CN108546704A

CN108546704A - 一种无功能的OsC1基因及其应用

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Publication number: CN108546704A
Application number: CN201810368609.2A
Authority: CN
Inventors: 陈浩; 郑婕; 吴昊; 周再会; 林拥军
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2018-09-18
Anticipated expiration: 2038-04-23
Also published as: CN108546704B

Abstract

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种无功能的OsC1基因及其应用。本发明所述无功能的OsC1基因的基因型为Hap 2，在OsC1基因的第791‑800bp位置发生10bp缺失。本发明还提供了上述无功能OsC1基因在去除叶片花青素中的应用，利用分子标记技术结合常规育种流程，将无功能的OsC1基因导入叶片中含花青素的黑米品种中，可以特异性去除叶片中花青素的积累，但不影响黑米种子中花青素的含量。

Description

一种无功能的OsC1基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种无功能的OsC1基因及其应用。

技术背景

水稻作为人类最重要的粮食作物之一，是全球约一半人口的主粮。我国是水稻种植最早的国家之一，水稻常年种植面积在3000万多公顷。花青素是一种具有生物活性的水溶性多酚类化合物，富含花青素的水果、蔬菜和谷类等能够预防一些慢性非传染性疾病，如癌症、心血管病、肥胖症等(Tsuda,2012；Valenti,et al.,2013)。黑米是一类非常稀有的水稻资源，黑米品种的种子由于种皮中富含花青素而呈现黑色或紫色。中国传统医学认为黑米具有补肾补血等保健功效，长期食用可以延年益寿。可以预期，随着社会的发展人类对生活品质的追求越来越高，富含花青素的黑米品种具有较大的市场前景。

已有的研究表明黑米的形成机制可能来源于一个花青素合成调控基因OsB2的“获得性”突变。突变的OsB2基因激活了水稻种子中花青素的合成途径，导致了黑米的诞生(Oikawa et al.,2015)。然而，水稻种子中花青素的合成途径被激活的同时，其他营养组织比如叶片中花青素的合成也可能被激活。因此，大多数的黑米品种的叶片中也含有花青素，而大多数普通水稻品种的叶片中不含有花青素。叶片中积累花青素不是育种家期望的农艺性状。一些研究表明，植物组织中积累花青素会影响其光合效率从而影响作物产量。通常黑米品种的产量显著低于普通的白米品种。因此，既去除黑米品种叶片中的花青素，又不影响种子中花青素的积累水平是提高黑米产量的可行策略。

由于花青素的合成途径具有保守型，在不了解花青素和合成的组织特异性调控机制的前提下，育种家难以保证去掉叶片花青素的同时不降低种子中花青素的含量。水稻中花青素合成调控的机理研究相对有限，组织特异性调控的细节并不清楚。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种无功能的OsC1基因及其在去除叶片花青素中的应用，可以在改善黑米品种光合效率的同时，不影响黑米的营养价值。

本发明提供了一种无功能的OsC1基因，所述OsC1基因的基因型为Hap2，在OsC1基因的第791-800bp位置发生10bp缺失。

本发明提供了上述无功能的OsC1基因在去除叶片花青素中的应用。

本发明还提供了一种组织特异性去除黑米品种叶片花青素的方法，包括如下步骤：

(1)从已知水稻品种中筛选得到OsC1基因无功能的水稻品种；

(2)将叶片中含有花青素的黑米品种与步骤(1)所述OsC1基因无功能的水稻品种杂交育种；

(3)从步骤(2)所述杂交育种的后代中筛选得到组织特异性去除叶片花青素的黑米品种；

步骤(1)所述OsC1基因的基因型为Hap 2。

优选的，步骤(3)所述筛选包括：用特异性引物Pc1-F和Pc1-R对黑米材料的总DNA进行PCR扩增，扩增产物大小为67bp的黑米品种，即为组织特异性去除叶片花青素的黑米品种；

特异性引物Pc1-F和Pc1-R的碱基序列5’-3’如下:

