JP2004522442A - 繊維含量が改変され、種皮が改変された植物種子の産生方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、植物からの新規な遺伝子を含む一般にＣＪＡＳ１と称されるヌクレオチド配列に関する。該新規な遺伝子は種子形成に関係し、植物防御に関与するタンパク質をコードする。本発明はさらに、植物、特にアブラナ科植物、とりわけアブラナ属の種において種子代謝を変化させるため、そして繊維含量が減少し、および／または、種皮が変化した種子を作成するための手段としてＣＪＡＳ１配列に対応する植物遺伝子の発現を阻害するような、センス方向またはアンチセンス方向の該ヌクレオチド配列の使用に関する。本発明はまた、その他の植物種において発現する類似の遺伝子にも関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、植物における種皮の形成および種子の繊維含量に関係する植物遺伝子に関する。特に、本発明はアブラナ属およびその他の種からの種皮の形成および種子の繊維含量に関与する植物遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
植物の種子は胚および子葉を含む多種類の組織を含み、それらは通常種皮と称される厚い木化した組織の層に包まれている。一般に、種皮は植物種子の消化不能な繊維の総含量のかなりの部分を含む。繊維含量が減少した植物種子は、飼料生産物として使用するための多くの利点をもたらす。したがって、種皮組成の変化、および種子のその他の組織の組成の変化によって繊維含量が減少すると、現在飼料として用いられている植物種子の改良がもたらされる。
【０００３】
種皮は発芽前の種子を保護する機械的障壁を提供し、それにより種子は休眠を維持でき、あるいは機械的攻撃に抵抗できる。植物種の中には非常に強い種皮を有するためかなりの機械的および環境的侵襲に抵抗し得るものもある。植物種の中にはより薄い種皮を有するため機械的障害からの保護の程度が限られているものもある。種皮の性質は遺伝的に決定され、典型的には植物種の生物学および生態学に相関する。
【０００４】
商業的に関心を持たれている多くの作物種においては、種皮が高レベルの消化不能な繊維を含有する傾向にあり、油用、食物用またはその他の産物用の種子の加工において廃棄産物となることがよくあるため、厚い種皮は一般に望ましくない。種皮は植物種子食物の繊維含量のかなりの部分に寄与している。したがって、種皮の減少は多くの作物種における作物改良の重要な目的である。しかし、種子自体の保護のための種皮の重要性により、種皮をいくらか減少させても、種子の収穫、加工、または定植の間の損傷または障害から種子を保護することが出来る。したがって、種皮の大きさおよび組成と、種皮が提供する機械的障壁機能の間のバランスが保持されなければならない。
【０００５】
種皮（または外皮）の組成も多くの作物種、特に飼料用のものの改良のために考慮される。植物種子からの食物の繊維含量は食料の製造のために考慮される重要なものである。多くの用途のための飼料産物の繊維レベルは注意深く維持されなければならない。というのは食物繊維が高レベルであると食物の有用性が低くなり、食物の有用性が制限される場合があるからである。植物細胞壁は食物繊維の大部分を構成し、この繊維は比較的少ない数の開始化合物からなり、それらは多種類の最終産物へと組み込まれる。細胞壁の基質は多くの繊維構成物を含み、この繊維は共有結合および非共有結合した様々なポリマーからなる。
【０００６】
共有「繊維」結合の例は、ペクチンおよび非セルロース多糖においてみられるもののようなエステル型架橋結合糖残基および架橋結合リグニンおよびエクステンシン分子を含む。非共有「繊維」結合は、セルロース繊維における結合およびペクチン間のＣａ＋＋イオン架橋を含む。アブラナ属の種子の細胞壁およびそれに付随する「繊維」成分は一次細胞壁およびいくらかの特殊化した型のものを含む。種子は３つの主要部分、子葉、胚軸、貯蔵組織からなる。子葉は一般に、厚い、木化およびコルク質化した、様々な消化不能な化合物が組み込まれた細胞壁を含む果皮および外種皮とは対照的に、薄い壁の柔細胞である。したがって、外皮を取る手段は、高繊維含量の種子の部分の物理的分離において明らかに有用である。外皮は重量ベースでは種子の比較的小さい部分であるが、種子の繊維含量のかなりの量を含む。しかし繊維含量をさらに減少させるのが望ましい。
【０００７】
残念ながら、植物における各細胞型の繊維成分の正確な生化学的組成は決定されていない。それゆえすべての「繊維」総含有量は帰納的結果になりがちであり、繊維成分の正確な組成を正確に反映するものではない。もっとも簡単で一般的なレベルにおいて植物細胞壁または繊維は主に４つの複雑な化合物から構成される。これらはセルロース、非セルロース多糖、タンパク質およびフェノール化合物即ちリグニンである。セルロースは単純な化合物でありグルコースの繰り返し残基からなるが、この分子の正確な超分子構造は複雑である。非セルロース多糖は酸性ペクチン多糖、ヘミセルロースおよび様々な構造的に異なる糖のポリマーからなる。繊維には多くのタンパク質成分もあり、その大部分は多くの化合物のさらなる架橋のための骨格を形成する独特のタンパク質であるエクステンシンである。もちろんリグニンは主要なフェノール性成分である。たいていこれらの化合物は全く食事において単胃動物には有効利用されない。
【０００８】
種子および種子食物における繊維含量は一般に粗繊維、酸性界面活性剤繊維または中性界面活性剤繊維として表される。粗繊維（ＣＦ）は典型的には種子のリグニン画分、セルロース性画分、ヘミセルロース性画分およびペクチン画分を含む。酸性界面活性剤繊維（ＡＤＦ）は典型的にはセルロース性画分および酸安定性リグニン画分を含み、中性界面活性剤繊維（ＮＤＦ）は、リグニン、セルロースおよびヘミセルロース成分を表す傾向にある。したがって、繊維という語は多くの異なる化学成分を意味し得る。これらの様々な繊維成分のレベルの決定方法は、ＡＯＡＣ（Association of Official Agricultural Chemists)法にしたがって標準化されている。
【０００９】
種子食物の消化可能性は繊維成分の組成に依存している。種皮または外皮のなかには高度に木化していて一般に摂取後の分解に対して耐性であるものもある一方、種皮の中には動物の腸において簡単に分解できる組成を有するものもある。したがって、繊維含量の低い種皮が作物改良の重要な目的である。同様に種皮の組成は種子およびタンパク質、デンプンまたは油などの種子産物の加工にも影響を及ぼすため、より加工しやすい種皮が好ましい。これは、色素レベルの低い種皮または二次代謝産物組成が変化した種皮も含む。
【００１０】
一般にアブラナ属の脂肪種子作物は粉砕技術の使用によって油およびミールへと加工される。油は種子の破壊の後、種子から抽出され、残った固体物質をミールと称する。一般に種皮はミール画分に見られ、加工の前に種皮を除去する（種子の外皮を取り除く）ことは可能であるが、外皮の除去には余分のコストがかかり、余分の廃棄産物を生み出す。
【００１１】
