KR100375262B1

KR100375262B1 - 액상현탁세포배양법에 의한 플라우노톨의 생산방법

Info

Publication number: KR100375262B1
Application number: KR10-1999-0044329A
Authority: KR
Inventors: 주영운
Original assignee: (주)유케이케미팜
Priority date: 1999-10-13
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2003-03-10
Also published as: KR20010037044A

Abstract

본 발명은 액상현탁세포배양에 의해 플라우노이(Croton sublyratus Kurz, Euphorbiaceae)를 배양하는 방법과 그로부터 플라우노톨(plaunotol)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 플라우노이를 액상현탁배양하는 방법은 플라우노이 묘목의 잎, 줄기, 뿌리 또는 종자를 발아시켜 얻어진 배아의 잎, 줄기, 뿌리를 한천 평판배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 한천 평판배지에서 계대배양하여 지속적으로 캘러스에서 얻어진 세포를 얻도록, 캘러스 세포배양을 확립하는 단계; 및 액체배지를 사용하여 캘러스에서 얻어진 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 플라우노톨을 생산하는 방법은 액상현탁배양된 플라우노이 세포 또는 그의 배양액으로부터 플라우노톨을 생산하는 방법이다. 본 발명에 의하면, 다른 배양방법에 비해, 플라우노이의 생장율 및 플라우노톨의 생산량이 우수하다. 또한, 생합성된 플라우노톨이 세포내보다는 배양액내에 더 많이 있으므로, 플라우노톨을 얻을때 배양된 세포를 수거하여 수거된 세포에서 세포추출물을 수득하는 공정을 생략할 수 있기때문에, 세포의 추출물에서 플라우노톨을 얻어내는 종래의 방법에 비하여, 생산비가 낮고 생산기간을 단축시킬 수 있으며, 공정이 간편하여 플라우노톨의 생산성을 매우 높일 수 있다는 장점을 가진다.

Description

액상현탁세포배양법에 의한 플라우노톨의 생산방법{A Method for Manufacturing Plaunotol by Liquid-Suspension Cell Culture}

본 발명은 액상현탁세포배양에 의해 플라우노이(Croton sublyratus Kurz, Euphorbiaceae)를 배양하는 방법과 그로부터 플라우노톨(plaunotol)(참조: 화학식 1)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 액체배지를 사용하여 플라우노이를 액상현탁배양하는 방법 및 액상현탁세포배양법에 의해 배양된 플라우노이로 부터 항궤양 성분인 플라우노톨을 생산하는 방법에 관한 것이다.

플라우노이는 태국에서 전통적으로 피부병과 구충제로 사용하던 약용식물로서, 태국 등 동남아시아에 자생하는 대극과 크로톤속 식물이다. 이러한 플라우노이에서 생산되는 플라우노톨은 항궤양 성분을 가진 비환원형 디테르펜 알콜(acyclic diterpene alcohol)로서, 플라우노이를 인공적으로 배양했을 때에는, 배양세포에서 검출되었다는 사례가 보고되지 않은 물질이다. 일반적으로 플라우노톨이 식물 생체내에서 원래의 형태, 에스테르화된 형태, 및 지방산과 결합된 형태로 존재한다고 알려져 있으며(참조: Hiroyuki Morimoto et al., Plant Cell Report, 8:210-213(1989)), 생체내에서는 주로 원래의 형태와 에스테르화된 형태로 존재한다고 알려져 있다(참조: Kitazawa E. et al., Ann. Rep. Sankyo Res. Lab. 34:39-41(1982)). 디테르펜계 물질은 지금까지, 캘러스나 액체현탁배양을 통해서 생산되거나 생물전환법에 의해 생산된 몇몇 사례만이 보고된 바 있다.

