CN101241123A - 一种基于抗生素筛选转基因水稻种子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于抗生素筛选转基因水稻种子的方法，其内容有：A)利用抗生素筛选转基因水稻种子，首先是确定筛选用的抗生素浓度，其次是建立筛选条件和培育条件，最后是判定筛选的结果；B)转基因植株的基因型纯合杂合的判定方法：设目标基因未转化的受体亲本加抗生素和不加抗生素对照，转基因株系不加抗生素的对照，用抗生素筛选转基因株系种子，比较分析转基因株系加入抗生素的和两个对照的实验结果来判定转基因株系的基因型。本发明方法简便，可规模化分析，筛选结果准确，能获得外源目的基因高效表达的植株，效率高，成本低廉，可节约研究资源。

Description

一种基于抗生素筛选转基因水稻种子的方法

技术领域

本发明属于水稻转基因技术领域，更具体涉及一种基于抗生素筛选转基因种子的方法，尤其适合于水稻种子筛选。

技术背景：

目前水稻转基因种子筛选阳性植株，是用PCR的方法，进一步的鉴定是通过Southern blot。PCR的筛选方法其流程是：1，用水稻种子发苗待长到有6片叶大小时，大约要40天；2，剪取0.2克左右的叶片。用CTAB方法提取基因组；3，PCR验证；4，电泳检测。用这种方法筛选鉴定周期较长，因为要等到苗子长到一定大小才可以取材，因为并不知道这些苗子是阳性的还是阴性的，要栽种很多的苗子，所以要耗费大量的精力，之后的提取DNA，PCR，电泳也是一系列繁琐的工作，费时，费力，成本高！

发明内容：

本发明的目的是在于提供了一种利用抗生素筛选转基因水稻种子的方法，方法简便，筛选结果准确，能获得外源目的基因高效表达的植株，效率高，成本低廉，节约了资源。

一种利用抗生素筛选转基因水稻种子及其基因型判定的方法，其步骤是：

1，利用抗生素筛选转基因水稻种子：

A)最佳筛选抗生素浓度确定：设定抗生素选择梯度(对于潮霉素：0，100，200，400，600，800，1000ul/l原始浓度2.5ug/ul；对于卡那霉素：0，100，200，400，600，800，1000mg/l)，将未转基因的受体种子在其中萌发，幼芽生长刚好完全被抑制的抗生素浓度即为最佳筛选抗生素浓度。

B)筛选条件：在2.5mm左右深的、适当浓度(根据A)确定的最适合浓度(浓度为卡那霉素400mg/l和潮霉素600ul/l)的抗生素溶液中铺垫两层大小适中的滤纸，在其上均匀铺撒所需数量的(种子密度小于1个/平方厘米)饱满的转基因水稻种子；阴性对照是未进行基因转化的受体种子，阳性表型对照为未加抗生素的受体种子。

C)培育条件：保持培养体系密闭，密闭空间要有一定的高度(6～10cm)的条件下26-30度暗培养5天。

D)结果判定：结果将出现三种情况的种子：①阳性表型：芽体正常，根生长旺盛，根长超过2cm；②阴性表型：芽体和根生长受到典型抑制，根长小于0.5cm；③萌发不正常的种子，没有发芽，或者芽体不正常，此种表型是种子本身发芽能力不好所致，与转基因阴性阳性没有关系。

2，转基因植株的基因型纯合杂合的判定方法

该判定方法是建立在第一步上，以抗生素为基础筛选转基因阳性种子的方法的基础上进行统计分析。

判断方法1：

A)设置对照：用未转基因的受体种子做一个加入抗生素的阴性对照和一个未加入抗生素的阳性对照。

B)按照《以抗生素为基础筛选转基因阳性种子的方法》所阐述的为基础，如果想判定某一转基因株系的基因型，只要在进行此株系的种子筛选时设置一个不加抗生素的对照即可简单的判断出来。

对照如表所示：

样品号	S1+	S1-	S2+	S2-	……	Sn+	Sn-	C+	C-
										是否加抗生素	是	否	是	否		是	否	是	否

S为转基因株系，C为非转基因对照

C)判断方法：将加入抗生素的和没有加抗生素的对照实验对比，如果S+和S-阳性表型率基本一致则此株系纯合，其后代也都为纯合；没有加入抗生素的对照高于加入抗生素的发芽阳性率，此株系为转基因杂合，(如果S-的阳性率明显高于S+发芽阳性率，那么表明此株系为转基因杂合，)其后代就有孟德尔分离。加入抗生素的表现为阴性，不加抗生素的为阳性表明此株系为非转基因株系，如果S+完全表现为阴性，S-有较高的阳性率说明此株系为非转基因株系(假阳性)。

