JP2001309729A - 組織培養によるサクラ属の大量増殖法 - Google Patents
組織培養によるサクラ属の大量増殖法Info
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Abstract
することを目的とする。 【解決手段】 サクラ属の茎頂又は茎頂を含む植物組織
を培養して多芽体を誘導し増殖させ、増殖した多芽体を
シュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次い
で伸長したシュートを発根培地で培養して発根させて植
物体を再生し、再生した植物体を順化前に低温処理する
ことによりサクラ属の植物体を大量に効率良く再生する
ことができる。
Description
養による大量増殖法に関するものである。更に詳細に
は、サクラ属の茎頂又は茎頂を含む植物組織を培養して
多芽体を誘導し増殖させ、増殖した多芽体をシュート伸
長培地で培養してシュートを伸長させ、次いで伸長した
シュートを発根培地で培養して発根させることにより植
物体を再生し、望ましくは、再生した植物体を順化前に
低温処理することにより順化後の成長を促進することを
特徴とするサクラ属の組織培養による大量増殖法に関す
るものである。
に親しまれている日本花木の一つである。サクラ属の増
殖は一般に挿し木、接ぎ木等により行われている。挿し
木による増殖法は活着が悪く後の樹勢が弱いと言う欠点
を有する。接ぎ木による増殖法は熟練と労力とを要する
と言う難点がある。更に挿し木、接ぎ木と言った従来の
方法では、老木からの増殖は困難であり、また羅病した
親木から生産された挿し木苗や接ぎ木苗は、羅病してい
る可能性が非常に高い。
発達により、希少木、貴重老木の増殖が行われており、
サクラ属においてもそのような技術の開発が期待されて
いる。特に、羅病した親木からも、無感染菌を生産でき
る茎頂培養法の開発が望まれている。組織培養によるサ
クラの増殖法として、特開平8−66134号公報に
は、サクラ(Prunusjamasakura Sied.)の外植片を培養
して多芽体を誘導し、次いで発根させてサクラの植物体
を作出する方法が提案されている。しかしながら、この
組織培養法はサクラの効率的な大量増殖法と言い得るも
のではない。サクラ属の組織培養による効率的な大量増
殖法は、未だ開発されておらず、早急な開発が望まれて
いる。従って、本発明の目的は、サクラ属の大量生産を
可能にする効率的な大量増殖法を提供することにある。
頂又は茎頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導し増
殖させ、増殖した多芽体をシュート伸長培地で培養して
シュートを伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培
地で培養して発根させることにより植物体を再生し、望
ましくは、再生した植物体を順化前に低温処理すること
により順化後の成長を促進することを特徴するサクラ属
の組織培養による大量増殖法である。
属であり、特にシダレザクラが好適な植物である。本発
明では、先ず、サクラ属の茎頂又は茎頂を含む植物組織
を培養して多芽体を誘導し増殖させる。ここで茎頂と
は、成長点あるいは成長点付近の組織を指し、多芽体と
は、定芽及び/又は不定芽からなる植物組織を指す。本
発明では、茎頂自身を用いてもよく、また茎頂を含む植
物組織を用いてもよい。茎頂を含む植物組織としては、
茎頂を含む腋芽又は頂芽が挙げられる。これらの培養材
料は、サクラ属の苗木又は成木から採取できる。採取し
た培養材料は、通常の方法に従って、エタノール及び次
亜塩素酸ナトリウムあるいは過酸化水素水あるいは塩化
水銀(昇汞水)で表面殺菌を行い、滅菌水で洗浄後に、
培地中で培養する。特に茎頂は、通常、殺菌した頂芽か
ら無菌条件下で摘出される。培養に用いる基本培地とし
ては、無機成分及び炭素源を必須成分とし、その他植物
成長調節物質、ビタミン、アミノ酸を含有する培地が用
いられる。無機成分としては、窒素、燐、カリウム、ナ
トリウム、カルシウム、硫黄、鉄、マンガン、亜鉛、沃
素、硼素、モリブデン、塩素、コバルト等の元素を含む
無機化合物が用いられる。炭素源としては、炭水化物、
例えばショ糖、トレハロース、グルコース、マルトース
が用いられる。また、ココナッツウォータ、酵母エキス
を用いることもできる。植物成長調節物質としては、例
えばオーキシン、サイトカイニン、ジベレリンが用いら
れる。オーキシンとしては、例えば3−インドール酢酸
(IAA)、3−インドール酪酸(IBA)、α−ナフ
タレン酢酸(NAA)、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸
(2,4-D)、4−クロロ−2−メチルフェノキシ酢酸、p−
クロロフェノキシ酢酸、2,4,5−トリクロロフェノキシ
酢酸等が挙げられ、サイトカイニンとしては、例えばベ
ンジルアミノプリン(BAP)、カイネチン、ゼアチ
ン、6−(γ,γ−ジメチルアラミノ)プリン(2iP)、
N−(2−クロロ−4−ピリド)−N’−フェニルウレア
(CPPU)、1−フェニル−3−(1,2,3−ティアディア
ゾール−5−YL)ウレア(チディアズロン)、ジベレ
リンとしてはGA3等が挙げられる。ビタミンとして
は、例えばチアミン、ピリドキシン、ニコチン酸等が挙
げられる。アミノ酸としては、例えばアデニン、グリシ
ン、グルタミン酸、リジン等が挙げられる。
は、植物組織培養に用いられる培地、例えばMS培地(M
urashige, T.(1962), Physiol. Plant. 15: 473 - 49
7)、B5培地(GAmborg, O.L. (1968), Exp. Cell. Re
s. 50: 151 - 158)、WP培地(Lloyd, G. (1981), Int.
