CN114231540A

CN114231540A - 中国菰ZlRc基因在提高水稻种子原花青素含量中的应用

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Publication number: CN114231540A
Application number: CN202111676095.5A
Authority: CN
Inventors: 闫宁; 于秀婷; 吴丹丹; 祁倩倩; 杨婷; 纪春; 李亚丽; 解颜宁; 张晶; 杜咏梅; 刘新民; 张忠锋
Original assignee: Hefei Jiangu Biotechnology Co ltd; Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Current assignee: Hefei Jiangu Biotechnology Co ltd; Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114231540B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。本发明的目的在于提高水稻种子原花青素含量，提供中国菰ZlRc基因在提高水稻种子原花青素含量中的应用，所述ZlRc基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。本发明能够有效在水稻中过表达ZlRc基因。在与对照植株生长环境一致的情况下，过表达ZlRc基因的水稻所收获的种子与对照组相比，具有更高的总酚、总黄酮和总原花青素含量以及更高的DPPH自由基清除能力和ABTS^·+自由基吸收能力。

Description

中国菰ZlRc基因在提高水稻种子原花青素含量中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别是涉及中国菰ZlRc基因在提高水稻原花青素含量中的应用。

背景技术

水稻作为我国最主要的粮食作物之一，可为人体提供必需的营养物质。稻谷经清理、砻谷、碾米等工序制成大米，在碾米过程中糊粉层和胚被碾除得越多，保留部分愈接近纯胚乳，导致脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和其它植物化学物质(如酚酸、类黄酮和γ-谷维素等)的损失也愈多。高精度加工大米食用口味和消化性虽然得到了提高，但是其营养价值却降低。随着人们生活水平的提高，在保证能量供给的前提下，消费者逐渐开始追求营养与健康。已有研究发现红米的抗氧化活性显著高于一般的糙米，这主要是由于红米的红色或浅红色表皮含有丰富的原花青素的原因，因此一些有色稻米越来越受到消费者及研究人员的关注。

黄酮类化合物，如花青素、黄酮醇和原花青素，是植物的主要次生代谢产物。有色稻米主要因富含不同类型的类黄酮化合物而呈现出不同的颜色，如棕色、红色、紫色和黑色等。其中紫色、黑色种皮一般是由花青素积累形成，而棕色、红色种皮是由于原花青素的积累形成的。原花青素是一种以儿茶素或表儿茶素为主要结构单元的多酚类聚合物，是目前国际上公认的清除人体内自由基的有效天然抗氧化剂，且原花青素的清除自由基的效果优于维生素C、维生素E、白藜芦醇和抗坏血酸。另外，原花青素还具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗动脉粥样硬化、抗心脑血管疾病、降血糖、降血脂、降血压、调节肠道菌群等多种作用，目前已被广泛地应用于保健食品、医药和化妆品等领域。

目前大多数栽培稻的颜色为白色，而大多数野生稻的颜色为红色，谷粒颜色一直是驯化过程中的一个重要目标，Rc和Rd的驯化就是对稻壳颜色的选择。已有的研究显示，红米主要受控于两个基因的表达——第七染色体上的Rc和第一染色体上的Rd。Rc编码bHLH转录因子，Rd编码二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)。Rc是水稻种皮原花青素生物合成的决定因素，且与Rd基因存在互补作用，当只有Rc存在时，水稻种皮呈棕色；当只有Rd存在时，水稻种皮无颜色；当Rc和Rd同时存在时，水稻种皮才呈红色。

中国菰(Zizania latifolia)起源于中国，与水稻同属禾本科(Gramineae)，主要分布于中国、日本、韩国、印度和部分东南亚国家。中国菰资源在中国十分丰富，尤其是长江中下游地区和淮河流域的一些水面分布最为广泛。研究表明，来自长江中下游地区的野生中国菰是一种良好的禾谷类作物驯化候选品种。中国菰的颖果称为中国菰米(Chinesewild rice)，其在我国作为粮食食用已经有3000多年的历史。中国菰米是一种全谷物，其所含的酚酸、类黄酮和其它植物化学物质具有优异的抗氧化特性，是一种很有潜力的功能性食品原料。中国菰米富含原花青素类化合物，其原花青素含量可达普通稻米的6倍、红米的3倍，抗氧化活性可达普通稻米的5倍、红米的3倍。通过中国菰和水稻的基因组比对和共线性分析，中国菰中的ZlRc与水稻中的Rc序列相似度较高，为中国菰中调控原花青素合成的bHLH转录因子。因此，中国菰中原花青素生物合成相关调控基因的发掘，对创新富含原花青素的功能型稻米品种、改善居民膳食结构和降低造成慢性疾病的膳食风险因素都具有重要的现实意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提高水稻种子原花青素含量，提供中国菰ZlRc基因在提高水稻种子原花青素含量中的应用。本发明分离和应用一种包含ZlRc基因的DNA片段，利用组成型启动子驱动该片段超量转录ZlRc基因后时，水稻种子的原花青素含量显著增加。

本发明的技术方案如下：

中国菰ZlRc基因在提高水稻种子原花青素含量中的应用，所述ZlRc基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。

进一步的，所述具有同等功能的核苷酸序列与SEQ ID No.1所示的全长序列之间至少有99％的同一性。

进一步的，所述ZlRc基因编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示，共657个氨基酸。

进一步的，将ZlRc蛋白的过表达载体转入水稻中，得到能够过表达ZlRc的转基因水稻。

进一步的，将ZlRc基因序列构建到1390-UBI过表达载体上，将所述过表达载体转入水稻中，通过提高该基因mRNA的表达量而获得种子原花青素含量显著提高的转基因水稻植株。

