KR100294656B1 - 배양기 내에서 직접배발생을 통한 가시오갈피 묘목의 미세 번식방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가시오갈피(Eleutherococcus senticosusMaxim.)를 캘러스(callus) 유도과정을 거치지 않고 배양재료의 표면에 직접 체세포배발생(direct somatic embryogenesis)의 방법을 이용하여 배양 용기 내에서 배양하여 묘목을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것임.

본 발명의 방법은 가시오갈피의 유식물 절편을 배양하여 캘러스 유도과정을 거치지 않고 어린 유식물 절편 표면으로부터 직접 체세포배를 유도하고 이를 발아시킨 다음, 어린 가시오갈피 유식물체를 생육시켜 가시오갈피 묘목을 생산하는 방법으로 구성됨. 본 발명은 또한 전술한 체세포배로부터 절편을 절취하여 배양하면 다시 배양재료의 표면으로부터 2차적으로 체세포배가 유도되는데, 이러한 2차 체세포배로부터 가시오갈피의 묘목을 생산하는 방법에도 관계됨. 본 발명에 의하면 번식이 어려운 가시오갈피의 묘목을 미세번식 시킬 수 있음.

Description

배양기 내에서 직접배발생을 통한 가시오갈피 묘목의 미세 번식방법.{METHOD FOR MICROPROPAGATION OFEleutherococcus senticosusMaxim. via DIRECT SOMATIC EMBRYOGENESIS}

본 발명은 식물조직배양 기술을 이용하여 가시오갈피 묘목을 대량으로 생산하는 방법에 관계되는 것이다.

식물조직배양을 이용하여 식물을 증식하는 방법은 여러 가지가 있는데 부정아를 이용하는 방법과 체세포배 발생 방법이 있다. 이 중 체세포배의 발생은 크게 배양재료에서 직접 발생되는 직접배 발생과 캘러스를 유도하여 이로부터 체세포배를 유도하는 두가지 방법으로 나누어진다.

본 발명은 가시오갈피의 유식물 배양절편의 표면으로부터 직접 체세포배를 유도하고 유도된 체세포배의 표면으로부터 2차 체세포배를 유도하는 단계를 반복하여 가시오갈피의 묘목을 생산하는 방법에 관계된다.

가시오갈피[Eleutherococcus senticosusMaxim.;Acanthopanax senticosus(Rupr. et Max.) harms 라고도 함]는 일명 시베리아 인삼이라고 하는 목본 식물로서, 러시아, 중국, 한국 및 동북부의 고랭지에만 분포하고 있으며 근피 및 수피를 약용으로 사용하고 있고, 그 약효가 인삼을 능가하는 식물로 알려져 있다.(LEE, KOREAN JOURNAL OF PHARMOCOLOGY, 1979, 10, 103-107). 가시오갈피는 소련, 중국, 일본 및 한국에서 법정보호수로 지정되어 있으며, 한국에서는 남벌로 인하여 강원도 지역에 극소수가 분포되고 있으나 거의 멸종단계에 있다. 가시오갈피의 약효는 전통한방서적에서도 만병에 효과가 있는 것으로 기재되어 있으며, 최근 소련을 중심으로 연구가 활발히 이루어져 항암, 당뇨, 진통해열, 신경통, 스트레스 피해 감소, 피로회복, 생명연장 등 다양한 분야에 약효가 뛰어난 것으로 확인되고 있다.(한, 생약학회지 1976, 7, 171-178)

가시오갈피는 한국에서는 종자가 잘 맺히지 못하므로 번식이 거의 불가능한 것으로 알려졌으며(Lee, KOREAN JOURNAL OF PHARMOCOLOGY, 1979, 10, 103-107), 설령 종자를 얻는다 하여도 종자발아만을 위해 2년 이상 저온 충적처리를 하여야 하는 것으로 알려졌다.(Isoda & Shoji, NATURAL MEDICINE 1994, 48, 75-81; Kuribayashi & Ohashi, Syoyakugaku Zasshi 1971. 25. 95-101) 그러나 전술한 처리방법으로 처리하여도 전혀 발아가 되지 않는 경우가 많아서, 한국에서는 종자발아를 통한 가시오갈피의 대량번식이 이루어진 예가 없는 것으로 알려졌다. 이와 같이 번식이 까다로운 식물의 경우는 생물공학적 기술을 이용하는 것이 획기적인 번식수단이 될 수 있다. 따라서 한국과 같이 종자에 의한 번식이 어려운 지역에서는 가시오갈피 묘목을 조직배양방법을 이용하여 실험실내에서 대량으로 생산할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

