CN112715368B - 一种毛梾茎段诱导植株再生培养基及其组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明属林木组培繁育技术领域，为解决目前毛梾组培生根率低、生根质量差等问题，提供一种毛梾茎段诱导植株再生培养基及其组培快繁方法。用改良MS作为基本培养基，以毛梾幼嫩茎段为外植体，进行腋芽诱导，用无菌苗诱导产生不定芽，再由不定芽诱导再生植株生根的繁殖方法。针对初代、继代和生根培养环节选择了改良的培养基，培养时间短，培养流程简便，提高了毛梾的繁殖效率，诱导腋芽成活率90％以上，增殖系数8.1～9.5，生根率85％以上；能快速获得遗传性状一致的毛梾试管苗。利用组培快繁技术，进行外植体培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，再生周期短，繁殖系数高，生根率高，为大规模工厂化生产育苗提供了技术支持。

Description

一种毛梾茎段诱导植株再生培养基及其组培快繁方法

技术领域

本发明属于林木组培繁育技术领域，具体涉及一种毛梾茎段诱导植株再生培养基及其组培快繁方法。

背景技术

据统计，中国国内石油储量只能供开采17年，世界石油将在30 ~ 40年内耗竭，面对日益减少的石油储备和不断增加的石油使用量，能源危机成为全世界关注的焦点，能源安全是我们面临的一个非常紧迫而现实的问题。发展石油替代能源、可再生能源成为能源战略的必然选择。毛梾是一个极具发展潜力的能源树种。

毛梾（Cornus walteri Wanger.），又名黑椋子、车梁木等，隶属山茱萸科梾木属，落叶乔木，集中分布于山西、山东、陕西、河南等地。毛梾果实含油率达31.8% ~ 41.3%，果皮含油率达24.9% ~ 25.7%，是重要的生物质能源树种。其耐干旱、耐瘠薄，适应性强，根系强大，是绿化荒山和水土保持的良好树种；树形优美，可作为良好的通道和城市绿化树种。

毛梾是集园林绿化、荒山造林、木本油料、生物质能源等多功能为一体的珍贵乡土树种，具有极高的研究和开发价值，发展潜力巨大。目前，毛梾的繁殖方式主要是种子繁殖，但由于其果皮富含油脂，内果皮坚硬骨质，透水透气性差，种子繁殖困难。康永祥等[1]采用低温层积方法对毛梾种子进行催芽，发芽率仅达46.7%；采用GA₃处理，发芽率最高也仅达48.43%[2]，而且繁育时间长，不易保持品种的优良特性；虽可采用扦插繁殖，但其存活率低，生根非常困难，又受到季节和资源的限制；嫁接的成活率也较低，不适宜进行大规模繁殖。组织培养成为大规模、快速繁殖毛梾优良品种的必然选择。

目前，国内外对毛梾组织培养方面的研究尚处于初期阶段。仅有张丹等[3]对毛梾初代培养的影响因素进行研究；暴甜等[4]学者建立了毛梾优良无性系组培体系。但是现有的研究存在生根率低、生根质量差等缺点，无法快速、高效地满足科研及大规模生产需要。

发明内容

本发明为了解决目前毛梾组培生根率低、生根质量差等问题，提供了一种毛梾茎段诱导植株再生培养基及其组培快繁方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种毛梾茎段诱导植株再生培养基，所述毛梾茎段再生培养基包括初代培养基、继代增殖培养基和生根培养基；

其中：所述初代培养基配方为：改良MS、0.5 mg·L^-1 ~ 1.0 mg·L^-1的BA、0.1mg·L^-1的NAA、0.1 mg·L^-1的IBA、20 g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂；培养基pH值为5.8 ~5.9；

所述继代增殖培养基为：继代增殖培养基（1）：改良MS、1.5 mg·L^-1的BA 、0.3mg·L^-1的IBA、20 g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8 ~ 5.9；或继代增殖培养基（2）：改良MS +1.0 mg·L^-1的BA、0.5 mg·L^-1的IBA、0.1 mg·L^-1的GA₃、20 g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8 ~ 5.9；

