CN115104536B - 一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于种子萌发技术领域，具体公开一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法，包括以下步骤：果荚及种子采收；无菌处理；萌发培养：接种至萌发基础培养基中，所述萌发培养基为改良Norstog培养基，所述改良Norstog培养基是在原Norstog1993培养基的基础上，大量元素：KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O浓度减半，其他元素改用1mg/L苹果酸、20g/L蔗糖和7g/L琼脂构成；继代培养；种苗移植及栽培；通过使用本发明的培养基配方、萌发及繁育栽培方法，暖地杓兰种子能萌发、原球茎未褐化，出瓶苗能顺利长大，最终能回归到原生境中，实现种群复壮，缓解濒危状况。
Description
技术领域
本发明属于种子萌发技术领域，具体公开一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法。
背景技术
暖地杓兰(Cypripedium subtropicum S.C.Chen&K.Y.Lang)是《野生动植物濒危物种国际贸易公约》附录I物种，被世界自然保护联盟(物种红色名录)列为极危(CR)物种，被《国家重点保护野生植物名录(2021版)》列为一级保护植物，在《全国极小种群野生植物拯救保护工程规划(2011-2015年)》中，暖地杓兰作为120种极小种群植物之一优先纳入了规划进行实施保护，被《云南省生物物种红色名录(2017版)》列为极危物种，被《中国生物多样性红色名录-高等植物版(2018版)》列为易危(VU)物种。
暖地杓兰是杓兰属在亚洲唯一的亚热带种，国内目前有少量兰分布，活植株仅存不足300株。暖地杓兰为仅有的常绿叶多花杓兰，唇瓣独特，花色艳丽，具有非常高的观赏价值，遭受过度的商业化采集，濒临灭绝。加之原生境遭破坏和种群退化等原因，野外活体数量逐年锐减，对暖地杓兰的保育工作迫在眉睫。人工繁育、引种回归、种群复壮、重建是兰科植物保育的有效措施。
杓兰的繁殖主要以种子无菌(非共生)萌发为主，繁殖的关键在于种子的质量及成熟度。暖地杓兰的传粉机制为非回报欺骗性传粉，传粉昆虫为食蚜蝇，因原生环境因素传粉昆虫较少，自然结实率非常低，野外获取种子比较困难。暖地杓兰种子像兜兰一样，细小如尘，无胚乳，无法提供种子萌发所必需的养分。同时暖地杓兰种子内层种皮被压缩成一层薄薄的层，紧紧地包裹着胚胎，而外层种皮逐渐拉长，成熟种子看起来像头发一样。木质化的内层和外层种皮导致种子休眠，种子萌发极其困难。杓兰繁殖普遍存在萌发率低、继代褐化及死苗、无菌苗出瓶成活率低、环境适应性差、幼苗生长缓慢等问题，暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法能有效解决这些问题，获得的大量种苗为暖地杓兰的回归、种群复壮保育及产业化开发奠定基础。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法，获得的大量种苗为暖地杓兰的回归、种群复壮保育及产业化开发奠定基础。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案:
一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法，包括以下步骤：
(1)果荚及种子采收：采收果荚及种子的时间为暖地杓兰人工异花授粉后90～120天之间。
(2)无菌处理；
