CN1090901C - 一种大蒜脱毒种苗繁殖的方法 - Google Patents

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本发明一种大蒜脱毒种苗的繁殖方法，属于蔬菜种苗生产技术领域，专用于脱毒种苗的繁殖。包括：取未熟蒜薹为外植体，通过对不同培养基、培养时间的选择、糖种类和浓度、激素配比的改变、新型植物激素水杨酸和茉莉酸的应用，可同时获得大量脱毒试管苗，繁殖系数达50-76；试管鳞茎诱导率达80%以上，鳞茎鲜重300mg以上。所形成的鳞茎可直接用于生产，省工省力，速度快，脱毒效果好，适合工厂化育苗，可商品化生产。

Description

一种大蒜脱毒种苗的繁殖方法
技术领域
本发明一种大蒜脱毒种苗的繁殖方法，属于蔬菜种苗生产技术领域，专用于大蒜种苗的脱毒快繁。
背景技术
大蒜(Allium sativum L.)是药、菜兼用的世界性蔬菜，也是我国重要的出口创汇蔬菜。因长期用蒜瓣进行无性繁殖而使病毒积累，种性退化，蒜头(鳞茎)变小，严重损害其商品品质，削弱其国际国内市场竞争力。努力改善蒜头(鳞茎)质量是当务之急。目前普遍使用的脱毒方法是结合热处理进行茎尖生长点组织培养，但繁殖系数低，通常从一个茎尖只能获得2～3苗，且在解剖镜下剥离生长点对技术要求严格，容易污染，成活率亦很低，劳动强度大，从而使脱毒种苗生产成本高，难以实用化。目前通过试管苗驯化、移栽途径，对驯化条件要求严格，成活率低，且受大田生长季节的限制，难以与大田生产接口。试管鳞茎属于休眠及储藏器官，对气候适应性广，不需经过驯化，可周年直接移栽，因而培育试管鳞茎则成为一种最有前途的方式。然而，试管鳞茎的形成目前还有赖于培养过程中的偶发性，尚不能定向控制其形成，且形成的鳞茎较小，影响随后的正常萌发生长。
以蒜薹为外植体，所获试管苗脱毒率高，甚至优于只带1～2个叶原基(0.3～0.5mm)的茎尖。但目前尚无以蒜薹为外植体直接获得脱毒苗的研究报道，用蒜薹先诱导形成愈伤组织再分化成苗，这难免会发生变异，从而不符合要求保持种性的脱毒快繁的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种大蒜脱毒种苗的繁殖方法，提出快速获得大量脱毒苗、试管苗健壮生长、诱导鳞茎形成、促进鳞茎膨大的最优培养方案，可定向诱导鳞茎形成，且形成的鳞茎大，适合工厂化育苗，适于移栽田间生长。
本发明所提供的一种大蒜脱毒种苗的繁殖方法，其特征在于：
1.脱毒种苗的获得：取未熟蒜薹为外植体，将蒜薹切分后接种在附加0.5～2.0mg/L BA和0.05～0.2mg/L NAA的MS或B5培养基中。培养40～60d后，切取试管苗基部继代培养。
2.诱导试管鳞茎形成与促进鳞茎膨大：将上述试管苗转接于附加0～5.0mg/L BA，0～0.20mg/L NAA，90～120mg/L糖，0.2～20mg/L乙烯利的MS或B5培养基中。60～90天后即可形成大量鳞茎供移栽用。
其大蒜试管鳞茎诱导形成与膨大方法中所用培养基如果添加水杨酸(SA)1～150mg/L或茉莉酸甲酯(Me-JA)0.01～5mg/L，鳞茎诱导率更高，形成的鳞茎更大。
上述大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法中，各培养基中琼脂含量为0.6～0.8％(质量百分比)，pH5.8～7.5，各阶段培养条件为温度20～25℃，光照强度1800～2500Lux，光照12～14小时/天。所用糖类是指蔗糖、白糖等，以蔗糖为最好。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：
1)与目前普遍使用的茎尖生长点组织培养获得脱毒苗相比，本发明首次以蒜薹为外植体建立大蒜脱毒快繁体系，操作极为简便，勿需在解剖镜下剥离生长点，成活率亦很高，劳动强度小，从而突破性地解决了大蒜脱毒苗繁殖系数低，种苗生产成本高，难以实用化的瓶颈问题。本发明以刚抽出的蒜薹为外植体，培养40～60d后可以获得50～76苗，且生长正常，繁殖系数为50～76，可同时获得大量脱毒苗，且不会发生变异。
2)与目前通过试管苗驯化、移栽途径相比，本发明通过培育试管鳞茎途径，不需经过驯化，可直接移栽大田，且不受大田生长季节限制，从而建立了一种高效的驯化途径。与目前试管鳞茎形成偶发性相比，本发明试管鳞茎的诱导率达80％以上，鲜重达300mg以上，移栽成活率在95％以上。
3)本发明还证明Me-JA和SA在大蒜鳞茎形成与膨大中均具有重要的调控作用。茉莉酸甲酯诱导试管鳞茎形成和促进试管鳞茎膨大，鳞茎诱导率高达97％，鳞茎鲜重达460mg。SA对试管鳞茎形成的诱导率可达95％；且促进试管鳞茎膨大，鳞茎鲜重可达500mg。这是首次发现水杨酸与鳞茎形成的关系。