所述生根培养基为：生根培养基（1）为改良1/2MS、0.3 mg·L^-1的NAA、15 g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8 ~ 5.9；或生根培养基（2）为：改良1/4MS、0.2 mg·L^-1的NAA、15 g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8 ~ 5.9；

所述改良MS培养基配方为表1：

表1：

利用所述的再生培养基进行毛梾茎段诱导植株再生的组培快繁方法，具体步骤如下：

（1）外植体选取：1-3月选择当年生枝条进行水培，得到4~5cm的幼嫩茎段；或4-5月选择生长健壮、无病虫害的幼嫩茎段，作为外植体材料；

（2）外植体灭菌：所得幼嫩茎段用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗3次，沥干，再采用0.1% HgCI₂溶液消毒4 min ~ 5 min，无菌水冲洗5-6次，再切成1.5-1.8 cm的茎段，每个茎段至少带一个腋芽，备用；

（3）初代培养：将步骤（2）切取的茎段，接种在初代培养基上进行初代培养，控制：培养温度25±2℃，湿度60±2%，光照强度2500~3000lx，光照时间12 ~ 14 h/d，培养20 ~30天，待腋芽萌发至3cm时，将腋芽切下备用；

（4）继代增殖培养：将步骤（3）切下的腋芽转接至继代增殖培养基中培养，控制：培养温度25±2℃，湿度60±2%，光照强度2500~3000lx，光照时间12 ~ 14 h/d，培养20 ~ 30天，在茎段基部周围形成丛生芽，将其切成带茎节的切段，扩繁试管苗；

（5）生根培养：将步骤（4）扩繁的试管苗转接至生根培养基中进行生根培养，控制：培养温度25±2℃，光照强度为2500~3000lx，光照时间12 ~ 14 h/d，培养20 ~ 30天，试管苗在培养基中根长至2.0cm时，出瓶移栽。

本发明改良MS培养基与常用MS培养基的主要区别如下：

大量元素中，采用K₂SO₄代替KNO₃。理由：K₂SO₄可以同时提供植物生长所需的钾元素和硫元素，缺硫时培养的植物组织会明显的退绿。采用Ca(NO₃)₂·4H₂O代替CaCl₂·2H₂O，而且含量翻倍。理由：钙是植物细胞壁的组成成分，缺钙时细胞分裂收到影响，细胞壁形成受阻，严重时幼芽、幼根会溃烂坏死；钙离子能与蛋白质形成复合体，活化各种酶，调节植物对外界环境的反应。微量元素中，去除了KI和CoCl₂·6H₂O。理由：KI对存放要求高，可与许多物质发生化学反应，容易与Cu⁺形成沉淀；CoCl₂·6H₂O对水生生物有极高毒性，对植物产生长期不良影响。采用Zn(NO₃)₂·6H₂O代替ZnSO₄·7H₂O，而且含量翻倍。理由：ZnSO₄·7H₂O对眼睛有刺激性，长期接触可致眼损害。锌是生长素吲哚乙酸生物合成的催化剂，也是谷氨酸脱氢酶和乙醇脱氢酶的活化剂，缺锌时产生小叶病，使叶小而丛生，不能正常展开。有机元素中，去除盐酸吡哆醇，同时将盐酸硫胺素的含量扩大10倍。理由：盐酸硫胺素与根的生长有关，在缺少盐酸硫胺素时，根生长缓慢，甚至不能生长。

本发明中：所述BA为6-苄氨基腺嘌呤，是一种植物生长激素，其主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进生物体内物质的积累，促进侧芽发生，防止老化，是植物组织和细胞培养中的细胞分裂素。

所述IBA为吲哚丁酸，是一种植物生长激素，主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成。

所述NAA为萘乙酸，是一种植物生长激素，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组培快繁，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。

所述GA₃为赤霉素，是一种植物生长激素，主要作用是加速细胞的伸长生长和打破休眠。在大多数情况下，赤霉素对组织培养中器官和胚状体的形成具有抑制作用，但对已形成的器官和胚状体的生长则有促进作用。