Plant Prop. Soc. 30: 421 - 427)、BTM培地(Chalu
pa, V. (1984) Biologia Plnt. (praha) 26: 374 - 37
7)等が挙げられる。また、培地固化剤としては、ゲルラ
イト、寒天等が挙げられ、培地支持体としては、フロリ
アライト、バーミキュライト、パーライト、赤球土等が
挙げられる。本発明では、茎頂又は茎頂を含む植物組織
を培養して多芽体を誘導し増殖させるための培地、増殖
した多芽体を培養してシュートを伸長させるためのシュ
ート伸長培地及び伸長したシュートを培養して発根させ
るための発根培地は、いずれも、特に、WP培地及びそ
の改変培地が好ましい。本発明で改変培地とは、培地中
の各種成分量を、WP培地中の成分量未満から約20%
の量に減少させた培地を指し、例えば各種成分量を1/
3、1/2、2/3等に減少させた培地が挙げられる。
頂芽を培養して、定芽及び/又は不定芽を多数有する多
芽体の誘導及び増殖を促進するためには、BAP、硫酸
アデニン及びココナッツウォーターを含有するWP固体
培地又はその改変固体培地で培養するのが好ましく、更
に、これらの成分に加えてIBAを含有するのが好まし
い。また、必要に応じてGA3を加えるのが好ましい。
ココナッツウォーターの構成成分は、通常、脂肪酸、ア
ミノ酸、糖(グルコース、フラクトース、ショ糖)、サ
イトカイニン(ゼアチン、リボシルゼアチン、ジフェニ
ル尿素)、ミオイノシトールである。特に、BAPを0.
02〜2.2mg/l、好ましくは0.4〜1.0mg/l、IBAを0.1〜
2.0mg/l、好ましくは0.1〜1.0mg/l、GA3を0.1〜4.0mg
/l、好ましくは0.1〜2.0mg/l、硫酸アデニンを0.2〜4.0
mg/l、好ましくは2.0mg/l、ココナッツウォーターを1〜
20容量%、好ましくは10容量%含有するWP固体培地ま
たはその改変固体培地を用いることが好ましい。腋芽あ
るいは頂芽の培養は、15から30℃で、500から10,000l
uxで、1から3ケ月間、静置培養するのが好ましい。
また、茎頂自身を培養して、定芽及び/又は不定芽を多
数有する多芽体の誘導及び増殖を促進するためには、チ
ディアズロンを含有するWP液体培地またはその改変液
体培地を用いることが好ましい。特に、チディアズロン
を1.0〜4.0mg/l、好ましくは2.0mg/l含有するWP液体
培地またはその改変液体培地を用いることが好ましい。
茎頂自身の培養は、15から30℃で、500から20,000lu
xで、1から5ケ月間、回転又は旋回培養するのが好ま
しい。
を継続することにより、効率よく多芽体を増殖させるこ
とができる。即ち、多芽体を増殖するための培地として
は、腋芽あるいは頂芽を培養して、多芽体を誘導させた
場合には、上記したWP固体培地又はその改変固体培地
でそのまま培養するのが好ましく、茎頂自身を培養し
て、多芽体を誘導させた場合には、上記したWP液体培
地またはその改変液体培地でそのまま培養するのが好ま
しい。
地に移植して培養することにより、多芽体から効率よく
シュートを伸長させることができる。シュート伸長培地
としては、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン、アミ
ノ酸等を含有し、BAP、硫酸アデニン及びココナッツ
ウォーターを含有するWP固体培地又はその改変固体培
地で培養するのが好ましく、更に、これらの成分に加え
てIBAを含有するのが好ましい。また、必要に応じて
GA3を加えるのが好ましい。本発明では、ココナッツ
ウォーターとともに硫酸アデニンを添加することによ
り、正常な葉の展開及びシュート伸長の促進が得られ
る。特に、BAPを0.02〜2.2mg/l、好ましくは0.4〜1.