이처럼 플라우노이를 재배하여 그로부터 항궤양 성분인 플라우노톨을 추출하는 종래의 방법은 다음과 같은 단점이 있다: 첫째, 기후적인 요인에 의해 플라우노이의 생산지가 한정되어 있어서, 원자재의 확보가 용이하지 않으며, 온실같은 인공적인 환경을 조성할때는 원자재 생산비가 너무 높다; 둘째, 계절의 변화, 자연적 재해에 같은 기후조건의 불리한 변화 및 식물에 대한 전염병의 확산에 의하여 원자재의 생산량이 좌우되므로 필요한 플라우노이의 생산량을 적기에 확보하기 어렵다; 셋째, 재배, 수확, 유통과 같은 중간단계에서 작물의 손상에 의해 확보된 플라우노이 양의 감소가 일어난다; 넷째, 재배한 플라우노이 추출성분으로부터 항궤양성분만을 분리하여야 하기 때문에, 분리, 농축하는 과정이 복잡하다.

위에 상술한 것처럼, 자연상태에서 재배한 플라우노이로부터 항 궤양성분을 추출하는 종래의 기술은 시간, 비용 및 공정 면에서 많은 문제점이 있으므로, 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 식물 세포배양 방법을 이용하여 플라우노이 세포를 인공배양하여 항궤양 성분인 플라우노톨을 다량 생산하려는 연구가 지금까지 여러가지 방법으로 시도되어 왔다.

한편, 식물세포를 배양하는 방법은 식물체에서 조직을 얻어서 캘러스를 만들어 식물체의 조직을 배양하는 방법을 사용한다. 보통 이러한 캘러스를 만들때는 주로 고체배지를 사용하는데, 이 경우 액상현탁배양에 비해 산소의 공급량이 많고, 배양세포가 지지체의 영향을 받을 수 있다, 그러나, 액체배지를 사용한 액상현탁배양은 고체배지를 사용한 세포배양보다 다음과 같은 몇가지 장점이 있다: 첫째, 액상현탁배양으로는 같은 량의 고체배지를 사용했을 때 보다 균일하게 영양분을 공급할 수 있다; 둘째, 액상현탁배양으로는 규모나 생산량의 면에서, 배양의 한계성이 고체배지를 사용할때 보다 현저하게 작다; 셋째, 액상현탁배양으로는 같은 량의고체배지를 사용했을 때 보다 배양조건의 조절 등 배양 중 조작이 편이하고, 배양방법이 용이해서 생산 단가를 낮출 수 있다; 넷째, 액상배지는 그 자체로서 고체배지보다, 생산, 보관 및 유통이 용이하여 배양작업에 편이성을 도모할 수 있다; 다섯째, 조성의 변환이 용이하여 비슷한 종류의 다른세포 배양에 적용하기가 쉽다. 이와 같은 이유로, 액상현탁배양은 고체배지를 사용한 배양보다 선호되고 있는 바, 현재까지 생물공학적인 발효공정은 예외없이 액상배양으로 수행되고 있으며, 고체배양은 세포주의 유지, 보존적인 관점에서 사용되는 것이 일반적이다.

이러한 관점에서, 비교적 생산성이 높고, 취급이 용이한 플라우노이의 액상현탁배양법을 개발하려는 노력이 계속되어 왔으나, 지금까지는 고체 배양용 배지에서 키운 캘러스에서 소량의 플라우노톨을 얻었다는 결과(참조: 일본특허공개 제 62-152920호) 이외에는, 플라우노톨을 얻었다는 사례가 보고되지 않았다. 더욱이, 액상배지를 사용하여 프라우노톨을 생산한 사례로는, 플라우노톨의 전구체인 게라닐게라니올(geranylgeraniol)을 액체 현탁세포배양을 통해 얻었다는 결과가 있으나, 역시 플라우노톨은 얻을 수 없었다고 보고된 바 있다(참조: 삼공연보 41:169-173,1989; 일본특허공개 제 08-47426호).

따라서, 값싼 생산비와 취급이 용이한 배양과정에 의하여 경제적으로 생산 할 수 있으며, 플라우노톨의 생합성률을 증가시키고, 배양된 세포에서 쉽게 플라우노톨을 추출해 낼 수 있는 기술을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 플라우노이를 액체상태에서 배양하고, 그 세포에서 많은 량의 플라우노톨을 생산하며, 생산된 플라우노톨을 쉽게 추출할 수 있는 기술을 확립하고자 예의 노력한 결과, 플라우노톨의 생산성을 높일 수 있는 플라우노이 세포를 액상배지를 사용하여 다량으로 배양하는 액상현탁세포배양방법과 세포배양을 통하여 항궤양성분인 플라우노톨을 용이하게 생산할 수 있는 방법을 알아내고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 플라우노톨을 생산할 수 있는, 플라우노이를 효과적으로 액상현탁배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 액상현탁배양된 플라우노이 세포 또는 그의 배양액으로부터 플라우노톨을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

제 1도는 hMS 액체배지와 UK 액체배지를 사용하여 플라우노이를 액상현탁세 포배양하였을 때, 플라우노이세포의 성장과 플라우노톨의 생산의 상관관계를 비교하여 나타낸 그래프이다.