改良1/2MS：所述改良1/2MS为改良MS基本培养基中，大量元素减半，其余不变形成的培养基。

改良1/4MS：所述改良1/4MS为改良MS基本培养基中，大量元素减少3/4，其余不变形成的培养基。

相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种毛梾的组培快繁方法，包括外植体的选取及灭菌、初代培养、增殖培养、生根培养的步骤，采用改良MS 作为基本培养基，通过对初代培养基、增殖培养基、生根培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比。

改良MS培养基，配方简单，培养基成本低，采用水培带芽茎段或幼嫩茎段进行启动培养，通过添加BA、NAA 和IBA进行调控，诱导腋芽萌发生长；再通过改良MS培养基中添加适当浓度的激素调节腋芽的继代增殖和生根，建立了稳定的组培繁殖体系。

本发明组培快繁方法培养时间短，培养流程简便，提高了毛梾的繁殖效率，诱导腋芽成活率90％以上，增殖系数8.1～9.5，生根率85％以上；能快速获得遗传性状一致的毛梾试管苗。利用组培快繁技术，进行外植体培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，再生周期短，繁殖系数高，生根率高，为大规模工厂化生产育苗提供了技术支持。

附图说明

图1为毛梾茎段腋芽诱导图；

图2为毛梾试管苗增殖培养图；

图3为采用改良1/2MS+0.3 mg·L^-1 NAA进行毛梾试管苗生根培养图（ 1 ） ；

图4为采用改良1/4MS+0.2 mg·L^-1 NAA进行毛梾试管苗生根培养图（ 2 ） ；

图5为毛梾试管苗图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

例1：腋芽诱导试验

1、试验材料：本试验材料采自四年生毛梾实生苗，选择生长健壮、无病虫害的幼嫩茎段或水培后的茎段作为外植体材料。

将采回的毛梾茎段洗净后，在超净工作台上先用75%的酒精灭菌30 s，无菌水冲洗3次，采用灭菌剂0.1% HgCI₂溶液消毒4 min ~ 5 min，灭菌处理后，无菌水冲洗5 ~ 6次，切成1.5-1.8 cm的茎段，每个茎段至少带一个腋芽，准备接种。

试验设计：均采用单因素完全随机设计，每处理20瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次。

2、外植体采集时期：本试验从2015年4月~ 9月，采集毛梾幼嫩茎段作为外植体；2015年10月~ 2016年3月采集当年生枝条进行水培后，采用幼嫩茎段作为外植体，经灭菌处理后接种培养。4周后观察统计毛梾茎段外植体的污染率和成活率。

3、植物生长调节剂组合：采用MS和改良MS培养基作为基本培养基，分别添加不同浓度的BA（0.5 mg·L^-1，1.0 mg·L^-1，2.0 mg·L^-1）与0.1 mg·L^-1 NAA；或分别添加不同浓度的BA（0.5 mg·L^-1，1.0 mg·L^-1，2.0 mg·L^-1）与0.1 mg·L^-1 NAA和0.1 mg·L^-1 IBA。4周后，观察毛梾腋芽生长情况，统计腋芽诱导率，研究不同植物生长调节剂组合对毛梾茎段腋芽诱导的影响。

4、培养条件：培养温度为25 ± 2℃，光照强度为2500 lx ~ 3000 lx，光照时间为14 ~ 16 h/d；培养基pH值均调整至5.8 ~ 5.9；所有培养基均添加蔗糖20 g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1。

例2：试管苗增殖培养试验

1、BA与IBA组合：将诱导的腋芽转接于MS和改良MS基本培养基，并添加不同浓度的BA与IBA，4周后统计试管苗的增殖率和增殖系数，研究BA与IBA组合对毛梾试管苗增殖的影响。

2、BA与IBA、GA₃组合：将诱导的腋芽转接于MS和改良MS基本培养基，并添加不同浓度BA与IBA、GA₃组合，4周后统计试管苗的增殖率和增殖系数，研究不同浓度BA与IBA、GA₃组合对毛梾试管苗增殖的影响。

