CN110195060B

CN110195060B - 利用BnaA06FUL1基因改良油菜抗裂角性

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Publication number: CN110195060B
Application number: CN201910325759.XA
Authority: CN
Inventors: 胡琼; 成洪涛; 郝梦宇; 丁炳莉; 梅德圣; 汪文祥; 刘佳; 王会; 周日金
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2039-04-23
Also published as: CN110195060A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及利用BnaA06FUL1基因改良油菜抗裂角性。分析了甘蓝型油菜BnaA06FUL1基因组织表达和抗裂角易裂角材料中差异表达情况，通过构建植物转化载体，过表达BnaA06FUL1基因来转化甘蓝型油菜，改良甘蓝型油菜的抗裂角性，但不影响其它性状。本发明克隆的BnaA06.FUL1的核苷酸序列如SEQ：ID NO：1所示。本发明以甘蓝型油菜作为受体，通过农杆菌介导的转化方法获得过表达油菜BnaA06FUL1基因的抗裂角性状的转基因植株。BnaA06FUL1基因可在改良农作物特别是甘蓝型油菜的抗裂角能力中的应用。

Description

利用BnaA06FUL1基因改良油菜抗裂角性

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及利用BnaA06FUL1基因改良油菜抗裂角性的方法。

背景技术

油菜是我国第一大植物油来源，菜籽油占国产植物油产量的55％，我国也是世界油菜生产大国，总产约占全球的20％左右(Hu et al.,2017)。增加油菜种植面积，提高油菜产量对保障我国食用植物油供给安全意义重大。然而，由于目前油菜生产中机械化程度较低、人工成本不断提高，导致油菜种植效益逐渐下滑，严重影响了油菜生产发展。油菜角果易开裂是目前制约油菜机械化收获的瓶颈，严重制约了生产效益的提高。油菜品种大部分在成熟期角果易开裂，一般可造成10％以上的损失，机械化收割损失将更大(Wang etal.,2007；Andrea et al.,2016)。因此，发掘优良抗裂角基因，对于培育油菜适应机械化生产的抗裂角品种具有重要意义。数据显示，由于目前油菜抗裂角研究大部分集中在遗传定位，分子机制研究不透彻，借助于拟南芥的研究结果能够加快油菜抗裂角性的改良。

FUL基因属于MADS-box转录因子家族，同时参与花序分生组织的形成、花器官发育、种子及叶片发育等多个生理过程(Theissen et al.,2000)。研究表明，FUL参与调控芽顶端分生组织向花序分生组织的转变，并通过诱导花序分生组织转变为花分生组织，控制开花时间。在拟南芥中FUL基因参与调控角果的伸长和果荚的开裂，同时影响植物的开花时间。在芥菜型油菜中过量表达拟南芥FUL基因可以提高角果的抗裂性(

etal.,2006)，在拟南芥中过量表达油菜1个FUL基因拷贝提高了角果的抗裂角性，但开花时间也显著提早(彭鹏飞等，2016)。FUL在果瓣和胚座框表达，抑制离区向果瓣和胚座框的发展(Kay et al.,2012)。研究者认为拟南芥基因组经过了多达3次的多倍化过程，并且最后一次接近于芸薹属的产生。油菜和拟南芥分化之后，又有自己独立的三倍化事件，所以导致拟南芥的基因在油菜中有2-6个甚至更多的同源基因。同源基因在不同的物种中都存在功能分化，如在番茄中过表达FUL同源基因SlFUL2的植株表现果皮变薄，而过表达SlFUL1的植株则没有出现表型的明显变化，说明在二倍体番茄中FUL基因功能已经存在分化(Wanget al.,2014)。在更复杂的异源四倍体油菜，FUL基因拷贝更多，不同同源拷贝的具体功能尚不明确。此外，油菜与拟南芥的表型差异很大，就角果而言，油菜角果胎座框没有突出果瓣而具有较长的果喙，拟南芥角果中胎座框有部分露出于果瓣，表明二者在角果发育的调控方面存在差异，相关调控基因的功能和作用也不同。甘蓝型油菜中有6个FUL的同源拷贝，从不同FUL基因拷贝中找到调控抗裂角且不影响花期的拷贝基因则对油菜抗裂角遗传改良具有创新意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用油菜抗裂角调控基因BnaA06FUL1提高油菜抗裂角性。本发明提供了BnaA06FUL1基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列。实施例中，本发明将过表达油菜BnaA06FUL1基因的载体用于转化甘蓝型油菜品种中双6号，使甘蓝型油菜品种中双6号表现出抗裂角性增强，而不改变开花时间。