Pc1-F：CTCATTGCAGGCAGGCTG；

Pc1-R：ATCTTGCGGCTGAGCGT。

在本发明中，若PCR产物的大小为77bp，则该品种为含有叶片花青素的黑米品种。

优选的，步骤(2)所述杂交育种包括：将F1代与亲本中的黑米品种回交n代后自交，或将F1代直接自交。

优选的，步骤(3)所述杂交育种的后代为F2代或BC1F2～BCnF2代。

优选的，步骤(3)所述组织特异性去除叶片花青素的黑米植株是指OsC1基因全部无功能，且种子为黑米表型的子代植株。

优选的，步骤(2)所述杂交育种的后代单株收种，每个单株来源的种子种植为一个家系，所述筛选以家系为单位进行。

在本发明中，每个家系优选种植20～100株。

有益效果：

本发明提供的Hap 2基因在OsC1基因的第791-800bp位置发生10bp缺失。该Hap 2基因的单倍型可100％导致绿叶表型(叶片无花青素积累)。

本发明通过实验证明了叶片中有花青素积累时，会降低了光合效率。在上述结论基础上，本发明利用常规育种流程将无功能的OsC1基因导入叶片中含有花青素的黑米品种中，可以特异性的去除叶片中花青素的积累，但不影响黑米种子中花青素的含量，从而改善黑米品种的光合作用效率，同时不影响黑米的营养价值。

在优选的技术方案中，本发明使用特异性引物Pc1-F和Pc1-R对黑米材料的总DNA进行PCR扩增，可以快速确定OsC1的基因型，筛选得到需要的黑米品种。

本发明提供了一种操作简便、适于推广的组织特异性去除黑米品种中叶片花青素的方法。在优选的技术方案中，本发明使用分子标记技术结合常规育种流程，加速的育种的流程，大大缩短本发明得到去除叶片花青素黑米品种的育种周期。

附图说明

图1为本发明实施例1所述523份水稻样品数据的GWAS分析结果；其中，a为523份水稻样品的主组分分析结果；b为GWAS分析的Q-Q图；、c为GWAS分析的曼哈顿图；d为局部曼哈顿图和LD热图。

图2为本发明实施例1所述5种无功能的OsC1单倍型(Hap 2-Hap 6)；

图3为本发明实施例2所述表达载体pC1300NU(图3a)以及OsC1的超表达载体pC1300NU-OsC1；

图4为本发明实施例2所述Southern杂交分析结果；

图5为本发明实施例2所述HPLC分析结果；

图6为本发明实施例2所述光合速率检测结果；

图7为本发明实施例3所述51个黑米品种中糙米及叶片中的花青素含量测定结果；

图8为本发明实施例4所述PCR扩增结果；

图9为本发明实施例5所述先自交，再杂交的技术路线示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种无功能的OsC1基因，所述OsC1基因的基因型为Hap2，所述Hap 2在OsC1基因的第791-800bp位置发生10bp(ACTGGAACAG)缺失。本发明还提供了一种具体的Hap 2基因型，其序列如SEQ ID NO.1所示；该序列意为对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，而不应当作为对Hap 2基因型序列的严格限定；在不影响功能的前提下，所述Hap2基因型可包括本领域常见的无意义突变。该Hap 2基因的单倍型可100％导致绿叶表型(叶片无花青素积累)，可通过杂交或基因工程的手段应用于去除水稻叶片中的花青素。

(1)从已知水稻品种中筛选得到OsC1基因无功能的水稻品种；

(2)将叶片中含有花青素的黑米品种与步骤(1)所述OsC1基因无功能的水稻品种杂交；

(3)从步骤(2)所述杂交的后代中筛选得到组织特异性去除叶片花青素的黑米品种。

在本发明中，步骤(1)所述OsC1基因的基因型为Hap 2。Hap 2单倍型可100％导致绿叶表型(叶片无花青素积累)。且单倍型Hap 2在群体中出现的比率最高，为50.1％，来源广泛。