0mg/l、IBAを0.1〜2.0mg/l、好ましくは0.1〜0.5mg/
l、GA3を0.1〜4.0mg/l、好ましくは0.1〜2.0mg/l、硫
酸アデニンを0.2〜4.0mg/l、好ましくは2.0mg/l、ココ
ナッツウォーターを1〜20容量%、好ましくは10容量%
程度含有するWP固体培地またはその改変固体培地が好
ましい。シュートを伸長させるための培養は、15から30
℃で、500から10,000luxで、1から2ケ月間、静置
培養するのが好ましい。
は分割せずに発根培地に移植して培養することにより、
シュートを更に伸長させ、かつ発根させることができ
る。発根培地としては、前記の無機成分及び炭素源、ビ
タミン、アミノ酸等を含有するWP液体培地又はその改
変培地が好ましい。特に、IBAを0.1〜5.0mg/l、好ま
しくは0.1〜2.0mg/l含有するWP液体培地又はその改変
培地が好ましい。本発明では、WP液体培地又はその改
変培地を培地支持体に含侵させ、培地支持体上で培養す
るのが好ましい。培地支持体としては、フロリアライ
ト、バーミキュライト、パーライト、赤玉土等の土を圧
縮成型した培地支持体;スポンジ状の培地支持体、ロッ
クウール製の培地支持体、多孔質の培地支持体などが挙
げられる。発根させるための培養は、5から30℃で、0
から5,000luxで、1から3ケ月間、静置培養するの
が好ましい。かくして、サクラ属の植物体を大量に効率
良く再生することができる。
理することにより、順化後の成長を促進することができ
る。低温処理の温度としては0〜15℃、好ましくは5〜15
℃であり、低温処理の期間は1〜3週間、好ましくは3週
間が好ましい。このような低温処理に適したサクラ属
は、特に低温感受性の種に属するものである。低温処理
は、発根培地で培養し再生した植物体を、そのまま低温
室にて、湿度50〜100%、好ましくは70〜100%で、0か
ら5,000luxで行われる。低温処理後に、通常の順化
工程に付すことにより、サクラ属の植物を作出すること
ができる。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例1 (1)植物組織の調製 京都醍醐寺境内に植栽されている樹齢約150年生のシ
ダレザクラ(通称:土牛の桜)から、材料を採取した。
ヒガンザクラ又はエドヒガンの園芸品種として知られて
いる。 Prunus pendula Maximowicz in Bull.Acad.Sci.St.Pete
rsb.29:98(1883) cv.Pendula;Cerasus spachiana Lava
llee ex Otto in Hambrug.GArt.u.Blumenz.35:57(187
9);Prunus itosakura Sieb.in Verh.Batav.Genoot.12:
68(1830);Prunus subhirtella var.pendula(Maxim.)Ta
naka in Useful Pl.Jap.:620(1895);Prunus aequinoct
ialis var.pendula Miyoshi in Bot.Mag.Tokyo 34:164
(1920);Prunus spachiana(Lavallee ex Otto)Kitamura
in Act.Phytotax.Geobot.25:2(1971)。
よび頂芽を採取し、70%エタノール中で30秒、2%
次亜塩素酸ナトリウム中で7分間表面殺菌を行い、滅菌
水で数回洗浄後、滅菌濾紙上で風乾した。風乾後、寒天
培地に植え付けた。茎頂は、殺菌した頂芽から無菌条件
下で摘出した。
はグルコースを各々30g/l及び植物成長調節物質として
BAPを0〜4.4mg/l、ゼアチンを0〜4.4 mg/l、あるい
はチディアズロンを0〜4.4mg/l添加し、塩化カリウムで
pHを5.7に調整後、オートクレーブ(121℃、
1.2atm、20分の条件)で殺菌して用いた。茎頂
は、液体培地で培養した。培養は26±2℃、24時間
日長(10,000lux)で行った。3ヶ月後の多芽体形成率
の結果を表1に示した。
全ての個体が褐変枯死した。これに対して、チディアズ
ロン添加処理区では、表1の結果から明らかなように、
培養2〜3ヶ月後には、展開した茎頂の基部より新しい
芽の形成が始まり、茎頂は多芽体へと成長した。特に、
チディアズロン2.0mg/lを添加することが効果的であっ
た。
/l、ショ糖、トレハロースあるいはグルコースを30g/l
及び植物成長調節物質としてIBA0〜2.0mg/l、BAP
を0〜2.2mg/l、GA3を0〜4.0mg/l、硫酸アデニンを0〜