3、培养条件：培养温度为25 ± 2℃，光照强度均为2500 lx ~ 3000 lx，光照时间为14 ~ 16 h/d；所有培养基均添加蔗糖20 g·L^-1、琼脂6.5 g·L^-1。

例3：试管苗生根培养试验

1、试验材料：以高度> 2 cm生长健壮的试管苗作为试验材料，转接到生根培养基上进行生根培养。

2、试验设计：以1/2MS和1/4MS作为基本培养基，分别添加不同浓度的IBA或NAA（0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mg·L^-1），未添加任何生长素的基本培养基作为对照。四周后观察记录生根情况，统计生根率和生根数，研究NAA或IBA对试管苗生根的影响。

均采用单因素完全随机设计，每处理20瓶，重复3次。

3、培养条件：培养温度为25 ± 2℃，光照强度均为2500 lx ~ 3000 lx，光照时间为14 ~ 16 h/d；所有培养基均添加蔗糖15 g·L^-1，琼脂6.5 g·L^-1。

4、数据统计与分析：将试验所得数据采用SPSS 17.0进行方差分析，并用Duncan多重比较方法对均值进行差异显著性检验。具体指标计算如下：

结果与分析：

一、腋芽诱导试验

1、采集时期对毛梾茎段外植体灭菌效果的影响：本试验研究了12个不同采集时期对毛梾茎段外植体灭菌效果的影响。方差分析表明，不同采集时期对毛梾茎段外植体污染率和成活率均有极显著影响（P<0.001）。多重比较结果见表2。

表2 外植体采集时期对茎段外植体灭菌效果的多重比较

研究结果表明，4月 ~ 9月采集毛梾幼嫩茎段作为外植体时，4月、5月的污染率较低，分别为27.8%和28.6%，成活率较高，分别为70.4%和69.1%；6月后的污染率逐渐升高，成活率逐渐降低；8月采集外植体，污染率达到最高，为82.4%，成活率最低，仅为15.4%；可能是由于天气炎热，雨水较多，环境中存在的菌较多所致；到9月采集外植体，污染率又有所降低，成活率有所升高，分别为50.5%和44.8%（表2）。

10月到次年3月，采集当年生枝条进行水培后，采用幼嫩茎段作为外植体时，10月的污染率仍较高，为53.3%，成活率较低，达41.7%；11月、12月污染率逐渐降低，成活率逐渐升高；1月 ~ 3月采集时，污染率最低，成活率最高，分别为79.2%、80.1%和81.9%（表2）；可能是由于冬季寒冷，空气中携带的菌较少，易于灭菌。

由此可见，4月 ~ 5月是毛梾茎段外植体较为理想的采集时期；1月~ 3月采集当年生枝条进行水培后，采用幼嫩茎段作为外植体是毛梾茎段外植体的最佳采集时期。

2、植物生长调节剂组合对毛梾茎段腋芽诱导的影响：本试验研究了不同植物生长调节剂组合对毛梾茎段腋芽诱导的影响。方差分析表明，不同植物生长调节剂组合对毛梾茎段腋芽诱导率有极显著影响（P<0.001）。多重比较结果见表3。

表3 植物生长调节剂组合对腋芽诱导的多重比较

研究结果表明，MS作为基本培养基时，当培养基添加不同浓度的BA与NAA组合时，腋芽诱导率低于BA、NAA与IBA组合。BA与NAA组合时，当BA浓度为1.0 mg·L^-1，腋芽诱导率较高，达74.2%；高于或低于此浓度，腋芽诱导率均有所降低。BA、NAA与IBA组合时，当BA浓度为0.5 mg·L^-1，腋芽诱导率较高，达85.5%；当BA浓度升高至1.0 mg·L^-1时，腋芽诱导率也较高，达84.4%；继续升高BA浓度至2.0mg·L^-1时，腋芽诱导率略有下降，达78.9%，并伴有轻微玻璃化现象（表3）。