本发明从已知水稻品种中筛选得到OsC1基因无功能的Hap 2型水稻品种；优选的，本发明利用引物对Pc1-F和Pc1-R对水稻总DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行序列分析，如果该扩增产物存在特征性的10bp缺失，则为OsC1的Hap 2基因型。筛选得到OsC1基因无功能的Hap 2型水稻品种后，本发明将叶片中含有花青素的黑米品种与上述OsC1基因无功能的Hap 2型水稻品种杂交育种。在本发明中，所述杂交育种优选包括：将F1代与亲本中的黑米品种回交n代后自交，或将F1代直接自交的步骤。在本发明中，将F1代与亲本中黑米品种回交的目的是尽可能多的保留黑米品种原有性状中除叶色外的其他性状；具体的回交代数根据育种者需求确定；本发明所述自交的目的是让杂合子的性状分离，从而能够从F2代或BC1F2～BCnF2代杂交后代中筛选得到组织特异性去除叶片花青素的黑米品种。

在本发明中，所述杂交的后代优选采用单株收种，每个单株来源的种子种植为一个家系。本发明所述组织特异性去除叶片花青素的黑米植株是指OsC1基因全部无功能，且种子为黑米表型的子代植株。在本发明中，所述筛选优选以家系为单位进行，每个家系优选种植20～100株，更优选为50株。

本发明对步骤(1)所述OsC1基因无功能型水稻品种的筛选方法以及步骤(3)所述杂交后代中组织特异性去除叶片花青素的黑米品种的筛选方法不作具体限定，采用本领域已知的检测手段进行检测即可。在本发明的实施例中，优选采用分子标记技术对OsC1基因无功能的水稻品种进行筛选。

本发明优选用特异性引物Pc1-F和Pc1-R对黑米材料的总DNA进行PCR扩增，所述特异性引物Pc1-F的碱基序列5’-3’为：CTCATTGCAGGCAGGCTG(SEQ ID No.2)；所述特异性引物Pc1-R的碱基序列5’-3’为：ATCTTGCGGCTGAGCGT(SEQ ID No.3)。

在本发明中，所述PCR的反应体系优选由50～200ng的DNA模板，0.1～0.3μL的5～15μM的Pc1-F，0.1～0.3μL的5～15μM的Pc1-R，10μL的2×KODBuffer，0.1～0.3μL的KOD(Toyobo)，0.5～1.5μL的2mMdNTPs，以及余量的双蒸水组成20μL反应体系。

在本发明的具体实施例中，所述PCR扩增的反应体系优选为

DNA模板	100ng
		10μMPc1-F	0.2μL
10μMPc1-R	0.2μL
		2×KODBuffer	10μL
KOD(Toyobo)	0.2μL
		2mMdNTPs	1μL
ddH₂O	补至20μL

在本发明中，所述PCR的反应程序优选为：

采用上述方案进行PCR扩增，当扩增产物大小为67bp时，则黑米材料即为组织特异性去除叶片花青素的Hap 2型黑米品种；若PCR产物的大小为77bp，则该品种为含有叶片花青素的黑米品种。

