CN114403003B

CN114403003B - 一种绿樱花植株离体再生的方法

Info

Publication number: CN114403003B
Application number: CN202210031678.0A
Authority: CN
Inventors: 侯金艳; 吴丽芳; 王大成; 王萍; 苏鹏飞; 丁双双; 王军
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2022-01-12
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2042-01-12
Also published as: CN114403003A

Abstract

本发明公开了一种绿樱花植株离体再生的方法，包括以下步骤：(1)腋芽的萌发诱导；(2)不定芽的诱导和伸长培养；(3)不定根的诱导培养，最终获得完整的绿樱花再生植株。本发明以野外郁金樱的当年生半木质茎段为外植体，通过直接不定芽诱导实现郁金樱植株的离体再生，取材方便、材料丰富，能保持郁金樱母本株系的优良性状，再生效率高，腋芽萌发绿最高达100％，不定芽诱导率高达94.6％，平均每个外植体产生6.3个不定芽，平均不定芽长度为4.3cm，不定根诱导率最高为94.7％；本发明再生过程简单，育苗周期短，8‑9周即可成苗，且能够实现对所获得的再生植株进行进一步的扩大繁殖，为郁金樱植株的快速繁殖和后期优良株系的规模化生产提供了技术支撑。

Description

一种绿樱花植株离体再生的方法

技术领域

本发明涉及植物快速繁殖技术领域，具体涉及一种绿樱花植株离体再生的方法。

背景技术

樱花为蔷薇科樱属多年生木本景观植物，品种众多，因其株型优美、花色艳丽，花期较长，为早春主要观赏花木之一，在园林上有极大的应用价值。郁金樱作为绿樱的一种，花期在3-4月，因其淡黄绿色花而独具特色，在盛花期和落花期均具有极高的观赏价值。近年来，随着樱花产业的迅猛发展，市场对郁金樱种苗的需求量也日益增加。

目前，生产上郁金樱主要通过嫁接方式繁殖，如申请号为CN201210597543.7的专利公开一种绿樱花的嫁接技术，但该繁殖方法存在繁殖系数低，繁殖周期长，占用空间资源大且繁殖受季节和材料限制等问题，很难满足市场对郁金樱种苗的需求。植物组织培养技术因其高效性和无时节限制性，在樱花种苗繁育中起着至关重要的作用。目前有关郁金樱组培研究较少，以叶片为外植体通过愈伤组织诱导、分化途径进行离体再生的研究已有零星报道，但繁殖过程存在强烈的玩拗现象，愈伤组织分化率低，最大仅为78.14％，且随着继代次数的增加，外植体出现叶片发黄、毒害作用加强及大量死亡等问题。此外，通过愈伤组织诱导途径很难保持郁金樱母本植株的优良农艺性状，难以在短期内大量生产优良无性系苗木。目前，有关其他樱花品种的组培快繁研究也已有报道，但对于不同樱花品种，即便是同一樱花品种不同材料，由于再生能力存在差异，已有的组培技术也不可直接套用。

因此，针对郁金樱繁育所存在的诸多问题急需开发一种绿樱花植株离体再生的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于如何在保持绿樱花母本植株的优良农艺性状的同时，在短期内大量生产优良无性系苗木。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种绿樱花植株离体再生的方法，包括以下步骤：

(1)取材：以郁金樱的当年生半木质化的带腋芽茎段为外植体；

(2)将步骤(1)中的带腋芽茎段进行表面消毒；

(3)将步骤(2)中消毒后的茎段接种于腋芽诱导培养基中进行腋芽的萌发诱导；

(4)带腋芽萌发后，分离腋芽并转接于不定芽诱导培养基中进行不定芽的诱导和伸长培养；

(5)将伸长的不定芽分离后转接于不定根诱导培养基中进行不定根的诱导培养，最终获得完整的绿樱花再生植株。

本发明以野外郁金樱的当年生半木质茎段为外植体，通过直接不定芽诱导实现郁金樱植株的离体再生，具有取材方便、材料丰富的优点，且能保持郁金樱母本株系的优良性状。

繁育过程采用带腋芽的茎段直接诱导不定芽，再生效率高，腋芽萌发绿最高达100％，不定芽诱导率高达94.6％，平均每个外植体产生6.3个不定芽，平均不定芽长度为4.3cm，不定根诱导率最高为94.7％。