具体实施例
实施例1：
1)脱毒试管苗的获得：供试品种为太仓白蒜(Allium sativum L.)。取未熟蒜薹为外植体，用70％乙醇表面消毒1分钟，再用0.1％氯化汞消毒15分钟，无菌水冲洗4遍后，剥去外层苞叶，将薹尖四切分后接于同一瓶中，以B5为基本培养基，附加1.0mg/L BA和0.1mg/L NAA。培养60d后，每薹可获得50苗。
2)试管鳞茎诱导及膨大：选用生长整齐一致的试管苗，切取幼苗基部接种于B5基本培养基中，附加蔗糖120g/L，乙烯利0.5mg/L。灭菌前将pH值调至6.4。培养室温度为25℃±2℃，每日光照14h，光强2000Lux，85天后统计鳞茎形成率为85％，并称量鳞茎鲜重达310mg，鳞茎移栽大田成活率为91％。
实施例2：
1)脱毒试管苗的获得：供试大蒜品种为徐州白菜(Allium sativum L.)。取未熟蒜薹为外植体，用70％乙醇表面消毒1分钟，再用0.1％氯化汞消毒15分钟，无菌水冲洗4遍后，剥去外层苞叶，将薹尖切分后接于同一瓶中，以MS为基本培养基，附加0.5mg/LBA和0.06mg/L NAA。培养50天后，每薹可获得65苗。选用生长整齐一致的试管苗，切取幼苗基部作为处理材料。
2)试管鳞茎诱导及膨大：选用生长整齐一致的试管苗，切取幼苗基部接种于MS基本培养基中，附加4.0mg/L BA，白糖90g/L，乙烯利10mg/L。灭菌前将pH值调至6.0。培养室温度为25℃±2℃，每日光照14h，光强2000Lux，60天后统计鳞茎形成率为86％，并称量鳞茎鲜重320mg，鳞茎移栽大田成活率为96.5％。
实施例3：
供试大蒜品种为徐州白蒜，取未熟蒜薹为外植体，按照以上方法，调整培养基成份后实施结果如下：
1)试管苗培养基：B5+2.0mg/L BA+0.2mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA+白糖100g/L+乙烯利20mg/L，80天后统计鳞茎形成率为82％，鳞茎鲜重300mg，鳞茎移栽大田成活率为95.6％。
2)试管苗培养基：B5+3.0mg/L BA+0.2mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+2.5mg/L BA+0.1mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利0.5mg/L，70天后统计鳞茎形成率为83％，鳞茎鲜重320mg，鳞茎移栽大田成活率为95.8％。
3)试管苗培养基：B5+2.5mg/L BA+0.05mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利8mg/L，85天后统计鳞茎形成率为82％，鳞茎鲜重360mg，鳞茎移栽大田成活率为95.6％。
4)试管苗培养基：B5+1.5mg/L BA+0.12mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.5mg/L BA+0.05mg/L NAA+白糖100g/L+乙烯利18mg/L，80天后统计鳞茎形成率为85％，鳞茎鲜重340mg，鳞茎移栽大田成活率为98.5％。
5)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+水杨酸1.5mg/L，90天后统计鳞茎形成率为95％，鳞茎鲜重420mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％。
6)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+水杨酸1.0mg/L，90天后统计鳞茎形成率为88％，鳞茎鲜重410mg，鳞茎移栽大田成活率为98.2％。
7)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：MS+4.5mg/L BA+0.15mg/L NAA+蔗糖110g/L+乙烯利1mg/L+水杨酸10mg/L，90天后统计鳞茎形成率为88％，鳞茎鲜重340mg，鳞茎移栽大田成活率为96％。
8)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.05mg/L NAA+蔗糖95g/L+乙烯利5mg/L+水杨酸50mg/L，75天后统计鳞茎形成率为93％，鳞茎鲜重460mg，鳞茎移栽大田成活率为97.6％。
