CN106171971B - 一种丁香叶忍冬组培快繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丁香叶忍冬组培快繁的方法，属于组织培养领域，包括以下步骤：外植体的选择及处理、外植体的消毒、接种培养、生根培养。本发明培养方法速度快，再生频率较高，并且变异率较低，周期相对较短，能较好地保持丁香叶忍冬的遗传稳定性。培养的组培苗移栽成活率高，达到90％以上。
Description
技术领域
本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种丁香叶忍冬组培快繁的方法。
背景技术
丁香叶忍冬(学名：Lonicera oblata)是忍冬科忍冬属的植物，是中国的特有植物。分布在中国大陆的河北等地，生长于海拔1,200米的地区，一般生于多石山坡上，目前尚未由人工引种栽培。
在2008年3月公布的《北京市重点保护野生植物名录》中，丁香叶忍冬位列其中，为北京市二级重点保护野生植物。目前可以见到的丁香叶忍冬位于延庆松山百瀑泉西北约200m处在海拔1100m以上的林下，上层乔木有油松、华北五角枫等，仅有两株。因此，保护丁香叶忍冬，扩大其存在数量达到了刻不容缓的地步。而组培由于其性状稳定、繁殖速度快等优点，是扩大其存在数量的一种有效的手段，但是目前对于丁香叶忍冬的研究较少，更没有关于丁香叶忍冬组织培养方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丁香叶忍冬组培快繁的方法，能够快速建立起丁香叶忍冬的组培快繁体系，可以实现丁香叶忍冬的快速增殖。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种丁香叶忍冬组培快繁的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选择及处理：外植体用野外植株茎段的腋芽，野外采集外植体应避免二次污染，用剪刀剪下茎段以干净封口袋保存，外植体不超过两天，并且不能沾水；
(2)外植体的消毒：用剪刀把外植体剪成带两三个腋芽的茎段放烧杯中，先加入几滴洗洁精，再加水冲洗，并重复一次，用自来水洗到基本无泡沫时，自来水冲洗时间不易过长以免造成外植体二次污染，在超净台中先用70％的酒精浸1分钟，无菌水冲洗2次，用加入两滴吐温的质量浓度为5％的次氯酸钠溶液消毒5分钟，用无菌水洗5次；再用加入两滴吐温的质量浓度为0.1％的升汞消毒10分钟，后用无菌水洗6次；
(3)接种培养：将茎段剪成1cm左右，每段带两个腋芽，接种到接种培养基中，所述接种培养基为GS的大量元素+去除大量元素的MS+6-BA 0.05mg\L+IBA 0.0025mg\L+糖30g/L，每瓶只接一段外植体，培养2-3天开始生长，每30天接转一次；
(4)生根培养：将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根，所述生根培养基为：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IBA 0.0025-0.0035mg\L+糖20g/L，诱导生根约25天开始生根，当根生长到3cm左右出瓶。
优选地，步骤(3)的培养条件为：温度23±1℃，光照时间12小时，光照强度1000Lx左右，培养介质pH值为6.2。
优选地，步骤(4)的培养条件为：23±1℃，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx左右，pH值为6.2。
优选地，还包括组培苗移栽，具体如下：出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗2d，然后解开封口膜，炼苗5d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，后移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，湿度控制在70％左右，15d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50％。
优选地，所述的栽培基质用腐殖土、园土和沙按照1∶1∶1的体积比混合而成。
本发明的有益效果是：
申请人在组培过程中发现，将常规的MS作为基础培养基，在接种后，外植体出现了变黑坏死的情况，为了克服上述问题，申请人创造性得引入GS培养基，并且仅采用其大量元素，同时去除MS的大量元素，将其合并组成基础培养基后，可以克服上述变黑坏死的情况；另外，申请人还发现丁香叶忍冬的外植体对激素浓度较敏感，激素浓度按照本领域常规的浓度设定后，外植体出现大量愈伤组织，而并没有出现分化，因此，本申请大大降低了激素的浓度，从而克服上述缺陷。按照本申请的组培方法，丁香叶忍冬的成活率在90％左右。
本发明通过系统的研究，对丁香叶忍冬各个培养阶段的培养基进行了优选，首次建立了丁香叶忍冬的组织培养体系，提供了一整套的采用丁香叶忍冬的腋芽作为外植体进行培养的方法，可以生产整齐一致的丁香叶忍冬幼苗，为丁香叶忍冬的快速繁殖提供了有效的支持，为丁香叶忍冬的开发利用提供了技术保证，也为进一步探索丁香叶忍冬的基因工程、拓宽外植体材料等奠定了基础。
并且本发明培养过程速度快，再生频率较高，并且变异率较低，周期相对较短，能较好地保持丁香叶忍冬的遗传稳定性。
附图说明
图1是本发明实施例1丁香叶忍冬经过继代增殖培养出来的苗生长状况。
图2是对比例1的苗生长状况。