(3)萌发培养：接种至萌发培养基中，所述萌发培养基为改良Norstog培养基，所述改良Norstog培养基是在原Norstog1993培养基的基础上，大量元素：KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O浓度减半，其他元素改用1mg/L苹果酸、20g/L蔗糖和7g/L琼脂构成；
(4)继代培养；
(5)种苗移植及栽培。
优选的，所述步骤(1)中，采收果荚及种子的时间为暖地杓兰人工异花授粉后的第105天。
优选的，所述步骤(2)中，无菌处理方法为：将采收的果荚进行清洗，在无菌环境下用大量无菌水冲洗，果荚表面用75％无水乙醇擦拭，后用10％的次氯酸钠溶液加一滴Tween20混合溶液消毒10分钟，再用1％升汞消毒5分钟，表面灭菌后，将果荚切开，在无菌培养皿中用镊子取出种子。
优选的，所述步骤(3)中，萌发培养使用的培养基中，还添加有2iP或KT。种子萌发后，其中一些原球茎变成褐色并最终死亡，尤其是在没有细胞分裂素的培养基上，形成种子虽然萌发，但是后期成活率不高的情况。本发明培养后发现，原球茎在含有2iP的培养基上不仅萌发率相对其他细胞分裂素KT或6-BA有显著的提高，且180天后都继续存活，未出现褐色死亡情况。
优选的，所述步骤(3)中，萌发培养使用的培养基中，2iP的添加的浓度为1～8μmol/L，KT的添加的浓度为1～2μmol/L。
优选的，所述步骤(4)中，继代培养所用的培养基为：改良Norstog培养基的基础上，再添加20g/L马铃薯匀浆构成。。
优选的，萌发培养和继代培养用培养基pH值调节至5.7，然后经过高温灭菌后获得。
进一步的，所述步骤(5)中，种苗移植及栽培包括以下步骤：
S1：炼苗处理；
S2：春化处理：炼苗后洗净根部培养基，将幼苗放在自封袋中放入4℃冰箱进行春化，春化4-6个月；
S3：移栽至栽培基质进行栽培。
优选的，所述步骤S3中，栽培基质为1:1泥炭土和兰石混合基质。
优选的，所述栽培基质浇2000倍的高锰酸钾溶液进行杀菌。
本发明达到的技术效果有：
1、采用本发明的萌发培养基，成功的获得萌发的暖地杓兰种子，其中人工授粉后90～120天之间采摘的果荚种子平均萌发率最高达到了31.21％，添加生长激素后，萌发率最高达到38.74％。
2、采用本发明的继代培养基，成功的使萌发的暖地杓兰原球茎长出了根系和芽点，可继续后续的移栽处理。
3、采用本发明的栽培基质，栽培生根后的暖地杓兰，移栽180天后暖地杓兰小苗成活率在90％以上。
4、在本发明的培养基配方、萌发及繁育栽培方法下，暖地杓兰种子能萌发、原球茎未褐化，出瓶苗能顺利长大，最终能回归到原生境中，实现种群复壮，缓解濒危状况。
附图说明
图1：暖地杓兰果荚示意图；
图2：暖地杓兰种子在萌发培养基萌发120天后的效果示意图；
图3：暖地杓兰种子在萌发培养基萌发180天后的效果示意图；
图4：暖地杓兰种子在继代培养基中培养90天后的效果示意图；
图5：暖地杓兰种子在继代培养基中培养120天后的效果示意图；
图6：暖地杓兰种子在继代培养基中培养180天后的效果示意图；
图7：暖地杓兰种子春化处理示意图；
图8：暖地杓兰幼苗采用本发明移栽基质栽培120天后的效果示意图；
图9：暖地杓兰幼苗采用本发明移栽基质栽培210天后的效果示意图；
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的说明，本发明中所述的Norstog1993培养基的配方参考文献：De Pauw MA,Remphrey WR(1993)In vitrogermination of three Cypripedium species in relation to time of seedcollection,media,and cold treatment.Can J Bot 71:879-885；记载的配方。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
具体的本发明改良Norstog培养基的配方如下表1所示：
