CN111387060A - 一种扇脉杓兰的离体快速繁殖方法 - Google Patents

一种扇脉杓兰的离体快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，属于植物组织培养领域。包括步骤：采集扇脉杓兰成熟而未开裂的蒴果；对成熟而未裂开蒴果消毒后切开取粉末状胚进行无菌萌发；增殖培养；分化培养；生根培养；进行移植。本发明通过对无菌萌发所采用的培养基的组分选择，达到95％以上的萌发率；然后进一步筛选分化所用培养基，使分化率达到90％以上；本发明通过对小苗培养所用的培养基的优选以及对移栽的混合基质的控制，使其移栽成活率达到95％以上。最终达到种子萌发率高、成苗快、种苗品质好的优点。

Description

一种扇脉杓兰的离体快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种扇脉杓兰的离体快速繁殖方法。
背景技术
扇脉杓兰(Cypripedium japonicum)属兰科杓兰属多年生草本植物。中国是扇脉杓兰的分布中心，在陕西、甘肃、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、四川和贵州等地均有分布，其生于海拔1000-2000m的林下、林缘、溪谷旁、荫蔽山坡等湿润和腐殖质丰富的土壤上。花形独特、花色鲜艳，观赏价值较高，并有活血调经、祛风止疼等药用功效。目前，对扇脉杓兰的研究主要集中于遗传多样性、花、果汁、胚胎繁育研究、传粉、物种多样性的研究等方面。人类活动影响多种生物的生存环境，甚至使其濒临灭绝。近年来，由于人们大量采挖，以及生境的破坏导致野生兰资源急剧减少。前期研究发现，目前贵州杓兰属植物主要分布于大娄山和乌蒙山山脉，仅在贵州大沙河省级自然保护区(位于道真县境内)发现较为完整的扇脉杓兰居群，其余地方均呈零星分布态势，因此迫切需要对扇脉杓兰进行人工繁育。
目前，扇脉杓兰种苗主要通过分株方式繁殖，但存在繁殖效率低，成本高，周期长的问题，无法满足扇脉杓兰规模化商业种植种苗的需求。另外，扇脉杓兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的问题，本发明第目的是提供一种扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，建立扇脉杓兰离体快速繁殖技术体系
为实现本发明目的，通过以下技术方案予以实现：
一种扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体采集：采集扇脉杓兰成熟而未开裂的蒴果作为外植体；
(2)无菌萌发：对成熟而未裂开的蒴果消毒后切开取粉末状胚进行无菌萌发获得圆球茎；
(3)原球茎增殖：对圆球茎进行增殖培养，得类原球茎；
(4)分化培养：对类原球茎分化培养，得小苗；
(5)壮苗生根培养：对小苗进行生根培养，得试管苗；
(6)移栽：将试管苗进行移植，得种苗。
优选地，所述步骤(2)中：使用酒精消毒后冲洗，然后再使用升汞溶液消毒并冲洗；然后切开成熟而未开裂取内部的粉末状胚，粉末状胚在到无菌萌发培养基上培养萌发。
进一步优选地，所述步骤(2)中：将成熟而未开裂的蒴果浸泡在消毒酒精中至少1min并使用无菌水冲洗至少三次；再浸泡在0.1％升汞溶液中并使用无菌水冲洗至少五次；粉末状胚在无菌萌发培养基上培养至少90天；
所述无菌萌发培养基的条件为：
1.5-2.5g/L花宝二号，0.2-0.1mg/LTDZ，20-30g/L蔗糖，3.0-4.5g/L琼脂，100-500ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8。
优选地，所述步骤(3)中，将圆球茎接种到原球茎增殖培养基中至少培养40天；且在至少100r/min的转速下振荡培养；
所述原球茎增殖培养基的条件为：
LS培养基，0.1-0.5mg/L6-BA，0.1-0.3mg/LZT，15-30g/L蔗糖，50-100ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8。
优选地，所述步骤(4)中，将类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养至少60天；
所述原球茎分化培养基的条件为：
LS培养基，0.5-1.0mg/LNAA，15-30g/L蔗糖，3.0-5.0g/L琼脂，50-100ml/L椰子汁，0.3-0.5g/L活性炭，pH为5.4-5.8。
优选地，所述步骤(5)中，将小苗接种到壮苗生根培养基中培养至少30天；
所述原球茎分化培养基的条件为：
LS培养基，0.1-1.0mg/LNAA，15-30g/L蔗糖，3.5-5.0g/L琼脂，150g-200/L香蕉汁，0.3-0.5g/L活性炭，pH为5.4-5.8。
优选地，所述步骤(6)中：将试管苗转移至大棚内炼苗，然后撤去大棚盖炼苗；然后将试管苗取出，其根部浸泡杀菌剂并晾干；在基质栽培成苗得种苗。
进一步优选地，试管苗在大棚内炼苗至少15天，撤去大棚盖后炼苗至少3天；其试管苗根部在多菌灵中至少浸泡15min；所述基质中包含树皮和椰糠。
进一步优选地，所述基质中包含树皮和椰糠；树皮和椰糠的体积比为2：1。
更进一步优选地，在步骤(2)至步骤(5)中，培养条件为：温度25-28℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为12-16小时/天。
外植体需要扇脉杓兰成熟而未开裂的蒴果，蒴果成熟度太低或已经成熟开裂则其粉末状胚发育成原球茎的几率很低。
本发明通过对无菌萌发所采用的培养基的组分选择，达到95％以上的萌发率；然后进一步筛选分化所用培养基，使分化率达到90％以上；本发明通过对小苗培养所用的培养基的优选以及对移栽的混合基质的控制，使其移栽成活率达到95％以上。最终达到种子萌发率高、成苗快、种苗品质好的优点。
具体实施方式
下面具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明野外的扇脉杓兰均采自贵州。花宝二号为复合肥，TDZ是N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲，6-BA是指6-苄氨基嘌呤，ZT是指玉米素，NAA是指萘乙酸，LS培养基是指Linsmaier&Skoog植物组织培养基。
