CN101331851A - 板栗的组织培养方法及其专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种繁殖板栗的方法及其专用培养基。本发明培养基，是在WPM培养基中添加包括IBA和下述两种激素中的至少一种得到的培养基：KT和TDZ；所述IBA的终浓度为0.1－1.0mg/L，所述KT或TDZ的终浓度为0.5－1.0mg/L。本发明培养基筛选出了适合中国板栗生长的激素种类、抗生素种类、防褐化物质等，解决了目前中国板栗培养中存在的污染和褐化问题，成功建立了中国板栗成年树的无菌培养体系。用本发明培养基培养板栗的方法操作简单、成本低廉，适合于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种板栗的组织培养方法及其专用培养基。
背景技术
板栗是一种重要的经济作物，全身是宝，例如，板栗果实具有重要的营养价值，可加工成多种食品；板栗树材质坚硬，纹理通直，防腐耐湿，是制造军工、车船、家具等良好材料；其枝叶、树皮、刺苞富含单宁，可提取烤胶；花可作为是很好的蜜源等等。正是由于板栗具有诸多重要的应用价值，市场需求大，所以人们越来越注重其优良品种的培育。尤其是在20世纪初，美国发生的栗疫病(Cryphonectriaparasitica(Murr.)Barr)，引起了前所未有的大面积生态环境灾害，几乎毁灭了美国东部所有天然的栗树林，此后，育种学家们更加注重培育抗疫病性的板栗新品种。
离体培养技术作为现代育种技术的基础和良种繁育的重要手段，受到了极大地青睐。栗属树种离体培养最早是Jacquiot开始尝试的，1971年，Borrot完成了对茎形成层的研究，以成熟板栗树(100年以上)的形成层做外植体，经过离体培养形成愈伤组织，随后在Trippi等人的研究中，也只获得了愈伤组织(callus tissue)，而未见器官分化或只分化到“类芽组织”或芽原基。
中国板栗(Castanea mollissima BL.)具有抗疫病性(blight-resistance)和抗黑水病(inkdisease)的优良特性，是一种良好的种质资源。但是中国板栗极难生根，扦插繁殖生根率很低，而在生物技术方面的研究很少，还未见中国板栗成年树无菌培养体系的成功报道。其有关组培技术的欠缺极大地束缚了现代生物技术在板栗的科研、生产中的应用与发展。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于培养板栗的培养基。
本发明所提供的板栗培养基，是在WPM培养基中添加包括IBA和下述两种激素中的至少一种得到的培养基：KT和TDZ；所述IBA的终浓度为0.1-1.0mg/L，所述KT或TDZ的终浓度为0.5-1.0mg/L。
为了防止内生菌的产生，所述培养基还可以包括终浓度为250-500mg/L的头孢霉素。
为了防止褐化，所述培养基还可包括终浓度为3-5g/L的活性炭。
其中，所述IBA的终浓度优选为0.1mg/L，所述KT或TDZ的终浓度优选为1.0mg/L，所述头孢霉素的终浓度优选为250mg/L，所述活性炭的终浓度优选为4g/L。
本发明的另一个目的是提供一种组织培养板栗的方法。
本发明所提供的组织培养板栗的方法，包括如下步骤：以板栗带腋芽的茎段为外植体，利用上述任一所述培养基进行组织培养，得到板栗组培苗。
所述培养的条件可以为：温度为23±2℃、相对湿度为50-60％、光强为2000-2500Lx、光照明暗周期为14小时光照/10小时黑暗。
所述茎段取自板栗成年树的春季新生枝条。
为了改变外植体材料表面所携带真菌及细菌的正常生活温度，在杀菌前使其生理代谢产生紊乱，从而增加外植体的成活率，而又能保证新生枝条维持正常的生命代谢，所述新生枝条在所述初代培养前最好先在4℃条件下保存24h。
上述培养基及培养方法适合于一般板栗的培养，如中国板栗，具体可以为中国板栗燕红。
本发明培养基筛选出了适合中国板栗生长的激素种类、抗生素种类、防褐化物质等，解决了目前中国板栗培养中存在的污染和褐化问题，成功建立了中国板栗成年树的无菌培养体系。用本发明培养基培养板栗的方法，成功筛选出了建立中国板栗成年树无菌培养体系的外植体材料——板栗成年树春季枝条，保证了优良性状的遗传稳定性，完善了杀菌处理方法，还具有操作简单、成本低廉。因此，本发明培养基及板栗培养方法适合于推广应用。
附图说明
图1为中国板栗燕红初代培养的生长情况。