判断方法2：直接统计筛选结果，如果阳性率为0，则为阴性纯合株系，如果阳性种子与阴性种子的比率符合孟德尔分离规律则为杂合型，如果阳性率接近100)则为阳性纯合株系。

判断方法1比判断方法2更准确。

说明：阳性率＝阳性种子/(阴性种子+阳性种子)，没有发芽的种子或者发芽不正常的种子不计算在内。

本发明的效果是：

1)投入少、操作简单，只要简单的一个组织培养盒，少量的抗生素，建立好筛选体系后，5天内就可以轻而易举的得到阳性植株，而且还可以分析转基因植株的基因型纯合杂合状态。2)可信度高，两次次单独的筛选实验中，阳性表型苗的PCR阳性率均为100％；阴性苗去除潮霉素后仍可以继续生长，挑取生长良好的芽提取DNA进行PCR分析，阴性率100％(每次实验PCR样本量＞30个)，表明本方法很可靠。3)鉴别明确、省时省力，本发明方法筛选出来的阳性苗应该是已经表达目的基因的植株，这与PCR筛选和Southern blot分析有所区别，用Southern blot分析和PCR鉴定的结果不一定就是能够表达目的基因的植株，因为外源目的基因的插入有位点效应，Southern blot分析和PCR检测只能鉴定出片断是否插入到基因组中，不能说明目的基因已经表达。而我们所需要的植株是目的基因高效表达的植株，本方法不仅鉴定了外源目的基因转化的阳性植株，而且得到了外源目的基因稳定表达的阳性植株，具有Northern blot分析的意义。所以本发明方法与以往的PCR检测技术相比，具有简单、高效、准确、节约、省时省力，而且对进一步实验分析验证也更有意义。

附图说明

图1：一个筛选体系建立的实验结果示意图：A)潮霉素浓度为0的筛选结果：发芽生根正常；B)浓度为100ul/L的筛选结果：大部分芽根抑制仍有少部分芽根长出；C)浓度为200ul/L的筛选结果大部分芽根抑制仍有少部分芽根长出；D)浓度为400ul/L的筛选结果大部分芽根抑制仍有极少量生根表现正常；E)浓度为600ul/L的筛选结果：所有的种子生根得到了抑制，仅有较短的芽体产生；F)浓度为800ul/L的筛选结果：所有的种子生根得到了抑制，仅有较短的芽体产生.(抗生素为潮霉素原始浓度为2.5ug/ul)

图2：转基因wx25株系的筛选结果示意图，表明此株系为阴性，即假阳性转基因植株。

图3：所用的受体zh11在筛选条件下的阴性表型对照。此对照说明对于非转基因种子，我们的筛选浓度得到了完全抑制。

图4：所用的受体zh11在无筛选条件下的阳性表型对照。说明图3的结果(种子萌发不正常的结果)是抗生素压力的结果，不是种子自身的原因。其表型为标准的阳性表型，可以作为转基因种子筛选的表型参考。

图5：wx18的筛选结果。出现了阳性表型和阴性表型以及其他不正常萌发的表型。

图6：wx18株系中的10个阴性芽表型：符合上文所说的阴性表型的标准，芽体可以萌发但是根长小于0.5cm。说明wx18存在阳性表型的和阴性表型为杂合。

图7：阴性芽和阳性芽的对比，差别明显对于结果容易判断。

图8：wx18株系中的10个阴性表型芽经过4天的恢复情况，除去抗生素后能够恢复生长生根，说明这些阴性标准得到的阴性种子是可靠的，他们确实因为抗生素压力才不能够生长的，不是因为种子的其他原因引起的，因为当抗生素压力除去后都仍能恢复生长。

图9：阴性表型种子恢复的表型：对阴性表型种子恢复后的细节描述，除去抗生素压力后根芽得到了健康生长。

图10：第一次筛选出的阳性苗PCR检测验证结果，100％吻合，ZH11为未转基因的对照，3，4，18，25，27，32，34为不同株系编号，下面为每个编号对应的不同后代苗。“+”为有目的基因的载体做模板，“-”为非转基因DNA为模板，M为DL2000marker。

图11：第二次筛选的阳性苗PCR检测验证结果，100％吻合，“M”DL2000marker，“-”非转基因DNA阴性对照。3，34，32，27，18，4为不同株系的不同植株。