进一步的，将所述过表达载体通过化学转化方式转化到农杆菌中，通过农杆菌浸染愈伤组织的方式，获得独立转化体，通过植株再生，得到所述转基因水稻。

有益效果：

采用PCR技术，从中国菰基因组DNA中扩增得到本发明中含有ZlRc基因编码序列的基因组DNA片段(SEQ ID NO：1所示)，将这一序列构建到1390-UBI过表达载体上，利用该载体转化水稻，可通过提高该基因mRNA的表达量而获得种子原花青素含量显著提高的转基因水稻植株。

本发明提供了过表达ZlRc在提高水稻种子原花青素含量中的应用。本发明能够有效在水稻中过表达ZlRc基因。在与对照植株生长环境一致的情况下，过表达ZlRc基因的水稻所收获的种子与对照组相比，具有更高的总酚、总黄酮和总原花青素含量以及更高的DPPH自由基清除能力和ABTS^·+自由基吸收能力。这说明ZlRc基因过表达对水稻中原花青素类化合物的合成途径具有有效调控作用，提高了转基因水稻种子中的原花青素含量，进而导致水稻种子变红。

本发明基于中国菰基因组测序结果，通过与水稻基因组比对和共线性分析，在中国菰中克隆得到一个控制原花青素合成的基因ZlRc。生物学功能验证表明，过表达ZlRc基因引起转基因水稻种子原花青素含量显著提升，本发明证实了ZlRc基因的生物学功能及其应用途径和方法。

附图说明

图1为实施例1采用ClustalΩ软件(公开使用软件)将ZlRc基因推导的蛋白序列与水稻和玉米中的同源基因序列进行比对的结果。从图1可以看出，ZlRc与Rc和Lc蛋白序列具有一定的相似度，且其若干位点是保守的。附图标记说明：在图1中Rc为水稻中与本发明同源的基因，Lc为玉米中与本发明同源的基因，ZlRc基因为本发明克隆的基因。

图2为实施例1阳性克隆测序峰图和测序结果与Rc基因序列比对结果。附图标记说明：(A)为阳性克隆测序峰图；(B)为测序结果与Rc基因序列比对结果。

图3为实施例2过表达载体1390-UBI的物理图谱。

图4为实施例2阳性克隆测序结果及峰图。

图5为实施例2转基因水稻的遗传转化过程。附图标记说明：图三从左至右依次为(A)愈伤诱导、(B)愈伤筛选、(C)抗性愈伤分化再生。

图6为实施例2转基因水稻阳性植株鉴定的琼脂糖电泳胶图。

图7为实施例3转基因水稻抽穗期表型观察。附图标记说明：(A)为野生型日本晴，(B)为ZlRc转基因水稻。

图8为实施例3转基因水稻结实并黄熟期表型观察。附图标记说明：(A)为野生型日本晴，(B)为ZlRc转基因水稻。

图9为实施例4ZlRc过表达转化T0代材料中的ZlRc基因在不同部位转录水平的检测。附图标记说明：实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测T0代过表达植株，UbQ5基因作为内参基因，纵坐标数值表示T0代材料中ZlRc的表达量相对于根ZlRc的表达量的倍数，横坐标CK为野生型日本晴对照，根、茎、叶、叶鞘、种子、花梗均为ZlRc转基因水稻不同组织。测试结果为三次重复的均值，误差线代表标准偏差(SD)。

图10为实施例3野生型日本晴水稻种子与ZlRc转基因水稻种子表型。附图标记说明：(A)为野生型日本晴种子，(B)为ZlRc转基因水稻种子。

图11为实施例5 1个阴性对照植株及6个独立的T0代转基因植株种子的酚类化合物含量和抗氧化活性比较结果。附图说明：(A)为对照和转基因水稻种子总酚含量，(B)为对照和转基因水稻种子总黄酮含量，(C)为对照和转基因水稻种子总原花青素含量，(D)为对照和转基因水稻种子DPPH自由基清除能力，(E)为对照和转基因水稻种子ABTS^·+自由基吸收能力。测试结果为三次重复的均值，误差线代表标准偏差(SD)。

具体实施方式

以下实施例采用的生物材料中国菰采集于中国江苏省淮安市；水稻品种为日本晴，种子来源于中国安徽省合肥市。

实施例1：ZlRc基因的获得

1.1提取中国菰总RNA和制备cDNA

(1)提取中国菰总RNA：

使用多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取中国菰叶片RNA，并反转录为cDNA。中国菰叶片RNA提取参考植物RNA提取试剂盒说明书进行，具体实验方法如下：

1)水稻样本在液氮中迅速研磨成粉末，称取50mg液氨研磨的样本，加入65℃预热的500μL Bufer PRL，立即剧烈涡旋震荡60sec。

2)将裂解物在65℃水浴5min，期间颠倒2次，12000rpm(13400×g)离心10min，转移上清至新的1.5mL RNase-free离心管中，加入0.5倍上清体积的无水乙醇，立即吹打混匀。

3)将上述混合液转移至FastPure gDNA-Filter Column II中，12000rpm(13400×g)离心2min，弃滤液。

4)向FastPure gDNA-Filter Column II中加入500μL Buffer PRLPlus，12000rpm(13400×g)离心30sec，收集滤液。