实施例一
(1)外植体采集：从野外采集扇脉杓兰成熟而未裂开的蒴果为外植体。
(2)无菌萌发：将步骤(1)所述的果实于75％酒精中1min，然后用无菌水冲洗3-5次后，再用0.1％升汞溶液消毒20min后，用无菌水冲洗5-6次，切开果实将其粉末状胚接种到无菌萌发培养基上培养90天即可得到原球茎，所述的无菌萌发培养基为：1.5g/L花宝二号+0.2mg/LTDZ+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8；萌发率达到95％。
(3)原球茎增殖：将步骤(2)所得的原球茎接种到原球茎增殖培养基中培养40天即可增殖得到大量的原球茎，增殖系数达到3.5倍，所述的原球茎增殖培养基为：LS培养基+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LZT+15g/L蔗糖+50ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8。在100r/min的转速下振荡培养。
(4)分化培养：将步骤(3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养60天即能分化出小苗，分化率达到90％以上。所述的原球茎分化培养基为：LS培养基+0.5mg/LNAA+15g/L蔗糖+3.0g/L琼脂+50ml/L椰子汁+0.3g/L活性炭，pH为5.4-5.8。
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗生根培养基中培养30天即能得到株高3-5cm的试管苗，所述的壮苗培养基为：LS培养基+0.1mg/LNAA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+150g/L香蕉汁+0.3g/L活性炭，pH为5.4-5.8。
(6)移栽：将步骤(5)所得株高为7-10cm的试管苗转移至大棚的自然光下炼苗15d后，再开盖炼苗3d；将组培苗取出洗净培养基，用多菌灵浸泡15min后晾干根部，在体积比为2:1的树皮、椰糠的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽1个月后的成活率达95％以上。
上述步骤(2)-(5)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12小时/天。
实施例二
(1)外植体采集：从野外采集扇脉杓兰发育至成熟而未开裂的果实为外植体。
(2)无菌萌发：将步骤(1)所述的果实于75％酒精中1min，然后用无菌水冲洗3-5次后，再用0.1％升汞溶液消毒20min后，用无菌水冲洗5-6次，切开果实将其粉末状胚接种到无菌萌发培养基上培养80天即可得到原球茎，所述的无菌萌发培养基为：2.0g/L花宝二号+0.5mg/LTDZ+25g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+150ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8；萌发率达到96％。
(3)原球茎增殖：将步骤(2)所得的原球茎接种到原球茎增殖培养基中培养35天即可增殖得到大量的类原球茎，增殖系数达到4.3倍，所述的原球茎增殖培养基为：LS培养基+0.3mg/L6-BA+0.2mg/LZT+25g/L蔗糖+80ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8。在100r/min的转速下振荡培养。
(4)分化培养：将步骤(3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养50天即能分化出小苗，分化率达到93％以上，所述的原球茎分化培养基为：LS培养基+0.8mg/LNAA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+80ml/L椰子汁+0.4g/L活性炭，pH为5.4-5.8。
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗生根培养基中培养26天即能得到株高3-5cm的扇脉杓兰试管苗，所述的壮苗生根培养基为：LS培养基+0.5mg/LNAA+25g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+180g/L香蕉汁+0.4g/L活性炭，pH为5.4-5.8
(6)移栽：将步骤(5)所得株高为7-10cm的试管苗转移至大棚的自然光下炼苗15d后，再开盖炼苗3d；将组培苗取出洗净培养基，用多菌灵浸泡15min后晾干根部，在体积比为2:1的树皮、椰糠的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽1个月后的成活率达96％以上。
上述步骤(2)-(5)的培养条件为：培养温度为26℃，光照强度为1800lx，光照时间为14小时/天。
实施例三
(1)外植体采集：从野外采集扇脉杓兰发育至成熟而未开裂的果实为外植体。
(2)无菌萌发：将步骤(1)所述的果实于75％酒精中1min，然后用无菌水冲洗3-5次后，再用0.1％升汞溶液消毒20min后，用无菌水冲洗5-6次，切开果实将其粉末状胚接种到无菌萌发培养基上培养70天即可得到原球茎，所述的无菌萌发培养基为：2.5g/L花宝二号+1.0mg/LTDZ+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂+200ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8；萌发率达到98％。
