CN113243296B - 一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法 - Google Patents

一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于虎舌红植物组织培养技术领域，具体公开了一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法。该方法包括枝条的获取、茎段预处理和消毒、初代培养、增殖培养、培养物继代增殖。本发明所采用的消毒试剂与消毒时间，获得了较低污染率的茎段，污染率仅为36.3％；对带芽茎段进行20～60天的初代萌发诱导，获得了较高的萌发率，萌发率为90.9％；对萌发的茎段增殖培养30～60天，增殖系数为8.33；对培养物继代培养45～55天，平均增殖系数为10.83、最高增殖系数为22.0。本发明筛选出适宜的消毒试剂及消毒时间、茎段初代培养和增殖培养基，培养物继代培养基，获得了大量的红色芽丛，为保留虎舌红红色单株的优良特性，提高其观赏性及其后续苗木繁育提供技术保障，为产业开发奠定了基础。

Description

一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法
技术领域
本发明属于虎舌红植物组织培养技术领域，具体公开了一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法。
背景技术
虎舌红(Ardisia mamillata Hance)，紫金牛科紫金牛属多年生常绿小灌木，其叶片两面呈绿色或暗紫红色，且均被绒毛，光泽美丽；花呈伞状花序；果实呈鲜红色，果期长，是集观叶、观花和观果的观赏植物；其根、茎、叶均为中药材，具有较高的观赏和药用价值。虎舌红为世界名贵花卉，野生资源稀少，主要生于山间、竹林以及灌木丛阴湿处，呈零星分布，自我更新能力差，为世界濒危植物。由于市场对虎舌红的需求日益增大，导致虎舌红野生资源日渐枯竭。因此，开展虎舌红繁育技术的研究是解决当下虎舌红资源稀缺迫切的需求。
虎舌红繁殖方法较多，如播种、埋根、嫁接和扦插等。虽然虎舌红播种繁殖的萌发率高，但是种子繁殖存在繁育周期长，遗传变异大和实生苗性状不稳定等特点使得播种繁殖获得的实生苗观赏价值大大降低。大多数研究表明，虎舌红属于独干型株型，几乎没有侧枝，所以嫁接与扦插所需繁殖材料欠缺，虎舌红组培中又存在茎段污染率高、增殖系数低等亟需解决的技术问题。
因此，本发明旨在基于无性繁殖，设计一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法，使得母本的优良性状得以保留，确保高效的繁殖，优化培养基，通过初代诱导萌发茎段的增殖和培养物的增殖两种方式提高其增殖系数，为虎舌红扩繁、种质资源保存和产业化生产等研究提供技术支撑，以解决上述存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法，以解决虎舌红组培中茎段污染率高、增殖系数低的问题。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法。
本技术方案的工作原理在于：(1)枝条的获取：选择生长健壮和无病虫害的红色植株，剪取5～10cm长的主枝；
(2)茎段预处理：将步骤(1)的主枝剪除叶片，装入400～500ml水的烧杯中，首先滴入4～5滴洗洁精放在磁力搅拌器上搅拌10～15min，然后用牙刷将主枝清洗干净转移至自来水下流水冲洗20～30min，最后剪成3～5cm长的茎段；
(3)茎段消毒：在超净工作台上，将步骤(2)中的茎段用70％～75％乙醇处理1～2min、0.1％～0.2％HgCl2处理10～15min、1％～2％NaClO处理2～5min、期间间隔10～30秒摇晃一次，最后用无菌水清洗3～5次，装入灭菌的培养瓶中；
(4)茎段初代培养：将步骤(3)的茎段用灭菌滤纸吸干水分后，用灭菌镊子和刀片切成带1个芽、1～1.5cm长的茎段作为外植体，接种至MS基本培养基，培养基中添加6-BA(1.0～4.0mg/L)，NAA(0.1～0.5mg/L)，IBA(0.1～0.2mg/L)，GA3(2.0mg/L)，培养20～60天；
(5)茎段增殖诱导：将步骤(4)中萌发的茎段转至新的MS基本培养基，培养基中添加6-BA(2.0mg/L、4.0mg/L)，NAA(0.1mg/L、0.2mg/L)，GA3(2.0mg/L)，培养30～60天；
(6)继代增殖培养：将步骤(5)中增殖的培养物转移至新的MS基本培养基，培养基中添加6-BA(4.0mg/L)、GA3(2.0mg/L)、IAA(0.2mg/L)，培养45～55天。
