JPH06169662A - シクラメンの幼苗の大量生産方法およびカルスの増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明はシクラメンの植物体の一部から形成
されたカルスをタンクなどを用いて液体培養を行い、効
率的に大量に増殖させた後、不定胚を形成させ、これを
幼植物体に再生させて同一形質を有するシクラメンの幼
苗の大量生産方法を提供することを目的とする。 【構成】 シクラメンの植物体の一部から形成させたカ
ルスを固体培地上で培養してカルスを増殖させるＡ工程
と、前記Ａ工程で増殖したカルスを液体培地中で培養し
て増殖させるＢ工程と、前記Ｂ工程で増殖したカルスを
培養して不定胚を形成させた後、不定胚から幼植物体を
再生させるＣ工程と、前記Ｃ工程で得られた幼植物体を
育成するＤ工程、からなることを特徴とする、シクラメ
ンの幼苗の生産方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明はシクラメンのカルスを効
率的に増殖させた後、カルスから不定胚を形成させ、こ
の不定胚から幼植物体を再生し、育成して幼苗を大量生
産する方法およびシクラメンのカルスを効率的に増殖さ
せる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】シクラメンはこれまでに種子繁殖の方法
により種子を採取し、播種、育苗の手段によって栽培さ
れている。この従来の方法では種子の生産過程でシクラ
メンの固体間で交配を行うため、花色や花型などの重要
な形質が固定化されず、親株と同じものが安定して得ら
れない。

【０００３】このような問題を解決するために、近年シ
クラメンの組織培養方法が提案されている。組織培養方
法としては、シクラメンの各組織から不定芽を形成させ
て増殖する方法（特公平３−５３８９５号公報、特開昭
６３−２２６２１５号公報、特開平２−９２２２１号公
報、特開平２−２４５１２７号公報、特開平３−２４４
３２８号公報）や、カルスから不定胚を形成させて幼植
物体を得る方法（プラント ティシュー カルチャー
レターズ 第８巻 Ｎｏ．２ 第１２１頁〜第１２３頁
１９９１年、園芸学会雑誌 第６０巻別冊１第４４５
頁〜第４４６頁１９９１年、 園芸学会雑誌 第６１巻
別冊１第４３０頁〜第４３１頁 １９９２年）がある。

【０００４】しかしながら、前者の方法は固形培地と小
規模な培養器を用いた方法であり、効率的に不定芽を増
殖することができない。一方、後者の方法ではカルスや
不定胚の増殖率や再生率が低い。そのため、いずれの方
法も種苗を大量に生産する方法としては必ずしも満足で
きるものではない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】これまでは同一形質の
シクラメンの幼苗を連続的に効率よく大量生産すること
ができなかった。それゆえに、新しい方法で同一形質の
シクラメンの幼苗を大量生産する方法を開発することが
要望されている。

【０００６】本発明はこれらの要望に応えるシクラメン
の幼苗の生産方法およびカルスの増殖方法を提供するこ
とにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、下記の方
法により上記した課題を解決することを見いだした。す
なわち、本発明の第１の要旨とするところは、シクラメ
ンの植物体の一部から形成させたカルスを固体培地上で
培養してカルスを増殖させるＡ工程と、前記Ａ工程で増
殖したカルスを液体倍地中で培養して増殖させるＢ工程
と、前記Ｂ工程で増殖したカルスを培養して不定胚を形
成させた後、不定胚から幼植物体を再生させるＣ工程
と、前記Ｃ工程で得られた幼植物体を育成するＤ工程、
からなることを特徴とする、シクラメン幼苗の大量生産
方法にある。

【０００８】また本発明の第２の要旨とするところは、
シクラメンの植物体の一部から形成させたカルスを固体
培地上で培養してカルスを増殖させるＡ工程と、前記Ａ
工程で増殖したカルスを液体培地中で培養して増殖させ
るＢ工程と、前記Ｂ工程で増殖して得られたカルスの一
部を前記Ａ工程の出発材料のカルスとしてとして再循環
するＢ´工程、からなることを特徴とするシクラメンの
カルスの増殖方法にある。

