CN116584389B - 一种水芹的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水芹的组培快繁方法，所述水芹的组培快繁方法包括以下步骤：步骤1）、选取水芹幼嫩叶茎的腋芽作为外植体；步骤2）、消毒后接种到基本MS培养基上形成无菌苗；步骤3）、选取生长状况良好的无菌苗，剪取其叶柄后接种至愈伤组织诱导培养基获取愈伤组织，步骤4）、后转接至从生芽继代增值培养基中获得大量从生芽；步骤5）、丛生芽最后接种于分化成株诱导培养基中形成水芹再生苗。通过本发明，可用于快速获得水芹愈伤组织和组培苗，对水芹工厂化生产及水芹扩繁和科研需求具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种水芹的组培快繁方法，涉及一种水芹组培快繁体系的建立，用于快速获得水芹愈伤组织及组培苗，满足水芹的扩繁及科研需求；属于生物技术领域。
背景技术
水芹(Oenanthe javanica(Bl.)DC.)是伞形科、水芹属多年生草本植物，茎直立或基部匍匐，具有多年生水生宿根性。水芹产量高、效益较好，在我国主要分布在长江流域及其以南地区，其中在江苏、浙江、安徽等地栽培普遍。水芹中含有丰富的营养物质，不仅含有六大传统营养素，水芹还含有丰富的蛋白质、膳食纤维、维生素以及矿质元素。水芹可平肝降压、镇静安神以及防癌抗癌。
水芹种子果实为双悬果，种子萌发十分困难，而且成熟的水芹种子易自然脱落，不易采收，且留在植株上的多为未成熟的种子，种子发育不良。水芹种子休眠和发芽困难的问题，是制约水芹有性生殖种子育苗过程主要原因。因此国内水芹生产多采用老茎进行无性繁殖。种子繁殖的繁殖系数低导致水芹新品种选育难度大，育种技术创新与应用明显落后于其他种子繁殖蔬菜。国内大规模采用的老茎无性繁殖尽管对生产环境要求较低，适于大田生产，经济效益适中，但易受季节影响限制，温度过高过低都不利于水芹生长，且通常繁殖时均要催芽，耗时耗力，严重制约了水芹产业的高质量发展，无法满足人们对水芹日益增长的需求。因此，开展水芹组培快繁体系技术研究，对水芹的高效繁殖、周年生产，提升水芹经济效益、实现水芹的周年生产和供应、满足和丰富人民生活需要都具有极为重要的意义。
植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论发展起来的技术。组织培养技术是利用植物体离体的器官、组织、细胞或者原生质体，在人工培养的无菌条件下诱导出愈伤、不定芽、不定根，最后形成完整植株的方法。植物组织培养技术既不受季节影响限制，且生产周期较短，生产效率高。在生产中，植物组织培养条件可以人为的进行控制，管理方便；同时，再生植株生长周期短，繁殖率高，便于工厂化及自动化育苗，亦可满足人们对水芹日益增长的需求。
根据水芹生长特性及遗传特点，该体系先对水芹腋芽进行清水处理后，再采用一定浓度的乙醇和次氯酸钠消毒剂进行消毒，其后按照一般组培技术流程进行。该技术体系包括：水芹外植体消毒方法、外植体接种方法、培养条件、培养基及激素浓度的配比等。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种水芹的组培快繁方法，该体系包括：水芹外植体消毒方法、外植体接种方法及培养条件、培养基及激素浓度的配比、愈伤组织诱导及分化成株诱导。该技术对水芹组培快繁、工厂化生产及科学研究具有重要意义。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种水芹的组培快繁方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1)、选取水芹幼嫩叶茎的腋芽作为外植体，并对外植体消毒；
步骤2)、外植体消毒后接种到基本MS培养基上形成无菌苗；
步骤3)、选取生长状况良好的无菌苗，剪取其叶柄后接种至愈伤组织诱导培养基获取愈伤组织；
步骤4)、后转接至从生芽继代增值培养基中获得大量从生芽；
步骤5)、丛生芽最后接种于分化成株诱导培养基中形成水芹再生苗。
步骤1)具体为：
外植体消毒：取生长旺盛带腋芽的水芹嫩茎3～4cm，放入250ml的烧杯中，用清水清洗两遍，然后流水冲洗60min；冲洗完成后加入75％浓度无水乙醇洗涤灭菌30s，倒掉乙醇，再用20％浓度的已加入1～2滴吐温的次氯酸钠溶液洗涤灭菌两次，第一次灭菌2min，第二次灭菌20min。