本发明再生过程简单，育苗周期短，8-9周即可成苗，且能够实现对所获得的再生植株进行进一步的扩大繁殖，为郁金樱植株的快速繁殖和后期优良株系的规模化生产提供了技术支撑。

优选地，所述步骤(1)中带腋芽茎段是指将郁金樱的当年生半木质化茎段剪切成2-3cm带腋芽的切段。

优选地，所述步骤(2)中茎段表面消毒是指将带腋芽茎段先于流水下冲洗30-40min；然后用75％的无水乙醇消毒擦拭1遍后置于无菌操作台中用无菌水冲洗3-4遍；紧接着用75％的无水乙醇消毒30-45s；再用无菌水冲洗3-4遍；之后再用10％过氧化氢溶液消毒3-7min，最后用无菌水冲洗6遍，消毒后吸干表面水分，备用。

有益效果：采用10％过氧化氢溶液消毒5min的消毒效果最佳，茎段腋芽的生长状态最好，茎段污染率为3.9％，腋芽萌发率为92.3％。

优选地，所述消毒期间需不停地摇动茎段。

优选地，所述步骤(3)中腋芽诱导培养基为添加有0.2-1.0mg/L ZT、0.05-0.5mg/LGA3、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基。

有益效果：对于消毒后的半木质化茎段而言，DKW培养基中添加0.5mg/L ZT和0.1mg/L GA3时，茎段不定芽的诱导效果最好，腋芽萌发率最高达92.3％，污染率为3.9％。

优选地，所述步骤(4)中不定芽诱导培养基为为添加有0.2-0.5mg/L 6-BA、0.05-0.5mg/L ZT、0.05-0.2mg/L IAA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基。

有益效果：0.3mg/L 6-BA结合0.2mg/L ZT和0.05mg/L IAA使用时不定芽的诱导效果最好，不定芽诱导率为89.7％，平均每个外植体产生4.7个不定芽。

优选地，所述步骤(5)中不定根诱导培养基为添加有0.1-2.0mg/L K-IBA、0.05-0.5mg/L IAA、20g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的1/2DKW培养基。

有益效果：培养基中K-IBA及IAA的使用能够有效的促进不定根的形成，且在一定浓度范围内，随着培养基中K-IBA及IAA浓度的增加，不定根的诱导率逐渐增加，平均每个外植体产生的不定根个数也逐渐增加；当浓度达到一定程度上，促进作用逐渐减弱，培养基中1.0mg/L K-IBA及0.1mg/L IAA不定根的诱导效果最好，不定根诱导效率为91.2％，平均每个外植体产生7.6条不定根。

优选地，所述步骤(3)中腋芽的萌发诱导培养条件为：温度为25±2℃，光周期为明期16h/暗期8h，光照强度为2000lx的恒温培养室，培养周期为2-3周。

优选地，所述步骤(4)中不定芽的诱导和伸长培养条件为：温度为25±2℃，光周期为明期16h/暗期8h，光照强度为2000lx的恒温培养室，培养周期为30-45d周。

优选地，所述步骤(5)中不定根的诱导培养条件为：温度为25±2℃，光周期为明期16h/暗期8h，光照强度为2000lx的恒温培养室，培养周期为3-4周。

本发明具有如下的有益效果：

1、本发明以野外郁金樱的当年生半木质茎段为外植体，通过直接不定芽诱导实现郁金樱植株的离体再生，具有取材方便、材料丰富的优点，且能保持郁金樱母本株系的优良性状；繁育过程采用带腋芽的茎段直接诱导不定芽，再生效率高，腋芽萌发绿最高达100％，不定芽诱导率高达94.6％，平均每个外植体产生6.3个不定芽，平均不定芽长度为4.3cm，不定根诱导率最高为94.7％；本发明再生过程简单，育苗周期短，8-9周即可成苗，且能够实现对所获得的再生植株进行进一步的扩大繁殖，为郁金樱植株的快速繁殖和后期优良株系的规模化生产提供了技术支撑。