图12：阴性表型苗经过恢复后进行PCR验证，100％吻合；随机的从9个株系的共108个可恢复的苗中随机抽取30株进行PCR检测，最后一个样”+”为转基因阳性苗对照。

具体实施方式

实施例1

1.转基因材料和抗生素

转基因种子和未转基因种子，潮霉素(浓度2.5mg/ml)。

转基因材料说明：中花11转CA(碳酸酐酶基因)基因，所用载体为pCAMBIA1301(澳大利亚CAMBIA研究中心购买)，抗性筛选标记为潮霉素，用农杆菌EHA101(由takara公司购买)介导法。

2.条件确定：

用6个9cm培养皿，每个皿中加入潮霉素溶液10ml，浓度依次是0.0，100，200，400，600，800ul/L(母液浓度为2.5ug/ul)，平皿下铺垫大小合适的滤纸两层，每个培养皿放入中花11(未转基)因种子30粒左右.均匀放置.28度暗培养3天.观察结果.(如：图1)从结果可见潮霉素浓度为0ul/L，100ul/L，200ul/L，400ul/L的情况下不能完全抑制当浓度达到：600ul/L的时候就可以达到完全抑制，所以选用此浓度作为以后实验的筛选浓度。

3.筛选流程：

一)组培盒(长×宽×高：6cm×6cm×10cm，有盖可以形成密闭的体系，透明塑料盒)加入10mL蒸馏水，pH 6.0-7.0

二)每盒加入6ul潮霉素，混合均匀

三)铺垫两层大小合适的滤纸

四)放入CA转基因种子40粒左右，种子要饱满干净，有较好的发芽率。

五)28度暗培养五天后观察统计结果。

4实验结果

4.1五天后观察结果(部分)

结果如：

图2：为转基因wx25株系的筛选结果示意图，表明此株系为阴性，即假阳性转基因植株

图3：所用的受体zh11在筛选条件下的阴性表型对照。此对照说明对于非转基因种子，我们的筛选浓度得到了完全抑制，只能长出较短的芽以及小于0.5cm的不正常的根。

图4：所用的受体zh11在无筛选条件下的阳性表型对照。说明图3的结果(种子萌发阴性表型的结果)是抗生素压力的结果，不是种子自身的原因。其表型为标准的阳性表型，可以作为转基因种子筛选的参考表型。

图5：wx18的筛选结果。出现了阳性表型和阴性表型以及其他不正常萌发的表型，表明此株系为杂合。

图6：wx18株系中的10个阴性芽表型符合上文所说的阴性表型的标准，芽体可以萌发但是根长小于0.5cm。说明wx18存在阳性表型的和阴性表型为杂合。

4.2统计数据

表：1筛选统计情况.

编号：	是否加入抗生素	阴性表型(个)	阳性表型(个)	共发芽(个)	分析评论
						ZH11+	未加	5	27	32	阳性标准对照
ZH11-	加入	33	0	33	典型阴性纯合
						WX3	加入	13	27	40	转基因杂合
WX4	加入	4	56	59	转基因纯合
						WX11	加入	25	0	25	非转基因
WX18-	未加	1	36	37	转基因杂合
						WX18	加入	10	32	42	转基因杂合
WX25	加入	22	0	22	非转基因
						WX27	加入	19	19	38	转基因杂合
WX32	加入	3	35	38	转基因纯合
						WX34	加入	20	15	35	转基因杂合

说明：ZH11+，未加潮霉素的阳性表型对照；ZH11-为加入潮霉素的非转基因阴性表型对照，WX18-：为WX18株系没有加入潮霉素的对照。其他的为正常的筛选样本。阴性表型：发芽但是根系不发达(小于0.5cm)或没有根系，阴性表型不一定就是阴性种子，因为有可能是本身发芽不正常的种子与抗生素压力无关；阳性表型：芽体茁壮，根系发达(大于2.0cm)；没有芽也没有跟的种子是不能萌发的种子与本实验无关！本实验只计能正常萌发的种子，以消除干扰！

结果表明：根据判断方法1，即针对wx18进行判断，因为只有wx18设了正负对照，wx18为转基因杂合；根据判断方法2，wx3，wx18，wx27，wx32，wx34为转基因杂合有，wx4为纯合株系，wx25，wx11为非转基因株系。

4.3阴性苗的抑止解除实验.

