CN116098060A - 一种当归组培苗生根培养方法 - Google Patents

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蔡子平
王宏霞
王国祥
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Abstract

本发明提供一种当归组培苗生根培养方法，属于农业生物技术领域，当归组培苗生根培养方法包括：将1cm～3cm高的从生无根苗在无菌条件下切分为单芽，转至生根培养基中在设定的培养条件下诱导生根，得到试管苗植株幼苗，将试管苗植株幼苗进行炼苗，炼苗时间为一周，练苗过程中在炼苗室释放CO2，并逐渐增加CO2的浓度，然后洗去炼苗后的幼苗的培养基，并将幼苗移栽至移栽基质中，培养至幼苗开始抽出新芽后置于户外阴凉处生长，50‑60天后后经炼苗移栽，即可进行大田移植。本发明有效缩短了诱导生根的时间，并且能够促进不定根生长，且诱导出的根，根系发达，幼苗健壮。

Description

一种当归组培苗生根培养方法
本申请是名为《一种当归组培苗生根培养方法》的专利申请的分案申请，原申请的申请日为2020年06月10日，申请号为202010522646.1。
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及中药材当归的组织培养，特别是涉及一种当归组培苗的生根培养方法。
背景技术
当归(Angelicasinensis(Oliv)Diels)为伞形科多年生草本植物，其干燥根是一味常用的中药材。当归具有活血，调经止痛，润肠通便之功效，素有“十方九归”之称。当归不但用于治病，而且还用于保健和美容等方面，也是中国出口创汇的主要药用植物之一，需求量逐年增加。
当归在人工栽培中生长周期为3年，常规方法育种或育苗，耗时长，繁殖系数低，耗种量大，生产成本高，导致其发展速度很慢。此外，长期只重视种植，而育种方面相对落后，造成当归早期抽薹率高，品质退化严重。
植物组织培养技术在品种改良、规模化生产种苗方面发挥着巨大的作用。组织培养方法具有不受时间、地点、季节限制，有利于工厂化大规模生产的特点。当归的组培快繁主要有三个阶段，第一阶段：通过外植体的初代培养获得愈伤组织；第二阶段，愈伤组织诱导产生大量的丛生芽；第三阶段：丛生芽诱导生根形成完整的植株与炼苗移栽。当归组培快繁第二阶段产生的丛生芽需要在适当的培养基上进一步诱导生根才能得到完整的植株。当丛生芽达到一定数量后，就要使丛生芽分流到生根培养阶段。生根培养是使无根苗生根形成完整植株的过程，这个过程的目的是及时使组培苗生出浓密而粗壮的不定根，以提高组培苗对外界环境的适应力及驯化移栽的成活率，获得更高质量的商品苗；若不能及时将丛生芽转移到生根培养基上，就会使久不转移的组培苗发黄老化，或者因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。因此，第三阶段是当归组培快繁能否进行大量生产和实际应用的关键，同时也是商品化生产出售产品和取得效益的最终关节。
目前，中国关于当归组织培养的报道较少，并且主要集中于愈伤组织培养，不定根的培养也有报道，但存在诱导成本高、移栽成活率低、重复性差，难以实现规模化育苗的问题。
发明内容
本发明为解决上述工艺中存在的不足，克服现有条件下当归组织培养苗生根率低，不定根不强壮，移栽成活率低的难题，提供一种生根率高、根系发达且移栽成活率高的当归组培苗生根培养方法。
本发明提供的当归组培苗的生根培养方法包括以下步骤：
(1)选取健壮的高度为1cm～3cm的从生无根苗，在无菌条件下将从生无根苗切分为单芽，转至生根培养基中，在设定的培养条件下诱导生根，得到试管苗植株幼苗；生根培养时间为4～6周，此时幼苗生长健壮，根系发达，有助于下一步炼苗过程；
(2)将所述试管苗植株幼苗进行炼苗，炼苗时间为一周，练苗过程中在炼苗室释放CO2，并逐渐增加CO2的浓度；
(3)洗去炼苗后的幼苗的培养基，并将幼苗移栽于至搭盖有遮阳网的移栽基质中，避免阳光直射，培养至幼苗开始抽出新芽后置于户外阴凉处生长，50-60天后进行大田移植；所述移栽基质为草炭或蛭石或二者的混合物。
进一步地，所述从生无根苗是采用常规组织培养技术，利用植物离体器官(如根、茎、叶、茎尖等)、组织(如形成层、表皮、皮胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养及光照、温度等条件下，诱导培养得到的组织培养再生幼苗，此处的组培苗是无根的。