アブラナ属においては、多くのタイプの脂肪種子品種があり、高エルカ酸、ナタネ、およびキャノーラ品質の品種が含まれる。キャノーラ品質の品種は、食用油用に栽培される脂肪種子アブラナ属の種の中で最も主要な型である。キャノーラ品質とは高価値の食用油を提供する、グルコシノラート(glucosinolate)およびエルカ酸含量が少ない特定の油組成のものを指す。高レベルのエルカ酸を産生するアブラナ属の品種は工業的目的で栽培され、ナタネ系統は食用油生産には一般に用いられておらず、例外的に市場が低品質のナタネ油を許容するような特定の状況および場所において用いられるに過ぎない。ナタネは広範に栽培されてはいるが、ナタネ油はキャノーラ品質の油のように高価に売れるものではない。したがって、キャノーラ品質の品種は産業において高い価値を有するものである。
【００１２】
多くのアブラナ属の種は典型的には暗色の種皮を有する種子を産生し、いくらかの種は黄色の種皮を有する種子を産生する。キャノーラ品質の脂肪種子であるアブラナ（Brassica napus)の通常の黒色種皮は、キャノーラ種子の典型的な加工においてキャノーラ品種の油とミールの両方に望ましくない外観の特性を与える。キャノーラ種子を粉砕する際、油画分とミール画分は分離され、それらには種皮または種皮にみられる色素が混入する。油は加工の初期段階に暗色となり、それによって外観が悪くなる。ミールにおいては明色のミールに混入したわずかの黒色種皮により、昆虫がはびこったようにみえるようになる。したがって色のより明るい種皮がキャノーラ粉砕産業において有用である。
【００１３】
種皮が少ないキャノーラ品質のアブラナ属の種子の育種がキャノーラ育種家にとって重要な目的である。アブラナ属の種の中には、色が黄色の種皮を有するものがあり、その黄色は一般により薄くサイズの小さい種皮に関連していることが判明した。黄色の種皮は繊維含量も少ないようであり、通常暗色の厚い木化した種皮に付随する特定の色素または二次代謝産物を含まないためにより消化性がよいようである。アブラナ属の黄色い種子の種から得られるミールは通常繊維含量が少なく、パーセンテージベースでより高いタンパク質含量を有する産物を提供するため、より価値が高い。したがって、種皮のサイズの減少によって多くの利点がもたらされる。したがって、黄色い種皮を有するアブラナ(Brassica napus)種の開発がアブラナ属脂肪種子産業の重要な目標である。
【００１４】
アブラナ属において黄色い種皮の形成をコードする遺伝子の新規な供給源を見出すための上記の目標について研究がなされてきた。例えば、Wu- JiangSheng ら、 1997, Study on a new germplasm resource of a dominant gene controlling yellow seed coat in Brassica napus L., Journal of Huazhong-Agricultural-University., 16: 1,26-28., Wu-JiangSheng ら、 1998, A study on the inheritance of a yellow-seeded mutant of rapeseed (Brassica napus L.)., Chinese- Journal-of-Oil-Crop-Sciences 20: 3,6-9., Li-JiaNa ら、 1998, An initial study of the inheritance of seed colour in yellow-seeded rapeseed (Brassica napus) lines with different genetic backgrounds., Chinese-Journal-of-Oil-Crop-Sciences 20: 4, 16-19を参照されたい。しかし、同定された形質のほとんどはキャノーラ品質のアブラナ属育種系統への単純な遺伝子移入には適していない。
【００１５】
アブラナ(Brassica napus)へ黄色の種皮を導入するその他の試みとしては、食用脂肪種子品質の育種系統へと開発されたその他のアブラナ属の種から黄色種子の形質を遺伝子移入することが含まれる。このような研究の例としては、Barcikowska ら、 1997, Seed coat pigmentation-F2 yellow-seed forms of Brassica juncea Coss X B. carinata Braun. Rosliny-Oleiste 18: 1, 99-102., Meng-JinLing ら, 1998, The production of yellow-seeded Brassica napus (AACC) through crossing interspecific hybrids of B. campestris (AA) and B. carinata (BBCC) with B. napus. Euphutica. 103: 3,329-333., Qi- CunKou ら、 1996, Studies on the transfer of yellow-seeded trait from Brassica carinata to B. napus. Jiangsu-Journal-of-Agricultural-Sciences 12: 2,23-28、が含まれる。このような種間交雑種から黄色種子系統を得ることは可能であるが、その結果得られる系統はその形質に関して不安定であることが多く、育種工程での形質の安定化および管理は、信頼できないものであることが多い。
【００１６】
したがって、形質を安定化させる手段を提供するためにいくらかの実験がなされてきた。例えば、Vyvadilova ら、 1999, The use of doubled haploids to stabilize yellow-seededness in oilseed rape (Brassica napus)., Czech-Journal-of- Genetics-and-Plant-Breeding. 35: 1,7-9を参照されたい。しかし、黄色種子品種を慣用的に安定化させかつ得る能力は予測不能であり、都合よく達成されない。
【００１７】
より効率的に黄色種子のアブラナ属の品種の産生を管理する手段として、黄色種子形質と同時分離する分子マーカーを同定するための研究もなされてきた。それには以下のものが含まれる: Chen-BY ら、1997, Identification and chromosomal assignment of RAPD markers linked with a gene for seed colour in a Brassica campestris-alboglabra addition line., Hereditas- Landskrona 126: 2,133-138., および Deynze-AE-van ら, 1995, The identification of restriction fragment length polymorphisms linked to seed colour genes in Brassica napus., Genome 38: 3,534-542。
【００１８】
アブラナ属において黄色い種子の着色をもたらすような変異を選抜する研究もなされてきた。ＷＯ９８４９８８９Ａ１には小胞子培養の使用および変異系統の選抜によってナタネ系統から黄色種子の特性を選抜する方法が教示されているが、その結果得られる植物はキャノーラ品質の系統へと育種しなければならず、黄色い種皮を含むキャノーラ品質の系統を作り出すには困難かつ面倒な工程を経なければならない。
【００１９】