将阴性表型的发芽种子用清水洗后放入无潮酶素的培养盒中继续生长，然后统计表型并分析.结果能够继续生长的，并能长出根的种子被认为是从抑止中解除的种子，能够恢复生长的种芽应该为阴性种芽，不能够恢复生长的种芽可能与种芽本身的萌发有关(这样的话有可能是阳性芽)，或者和潮霉素毒性损伤有关.阴性苗恢复生长4天后，如：图7，图8.

4.4PCR检测结果：CTAB法提取阳性表型苗基因组和阴性恢复苗基因组进行PCR检测以验证本发明的可靠性。PCR所用引物扩增目的基因800bp，为转的外源基因，水稻本身不含有。

第一次检测，对潮霉素筛选出来的阳性表型发芽种子，种植到温室的水稻苗提取基因组进行PCR的结果。如：图10；第二次检测筛选实验结果：2007-07-12如：图11和预期结果完全吻合。阴性表型苗消除潮霉素后，恢复生长后提取基因组进行PCR结果：2007-07-17如：图12和预期结果完全吻合。

实施例2.

1.转基因材料和抗生素

转基因种子和未转基因种子，卡那霉素

转基因材料说明：中花11转sbpase基因(1，7-2磷酸酶景天庚酮糖酶基因来源于蓝藻)，所用载体为pBI121(genebank登录号：AY781296)，抗性筛选标记为卡那霉素，用农杆菌介导法进行转基因，农杆菌菌株EHA101，由takara公司购买。

2条件确定：

用6个9cm培养皿，每个皿中加入卡那霉素溶液10ml，浓度依次是0.0mg/L，100mg/L，200mg/L，400mg/L，600mg/L，800mg/L，平皿下铺垫大小合适的滤纸两层，每个培养皿放入受体(未转基)种子30粒左右.均匀放置.28度暗培养3天.结果发现卡那霉素浓度为0mg/L，100mg/L，200mg/L的情况下不能完全抑制当浓度达到：400mg/l的时候就可以达到完全抑制，所以选用此浓度作为以后实验的筛选浓度。

3，筛选流程：

一)组培盒(长×宽×高：6cm×6cm×10cm，有盖可以形成密闭的体系，透明塑料盒)。

二)每盒加入10ml浓度为400mg/l的潮霉素，

三)铺垫两层大小合适的滤纸

四)放入sbpase转基因种子40粒左右，种子要饱满干净，有较好的发芽率。

五)28度暗培养五天后即得到筛选结果。

具体流程与实施例1相同。

Claims (1)

1、一种基于抗生素筛选转基因水稻种子的方法，它包括下列步骤：

A、利用抗生素筛选转基因水稻种子，首先是筛选抗生素浓度确定：设定抗生素选择梯度，梯度为：0-1000mg/l，将未转基因的受体种子在其中萌发，幼芽生长被抑制的抗生素浓度为筛选抗生素浓度；其次是筛选条件：在2.5mm深，浓度的抗生素溶液中铺垫两层滤纸，浓度为卡那霉素400mg/l和潮霉素600ul/l，在其上均匀铺撒种子密度小于1个/平方厘米转基因水稻种子；阴性对照是未进行基因转化的受体种子，阳性表型对照为未加抗生素的受体种子；第三是培育条件，密闭空间条件下26-30度暗培养5天；第四是结果判定：结果出现三种情况的种子：①阳性表型：芽体正常，根生长旺盛，根长超过2cm；②阴性表型：芽体和根生长受到典型抑制，根长小于0.5cm；③萌发不正常的种子，没有发芽或者芽体不正常；

B、转基因植株的基因型纯合杂合的判定方法：首先是设置对照：用未转基因的受体种子做一个加入抗生素的阴性表型对照和一个未加入抗生素的阳性表型对照；其次是按照以抗生素为基础筛选转基因阳性种子的方法为基础，判定转基因株系的基因型，在进行此株系的种子筛选时设置一个不加抗生素的对照即判断出来；第三是将加入抗生素的和没有加抗生素的对照实验对比，阳性表型率一致则此株系纯合，其后代也都为纯合；没有加入抗生素的对照高于加入抗生素的发芽阳性率，此株系为转基因杂合，其后代就有孟德尔分离；加入抗生素的表现为阴性，不加抗生素的为阳性表明此株系为非转基因株系；或直接统计筛选结果，阳性率为0，则为阴性纯合株系，阳性种子与阴性种子的比率符合孟德尔分离规律则为杂合型，阳性率接近100则为阳性纯合株系。

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