5)向滤液中加入0.5倍滤液体积的无水乙醇，立即吹打混匀。将上述混合液转移至FastPure RNA Column IV中，12000rpm(13400×g)离心2min，弃滤液。

6)向FasiPure RNA Column IV中加入700μL Buffer PRW1，室温放置1min，12000rpm(13400×g)离心30sec，弃滤液。

7)向FastPure RNA Column IV中加入500μL Buffer PRW2，12000rpm(13400×g)离心30sec，弃滤液，重复本步骤一遍。

8)将FastPure RNA Column IV吸附柱12000rpm(13400×g)空转离心2min，去掉FastPure RNA Column IV中残留的Buffer PRW2。

9)将FastPure RNA Column IV转移至新的RNase-free 1.5mL离心管中，向吸附柱膜中央悬空滴加40μL的RNase-free ddH₂O，室温放置2min，12000rpm(13400×g)离心1min。

(2)制备cDNA：

RNA提取后，测定RNA浓度，每个样品取2.0μg作为反转录的底物。使用反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA产物，-20℃冰箱保存备用。

表1反转录PCR体系及程序：

1.2 ZlRc的扩增

根据ZlRc基因序列，设计引物。PCR反应使用引物ZlRcF:5’-ATGCACGCCATGGCC-3’(SEQ ID NO:3)和ZlRcR:5’-TCATGGTGAGGAGAGGACAAG-3’(SEQ ID NO:4)

以1.1制备得到的cDNA作为模板，1μL；特异性扩增引物ZlRcF，1μL；ZlRcR，1μL；DNApfu酶，1μL；DNA pfu Buffer，2μL；d NTP，1μL；用dd H₂O补至20μL。吹打混匀后进行聚合酶链式反应，PCR温度体系为：95℃，3min预变性；95℃，30sec；64℃，30sec；72℃，2min 20sec，34个循环；72℃，5min。扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，扩增产物与目的片段大小一致且无杂带。

PCR产物进行DNA沉淀回收，具体操作方法：在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，并于﹣20℃冰箱放置30min-1h；12000×g离心10min，弃除上清，保留沉淀；在沉淀中加入1mL75％乙醇(DEPC水)清洗DNA沉淀，离心并去除上清液，重复一次，37℃开盖晾干；离心管中加10μL无菌去离子水溶解DNA沉淀。

取沉淀回收所得10μL混合液加入10μL taq酶，72℃15min，连接A尾。产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收产物。T载体0.5μL，DNA 4.5μL，Buffer 5μL，4℃过夜，将目的基因连接到载体，转化到大肠杆菌感受态DH5α中。连接产物转化大肠杆菌DH5α，具体转化步骤：将﹣80℃冰箱保存的DH5α置于冰上10min左右进行冰浴冻融，在100μL DH5α中加入10μL连接产物，吹打混匀后冰浴30min；随后在42℃水浴锅中热激90s，迅速转移至冰上冰浴2min；在超净工作台内加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，于37℃下220rpm的摇床中复苏培养45min～1h；复苏的菌液在6000rpm离心5min，用移液枪取出500μL上清液，保留500μL培养基重悬沉淀的菌体，重悬后涂平板，37℃培养箱中倒置过夜培养，挑取阳性克隆。菌落PCR产物经电泳后筛选出有目的条带的单菌落，并进行测序。测序结果见图2，PCR产物的核苷酸序列和SED ID NO:1序列一致。说明大肠杆菌中的T载体上具有扩增得到ZlRc的序列。

实施例2：ZlRc基因过表达载体的构建和遗传转化

2.1ZlRc过表达载体的构建

过表达载体构建具体步骤如下：利用限制性内切酶BamHI酶切1390-ubi载体，用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用胶回收试剂盒回收线性化的1390-ubi大片段。用无缝克隆扩增引物FP：5’-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGCACGCCATGGCCGGC-3’(SEQ ID NO:5)和FR：5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCTTGATTCTTGATTCCGAAATCT-3’(SEQ ID NO:6)，扩增出包含ZlRc全长的DNA片段，用1％琼脂糖凝胶电泳，25min后，在紫外灯下切取目标片段，使用胶回收试剂盒进行纯化。

表2 PCR体系及程序

表3无缝克隆体系反应体系

轻轻混合，50℃反应15min，反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒。取5μL产物转化DH5a感受态细胞。冰浴30min，42℃热激30s，冰浴2min，加入700μL LB，37℃200rpm培养1h，涂板。

设计菌液PCR引物：1390-FP:AGCCCTGCCTTCATACGCTA(SEQ ID NO:7)，1390-RP:GCCGGCCATGGCGTGCAT(SEQ ID NO:8)，利用PCR检测单克隆阳性。对阳性克隆进行测序验证，测序正确的菌液，抽提质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞。

操作方法如下：

1.取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2.每100μL农杆菌感EHA105受态细胞加入5uL抽提好的质粒，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

3.加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3h。

4.6000rpm离心一分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含有卡那霉素的抗生素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

过表达载体1390-UBI的物理图谱见图3，测序结果及峰图见图4。

2.2ZlRc转基因水稻的获得及鉴定

转基因水稻的遗传转化过程如图5所示。

(1)愈伤组织准备

1)水稻成熟种子灭菌。用合适的工具将成熟种子去壳，丢弃带霉斑和胚未发育好(干瘪、褐色)的种子，保证种子的完整度和净度。首先将适量种子(不超过6g)倒入灭菌50mL离心管中，倒入适量70％酒精清洗种子，摇晃90s，倒掉酒精。之后倒入含有一滴吐温-20的50％的84消毒液，盖好管盖，置于摇床震荡，设置温度30℃、转速180r/min、时间40min。倒掉84消毒液，灭菌水清洗10次，直至澄清无异味。最后一次过夜浸泡。