こういった研究にもかかわらず、アブラナ属において繊維含量が低く、黄色種子形質の都合のよい供給源あるいは、その他のアブラナ属の種において天然に生じた形質を操作する都合のよい手段はいまだに見出されていない。さらに、繊維含量が低い黄色種子の品種の開発は多くのアブラナ属の脂肪種子育種計画のもっとも望ましい目的である。しかし今日までこれを達成するのは困難であった。したがって、商業的に栽培されているアブラナ(Brassica napus)脂肪種子作物のほぼすべてがいまだに暗色種子の特徴を有し、わずかのものだけが様々な程度に黄色い種子特性を有するに過ぎない。従来のキャノーラ品種の繊維含量は、低繊維、黄色種子品種の生産への努力がなされているにもかかわらず、いまだに変わらないままである。したがって、黄色種子キャノーラ品種を開発することがアブラナ属脂肪種子産業の重要な目的である。
【００２０】
アブラナ科のファミリーのメンバーを含む、アブラナ属の種に関して繊維含量を減らし、種皮の色を操作する手段の開発により、種皮の色および特性が望ましくない種からキャノーラ品質の作物種を開発する可能性が開ける。それゆえ、繊維含量が低く、種皮が変化した作物、特にアブラナ科作物を開発する能力は、新規な脂肪種子およびミール作物のさらなる開発において重要な要素である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
３．発明の概要
本発明の目的は植物種子における繊維の形成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は植物種子の種皮の形成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は植物の種子の繊維含量を減少させるための植物を改変する方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は植物の種子の色を変化させるために植物を改変する方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は非改変植物と比べて繊維含量が減少したトランスジェニック植物を作成することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は非改変植物と比べて種子の色が変化したトランスジェニック植物を作成することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
１つの態様において、本発明は、アブラナ属およびアブラナ科の種において典型的な高繊維、暗色種皮の形成に関与するタンパク質をコードする核酸配列を提供する。本発明の核酸は正常な方向と比べてアンチセンス方向に発現させた場合、通常は暗色種皮を有するアブラナ属品種において、繊維含量の減少および黄色種皮の形成を引き起こすことが出来る。さらに本発明の核酸配列はその他の植物品種において発現させて同様の結果を達成することが出来る。
【００２８】
本発明はまた、植物種子の繊維含量の制御に関与するポリヌクレオチド配列を提供する。本発明のポリヌクレオチド配列を植物において正常な方向に対してアンチセンス方向に発現させると、暗色種皮を有する品種の種子に対して粗繊維含量が減少した種子が得られる。
【００２９】
１つの態様において、本発明は、単離ヌクレオチド配列を提供し、該単離ヌクレオチドが以下からなる群から選択されることを特徴とする：
ａ）配列番号１、またはその相補鎖、
ｂ）配列番号３、またはその相補鎖、
ｃ）ヌクレオチド配列ａ）またはｂ）によってコードされるペプチドに対して少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％の相同性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ここで、該単離ヌクレオチド配列またはその相補鎖は、該ヌクレオチド配列を発現する植物において種子の発生を変化させるタンパク質またはその一部をコードする。
【００３０】
別の態様において、本発明は、単離ヌクレオチド配列を提供し、該単離ヌクレオチド配列は以下からなる群から選択されることを特徴とする：
ａ）配列番号１、またはその相補鎖；
ｂ）配列番号３、またはその相補鎖；および、
ｃ）ストリンジェントな条件（６５℃、６ｘＳＳＣ）下でａ）またはｂ）にハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ここで、該単離ヌクレオチド配列またはその相補鎖は、該ヌクレオチド配列を発現する植物において種子の発生を変化させるタンパク質またはその一部をコードする。
【００３１】
好ましくは本発明のヌクレオチド配列はアブラナ科植物またはアブラナ属の植物に由来のものである。
【００３２】
好ましくは本発明のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列の植物における発現が、非改変植物の種子と比較して、種子の繊維含量を減少させること、および／または植物の種子の色を明るくすること、によって特徴付けられる。
【００３３】
本発明はまた、ペプチドが本発明のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、単離および精製ペプチドを包含する。
【００３４】
別の態様において本発明のヌクレオチド配列は、プロモーターに操作可能に結合したヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現カセットまたはコンストラクトの作成に利用できる。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、上記のコンストラクトによって形質転換された植物細胞によって特徴付けられる植物細胞、および形質転換植物細胞から、植物体全体への再生により得られるトランスジェニック植物を含む。好適な態様において、本発明のトランスジェニック植物はアブラナ科植物またはアブラナ属の植物である。
【００３６】
別の態様において、本発明はまた、植物の種子を改変する方法を提供し、該方法は以下の工程を有することを特徴とする：
（ａ）形質転換され得、植物体全体へと再生され得る植物細胞に、植物における形質転換と選抜に必要とされるＤＮＡ配列に加えて、プロモーターに操作可能に結合した本発明によるヌクレオチド配列を含むコンストラクトを導入する工程；および、
（ｂ）該ヌクレオチド配列を含む植物を回収する工程。
もっとも好ましくは、該方法は、正常な植物からの種子と比較して繊維含量が減量している、および／またはより明るい色を呈する種子を有する植物を作成するものである。その他の態様において該方法は、プロモーターに対して、本発明のヌクレオチド配列をセンスまたはアンチセンス方向に含むコンストラクトの使用を含む。
【００３７】
本発明はまた、種子が該トランスジェニック植物および本明細書に開示する対応する方法から得られることを特徴とする、種子をも含む。
【００３８】
特別の態様において、本発明は配列表において配列番号１、３および５と称する相同的なヌクレオチド配列を開示する。本開示のために、これらの配列を包括的にＣＪＡＳ１と命名する。
【００３９】
本発明は開示したＣＪＡＳ１配列およびそのホモログを用いた植物の形質転換を提供する。植物の種子は、ＣＪＡＳ１配列のセンスまたはアンチセンス部分を含む植物形質転換ベクターまたは該遺伝子のセンスおよびアンチセンス部分の両方を含む二本鎖ＲＮＡによる、植物細胞の形質転換によって改変され得る。