步骤2)具体为：
外植体接种方法：将外植体置于已通过紫外消毒好的超净工作台中，倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水反复冲洗4次；将外植体放于已消毒的培养皿上，用吸水纸吸净外植体多余水分，剪取腋芽接种到基础MS培养基上，接种时腋芽生长方向需朝向瓶口，每瓶接种2～3个腋芽；
光下培养：将接种好的培养瓶放置于光照培养箱中进行培养，经30d获得水芹无菌苗；其中光照培养箱的光周期为16h光照、8h黑暗，光照培养箱的温度为25℃。
步骤3)具体为：
愈伤组织诱导：于超净工作台上剪取50mm的健壮无菌苗嫩茎30～40个，平铺在装有培养基的培养皿上，培养基配方为B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L6-BA+100mg/L SER；铺好之后及时用封口膜封好，放置于愈伤诱导培养箱中25℃暗培养。
步骤4)至步骤5)，具体为：
分化成株诱导：愈伤于黑暗中培养20d后可进行分株诱导，诱导培养基为基础MS培养基；将长势较好的水芹愈伤组织于紫外消毒后的超净工作台中平铺于装有MS培养基的培养皿上，密度控制在4～5个，用封口膜封好后，置于愈伤诱导培养箱中25℃暗培养；培养约10d后长出丛生芽，继续培养10d后，将长出的嫩芽于超净工作台中接种到基础MS培养基上，置于光照培养箱中生长，生长条件为光周期16h光照、8h黑暗，温度为25℃；培养40d后得到水芹无菌再生苗；经过锻炼可进行移栽或者继续分离组织；
最后可快速扩繁水芹和获得生长状况较好的愈伤组织。
本发明方法先进科学，通过本发明，提供的一种水芹的组培快繁方法，包括以下步骤：步骤1)选取水芹幼嫩叶茎的腋芽作为外植体；步骤2)消毒后接种到基础MS培养基上形成无菌苗；步骤3)选取生长状况良好的无菌苗，剪取其叶柄后接种至愈伤组织诱导培养基获取愈伤组织；步骤4)后转接至从生芽继代增值培养基中获得大量从生芽；步骤5)丛生芽最后接种于分化成株培养基中形成水芹再生苗。
本发明所述的外植体消毒方法顺序为，清水清洗两遍，流水冲洗60min，75％无水乙醇洗涤灭菌30s，20％浓度次氯酸钠溶液洗涤灭菌两次，第一次灭菌2min，第二次灭菌20min。
进一步为，本发明愈伤组织诱导培养基为B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L6-BA+100mg/L SER。
进一步为，本发明愈伤组织继代增值培养基为基础MS培养基。
进一步为，本发明丛生芽生根培养基为基础MS培养基。具体为：
1.外植体的选择：应选用生长旺盛水芹的嫩茎，剪取嫩茎上的腋芽作为外植体，选取的腋芽长度约为0.5～1cm。
2.外植体的清洗：剪取含有腋芽的嫩茎段3～4cm，放入250ml烧杯中，用清水清洗两遍，再流水冲洗60min，直至嫩茎上无泥土等杂质残留。
3.外植体的消毒：冲洗完成后加入75％浓度无水乙醇洗涤灭菌30s，倒掉乙醇，将嫩茎移至超净工作台。加入20％浓度次氯酸钠溶液洗涤60s～90s，后再次加入20％浓度次氯酸钠溶液浸泡消毒20min(次氯酸钠溶液中均加入1～2滴吐温)。弃废液，用无菌水反复冲洗4次。
4.无菌苗的获取：将带有腋芽的嫩茎放入已消毒的培养皿上，用吸水纸吸净嫩茎多余水分，剪取腋芽接种到基础MS培养基上，接种时腋芽生长方向需朝向瓶口。接种完成后置于光照培养箱中生长，生长条件为16h光照、8h黑暗、温度25℃。经30d后获得水芹无菌苗。
5.愈伤组织诱导：选取生长旺盛的无菌苗，于超净工作台上剪取50mm的无菌苗叶柄30～40个，接种于B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+100mg/L SER的愈伤组织诱导培养基中，用封口膜封好，放置于愈伤诱导培养箱中25℃暗培养15～20d。
6.从生芽继代增殖培养：暗培养20d之后，于超净工作台中选取体积较大、颜色淡黄、质地致密的愈伤组织进行从生芽继代增值培养。在超净工作台中将水芹愈伤组织平铺在装有基础MS培养基的培养皿上，每块培养皿中放置4～5个水芹愈伤组织，均匀平铺，用封口膜封好，放置于光照培养箱中暗培养20d。