下面结合实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围

实施例1

利用GWAS技术确定水稻叶片花青素合成的决定基因：

本发明在华中农业大学校园内的试验田中种植533份从世界各地收集的水稻种质资源，具体的种质资源信息参考Chen等(2014)发表的文献(Chen,W.,Gao,Y.,Xie,W.,Gong,L.,Lu,K.,Wang,W.,Li,Y.,Liu,X.,Zhang,H.,Dong,H.,et al.(2014).Genome-wideassociation analyses provide genetic and biochemical insights into naturalvariation in rice metabolism.Nat.Genet.46:714-721)。在水稻的分蘖期采集其叶片样品。利用高效液相色谱仪(high-performance liquid chromatography，HPLC)分析叶片中花青素的含量。水稻叶片花青素的抽取和测定方法参考Zhu等(2010)发表的文献。利用真空冻干机将叶片样品冻干后在室温条件下磨成粉。用10ml离心管取约100mg叶片粉末，加入1ml 80％甲醇和50μL 5M HCl，盖紧在摇床上120转/分钟震荡抽提24h。取上清用0.22μm孔径的滤膜过滤，滤液置于2ml棕色瓶避光保存。用高效液相色谱仪Agilent 1100series对花青素含量进行分析。配置溶液A，配方为水:甲酸＝100:5(体积比)，以及溶液B(纯甲醇)。仪器设置为：0-12min，20-70％B；12-20min,70-78％B。流速0.8ml/min，上样量10μl。测量波长为520nm。用水稻组织中普遍存在的两种花青素，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Miragen)和芍药素-3-O-葡萄糖苷(Miragen)作为标准品，对两种标准品分别进行浓度梯度稀释后，取250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.813μg/ml、3.906μg/ml、1.953μg/ml、0.977μg/ml、0.488μg/ml和0.244μg/ml的标准品稀释液进行含量测定并绘制标准曲线。

根据检测结果，如果叶片中检测不到花青素将其记录为“绿叶”性状(GL)；如果叶片中检测到花青素(无论含量高低)记录为“紫叶”性状(PL)。同年冬季在海南陵水华中农业大学南繁基地再次种植同样的533份水稻种质资源，并在分蘖期取叶片样品。同样利用HPLC检测叶片花青素含量，根据检测结果对叶色性状进行记录。将两次检测结果进行比较，去掉10份两次检测结果不一致的样品，剩下的523份样品的数据进行GWAS分析。所有523份水稻材料的基因型数据从RiceVarMap数据库(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)下载。用GCTAv1.90.2beta0(http://cnsgenomics.com/software/gcta/#Citations)进行主组分分析。以主组分分析的前四个组分作为协变量，用plink v1.90b3.40(http://www.cog-genomics.org/plink/1.9/general_usage#cite)进行GWAS(逻辑回归算法)。GWAS显著性阈值的计算参考Li等(2012)的公式α*＝α/Me。

GWAS结果表明，在第6号染色体上检测到一个与叶片花青素积累显著相关的位点(阈值-Log10P>7.23)，该位点包含一个R2R3-MYB转录因子OsC1(图1)。

利用PCR分离523份水稻材料的OsC1基因的DNA序列(约1.3kb)。PCR所用的左引物seqOsC1-F为ACATCGTACGGGGCTACA(SEQ ID No.4)，右引物seqOsC1-R为TATACGGAAACCCGCAACTG(SEQ ID No.5)。PCR反应体系为10×PCRBuffer 5μL，2mM dNTPs 4μL，10μM左右引物各0.5μL，DNA模板200ng，ExTaq 0.5μL，补ddH2O至50μL。PCR的程序为94℃5min；94℃30s，57℃1min 30s，72℃30s，35个循环，72℃5min，25℃1min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后进行测序分析。

根据测序结果，我们对OsC1基因进行了单倍型分析。我们考察了OsC1基因的所有变异类型删除、插入或者单碱基突变(SNP)。如果特定变异类型仅在少数水稻材料(在523群体中的比率小于5％)中发现，则被视为稀有变异，不予考虑。根据DNA突变与叶片花青素含量表型的对应关系，我们确定了5种无功能的OsC1单倍型(Hap 2-Hap 6)，这些OsC1的单倍型可100％导致绿叶表型(叶片无花青素积累)。在5种无功能的OsC1单倍型中Hap 2在基因的791-800bp位置发生10bp的缺失，且单倍型Hap 2在群体中出现的的比率最高，为50.1％(图2)。

实施例2

叶片中花青素含量对光合速率的影响试验：

取黑米品种“黑帅”苗期叶片，用TransZol Reagent抽提RNA。取2μg黑帅RNA样品，用MLV反转录酶进行反转录。获得的cDNA稀释至100μL。取1μL cDNA作为模板，用OsC1-F(SEQID No.6：GGATCCGCTCAGTCTCACACCGCACAGA)和OsC1-R(SEQ ID No.7：GGTACCGTCACGCACACAAGTTC)扩增OsC1基因的全长cDNA序列。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