表1 改良Norstog培养基
| 大量元素成分 | 质量浓度(g/L) |
| KH2PO4 | 0.455 |
| KCl | 0.375 |
| MgSO4·7H2O | 0.37 |
| CaCl2·2H2O | 0.37 |
| 微量元素 | 质量浓度(mg/L) |
| MnSO4·H2O | 3.0 |
| H3BO3 | 0.5 |
| ZnSO4·7H2O | 0.5 |
| CoCl2·6H2O | 0.025 |
| CuSO4·5H2O | 0.025 |
| NaMoO4 | 0.025 |
| 柠檬酸铁 | 10.0 |
| 维生素 | 质量浓度(mg/L) |
| 肌醇 | 50.0 |
| 维生素B1 | 0.25 |
| 维生素B5 | 0.25 |
| 维生素B6 | 0.25 |
| 氨基酸 | 质量浓度(g/L) |
| L-谷氨酰胺 | 0.4 |
| L-丙氨酸 | 0.05 |
| L-半胱氨酸 | 0.02 |
| 精胺酸 | 0.01 |
| L-亮氨酸 | 0.01 |
| L-苯丙氨酸 | 0.01 |
| L-酪氨酸 | 0.01 |
| 其他元素 | 质量浓度 |
| 苹果酸 | 1.0mg/L |
| 琼脂 | 7.0g/L |
| 蔗糖 | 20g/L |
实施例1
1.暖地杓兰人工授粉
选取云南马关野生居群暖地杓兰开花植株(七月初盛开)进行套袋并人工异花授粉，记录授粉时间。
2.暖地杓兰果荚及种子采收
暖地杓兰采集时间为90DAP～120DAP之间，最佳的采集时间为105DAP。
3.暖地杓兰果荚无菌处理
选取105DAP采集的果荚，将采收的果荚进行清洗，在无菌环境下用大量无菌水冲洗，果荚表面用75％无水乙醇擦拭，后用10％的次氯酸钠溶液(内加一滴Tween 20)消毒10分钟，再用1％升汞消毒5分钟。表面灭菌后，将果荚切开，在无菌培养皿中用镊子取出种子。
4.暖地杓兰种子繁育及培养基配方
(1)种子无菌萌发培养
经过大量的实验筛选，包括尝试过的培养基有MS、1/2MS、1/4MS、B5、VM、花宝1号，改良Norstog培养基(表1)，实验结果为：除了在改良Norstog培养基中种子有萌发外，其余培养基在培养180-210天后，种子均没有萌发，最终确定暖地杓兰种子无菌萌发培养基为改良Norstog培养基(表1)。
配制改良Norstog培养基，配方如表1所示，并在表1的基础上，添加8μmol/L 2iP(6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤)，用5mol/L NaOH来调节培养基的pH至5.7，在121℃高压灭菌20分钟后获得无菌培养基。将暖地杓兰种子均匀的播撒到培养基表面，每瓶约100粒种子，将培养瓶在25±1℃和恒定黑暗的生长室中进行培养，种子膨胀胚突破种皮确认为种子萌发，萌发率的计算方法是将萌发的种子数除以种子总数并乘以100。通过四个多月的培养，在该萌发培养基中和培养方法下，暖地杓兰种子能萌发、原球茎未褐化，平均萌发率达38.74％，具体生长情况如图2、3所示。其中图2为播种120天后种子开始萌发的效果示意图，图3为暖地杓兰种子在萌发培养基萌发180天后的效果示意图，原球茎开始分化根和芽。
(2)继代培养
暖地杓兰播种在萌发培养基中4个月后，种子开始萌发，第六个月开始将发育中的幼苗转移到继代培养基中，培养3个月后，幼苗体积增大，根系形成明显。之后再培养3个月，再进行二次继代培养，当根长到10cm左右，长出芽点时，即可出瓶移栽。继代培养过程中，暖地杓兰幼苗能长根并长出芽点，具体如图4、5、6所示，其中，图4为暖地杓兰种子在继代培养基中培养90天后的效果示意图；图5为暖地杓兰种子在继代培养基中培养120天后的效果示意图；图6为暖地杓兰种子在继代培养基中培养180天后的效果示意图。从图中可以看出，随着继代培养时间的增加，暖地杓兰幼苗体积增大，根长长、长粗，长出芽点，继代培养180天后根长到10cm左右，有2-3条根。