【００４０】
ＣＪＡＳ１配列はまた、当該技術分野に周知の比較技術によって公共データベースに寄託されている関連する相同的配列を同定するためにも使用できるし、様々な植物種からの関連するｃＤＮＡまたはゲノム配列を同定するためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも使用できる。
【００４１】
本発明はさらに本出願において開示されたヌクレオチド配列と実質的に相同的なＤＮＡ配列の同定および単離方法を提供し、該方法は、以下の工程を有することを特徴とする：
ストリンジェントな条件下で本明細書において開示したヌクレオチド配列にハイブリダイズできるディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程；
該ディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを標識する工程；および、
該標識したディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーをプローブとして用いて、該実質的に相同的なＤＮＡ配列についてＤＮＡライブラリーをスクリーニングする工程。
【００４２】
本発明はまた本発明に含まれる単離ヌクレオチド配列の、非改変植物の種子と比較して繊維含量が減少した、および／またはより明るい色を呈する種子を有するトランスジェニック植物を作成するための使用を提供する。
（図面の簡単な説明）
【００４３】
図１：ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡを含む植物形質転換ベクター。矢印は３５Ｓプロモーターからのアンチセンス発現方向を示す。
【００４４】
図２ａ：野生型アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの種子、そして図２ｂ：ＣＪＡＳ１（配列番号１）をアンチセンス方向に発現するトランスジェニックアブラナ属カリナタから得た種子。
【００４５】
図３：トランスジェニックアブラナ属における粗繊維の減少のグラフ表示。
【００４６】
図４：トランスジェニックアブラナ属における酸性界面活性剤繊維の減少のグラフ表示。
【００４７】
図５：トランスジェニックアブラナ属における中性界面活性剤繊維の減少のグラフ表示。
【００４８】
図６ａ：最初のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの配列番号１）の５’−末端およびアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から得た第二の相同的ｃＤＮＡクローン（アブラナ属アブラナ（Brassica napus）から得た全長ｃＤＮＡである配列番号３の５’−末端と同一）との配列アラインメント。
【００４９】
図６ｂ：最初のＣＪＡＳ１遺伝子産物の予測ペプチド配列（アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの配列番号２）のアミノ末端と配列番号４に示す予測ペプチド配列との配列アラインメント。
【００５０】
図７：配列番号１からの選択された領域と、いくつかのクラスＩグルタミンアミドトランスフェラーゼの２つのドメインからの既知のペプチド配列との手操作によるアラインメント。
【００５１】
図８：配列番号２と、実施例１３に記載のようにＢＬＡＳＴサーチから同定されたシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)からの相同的ペプチド配列との配列アラインメント。
【００５２】
５．用語解説
ＤＮＡの増幅／増幅ＤＮＡ：「増幅ＤＮＡ」とは標的核酸配列の核酸増幅の産物を指す。核酸増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む当該技術分野で公知の様々な核酸増幅方法のいずれによっても達成できる。当該技術分野に公知の様々な増幅方法は、とりわけ、米国特許第４６８３１９５号および４６８３２０２号およびInnis ら. (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990に記載されている。
【００５３】
コンストラクト：コンストラクトはベクターおよびベクターに操作可能に結合したインサートを含み、ベクターおよびインサートは複製可能で所望により形質転換可能である。
【００５４】
発現：転写と翻訳との組合せを含む、タンパク質をコードするＤＮＡ配列からのタンパク質産物の生成である。
【００５５】
発現カセット：オープンリーディングフレームまたはその相補鎖と操作可能な関係のプロモーターを含むヌクレオチド配列である。
【００５６】
相同的：配列において互いに相対する個々の残基の化学的性質、順序および位置の点から、他のＤＮＡまたはペプチド配列に類似性を示すＤＮＡまたはペプチド配列。本出願の目的では、特に断りのない限り相同性はＢＬＡＳＴサーチ結果によって特徴付けられる。ＢＬＡＳＴサーチ結果では最適に一致する配列アラインメントが得られる。このように類似または同一の残基を含む配列がアラインされ必要であればギャップが与えられる。それゆえ相同性は類似性または同一性のパーセンテージとして表現され、ここで類似性は類似残基および同一残基の両方を含む。特に断りのない限り、すべてのＢＬＡＳＴサーチは以下を用いて行われる。デフォールトパラメーター：例えば、ギャップ許容、Ｅ−値＝１、所望により選択される生物、低複雑性用フィルタ、標準遺伝コード、ＢＬＯＳＵＭ６２一般目的行列；さらなる情報については、Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/tut1.html.を参照されたい。
【００５７】
同一性：相同的なＤＮＡまたはペプチド配列の比較により、配列の同じ相対位置において同一の残基が同定された後、最適一致アラインメントが得られる。本出願のためには特にことわりのない限り、相同性、最適一致アラインメントおよび同一性はＢＬＡＳＴサーチ結果にしたがって計算される（ＢＬＡＳＴサーチは例えば、ウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から入手できる）。同一性はパーセンテージとして示され、これはアラインされた配列の間のギャップ領域を除いて、比較した配列間で同一の残基のパーセンテージを示す。ＢＬＡＳＴサーチにより、配列間のギャップまたは切断領域を自動的に考慮した標準アラインメント配置が得られ、それにより「最適一致」アラインメントが提供される。
【００５８】
単離：ヌクレオチドまたはペプチドはそれに自然に付随するその他の細胞構成成分（核酸、液体、炭水化物およびその他のヌクレオチドまたはペプチド）から分離されている場合、「単離」されているという。そのようなヌクレオチドまたはペプチドは「純粋な」または「均質な」あるいは「実質的に」純粋なまたは均質なともいう。したがって化学合成されたかまたは組換えのヌクレオチドまたはペプチドは単離されていると考えられる。ヌクレオチドまたはペプチドは試料の重量の少なくとも６０−９０％、好ましくは９５％またはそれ以上、より好ましくは９９％以上がそのヌクレオチドまたはペプチドからなる場合単離されている。タンパク質の純度または均質性は例えばタンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いでポリアクリルアミドゲルの染色時の単一ペプチドバンドの可視化；高速液体クロマトグラフィー；またはその他の通常の方法によって示される。本発明のペプチドは当該技術分野で公知のいかなる手段によって精製してもよい。様々なタンパク質精製方法が、例えば、 Guide to Protein Purification, in Deutscher (ed.), Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; および Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982 に記載されている。