将PCR扩增的OsC1基因的全长cDNA克隆到T载体pEASY-BluntZero(全式金)上。利用BamH I和Kpn I双酶切表达载体pC1300NU(图3a)以及克隆于pEASY-Blunt Zero载体上的OsC1的全长cDNA，然后将OsC1的全长cDNA连接到pC1300NU载体上并置于玉米Ubiquitin启动子和Nos终止子的调控之下，形成OsC1的超表达载体pC1300NU-OsC1(图3b)。

BamH I和Kpn I双酶切的体系为：质粒DNA5μg；BamH I和Kpn I各1μL；10×FDBuffer5μL；补ddH₂O至50μL。酶切反应条件为37℃，1h。酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳并挖胶回收载体片段和目的基因片段。用T4DNA连接酶(New EnglandBiolabs)连接目的基因和载体片段，连接体系如下为OsC1全长cDNA3.5μL；pC1300NU载体0.5μL；T4DNA连接酶0.5μL；10×T4Buffer0.5μL；16℃连接过夜。

Chao2-10是一个叶片不含花青素的粳稻品种，对其内源的OsC1的基因型检测发现该品种的OsC1的基因为无功能型。用农杆菌介导的遗传转化法将pC1300NU-OsC1表达载体转化Chao2-10。农杆菌介导的遗传转化具体步骤如下：

(1)愈伤诱导：

将成熟的空育131水稻种子去壳处理，然后依次用75％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞种子表面消毒20分钟。用灭菌单蒸水洗种子4-5次，将种子均匀放在诱导培养基上。接种后的培养基放置于黑暗室培养4-6周，温度28±1℃；

(2)愈伤继代

挑取亮黄色、紧实并且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上在暗室培养3周，温度28±1℃；

(3)预培养

挑取紧实且相对干燥的胚性愈伤，放置于预培养基上黑暗条件下培养4天，温度28±1℃；

(4)农杆菌培养

在带有羧苄青霉素的LA培养基上预培养农杆菌2天，温度为28±1℃；将农杆菌移至悬浮培养基里，在摇床上以28℃，200rpm的条件培养2-3h；

(5)农杆菌侵染

将预培养的愈伤转移至灭菌的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD600＝0.3左右；愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡10min；转移愈伤至已灭菌的滤纸上吸干，然后放置于共培养基上培养3d，温度19-20℃；

(6)愈伤洗涤和选择培养

用灭菌水洗涤侵染后愈伤7～8次，然后浸泡在含有400mg/L的羧苄青霉素的灭菌水中30min；转移愈伤到灭菌好的滤纸上吸干后，转移愈伤到选择培养基上选择培养3次，每次为2周；

(7)分化

将抗性愈伤转移至预分化培养基在黑暗处培养7天，温度26±1℃；转移预分化培养的愈伤至分化培养基，光照下培养，温度26±1℃；

(8)生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基上光照下培养2～3周，温度26±1℃；

(9)移栽

将根上的残留培养基洗干净，将具有良好根系的T0代幼苗转移入温室，同时在最初的几天内保持水分湿润。

将获得的T0代Chao2-10转化植株种植小盆中，在温室中自然光照条件下生长至结实。利用PCR对T0代转基因植株进行阳性检测，PCR所用的引物序列为Hpt-F(SEQ ID No.8：ACACTACATGGCGTGATTTCAT)和Hpt-R(SEQ ID No.9：TCCACTATCGGCGAGTACTTCT)。对PCR检测阳性植株进行Southern杂交分析，确定外源基因插入的拷贝数(图4)，并从中挑选出3个单拷贝插入的转基因家系，分别命名为CC-1,CC-2和CC-3。