图2为中国板栗燕红的继代培养的生长状况。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例中用到的试剂及基本培养基如下：
琼脂、蔗糖、活性炭、滤纸、封口膜、75％乙醇、95％乙醇、硝酸铵、硝酸钙、硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、钼酸钠、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硼酸、乙二胺四乙酸钠铁、甘氨酸、肌醇、Ph试纸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、核黄素均购自北京广达恒益科技有限公司。
3-吲哚丁酸(IBA)、6-糠氨基嘌呤(KT)、噻苯隆(TDZ)、头孢霉素均购自北京华夏康源科技有限公司。
升汞购自上海开通化工有限公司。
草酸铵结晶紫、碘液、蕃红(或沙黄)购自上海生工生物工程有限公司。
本发明利用WPM培养基为基本培养基，具体的营养成分如下：
表1、WPM基本培养基组成(mg/L)
实施例1、板栗离体培养各实验条件的探索
一、激素种类及浓度的选择
设3个实验组，筛选方法如下：
实验1：将中国板栗燕红的带腋芽的茎段接种于含有1.0mg/L的细胞分裂素KT和0.1mg/L的生长素IBA的培养基中，在23±2℃、相对湿度50-60％、光强2000-2500Lx、每天光照10小时的条件下进行培养30天，观察茎段生长状况，结果100％的茎段开始有腋芽萌发。
实验2：将中国板栗燕红的带腋芽的茎段接种于含有1.0mg/L的KT和0.1mg/L的BA的培养基中，进行培养，培养条件等均与实验1所述相同。结果都没有腋芽萌发，最后茎尖干枯死亡。
实验3：将中国板栗燕红的带腋芽的茎段接种于含有1.0mg/L的TDZ和0.1mg/L的IBA的培养基中，进行培养，培养条件等均与实验1所述相同。结果100％的茎段开始有腋芽萌发。
因此，以上实验表明，在培养基中添加终浓度为1.0mg/L的KT(或TDZ)和终浓度为0.1mg/L的IBA，可有效促进中国板栗茎段腋芽萌发，而相同质量浓度的BA效果较差，腋芽不萌动。
二、抗生素的筛选：
方法：本发明分别在WPM培养基中添加250mg/L头孢霉素和25mg/L利福平，其抑菌效果如表2所示。
表2、抗生素的抑制效果比对
| 抗生素(浓度) | 接种的外植体数(个) | 细菌污染数(％) | 真菌污染数(％) | 成活率(％) |
| 利福平(25mg/L) | 52 | 29 | 0 | 44.2 |
| 头孢霉素(250mg/L) | 52 | 5 | 7 | 76.9 |
结果表明，在WPM培养基中添加250mg/L头孢霉素可有效抑制外植体材料的污染率，比25mg/L利福平的效果要好。
三、防褐化物质的筛选：
方法：本发明以常用的防褐化物质Vc、PVP、颗粒状活性炭、粉末状活性炭等为实验原料，将其分别以常用的浓度，分别添加到WPM培养基中。
结果表明，添加100mg/L的Vc和1g/L的PVP均褐化严重；颗粒状活性炭聚集于培养基底部，防止褐化效果较差；粉末状活性炭可溶解于培养基中，防止褐化效果较好。
实施例2、中国板栗燕红的离体培养
一、外植体材料的获得及消毒处理
取材：于北京4月底至5月初晴天上午，取中国板栗燕红成年树春季新生枝条，用湿报纸包裹材料放入4℃冰箱24h(注意：此时不要用流水冲洗外植体材料)，然后将材料剪成1cm左右带腋芽的茎段，去除大叶片，流水冲洗。取材时间很重要，是关系到无菌体系能否成功建立的决定因素。本发明通过实验表明，冬季休眠芽、生长季枝条均不适合作为建立无菌体系的外植体材料。
消毒：在超净工作台上，将茎段先用75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2次，每次2min，再用0.1％升汞处理5min，无菌水冲洗3次，每次2min，最后用无菌滤纸将材料表面的水分吸干，将材料的托叶去除后待接种。
二、外植体的培养
(一)用培养基I进行培养
初代培养：将步骤一消过毒的带腋芽茎段接种于培养基I中，在23℃、相对湿度55％、光强2250Lx、光照明暗周期为光照14h/黑暗10h的条件下进行培养，培养30天。
培养基I的组成为：在WPM培养基中添加终浓度为1.0mg/L的KT、终浓度为0.1mg/L的IBA、终浓度为250mg/L的头孢霉素和4g/L粉末状活性炭。