当改良MS作为基本培养基时，腋芽诱导规律与MS基本培养基基本一致。当培养基添加不同浓度的BA与NAA组合时，腋芽诱导率低于BA、NAA与IBA组合，但整体腋芽诱导率显著提高。BA、NAA与IBA组合时，当BA浓度为0.5 mg·L^-1，腋芽诱导率最高，达90.3%；当BA浓度提高至1.0 mg·L^-1时，腋芽诱导率也较高，达89.8%；继续提高BA浓度至2.0mg·L^-1时，腋芽诱导率略有下降，并伴有轻微玻璃化现象（表3）。

由此可见，改良MS培养基添加0.5 mg·L^-1 ~ 1.0 mg·L^-1 BA、0.1 mg·L^-1 NAA与0.1 mg·L^-1 IBA是毛梾茎段腋芽诱导的最佳培养基。

二、试管苗增殖培养试验

1、BA与IBA组合对毛梾试管苗增殖的影响：本试验研究了BA与IBA组合对毛梾试管苗增殖的影响。方差分析表明，BA与IBA组合对毛梾试管苗增殖率（P<0.001）、增殖系数（P<0.001）均影响显著。多重比较结果见表4。

表4 BA与IBA组合对试管苗增殖的多重比较

以MS作为基本培养基时，所有组合中，试管苗基部均分化少量淡白、绿色愈伤组织，但均未实现试管苗增殖。

以改良MS作为基本培养基时，所有组合中，试管苗基部均分化少量淡绿、紧致愈伤组织，并分化大量不定芽，长势良好，属于不定芽发生型。当0.5 mg·L^-1 BA与0.3 mg·L^-1 IBA组合时，增殖率为44.9%，增殖系数为4.2；随着BA浓度升高，增殖率和增殖系数呈先上升后下降的趋势；当BA浓度升高至1.5 mg·L^-1 BA时，增殖率和增殖系数达到最高，分别为89.4%和8.1；随着BA浓度继续升高，增殖率和增殖系数呈下降趋势。当BA浓度升高至3.0mg·L^-1 BA时，增殖率和增殖系数均较低，分别为41.6%和4.4（表4）。

由此可见，当改良MS培养基添加1.5 mg·L^-1 BA与0.3 mg·L^-1 IBA，是毛梾试管苗的最佳增殖培养基，属于不定芽发生型。

2、BA与IBA、GA₃组合对毛梾试管苗增殖的影响：本试验研究了BA与IBA、GA₃组合对毛梾试管苗增殖的影响。方差分析表明，BA与IBA、GA₃组合对毛梾试管苗增殖率（P<0.001）、增殖系数（P<0.001）均影响显著。多重比较结果见表5。

表5 BA与IBA、GA₃组合对试管苗增殖的多重比较

以MS培养基作为基本培养基时，所有组合中，试管苗基部均分化少量白色、疏松愈伤组织，但均未实现试管苗增殖。

以改良MS培养基作为基本培养基时，所有组合中，试管苗基部均分化少量淡绿、紧致愈伤组织，并分化大量不定芽，长势良好，属于不定芽发生型。当0.5 mg·L^-1 BA与0.5mg·L^-1 IBA、0.1 mg·L^-1 GA₃组合时，增殖率为65.1%，增殖系数为5.6；当BA浓度升高至1.0mg·L^-1 BA时，增殖率和增殖系数达到最高，分别为88.8%和9.5；随着BA浓度继续升高，增殖率和增殖系数呈下降趋势。当BA浓度升高至3.0 mg·L^-1 BA时，增殖率和增殖系数达最低，分别为44.5%和4.3（表5）。

由此可见，当改良MS培养基添加1.0 mg·L^-1 BA与0.5 mg·L^-1 IBA、0.1 mg·L^-1 GA₃，也是毛梾试管苗最佳的增殖培养基，也属于不定芽发生型。

三、试管苗生根培养试验：

1、IBA对毛梾试管苗生根的影响：本试验研究了不同浓度IBA对毛梾试管苗生根的影响。方差分析表明，不同浓度IBA对毛梾试管苗生根率（P<0.001）、生根数（P<0.001）均影响显著。多重比较结果见表6。