本技术方案的有益效果在于：
(1)本发明方法以虎舌红红色观赏类型的主枝上的带芽茎段为外植体，能保持母本的优良观赏特性；
(2)本发明方法所采用的消毒试剂与消毒时间，获得了较低污染率的带芽茎段，污染率仅为36.3％；
(3)本发明方法20～60天对虎舌红带芽茎段进行初代萌发培养，获得了较高的萌发率，萌发率高达90.9％；
(4)本发明方法30～60天对萌发的茎段进行增殖培养，获得了较高的增殖系数，增殖系数为8.33；
(5)本发明方法45～55天对带愈伤茎段的继代增殖培养，获得了比(4)更高的增殖系数，平均增殖系数为10.83、最高增殖系数可达22.0，为保留红色虎舌红单株的优良特性、进行产业开发奠定了基础。
附图说明
图1是获取的红色虎舌红的主枝(2020年3月22日拍照)；
图2是图1中的主枝带回室内剪去叶片等预处理；
图3是图2中的外植体接种到初代培养基，接种第38天的萌发效果(4月29日拍照)；
图4是图3中的培养物转接到茎段增殖培养基，即接种第50天转接(5月12日拍照)；
图5是图4中的茎段增殖30天的效果(6月11日拍照)；
图6是图4中茎段上萌发的不定芽增殖43天的效果(6月24日拍照)；
图7是为进行继代增殖培养所选取的培养物(11月9日拍照)；
图8是对图7中的培养物进行分割(11月9日拍照)；
图9是将图7中的培养物分割成4种外植体：①单芽、②顶芽、③茎段、④带愈伤茎段；
图10是图9的外植体接种到继代增殖培养基(11月9日拍照)；
图11是图9中的4种外植体继代培养55天的增殖效果之一(2021年1月5日拍照)；
图12是图9中的4种外植体继代培养55天的增殖效果之二(2021年1月5日拍照)；
图13中图9中带愈伤茎段继代55天的增殖效果之一(2021年1月5日拍照)；
图14是图9中带愈伤茎段继代55天的增殖效果之二(2021年1月5日拍照)。
具体实施方式
以下结合附图1-14对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法，包括以下步骤：
(1)枝条的获取：选择生长健壮和无病虫害的红色植株，剪取5～10cm长的主枝(图1)；
(2)茎段预处理：步骤(1)的主枝剪除叶片，装入400～500ml水的烧杯中，首先滴入4～5滴洗洁精放在磁力搅拌器上搅拌10～15min，然后用牙刷清洗干净转移至自来水下流水冲洗20～30min，最后剪成3～5cm长的茎段(图2)；
(3)茎段消毒：在超净工作台上，将步骤(2)中的茎段用70％～75％乙醇处理1～2min、0.1％～0.2％HgCl2处理10～15min、1％～2％NaClO处理2～5min、期间间隔10～30秒摇晃一次，最后用无菌水清洗3～5次，装入灭菌的培养瓶中。具体配方如表1，每瓶接种一个外植体，每组接种22～40个，30天后统计污染率和萌发率；
表1不同消毒处理对茎段污染率和萌发率的影响
Figure BDA0003130189770000041
由表1可知：消毒时间越短，污染率越高，但对外植体的伤害越小，其萌发率越高；相反，消毒时间越长，污染率相应降低，但对外植体的伤害越大，对外植体萌发是不利的。本发明发现，虎舌红茎段的消毒极其困难，控制好消毒液的浓度和时间，使得茎段污染率低和萌发率高是本发明的初衷。因此，选择75％酒精1min+0.1％HgCl2 15min+2％NaClO 5min的消毒处理作为茎段适宜的消毒方法，污染率36.3％，接种一周左右顶芽开始萌发。
(4)茎段初代培养：步骤(3)中的茎段用灭菌滤纸吸干水分后，用灭菌镊子和刀片切成带1个芽、1～1.5cm长的茎段作为外植体，接种至MS基本培养基，培养基中添加6-BA(1.0～4.0mg/L)，NAA(0.1～0.5mg/L)，IBA(0.1～0.2mg/L)，GA3(2.0mg/L)，培养20～60天(图3)。具体配方如表2，每组接种17～27个外植体，45天后统计萌发率；
表2不同植物生长调节剂对茎段萌发的影响
Figure BDA0003130189770000051
由表2可知：适当高的细胞分裂素6-BA能够促进虎舌红茎段的萌发；相反，提高生长素NAA浓度却不利于虎舌红茎段的萌发。与0.2mg/L NAA相比，0.2mg/LIBA更利于茎段的萌发；在培养基中添加2.0mg/LGA3能够促进虎舌红茎段的萌发。综上可得，适宜虎舌红茎段萌发的培养基为MS+6-BA(2.0)+IBA(0.1)+GA3(2.0)，其萌发诱导率最高为90.90％。
(5)茎段增殖诱导：步骤(4)中萌发的茎段转至新MS基本培养基(图4)，培养基中添加6-BA(2.0～4.0mg/L)+NAA(0.1～0.2mg/L)+GA3(2.0mg/L)，培养30～60天。具体配方如表3，每组接种20～30个外植体，培养45天统计增殖系数；