向培养基中添加头孢霉素的方法为：由于头孢霉素经高压会分解，所以需要过滤灭菌。将空三角瓶和培养基高压灭菌后，在超净工作台中，待培养基温度降至60℃，将经过过滤灭菌的头孢霉素添加到培养基中，摇匀分装。
实验设3次重复，每次培养30个茎段。结果表明，共培养的90个茎段中，有90个(100％)长出新生枝(图1)，每个带腋芽的茎段生出一个枝，每个新生的枝约1cm，每个新生枝带有一个腋芽。
继代培养：将上述初代培养中得到的新生枝去掉叶片，再切成带腋芽的茎段，然后按照上述初代培养的方法继续培养30天，结果表明，所有继代培养的茎段均正常生长(图2)，均无染菌现象。
(二)用培养基II进行培养
初代培养：将步骤一消过毒的带腋芽茎段接种于培养基II中，在21℃、相对湿度50％、光强2000Lx、光照明暗周期为光照14h/黑暗10h的条件下进行培养，培养30天。
培养基II的组成为：在WPM培养基中添加终浓度为0.8mg/L的TDZ、终浓度为0.6mg/L的IBA、终浓度为350mg/L的头孢霉素和3g/L粉末状活性炭。
实验设3次重复，每次培养30个茎段。结果表明，共培养的90个茎段中，有90个(100％)长出新生枝，每个带腋芽的茎段生出一个枝，每个新生的枝约1cm，每个新生枝带有一个腋芽。
继代培养：将上述初代培养中得到的新生枝去掉叶片，再切成带腋芽的茎段，然后按照上述初代培养的方法继续培养30天，结果表明，所有继代培养的茎段均正常生长，均无染菌现象。
(三)用培养基III进行培养
初代培养：将步骤一消过毒的带腋芽茎段接种于培养基III中，在25℃、相对湿度60％、光强2500Lx、光照明暗周期为光照14h/黑暗10h的条件下进行培养，培养30天。
培养基III的组成为：在WPM培养基中添加终浓度为0.5mg/L的KT、终浓度为1mg/L的IBA、终浓度为500mg/L的头孢霉素和5g/L粉末状活性炭。
实验设3次重复，每次培养30个茎段。结果表明，共培养的90个茎段中，有90个(100％)长出新生枝，每个带腋芽的茎段生出一个枝，每个新生的枝约1cm，每个新生枝带有一个腋芽。
继代培养：将上述初代培养中得到的新生枝去掉叶片，再切成带腋芽的茎段，然后按照上述初代培养的方法继续培养30天，结果表明，所有继代培养的茎段均正常生长，均无染菌现象。
Claims (10)
1、一种板栗培养基，是在WPM培养基中添加包括IBA和下述两种激素中的至少一种得到的培养基：KT和TDZ；所述IBA的终浓度为0.1-1.0mg/L，所述KT或TDZ的终浓度为0.5-1.0mg/L。
2、根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基还包括终浓度为250-500mg/L的头孢霉素。
3、根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述培养基还包括终浓度为3-5g/L的活性炭。
4、根据权利要求1-3中任一所述的培养基，其特征在于：所述IBA的终浓度优选为0.1mg/L，所述KT或TDZ的终浓度优选为1.0mg/L，所述头孢霉素的终浓度优选为250mg/L，所述活性炭的终浓度优选为4g/L。
5、一种组织培养板栗的方法，包括如下步骤：以板栗带腋芽的茎段为外植体，利用权利要求1-4中任一所述培养基进行组织培养，得到板栗组培苗。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为：温度为23±2℃、相对湿度为50-60％、光强为2000-2500Lx、光照明暗周期为14小时光照/10小时黑暗。
7、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述茎段取自板栗成年树的春季新生枝条。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述新生枝条在所述组织培养前先在4℃条件下保存24h。
9、根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：所述板栗为中国板栗。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述板栗为燕红板栗。
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