본 발명의 플라우노이를 액상현탁배양하는 방법은 플라우노이 묘목의 잎, 줄기, 뿌리 또는 종자를 발아시켜 얻어진 배아의 잎, 줄기, 뿌리를 한천 평판배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 한천 평판배지에서 계대배양하여 지속적으로 캘러스에서 얻어진 세포를 얻도록, 캘러스 세포배양을 확립하는 단계; 및 액체배지를 사용하여 캘러스에서 얻어진 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 플라우노톨을 생산하는 방법은 액상현탁배양된 플라우노이 세포 또는 그의 배양액으로부터 플라우노톨을 생산하는 방법이다.

이하, 본 발명의 플라우노이의 액상현탁배양방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1단계: 캘러스의 유도

플라우노이 묘목의 잎, 줄기, 뿌리 또는 종자를 발아시켜 얻어진 배아의 잎, 줄기, 뿌리를 한천 평판배지에서 배양하여 캘러스를 유도한다: 플라우노이 묘목의 잎, 줄기, 뿌리 또는 종자를 발아시켜 얻어진 배아의 잎, 줄기, 뿌리의 생장점부근을 5 내지 10㎝의 길이로 자른 후, 얻어진 세포절편을 세제, NaOCl용액, 초음파 발생기, 및 70%(v/v) 에탄올 용액을 사용하여 멸균한 후, 멸균증류수로 세척하였다. 그런 다음, 준비된 세포절편을 한천 평판배지에서 배양기에서 배양하여 캘러스를 유도하는데, 캘러스의 유도시, 온도는 30 내지 38℃, 보다 바람직하게는 32 내지 36℃, 가장 바람직하게는 34℃, 광조건은 암조건을 유지하며, 한천 평판배지에 들어가는 한천의 농도를 0.5% 로 한다.

제 2단계: 캘러스 세포배양의 확립

유도된 캘러스를 한천 평판배지에서 계대배양하여 지속적으로 캘러스에서 얻어진 세포를 얻도록, 캘러스 세포배양을 확립한다: 제 1단계에서 얻어진 캘러스를 한천 평판배지에서 4주간격으로 계대배양하여 플라우노이 세포의 캘러스를 안정적으로 공급한다. 이때, 배지에 들어가는 한천의 농도는 역시 0.5% 로 한다.

제 3단계: 캘러스에서 얻어진 세포의 배양

액체배지를 사용하여 캘러스에서 얻어진 세포를 배양한다: 제 2단계에서 얻어진 캘러스 세포를 이용하여 액상현탁배양을 실시한다. 이때, 액체배지로는 5% 과당이 탄소원으로 함유된 우광(UK)배지를 사용하며, 배양온도는 30 내지 38℃, 보다 바람직하게는 32 내지 36℃, 가장 바람직하게는 34℃, 광조건은 2000룩스 이상의 밝기를 가진 빛으로 24시간 내내 명조건으로 한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 캘러스의 유도

플라우노이세포를 배양하기 위하여 먼저 캘러스를 유도하였다: 태국에서 입수한 Plau-noi(Croton sublyratus Kurz, Euphorbiaceae)의 잎, 줄기, 뿌리의 생장점부근을 5 내지 10㎝의 길이로 자른 후, 얻어진 세포절편을 세제가 첨가된 증류수에 넣은 후 조심스럽게 세척하였다. 그런 다음, 다시 증류수로 세척하고 2.5%의 NaOCl용액에 Tween 80을 2 내지 3방울 정도 넣고 10분간 교반시켜서 표면살균하였다. 30초간 초음파 발생기로 표면에 잔존하는 미세기포를 제거한 후, 다시 10분간 더 교반하였다. 멸균실험대(clean bench)로 옮겨 멸균수로 2회 세척한 후, 70%(v/v) 에탄올 용액에 2분간 침지하고 멸균수로 3회 세척하였다. 함께 입수한 종자는 34℃ 온실에서 발아시켜 생육된 잎·줄기·뿌리등을 상기의 방법으로 살균한 다음, 각각의 생장점 부위를 1㎝정도의 크기로 잘라서 세포절편체를 얻었다. 이렇게 얻어진 세포절편체 역시 상기와 같은 처리로서 준비하였다.

