CN103651078B - 一种筛选转基因植物种子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种筛选转基因种子的方法，该方法包括：（1）、对需要筛选的种子进行消毒处理；（2）、提供无菌培养皿，在无菌培养皿中放置一张或多张无菌滤纸，使抗生素溶液湿润每一张滤纸；（3）将经过步骤1消毒的种子播种在步骤2的培养皿中的滤纸表面上；其中，所述的种子为T0代烟草或拟南芥转基因种子。通过该方法，可以提高后期苗的成活率，大大降低筛选成本和提交生产效率,特别的,在配置抗生素的时候,采用未灭菌的蒸馏水替代灭菌的水作为溶剂。
Description
技术领域
本发明属于转基因技术，特别的，属于一种植物转基因种子筛选技术。
背景技术
随着基因工程技术的快速发展，植物转基因技术被广泛应用于现代生物技术研究及农业生产中。如何快速、便捷、高通量的筛选与种植转基因植物是其中的一个重要环节。
传统的方法是将T0代种子播种于含相应抗生素的培养基中，生长一定时间后出现表型分离，一般，带有目标基因的阳性植株呈正常绿色，阴性植株则出现黄化。继续生长至适宜苗龄时，从瓶中移出阳性植株栽种。该法虽被广泛使用，但存在如下缺点：首先，要制备大量的培养基，这些培养基需要经过湿热灭菌后，再加抗生素，最后倒制平板，然后再把种子播种在还有抗生素的培养基上，同时，种子也必须经过严格的消毒。这样做不仅增加了试剂成本，且对无菌操作技术也提出了较高要求，整个过程都需要在无菌换进下进行操作，而且筛选的时间长。整个过程繁琐，耗时长；其次，将组培苗移至营养土中时，由于根系扎入培养基，在去除残留培养基时易损伤根系，及其显著降低组培苗成活率；第三，在培养基中生长的小苗如果移栽太早，苗小，长势弱，成活率非常低，需苗在组培瓶中生长至较大时再进行移栽，这样做虽增加了移栽的成活率，却延误了时间；第四，种子消毒必须彻底，与清水相比，在培养基的长时间培养更易导致污染。有鉴于此，需要开发快速、高效与简洁的播种及筛选转基因种子技术。
发明内容
为了克服传统方法的缺陷，本发明提供一种新型的转基因种子播种及筛选技术，它有效地解决了传统方法存在的上述弊端。
一方面，该本发明提供一种转基因植物种子的筛选方法，该方法包括：对需要筛选的种子进行消毒处理；2、提供无菌培养皿，在无菌培养皿中放置一张或多张无菌滤纸，使抗生素溶液湿润每一张滤纸；3、将经过步骤1消毒的种子播种在步骤2的培养皿中的滤纸表面上；其中，所述的种子为T0代烟草或拟南芥转基因种子。
在一些优选的方式中，当种子为T0代烟草种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗潮霉素的基因，湿润所述滤纸的抗生素为40 mg/L的潮霉素溶液，让每克滤纸吸收7毫升的潮霉素溶液。
在一些优选的方式中，，当种子为T0代拟南芥种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗卡纳霉素的基因，湿润所述滤纸的抗生素为100 mg/L的卡纳霉素溶液，让每克滤纸吸收14毫升的卡纳霉素溶液。
在一些优选的方式中，消毒处理的步骤如下：先将适量待播的转基因种子倒入1.5 mL无菌离心管中，加入75%乙醇处理30 s;弃去75%乙醇，加入20%次氯酸钠处理20 s；弃去20%次氯酸钠，用无菌蒸馏水洗涤种子3-4次。
在另一些优选的方式中，先对种子进行黑暗培养，待种子萌发至刚露出胚根，且胚根的长度为1-3毫米时，进行光照培养，光照培养的条件为：温度24 ± 1℃、光照强度2000 Lux，光周期为16 h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，将叶片呈绿色的幼苗播于营养土中。优选的，培根的长度小于2毫米的时候进行光照培养。优选的，用封口膜密封无菌培养皿，并让密封的培养皿处于黑暗环境，温度24 ±1℃，湿度为60%-75%下暗培养2-3天进行发芽。