7.分化成株诱导：暗培养20d后，水芹愈伤组织都长出幼嫩的丛生芽，于超净工作台中将从生芽接种到含有基础MS培养基的培养瓶中，接种时丛生芽的生长方向需朝向瓶口，每瓶MS培养基接种3个从生芽，放置于光照培养箱中生长，生长条件为16h光照、8h黑暗、温度25℃。经40d后可长成水芹再生苗。
附图说明
图1为不同外植体诱导愈伤；
其中，A表示水芹根作为外植体诱导愈伤，B表示水芹叶片作为外植体诱导愈伤，C表示水芹叶柄作为外植体诱导愈伤。
图2为B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L6-BA+100mg/L SER诱导愈伤。
图3为B5+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+100mg/L SER诱导愈伤。
图4为丛生芽继代增殖培养。
图5为愈伤形成的水芹无菌再生苗。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
一种水芹的组培快繁方法，本发明所述水芹的组培快繁方法包括以下步骤：
步骤1)选取水芹幼嫩茎的腋芽作为外植体；
步骤2)消毒后接种到基本MS培养基上形成无菌苗；
步骤3)选取生长状况良好的无菌苗，剪取其叶柄后接种至愈伤组织诱导培养基获取愈伤组织；
步骤4)后转接至从生芽继代增值培养基中获得大量从生芽；
步骤5)丛生芽最后接种于分化成株培养基中形成水芹再生苗。
本发明所述的实验材料均来自扬州大学水生蔬菜试验基地，所选水芹品种为‘伏芹1号’。
本发明所述的外植体消毒方法顺序为清水清洗两遍，流水冲洗60min，75％无水乙醇洗涤灭菌30s，20％浓度次氯酸钠溶液洗涤灭菌两次，第一次灭菌2min，第二次灭菌20min。
进一步为，本发明愈伤组织诱导培养基为B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L6-BA+100mg/L SER。
进一步为，本发明愈伤组织继代增值培养基为基础MS培养基。
进一步为，本发明丛生芽生根培养基为基础MS培养基。
实例：
1.外植体的选择：应选用生长旺盛水芹的嫩茎，剪取嫩茎上的腋芽作为外植体，选取的腋芽长度约为0.5～1cm。
2.外植体的清洗：剪取含有腋芽的嫩茎段3～4cm，放入250ml烧杯中，用清水清洗两遍，再流水冲洗60min，直至嫩茎上无泥土等杂质残留。
3.外植体的消毒：冲洗完成后加入75％浓度无水乙醇洗涤灭菌30s，倒掉乙醇，将嫩茎移至超净工作台。加入20％浓度次氯酸钠溶液洗涤60s～90s，后再次加入20％浓度次氯酸钠溶液浸泡消毒20min(次氯酸钠溶液中均加入1～2滴吐温)。弃废液，用无菌水反复冲洗4次。
4.无菌苗的获取：将嫩茎放入已消毒的培养皿上，用吸水纸吸净嫩茎多余水分，剪取腋芽接种到基础MS培养基上，接种时腋芽生长方向需朝向瓶口。接种完成后置于光照培养箱中生长，生长条件为16h光照、8h黑暗、温度25℃。经过40d于光照培养箱中培养，获得了大量的水芹无菌苗。
5.愈伤组织诱导：选取生长旺盛的无菌苗，于超净工作台上剪取50mm的无菌苗叶柄30～40个，接种于B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+100mg/L SER的愈伤组织诱导培养基中，用封口膜封好，放置于愈伤诱导培养箱中25℃暗培养20d，愈伤诱导率为95％，愈伤体积较大，颜色淡黄，无褐化现象，质地致密，易于分化成株。
6.从生芽继代增殖培养：于超净工作台中对愈伤组织进行从生芽继代增值培养，将水芹愈伤组织平铺在装有基础MS培养基的培养皿上，每块培养皿中放置4～5个水芹愈伤组织，均匀平铺，用封口膜封好，放置于光照培养箱中暗培养20d，分化率为100％，从生芽增殖系数为4.8，出现少量褐化现象，但不影响从生芽的增殖。
7.分化成株诱导：暗培养20d后，水芹愈伤组织都长出幼嫩的丛生芽，于超净工作台中将从生芽接种到含有基础MS培养基的培养瓶中，接种时丛生芽的生长方向需朝向瓶口，每瓶MS培养基接种3个从生芽，放置于光照培养箱中生长，生长条件为16h光照、8h黑暗、温度25℃，经40d后，从生芽生根成苗率为95％，且水芹再生苗生长健壮，颜色鲜绿。