2、过氧化氢消毒时间对郁金樱野外茎段再生具有一定的影响，采用10％过氧化氢溶液消毒5min的消毒效果最佳，茎段腋芽的生长状态最好，茎段污染率为3.9％，腋芽萌发率为92.3％。

3、培养基中ZT和GA3浓度对绿樱花茎段腋芽萌发具有一定的影响，对于消毒后的半木质化茎段而言，DKW培养基中添加0.5mg/L ZT和0.1mg/L GA3时，茎段不定芽的诱导效果最好，腋芽萌发率最高达92.3％，污染率为3.9％。

4、植物生长调节剂种类和浓度对茎段不定芽诱导具有一定的影响，采用0.3mg/L6-BA结合0.2mg/L ZT和0.05mg/L IAA使用时不定芽的诱导效果最好，不定芽诱导率为89.7％，平均每个外植体产生4.7个不定芽。

5、培养基中K-IBA及IAA的使用能够有效的促进不定根的形成，且在一定浓度范围内，随着培养基中K-IBA及IAA浓度的增加，不定根的诱导率逐渐增加，平均每个外植体产生的不定根个数也逐渐增加；当浓度达到一定程度上，促进作用逐渐减弱，培养基中1.0mg/LK-IBA及0.1mg/L IAA不定根的诱导效果最好，不定根诱导效率为91.2％，平均每个外植体产生7.6条不定根。

附图说明

图1为本发明实施例1的于腋芽萌发培养基上的郁金樱茎段图；

图2本发明实施例1的于腋芽萌发培养基上培养14d的郁金樱茎段图；

图3本发明实施例1的于不定芽诱导培养基上培养45d的郁金樱丛生芽图；

图4本发明实施例1的于生根培养基上培养4周获得的完整郁金樱植株图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

一种绿樱花植株离体再生的方法，包括以下步骤：

(2)将步骤(1)中的茎段剪切成2-3cm带腋芽的切段，于流水下冲洗30min；然后用75％的无水乙醇消毒擦拭1遍后置于无菌操作台中用无菌水冲洗4遍；紧接着用75％的无水乙醇消毒45s；再用无菌水冲洗3遍；之后再用10％过氧化氢溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗6遍，消毒期间不停的摇动，消毒后吸干表面水分，备用；

(3)将步骤(2)中消毒后的茎段接种于添加有0.5mg/L ZT、0.1mg/L GA3、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基中，然后于温度为25±2℃，光周期为明期16h/暗期8，光照强度为2000lx的恒温培养室进行腋芽的萌发诱导(如图1所示)，培养14d后腋芽萌发(如图2所示)，萌发率为92.3％；

(4)继续光照培养1周后，分离步骤(3)中的腋芽并将腋芽转接于添加有0.3mg/L6-BA、0.2mg/L ZT、0.05mg/L IAA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基中进行不定芽的诱导和伸长培养，光照培养45d后，不定芽诱导率为89.7％，平均每个外植体产生4.7个不定芽，平均不定芽长4.5cm(如图3所示)；

(5)将步骤(4)中伸长的不定芽转接于添加有1.0mg/L K-IBA、0.1mg/L IAA、20g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的1/2DKW培养基中进行不定根的诱导培养，光照培养2周后茎段基部形成不定根原基，继续培养2周后获得完整的绿樱花再生植株(如图4所示)，不定根诱导率为91.2％，平均每个外植体产生7.6条不定根。

实施例2

一种绿樱花植株离体再生的方法，包括以下步骤：

(1)取材：以郁金樱组培伸长芽的带腋芽茎段为外植体来源；

(2)将步骤(1)中的茎段剪切成0.5-1.0cm带腋芽的切段，接种于添加有0.2mg/LZT、0.05mg/L GA3、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基中于为25±2℃，光周期为明期16h/暗期8h，光照强度为2000lx的恒温培养室进行腋芽的萌发诱导，培养7d后腋芽萌发，萌发率为100％；

(3)继续光照培养1周后，步骤(2)中的茎段外植体转接于添加有0.2mg/L6-BA、0.1mg/L ZT、0.05mg/L IAA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基中进行不定芽的诱导和伸长培养；光照培养30d后不定芽诱导率高达94.6％，平均每个外植体产生6.3个不定芽，平均不定芽长度为4.3cm；