表6 IBA对试管苗生根的多重比较

研究结果表明，在未添加IBA的培养基中，试管苗未发现有生根现象；而在添加IBA的培养基中，试管苗直接诱导生根，根较细。

以改良1/2MS作为基本培养基时，当IBA浓度较低时，生根率较低或不生根；当IBA浓度为0.3 mg·L^-1和0.5 mg·L^-1时，生根率较高，分别达16.4%和15.8%，生根数分别为1.3和1.6；其次是1.0 mg·L^-1，生根率和生根数为9.5%和1.1（表6）。

以改良1/4MS作为基本培养基时，当IBA浓度低于0.2 mg·L^-1（包含0.2 mg·L^-1），未能诱导试管苗生根。当IBA浓度为0.3 mg·L^-1时，生根率略低，达9.9%，生根数为1.6；IBA浓度为0.5 mg·L^-1时，生根率较高，达33.3%，生根数为2.9；高于该浓度，生根率有所降低（表6）。

由此可见，以改良1/4MS作为基本培养基，添加0.5 mg·L^-1 IBA时，生根率较高。

2、NAA对毛梾试管苗生根的影响：本试验研究了不同浓度的NAA对毛梾试管苗生根的影响。方差分析表明，不同浓度的NAA对毛梾试管苗生根率（P<0.001）、生根数（P<0.001）均影响显著。多重比较结果见表7。

表7 NAA对试管苗生根的多重比较

研究结果表明，培养基中未添加NAA时，试管苗未诱导生根；而在添加NAA的培养基中，试管苗基部先诱导出适量淡绿、紧致愈伤组织，并诱导生根，根较粗壮，根数较多，并分化毛细根。

以改良1/2MS作为基本培养基时，随着NAA浓度增加，生根率和生根数均呈先上升后下降趋势。当添加0.3 mg·L^-1 NAA时，生根率和生根数均最高，分别为85.8%和4.8；其次是添加0.2 mg·L^-1 NAA，分别为60.0%和2.5（表7）。试验发现，NAA浓度高于0.5 mg·L^-1（包含0.5 mg·L^-1），试管苗基部会产生大量愈伤组织，而且诱导的根呈膨松状，不利于炼苗移栽。

以改良1/4MS作为基本培养基时，随着NAA浓度增加，生根率和生根数均呈先上升后下降趋势。当添加0.2 mg·L^-1 NAA时，生根率和生根数均达最高，为86.3%和7.5；其次是添加0.3 mg·L^-1 NAA，生根率为69.8%；而当NAA浓度为0.1mg·L^-1，生根数为3.5（表7）。

由此可见，改良1/2MS培养基添加0.3 mg·L^-1 NAA，或改良1/4MS培养基添加0.2mg·L^-1 NAA，生根率均最高，是毛梾试管苗的最佳生根培养基。

四、结论：

1、腋芽诱导：不同植物材料的最佳采集时期不尽相同。本研究表明，4月 ~ 5月是毛梾茎段外植体较为理想的采集时期；1月 ~ 3月采集当年生枝条进行水培后，采用幼嫩茎段作为外植体是毛梾茎段外植体的最佳采集时期。可能是由于4月 ~ 5月是毛梾自然萌发、生长的季节，外植体比较幼嫩，携带病菌较少，易于灭菌；1月 ~ 3月正处于寒冷的冬季，外界环境中的病菌较少，而且水培后很快进行灭菌接种，外植体携带病菌也少，因此也易于灭菌。但也有学者对苹果茎段外植体的采集时期进行研究发现，在3月 ~ 6月采集的成活率可达60%，而7月 ~ 11月采集就下降到10%，12月至翌年2月则在10%以下[5]。可见，不同植物材料须选择不同的采集时期进行接种培养。

木本植物组织培养中，外植体的诱导不仅与植物生长调节剂的种类有关，而且还与它的组合及浓度有关。本研究发现，改良MS培养基添加0.5 mg·L^-1 ~ 1.0 mg·L^-1 BA、0.1 mg·L^-1 NAA与0.1 mg·L^-1 IBA是毛梾茎段腋芽诱导的最佳培养基。在金叶红瑞木的离体快繁研究中发现，MS培养基添加0.5 mg·L^-1 BA与0.05 mg·L^-1 ~ 0.20 mg·L^-1 IBA是金叶红瑞木的最佳启动培养基[6]。毛梾和金叶红瑞木同属于山茱萸科梾木属植物，腋芽诱导所需的植物生长调节剂种类和组合却不尽相同。可见，不同植物材料需要根据自身的生物特性选择适宜的植物生长调节剂。