本发明首先鉴定到拟南芥AtFUL基因在甘蓝型油菜中六个同源拷贝，结合比较抗裂角材料和易裂角材料中甘蓝型油菜FUL基因的表达量以及组织表达谱，筛选到BnaA06FUL1基因，并进一步通过遗传转化，确定了BnaA06FUL1基因可以提高半冬性甘蓝型油菜中双6号的抗裂角性，并且不改变半冬性甘蓝型油菜的开花时间。本发明首次通过同源基因序列和抗易裂角材料表达量分析，明确了甘蓝型油菜中BnaA06FUL1基因调控抗裂角性但不影响开花时间，并通过超表达该基因提高了油菜的抗裂角性。经文献查新，国内外未见有关利用甘蓝型油菜该FUL基因提高油菜抗裂角性的研究报道，也未见相关的专利技术公开或使用。

本发明还包括：油菜BnaA06FUL1基因的分离、克隆与转基因抗裂角材料的鉴定等。

本发明的技术方案通过以下方法实现：

1、油菜BnaA06FUL1基因的来源

前期通过拟南芥FUL基因的序列(登录号AT5G60910)在甘蓝型油菜Damor基因组中做Blast分析，找到匹配好的共6条序列，其中于A基因组上共鉴定到3条FUL基因同源拷贝序列。在甘蓝型油菜中双 11号材料中检测6个基因在各组织中的表达量，发现BnaA06FUL1基因在角果相关的花蕾、柱头及角果皮材料中有较高的表达水平。见图1所示。进一步通过比较抗裂角材料和易裂角材料中甘蓝型油菜FUL 基因的表达量，发现BnaA06FUL1基因在抗裂角材料R1中的表达量随着角果发育基本维持不变，而在易裂角材料R2中则呈现出下降趋势；并且在角果发育到开花18天和20天时，BnaA06FUL1基因在抗裂角材料R1中的表达量显著高于易裂角材料R2中的表达量。见图2所示。

通过PCR扩增方法获得了BnaA06FUL1基因的cDNA全长。根据Damor基因组预测的FUL基因的 CDS序列信息设计引物，扩增BnaA06FUL1的全长CDS序列。其中：扩增BnaA06FUL1的全长编码序列的引物序列为：(正向引物A6FUL1F1:ATGGGAAGGGGTAGGGTTCA；反向引物A6FUL1R1:

CTATTCATTCGTCGTAGGGC)。从甘蓝型油菜品种中双6号的cDNA序列中克隆得到油菜

BnaA06FUL1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列全长为726bp，编码241个氨基酸残基，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

上述油菜BnaA06FUL1基因编码的蛋白具有典型的MADS-box和K-box结构域(见图3)。

2、过表达油菜BnaA06FUL1基因载体的构建

本发明使用的油菜BnaA06FUL1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)。以 PBI121载体作为表达的基础载体，利用限制性内切酶酶切位点BamHI将油菜BnaA06FUL1基因序列分别插入到PBI121载体35S组成型启动子的下游，得到过表达油菜BnaA06FUL1基因的表达载体。该表达载体的结构图如图4所示。