(4)将步骤(3)中伸长的不定芽转接于添加有1.0mg/L K-IBA、0.1mg/L IAA、20g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的1/2 DKW培养基中进行不定根的诱导培养，光照培养1周后茎段基部形成不定根原基，继续培养2周后获得完整的绿樱花再生植株，不定根诱导率为94.7％。

实施例3

为进一步测试过氧化氢消毒时间对郁金樱野外茎段再生的影响，发明人以野外郁金樱的当年生半木质枝条为外植体，将茎段剪切成2-3cm带腋芽的切段，于流水下冲洗30min；然后，用75％的无水乙醇消毒擦拭1遍后置于无菌操作台中用无菌水冲洗4遍；用75％的无水乙醇消毒45s；再用无菌水冲洗3遍；之后再用10％过氧化氢溶液消毒不同时间(1，3，5，7和10min)，最后用无菌水冲洗6遍，消毒期间不停的摇动，消毒后吸干表面水分，备用；然后将消毒后的茎段接种于实施例1中的腋芽萌发培养基中进行腋芽的萌发培养；培养2周后，统计茎段的污染率及腋芽的萌发率。

表1为10％过氧化氢消毒时间对郁金樱茎段污染及腋芽萌发的影响

消毒时间(min)	污染率(％)	萌发率(％)
			1	11.1	61.2
3	7.6	80.5
			5	3.9	92.3
7	2.1	83.6
			10	0.0	67.4

表1结果表明，随着10％过氧化氢消毒时间的延长，茎段污染率逐渐降低，腋芽萌发率呈现先增后减的现象；综合考虑污染及再生情况，在所测试的消毒时间中，消毒5min的消毒效果最佳，茎段腋芽的生长状态最好，茎段污染率为3.9％，腋芽萌发率为92.3％。

实施例4

为进一步测试培养基中ZT和GA3浓度对绿樱花茎段腋芽萌发的影响，发明人将实施例1中消毒后的带腋芽的茎段接种于添加不同浓度ZT(0.0，0.2，0.5，1.0和2.0mg/L)和GA3(0.0，0.05，0.1，0.2，0.5和1.0mg/L)的DKW培养基中进行腋芽的诱导培养。再生条件同实施例1。

表2为不同浓度ZT和GA3对郁金樱茎段腋芽萌发的影响

ZT(mg/L)	GA3(mg/L)	腋芽萌发率(％)
			0.0	0.0	33.8
0.2	--	56.7
			0.5	--	73.4
1.0	--	81.2
			2.0	--	71.3
--	0.05	50.4
			--	0.2	78.6
--	0.5	84.9
			--	1.0	65.3
0.2	0.05	89.1
			0.5	0.1	92.3
1.0	0.5	91.2
			2.0	1.0	63.7

表2研究表明，培养基中ZT和GA3的添加对腋芽的萌发起着重要的促进作用，且在适宜浓度范围两者对腋芽的萌发起到协同促进作用；其中对于消毒后的半木质化茎段而言，DKW培养基中添加0.5mg/L ZT和0.1mg/L GA3时，茎段不定芽的诱导效果最好，腋芽萌发率最高达92.3％，污染率为3.9％。

同时为了测试植物生长调节剂种类和浓度对茎段不定芽诱导的影响，将实施例1中萌发的腋芽分离后转接于添加有不同浓度的6-BA、ZT和IAA的DKW培养基中进行不定芽的诱导培养。

表3为不同植物生长调节剂对郁金樱茎段不定芽诱导的影响

表3研究表面，低浓度的细胞分裂素(6-BA和ZT)均能促进不定芽的形成，与低浓度的IAA结合使用时具有协同促进作用，随着培养基中IAA浓度的增大，不定芽出现矮化且基部伴有愈伤组织形成；在所测试的植物生长调节剂种类和浓度中，0.3mg/L 6-BA结合0.2mg/L ZT和0.05mg/L IAA使用时不定芽的诱导效果最好，不定芽诱导率为89.7％，平均每个外植体产生4.7个不定芽。