表3不同植物生长调节剂对茎段增殖的影响
Figure BDA0003130189770000052
步骤(4)中培养获得的萌发茎段在增殖培养基诱导过程中，多数萌发茎段的基部在培养30天左右有2～3个小芽长出(图5)，经过继续培养发现，小芽逐渐长大，其他小芽的数量不断增多，茎段上萌发的不定芽转接到增殖培养基后也有更多不定芽长出(图6)。由表3可知，本发明发现萌发的茎段或不定芽在MS培养基中添加6-BA(4.0mg/L)，NAA(0.2mg/L)，GA3(2.0mg/L)，其增殖系数最高为8.33。
(6)继代增殖培养：将步骤(5)中增殖的培养物转移至新的MS基本培养基，培养基中添加6-BA(4.0mg/L)、GA3(2.0mg/L)、IAA(0.2mg/L)，培养10天左右形成愈伤组织，随着愈伤组织的不断形成，不定芽开始萌发，45～55天即可转接；
表4不同外植体在相同培养基上继代增殖的萌发率与萌发数量统计表
Figure BDA0003130189770000061
将步骤(5)中增殖培养的培养物(图7)分割成单芽、顶稍、茎段、带愈伤茎段4种外植体(图8、图9)，每种外植体接种18个进行继代培养(图10)；55天统计萌发率，除了单芽的2个外植体没有萌发外，其余的外植体全部萌发或抽稍生长(表4)；第1次继代(单芽、顶芽、茎段)，主稍长度大于3mm的萌发率中、单芽(35.38％)＜顶芽(48.22％)＜茎段(70.72％)，茎段的增殖系数最大值为12，大于单芽与顶芽的最大增殖系数10(图11、图12)。带愈伤茎段进行继代增殖培养(第2次继代)，其增殖系数最高，平均增殖系数为10.83(图13)，最高增殖系数可达22.0(图14)。
通过本发明的上述实施例，以虎舌红红色观赏类型的主枝上的带芽茎段为外植体，能保持母本的优良观赏特性；且本发明所采用的消毒试剂与消毒时间，获得了较低污染率的带芽茎段，污染率仅为36.3％；同时，本发明的方法中，通过20～60天对虎舌红带芽茎段进行初代萌发培养，获得了较高的萌发率，萌发率高达90.9％；并且，本发明方法中通过30～60天对萌发的茎段进行增殖培养，获得了较高的增殖系数，增殖系数为8.33；此外，本发明的方法通过45～55天对带愈伤茎段的继代增殖培养，获得了更高的增殖系数，平均增殖系数为10.83、最高增殖系数可达22.0，为保留红色虎舌红单株的优良特性、进行产业开发奠定了基础。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (2)

1.一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法，其特征在于：枝条的获取、茎段的预处理、茎段消毒、外植体处理、初代培育、茎段增殖诱导和继代增殖培养，具体包括以下步骤：
(1)枝条的获取：选择生长健壮和无病虫害的红色植株，剪取5～10cm长的主枝；
(2)茎段预处理：将步骤(1)的主枝剪除叶片，装入400～500ml水的烧杯中，首先滴入4～5滴洗洁精放在磁力搅拌器上搅拌10～15min，然后用牙刷将主枝清洗干净转移至自来水下流水冲洗20～30min，最后剪成3～5cm长的茎段；
(3)茎段消毒：在超净工作台上，将步骤(2)中的茎段用75％乙醇处理1min、0.1％HgCl2处理15min、2％NaClO处理5min、期间间隔10～30秒摇晃一次，最后用无菌水清洗3～5次，装入灭菌的培养瓶中；
(4)茎段初代培养：将步骤(3)的茎段用灭菌滤纸吸干水分后，用灭菌镊子和刀片切成带1个芽、1～1.5cm长的茎段作为外植体，接种至以MS基本培养基为基础，添加激素6-BA2.0mg/L、IBA0.1mg/L、GA32.0mg/L的培养基中，培养20～60天；
(5)茎段增殖诱导：将步骤(4)中萌发的茎段转至以MS基本培养基为基础，添加激素6-BA4.0mg/L，NAA0.2mg/L，GA32.0mg/L的培养基中，培养30～60天；
(6)继代增殖培养：将步骤(5)中增殖的培养物转移至以MS基本培养基为基础，添加激素6-BA4.0mg/L、IAA0.2mg/L、GA32.0mg/L的培养基中，培养45～55天。
2.根据权利要求1所述的一种虎舌红茎段消毒及增殖诱导的方法，其特征在于，步骤(4)、步骤(5)以及步骤(6)培养基中均添加蔗糖30g/L、结冷胶2.5g/L，培养基均在121℃下，高压灭菌20min，pH值调节为5.95±0.1，培养温度为25±3℃，光照强度2000～2500Lux、光照时间每天16小时。
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