继代培养基为：改良Norstog基础培养基(表1)中，添加20g/L马铃薯匀浆；将培养基的pH值调节至5.7，在121℃高压灭菌20分钟。
5、暖地杓兰种苗移植及栽培
(1)暖地杓兰种苗移植前处理
将可以出瓶的暖地杓兰无菌苗进行炼苗处理(将待出瓶无菌苗组培瓶放置于大棚中的阴凉位置处一周；后将瓶盖拧松，再放置一周；再将瓶盖拧开一半，再放置一周；最后将瓶盖全部拿开，放置一周；炼苗将大棚温度控制在15-25℃，相对湿度70％-80％，光照强度为800-1000lx)，然后洗净根部培养基，将幼苗放在自封袋中(保湿)放入4℃冰箱进行春化，具体春化包装如图7所示，春化4-6个月，春化期间注意观察湿度及芽的情况，春天转暖时即可移栽。
2.暖地杓兰种苗移植及栽培
采用1:1泥炭土和兰石混合基质，基质用2000倍的高锰酸钾溶液进行杀菌，将经过春化的暖地杓兰小苗用2000倍的农用硫酸链霉素浸泡30min，然后晾干，进行栽培。将经过杀菌处理的暖地杓兰种苗种植于装有混合基质的陶盆中，每盆种10棵，将根埋住，芽点裸露在外面。栽培条件为：棚内温度控制在15-25℃，相对湿度70％-80％，光照强度为800-1000lx。经过2-3个月，芽伸长，叶子开始膨胀生长。施肥：每盆施撒15g缓释肥，每年春季、秋季各施撒一次。浇水：基质发白喷洒水，浇湿即可。病虫害：暖地杓兰幼苗常见的病害有蜗牛和地老虎，用四聚乙醛和氯氰菊酯进行杀虫。
暖地杓兰移栽后的效果如图8、9所示，其中图8为暖地杓兰幼苗移栽栽培120天后，芽点进一步长大，并舒展长出叶子。图9为暖地杓兰幼苗移栽栽培210天后的效果示意图。移栽后180天后暖地杓兰小苗成活率在90％以上，效果显著。
对比实验验证
1、暖地杓兰种子采收时间对萌发率的影响
授粉后60至150天(DAP：days after pollination，授粉后天数)，每15天收集1个蒴果用于评估果荚成熟度对种子萌发的影响，确定最佳的采收时间。
将暖地杓兰种子均匀的播撒到萌发培养基(改良Norstog培养基)表面，每瓶约100粒种子。将培养瓶在25±1℃和恒定黑暗的生长室中进行培养，种子膨胀胚突破种皮确认为种子萌发，萌发率的计算方法是将萌发的种子数除以种子总数并乘以100。
结果如表2所示，暖地杓兰种子采集的时间(不同成熟度)明显影响种子萌发率。在105DAP收集的种子的萌发率最高，为31.21％。在60和75DAP收集的种子很少发芽，萌发率仅为0.18-3.8％。在90DAP(萌发率12.84％)和105DAP收集的种子的萌发率逐渐增加，但随后在120DAP收集的种子萌发率降低(萌发率10.86％)。在135DAP或之后收集的种子的萌发效果很差(萌发率小于1％)。根据实验结果，暖地杓兰采集时间在90DAP～120DAP之间，最佳的采集时间为105DAP。
表2 暖地杓兰种子采收时间对萌发率的影响
2、细胞分裂素对暖地杓兰种子萌发的影响
细胞分裂素对种子萌发的影响因兰花种类而异，确定培养基中细胞分裂素的最佳浓度和组成，可提高种子萌发及原球茎存活率，具体实验选取105DAP采收的种子用于探究细胞分裂素对暖地杓兰种子萌发的影响。在种子无菌萌发培养基中分别添加6-(γ,γ-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)和激动素(KT)，细胞分裂素的浓度分别为为1、2、4和8μmol/L。未添加细胞分裂素的萌发培养基作为对照。