在此基础上，进一步测试了K-IBA及IAA浓度对伸长芽不定根形成的影响。将实施例1中的伸长芽接种于添加有不同浓度K-IBA和IAA的1/2DKW培养基中，于实施例1中的培养条件下进行不定根的诱导。

表4为K-IBA及IAA浓度对郁金樱不定根形成的影响

表4研究表面，培养基中K-IBA及IAA的使用能够有效的促进不定根的形成，且在一定浓度范围内，随着培养基中K-IBA及IAA浓度的增加，不定根的诱导率逐渐增加，平均每个外植体产生的不定根个数也逐渐增加；当浓度达到一定程度上，促进作用逐渐减弱，在所测试的浓度中，培养基中1.0mg/L K-IBA及0.1mg/L IAA不定根的诱导效果最好，不定根诱导效率为91.2％，平均每个外植体产生7.6条不定根。

综上，本发明以野外郁金樱的当年生半木质茎段为外植体，通过直接不定芽诱导实现郁金樱植株的离体再生，具有取材方便、材料丰富的优点，且能保持郁金樱母本株系的优良性状；繁育过程采用带腋芽的茎段直接诱导不定芽，再生效率高；本发明再生过程简单，育苗周期短，且能够实现对所获得的再生植株进行进一步的扩大繁殖，为郁金樱植株的快速繁殖和后期优良株系的规模化生产提供了技术支撑。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种绿樱花植株离体再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取材：以郁金樱的当年生半木质化的带腋芽茎段为外植体；

（2）将步骤（1）中的带腋芽茎段进行表面消毒；

（3）将步骤（2）中消毒后的茎段接种于腋芽诱导培养基中进行腋芽的萌发诱导；所述腋芽诱导培养基为添加有0.2-1.0mg/L ZT、0.05-0.5mg/L GA3、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基；

（4）待腋芽萌发后，分离腋芽并转接于不定芽诱导培养基中进行不定芽的诱导和伸长培养；所述不定芽诱导培养基为添加有0.2-0.5mg/L 6-BA、0.05-0.5mg/L ZT、0.05-0.2mg/L IAA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的DKW培养基；

（5）将伸长的不定芽分离后转接于不定根诱导培养基中进行不定根的诱导培养，最终获得完整的绿樱花再生植株；所述不定根诱导培养基为添加有0.1-2.0mg/L K-IBA、0.05-0.5mg/L IAA、20g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的1/2 DKW培养基。

2.根据权利要求1所述的一种绿樱花植株离体再生的方法，其特征在于：所述步骤（1）中带腋芽茎段是指将郁金樱的当年生半木质化茎段剪切成2-3cm带腋芽的切段。

3.根据权利要求2所述的一种绿樱花植株离体再生的方法，其特征在于：所述步骤（2）中茎段表面消毒是指将带腋芽茎段先于流水下冲洗30-40min；然后用75%的无水乙醇消毒擦拭1遍后置于无菌操作台中用无菌水冲洗3-4遍；紧接着用75%的无水乙醇消毒30-45s；再用无菌水冲洗3-4遍；之后再用10%过氧化氢溶液消毒3-7min，最后用无菌水冲洗6遍，消毒后吸干表面水分，备用。

4.根据权利要求3所述的一种绿樱花植株离体再生的方法，其特征在于：所述消毒期间需不停地摇动茎段。

5.根据权利要求1所述的一种绿樱花植株离体再生的方法，其特征在于：所述步骤（3）中腋芽的萌发诱导培养条件为：温度为25±2℃，光周期为明期16h/暗期8h，光照强度为2000lx的恒温培养室，培养周期为2-3周。

6.根据权利要求1所述的一种绿樱花植株离体再生的方法，其特征在于：所述步骤（4）中不定芽的诱导和伸长培养条件为：温度为25±2℃，光周期为明期16h/暗期8h，光照强度为2000lx的恒温培养室，培养周期为30-45d。

7.根据权利要求1所述的一种绿樱花植株离体再生的方法，其特征在于：所述步骤（5）中不定根的诱导培养条件为：温度为25±2℃，光周期为明期16h/暗期8h，光照强度为2000lx的恒温培养室，培养周期为3-4周。