3、油菜BnaA06FUL1基因的转化试验及DNA检测

本发明以甘蓝型油菜品种中双6号作为转基因的受体，利用农杆菌介导的侵染方法将油菜 BnaA06FUL1基因过表达载体导入到切短的甘蓝型油菜品种中双6号的下胚轴中，用卡那霉素(见实施例)筛选阳性植株，获得过表达油菜BnaA06FUL1基因的转基因植株。将油菜BnaA06FUL1基因转化处理的甘蓝型油菜品种中双6号移栽到生长间，于苗期取叶片用常规的CTAB方法提取基因组DNA。以转化载体中的标记引物NPTII(正向引物NPTIIF:GATGGATTGCACGCAGGT；反向引物 NPTIIR:TCGTCAAGAAGGCGATAGA)进行PCR扩增，检测转化材料的阳性，最终获得阳性植株。

4、转化BnaA06FUL1基因油菜的表达量的检测

用通用的Trizol法抽提甘蓝型油菜中双6号幼嫩单株叶片的RNA，通过反转录，设计扩增 BnaA06FUL1基因特异的检测引物扩增cDNA片段。同时以油菜BnaActin基因(BnaC02g00690D)作内参，扩增引物为(正向引物BnaActinF:TCTGGCATCACACTTTCTACAACGAGC；反向引物BnaActinR: CAGGGAACATGGTCGAACCACC)，分析BnaA06FUL1基因表达量的变化情况。在BnaA06FUL1转基因植株中的表达量比对照甘蓝型油菜品种中双6号均有明显升高。结果见图5所示。

5、利用随机碰撞法检测甘蓝型油菜转BnaA06FUL1基因植株的抗裂角性

在转BnaA06FUL1基因植株T₁家系成熟期考察每个家系阳性单株和阴性单株的抗裂角指数(SRI)，鉴定方法参考行业标准(中华人民共和国农业部发布：农业行业标准，标准编号NY/T 3066-2016)。对每一份转基因材料重复3次。利用公式：裂角指数＝∑Xi×(6-i)/角果数×总次数计算裂角指数，其中 Xi为第i次破损的角果数，1≤i≤5，抗裂角指数＝1-裂角指数。随机碰撞结果显示，转BnaA06FUL1基因植株家系阳性单株均表现出非常好的抗裂角性，而阴性单株则没有明显差异(见图6、图7)。

6、利用拉力法检测甘蓝型油菜BnaA06FUL1基因转基因植株的抗裂角性状

角果拉力法测定参照前人报道的方法(谭小力等，2006)，采用山度SH-100拉力仪测定转基因材料的抗拉力值。拉力法测定结果显示，BnaA06FUL1基因转基因阳性家系相比对照，均表现出非常好的抗拉力性(见图8所示)。

附图说明

图1：BnaA06FUL1基因在甘蓝型油菜中双11号(即，ZS11)各个组织中的表达量的检测。附图标记说明：标记Rt为根；Hp为下胚轴；Cd为子叶；St为茎；Lf为叶；Bd为花蕾；Pi为柱头；Sm为雄蕊；Pe 为花瓣；Pd为小角果。

图2：BnaA06FUL1基因在抗裂角和易裂角材料中的表达量的检测。附图标记说明：标记R1为抗裂角材料；R2为易裂角材料；10、16、18、20、22为开花后实际天数取样的角果。

图3：BnaA06FUL1蛋白结构示意图。

图4：BnaA06FUL1超量表达载体构建示意图。

图5：BnaA06FUL1转化甘蓝型油菜植株表达量检测。

图6：油菜BnaA06FUL1转基因植株家系1的抗裂角性明显增强。附图标记说明：其中“-”为阴性单株。

图7：油菜BnaA06FUL1转基因植株家系2的抗裂角性明显增强。附图标记说明：其中“-”为阴性单株。

图8：油菜BnaA06FUL1转基因甘蓝型油菜植株的抗拉力性明显增强。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是BnaA06FUL1基因的核苷酸序列(其中1-723bp是该基因的编码区)。