【０００９】次に本発明のシクラメン幼苗の生産方法に
おける出発材料の調製について説明する。

【００１０】本発明に用いるシクラメンは、シクラメン
属の植物であり、品種としてビクトリア、バーバーグ、
ピュアホワイト、パステル、ライラックローズなどが挙
げられるが、これらの品種に限定されるものではない。

【００１１】まず、シクラメンの植物体、例えば葉身、
葉柄、茎頂、葯基部、花茎などから組織片を採取し、こ
れを７０％エタノール溶液に１０秒間、次いで有効塩素
濃度約１％の次亜塩素ナトリウム溶液に２０分間浸漬
し、殺菌処理する。次いで、この組織を取り出し、その
表面に付着した次亜塩素酸ナトリウムを滅菌水で３回洗
浄後、これを無菌条件下で１ｃｍ角の切片とする。

【００１２】次に、ムラシゲ・スクーグ培地（以下「Ｍ
Ｓ」培地という）の所定濃度の無機成分にショ糖を５０
ｇ／１（リットル；以下同じ）、２，４−ＰＡを４ｍｇ
／ｌ、カイネチンを０．１ｍｇ／ｌをそれぞれ加え、ｐ
Ｈを５．８とし、ゲルライトを２ｇ／ｌ加えて調整す
る。

【００１３】このようにして得た培地を直径９ｃｍのシ
ャーレに入れて固化した後、上記の組織片を培地上に置
床する。これを１５〜３０℃、好ましくは２５℃の恒温
室内で６０〜１５０日、好ましくは９０日間暗所で継代
培養（３０日間ごとに継代）すると、組織切片に不定胚
形成能を持つカルスが形成する。

【００１４】このようにして得たカルスを本発明の出発
材料として用いた。

【００１５】次に、Ａ〜Ｄの各工程について説明する。

【００１６】本発明の各工程で用いる培地としては、例
えばＭＳ培地、ガンボルグのＢ５培地、ホワイト培地、
ニッチ−ニッチ培地、Ｎ６培地などの植物組織培養用の
培地が挙げられる。これらの公知の培地組成に関して
は、例えば、竹内、中島、小谷著の「新植物組織培養」
第３８６頁〜第３９１頁（１９７９年、朝倉書店発行）
に記載されている。これらの培地の無機成分の濃度をそ
のままか、もしくは３分の１または２分の１に希釈した
ものを用いればよいが、Ａ工程、Ｂ工程およびＣ工程は
所定濃度の無機成分を含むＭＳ培地が好ましく、Ｄ工程
はＭＳ培地の無機成分を３分の１に希釈した培地を用い
るのがよい。

【００１７】各工程の培地の植物ホルモンは、オーキシ
ン類としてインドール酢酸、α−ナフタレン酢酸（ＮＡ
Ａ）、インドール酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−ＰＡ）、３，６−ジクロロメトキシ安息香
酸、４−アミノ−３，５，６−トリクロロピコリン酸な
どが挙げられ、サイトカイニン類としてベンジルアデニ
ン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチンなどが挙げられ、ジ
ベレリンとしてＧＡ₁、ＧＡ₃、ＧＡ₇などが挙げられる
が、好ましくは２，４−ＰＡを０．０１ｍｇ／１〜１０
ｍｇ／１、ＮＡＡを０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、
カイネチンを０．０１ｍｇ／ｌ〜１ｍｇ／ｌ、ＢＡを
０．０１ｍｇ／１〜１ｍｇ／ｌ、ジベレリンを０．０２
ｍｇ／ｌ〜２ｍｇ／ｌを添加して用いればよいが、さら
に好ましくはＡ工程およびＢ工程においては２，４−Ｐ
Ａ ４ｍｇ／ｌ、カイネチン ０．１ｍｇ／ｌ、Ｃ工程
においてはＮＡＡ ０．０１ｍｇ／１、ＢＡ ０．１ｍ
ｇ／１、ジベレリン０．２ｍｇ／ｌ、Ｄ工程においては
植物ホルモンを添加しないで用いるのがよい。