캘러스 세포 유도에 사용되는 배지는 일반적인 MS배지의 성분이 절반정도 들어 있는 hMS(half MS)배지가 가장 적합하다(참조: 표 1). 이 배지에 식물호르몬으로서 오옥신과 사이토키닌을 첨가하는데, 오옥신으로는 1-나프탈렌아세트산(1-naphthaleneacetic acid, NAA)를 2ppm을 첨가하였고, 사이토키닌으로는 6-벤질아미노퓨린(6-benzylaminopurine, BA)을 0.2ppm을 첨가하였다. 그리고, 지지체로 한천을 첨가한 캘러스 유도용 한천 평판배지위에 세포절편체들을 옮겨 놓고, 온도는 34℃, 암조건의 환경에서 배양을 시작한지 4일후부터 캘러스가 유도되어 자라는 것을확인하였다. 이때, 한천의 농도는 0.5%를 사용하였을 때, 캘러스를 형성하는 세포들간의 결합력이 가장 약화되었으며, 이러한 세포간의 결합력의 약화는, 캘러스 계대배양에서 얻어진 세포를 이용하여 액상현탁배양을 수행하는데 중요한 요건이 되었다. 사용한 잎, 줄기, 뿌리 모두에서 캘러스가 잘 유도되었으며, 이중 우수한 것을 매 4주마다 계대하여 세포주(cell line)를 확립하였다. 이때, 배지내에 자당(sucrose)의 농도는 3%를 유지했을 때 세포의 생장이 좋았으며, 과량의 식물호르몬 첨가시 세포의 생장이 억제되었다.

hMS 배지의 조성

성분명	농도(㎎/ℓ)	성분명	농도(㎎/ℓ)
NH₄NO₃	825.000	CuSO₄·5H₂O	0.013
KNO₃	950.000	CoCl·6H₂O	0.013
MgSO₄·7H₂O	185.000	Fe·Na-EDTA	1.836
KH₂PO₄	85.000	Myo-inositol	100.000
CaCl₂·7H₂O	220.000	Nicotinic Acid	0.500
KI	0.415	Pyridoxine·HCl	0.500
H₃BO₃	3.100	Thiamine·HCl	0.500
MnSO₄	7.550	Glycine	2.000
ZnSO₄	4.300	탄소원	자당 3%
Na₂MoO₄·2H₂O	0.125	pH	5.8

실시예 2: 액상현탁배양 유도

상기에서 얻어진 캘러스에서 액상현탁배양을 유도하였다: 실시예 1에서 유도된 캘러스중 생장이 우수한 캘러스에서 얻어진 세포를 액상현탁배양용 hMS 배지에넣고 궤도식 진탕기에서 180rpm 속도로 교반시키면서 배양하였다. 배지 성분은 한천을 제외하고 실시예 1에서 사용한 고체배지의 조성과 동일하며, 배양조건 및 첨가물도 동일하게 하였다. 이때 12일 배양시 세포의 생장은 2배로 증가하며, 플라우노톨은 6ppm 이내로 생성되었다. 이중 우수한 세포를 매 12일마다 새로운 배지에 계대배양하여 액상현탁세포배양을 확립하였다. 배양된 플라우노이세포에서 플라우노톨을 생산하는지 확인하였으나, 이러한 액상배양을 통하여 얻어진 플라우노이세포에서는 많은량의 플라우노톨을 얻을 수 없었다.