在一些优选的方式中，种子是转基因烟草T0代种子。这里所所的T0代种子是目标基因被插入到组织或细胞基因组中获得的当代种子，例如，当通过组织培养的方法，对某个植物的愈伤组织进行农杆菌介导法把某个目的外源基因插入到该植物的组织细胞中的基因序列中的某一个位置，然后通过培养获得小苗，该小苗上的种子为T0代。在T0的种子中，有些可能还有目的基因，有的可能不含有目的基因。另外，在进行目的基因转化中，可以把一些抗抗生素的基因与目的基因连接，如果转化的种子中含有抗生素基因，就表示目的基因也被包含在该转基因植物的种子中，当然，单独的抗潮霉素或卡纳霉素的基因也可以被转入到植物中。常用的抗生素为抗潮霉素或卡纳霉素的基因，这些基因的序列为现有公知的技术，转基因植物的获得方法也是本领域的公知技术。
在一些优选的方式中，消毒处理的步骤如下：先将适量待播的转基因种子倒入1.5 mL无菌离心管中，加入75%乙醇处理30 s;弃去75%乙醇，加入20%次氯酸钠处理20 s；弃去20%次氯酸钠，用无菌蒸馏水洗涤种子3-4次。
在一些优选的方式中，湿润滤纸的抗生素为40 mg/L，让每克滤纸吸收大约7毫升的抗生素溶液，也可以是让每克滤纸吸收大约6-9毫升的抗生素溶液。处理滤纸的抗生素溶液的量特别关键，我们发现，如果是烟草种子，且抗生素的浓度为40 mg/L的情况下，每克滤纸处理抗生素的量处于7毫升左右时筛选效果最好，有85-98%的正确率。相反，不在此筛选浓度左右下，筛选效果差，几乎不能满足筛选目的。含量太低，假阳性的种子特别多，绝大多数种子均发芽并正常生长，也不能满足要求；含量太高，几乎所有的种子（90%-95%）都不能萌发或正常的后期生长。
在优选的方式中，抗生素为潮霉素或卡纳霉素。在一些优选的方式中，种子为烟草或拟南芥T0代转基因种子。当转基因种子为T0代拟南芥种子的时候，且种子中含有抗卡纳霉素的基因的时候，让每克滤纸吸收大约14毫升的100 mg/L含卡纳霉素的溶液。
在一些优选的方式中，用封口膜密封无菌培养皿，并让密封的培养皿处于黑暗环境，温度24 ±1℃，湿度为60%-75%下暗培养2-3天进行发芽。
在另一些优选的方式中，待种子萌发至刚露出胚根后，胚根的长度为1-3毫米下，进行光照培养，培养的条件为：温度24 ± 1℃、光照强度2000 Lux，光周期为16 h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，将叶片呈绿色的幼苗播于营养土中，盖保鲜膜以减少水分蒸发，继续光照培养，培养的条件为：培养温度24 ± 1℃、光照强度2000 Lux，光周期为16 h。
有益效果
本发明通过滤纸上还有抗生素来筛选转基因种子，相对与传统的培养基筛选，更快速、更高效与简洁，而且成本低。特别适用筛选T0代烟草和拟南芥转基因种子。
附图说明
图1为实施例子2的实验结果图。A：阳性对照（培养皿内滤纸用不含相应浓度抗生素的蒸馏水浸润，种子为野生型本氏烟）；B：阴性对照（培养皿内滤纸用含相应浓度抗生素的蒸馏水浸润，种子为野生型本氏烟）；C：T0代转基因种子。
图 2实施例子2的结果实验图。A：幼苗移栽时合适的根长（3毫米）；B：幼苗移栽时不适宜的根长（实际为23毫米）。
图3 为实施例子2中转基因苗生长的不同阶段的结果图。A：T0代转基因种子播种于含相应浓度抗生素蒸馏水的培养皿中；B：T0代转基因种子暗培养2-3 d后刚长出胚根；C：T0代转基因种子经光照培养后已长出两片绿色子叶，并产生3：1的分离比；D-E：移至营养土后的T0代转基因幼苗。