序列表SEQ ID NO:2是BnaA06FUL1基因编码的蛋白质序列。

实施例1基因的分离及克隆

取甘蓝型油菜中双11号(ZS11)的根、下胚轴、子叶、茎、苔茎叶、花蕾、柱头、雄蕊、萼片和角果样，加入液氮研磨，取0.1g粉末左右到RNAase free的离心管中，加入1mlTrizol试剂(宝生物工程大连有限公司)，混匀后室温放置5分钟，然后加入200μl的氯仿，剧烈震荡30次，静置至液相分层后，4℃12000rpm离心15分钟，吸取上清约500μl到一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温放置15分钟，4℃10000rpm离心10分钟，倒掉上清加入75％乙醇洗涤1次，吹干后加入DEPC水溶解，获得RNA样；同时取甘蓝型油菜抗裂角品种R1和易裂角品种R2，在开花后10、16、18、20和22天的角果样，用同样的方法抽提RNA样。采用试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，按试剂盒说明书操作)进行反转录，获得cDNA样品。以引物(正向引物A6FUL1F3:TGGAAAGGATACTTGAGCGA；反向引物A6FUL1R3:AGCTTGGATGCTACGTTCAA)扩增油菜BnaA06FUL1基因的部分片段。结果显示，BnaA06FUL1基因在花蕾、柱头及角果皮中有较高的表达量，同时在开花18天和20天，抗裂角R1 中的表达量相比易裂角材料R2中要高，见图1，图2。设计全长扩增引物(正向引物A6FUL1F1:ATGGGAAGGGGTAGGGTTCA；反向引物A6FUL1R1:CTATTCATTCGTCGTAGGGC)扩增 BnaA06FUL1基因CDS序列。经测序，其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2转化载体的构建

用带酶切位点BamHI的引物(A6FUL1F2：GGATCCATGGGAAGGGGTAGGGTTCA反向引物A6FUL1R2:GGATCCCTATTCATTCGTCGTAGGGC)克隆油菜BnaA06FUL1基因的CDS片段，用限制性内切酶BamHI酶切，然后用琼脂糖凝胶电泳，再利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京) 有限公司)回收该片段。用限制性内切酶BamHI酶切植株过表达载体PBI121，加入去磷酸化酶SAP去磷酸化，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段，将酶切好的外源片段和载体片段用DNA T4连接酶连接。采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，将连接产物加入感受态后，冰上放置30min， 42℃水浴90s，加入400μl的LB液体培养基，37℃摇床复苏30min，菌体离心后涂布于含有卡那霉素 50mg/L的平板上。挑取大肠杆菌单菌落，在加入有卡那霉素的LB培养基中培养，然后抽提质粒，酶切及测序验证阳性，最后将油菜BnaA06FUL1基因插入到35S启动子的下游。见图3。

实施例3利用转化载体转化根癌农杆菌

取1μl的油菜BnaA06FUL1基因过表达载体质粒DNA加入到50μl的GV3101感受态细胞中，冰浴30 min，加液氮迅速冷冻5min，37℃水浴5min，加入500μl的LB液体培养基，菌体离心后涂布于含有卡那霉素50mg/L、利福平25mg/L和链霉素25mg/L的YEP平板上，28℃培养2天。挑取鉴定结果为阳性的农杆菌单菌落，接种至含有上述浓度抗生素的YEP培养液中，28℃，200rpm摇床培养16个小时，使农杆菌培养至对数期，用含蔗糖30g/L的液体MS(MS基本培养基参见：Murashige和Skoog，1962年发表的文献，MS基本培养基是本领域的公知常识)培养基将其重悬至OD₆₀₀为0.3-0.4。