2)水稻愈伤组织诱导。灭菌水清洗过夜的种子，用解剖刀沿糊粉层将胚剥下，接种于诱导培养基NBCIM上，置于光照培养箱或培养室诱导愈伤组织，设置温度30℃，光照周期为16h光照/8h黑暗。

3)愈伤组织的继代。光照培养10-14d后，挑选淡黄色、颗粒状、干燥、活力强的愈伤组织，将愈伤与胚芽分离，并且去掉多余的胚乳，于原培养基上继续培养。培养条件：温度30℃，光照周期为16h光照/8h黑暗。

4)愈伤组织预培养。将去芽的状态良好的愈伤组织转至NBCIM培养基上预培养3-5天。预培养结束后，将状态良好的、分裂旺盛的小颗粒用小勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染，每10mL愈伤组织，共培养两皿。

(2)农杆菌准备

1)农杆菌活化。于-80℃冰箱取出所需农杆菌EHA105，置于冰中，在超净工作台中打开甘油管，用无菌接种环将农杆菌接种于YP:AS培养基上，28℃黑暗培养24h。第一次活化培养24h之后，用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的YP:AS培养基上，28℃黑暗培养过夜，进行第二次活化。

2)农杆菌重悬。每升接种培养基中加入1mL As储存液(20mg/mL)，分装于50mL灭菌离心管中，每管25mL作为重悬液；用接种环将活化2次的农杆菌刮下，用重悬液重悬农杆菌，调整OD660至约0.10～0.20。

(3)农杆菌侵染及液体共培养

1)农杆菌侵染。向准备好的愈伤组织中，加入25mL农杆菌重悬液浸泡15min，其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉重悬液(尽量将液体滴净)，将愈伤组织置于垫有多张无菌滤纸的培养皿中，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的农杆菌菌液。

2)共培养。在90×25mm的一次性培养皿垫上三张无菌滤纸后加入2.5mL接种培养基(含终浓度为20mg/L的AS)，吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

3)恢复培养。共培养结束后，用一小勺将经共培养的愈伤组织均匀散布于恢复培养基中，每皿至少分成两皿于恢复培养基，使愈伤颗粒稀疏分布于恢复培养基。30℃光照培养5天左右，光照周期为16h光照/8h黑暗。从原来的愈伤组织生长脱落下的愈伤组织视为独立的转化体。

4)愈伤组织筛选。恢复培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上，每个培养皿接25粒愈伤组织，筛选培养条件为：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。

5)植株再生。在培养基上筛选3-4周之后，每个独立转化体挑选3～5颗生长状态良好、新鲜的抗性愈伤小颗粒，转至再生培养基上。每培养皿接5个独立转化体。30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。

6)植株生根。苗生长至长度2-5cm左右时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(丢弃已取过苗的愈伤组织，并在培养皿的底部做标记，以防止与未分化或未取苗的其它独立来源的愈伤组织混淆)。每个生根培养罐中接4个苗，每个生根指管接一个苗。30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。

(3)转化中所用试剂和培养基的配制：

1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；Carb(Carbenicillin，羧苄青霉素)；NAA(Napthaleneacetic acid，萘乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；Hyg(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)。

2)主要溶液配方：

1、N6 Majors母液[20倍浓缩液(20X)]的配制：(NH₄)₂SO₄ 9.26g、KNO₃ 56.60g、CaCl₂·2H₂O 3.32g、MgSO₄·7H₂O 3.70g及KH₂PO₄ 8.00g，逐一溶解，然后室温下定容至1000mL。

2、B₅ M1母液[100倍浓缩液(100X)]的配制：KI 0.075g、H₃BO₃ 0.3g、MnSO₄·H₂O 1g及ZnSO₄·7H₂O 0.2g，逐一溶解，然后室温下定容至1000mL。

3、B₅ M2母液[1000倍浓缩液(1000X)]的配制：Na₂MoO₄·2H₂O 0.25g、CuSO₄·5H₂O0.025g及CoCl₂·6H₂O 0.025g，逐一溶解，然后室温下定容至1000mL。

4、B₅ vitamins母液[100倍浓缩液(100X)]的配制：Myo-inositol 10g、Nicotinicacid 0.1g、Pyridoxine HCl 0.1g及Thiamine HCl 1g，逐一溶解，然后室温下定容至1000mL。

5、MS Iron母液[100倍浓缩液(100X)]的配制：Na₂EDTA·2H₂O 4.13g及FeSO₄·7H₂O 2.78g，逐一溶解，然后室温下定容至1000mL，避光搅拌三小时以上，最终pH＝7.98。

6、2,4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液：均为1mg/mL；AS贮存液的配制：称取2g AS溶于100mL DMSO。

3)用于水稻遗传转化的培养基配方：

1、NBCIM——愈伤组织诱导，继代及预培养培养基，其组成为：N6 Majors(20X)50mL、B5 M1(100X)10mL、B5 M2(1000X)1mL、B5 Vitamins(100X)10mL、MS Iron(100X)10mL、Glutamine 0.5g、Proline 0.5g、2,4-D(1mg/mL)2mL、Sucrose 30g、Phytagel 3g。