일반적으로 배양용기내에서 무균적으로 식물체를 생산하는 방법은 매우 다양하며, 이러한 방법 중에는 체세포배 발생을 거쳐 식물체를 생산하는 방법이 있는데, 체세포배의 발생은 크게 두 가지로 구분되고 있다. 즉, 배양조식의 표면으로부터 체세포배를 직접 유도하여 묘목을 유도하는 방법이 있고, 배양조직으로부터 캘러스를 유도한 다음 이 캘러스로부터 체세포배를 유도하는 방법이 있다.

가시오갈피 조직배양에 관한 최초보고는 최 및 소(한국 식물조직배양학회지 1993, 20, 261-266)에 의하여 발표되었는데, 이 방법은 조직배양을 이용하여 체세포배를 유도하는 초보적인 방법으로서 체세포배 유도 빈도가 극히 낮아서 묘목생산에는 이용할 수 없었다.

공개특허 제1999-002463호에는 가시오갈피의 뿌리로부터 체세포배 캘러스를 유도하고 이 캘러스로부터 체세포배를 배양하는 방법으로 구성된 체세포배를 이용한 가시오갈피의 번식방법이 기재되어 있다. 이와 같은 캘러스를 이용하는 방법은 가시오갈피가 가지고 있는 형질을 손실할 가능성이 있었다.

본 발명은 가시오갈피의 종자로부터 1차 체세포배를 유도하고 이 1차 체세포배의 표면으로부터 캘러스 생성과정이 없이 2차 체세포배를 유도하므로서 유전자의 변이가 전혀 이루어지지 않아서 원재료가 지니는 형질의 보존에 있어서 가장 이상적인 가시오갈피 번식방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 식물조직 배양 기술을 이용하여 가시오갈피 묘목을 대량으로 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

전술한 본 발명의 목적은 캘러스 유도과정을 거치지 않고 가시오갈피 종자 유래 유식물 절편을 배양하여 고빈도로 체세포배를 생산하거나 또는 이들 체세포배 유래 절편표면으로부터 다시 2차 배를 생산하여 가시오갈피 묘목을 생산하는 본 발명의 방법에 의하여 달성된다.

본 발명은 가시오갈피 종자 유래 유식물체 절편으로부터 캘러스 유도과정을 거치지 않고 배양재료 표면으로부터 직접 체세포배를 유도하여 가시오갈피 묘목을 대량생산하는 방법으로 구성된다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같이 얻어지는 체세포배 절편으로부터 체세포배를 유도하여 유식물체를 계속적으로 생산하는 방법에도 관계된다.

본 발명의 특징은 캘러스 유도과정을 거치지 않고 직접 가시오갈피 유식물체 절편 표면으로부터 체세포배를 유도하는데 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 가시오갈피의 묘목을 대량으로 생산하기 위하여는 가시오갈피 유식물 절편으로부터 체세포배를 직접 유도하여 가시오갈피의 유식물체를 생산하고 이와 같이 생산된 체세포배 절편으로부터 2차 배를 유도하는 방법을 반복하는 것이며, 유도된 체세포배는 지배렐린으로 처리하여 발아시키고, 발아된 어린 식물체를 토양에 이식하여 묘목을 생산한다.

따라서 본 발명은 가시오갈피 유식물 절편으로부터 체세포배를 직접 유도하는 1차 체세포배 유도 단계, 유도된 체세포배 절편으로부터 2차 배 유도를 유도하는 단계, 유도된 체세포배를 지베렐린으로 처리하여 발아시키고 생육시키는 단계 및 발아된 어린 식물체를 토양에 적응하도록 이식하여 묘목을 생산하는 단계를 포함하는 가시오갈피 묘목 생산방법에도 관계된다. 전술한 방법에서, 묘목을 한꺼번에 대량으로 생산하기 위하여는 2차 배 유도단계를 수 차례 반복하는 것이 바람직하다.

도1은 가시오갈피의 종자유래 유식물 절편 표면으로부터 체세포배를 유도하는 사진.

도2는 가시오갈피 체세포배유래 어린 유식물 절편 표면으로 2차 배를 유도하는 사진.

도3은 가시오갈피 체세포배가 배양재료의 표면으로부터 직접 발생됨을 조직학적으로 증명하는 사진.