实施例4转基因甘蓝型油菜植株的获得

本实施例采用甘蓝型油菜中双6号下胚轴为受体材料。具体操作步骤为：取甘蓝型油菜中双6号种子若干，去除干瘪破损的种子，用75％的酒精灭菌4min，再用0.1％HgCl₂表面灭菌15min，用无菌水冲洗6-8次，种子吸干水分后，置于1/2MS基本培养基(每升含1/2MS培养基和琼脂7.5g，PH6.0，此处 1/2MS是指MS基本培养基中的无机盐成分减半)上暗培养发芽4-5天，取出无菌幼苗，将下胚轴切成 1cm左右的片段，将培养到一定浓度的农杆菌菌液侵染油菜下胚轴30分钟，期间每隔五分钟左右摇动一次三角瓶，将外植体转至放有灭菌滤纸的空培养皿中，铺开，用小滤纸片将菌液吸干后，将外植体转到M1培养基(每升培养基中含MS基本培养基和30g蔗糖，18g甘露醇，1mg 2,4-D，0.3mg激动素， 100μM乙酰丁香酮，7.5g琼脂糖,pH 5.8)中，，24℃暗培养两天(48h)；将共培养两天的外植体转入M2培养基(每升含MS培养基和30g蔗糖，18g甘露醇，1mg 2,4-D，0.3mg激动素，20mg AgNO3， 7.5g琼脂糖，并加入25mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素,pH 5.8)，在光温可控的培养室(光照16h，黑暗8h，温度24℃)培养三周，然后将外植体转入M3培养基(每升培养基含MS基本培养基和 10g葡萄糖，0.25g/木糖，0.6g MES，2mg玉米素，0.1mg吲哚乙酸(IAA)，7.5g琼脂糖，并加入25mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素，pH 5.8)，继续以上述条件进行光照培养，每两周继代一次以保证营养充分，一般在第二次继代后可看到分化出小苗子；将长出小苗子的愈伤组织移入一灭菌的空皿中，用镊子和手术刀将苗子从愈伤组织上切下来(尽量切干净)，转入M4培养基(每升培养基含MS基本培养基和10g蔗糖，7.5g琼脂粉,pH 5.8)以上述条件进行光照培养，约三到四周再生苗生根，得到再生植株。

实施例5对转基因植株的阳性检测

在2ml离心管中加入0.1g左右的新鲜甘蓝型油菜叶片，加入600μl的1.5％的CTAB溶液(彭鹏飞等， 2016)，将样品打碎，放入到65℃的水浴锅中30分钟，期间摇动3次，取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24：1)，摇匀，在室温10000rpm离心10分钟，吸取上清至另一洁净的离心管中，加入2倍体积的95％的乙醇溶液，轻缓颠倒混匀，-20℃放置30分钟以上，12000rpm离心 15分钟，用75％浓度的乙醇溶液洗涤沉淀一次，吹干后加100μl的双蒸水。取前述的甘蓝型油菜叶片 DNA 1μl进行PCR扩增，PCR扩增的体系：DNA1μl，2×PCR mix 10μl，引物F及R各0.5μl，水8μl，总体积20μl；PCR扩增的条件：95℃3min后，95℃30s，57℃30s，72℃30s，28个循环，之后用72 ℃5min。NPTII引物的序列(正向引物NPTIIF:GATGGATTGCACGCAGGT；反向引物 NPTIIR:TCGTCAAGAAGGCGATAGA)，PCR产物凝胶电泳检测后，获得BnaA06FUL1转基因阳性植株。

实施例6转基因植株BnaA06FUL1基因的表达量检测

取新鲜的甘蓝型油菜叶片加入液氮研磨，取0.1g左右粉末到RNAase free的离心管中，加入1ml Trizol试剂，混匀后室温放置5分钟，然后加入200μl的氯仿，剧烈震荡30次，放置至液相分层，然后4 ℃12000rpm离心15分钟，吸取上清约500μl到一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温放置15 分钟，4℃10000rpm离心10分钟，倒掉上清加入75％乙醇洗涤1次，吹干后加入DEPC水溶解，测定浓度后进行反转录。以引物(正向引物A6FUL1F3:TGGAAAGGATACTTGAGCGA；反向引物A6FUL1R3: AGCTTGGATGCTACGTTCAA)扩增油菜BnaA06FUL1基因的部分片段；同时以引物(BnaActinF: TCTGGCATCACACTTTCTACAACGAGC；BnaActinR:CAGGGAACATGGTCGAACCACC)扩增油菜BnaActin基因作内参，分析BnaA06FUL1基因表达量的变化情况。