(3)原球茎增殖：将步骤(2)所得的原球茎接种到原球茎增殖培养基中培养25天即可增殖得到大量的原球茎，增殖系数为5.0倍，所述的原球茎增殖培养基为：LS培养基+0.5mg/L6-BA+0.3mg/LZT+30g/L蔗糖+100ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8。在100r/min的转速下振荡培养。
(4)分化培养：将步骤(3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养40天即能分化出小苗，分化率达到95％。所述的原球茎分化培养基为：LS培养基+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂+100ml/L椰子汁+0.5g/L活性炭，pH为5.4-5.8。
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗生根培养基中培养20天即能得到株高3-5cm的扇脉杓兰试管苗，所述的壮苗培养基为：LS培养基+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+5.0g/L琼脂+200g/L香蕉汁+0.5g/L活性炭，pH为5.4-5.8。
(6)移栽：将步骤(5)所得株高为7-10cm的试管苗转移至大棚的自然光下炼苗15d后，再开盖炼苗3d；将组培苗取出洗净培养基，用多菌灵浸泡15min后晾干根部，在体积比为2:1的树皮、椰糠的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽1个月后的成活率达98％以上。
上述步骤(2)-(5)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天。
本发明的上述实施例并不是对本发明保护范围的限定，本发明的实施方式不限于此，凡此种种根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，对本发明上述结构做出的其它多种形式的修改、替换或变更，均应落在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)外植体采集：采集扇脉杓兰成熟而未开裂的蒴果作为外植体；
(2)无菌萌发：对成熟蒴果消毒后切开取粉末状胚进行无菌萌发获得圆球茎；
(3)原球茎增殖：对圆球茎进行增殖培养，得类原球茎；
(4)分化培养：对类原球茎分化培养，得小苗；
(5)壮苗生根培养：对小苗进行生根培养，得试管苗；
(6)移栽：将试管苗进行移植，得种苗。
2.根据权利要求1所述的扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(2)中：使用酒精消毒后冲洗，然后再使用升汞溶液消毒并冲洗；然后切开成熟而未裂开的蒴果取内部的粉末状胚，粉末状胚在到无菌萌发培养基上培养萌发。
3.根据权利要求2所述的扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(2)中：将成熟而未裂开的蒴果浸泡在消毒酒精中至少1min并使用无菌水冲洗至少三次；再浸泡在0.1％升汞溶液中并使用无菌水冲洗至少五次；粉末状胚在无菌萌发培养基上培养至少90天；
所述无菌萌发培养基的条件为：
1.5-2.5g/L花宝二号，0.2-0.1mg/LTDZ，20-30g/L蔗糖，3.0-4.5g/L琼脂，100-500ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8。
4.根据权利要求1所述的扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将圆球茎接种到原球茎增殖培养基中至少培养40天；且在至少100r/min的转速下振荡培养；
所述原球茎增殖培养基的条件为：
LS培养基，0.1-0.5mg/L6-BA，0.1-0.3mg/LZT，15-30g/L蔗糖，50-100ml/L椰子汁，pH为5.4-5.8。
5.根据权利要求1所述的扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(4)中，将类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养至少60天；
所述原球茎分化培养基的条件为：
LS培养基，0.5-1.0mg/LNAA，15-30g/L蔗糖，3.0-5.0g/L琼脂，50-100ml/L椰子汁，0.3-0.5g/L活性炭，pH为5.4-5.8。
6.根据权利要求1所述的扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(5)中，将小苗接种到壮苗生根培养基中培养至少30天；
所述原球茎分化培养基的条件为：
LS培养基，0.1-1.0mg/LNAA，15-30g/L蔗糖，3.5-5.0g/L琼脂，150g-200/L香蕉汁，0.3-0.5g/L活性炭，pH为5.4-5.8。
7.根据权利要求1所述的扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(6)中：将试管苗转移至大棚内炼苗，然后撤去大棚盖炼苗；然后将试管苗取出，其根部浸泡杀菌剂并晾干；在基质栽培成苗得种苗。
8.根据权利要求7所述的扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于：试管苗在大棚内炼苗至少15天，撤去大棚盖后炼苗至少3天；其试管苗根部在多菌灵中至少浸泡15min；所述基质中包含树皮和椰糠。
9.根据权利要求7所述的扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于：所述基质中包含树皮和椰糠；树皮和椰糠的体积比为2：1。
10.根据权利要求1-9任一所述的扇脉杓兰的离体快速繁殖方法，其特征在于：在步骤(2)至步骤(5)中，培养条件为：温度25-28℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为12-16小时/天。
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