【００５９】
より明るい種子の色／より明るい種皮の色：非トランスジェニック非改変植物からの平均的な色の種子よりも、明るい色の種子または種皮の色を有することをいう。「より明るい」という語は、本発明のトランスジェニック植物と対応する野生型非改変植物との両方から得られる種子の色において自然の変動が存在するという理解のうえで用いられる。それゆえ「より明るい」という語はトランスジェニック植物と非改変植物とから得られる種子を比較して平均的な種子の色または種皮の色を考慮して用いられる。
【００６０】
器官：構造と機能の点から定義される植物の特定の領域。例えば植物の場合、茎、葉、葯、花粉粒または根。
【００６１】
プロモーター：ＤＮＡ配列上またはＤＮＡ配列のグループ上の認識部位であって、ポリペプチドをコードする遺伝子に対する少なくとも１つの発現制御要素を提供し、そこにＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、遺伝子のＲＮＡ合成（転写）が開始する部位。
【００６２】
繊維含量の減少：対応する非トランスジェニック非改変植物由来の種子と比較して、繊維含量が減少している本発明のトランスジェニック植物由来の種子に関する。「繊維含量の減少」という表現は、本発明のトランスジェニック植物および対応する野生型非改変植物の両方から得られる種子の繊維含量において自然の変動が存在するという理解のうえで用いられる。それゆえ、「繊維含量の減少」という表現は、トランスジェニック植物および非改変植物から得られる種子を比較した場合の平均種子繊維含量を考慮して用いられる。
【００６３】
ストリンジェントな条件：「ストリンジェントな条件」という語は、標的核酸（即ち問題の特定の核酸配列）に対する核酸プローブの、Sambrook ら, 1989, 9.52-9.55に記載のハイブリダイゼーション手順によるハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrook ら, 1989, 9.47-9.52,9.56-9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12: 203-213,1984; および Wetmurおよび Davidson, J. Mol. Biol. 31: 349-370,1968も参照されたい。一般に洗浄条件は、研究対象のハイブリッド対の計算Ｔｍ（融解温度）より低いおよそ１２−２０℃の洗浄温度を含む（Sambrook ら, 1989, pp. 9-51)。ハイブリッド対の融解温度は以下の等式によって計算できる。
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／Ｌ）
ここで、Ｌ＝ハイブリッドの塩基対長
例えば、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション条件の典型的なものは、６５℃、６ｘＳＳＣである。
【００６４】
形質転換：外来ＤＮＡ配列（例えば、ベクター、コンストラクト、または組換えＤＮＡ分子）の導入による細胞の改変。
【００６５】
トランスジェニック：細胞の形質転換工程に由来する細胞または生物であり、ここで該細胞または生物は、非トランスジェニック細胞または生物においては本来存在しない、導入された外来ＤＮＡ分子を含む。
【００６６】
トランスジェニック植物：形質転換植物細胞またはプロトプラスト由来の植物またはその子孫であって、ここで該植物ＤＮＡは同じ株の自然の非トランスジェニック植物には本来存在しない導入された外来ＤＮＡ分子を含む。「トランスジェニック植物」および「形質転換植物」という語は当該技術分野において、そのＤＮＡが外来ＤＮＡ分子を含む植物を定義するために同義語として用いられることがある。しかし形質転換植物細胞またはプロトプラストから得られた再生した植物またはカルスをトランスジェニック植物と称するのがより科学的に正確である。
【００６７】
ベクター：宿主細胞において複製可能なＤＮＡ分子および／またはそれにその他のＤＮＡセグメントが操作可能に結合して、結合したセグメントの複製をもたらすことができるもの。プラスミドはベクターの例である。
６．発明の詳細な記載
【００６８】
本発明はアブラナ科の植物における種子代謝に関与するタンパク質をコードする、一般にＣＪＡＳ１と称される核酸を記載する。本発明者らはＣＪＡＳ１によってコードされる相同的タンパク質が植物に見られる防御応答に関与し、ＣＪＡＳ１が当該技術分野において以前に記載された遺伝子に対して制限された相同性しか示さない新規な遺伝子を表すということを見出した。ＣＪＡＳ１配列はまた、アブラナ属の典型的な暗色の種皮の形成の過程で発現している遺伝子を表す。実験結果より、ＣＪＡＳ１によってコードされるタンパク質は、発達途中の種子において正常に発現した場合、多くのアブラナ属の種においてみられる、繊維含量の多い種皮を含む、通常の暗色の種皮の形成に関与していることが示された。
【００６９】
この点で、ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡを、通常は粗繊維レベルの高い暗色の種皮を有する形質転換植物においてアンチセンス方向に発現させると、予期せぬことに黄色の種皮を有し、および／または粗繊維含量が減少した種子の形成が導かれる。
【００７０】
したがって、本発明は、典型的には暗色の種子であって繊維含量の多い種子が観察される、アブラナ属の品種において繊維含量が低く黄色い色の種子の産生をもたらす。この発明によって従来の育種または突然変異技術では不可能であった、繊維含量が低いまたは繊維含量が低く黄色い種子のキャノーラアブラナ（Brassica napus）を大規模に発生させることが可能となることが予想される。さらにその他の植物種も対応する改変をすることができると考えられる。
【００７１】
ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡの単離は最初、ファイトアレキシン生合成に関与する遺伝子の研究の結果としてアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から達成された。ファイトアレキシンは植物の多くの組織に見られ、細胞防御と二次代謝にしばしば関連している。ファイトアレキシンは典型的には菌類などの病原体に応答して誘導され、様々な化学ストレスによっても誘導される。アブラナ属のファイトアレキシンは、部分的にインドールグルコシノラートを利用する、植物にコードされる酵素活性の結果として形成される。グルコシノラートは一般に栄養分吸収を阻止する性質があると考えられているため、インドールグルコシノラートの生合成は研究対象とされてきた。
【００７２】