도4는 각각의 체세포배를 지베렐린 처리하여 어린 유식물을 얻어내는 사진.

도5는 상기 과정을 거쳐 토양에서 대량으로 번식되고 있는 가시오갈피의 사진.

이하 본 발명의 방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1) 배양된 유식물 절편으로 체세포배를 직접 유도하는 1차 체세포배 유도단계.

가시오갈피의 종자를 약 2년 동안 충적 및 저온 처리하여 종자 내 접합자배를 충분히 성숙시키고 접합자배를 무균적으로 적출시켜 발아시킨 다음, 발아된 유식물로부터 1∼3cm의 유식물 절편을 절취하고 이 유식물 절편을 설탕 3%, 2, 4-D 0.1-5mg/1 및 한천 0.8%가 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 배지에서 배양한다. 약 2주 후에 배양절편 표면으로부터 체세포배가 직접 발생되기 시작하여 1달 후면 자연 단계로 성숙되어 1달만에 유식물 당 최소한 50개 이상의 체세포배가 생산되게 된다.(도1 참조) 체세포배가 발생되는 기원을 알기 위해 조직학적으로 관찰하였을 경우 배양재료의 표면으로부터 직접 발생됨이 확인되었다(도2 참조). 이 때 배양실 조건은 1500 LUX 백색 형광등으로 16시간 조명하고 온도는 24℃로 유지한다. 그러나 발아 전의 미숙배를 배양하는 경우에는 발생된 체세포배의 수가 적고(접합자 배당 10개 이하) 또한 서로 융합된 기형배가 유도될 수 있다. 필요에 따라서는 전술한 체세포배를 생육하여 어린 유식물체를 얻을 수 있다.

2) 체세포배 유래 유식물 절편표면으로부터 다시 2차 배를 유도하는 단계.

전술한 단계에서 얻은 체세포배 또는 어린 유식물체를 생장시킨 후, 체세포배 및 어린 유식물체로부터 절편을 절취하고, 이 절편을 전술한 단계에서 사용한 것과 같은 뮤라시게오 스쿠그 배지에 2.4-D를 첨가하여 조제된고체배지에 다시 배양하여 유식물 당 70개 정도의 체세포배를 2차로 생산한다.(도3 참조) 따라서 이러한 방법을 계속하면 기하급수적으로 다량의 체세포배를 얻을 수 있으므로 대량의 묘목을 생산할 수 있게 된다.

3) 유도된 체세포배로부터 식물체를 생산하는 단계

2차 단계에서 유도된 체세포배를 하나 하나 분리하여 3% 설탕과 0.8% 한천이 함유된 뮤라시게와 스크쿠 배지에 1-100mg/1의 지베렐린을 첨가하여 배양하면, 발아되어 유식물체로 자란다. 발아된 유식물체는 1/3 농도로 희석시키고 설탕 1%를 첨가한 뮤라시게와 스쿠그배지(0.5-0.8% 한천 포함)에 옮겨서 생육시킨다.

일반적으로 체세포배, 특히 캘러스에서 유래된 체세포배는 고빈도로 생산되어도 묘목으로 생장되는 비율이 낮다. 특히, 가시오갈피 체세포배는 자연단계로 성숙한 후에 호르몬이 첨가되지 않은 뮤라시게와 스쿠그 배지에 옮겨주어도 발아가 쉽게 이루어지지 않음을 알게 되었다. 본 발명에서는 체세포배를 뮤라시게와 스쿠그 배지(3%설탕, 0.8% 한천 포함)에 지베렐린을 약 1-100 mg/1로 첨가하여 배양한 결과, 2주일 이내에 96% 이상의 체세포배가 발아되었다(도4 참조). 발아된 유식물체는 1/3농도로 희석시킨 뮤라시게와 스쿠그가 배지에 1% 설탕을 첨가한 고체 배지(0.5-0.8% 한천 포함)에 옮겨서 생육시킨 결과 건실한 묘목으로 생장함을 확인할 수 있었다.(도5 참조)

4) 식물체의 토양 순화단계.

한편 식물체를 모래, 토양 및 버뮤큘라이트를 1:1:1의 비율로 혼합시킨 토양에 이식하여 뿌리와 줄기가 건실한 묘목으로 생장시킨다.

전술한 뮤라시게와 스쿠그 배지에서 생육된 묘목은 직접 일반 토양에 이식하면 발육장애가 일어날 수 있으므로 모래, 토양 및 버뮤큘라이트 1:1:1의 비율로 혼합시킨 토양에 이식하여 일반 토양에 순응하도록 일정 기간 동안 생장시켜야 한다.