进一步地，步骤(1)中的培养条件包括：光照条件为12h/d，光照强度为1500-3000lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％；
进一步地，步骤(1)中生根培养基的配方为：1/2MS或MS固体培养基+0～1.0mg/LIBA+0～1.5mg/LNAA。
IBA可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进当归不定根的形成，但是低浓度的IBA利于不定根的直接发生，高浓度的激素及其配比利于愈伤组织产生，但阻碍根的发生，因此本发明选择IBA浓度范围在0～1.0mg/L；
NAA作为生长调节剂同样能够促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加；
一定浓度的IBA和NAA相互配合能够显著提高不定根的诱导，对根的进一步生长起至关重要的作用。
进一步地，所述MS固体培养基是由MS液添加4.5g/L琼脂制成，PH值为5.8，所述MS液是指Murashige和Skoog研制的液体培养基，其成分配方见表1。
表1 MS培养基成分
Figure BDA0004088019780000031
Figure BDA0004088019780000041
进一步地，步骤(2)中的炼苗步骤包括：在炼苗室内逐渐打开培养瓶盖，使生长于封闭环境中的试管苗逐步暴露于开放的外界环境。
具体的，第一天培养瓶盖打开时间为2h，上午1h，下午1h；第二天培养瓶盖打开时间为4h，上午2h，下午2h；第三天培养瓶盖打开时间为8h，上午3h，下午3h，晚上2h；第四天培养瓶盖打开时间为12h，打开间隔为每隔4h打开4h；第五天培养瓶盖打开时间为16h，每隔4h，打开8h；第6天培养瓶盖打开时间为20h，每隔2h，打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22h，每隔1h，打开11h；
进一步地，练苗过程中控制CO2的浓度为1400-2000ppm。
进一步地，炼苗期内第1天CO2的浓度为1400ppm，以后逐天递增100ppm，至炼苗第7天CO2的浓度为2000ppm，且CO2的释放时间与瓶盖打开时间一致。
进一步地，步骤(3)中培养过程中保持移栽基质和空气湿润，户外生长保持移栽基质为湿润状态。移栽基质的含水率大于或等于40％，空气湿度大于或等于40％。
进一步地，所述移栽基质为体积比为1:1的草炭和蛭石。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的培养方法生根率可达85％以上，移栽成活率在75％以上，不定根伸长较快；
2、本发明采用一步生根法，操作简单、易行，试管苗植株培养时间在4-6周。炼苗7天后，移栽于基质中置于户外阴凉处生长，搭盖遮阳网避免阳光直射，继续培养5-10天幼苗开始抽出新芽；40-60天即可用于大田移栽，本发明有效缩短了诱导生根时间，又能促进不定根生长；
3、练苗过程中控制二氧化碳浓度可以让植株实现自养状态；
4、本发明诱导出的根，根系发达，幼苗健壮，可以有效提高大田种植的成活率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1诱导出的试管苗植株；
图2为本发明实施例1诱导出的大田移栽前的当归不定根。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
本发明以下实施例中所使用的从生无根苗的培养方法为以休眠芽叶片为外植体采用常规培养方法制得，在此不做赘述；
实施例1
(1)选取健壮的1cm～3cm高的从生无根苗，无菌条件下将其切分为单芽，接种至生根培养基(1/2MS(固体培养基)+1.0mg/LIBA)，在光照为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％的环境中诱导生根。生根培养6周后的试管苗植株幼苗生长健壮，根系发达，生根率达100％，见图1。