2、试管苗增殖培养：基本培养基仅能保持腋芽或不定芽诱导，但决定试管苗增殖的关键因素是植物生长调节剂的种类、浓度及比例，特别是细胞分裂素和生长素浓度配比。一般情况下，当二者浓度比例高时有利于分化芽，浓度比例适中有利于芽的生长，浓度比例低时有利于生根。因此，只有在培养基中添加一定比例的植物生长调节剂，才能保证试管苗的有效增殖，从而在较短时间内获得较多的组培苗。

不同种类的细胞分裂素和生长素组合对不同植物材料的分化及增殖作用差异较大，但大多数种类以BA最为有效。曾令达等[7]研究发现，淡水沙梨试管苗增殖的最佳培养基配方为MS培养基中添加2.0 mg·L^-1 BA与0.1 mg·L^-1 IBA，增殖系数为8.7。但本研究发现，MS培养基添加BA与IBA组合，试管苗基部仅分化出少量淡绿、紧致或淡白、疏松愈伤组织，均未实现试管苗增殖。

为了进一步提高毛梾试管苗增殖率，对MS基本培养基进行了改良。本试验采用改良MS培养基作为基本培养基，添加不同浓度的BA和IBA进行毛梾试管苗增殖培养。研究结果表明，当培养基中添加1.5 mg·L^-1 BA与0.3 mg·L^-1 IBA，试管苗基部分化少量淡绿、紧致愈伤组织，并分化大量不定芽，长势良好，属于不定芽发生型，增殖率和增殖系数达到最高，分别为89.4%和8.1，是毛梾试管苗的最佳增殖培养基。王秋庆等[8]在偃伏梾木组织培养中发现，不定芽在1/2MS+0.5 mg·L^-1 BA+0.25 mg·L^-1 IBA培养基中能有效增殖。赵青华[9]在红瑞木试管苗增殖培养中发现，芽的增殖以M（MS培养基中的CaCl₂·2H₂O的浓度为1200mg·L^-1）基本培养基，添加0.5 mg·L^-1 BA和0.05 mg·L^-1 IBA，丛生芽长势最好，增殖率达73.5%，增殖系数为2.32。

赤霉素的生理作用是诱导茎的细胞伸长和形成层的细胞分化，并能刺激不定胚发育成小植株。本试验又以改良MS培养基作为基本培养基，研究了BA与IBA、GA₃组合对毛梾试管苗增殖的影响。研究结果表明，当培养基中添加1.0 mg·L^-1 BA与0.5 mg·L^-1 IBA、0.1mg·L^-1 GA₃，试管苗基部分化少量淡绿、紧致愈伤组织，并分化大量不定芽，长势良好，也属于不定芽发生型，增殖率和增殖系数也较高，分别为88.8%和9.5，也是毛梾试管苗的最佳增殖培养基。

3、试管苗生根培养：在植物离体快繁中，根系形成是受多种内源激素与外源激素综合调控的复杂过程。大量研究表明，在不定根形成过程中，生长素起着重要作用。其中NAA对生根的作用十分强大，其启动能力比IBA高3.7倍。IBA的作用虽弱，但不易被过氧化物酶分解，对生根有良好的效果。

本试验发现，改良1/2MS培养基中添加0.3 mg·L^-1 NAA，或改良1/4MS培养基添加0.2 mg·L^-1 NAA，生根率均最高，是毛梾试管苗的最佳生根培养基。王秋庆等[8]在偃伏梾木组织培养中发现，l/2 MS+0.5 mg·L^-1 IBA的生根效果最佳。赵青华[9]在红瑞木的生根培养中发现，1/2M（改良的MS）+0.5 mg·L^-1 IBA的培养基中生根效果最好；而张扬等[10]研究发现，红瑞木试管苗生根诱导的最适培养基为l/4 MS+0.05 mg·L^-1 IBA。可见，尽管这些树种同属山茱萸科，但生根培养基中的无机盐浓度及生长素种类受树种个体影响差异较大。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献：

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[2]康永祥,贠玉洁,赵宝鑫,陈绵,康晋.毛梾种子萌发特性及幼苗生长规律研究[J].西北林学院学报,2012,27(03):62-67+112.