2、YP:As——农杆菌活化培养基，其组成为：Yeast extract 10g、Tryptone 10g、Nacl 5g、Kanamycin(50mg/mL)1mL、Rifampicin(10mg/mL)1.5mL、Acetosyringone(20mg/mL)1mL、Bacto-Agar 12g。

3、NB-Inoculation——愈伤组织转化农杆菌重悬液，液体共培养基，其组成为：N6Majors(20X)50mL、B5 M1(100X)10mL、B5 M2(1000X)1mL、B5 Vitamins(100X)10mL、MS Iron(100X)10mL、Proline 0.5g、2,4-D(1mg/mL)2mL、Sucrose 20g、Glucose10g、Acetosyringone(20mg/mL)1mL。

4、NB-REC——愈伤组织恢复培养基，其组成为：N6 Majors(20X)50mL、B5 M1(100X)10mL、B5 M2(1000X)1mL、B5 Vitamins(100X)10mL、MS Iron(100X)10mL、Glutamine0.5g、Proline 0.5g、Casein Hydrolysate Enzymatic 0.3g、2,4-D(1mg/mL)2mL、Carbenicillin(250mg/mL)1mL、Sucrose 30g、Phytagel 3g。

5、NB-SEL——愈伤组织筛选培养基，其组成为：N6 Majors(20X)50mL、B5 M1(100X)10mL、B5 M2(1000X)1mL、B5 Vitamins(100X)10mL、MS Iron(100X)10mL、Glutamine0.5g、Proline 0.5g、Sucrose 30g、2,4-D(1mg/mL)2mL、Carbenicillin(250mg/mL)1mL、Hyg-B(50mg/mL)1.4mL、Phytagel 3g。

6、NBNB-REG——愈伤组织再生培养基，其组成为：N6 Majors(20X)50mL、B5 M1(100X)10mL、B5 M2(1000X)1mL、B5 Vitamins(100X)10mL、MS Iron(100X)10mL、Sucrose30g、Sorbitol 30g、Carbenicillin(250mg/mL)0.5mL、Hyg-B(50mg/mL)0.4mL、NAA(1mg/mL)1.5mL、6-BA(1mg/mL)1mL、AA amino acids(10X)100mL、Phytagel 2.8g。

7、1/2MS Rooting——生根培养基，其组成为：MS basal salts 2.165g、B5Vitamins 100X10mL、Sucrose 20g、Carbenicillin(250mg/mL)0.5mL、NAA(1mg/mL)0.4mL、Phytagel3.5g

(2)过表达植株鉴定

跨启动子设计过表达载体转化阳性鉴定引物。1390-FP:5’-AGCCCTGCCTTCATACGCTA-3’(SEQ ID NO:7)，RP:5’-AAGGAGTAGGAGGCCGACAT-3’(SEQ ID NO:8)引物序列和琼脂糖电泳胶图见图6。

表4 PCR体系及程序

实施例3：ZlRc转基因水稻及种子表型观察

ZlRc转基因水稻与对照组日本晴于相同温室环境下种植，并予以相同浇水、施肥频率。试验用的土壤为中国南方水稻土，每方盒等量水稻土加等体积水，试验设3次重复。材料在正常水肥条件下生长至开始抽穗时拍照记录。材料在正常水肥条件下生长至正常结实并黄熟时，拍照记录。水稻结实并黄熟后，将谷粒与穗分开后晾干，手工去除谷粒颖壳。

ZlRc转基因水稻与对照组日本晴在相同的生长条件下，生长速度与抽穗、黄熟时间大致相同。谷粒去除颖壳后，ZlRc转基因水稻植株的种子呈红色或浅红色，对照日本晴植株种子为无色，如图10所示。ZlRc转基因水稻植株的种子相对对照材料表现出显著种皮颜色差异，且种子形态发生变化。

实施例4：ZlRc转基因水稻各部位ZlRc基因相对表达量的测定

转基因水稻抽穗完成后，取转基因水稻的根、茎、叶片、叶鞘、种子、花梗及对照组日本晴的叶片，放置于液氮中速冻备用。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)测定基因表达量，设计反应体系为：2×Go Taq Master Mix，12.5μL；5′定量引物，1.0μL；3′定量引物，1.0μL；cDNA，0.5μL；ddH₂O，10.0μL；共25μL。以UbQ5基因作为内参，扩增引物为UbQ5-5′和UbQ5-3′，测定ZlRc基因表达量，扩增引物分别为ZlRc-5′和ZlRc-3′。

引物序列如下：

PCR反应条件如下：

基因相对表达量采用公式2^-ΔΔCt计算，使用SAS进行邓肯法多重比较。检测结果如图9所示，由此可以看出ZlRc基因在转基因水稻根、茎、叶片、叶鞘、种子、花梗中均不同程度表达，在阴性对照中未检测到。ZlRc基因在茎中的相对表达量最高，在叶鞘中的最低。ZlRc基因在茎中的相对表达量为根的1.87倍，叶片的1.07倍，叶鞘的20.27倍，种子的1.82倍，花梗的1.55倍。

实施例5：ZlRc转基因水稻种子总酚、总黄酮和总原花青素含量测定

谷粒去壳后得到的ZlRc转基因水稻种子和对照组种子冷冻干燥至恒重后磨粉过100目筛。

种子总酚类化合物提取方法以及种子总酚、总黄酮和总原花青素含量检测方法来源于文章Comparison of the contents of phenolic compounds including flavonoidsand antioxidant activity of rice(Oryza sativa)and Chinese wild rice(Zizanialatifolia)。