(2)炼苗：第一天培养瓶盖打开时间为2h，上午1h，下午1h；第二天培养瓶盖打开时间为4h，上午2h，下午2h；第三天培养瓶盖打开时间为8h，上午3h，下午3h，晚上2h；第四天培养瓶盖打开时间为12h，打开间隔为每隔4h打开4h；第五天培养瓶盖打开时间为16h，每隔4h，打开8h；第6天培养瓶盖打开时间为20h，每隔2h，打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22h，每隔1h，打开11h。
(3)用自来水洗去培养基，移栽于草炭和蛭石的体积比为1:1的移栽基质，置于户外阴凉处生长，搭盖遮阳网避免阳光直射，继续培养10d幼苗开始抽出新芽；将抽出新芽的幼苗基质保持湿润状态(含水率不低于40％)，50天后移栽苗种植于大田，移栽成活率达到80％，移栽前当归不定根见图2。
实施例2
(1)选取健壮的1cm～3cm高的从生无根苗，无菌条件下将其切分为单芽，接种至生根培养基(MS(固体培养基)+1.0mg/LIBA+1.5mg/LNAA)，在光照为12h/d，光照强度为1500lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％的环境中诱导生根。生根培养4周后的试管苗植株幼苗生长健壮，根系发达，生根率达90％。
(2)炼苗：第一天培养瓶盖打开时间为2h，上午1h，下午1h；第二天培养瓶盖打开时间为4h，上午2h，下午2h；第三天培养瓶盖打开时间为8h，上午3h，下午3h，晚上2h；第四天培养瓶盖打开时间为12h，打开间隔为每隔4h打开4h；第五天培养瓶盖打开时间为16h，每隔4h，打开8h；第6天培养瓶盖打开时间为20h，每隔2h，打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22h，每隔1h，打开11h。
(3)用自来水洗去培养基，移栽于草炭中，置于户外阴凉处生长，搭盖遮阳网避免阳光直射，继续培养8d幼苗开始抽出新芽；将抽出新芽的幼苗基质保持湿润状态(含水率不低于40％)，50d后移栽苗种植于大田，移栽成活率达到85％。
实施例3
(1)选取健壮的1cm～3cm高的从生无根苗，无菌条件下将其切分为单芽，接种至生根培养基(MS(固体培养基)+1.0mg/LIBA)，在光照为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％的环境中诱导生根。生根培养5周后的试管苗植株幼苗生长健壮，根系发达，生根率达85％。
(2)炼苗：第一天培养瓶盖打开时间为2h，上午1h，下午1h；第二天培养瓶盖打开时间为4h，上午2h，下午2h；第三天培养瓶盖打开时间为8h，上午3h，下午3h，晚上2h；第四天培养瓶盖打开时间为12h，打开间隔为每隔4h打开4h；第五天培养瓶盖打开时间为16h，每隔4h，打开8h；第6天培养瓶盖打开时间为20h，每隔2h，打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22h，每隔1h，打开11h。
(3)用自来水洗去培养基移栽于草炭中，置于户外阴凉处生长，搭盖遮阳网避免阳光直射，继续培养9d幼苗开始抽出新芽；将抽出新芽的幼苗基质保持湿润状态(含水率不低于40％)，55天后移栽苗种植于大田，移栽成活率达到76％。
实施例4
(1)选取健壮的1cm～3cm高的从生无根苗，无菌条件下将其切分为单芽，接种至生根培养基(1/2MS(固体培养基)+1.0mg/LIBA+1.5mg/LNAA)，在光照为12h/d，光照强度为2500lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％的环境中诱导生根。生根培养5周后的试管苗植株幼苗生长健壮，根系发达，生根率达92％。
(2)炼苗：第一天培养瓶盖打开时间为2h，上午1h，下午1h；第二天培养瓶盖打开时间为4h，上午2h，下午2h；第三天培养瓶盖打开时间为8h，上午3h，下午3h，晚上2h；第四天培养瓶盖打开时间为12h，打开间隔为每隔4h打开4h；第五天培养瓶盖打开时间为16h，每隔4h，打开8h；第6天培养瓶盖打开时间为20h，每隔2h，打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22h，每隔1h，打开11h。
(3)用自来水洗去培养基移栽于草炭中，置于户外阴凉处生长，搭盖遮阳网避免阳光直射，继续培养10d开始抽出新芽；将抽出新芽的幼苗基质保持湿润状态(含水率不低于40％)，60天后移栽苗种植于大田，移栽成活率达到87％。