【００１８】各工程の培地の炭素源としては、ショ糖、
ブドウ糖などの糖類が挙げられるが、好ましくはショ糖
を２０ｇ／１〜９０ｇ／１、さらに好ましくはＡ工程お
よびＢ工程においては５０ｇ／１、Ｃ工程およびＤ工程
においては３０ｇ／１の濃度で使用されるのがよい。

【００１９】各工程の培地のｐＨは４．０〜７．０、好
ましくは５．８に調整する。

【００２０】またＡ工程、Ｂ工程およびＣ工程は暗黒条
件、Ｄ工程は光照射下で行われるのがよい。この場合の
照度としては５００ルックス以上１００００ルックス以
下、好ましくは１０００ルックス以上３０００ルックス
以下であり、１日当り明期１６時間、暗期８時間が適し
ている。

【００２１】Ｃ工程およびＤ工程に用いる培地は固体ま
たは液体であってもよいが、好ましくはＣ工程では固体
培地、Ｄ工程では液体培地を使用するのがよい。固体培
地にはゲル化剤として寒天、アガロース、ゲルライト
（ゲランガム）、カラギーナンなどが用いられるが、好
ましくはゲルライトを０．１〜２．０％添加して用いる
のがよい。

【００２２】Ｄ工程における液体培養は振盪しても静置
してもどちらでもよいが、培養は液体培地に酸素を含有
する気体を通して行われるのがよい。この場合の酸素を
含有する気体とは、空気を単独、酸素ガスを単独、また
は酸素、二酸化炭素、窒素、空気などのうちの２種類以
上を混合してなる気体を用いることができる。これらの
気体中の酸素含有量は５％〜１００％、好ましくは２０
％〜９０％である。液体倍地中への上記した気体の通気
料としては５０ｍｌ／ｌ・ｍｉｎ以上５００ｍｌ／ｌ・
ｍｉｎ以下、好ましくは１００ｍｌ／ｌ・ｍｉｎ以上３
００ｍｌ／ｌ・ｍｉｎ以下が適している。

【００２３】（Ａ工程：固体培地上でのカルス増殖）シ
クラメンの組織から誘導した不定胚形成能を持つカルス
を固体培地上に置床して培養することにより、不定胚形
成能を維持したままカルスを増殖することができる。

【００２４】（Ｂ工程：液体培地中のカルス増殖）Ａ工
程で増殖したカルスを液体培地中に移植して培養するこ
とにより効率的にカルスを増殖することができる。

【００２５】液体倍地中でのカルスの増殖は培養１４日
ごとに新しい培地に継代して行い、その際、孔径１ｍｍ
のステンレス製ふるいを用いて１ｍｍ以下の大きさのカ
ルスを継代することによりカルスの増殖および生育を均
一にすることができる。

【００２６】（Ｂ´工程：カルスの再循環）Ｂ工程で増
殖したカルスの一部を再びＡ工程の固体培養上に循環し
て使用することによりカルスを連続的かつ効率的に増殖
することができる。

【００２７】通常の植物種のカルスは液体倍地中で継代
培養するにつれて不定胚形成能や植物体再生能が低下す
ることが知られているが、本発明のＢ´工程の方法によ
れば不定胚形成能や植物体再生能が低下することなくカ
ルスを増殖することができる。

【００２８】（Ｃ工程：不定胚形成および幼植物体再
生）Ｂ工程で増殖したカルスを固体培地上に置床するこ
とにより、カルスから不定胚を形成させ、さらに培養を
続けて不定胚から正常に発芽および発根がおこり、幼植
物体を再生することができる。

【００２９】この際に用いるカルスは、ステンレス製ふ
るいを用いて大きさを０．２５ｍｍ〜１ｍｍに選別した
ものを、１シャーレ当り５０〜１００個置床する。

【００３０】（Ｄ工程：幼植物体育成）Ｃ工程で再生し
た大きさが約１ｃｍの第１葉、塊茎、根を持つ幼植物体
５０〜２００本／リットルを培養槽に入れて液体培養す
ることにより、幼植物体の茎葉を展開伸長させ、根部を
伸長させて、健全な幼苗を得ることができる。