图3是对比例2的苗生长状况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种丁香叶忍冬组培快繁的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选择及处理：外植体用野外植株茎段的腋芽，野外采集外植体应避免二次污染，用剪刀剪下茎段以干净封口袋保存，外植体不超过两天，并且不能沾水；
(2)外植体的消毒：用剪刀把外植体剪成带两三个腋芽的茎段放烧杯中，先加入几滴洗洁精，再加水冲洗，并重复一次，用自来水洗到基本无泡沫时，自来水冲洗时间不易过长以免造成外植体二次污染，在超净台中先用70％的酒精浸1分钟，无菌水冲洗2次，用加入两滴吐温的质量浓度为5％的次氯酸钠溶液消毒5分钟，用无菌水洗5次；再用加入两滴吐温的质量浓度为0.1％的升汞消毒10分钟，后用无菌水洗6次；
(3)接种培养：将茎段剪成1cm左右，每段带两个腋芽，接种到接种培养基中，所述接种培养基为GS的大量元素+去除大量元素的MS+6-BA 0.05mg\L+IBA 0.0025mg\L+糖30g/L，每瓶只接一段外植体，培养2-3天开始生长，每30天接转一次；培养条件为：温度23+1℃，光照时间12小时，光照强度1000Lx左右，培养介质pH值为6.2
(4)生根培养：将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根，所述生根培养基为：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IBA 0.003mg\L+糖20g/L，诱导生根约25天开始生根，当根生长到3cm左右出瓶，培养条件为：23±1℃，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx左右，pH值为6.2。
(5)组培苗移栽，具体如下：出瓶前练苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗2d，然后解开封口膜，炼苗5d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，后移栽到经消毒的基质中，温度控制在25℃，湿度控制在70％左右，15d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50％。所述的栽培基质用腐殖土、园土和沙按照1∶1∶1的体积比混合而成。
对比例1
接种和生根培养基的基础培养基均改为MS，其余同实施例1。最终培养得到的组培苗生长状况见图2。
对比例2
生根培养基的IBA浓度改为0.01mg\L，其余同实施例1。最终培养得到的组培苗生长状况见图3。
发明人经研究发现，使用MS作为基础培养基的，出现了变黑坏死的现象，且浓度调高之后，出现了大量的愈伤组织，而将MS培养基换为本申请的培养基，且浓度降低之后，上述问题均未出现。
Claims (5)
1.一种丁香叶忍冬组培快繁的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)外植体的选择及处理：外植体用野外植株茎段的腋芽，野外采集外植体应避免二次污染，用剪刀剪下茎段以干净封口袋保存，外植体不超过两天，并且不能沾水；(2)外植体的消毒：用剪刀把外植体剪成带两三个腋芽的茎段放烧杯中，先加入几滴洗洁精，再加水冲洗，并重复一次，用自来水洗到基本无泡沫时，自来水冲洗时间不易过长以免造成外植体二次污染，在超净台中先用70％的酒精浸1分钟，无菌水冲洗2次，用加入两滴吐温的质量浓度为5％的次氯酸钠溶液消毒5分钟，用无菌水洗5次；再用加入两滴吐温的质量浓度为0.1％的升汞消毒10分钟，后用无菌水洗6次；(3)接种培养：将茎段剪成1cm，每段带两个腋芽，接种到接种培养基中，所述接种培养基为GS的大量元素+去除大量元素的MS+6-BA 0.05mg/ L+IBA 0.0025mg/ L+糖30g/L，每瓶只接一段外植体，培养2-3天开始生长，每30天接转一次；(4)生根培养：将经过继代培养的分化芽转移到生根培养基上诱导生根，所述生根培养基为：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IBA 0.0025-0.0035mg/ L+糖20g/L，诱导生根25天开始生根，当根生长到3cm出瓶。
2.根据权利要求1所述的丁香叶忍冬组培快繁的方法，其特征在于，步骤(3)所述的接种培养的条件为：温度23±1℃，光照时间12小时，光照强度1000Lx，培养介质pH值为6.2。
3.根据权利要求1或2所述的丁香叶忍冬组培快繁的方法，其特征在于，步骤(4)的培养条件为：23±1℃，光照时间12小时/天，光照强度2000Lx，pH值为6.2。
4.根据权利要求1所述的丁香叶忍冬组培快繁的方法，其特征在于，还包括组培苗移栽，具体如下：出瓶前炼苗一周，先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗2d，然后解开封口膜，炼苗5d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，用多菌灵或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，后移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，湿度控制在70％，15d以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50％。
5.根据权利要求4所述的丁香叶忍冬组培快繁的方法，其特征在于，所述的栽培基质用腐殖土、园土和沙按照1∶1∶1的体积比混合而成。
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