图4为转基因与非转基因拟南芥不同生长阶段实验结果图；萌发 A：6 d；B：移苗1D C：移苗5 D D：移苗15D。
具体实施方式
现以潮霉素抗性转基因烟草为例来说明本发明的一个具体方式，该方式并不是对本发明的限制。
实施1：滤纸中不同含量的抗生素溶液对T0代烟草种子萌发率和筛选效果的影响。
1． 实验材料
含无菌滤纸的无菌培养皿、1.0 mL无菌枪头（剪去枪头顶端）、1.5 mL无菌离心管、75%乙醇、20%次氯酸钠及无菌蒸馏水。
2． 种子的消毒与播种的步骤如下：
① 240颗待播的转基因烟草T0代种子倒入1.5 mL无菌离心管中，加入1 mL的75%乙醇处理30 s;
②弃去75%乙醇，加入1 mL的20%次氯酸钠处理20 s；
③弃去20%次氯酸钠，用无菌蒸馏水洗涤3-4次；
④弃去无菌蒸馏水；
⑤提供含无菌滤纸的无菌培养皿，提供用无菌蒸馏水作为溶剂配置的40 mg/L含潮霉素的溶液，用以上含潮霉素的溶液将培养皿内的无菌滤纸打湿，其中，让培养皿里的无菌纸含有不同含量的抗生素，具体如下（毫升/克滤纸）：0、2.2、4.4、7.0、14.0。在露出胚根的时候统计发芽率（培根的长度为2毫米）。待种子萌发至刚露出胚根（2毫米长）后，光照培养4 d后，统计绿叶和黄化页数目，并计算比率。培养的条件为：温度24 ± 1℃、光照强度2000 Lux，光周期为16 h）。
⑥用无菌1.0 mL枪头将种子均匀播种于上述培养皿中的无菌纸表面上；
⑦在培养皿上封上封口膜，让培养皿暗培养2-3 d，待种子萌发。
结果如下：
表1：滤纸上不同含量抗生素对烟草T0代转基因种子发芽和筛选结果影响
从表1中可以看出，如果抗生素含量很低，0-4.4毫升/克滤纸，几乎不能有效筛选目的基因种子，而当抗生素在滤纸上含量合适，7.0毫升每克滤纸，可以有效筛选含有目的基因的种子，他们的分离比大约为3：1。同样，当抗生素在滤纸中含量太高的时候，种子萌发后，部分小苗表现出短根症状，达不到筛选的目的，且不利于后期的苗的生长和后期成活率。
实施2 ：潮霉素抗性转基因烟草种子T0代的筛选
3． 实验材料
含无菌滤纸的无菌培养皿、1.0 mL无菌枪头（剪去枪头顶端）、1.5 mL无菌离心管、75%乙醇、20%次氯酸钠及无菌蒸馏水。
4． 种子的消毒与播种的步骤如下：
② 240颗待播的转基因T0种子倒入1.5 mL无菌离心管中，加入1 mL的75%乙醇处理30 s;
②弃去75%乙醇，加入1 mL的20%次氯酸钠处理20 s；
③弃去20%次氯酸钠，用无菌蒸馏水洗涤3-4次；
④弃去无菌蒸馏水；
⑤提供含无菌滤纸的无菌培养皿，及用无菌蒸馏水作为溶剂配置的40 mg/L含潮霉素的溶液，用5 mL的含潮霉素的溶液将培养皿内的无菌滤纸打湿，其中，每克无菌滤纸含7 mL潮霉素溶液；
⑥用无菌1.0 mL枪头将种子均匀播种于上述培养皿中的无菌纸表面上；
⑦在培养皿上封上封口膜，让培养皿暗培养2-3 d，待种子萌发。
5． 阳性植株的移栽
待种子萌发至刚露出胚根（2毫米）后，光照培养2-4 d，培养的条件为：温度24 ± 1℃、光照强度2000 Lux，光周期为16 h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，将叶片呈绿色的幼苗播于营养土中，盖上保鲜膜以减少水分蒸发，继续光照培养，培养条件为：温度24 ± 1℃、光照强度2000 Lux，光周期为16 h。
结果