结果如表3所示：暖地杓兰无菌萌发添加不同类型的细胞分裂素会影响种子萌发率。与对照相比(105天萌发率31.45％)，2iP和6-BA均对种子萌发有影响，但较高浓度的6-BA(4和8μmol/L)抑制种子萌发。在低浓度下，KT的添加既不增加也不抑制种子萌发。种子萌发后，观察原球茎的生长情况，在萌发180天后统计原球茎成活率(成活率计算方式：180天原球茎成活率是种子萌发180天存活的原球茎的数量除以120天种子萌发获得的原球茎的数量并乘以100)，一些原球茎变成褐色并最终死亡，尤其是在没有细胞分裂素的培养基上,成活率仅为9.6％。如表4所示，原球茎在含有2iP的培养基上的存活率显著高于含有KT或6-BA的培养基。
表3 细胞分裂素对暖地杓兰种子萌发的影响
表4 细胞分裂素对暖地杓兰原球茎成活率的影响
3、不同栽培基质对暖地杓兰移栽成活率的影响
栽培基质分别选用山土、1:1山土和树皮、1:1泥炭土和兰石混合基质，基质用2000倍的高锰酸钾溶液进行杀菌，筛选最适宜暖地杓兰栽培的基质。
将经过春化的暖地杓兰小苗用2000倍的农用硫酸链霉素浸泡30min，然后晾干，进行栽培。将经过杀菌处理的暖地杓兰种苗种植于装有混合基质的陶盆中，每盆种10棵，将根埋住，芽点裸露在外面。栽培条件为：棚内温度控制在15-25℃，相对湿度70％-80％，光照强度为800-1000lx。经过2-3个月，芽伸长，叶子开始膨胀生长。
结果如表5所示，在三种基质中，暖地杓兰幼苗都能成活，最适宜暖地杓兰栽培的基质为1:1泥炭土和兰石混合基质，在该基质中移栽180天后暖地杓兰小苗成活率在90％以上。
表5 不同栽培基质对暖地杓兰移栽成活率的影响
Claims (7)
1.一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)果荚及种子采收：采收果荚及种子的时间为暖地杓兰人工异花授粉后90～120天之间。
(2)无菌处理；
(3)萌发培养：接种至萌发培养基中，所述萌发培养基为改良Norstog培养基，
(4)继代培养；
(5)种苗移植及栽培；
所述改良Norstog培养基成分构成如下：
所述步骤(3)中，萌发培养使用的培养基中，还添加有2iP或KT,2iP的添加的浓度为1～8μmol/L，KT的添加的浓度为1～2μmol/L；
所述步骤(4)中，继代培养所用的培养基为：改良Norstog培养基的基础上，再添加20g/L马铃薯匀浆构成。
2.根据权利要求1所述的一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采收果荚及种子的时间为暖地杓兰人工异花授粉后的第105天。
3.根据权利要求1所述的一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法，其特征在于，所述步骤(2)中，无菌处理方法为：将采收的果荚进行清洗，在无菌环境下用大量无菌水冲洗，果荚表面用75％无水乙醇擦拭，后用10％的次氯酸钠溶液加一滴Tween 20混合溶液消毒10分钟，再用1％升汞消毒5分钟，表面灭菌后，将果荚切开，在无菌培养皿中用镊子取出种子。
4.根据权利要求1所述的一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法，其特征在于，萌发培养和继代培养用培养基pH值调节至5.7，然后经过高温灭菌后获得。
5.根据权利要求1所述的一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法，其特征在于，所述步骤(5)中，种苗移植及栽培包括以下步骤：
S1：炼苗处理；
S2：春化处理：炼苗后洗净根部培养基，将幼苗放在自封袋中放入4℃冰箱进行春化，春化4-6个月；
S3：移栽至栽培基质进行栽培。
6.根据权利要求5所述的一种暖地杓兰种子萌发及繁育栽培方法，其特征在于，所述步骤S3中，栽培基质为1:1泥炭土和兰石混合基质。
7.根据权利要求6所述的一种暖地杓兰组培快繁方法，其特征在于，所述栽培基质浇2000倍的高锰酸钾溶液进行杀菌。
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