实施例7利用随机碰撞法测定BnaA06FUL1转基因材料抗裂角性

种植的转BnaA06FUL1基因T₁家系，成熟期考察每个家系单株的抗裂角指数(SRI)，鉴定方法参考中华人民共和国农业行业标准(标准编号NY/T 3066-2016，中华人民共和国农业部发布)。具体为将油菜角果在42℃烘干8hr，室温封闭保存后，放入圆柱容器，圆柱容器中放置8个钢珠；采用型号为 HQ45Z摇床，以280rpm转速对圆柱容器进行震荡处理，每两分钟观察一次，共观察5次，每份材料重复3次，利用公式：裂角指数＝∑Xi×(6-i)/角果数×总次数计算裂角指数，Xi为第i次破损的角果数，1≤i≤5，抗裂角指数＝1-裂角指数。随机碰撞结果显示，转BnaA06FUL1基因植株家系阳性单株均表现出非常好的抗裂角性，而阴性单株则没有明显差异，见图6和图7。

实施例8利用拉力法测定BnaA06FUL1转基因材料的抗裂角性

角果拉力法测定参照前人方法(谭小力等，2006)，BnaA06FUL1转基因材料每株抽取10个角果，测定前将角果用胶水粘在木板上，并使角果假隔膜所在平面与木板平面平行，角果基部与木板边沿对齐，角果柄悬于木板之外。将山度SH－100拉力仪的L形钩置于角果和果柄的结合处，让拉力仪与角果呈直角，左手压住木板，右手将拉力仪匀速向上提拉，随着拉力仪缓慢向上移动，所需力值逐渐增大，在拉开角果的瞬间达到最大值，同时拉力仪将最大力值记录下来。测试结果显示，BnaA06FUL1 基因转基因阳性家系抗拉力值在2-3N之间，接近3N，而对照则只有不到1N(图8)。该结果表明， BnaA06FUL1基因转基因材料显著提高了角果抗拉力值。

参考文献

1.彭鹏飞等，过表达BnFUL基因对拟南芥花和角果发育的影响.中国油料作物学报，2016,38:13-18；

2.谭小力等，油菜角果裂角力的定量测定.农业工程学报，2006，22:40-43；

3.Andrea C,K.Neil H,Linda M.Evaluation of the causes of on-farmharvest losses in canola in the northern great plains.Crop Science,2016,56:2005-2015；

4.Hu Q,Hua W,Yin Y,Zhang X,Liu L,Shi J,Zhao Y,Qin L,Chen C,WangH.Rapeseed research and production in China.The Crop Journal,2017,5:127-135；

5.Kay P,Groszmann M,Ross JJ,Parish RW,Swain SM.Modifications of aconserved regulatory network involving INDEHISCENT controls multiple aspectsof reproductive tissue development in Arabidopsis.The New Phytologist,2012,197:73-87；

6.

L,Kempin SA,Bies D,Klee HJ,Yanofsky MF.Pod shatterresistant Brassica fruit produced by ectopic expression of the FRUITFULLgene.Plant Biotechnol J,2006,4:45-51；

7.Theissen G,Becker A,Di Rosa A,Kanno A,Kim JT,Münster T,Winter KU,Saedler H.A short history of MADS-box genes in plants.Plant Mol Biol,2000,42:115-149；

8.Wang R,Ripley VL,Rakow G.Pod shatter resistance evaluation incultivars and breeding lines of Brassica napus,B.juncea and Sinapisalba.Plant Breeding,2007,126:588-595；

9.Wang S,Lu G,Hou Z,Luo Z,Wang T,Li H,Zhang J,Ye Z.Members of thetomato FRUITFULL MADS-box family regulate style abscission and fruitripening.J Exp Bot.2014 65:3005-3014。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 利用BnaA06FUL1基因改良油菜抗裂角性