部分试验数据
试验一：不同外植体对水芹愈伤诱导率的影响
不同外植体对愈伤诱导率影响较大，为了筛选出本发明组培快繁体系的最适外植体，分别将水芹无菌苗的叶柄、叶片、根作为外植体进行愈伤诱导，并统计愈伤诱导率。
表1：不同外植体的愈伤诱导率
结果表明：叶柄的愈伤诱导率显著高于根和叶片，叶柄相比于根和叶片，更适合作为本发明组培快繁体系的外植体。
试验二：不同植物生长调节剂对水芹愈伤诱导率及生长状况的影响；
不同的植物生长调节剂对愈伤诱导效率影响不同，生长素对植株诱导愈伤有重要影响，细胞分裂素在愈伤组织的诱导过程中也是不可或缺的。细胞分裂素能促进细胞分裂和分化，适当浓度的细胞分裂素和生长素可有效提高愈伤组织的诱导效率。为了快速得到生长状况较好的水芹愈伤组织，更高效地获得水芹再生无菌苗，本试验采用6-BA、2,4-D、NAA3种植物生长调节剂进行诱导试验，设计4种组合，每种组合分别设计12个浓度梯度，每一梯度都进行3次重复试验，对能高效诱导水芹愈伤的激素组合进行筛选。
表2：水芹愈伤组织诱导率及愈伤生长状况(MS+NAA+6-BA+SER)
表3：水芹愈伤组织诱导率及愈伤生长状况(B5+NAA+6-BA+SER)
表4：水芹愈伤组织诱导率及愈伤生长状况(MS+2,4-D+6-BA+SER)
表5：水芹愈伤组织诱导率及愈伤生长状况(B5+2,4-D+6-BA+SER)
结果表明：B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+SER的激素配比和B5+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L 6-BA+SER的激素配比能高效的诱导水芹愈伤组织，并且愈伤的生长状况都较好，无褐化现象，可以更高效的得到水芹无菌再生苗。
试验三：从生芽继代增殖培养基筛选
我们通过对6-BA、2,4-D、NAA三种激素的多种组合，筛选得出本发明中水芹愈伤组织诱导效率最高的激素配比为B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L6-BA+100mg/L SER和B5+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+100mg/L SER，愈伤诱导效率分别为99％和98％，在此基础上，本发明对从生芽继代增殖培养基进行筛选，以诱导效率最好的B5+2,4-D+6-BA+SER组合为前置条件，选取该组合中诱导效率较高，愈伤组织生长状况较好的几个配比，对基础MS培养基和B5培养基进行筛选，统计其分化率，在筛选出最适从生芽继代增殖培养基后，将B5+2,4-D+6-BA+SER组合在该培养基上继代增殖，并统计其分化率。
表6：继代增值培养基的筛选
表7：水芹愈伤分化率统计
结果表明：基础MS培养基更适合作为本发明的从生芽继代增殖培养基，并且在B5+2,4-D+6-BA+SER诱导愈伤的基础上，以基础MS为继代增殖培养基的从生芽增值系数和分化率都较好。
试验结果
1.不同外植体对愈伤诱导率影响较大，外植体筛选结果显示：根，叶片和叶柄中，本发明最适外植体为叶柄(图1)；
2.不同的植物生长调节剂对愈伤诱导效率影响不同，适当浓度的细胞分裂素和生长素可有效提高愈伤组织的诱导效率。通过对不同植物生长调节剂及其不同的浓度进行水芹愈伤组织诱导，结果显示：B5+2,4-D+6-BA+SER为愈伤诱导效率最高的植物生长调节剂组合，其中B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+100mg/LSER和B5+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+100mg/L SER为最适浓度的愈伤组织诱导培养基(图2、3)。
3.在选用相同的愈伤诱导培养基进行愈伤组织诱导的条件下，对从生芽继代增殖培养基进行筛选，结果显示：基础MS培养基的从生芽增殖系数较高且愈伤分化率为95％，相比于B5培养基，更适于本发明作为继代增值培养基(图4)。
4.将得到的从生芽接种到基础MS培养基上，在生长条件为16h光照、8h黑暗、温度25℃的光照培养箱中生长40d后得到水芹无菌再生苗，且再生苗生长健壮，颜色鲜绿(图5)。