ファイトアレキシンの生合成の制御はあまりよく理解されておらず、鍵となる制御段階の同定が植物科学者にとっての目的であった。ファイトアレキシンは細菌または菌類などの種子病原体に対してなんらかの防御を提供すると考えられており、種皮においてしばしば見出されてきた。個々のファイトアレキシンは菌類の制御において有効ではないが、種皮におけるファイトアレキシン類、木化組織およびその他の二次代謝産物の複雑な混合物は種子の疾病に対する強力な障壁を提供し得る。したがって、ファイトアレキシンの生合成は種皮の発達の間に、病原体の侵入のレベルにおいて調節されているようであり、多種類のレベルでの調節が示される。
【００７３】
現在、ファイトアレキシン生合成に関与する遺伝子についてのデータはほとんど存在しない。それゆえ本発明者らはファイトアレキシン生合成の誘導の際に誘導される遺伝子の発現を調査した。塩化銅（ファイトアレキシン生合成のエリシター）の溶液で植物を噴霧することにより、ファイトアレキシンの産生およびその他の植物防御応答が誘導されることが知られている。植物細胞を塩化銅で処理し、塩化銅誘導性遺伝子を表すｃＤＮＡライブラリーを作成した。塩化銅による誘導を示す遺伝子の多数を特徴づけする一方、そのｃＤＮＡ配列を配列決定し、その配列をデータベースエントリーと比較した（実施例を参照されたい）。
【００７４】
塩化銅処理によって特異的に誘導され遺伝子データバンクには存在しなかったｃＤＮＡをトランスジェニック植物を用いる実験に用いた。ここで該トランスジェニック植物は形質転換植物においてｃＤＮＡのアンチセンス鎖を発現する植物形質転換ベクターを用いて作成した。外来遺伝子の発現を形質転換植物において減少させるためのこの技術の適用は、当該技術分野において周知であり、表現型の変化が観察され得る。
【００７５】
アンチセンス遺伝子ベクターを含む形質転換植物は表現型の変化によって目視により調べた。この分析の結果、驚くべきことに、ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）を用いるアンチセンス遺伝子を含む、形質転換ベクターの１つが種皮の色を変化させた。本発明者らはＣＪＡＳ１ｃＤＮＡアンチセンスでの形質転換体の５０％以上が、非改変植物のより暗い色の種子と対比して、より明るい色（黄色）の種子を産生することを観察した。これらの黄色種子から、黄色種子の産生について３：１の比で分離する植物が生じた。種皮の色の変化に加え、トランスジェニック植物種子は粗繊維含量の有意な減少を示した（実施例を参照されたい）。
【００７６】
それゆえ、本発明はＣＪＡＳ１ｃＤＮＡに対応する植物遺伝子の（アンチセンス発現による）阻害により、通常は暗色の種皮が見られるアブラナ属の品種において繊維含量が減少した黄色の種子の産生が導かれるという発明を含む（実施例を参照されたい）。形質の分離の遺伝学により、単一の挿入現象が黄色種子表現型を与えるのに十分であることが示唆される。繊維含量の減少も観察された（実施例を参照されたい）。この遺伝子の発現の減少により、種皮の色および種子の繊維含量の両方を変化させることができるようである。したがって、暗色種子のキャノーラ品種から、繊維含量が低く、および／または黄色い種子のキャノーラの産生のための新規な方法が見出された。
【００７７】
本発明はアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から単離されたＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ配列（配列番号１）およびアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)およびその他の種の植物由来の他の相同的なヌクレオチド配列、およびより明るい色を有し繊維含量が減少した種子を含むトランスジェニック植物の産生のためのそのような相同的ヌクレオチド配列の使用を含む。そのような相同的配列は以下の技術のいずれによっても得ることが出来る。
【００７８】
１）ＤＮＡライブラリースクリーニング
本発明のヌクレオチド配列は、様々な植物種のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、（ディジェネレート）ヌクレオチドプローブを作成するのに用いることが出来る。関連する技術は当該技術分野においてよく理解されており、例えば、Sambrook ら, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)において提供されている。このように本出願の配列に相同的な配列は簡単に入手できる。このため、本出願において開示されたものと有意な配列同一性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド分子が本発明に含まれ、ここで、配列番号１、３または５あるいはその部分が、相同的ポリヌクレオチド分子を探索および単離するためのポリヌクレオチドプローブとして利用される。さらに本出願のものと有意な配列同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明において開示されたものと類似の生化学的特性を有する類似のタンパク質産物を生じさせると予想される。
【００７９】
ＤＮＡライブラリースクリーニングとＰＣＲ増幅技術を用いることにより、本発明者らはアブラナ（Brassica napus)から全長のＣＪＡＳ１相同的ｃＤＮＡ（配列番号３）、アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から部分ＣＪＡＳ１相同的ｃＤＮＡ（これは配列番号３の５’−末端と同一であった）、およびアブラナ（Brassica napus)からもう１つの相同的遺伝子の部分ｃＤＮＡ（配列番号５、後述）を得ることに成功した。この点についての詳細は実施例において記載する。
【００８０】
２）コンピュータに基く相同性サーチ
本出願において開示したヌクレオチドおよびアミノ酸配列を用いて、コンピュータに基くサーチ技術（例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から利用できるＢＬＡＳＴサーチ）により、相同的ヌクレオチドおよびペプチド配列を同定することが出来る。そのような技術は当業者に周知であり本出願の教示にしたがって用いられる相同的ヌクレオチドおよびペプチド配列の同定のために簡単に利用できる。
【００８１】
本発明者らはＢＬＡＳＴサーチを用いてシロイヌナズナ（Alabidopsis thaliana)においてＣＪＡＳ１ホモログを同定することに成功し、これをクローニングして、本発明による繊維含量が減少しているかより明るい色の種子を含むトランスジェニック植物の作成に用いることができる。この点については実施例において詳述する。
【００８２】