[3]张丹,康永祥,薛丽艳,叶新华.毛梾初代培养影响因素研究[J].北方园艺,2012(07):123-125.

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[7]曾令达,宋冠华,曾惠雯,徐春香,黄建昌.淡水沙梨腋芽诱导和增殖培养技术[J].分子植物育种,2018,16(07):2260-2265.

[8]王秋庆,刘华,朱金启,王翠亭,张洪霞.偃伏梾木组织培养及再生体系的建立(简报)(英文)[J].分子细胞生物学报,2008(03):227-232.

[9]赵青华.红瑞木的组织培养与快速繁殖[J].植物学通报,2008(02):220.

[10]张杨,李周岐.红瑞木茎段组织培养技术研究(英文)[J].西北林学院学报,2010,25(06):87-90+133。

Claims (2)

1.一种毛梾茎段诱导植株再生培养基，其特征在于：所示毛梾茎段再生培养基包括初代培养基、继代增殖培养基、生根培养基；

其中：所述初代培养基配方为：改良MS、0.5 mg·L^-1 ~ 1.0 mg·L^-1的BA、0.1 mg·L^-1的NAA、0.1 mg·L^-1的IBA、20 g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂；培养基pH值为5.8 ~ 5.9；

所述继代增殖培养基为：继代增殖培养基（1）：改良MS、1.5 mg·L^-1的BA 、0.3 mg·L^-1的IBA、20 g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8 ~ 5.9；或继代增殖培养基（2）：改良MS、1.0 mg·L^-1的BA、0.5 mg·L^-1的IBA、0.1 mg·L^-1的GA₃、20 g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8 ~ 5.9；

所述生根培养基为：生根培养基（1）为改良1/2MS、0.3 mg·L^-1的NAA、15 g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8 ~ 5.9；或生根培养基（2）为：改良1/4MS、0.2 mg·L^-1的NAA、15g·L^-1蔗糖、6.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8 ~ 5.9；

所述改良MS培养基配方为表1：

表1：

。

2.利用权利要求1所述的再生培养基进行毛梾茎段诱导植株再生的组培快繁方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）外植体选取：1-3月选择当年生枝条进行水培，得到4~5cm的幼嫩茎段；或4-5月选择生长健壮、无病虫害的幼嫩茎段，作为外植体材料；

（2）外植体灭菌：所得幼嫩茎段用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗3次，沥干，再采用0.1% HgCI₂溶液消毒4 min ~ 5 min，无菌水冲洗5-6次，再切成1.5-1.8 cm的茎段，每个茎段至少带一个腋芽，备用；

（3）初代培养：将步骤（2）切取的茎段，接种在初代培养基上进行初代培养，控制：培养温度25±2℃，湿度60±2%，光照强度2500~3000lx，光照时间12 ~ 14 h/d，培养20 ~ 30天，待腋芽萌发至3cm时，将腋芽切下备用；

（4）继代增殖培养：将步骤（3）切下的腋芽转接至继代增殖培养基中培养，控制：培养温度25±2℃，湿度60±2%，光照强度2500~3000lx，光照时间12 ~ 14 h/d，培养20 ~ 30天，在茎段基部周围形成丛生芽，将其切成带茎节的切段，扩繁试管苗；

（5）生根培养：将步骤（4）扩繁的试管苗转接至生根培养基中进行生根培养，控制：培养温度25±2℃，光照强度为2500~3000lx，光照时间12 ~ 14 h/d，培养20 ~ 30天，试管苗在培养基中根长至2.0cm时，出瓶移栽。

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