(1)种子总酚类化合物提取

分别称取ZlRc转基因水稻种子粉末和对照组种子粉末0.2g(精度为0.0001)，加入5mL甲醇后，50℃条件下超声提取80min。混合物在低速离心机中4℃、15300×g离心10min。取上清液，过0.22μm极性滤膜，得到游离酚类提取物。向剩余滤渣中加入5mL 4mol/L NaOH溶液，在30℃、220r/min恒温振荡器中水解4h。将混合物在4℃、15300×g的条件下离心10min，收集上清于40mL的玻璃离心管中。用6mol/L HCl调节上清液pH至1.5～2.0，用30mL乙酸乙酯萃取结合酚3次。将3次得到的乙酸乙酯混合液于旋转蒸发仪上35℃旋转蒸干后，加入5mL甲醇超声复溶，过0.22μm极性滤膜得到结合酚提取物，4℃下保存。测量时将等量(1mL)的游离酚和结合酚提取液混合，得到总酚化合物溶液。

(2)种子总酚含量测定

总酚含量测定采用福林酚比色法。向250μL稀释三倍的folin-ciocalteu溶液中加入250μL样品溶液混匀，室温反应5min后加入1mL超纯水和250μL 20％Na₂CO₃，充分混匀避光反应30min，4℃3000r/min离心10min。取200mL上清液于96孔板，在酶标仪中测量其在725nm处的吸光度。每个样品重复测定3次，实验以无水甲醇为空白对照，以没食子酸(GA)为标准品建立标准曲线。每个样品中的总酚含量以每100g水稻种子粉末的当量没食子酸毫克数(mg GAE/100g)的表示。

(3)种子总黄酮含量测定

反应在96孔板中进行。向10μL 5％NaNO₂水溶液中加入50μL样品提取液，混匀后室温反应5min。加入10％AlCl₃水溶液10μL混匀，室温反应1min。加入100μL 0.5M NaOH溶液，反应10min，测定其在510nm处的吸光度。每个样品重复测定3次，实验以无水甲醇为空白对照，以儿茶素(C)为标准品建立标准曲线。每个样品中的总黄酮含量以每100g水稻种子粉末的当量儿茶素毫克数(mg CE/100g)表示。

(4)种子总原花青素含量测定

反应在96孔板中进行。向100μL香兰素甲醇溶液(30g/mL，W/V)中加入20μL样品，再加入100μL硫酸甲醇溶液(30％浓硫酸，V/V)，室温暗处反应5min，用酶标仪测定其500nm下的吸光度。每个样品重复测定3次，实验以无水甲醇为空白对照，以儿茶素(C)为标准品建立标准曲线。每个样品中的总酚含量以每100g水稻种子粉末的当量儿茶素毫克数(mg CE/100g)表示。

检测结果如图11所示，ZlRc转基因水稻的种子总酚含量、总黄酮含量和总原花青素含量显著高于对照植株。ZlRc转基因水稻的种子，其总酚含量、总黄酮含量和总原花青素含量平均为阴性对照植株种子的1.38、1.21、1.55倍。

实施例5：ZlRc转基因水稻种子DPPH自由基清除能力、ABTS^·+自由基吸收能力测定

种子DPPH自由基清除能力、ABTS^·+自由基吸收能力检测方法来源于文章Comparison of the contents of phenolic compounds including flavonoids andantioxidant activity of rice(Oryza sativa)and Chinese wild rice(Zizanialatifolia)。

(1)种子DPPH自由基清除能力测定：反应在96孔板中进行，将50μL样品添加到150μL 0.5mM DPPH甲醇溶液中。混合后30℃条件下暗反应30分钟，并使用酶标仪测量其在517nm处的吸光度。甲醇作空白对照，维生素E甲醇溶液为标准品。对每个样品重复测定3次，DPPH自由基清除能力表示为100g水稻种子粉末的当量维生素微摩尔数(μmol TE/100g)。

(2)种子ABTS^·+自由基吸收能力测定：将以1.1mg/mL的ABTS甲醇溶液与0.68mg/mL过硫酸钾水溶液等量混合，于暗室中过夜得到ABTS^·+试剂，甲醇稀释，调整吸光度为0.700±0.020。反应在96孔板中进行，将50μL样品添加到150μL ABTS^·+溶液中。混30℃条件下暗反应30分钟，并使用酶标仪测量其在734nm处的吸光度。甲醇作空白对照，维生素E甲醇溶液为标准品。对每个样品重复测定3次，ABTS^·+自由基吸收能力表示为100g水稻种子粉末的当量维生素微摩尔数(μmol TE/100g)。

检测结果如图11所示，由此可以看出ZlRc转基因水稻的种子DPPH自由基清除能力、ABTS^·+自由基吸收能力显著高于对照植株。ZlRc转基因水稻的种子，其DPPH自由基清除能力、ABTS^·+自由基吸收能力平均为阴性对照植株种子的1.41倍和1.10倍。

本发明ZlRc转基因水稻的种子，其总酚含量、总黄酮含量和总原花青素含量显著高于对照植株，同时以及DPPH自由基清除能力和ABTS^·+自由基吸收能力均显著上升。值得关注的是，过表达ZlRc基因对水稻种子总原花青素含量的提升作用最为突出，说明ZlRc基因在水稻中过表达对原花青素类化合物的合成途径具有有效调控作用，有效提高了水稻种子中的原花青素含量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