利用HPLC对CC-1、CC-2和CC-3叶片中花青素的含量进行分析，发现CC-1、CC-2和CC-3叶片均含有花青素，而非转基因受体品种Chao2-10中未检测到花青素积累(图5)。将CC-1、CC-2和CC-3自交的T2代种子在含有潮霉素抗性的培养基上进行发芽试验筛选纯合阳性植株。根据孟德尔遗传规律，纯合阳性植株种子的发芽率为100％，纯合阴性植株种子发芽率为0％，而杂合植株种子的发芽率约为75％。

对CC-1、CC-2和CC-3纯合植株的光合速率进行检测，检测结果表明：相对于叶片中不积累花青素的野生型Chao2-10，叶片中积累花青素的CC-1、CC-2和CC-3转基因植株光合速率显著下降(图6)。

实施例3

OsC1基因与花青素合成的组织特异性验证：

本发明共收集了51个黑米品种，其中6个品种来自533份用于GWAS分析的水稻种质资源，44个品种来自于中国水稻研究所，1个品种来自于陕西省水稻研究所(表1)。将51个黑米品种种植到田间，生长至分蘖期收集叶片样品，利用HPLC对叶片样品中的花青素含量进行分析，分析方法参考实施例1；成熟后收种、晒干，脱壳后利用HPLC对糙米中花青素的含量进行分析，分析方法同叶片中花青素含量测定。利用引物seqOsC1-F和seqOsC1-R分离黑米品种的OsC1基因序列，PCR反应体系和扩增条件同实施例1。通过对PCR扩增产物进行序列分析，获得51个黑米品种的OsC1基因序列并对其进行基因型分析。分析结果表明，在51个黑米品种中，所有20个OsC1基因为无功能型的品种叶片中均无花青素积累，但并不影响种子中花青素的积累(图7)。这个结果表明：OsC1基因是一个组织特异性的花青素合成决定因子。

表1：51份黑米材料信息

实施例4

利用无功能型OsC1等位基因特异性去除水稻叶片的花青素：

黑帅是一个商业化种植的黑米品种，其种子和叶片中均有花青素的积累。明恢63是一个籼稻恢复系，其叶片和种子中无花青素积累，经检测其OsC1基因为最常见的无功能型Hap 2。

本实施例首先将黑帅品种与明恢63杂交获得F1代种子。然后利用Pc1-F和Pc1-R引物对BC1F1植株进行检测，从中筛选同时带有OsC1Hap 1和Hap 2杂合基因型的F1植株。将筛选的F1植株自交并分单株收F2代种子。

种植F2代，每个F1单株来源的种子种植为一个家系，每个家系种植50株。利用引物Pc1-F和Pc1-R对F2的每个单株进行PCR检测，并对株型和种子颜色进行观察，挑选OsC1全部为无功能型、外观表型与黑帅一致，且种子为黑米表型的F2家系，即为组织特异性去除叶片中花青素的黑米品种。

实施例5

先将黑帅品种与明恢63杂交获得F1代种子。然后将F1植株与黑帅亲本进行1次回交，得BC1F1；将BC1F1自交，得BC1F2；然后利用Pc1-F和Pc1-R引物从BC1F2中筛选OsC1全部为无功能型、外观表型与黑帅一致的家系，即为组织特异性去除叶片中花青素的黑米品种。

通过上述策略，我们从BC1F2代中挑选出一个家系，其叶片中无花青素积累且种子中花青素含量与黑帅一致的新黑米品系(表2)。

表2：黑帅及黑帅与明恢63的BC1F2后代叶片及糙米花青素含量分析(μg/g)