【００３１】このようにＡ〜Ｄの各工程からなる本発明
の方法によれば健全な幼苗を効率的、連続的に生産する
ことができる。

【００３２】以下に本発明の実施例を示す。

【００３３】

【実施例】

実施例１ シクラメン（品種：ビクトリア）の開花株の１０．０ｍ
ｍ〜２０．０ｍｍの長さの蕾をつみとり、この蕾を７０
％のエタノール溶液に１０秒間、次いで約１％の次亜塩
素酸ナトリウム溶液に１０分間殺菌後、無菌的にがくと
花弁とを切り出して、ほぼむき出しにされた蕾内組織を
さらに７０％のエタノール溶液に１０秒間、次いで約
０．５％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１０分間殺菌
後、滅菌水で洗浄して蕾内組織を殺菌する。殺菌された
蕾内組織から葯と葯基部を含む葯組織を切り出し、この
組織片をＭＳ培地の所定濃度の無機成分に２，４−ＰＡ
４ｍｇ／ｌ、カイネチン ０．１ｍｇ／ｌ、ショ糖３
０ｇ／１、ゲルライト ０．２％を添加した培地（ｐＨ
５．８）をシャーレ（直径９ｃｍ）に入れて固化させた
後、上記の組織切片を培地上に置床する。これを２５℃
で９０日間暗所で継代培養（３０日間ごとに継代）する
と、不定胚形成能を持つカルスが形成した。

【００３４】（Ａ工程：固体培地上でのカルス増殖）シ
クラメン（品種：ビクトリア）の葯基部から得たカルス
０．５ｇ（約１ｃｍ）を、ＭＳ培地の所定濃度の無機成
分に、ショ糖３０ｇ／１、２，４−ＰＡ ４ｍｇ／ｌ、
カイネチン ０．１ｍｇ／ｌ、ゲルライト ０．２％を
添加した培地（ｐＨ５．８）を入れたシャーレ（直径９
ｃｍ）に４個移植する。これを培養温度２５℃、暗黒
下、３０日間培養すると、約２ｃｍの塊に増殖した。

【００３５】（Ｂ工程：液体培地中のカルス増殖）Ａ工
程で得たカルス約０．５ｇ（約１ｃｍ塊）を、ＭＳ培地
の所定濃度の無機成分にショ糖３０ｇ／１、２，４−Ｐ
Ａ １ｍｇ／ｌ、カイネチン ０．１ｍｇ／ｌを添加し
た液体培地（ｐＨ５．８）２０ｍｌを入れた１００ｍｌ
容量の三角フラスコに移植する。これを培養温度２５
℃、暗黒下、回転数１００ｒｐｍで振盪する。

【００３６】移植後１４日ごとに、増殖したカルスを孔
径１ｍｍのステンレス製ふるいを用いて１ｍｍ以下の大
きさのカルスを選択して前記同一の培地組成で２８日間
継代培養する。

【００３７】この工程で培養２８日後に約５ｇのカルス
を得た。

【００３８】（Ｃ工程：不定胚形成および幼植物体再
生）Ｂ工程で得た１ｇカルスを孔径１ｍｍと０．２５ｍ
ｍのステンレス製ふるいにより、０．２５ｍｍ〜１ｍｍ
の大きさのカルスを選択して約０．８ｇのカルスを得
る。このカルスをＭＳ培地の所定濃度の無機成分にＮＡ
Ａ ０．０１ｍｇ／１、ＢＡ ０．１ｍｇ／ｌ、ジベレ
リン ０．２ｍｇ／ｌ、ショ糖３０ｇ／１、ゲルライト
０．５％を添加した培地をシャーレ（直径９ｃｍ）に
入れて固化させた後、１シャーレ当り１００個ずつ、約
４０００個移植する。これを２５℃、暗黒下で６０日間
培養すると、移植３０日後に不定胚が形成され、移植６
０日後に不定胚から発芽、発根して幼植物体が得られ
る。