Claims (1)
1.一种水芹的组培快繁方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1）、选取水芹幼嫩叶茎的腋芽作为外植体，并对外植体消毒；
步骤2）、外植体消毒后接种到基本MS培养基上形成无菌苗；
步骤3）、选取生长状况良好的无菌苗，剪取其叶柄后接种至愈伤组织诱导培养基获取愈伤组织；
步骤4）、后转接至从生芽继代增殖培养基中获得大量从生芽；
步骤5）、丛生芽最后接种于分化成株诱导培养基中形成水芹再生苗；
步骤1）具体为：
外植体消毒：取生长旺盛带腋芽的水芹嫩茎3~4 cm，放入250ml的烧杯中，用清水清洗两遍，然后流水冲洗60min；冲洗完成后加入75％浓度无水乙醇洗涤灭菌30s，倒掉乙醇，再用20％浓度的已加入1~2滴吐温的次氯酸钠溶液洗涤灭菌两次，第一次灭菌2 min，第二次灭菌20 min；
步骤2）具体为：
外植体接种方法：将外植体置于已通过紫外消毒好的超净工作台中，倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水反复冲洗4次；将外植体放于已消毒的培养皿上，用吸水纸吸净外植体多余水分，剪取腋芽接种到基础MS培养基上，接种时腋芽生长方向需朝向瓶口，每瓶接种2~3个腋芽；
光下培养：将接种好的培养瓶放置于光照培养箱中进行培养，经30d获得水芹无菌苗；其中光照培养箱的光周期为16h光照、8h黑暗，光照培养箱的温度为25℃；
步骤3）具体为：
愈伤组织诱导：于超净工作台上剪取50mm的健壮无菌苗叶柄30~40个，平铺在装有培养基的培养皿上，培养基配方为B5+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+100mg/L SER；铺好之后及时用封口膜封好，放置于愈伤诱导培养箱中25℃暗培养；
步骤4）具体为：
从生芽继代增殖培养：于超净工作台中对愈伤组织进行从生芽继代增殖培养，将水芹愈伤组织平铺在装有基础MS培养基的培养皿上，每块培养皿中放置4~5个水芹愈伤组织，均匀平铺，用封口膜封好，放置于光照培养箱中暗培养20d，出现少量褐化现象，但不影响从生芽的增殖；
步骤5）具体为：
分化成株诱导：暗培养20 d后，水芹愈伤组织都长出幼嫩的丛生芽，于超净工作台中将从生芽接种到含有基础MS培养基的培养瓶中，接种时丛生芽的生长方向需朝向瓶口，每瓶MS培养基接种3个从生芽，放置于光照培养箱中生长，生长条件为16 h光照、8 h黑暗、温度25℃，经40 d后，水芹再生苗生长健壮，颜色鲜绿。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310657505.4A CN116584389B (zh) | 2023-06-05 | 一种水芹的组培快繁方法 |
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| CN116584389A CN116584389A (zh) | 2023-08-15 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR100620799B1 (ko) * | 2005-05-06 | 2006-09-06 | 화이젠 주식회사 | 재분화 및 재분화된 물푸레나무과 식물체의토양순화이식방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100620799B1 (ko) * | 2005-05-06 | 2006-09-06 | 화이젠 주식회사 | 재분화 및 재분화된 물푸레나무과 식물체의토양순화이식방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 水芹的组织培养及快速繁殖研究;许文一;高洋;马依妮;孙慧超;姜长阳;;安徽农业科学;20080510(第14期);全文 * |
| 湿地植物水芹再生体系的建立与优化;李海洲;王平;王海滨;陈永华;;中南林业科技大学学报;20110715(第07期);全文 * |
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