それゆえ本発明は相同的ＤＮＡ配列を単離するために当該技術分野で知られている技術によって得られるＤＮＡ配列を含み、ここで該技術は配列番号１、３および５またはその部分から選択される配列に由来するディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブを利用する。あるいは、該技術は相同的ヌクレオチドおよびペプチド配列についてＧｅｎｂａｎｋなどのデータベースをサーチする公知の配列アラインメントプログラムを利用するものであってもよい。アミノ酸配列相同性の程度はそれぞれの同定された配列によって変動する。本発明は対応するポリヌクレオチドによってコードされるペプチド配列について少なくとも５０％の配列相同性を含むポリヌクレオチド配列を含む。理論に拘束されるわけではないが、少なくとも５０％の相同性を有する酵素は範囲が類似した酵素活性を有すると当該技術分野で一般に予想される。この点において酵素の必須の構造特性は酵素の触媒部位のコンフォメーションを固定するように保存される。それゆえ本発明は本出願の配列由来のディジェネレートＤＮＡプローブを用いて、アブラナ属カリナタ(Brassica carinata)、アブラナ(Brassica napus)以外の種のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られるポリヌクレオチド分子も含む。そのような種にはその他のアブラナ科の種およびアブラナ属に含まれる種が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００８３】
本発明は本発明のポリヌクレオチドまたは好適なヌクレオチドデータベース（例えばＧｅｎｂａｎｋ）からの配列アラインメント由来のディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブを用いてＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られるポリヌクレオチド配列も含み、ここで該配列は、配列番号１、３および５によってコードされるペプチドに対して少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性を含むペプチドをコードする。この点で、少なくとも７０％の予想アミノ酸配列相同性を有する相同的タンパク質は本発明によって定義された活性を有するタンパク質を含むと予想され、ここで相同的タンパク質の発現の破壊は繊維含量が減少した、および／またはより明るい色の種子を含む植物を生じさせると予想される。そのようなタンパク質は類似の植物種から由来するものであってもよい。
【００８４】
本発明はまた、配列番号１、３および５によってコードされるペプチドと少なくとも９０％または９５％の配列相同性を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も含む。このクラスの関連タンパク質は非常に類似または同一の触媒活性を有する近接した遺伝子ファミリーメンバーを含む。さらに９０％から９５％のアミノ酸配列相同性を有するペプチドは類似の植物種の機能的ホモログに、あるいは本出願に開示された配列に向けられた突然変異に由来し得る。
【００８５】
部位特異的突然変異誘発技術を本発明のポリヌクレオチド配列に簡単に適用することが出来ることが当業者に理解されるであろう。関連技術が当該技術分野で知られており、例えSambrook ら, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)において提供されている。この点で本発明は配列番号１、３および５に提供されるＤＮＡ配列の単離および特徴づけを教示する。しかし本発明はこれらの特定の配列に限定されるものではない。多数の特異的突然変異誘発技術によって、技術者であればヌクレオチド配列において１または複数の残基を変化させることが出来、それによってその結果発現されるポリペプチド配列を変化させることが出来る。さらに多くの製造業者から入手できる市販の「キット」によっても特異的突然変異誘発を行うことが出来る（例えばPromegaおよびBioradから入手できる）。これらは所望の突然変異を作出するための、抗生物質耐性が変化したプラスミドの使用、ウラシル取りこみおよびＰＣＲ技術を含む。作出された突然変異は点突然変異、欠失および切断を所望により含むものであろう。本発明はそれゆえ本出願において開示されたＣＪＡＳ１ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列の対応する突然変異体も含む。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチド配列は植物体に遺伝物質を伝達させる前に好適なベクターに結合しなければならない。この目的のため、当該技術分野に周知の標準的ライゲーション技術を用いればよい。そのような技術は分子生物学におけるプロトコールに関する標準的テキストから簡単に得られ、好適なリガーゼ酵素は市販されている。
【００８７】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列によってコードされる単離および精製ペプチドも含む。本発明はまた、本発明のペプチドに対して特異的であり本発明のペプチドとその他のポリペプチドを標準的条件下で区別することが出来るポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体も含む。そのような抗体は通常の方法によって作成することができる。様々なイムノアッセイ技術および適用を含む本発明による抗体の調製および使用については、例えばGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., Academic Press, New York, 1986; および Harlow および Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1988を参照されたい。本発明のペプチドおよび抗体は通常の技術によって標識できる。好適な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光試薬、化学発光試薬、磁性粒子などが含まれる。
【００８８】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列によって形質転換された植物細胞および形質転換植物細胞の増殖から得られた植物も含む。生物学的方法および物理的方法を含む、植物の形質転換の多くの方法が開発されており、植物形質転換プロトコールについては例えば、Miki ら,"Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants"in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. および Thompson, J. E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pages 67-88を参照されたい。さらに発現ベクターおよび植物細胞または組織のインビトロ培養方法、植物の形質転換および再生も利用できる。例えば、Gruber ら,"Vectors for Plant Transformation"in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. および Thompson, J. E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pages 89-119を参照されたい。
【００８９】
以下は例示であって限定的なものではない。
【００９０】