实施例5
(1)选取健壮的1cm～3cm高的从生无根苗，无菌条件下将其切分为单芽，接种至生根培养基(1/2MS(固体培养基)+1.0mg/LIBA+1.5mg/LNAA)，在光照为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％的环境中诱导生根。生根培养4周后的试管苗植株幼苗生长健壮，根系发达，生根率达100％。
(2)炼苗：第一天培养瓶盖打开时间为2h，上午1h，下午1h；第二天培养瓶盖打开时间为4h，上午2h，下午2h；第三天培养瓶盖打开时间为8h，上午3h，下午3h，晚上2h；第四天培养瓶盖打开时间为12h，打开间隔为每隔4h打开4h；第五天培养瓶盖打开时间为16h，每隔4h，打开8h；第6天培养瓶盖打开时间为20h，每隔2h，打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22h，每隔1h，打开11h。
(3)用自来水洗去培养基移栽于草炭和蛭石的体积比为1:1的移栽基质，置于户外阴凉处生长，搭盖遮阳网避免阳光直射，继续培养10d开始抽出新芽；将抽出新芽的幼苗基质保持湿润状态(含水率不低于40％)，50d后苗种植于大田，移栽成活率达到90％。
实施例6
(1)选取健壮的1cm～3cm高的从生无根苗，无菌条件下将其切分为单芽，接种至生根培养基(1/2MS固体培养基)，在光照为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％的环境中诱导生根。生根培养6周后的试管苗植株幼苗生长健壮，根系发达，生根率达72％。
(2)炼苗：第一天培养瓶盖打开时间为2h，上午1h，下午1h；第二天培养瓶盖打开时间为4h，上午2h，下午2h；第三天培养瓶盖打开时间为8h，上午3h，下午3h，晚上2h；第四天培养瓶盖打开时间为12h，打开间隔为每隔4h打开4h；第五天培养瓶盖打开时间为16h，每隔4h，打开8h；第6天培养瓶盖打开时间为20h，每隔2h，打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22h，每隔1h，打开11h。
(3)用自来水洗去培养基移栽于草炭和蛭石的体积比为1:1的移栽基质，置于户外阴凉处生长，搭盖遮阳网避免阳光直射，继续培养14d幼苗开始抽出新芽；将抽出新芽的幼苗基质保持湿润状态(含水率不低于40％)，50d后移栽苗种植于大田，移栽成活率达到75％。
实施例7
(1)选取健壮的1cm～3cm高的从生无根苗，无菌条件下将其切分为单芽，接种至生根培养基(1/2MS固体培养基+1.5mg/LNAA)，在光照为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％的环境中诱导生根。生根培养6周后的试管苗植株幼苗生长健壮，根系发达，生根率达95％。
(2)炼苗：第一天培养瓶盖打开时间为2h，上午1h，下午1h；第二天培养瓶盖打开时间为4h，上午2h，下午2h；第三天培养瓶盖打开时间为8h，上午3h，下午3h，晚上2h；第四天培养瓶盖打开时间为12h，打开间隔为每隔4h打开4h；第五天培养瓶盖打开时间为16h，每隔4h，打开8h；第6天培养瓶盖打开时间为20h，每隔2h，打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22h，每隔1h，打开11h。
(3)用自来水洗去培养基移栽于草炭和蛭石的体积比为1:1的移栽基质，置于户外阴凉处生长，搭盖遮阳网避免阳光直射，继续培养10d开始抽出新芽；将抽出新芽的幼苗基质保持湿润状态(含水率不低于40％)，50d后移栽苗种植于大田，移栽成活率达到75％。
实施例8
(1)选取健壮的1cm～3cm高的从生无根苗，无菌条件下将其切分为单芽，接种至生根培养基(1/2MS(固体培养基)+2.0mg/LIBA+2.5mg/LNAA)，在光照为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％的环境中诱导生根。生根培养6周后的试管苗植株幼苗生长健壮，根系发达，生根率达60％。