<141> 2019-03-07

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(726)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(723)

<400> 1

atg gga agg ggt agg gtt cag ctg aag agg ata gag aac aag atc aat 48

aggcaagtt act ttc tca aag aga agg tct ggt ttg ctc aag aaa gct 96

cat gag atctct gtt ctc tgc gat gct gag gtt gct ctc gtt gtc ttc 144

tcttccaaaggc aaa ctc ttc gaa tat tcc act gac tct agc atg gaa 192

aggatactt gag cga tat gat cgc tat tta tat tca gac aaa caa ctt 240

gttggccgagac att tca caa agt gaa aat tgg gtt cta gag cat gct 288

aagctcaaggca aga gtt gag gta ctt gaa aag aat aaa agg aat ttt 336

atgggggaa gat ctt gat tcc ttg agc ata aag gag ctt caa agc ttg 384

gag cat cagctc gac gct gct atc aag agc att agg tca aga aag aac 432

caagctatgttc gaa tcc ata tca gcg ctc cag aag aag gat aag gcc 480

ttgcaa gat cac aat aat acg ctt ctc aaa aag att aag gag aag gaa 528

aag gag aagaac acg ggt cag caa gaa gga caa tta atc caa tgc tcc 576

aacaattcttca gtt ctt cag ccc cag tac tgc gta acc gcc tcc aga 624

gatggccttgtg gag aga gtt gtg gga gag aac ggc ggt gca tcg tcg 672

ttgattgaacca aac tct ctt ctt cca gct tgg atg cta cgt tca aat 720

gagtaa 726

<210> 2

<211> 241

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 2

Met Gly Arg Gly Arg Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Val Val Phe

35 40 45

Ser Ser Lys Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Met Glu

50 55 60

Arg Ile Leu Glu Arg Tyr Asp Arg Tyr Leu Tyr Ser Asp Lys Gln Leu

65 70 75 80

Val Gly Arg Asp Ile Ser Gln Ser Glu Asn Trp Val Leu Glu His Ala

85 90 95

Lys Leu Lys Ala Arg Val Glu Val Leu Glu Lys Asn Lys Arg Asn Phe

100 105 110

Met Gly Glu Asp Leu Asp Ser Leu Ser Ile Lys Glu Leu Gln Ser Leu

115 120 125

Glu His Gln Leu Asp Ala Ala Ile Lys Ser Ile Arg Ser Arg Lys Asn

130 135 140

Gln Ala Met Phe Glu Ser Ile Ser Ala Leu Gln Lys Lys Asp Lys Ala

145 150 155 160

Leu Gln Asp His Asn Asn Thr Leu Leu Lys Lys Ile Lys Glu Lys Glu

165 170 175

Lys Glu Lys Asn Thr Gly Gln Gln Glu Gly Gln Leu Ile Gln Cys Ser

180 185 190

Asn Asn Ser Ser Val Leu Gln Pro Gln Tyr Cys Val Thr Ala Ser Arg

195 200 205

Asp Gly Leu Val Glu Arg Val Val Gly Glu Asn Gly Gly Ala Ser Ser

210 215 220

Leu Ile Glu Pro Asn Ser Leu Leu Pro Ala Trp Met Leu Arg Ser Asn

225 230 235 240

Glu

Claims

1.一种过表达BnaA06FUL1基因在改良甘蓝型油菜的抗裂角性而不改变开花时间中的应用，其特征在于，所述BnaA06FUL1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种适用于改良甘蓝型油菜抗裂角性而不改变开花时间的表达载体pBI121S-BnaA06FUL1的构建方法，其特征在于，所述方法中的表达载体pBI121S-BnaA06FUL1包含有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，以PBI121S为起始载体，将SEQ ID NO：1所示的BnaA06FUL1基因插入到PBI121S载体35S组成型启动子的下游而得到。