【００３９】この工程で約３０００個の幼植物体が得ら
れた。

【００４０】（Ｄ工程：幼植物体育成）ＭＳ培地組成の
全無機成分の濃度を３分の１に希釈した培地にショ糖３
０ｇ／ｌを加えた液体培地（ｐＨ５．８）５リットルを
６リットル容量のガラス製培養槽に入れ、これにＣ工程
で得た大きさ約１ｃｍ長の幼植物体を１培養槽あたり５
００個、計３０００個移植し、２０℃で、１日あたり照
度２０００ルックスの明期を１６時間、暗期を８時間と
し、無菌空気を３００ｍｌ／ｌ・ｍｉｎの通気量で通気
して、３０日間培養する。

【００４１】この工程で約２７００個の幼植物体に茎葉
の展開伸長が認められ、健全な幼苗を得ることができ
た。

【００４２】実施例２ Ａ工程の出発材料の不定芽は試験例１に準じて得た。 （Ａ工程：固体培地上でのカルスの増殖）シクラメン
（品種：ビクトリア）の葯基部から得たカルス（約１ｃ
ｍ）を、ＭＳ培地の所定濃度の無機成分にショ糖３０ｇ
／１、２，４−ＰＡ ４ｍｇ／ｌ、カイネチン ０．１
ｍｇ／ｌ、ゲルライト ０．２％を添加した培地（ｐＨ
５．８）を入れたシャーレ（直径９ｃｍ）に４個移植す
る。これを培養温度２５℃、暗黒下、３０日間培養する
と、約２ｃｍの塊に増殖した。

【００４３】（Ｂ工程：液体培地中のカルスの増殖）Ａ
工程で得たカルス約０．５ｇ（約１ｃｍ塊）を、ＭＳ培
地の所定濃度の無機成分にショ糖３０ｇ／１、２，４−
ＰＡ １ｍｇ／ｌ、カイネチン ０．１ｍｇ／ｌを添加
した液体培地（ｐＨ５．８）２０ｍｌを入れた１００ｍ
ｌ容量の三角フラスコに移植する。これを培養温度２５
℃、暗黒下、回転数１００ｒｐｍで振盪培養する。

【００４４】移植後１４日ごとに、増殖したカルスを孔
径１ｍｍのステンレス製ふるいを用いて１ｍｍ以下の大
きさのカルスを選択して前記同一の培地組成で２８日間
継代培養する。

【００４５】この工程で培養２８日後に約５ｇのカルス
を得た。

【００４６】（Ｂ´工程：カルスの再循環）Ｂ工程で得
られたカルスの１０％にあたる０．５ｇのカルス（約１
ｃｍの塊）を再びＡ工程の新しく調整した培地に循環し
置床する。

【００４７】これらの工程によれば、０．５ｇのカルス
を１年間で約６０ｇに増殖することができた。

【００４８】

【発明の効果】本発明によれば、固体培地を用いた従来
の組織培養方法に比べ、シクラメンの植物体の一部を培
養して得られるカルスを効率的に増殖させ、カルスから
不定胚を形成し、幼植物体を再生することにより幼苗を
連続的に大量に得ることができる。

【００４９】したがって、本発明の方法は品質の均一な
シクラメンの幼苗の大量生産に有効に使用ができる。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年１２月１０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】 シクラメンの幼苗の大量生産方法
およびカルスの増殖方法

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シクラメンの植物体の一部から形成させ
   たカルスを固体培地上で培養してカルスを増殖させるＡ
   工程と、前記Ａ工程で増殖したカルスを液体培地中で培
   養して増殖させるＢ工程と、前記Ｂ工程で増殖したカル
   スを培養して不定胚を形成させた後、不定胚から幼植物
   体を再生させるＣ工程と、前記Ｃ工程で得られた幼植物
   体を育成するＤ工程、からなることを特徴とする、シク
   ラメンの幼苗の大量生産方法。
2. 【請求項２】 シクラメンの植物体の一部から形成させ
   たカルスを固体培地上で培養してカルスを増殖させるＡ
   工程と、前記Ａ工程で増殖したカルスを液体培地中で培
   養して増殖させるＢ工程と、前記Ｂ工程で増殖して得ら
   れたカルスの一部を前記Ａ工程の出発材料のカルスとし
   てとして再循環するＢ´工程、からなることを特徴とす
   る、シクラメンのカルスの増殖方法。 【０００１】