材料	叶片	糙米
			黑帅	31.4	1204.9
BC1F2	0.0	1470.9

以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。同样，任何所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种无功能的OsC1基因及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atggggagga gagcttgctg cgcaaaggaa gggatgaaga gaggggcatg gacgagcaag 60

gaggacgacg tgcttgcctc ctacatcaag tcccatggcg aaggcaagtg gcgcgaggtc 120

ccccaacgag ctggtgagct agctattacc taatcgatcg atggtcatcg atcatgagat 180

gatgatgatg agatttgtac ttaattgtga tctgtatgga tgctgttgtt gatcaagttc 240

ttgcgatcga tcgatctgaa ttttcaggtt tgaggcggtg cggcaagagc tgcaggctcc 300

ggtggctcaa ctatctccgg cctaacatca agcgcggcaa catcgacgac gacgaggagg 360

agctcatcgt caggctccac accctcctcg gcaacaggta atctcatcac ttcatgatca 420

ctccgagttc cgtatcaatt tcgttgagtt cacagcttaa atttggagct atttggtact 480

gtcggtgtgt ggatagtgat atactttttt cttttcctgg ttacggcttt ttagggttgt 540

aatataaact tcgcaacttc ttatacgagt cattcgaaaa aaatttgaag ctggctaacg 600

ctagacaata ataagctgat ttaacttctg ttttattttt atttattttt atctttatct 660

tttttaacaa atttgtaatt tgagctgtga aatcatagct tactgccgtt ttgatcgatc 720

gtgtatatat gttgtcaggt ggtctctcat tgcaggcagg ctgccgggcc gaacagacaa 780

tgaaatcaag aactcacgct cagccgcaag atcggcaccg ccgccaccgc cgccgccggc 840

agccgcggtg gcagcacgcc ggacaccgcc agagcgacgg acgcggcgtc gtccagctcc 900

gtcgtgccgc cgggccagca gcagcagcca gcctcccgcg ccgacaccga cacagcaacg 960

gcagcggcgg cggcggcggc gacgacgacc accgtgtggg cgcccaaggc cgtgcggtgc 1020

acgcgcgggt tcttcttcca cgaccgtgaa acggcgccgc tcgccgcggc ggcgccggcg 1080

ccggcagggg aattaggaga cggcgatgac gtcgactgcg actactactg cagcggcagc 1140

agctcggcgg cgacgacgac gtcgtcgagc tcattaccgg cggtcgtcga gccgtgcttc 1200

tccgccggcg acgactggat ggacgacgtg agagccttgg cgtcgtttct tgacaccgac 1260

gacgcctgga acttgtgtgc gtga 1284

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcattgcag gcaggctg 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcttgcggc tgagcgt 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acatcgtacg gggctaca 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatacggaaa cccgcaactg 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatccgctc agtctcacac cgcacaga 28

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtaccgtca cgcacacaag ttc 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acactacatg gcgtgatttc at 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccactatcg gcgagtactt ct 22

Claims

1.一种无功能的OsC1基因，其特征在于，所述OsC1基因的基因型为Hap 2，在OsC1基因的第791-800bp位置发生10bp缺失。

2.权利要求1所述无功能的OsC1基因在去除叶片花青素中的应用。

3.一种组织特异性去除黑米品种叶片花青素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从已知水稻品种中筛选得到OsC1基因无功能的水稻品种，所述OsC1基因的基因型为Hap 2；

(3)从步骤(2)所述杂交育种的后代中筛选得到组织特异性去除叶片花青素的黑米品种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述筛选包括：用特异性引物Pc1-F和Pc1-R对黑米材料的总DNA进行PCR扩增，扩增产物大小为67bp的黑米品种，即为组织特异性去除叶片花青素的黑米品种；

特异性引物Pc1-F和Pc1-R的碱基序列5’-3’如下:

Pc1-F：CTCATTGCAGGCAGGCTG；

Pc1-R：ATCTTGCGGCTGAGCGT。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，若PCR产物的大小为77bp，则该品种为含有叶片花青素的黑米品种。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述杂交育种包括：将F1代与亲本中的黑米品种回交n代后自交，或将F1代直接自交。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述杂交育种的后代为F2代或BC1F2～BCnF2代。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述杂交育种的后代单株收种，每个单株来源的种子作为一个家系种植，所述步骤(3)的筛选以家系为单位进行。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每个家系种植20～100株。