9)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+水杨酸150mg/L，90天后统计鳞茎形成率为90％，鳞茎鲜重500mg，鳞茎移栽大田成活率为99.6％。
10)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利10mg/L+水杨酸100mg/L，90天后统计鳞茎形成率为92％，鳞茎鲜重420mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％。
11)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯0.02mg/L，90天后统计鳞茎形成率为97％，鳞茎鲜重430mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％。
12)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯1.5mg/L，90天后统计鳞茎形成率为95％，鳞茎鲜重450mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％。
13)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯2.5mg/L，90天后统计鳞茎形成率为97％，鳞茎鲜重440mg，鳞茎移栽大田成活率为96％。
14)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯5mg/L，90天后统计鳞茎形成率为92％，鳞茎鲜重460mg，鳞茎移栽大田成活率为97％。
15)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利16mg/L+茉莉酸甲酯1.0mg/L，90天后统计鳞茎形成率为96％，鳞茎鲜重455mg，鳞茎移栽大田成活率为96％。
16)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+4.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖100g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯4.5mg/L，90天后统计鳞茎形成率为95.7％，鳞茎鲜重435mg，鳞茎移栽大田成活率为98.7％。
17)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：MS+3.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+白糖120g/L+乙烯利20mg/L+茉莉酸甲酯5mg/L，90天后统计鳞茎形成率为90％，鳞茎鲜重430mg，鳞茎移栽大田成活率为96.7％。
18)试管苗培养基：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA；诱导鳞茎形成与促进鳞茎膨大培养基：B5+5.0mg/L BA+0.2mg/L NAA+蔗糖90g/L+乙烯利12mg/L+茉莉酸甲酯0.5mg/L，90天后统计鳞茎形成率为94％，鳞茎鲜重430mg，鳞茎移栽大田成活率为98.6％。

Claims (3)

1一种大蒜脱毒种苗的繁殖方法，其特征在于：
 1)脱毒试管苗的获得：取未熟蒜薹为外植体，将蒜薹切分后接种在附加0.5～2.0mg/L BA和0.05～0.2mg/L NAA的MS或B5培养基中，培养40-60天后，切取试管苗基部继代培养：
2)诱导试管鳞茎形成与促进鳞茎膨大：将上述试管苗转接于附加0～5.0mg/L BA，0～2.0mg/L NAA，90～120g/L糖，0.2～20mg/L乙烯利的MS或B5培养基中，60-90天后即可形成大量鳞茎供移栽使用。
2根据权利要求1所述的一种大蒜脱毒种苗的繁殖方法中，各培养基中琼脂含量为0.6-0.8％(质量百分比，下文同)，pH5.8-7.5，各阶段培养条件为温度20-25℃光照强度1800-2500Lux，光照12-14小时/天，所用糖类是指蔗糖、白糖。
3根据权利要求2所述的一种大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法中，培养基所用糖类是蔗糖。
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