실시예 1

1차 체세포배 유도 단계

가시오갈피 접합자배의 종자를 약 2년간 모래 속에 충적처리하여 접합자배가 성숙되었을 때 휴면타파를 우해 약 6개월 간 저온 처리하여 약 7mm 크기의 발아직전 상태로 충분히 성숙되도록 한다. 이들 종자를 70% 에탄올로 1분 동안 처리하고 1% 차아염소산으로 20분 동안 처리하여 멸균시킨 후, 멸균되 증류수로 수세하고 접합자배를 무균적으로 절취한다. 접합자배를 1/2 뮤라시게와 스쿠그 고체배지에 무균 발아시키고 발아된 가시오갈피의 어린 유식물체(약 1-3cm)를 절취하여 약 2mm 크기의 절편을 만든 후 설탕 3%, 2, 4-D 0.1-5mg/1 및 한천 0.8%를 첨가한 뮤라시게와 스쿠그 고체배지에서 온도 24℃로 유지하면서 1500LUX 백색 형광등의 조명하에 1개월 동안 배양하여 배양 절편으로부터 체세포배가 직접 유도되도록 한다.

2차 체세포배 유도 단계

앞에서 얻어진 체세포배 또는 이들로부터 발아된 어린 유식물체로부터 2-5mm 크기의 절편을 만든 다음, 실시예1에서와 같은 배지에서 동일한 배양조건하에 1-2개월 동안 배양하여 절편으로부터 직접 체세포배를 유도한다.

발아 및 생육 단계

앞에서 얻어진 체세포배가 자엽단계로 성숙하면 발아를 유도하기 위해 지베렐린 1-100mg/1이 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 고체 배지에서 2주일 동안 배양하였다. 모든 체세포배가 발아되었다. 발아된 어린 유식물체는 뮤라시게와 스쿠그 배지의 농도를 1/3으로 낮추고 설탕의 농도를 1%로 낮춘 배지에 옮겨서 약 2개월 동안 생육한 결과 뿌리와 줄기가 건실한 식물체로 생장되었다.

4) 식물체의 토양 순화단계.

약 10센치 전후의 크기로 생장된 식물체를 모래, 토양 및 버뮤큘라이트를 1:1:1의 비율로 혼합시킨 토양에 이식하여 약 2개월 동안 생육시킨 결과 뿌리와 줄기가 건실한 묘목으로 생장되었고 86%가 생존하였다.

본 발명에 의하면 기후조건에 따라 종자에 의한 번식이 거의 이루어지지 아니하는 지역에서도 가시오갈피 묘목을 대량으로 생산할 수 있으므로 한국과 같이 가시오갈피가 성장할 수 있으나 종자에 의한 번식이 이루어지지 아니하는 기후조건을 갖는 지역에서도 가시오갈피를 대량으로 생산할 수 있게 된다.

Claims (1)

1. 가시오갈피 종자의 접합자배를 발아시켜 얻은 가시오갈피의 어린 유식물체로부터 절편을 절취하고, 이 절편을 오옥신인 2, 4-D가 첨가된 1/2 뮤라시게와 스쿠그(MS) 고체 배지에서 무균 배양하고 배양절편을 설탕 3%, 2, 4-D 0.1-5mg/1 및 한천 0.8%를 포함하는 뮤라시게 스쿠그 배지에서 배양하여 무균적으로 1차 체세포배를 얻는 1차 체세포배를 유도하는 단계, 유도된 체세포배를 2, 4-D가 첨가된 뮤라시게 스쿠그 배지에 옮기고 1-2개월 배양하여 체세포배의 표면으로부터 2차 체세포배를 유도하는 단계, 전술한 단계를 거쳐 얻어진 체세포배를 지베렐린 1-100mg이 첨가된 뮤라시게 스쿠그 배지에 옮겨서 2주 동안 발아시키는 단계, 발아된 유식물체를 1/3로 농도를 낮춘 설탕 1%를 포함하는 뮤라시게 스쿠그 배지에서 배양하여 어린 식물체를 얻는 단계, 및 어린 식물체를 모래, 토양 및 버뮤큘라이트가 1:1:1로 배합된 토양에 이식하여 약 2개월간 생육시켜 건실한 묘목으로 생장시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 배양 용기내에서 직접배 발생을 통한 가시오갈피의 미세 번식 방법.