合肥戬谷生物科技有限公司

<120> 中国菰ZlRc基因在提高水稻种子原花青素含量中的应用

<141> 2021-12-01

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1971

<212> DNA

<213> Zizania latifolia

<400> 1

atgcacgcca tggccggcgg cgaggctcag gtggcgctgc aggcggtggc gcagggcctc 60

cgctggacgt acagcctcct ctggtacctc tgccggcacc aagggaccgc gctggtgtgg 120

gcggaggggc actacaacgg tgccgtcaag acgcgcaaga cggtgcagcc tccggcggcg 180

gtggcggcgg gggcggagga ggactctgcc gaccacgcgg cgcgccacag gagccggcag 240

ctgcgggagc tctacgactg gctggcgggg gaggcagccg ccgctggcgg aggcgccgga 300

ggaacagcaa cggggagcgg cggcggcgtg caggcggccg cgagctgcag gcgcccgagc 360

gcggcgctgt cgccggagga cctgacggag accgagtggt tcttcctcat gtcggcctcc 420

tactccttcc cttccggcgt cgggttacct ggaagggcat ttgcaagggg aaggcatgta 480

tggctcactg gagcaaatga agttgacagc aaagtatttc taagagcaat ccttgcaaag 540

acagtcgtgt gtattcctat cgtcgatggt gtcctggaaa tcggaactac agaaaaggtg 600

gaggaagatg cagggttagt tcagtatgca aggagcatct tcatggatca ccatggcata 660

cacatgaagc ctaccctctc tgaacattca acatccaacc cggtagcaca catggatcaa 720

cagtcaagcc aggtgcagat gcagaaatgc accggccaga caaagatgga ttcagatgag 780

ctcaatccag aagacgagga cgacgaaaca gagaacgacg acgagggctt atcaggttca 840

gaaacttatt acactgacac tgtcaggaac tcgagccagg tgcaaacccc actgaacatg 900

gtgagcaatg gccggacaac gccaaatgta ggtaccagtg aactaatgca gtgtgacatg 960

tcagaggttg tgagagatgg ctgctcaaac aatctggagg aagaaatcca aatgctgatg 1020

gactgccaaa atagtaatgg ccagttcaat ttgcaggggc ctgatgagcc ctgtcactct 1080

tggcattttc tttatgaaga gctaaatggt tgcctgccag gtgcagaaga tcaagtgaca 1140

tcacctgaaa attcccacta cccacaaacg ctcttgacaa tcctacagtt caatgcgcgg 1200

cgacaaacag aattaaacat caagaactac ctgccagttt cagagaaatc atcattctcc 1260

agatggaacc ataaaggaat tgctgataat cagggcatga tcacacaagg caccccacag 1320

agaatgctca ggagtatcct gatgaatgct cccagtagtc actgcagcta caaggaagcc 1380

caaacaccca aatcaagggg cgggaaaggc gcaaatgggt tgcgcaaaat cggcactgtc 1440

caaggggatt tcagtgctaa tcatgtgctg aaagaaagaa aaagaagaga gaagcttaat 1500

gagaagttca taattctgag atctttggtg cctttcatga caaagatgga caagacctca 1560

atacttggtg acacgatcga gtacgtgaag cagttaagga agcgcataca ggacctcgag 1620

tcacgagctc ggccggcgac cacgacggcc aggaagcgga gggggcgcgc ggcggaaggc 1680

agcagcagca gcgctgccgc cgtcgccggc ggcgaaacgg aggtgcaggt gtccatcatc 1740

gagagcgacg cgctgctgga gctgcggtgc ggttgccggg acggtctgct gctccgggtg 1800

atgcaggcgc tgcaggagct ccagctcgag gtcaccgccg tgcaggcctc gtcggccgac 1860

ggcgtgttgg tcgccgagct ccgcgccaag gtgaaggagg cgcgcgggag gaggaagagc 1920

agcatttctc aggtgaagag ggcaatccat cttgtcctct cctcaccatg a 1971

<210> 2

<211> 656

<212> PRT

<213> Zizania latifolia

<400> 2

Met His Ala Met Ala Gly Gly Glu Ala Gln Val Ala Leu Gln Ala Val

1 5 10 15

Ala Gln Gly Leu Arg Trp Thr Tyr Ser Leu Leu Trp Tyr Leu Cys Arg

20 25 30

His Gln Gly Thr Ala Leu Val Trp Ala Glu Gly His Tyr Asn Gly Ala

35 40 45

Val Lys Thr Arg Lys Thr Val Gln Pro Pro Ala Ala Val Ala Ala Gly

50 55 60

Ala Glu Glu Asp Ser Ala Asp His Ala Ala Arg His Arg Ser Arg Gln

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Tyr Asp Trp Leu Ala Gly Glu Ala Ala Ala Ala Gly