由于T0代转基因烟草种子为杂合体种子，经抗生素筛选后将发生分离，一般来讲，对于单拷贝的转基因株系，其分离比例大约为3:1，有175颗烟草T0代种子出现绿叶，54颗种子出现黄化，另有11颗种子没有正常发芽。为了更准确知道烟草苗移栽的最佳时间，我们同时也设置野生型（不含抗潮霉素基因的对照烟草种子）本氏烟作为阴性对照以确定移苗时间，当野生型苗出现黄化时进行移苗。若移苗太早，无法判断转基因苗的后代的表型差异，易将假阳性植株移栽于营养土中。
表2：烟草转基因种子培根不同长度下进行光照培养对转基因植物后期成活率的影响
| 胚根长度 | 1毫米 | 2毫米 | 3毫米 | 3.5毫米 | 5毫米 | 7毫米 | 9毫米 |
| 后期苗的成活率 | 95% | 94.5% | 73% | 78% | 68% | 65% | 53% |
为保证转基因幼苗有较高的存活率，应注意以下几点：
第一，对种子暗培养的时间不宜过长，防止幼苗茎杆徒长，子叶黄化，如果是烟草种子，时间应该是2-3 d；优选的为3天。另外，待种子萌发至刚露出胚根时（长度为1-3毫米），马上进行光照培养,时间为2-4 d。经过我们的实验，发现当胚根的长度大于3.5毫米以上才进行光照培养，则后期的苗的成活率也很低，只有78%的成活率，如果培根的长度大于10好毫米，后期的成活率只有50%左右。
第二，转基因幼苗在培养皿中光照培养时间亦不宜过长，如果是烟草种子，时间应该是3-4天，其原因包括以下三点：首先，如果培养时间太长，容易导致幼苗根过度伸长，不利于栽培时成活；其次，如果培养时间太长，幼苗得不到足够的养分，出现营养不良导致黄化；最后，长时间的培养易使幼苗玻璃化，不适于健壮成长。
第三，由于该技术所要解决的是在可区分表型的前提下尽可能早的移苗，这样不仅节约时间，移栽效果也好。
第四，将幼苗移栽于营养土后，盖上保鲜膜（保鲜膜戳一些洞）以减少水分蒸发，待幼苗生长健壮后再移去保鲜膜。
通过实验发现，运用此方法将转基因幼苗移栽于营养土后的存活率可达到90%以上，而且有效解决了传统方法种子消毒必须彻底、工作量大等缺点，是一种适合于经多代筛选获得转基因纯合体或对杂合体幼苗进行后续处理的良好方法，具体花费的时间只有10-15天。同样，我们采用一般传统的培养基来进行T0代种子的筛选，转基因幼苗移栽于营养土后的存活率只有60%，花费的时间为大约50多天。
实施3：该方法在拟南芥转基因阳性植株后代筛选的应用。
由于基因组小，易于遗传转化等优点，拟南芥是最广泛被使用的研究基因功能的模式植物。除了用于研究自身基因功能外，还常用于研究其它物种中相关基因。为了验证此法是否也适用其它具有类似特点的种子抗生素筛选，我们尝试该筛选法是否也适用于拟南芥。
1.实验材料：转基因的T1代拟南芥（卡那霉素抗性）
2．种子的消毒与播种的步骤如下：
取240颗待播的转基因拟南芥种子放入1.5 mL无菌离心管中，加入1 mL75%乙醇处理30 s;弃75%乙醇，加入1 mL10%次氯酸钠和0.01% Triton X-100溶液处理10 m；弃去洗液，用无菌蒸馏水洗涤5-6次；加无菌水，放置4度冰箱3d；弃去无菌蒸馏水，提供含无菌滤纸的无菌培养皿，及用无菌蒸馏水作为溶剂配置的100 mg/L含卡纳霉素的溶液，用4 mL的含卡纳霉素的溶液将培养皿内的无菌滤纸打湿，其中，每克无菌滤纸含14 mL卡纳霉素溶液；
⑥用无菌1.0 mL枪头将种子均匀播种于上述培养皿中的无菌纸表面上；
⑦将培养皿封口，暗培养2-3 d，待种子萌发。
6． 阳性植株的移栽
待种子萌发至刚露出胚根（3毫米）后，光照培养2-4 d，培养条件为：温度22 ± 1℃、光照强度2000 Lux，光周期为16 h，直至转基因拟南芥幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，将叶片呈绿色的幼苗播于营养土中，盖保鲜膜保湿，继续光照培养，培养条件为：温度22 ± 1℃、光照强度2000 Lux，光周期为16 h。经过我们的实验，发现当胚根的长度大于3.5毫米以上才进行光照培养，则后期的苗的成活率也很低，只有76%的成活率。相对于传统培养基进行转基因植物的筛选，后期成活率只有50-60%左右，而且每一代消费的时间为60-80天。