(2)炼苗：第一天培养瓶盖打开时间为2h，上午1h，下午1h；第二天培养瓶盖打开时间为4h，上午2h，下午2h；第三天培养瓶盖打开时间为8h，上午3h，下午3h，晚上2h；第四天培养瓶盖打开时间为12h，打开间隔为每隔4h打开4h；第五天培养瓶盖打开时间为16h，每隔4h，打开8h；第6天培养瓶盖打开时间为20h，每隔2h，打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22h，每隔1h，打开11h。
(3)用自来水洗去培养基移栽于草炭和蛭石的体积比为1:1的移栽基质，置于户外阴凉处生长，搭盖遮阳网避免阳光直射，继续培养10d开始抽出新芽；将抽出新芽的幼苗基质保持湿润状态(含水率不低于40％)，50d后移栽苗种植于大田，移栽成活率达到77％。
实施例9
同实施例1，区别在于未进行炼苗操作，最终的移栽成活率为52％。
实施例10
同实施例1，区别在于，在练苗期内第1天控制CO2浓度为1400ppm，以后逐天递增100ppm，至炼苗第7天CO2浓度为2000ppm，且CO2的释放时间与瓶盖打开时间一致。
对实施例1-实施例10制备的移栽前不定根的数量和质量进行记录，结果见表2；
表2移栽前不定根的数量和质量
根条数 平均根长，cm 状态
实施例1 12根 0.5cm 致密
实施例2 10根 0.5cm 致密
实施例3 13根 0.5cm 致密
实施例4 13根 0.5cm 致密
实施例5 11根 0.5cm 致密
实施例6 8根 0.3cm 绵软
实施例7 7根 0.3cm 绵软
实施例8 8根 0.3cm 绵软
实施例9 9根 0.3cm 绵软
实施例10 15根 0.5cm 致密
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种当归组培苗生根培养方法，其特征在于，所述当归组培苗生根培养方法包括：
选取高度为1cm～3cm的从生无根苗；所述生无根苗为采用常规组织培养技术，利用植物离体器官、组织或细胞以及原生质体，在设定条件下诱导培养得到的组织培养再生幼苗；
在无菌条件下将所述从生无根苗切分为单芽；
将所述单芽接种至转至生根培养基中，在设定的培养条件下诱导生根，得到试管苗植株幼苗；生根培养时间为4～6周；
将所述试管苗植株幼苗进行炼苗，炼苗时间为一周，练苗过程中在炼苗室释放CO2，并逐渐增加CO2的浓度；
洗去炼苗后的幼苗的培养基，并将幼苗移栽至搭盖有遮阳网的移栽基质中，培养至幼苗开始抽出新芽后置于户外阴凉处生长，50-60天后进行大田移植；所述移栽基质为草炭或蛭石或二者的混合物。
2.根据权利要求1所述的当归组培苗生根培养方法，其特征在于，所述培养条件包括：光照条件为12h/d，光照强度为1500-3000lx，培养温度为23±1℃，相对湿度为50～60％。
3.根据权利要求1所述的当归组培苗生根培养方法，其特征在于，所述生根培养基为：1/2MS固体培养基+0～1.0mg/LIBA+0～1.5mg/LNAA。
4.根据权利要求1所述的当归组培苗生根培养方法，其特征在于，所述生根培养基为：MS固体培养基+0～1.0mg/LIBA+0～1.5mg/LNAA。
5.根据权利要求4所述的当归组培苗生根培养方法，其特征在于，所述MS固体培养基由MS液添加4.5g/L琼脂制成，PH值为5.8。
6.根据权利要求1所述的当归组培苗生根培养方法，其特征在于，将所述试管苗植株幼苗进行炼苗，具体包括：
在培养室内逐渐打开培养瓶盖，使生长于封闭环境中的试管苗逐步暴露于开放的外界环境。
7.根据权利要求6所述的当归组培苗生根培养方法，其特征在于，第一天培养瓶盖的打开时间为2小时：上午1小时，下午1小时；第二天培养瓶盖打开时间为4小时：上午2小时，下午2小时；第三天培养瓶盖打开时间为8小时：上午3小时，下午3小时，晚上2小时；第四天培养瓶盖打开时间为12小时：每隔4小时打开4小时；第五天培养瓶盖打开时间为16小时：每隔4小时打开8小时；第6天培养瓶盖打开时间为20小时：每隔2小时打开10h；第7天打开培养瓶盖打开时间为22小时：每隔1h打开11h。
8.根据权利要求1所述的当归组培苗生根培养方法，其特征在于，练苗过程中控制CO2的浓度为1400-2000ppm。
9.根据权利要求1所述的当归组培苗生根培养方法，其特征在于，生根培养及户外生长过程中，移栽基质的含水率大于或等于40％，空气湿度大于或等于40％。
10.根据权利要求1所述的当归组培苗生根培养方法，其特征在于，所述移栽基质为体积比为1:1的草炭和蛭石。
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