85 90 95

Gly Gly Ala Gly Gly Thr Ala Thr Gly Ser Gly Gly Gly Val Gln Ala

100 105 110

Ala Ala Ser Cys Arg Arg Pro Ser Ala Ala Leu Ser Pro Glu Asp Leu

115 120 125

Thr Glu Thr Glu Trp Phe Phe Leu Met Ser Ala Ser Tyr Ser Phe Pro

130 135 140

Ser Gly Val Gly Leu Pro Gly Arg Ala Phe Ala Arg Gly Arg His Val

145 150 155 160

Trp Leu Thr Gly Ala Asn Glu Val Asp Ser Lys Val Phe Leu Arg Ala

165 170 175

Ile Leu Ala Lys Thr Val Val Cys Ile Pro Ile Val Asp Gly Val Leu

180 185 190

Glu Ile Gly Thr Thr Glu Lys Val Glu Glu Asp Ala Gly Leu Val Gln

195 200 205

Tyr Ala Arg Ser Ile Phe Met Asp His His Gly Ile His Met Lys Pro

210 215 220

Thr Leu Ser Glu His Ser Thr Ser Asn Pro Val Ala His Met Asp Gln

225 230 235 240

Gln Ser Ser Gln Val Gln Met Gln Lys Cys Thr Gly Gln Thr Lys Met

245 250 255

Asp Ser Asp Glu Leu Asn Pro Glu Asp Glu Asp Asp Glu Thr Glu Asn

260 265 270

Asp Asp Glu Gly Leu Ser Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Thr Asp Thr Val

275 280 285

Arg Asn Ser Ser Gln Val Gln Thr Pro Leu Asn Met Val Ser Asn Gly

290 295 300

Arg Thr Thr Pro Asn Val Gly Thr Ser Glu Leu Met Gln Cys Asp Met

305 310 315 320

Ser Glu Val Val Arg Asp Gly Cys Ser Asn Asn Leu Glu Glu Glu Ile

325 330 335

Gln Met Leu Met Asp Cys Gln Asn Ser Asn Gly Gln Phe Asn Leu Gln

340 345 350

Gly Pro Asp Glu Pro Cys His Ser Trp His Phe Leu Tyr Glu Glu Leu

355 360 365

Asn Gly Cys Leu Pro Gly Ala Glu Asp Gln Val Thr Ser Pro Glu Asn

370 375 380

Ser His Tyr Pro Gln Thr Leu Leu Thr Ile Leu Gln Phe Asn Ala Arg

385 390 395 400

Arg Gln Thr Glu Leu Asn Ile Lys Asn Tyr Leu Pro Val Ser Glu Lys

405 410 415

Ser Ser Phe Ser Arg Trp Asn His Lys Gly Ile Ala Asp Asn Gln Gly

420 425 430

Met Ile Thr Gln Gly Thr Pro Gln Arg Met Leu Arg Ser Ile Leu Met

435 440 445

Asn Ala Pro Ser Ser His Cys Ser Tyr Lys Glu Ala Gln Thr Pro Lys

450 455 460

Ser Arg Gly Gly Lys Gly Ala Asn Gly Leu Arg Lys Ile Gly Thr Val

465 470 475 480

Gln Gly Asp Phe Ser Ala Asn His Val Leu Lys Glu Arg Lys Arg Arg

485 490 495

Glu Lys Leu Asn Glu Lys Phe Ile Ile Leu Arg Ser Leu Val Pro Phe

500 505 510

Met Thr Lys Met Asp Lys Thr Ser Ile Leu Gly Asp Thr Ile Glu Tyr

515 520 525

Val Lys Gln Leu Arg Lys Arg Ile Gln Asp Leu Glu Ser Arg Ala Arg

530 535 540

Pro Ala Thr Thr Thr Ala Arg Lys Arg Arg Gly Arg Ala Ala Glu Gly

545 550 555 560

Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala Val Ala Gly Gly Glu Thr Glu Val Gln

565 570 575

Val Ser Ile Ile Glu Ser Asp Ala Leu Leu Glu Leu Arg Cys Gly Cys

580 585 590

Arg Asp Gly Leu Leu Leu Arg Val Met Gln Ala Leu Gln Glu Leu Gln

595 600 605

Leu Glu Val Thr Ala Val Gln Ala Ser Ser Ala Asp Gly Val Leu Val

610 615 620

Ala Glu Leu Arg Ala Lys Val Lys Glu Ala Arg Gly Arg Arg Lys Ser

625 630 635 640

Ser Ile Ser Gln Val Lys Arg Ala Ile His Leu Val Leu Ser Ser Pro

645 650 655

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgcacgcca tggcc 15

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tcatggtgag gagaggacaa g 21

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

caggtcgact ctagaggatc catgcacgcc atggccggc 39

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ttgcggactc tagaggatcc ttgattcttg attccgaaat ct 42

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

agccctgcct tcatacgcta 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gccggccatg gcgtgcat 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aaggcacccc acagagaatg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tttgggtgtt tgggcttcct 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

accacttcga ccgccactac t 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

acgcctaagc ctgctggtt 19

Claims

1.中国菰ZlRc基因在提高水稻种子原花青素含量中的应用，其特征在于，所述ZlRc基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述具有同等功能的核苷酸序列与SEQ IDNo.1所示的全长序列之间至少有99％的同一性。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZlRc基因编码的蛋白质序列如SEQ IDNo.2所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将ZlRc蛋白的过表达载体转入水稻中，得到能够过表达ZlRc的转基因水稻。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将ZlRc基因序列构建到1390-UBI过表达载体上，将所述过表达载体转入水稻中，通过提高该基因mRNA的表达量而获得种子原花青素含量显著提高的转基因水稻植株。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述过表达载体通过化学转化方式转化到农杆菌中，通过农杆菌浸染愈伤组织的方式，获得独立转化体，通过植株再生，得到所述转基因水稻。