실시예 3: 플라우노톨 생성유도(이차 대사산물의 유도)

상기에서 얻어진 배양세포에서 더 많은 량의 플라우노톨을 생합성하도록 배양성분을 각각 달리하여 액상현탁배양하였다: 실시예 2에서 얻어진 액상현탁세포로부터 다량의 플라우노톨을 생성하도록 유도하기 위하여, 명조건, 34℃의 환경에서 상기한 hMS 배지 성분 18가지 및 투여 호르몬과 탄소원 각각의 농도를 달리하여 실험하였다. 그 결과, 세포의 생장이 좋으면서도 플라우노톨 생성이 잘되는 새로운 플라우노톨 생산유도 배지조성을 알아낼 수 있었고, 이 조성에 의해 만들어진 배지를 우광(UK)배지로 명명하였다(참조: 표 2).

우광(UK) 배지의 조성

성분명	농도(㎎/ℓ)	성분명	농도(㎎/ℓ)
NH₄NO₃	825.000	CuSO₄·5H₂O	0.225
KNO₃	950.000	CoCl·6H₂O	0.125
MgSO₄·7H₂O	370.000	Fe·Na-EDTA	7.342
KH₂PO₄	850.000	Myo-inositol	200.000
CaCl₂·7H₂O	220.000	Pyridoxine·HCl	0.100
H₃BO₃	11.200	Thiamine·HCl	0.100
MnSO₄	25.410	Glycine	10.000
ZnSO₄	9.600	탄소원	과당 5%
Na₂MoO₄·2H₂O	7.000	pH	5.8

우광배지조성에 식물성장호르몬으로서 1-나프탈렌아세트산을 2ppm, 6-벤질아미노퓨린 0.2ppm을 넣고, 배지 pH는 5.8로 조정한 후 플라우노톨 생성촉진배지를 완성하였다. 실시예 2에서 유도된 액상현탁배양 세포중 지수기(exponential phase) 말기의 현탁배양 세포를 뷔흐너(Buchner) 깔대기(Whatman No.1)로 여과한 후 우광배지가 50㎖든 125㎖ 삼각플라스크에 2g씩 접종하였다. 이어, 약 1시간 방치한 후 궤도식 진탕기에서 180rpm으로 교반하며, 34℃ 배양기에서 광도를 2000룩스 이상으로 하여 24시간 명조건의 환경에서 16일간 배양하였다. 이러한 환경에서 hMS 고체배지와 UK배지를 사용하여 플라우노이를 비교배양한 결과, 플라우노이의 생장률은 hMS 고체배지를 사용하였을 때보다, UK배지를 사용하였을때 약 3배이상, 플라우노톨 생산량은 10배이상 증가하였고(참조: 표 3), hMS 액체배지와 UK 액체배지를 사용하여 플라우노이를 비교배양한 결과 역시, 플라우노이의 생장률은 hMS 액체배지를 사용하였을 때보다, UK 액체배지를 사용하였을때 약 3배이상, 플라우노톨생산량은 8배이상 증가하였다(참조: 도 1).

실시예 4: 플라우노톨의 생산

실시예 3에서 액상현탁배양한 후 배양액에서 플라우노톨을 생산하였다: 실시예 3의 방법으로 배양된 플라우노이의 액체현탁배양세포에서 생산된 플라우노톨의 농도는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 고성능 기체 크로마토그래피(GC)로 분석하였고, 핵자기공명(NMR)장치로 플라우노톨을 검증하였다(참조: 일본특허공개 제 62-152920호).

고체배지와 액체배지를 사용하였을 때 세포생장률과 프라우노톨 생산률의 비교

구분	hMS배지(고체배지)	UK배지(액체배지)
계대간격	4주(28일)	12일
세포성장(접종량 대비)	2-4배 증식	3-12배 이상 증식
플라우노톨 생산성(mg/L/day)	0.5^*	6.5

*: 일본특허공개 제 62-152920호의 결과값을 환산한 수치임.