2.0mg/l、ココナッツウォーターを0〜20容量%添加し、
前記同様にpHを5.7に調整後、殺菌して用いた。培
養は26±2℃、16時間日長(3,000lux)で行った。
3ヶ月後の多芽体形成率の結果を表2に示した。
加処理区では、表2の結果から明らかなように、褐変枯
死が抑制された。特に、IBA0.1mg/l、BAP1.0mg/
l、GA32.0mg/l、硫酸アデニン2.0mg/l及びココナッツ
ウォーター10容量%を添加することが効果的であった。 (4)シュート伸長 (2)及び(3)で形成した多芽体をそのままシュート
伸長培地に移植した。培地には、ゲルライト3.0g/l、ト
レハロース30g/l及びIBA0.1〜0.5mg/l、BAPを0.4
〜1.0mg/l、GA3を1.0〜2.0mg/l、硫酸アデニンを2.0m
g/l、ココナッツウォーターを5〜20容量%添加したWP
培地を、前記と同様にpH5.7に調整し、殺菌して用
いた。培養条件は、(2)と同じ条件である。1ヶ月後のシ
ュート伸長の結果を表3に示した。
ヶ月後には、多芽体からのシュート伸長が認められ、特
にIBA0.1mg/l、BAP1.0mg/l、GA32.0mg/l、硫酸
アデニン2.0mg/l及びココナッツウォーター10容量%を
添加することにより、奇形葉の形成を抑制する効果が認
められた。 (5)発根 (4)で得られたシュートを一本ずつに切り分け、発根
培地に移植した。培地には、IBA0〜1.0mg/lを添加し
たWP固体培地あるいはIBA0〜1.0mg/lを添加したW
P液体培地を培地支持体であるフロリアライトに含侵さ
せ、この培地支持体上で培養した。前記同様にpH5.7
に調整し、殺菌して用いた。培養条件は、(2)と同じ条
件である。1ヶ月後の結果を表4に示した。
ヶ月後には、60%の個体で発根が観察され、特にIBA
1.0mg/lを添加したWP液体培地を培地支持体であるフ
ロリアライトに含侵させ、この培地支持体上で培養した
場合に効果的であった。 (6)低温処理及び順化 (5)で得られた再生植物体を順化前に低温処理を施し
た。植物体は無菌状態の培養容器に入れたまま低温室に
搬入した。低温処理の条件は、表5の通りである。結果
を表6に示した。
を施した個体は、順化後も良好なシュート成長を示し、
特に1週間毎に温度を5℃ずつ低下させ3週間の低温処
理を施すか、あるいは10℃で3週間の低温処理を施すこ
とが効果的であった。
頂を含む植物組織を培養して多芽体を誘導し増殖させ、
増殖した多芽体をシュート伸長培地で培養してシュート
を伸長させ、次いで伸長したシュートを発根培地で培養
して発根させることにより植物体を再生し、望ましく
は、再生した植物体を順化前に低温処理することにより
サクラ属の植物体を大量に再生することができる。本発
明により、短期間に大量にサクラ属の植物体を生産する
ことができ、サクラ属苗の大量生産、遺伝子研究等の可
能性が高くなる。
Claims (7)
- 【請求項1】 サクラ属の茎頂又は茎頂を含む植物組織
を培養して多芽体を誘導し増殖させ、増殖した多芽体を
シュート伸長培地で培養してシュートを伸長させ、次い
で伸長したシュートを発根培地で培養して発根させるこ
とにより植物体を再生することを特徴とするサクラ属の
組織培養による大量増殖法。 - 【請求項2】 サクラ属の茎頂を含む植物組織として腋
芽又は頂芽を、ベンジルアミノプリン(BAP)、硫酸
アデニン及びココナッツウォーターを含有するWP固体
培地又はその改変固体培地で培養して多芽体を誘導し増
殖させる請求項1記載の大量増殖法。 - 【請求項3】 サクラ属の茎頂を、1−フェニル−3−
(1,2,3−ティアディアゾール−5−YL)ウレア
(チディアズロン)を含有する液体WP培地又はその改
変培地で培養して多芽体を誘導し増殖させる請求項1記
載の大量増殖法。 - 【請求項4】 伸長培地として、ベンジルアミノプリン
(BAP)、ココナッツウォーター及び硫酸アデニンを
含有するWP固体培地又はその改変固体培地を用いる請
求項1から3のいずれかに記載の大量増殖法。 - 【請求項5】 発根培地として、WP液体培地又はその
改変液体培地を用いる請求項1から4のいずれかに記載
の大量増殖法。 - 【請求項6】 再生した植物体を順化前に低温処理する
ことにより順化後の成長を促進する請求項1から5のい
ずれかに記載の大量増殖法。 - 【請求項7】 サクラ属がシダレザクラである請求項1
から6のいずれかに記載の大量増殖法。
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