表3：拟南转基因种子培根不同长度下进行光照培养对转基因植物后期成活率的影响
| 胚根长度 | 1毫米 | 2毫米 | 3毫米 | 3.5毫米 | 5毫米 | 7毫米 | 9毫米 |
| 后期苗的成活率 | 95% | 94.5% | 94% | 76% | 74% | 65% | 50% |
实施4：在自然操作条件下，可以完成转基因植株的鉴定
转基因后代（T0代后的种子）的筛选与鉴定是一个工作量很大的工作，除了对材料消毒花费大量时间外，工作人员需要在超净工作台上工作，不仅占用设备，还需有一定无菌操作技术的的人员。与正常的操作相比，无菌操作效率低，工作强度大。与培养基相比，水几乎不含有微生物生长所需的有机物，不易滋生微生物。
因此我们尝试用未灭菌的蒸馏水替代灭菌的水来配置抗生素溶液，在自然实验桌面代替无菌超净工作台。种子的消毒过程与实施1—3相同（该实施中的消毒步骤主要消除种子带毒，预防后期烟草苗发病；同时，消毒有助于打破种子休眠）。实验结果表明，转基因植株筛选工作可以在自然操作状态下完成，通过对15个批次的转基因（烟草和拟南芥T0代种子）后代的筛选来看，到出现分离表型时，均未出现污染，后期苗的成活率为90%以上，所花费的时间为10-20天。在滤纸上一部分呈绿色，一部分子叶黄色，生长矮小，这表明这个工作体系可以很好的进行转基因植株的鉴定。同时我们用该法对拟南芥也进行了鉴定，此法同样也适应于对拟南芥转基因植株进行鉴定。
Claims (2)
1.一种筛选转基因种子的方法，该方法由下列步骤组成：(1)、对需要筛选的种子进行消毒处理；(2)、提供无菌培养皿，在无菌培养皿中放置一张或多张无菌滤纸，使抗生素溶液湿润每一张滤纸；(3)将经过步骤1消毒的种子播种在步骤2的培养皿中的滤纸表面上；其中，所述的种子为T0代烟草，其中，当种子为T0代烟草种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗潮霉素的基因，湿润所述滤纸的抗生素为40mg/L的潮霉素溶液，让每克滤纸吸收7毫升的潮霉素溶液,其中,配置抗生素的溶剂为未灭菌的蒸馏水；所述的消毒处理的步骤如下：先将适量待播的转基因种子倒入1.5mL无菌离心管中，加入75％乙醇处理30s；弃去75％乙醇，加入20％次氯酸钠处理20s；弃去20％次氯酸钠，用无菌蒸馏水洗涤种子3-4次；在步骤3后，用封口膜密封无菌培养皿，并让密封的培养皿处于黑暗环境，温度24±1℃，湿度为60％-75％下暗培养2-3天进行发芽；对种子进行黑暗培养后，待种子萌发至刚露出胚根，且胚根的长度为1或2毫米时，进行光照培养，光照培养的条件为：温度24±1℃、光照强度2000Lux，光周期为16h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，将叶片呈绿色的幼苗播于营养土中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当种子为T0代拟南芥种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗卡纳霉素的基因，湿润所述滤纸的抗生素为100mg/L的卡纳霉素溶液，让每克滤纸吸收14毫升的卡纳霉素溶液，其中,配置抗生素的溶剂为未灭菌的蒸馏水。
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