배양초기에는 투명하던 배양액이 배양이 진행됨에 따라 배양액의 탁도(turbidity)가 증가하였기 때문에 배양액을 분석한 결과, 배양액내에 다량의플라우노톨이 존재함을 발견하였다. 배양된 세포에서 얻어진 플라우노톨의 양과 배양액내에 존재하는 플라우노톨의 양을 비교한 결과, 특이하게도, 생성된 플라우노톨이 배양된 세포내 보다는 세포의 배양액 내에 현저히 많은 량이 존재한다는 사실을 발견하였다. 이에, 액상현탁배양된 플라우노이세포의 양과 액상현탁배양된 플라우노이세포 및 배양액에서 생산된 플라우노톨의 양을 측정한 결과, 얻어진 플라우노이 세포의 양은 배지 1리터당 453g이었고, 플라우노톨의 생산량은 배지 1리터당 75㎎의 수율을 확보할 수 있었다.

배양액에서 얻어진 플라우노톨은 배양된 세포추출물에서 얻어지는것과 같이 두가지의 형태로 얻어지므로, 상기와 같이 플라우노이의 액상현탁배양법을 통해 배양액에서 플라우노톨을 얻는경우, 플라우노이 추출물을 얻는 공정이 생략되고 세포내의 불순물의 함량을 크게 줄일 수 있으므로, 기존의 공정을 크게 변화시키지 않은 상태에서 단순화시켜, 실제 대량생산을 목적으로 하는 산업적 응용에 큰 잇점을 주어 폭넓게 적용될 수 있을 것으로 사료된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 액체배지를 사용하여 플라우노이를 액상현탁배양하는 방법 및 액상현탁세포배양법에 의해 배양된 플라우노이로 부터 항궤양 성분인 플라우노톨을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 다른 배양방법에 비해, 플라우노이의 생장율 및 플라우노톨의 생산량이 우수하다. 또한, 생합성된 플라우노톨이 세포내보다는 배양액내에 더 많이 있으므로, 플라우노톨을 얻을때 배양된 세포를 수거하여 수거된 세포에서 세포추출물을 수득하는 공정을 생략할 수 있기때문에, 세포의 추출물에서 플라우노톨을 얻어내는 종래의 방법에 비하여, 생산비가 낮고 생산기간을 단축시킬 수 있으며, 공정이 간편하여 플라우노톨의 생산성을 매우 높일 수 있다는 장점을 가진다.

Claims

(ⅰ) 플라우노이 묘목의 잎, 줄기, 뿌리 또는 종자를 발아시켜 얻어진 배아 의 잎, 줄기, 뿌리를 한천 평판배지에서 30 내지 38℃의 온도 및 암조 건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

(ⅱ) 유도된 캘러스를 한천 평판배지에서 계대배양하여 지속적으로 캘러스 세포를 얻도록 캘러스 세포배양을 확립하는 단계; 및,

(ⅲ) 캘러스에서 얻어진 세포를 825.000mg/L의 NH₄NO₃, 950.000mg/L의 KNO₃, 370.000mg/L의 MgSO₄·7H₂O, 850.000mg/L의 KH₂PO₄, 220.000mg/L의 CaCl₂·7H₂O, 11.200mg/L의 H₃BO₃, 25.410mg/L의 MnSO₄, 9.600mg/L의 ZnSO₄, 7.000mg/L의 Na₂MoO₄·2H₂O, 0.225mg/L의 CuSO₄·5H₂O, 0.125mg/L 의 CoCl·6H₂O, 7.342mg/L의 Fe·Na-EDTA, 200.000mg/L의 미오-이노시 톨(myo-inositol), 0.100mg/L의 피리독신(pyridoxine)·HCl, 0.100mg/L의 티아민(thiamine)·HCl, 10.000mg/L의 글리신 및 5%의 과 당을 포함하는 pH 5.8의 액체배지를 사용하여 30 내지 38℃의 온도 및 2000룩스 이상의 밝기를 가진 빛의 24시간 명조건에서 배양하는 단계 를 포함하는 플라우노이(Croton sublyratus Kurz, Euphorbiaceae)의 액상현탁배양방법.
삭제
제 1항에 있어서,

캘러스유도나 계대배양시 사용하는 한천 평판배지의 한천농도가 0.5% 인 것을 특징으로 하는

액상현탁배양방법.
삭제
삭제
삭제
제 1항의 액상현탁배양방법에 의해서 배양된 플라우노이 세포 또는 그의 배 양액으로부터 플라우노톨을 수득하는 단계를 포함하는 플라우노톨의 생산방 법.