Ａ．アグロバクテリウム媒介形質転換：植物への発現ベクターの導入方法の１つはアグロバクテリウムの自然の形質転換システムに基く。例えば、Horsch ら, Science 227: 1229 (1985)を参照されたい。A. tumefaciens およびA. rhizongenesは、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原体土壌細菌である。A. tumefaciens およびA. rhizongenesのそれぞれＴｉおよびＲｉプラスミドは植物の遺伝的形質転換に必要な遺伝子を担持する。たとえば、Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10 : 1 (1991)を参照されたい。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム媒介遺伝子移入方法についての記載は、Gruber ら, 前掲, Miki ら, 前掲, および Moloney ら, Plant Cell Reports 8: 238 (1989). Bechtold ら、 C. R. Acad. Sci. Paris Life Sciences, 316: 1194-9 (1993)によって提供される。
【００９１】
Ｂ．直接遺伝子移入：アグロバクテリウム媒介形質転換の代わりとして集合的に直接遺伝子移入と称されるいくつかの植物形質転換方法が開発されている。植物形質転換の一般的に適用可能な方法は、微粒子媒介形質転換であり、ここでＤＮＡは１から４μＭの大きさの微粒子の表面に担持される。発現ベクターは遺伝子銃装置によって植物組織に導入され、該装置は植物細胞壁および細胞膜を貫通するのに十分な速さである３００から６００ｍ／ｓの速さに微粒子を加速する。Sanford ら, Part. Sci. Technol. 5: 27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6: 299 (1988), Klein ら, Bio/Technology 6: 559-563 (1988), Sanford, J. C., Physiol Plant 79: 206 (1990), Klein ら, Biotechnology 10: 268 (1992)。１９９１年５月１４日発行の米国特許第５０１５５８０号 (Christouら); １９９４年１月２１日発行の米国特許第５３２２７８３号 (Tomesら)も参照されたい。
【００９２】
もう１つの植物へのＤＮＡの物理的送達方法は標的細胞の超音波処理である。Zhang ら, Bio/Technology 9: 996 (1991)。あるいはリポソームまたはスフェロプラスト融合を用いて発現ベクターを植物に導入する。Deshayes ら, EMBO J., 4 : 2731 (1985), Christou ら、Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 3962 (1987)。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニルアルコールまたはポリ−Ｌ−オルニチンを用いたプロトプラストへのＤＮＡの直接取りこみも報告されている。Hain ら, Mol. Gen. Genet. 199 : 161 (1985) および Draper ら, Plant Cell Physiol. 23: 451 (1982)。プロトプラストおよび細胞全体および組織のエレクトロポレーションも記載されている。Donn ら、 Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p 53 (1990); D'Halluinら, Plant Cell 4: 1495-1505 (1992) および Spencer ら、Plant Mol. Biol. 24: 51-61 (1994)。
【００９３】
標的細胞または組織の形質転換後、上記の選抜可能なマーカー遺伝子の発現により、現在当該技術分野で周知の再生および選抜方法を用いて形質転換細胞、組織および／または植物の優先的選抜が可能となる。
【００９４】
上記の形質転換方法はトランスジェニック品種を産生するために典型的に用いられるものである。トランスジェニック品種を次にその他の（非形質転換または形質転換）品種と交雑し、新規なトランスジェニック品種を産生することができる。
【００９５】
あるいは、上記形質転換技術を用いて特定の系統へと操作された遺伝形質は、植物育種分野に周知の従来からの戻し交配技術を用いて他の系統へと移すことが出来る。例えば、戻し交配アプローチを用いて公共の非優良品種から、操作された形質を優良品種へと移すことが出来るし、ゲノム内に外来遺伝子を含む品種からその遺伝子を含まない多くの品種へと形質を移すことも出来る。本明細書において用いる場合はその文脈によって、「交雑」はＸとＹとの単純な交雑または戻し交配工程を指す。いったんトランスジェニック植物が確立するとその植物の種子の表現型の決定が重要となる。したがって、本発明の好適な態様において植物の種子を改変する方法が提供され、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）形質転換可能で植物体全体へと再生可能な植物細胞に、植物の形質転換および選抜に必要なＤＮＡ配列に加えて、プロモーターに操作可能に結合した本発明に含まれるヌクレオチド配列によるヌクレオチド配列を含むコンストラクトを導入する工程；および、
（ｂ）ヌクレオチド配列を含む植物を回収する工程。
【００９６】
ポリヌクレオチドＣＪＡＳ１は転写調節領域と比較して、アンチセンス（アンチセンスＲＮＡによる阻害用）方向でもセンス（共抑制(co-suppression)による阻害用）方向であってもよく、あるいは二本鎖ＲＮＡ干渉を誘導するためにセンスおよびアンチセンスＲＮＡの組合せであってもよいことが当業者に明らかであろう (Chuang および Meyerowitz, PNAS 97: 4985-4990,2000, Smith ら, Nature 407: 319-320,2000）。その他の遺伝子阻害の方法も本発明の枠内であると考えられる。
【００９７】
転写調節領域はプロモーター領域と呼ばれることがよくあり、本発明の枠内において用いられる多数のプロモーターが存在する。好適なプロモーターはアンチセンス遺伝子の発現を、種皮の形成に寄与または関与する種子組織または種子内の組織に限定するプロモーターである。好適なプロモーターにはアブラナ属ナピン（Brassica napin)およびアブラナ科のプロモーター、マメフォゼアリンプロモーターまたはダイズコングリシニンプロモーターが含まれる。その他のプロモーターのタイプとしては限定されるものではないが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、器官特異的プロモーター、発達特異的プロモーター、強いプロモーター、弱いプロモーターなどが含まれる。
【００９８】
重要なことは、本発明は本発明の方法によって作成されたトランスジェニック植物およびその生産物および種子を含むということであり、ここで本発明のヌクレオチド配列は選択された植物種に形質転換されて発現する。本発明のトランスジェニック植物は、本発明のヌクレオチド配列の植物における形質転換および発現が、繊維含量が減少した、および／またはより明るい色の種子に関する所望の表現型をもたらすことを条件にして、植物種の点では限定されない。特に好適な種としてはアブラナ科品種およびアブラナ属の品種が含まれる。より好適な植物種としてはアブラナ属カリナタ(Brassica carinata)およびアブラナ(Brassica napus)が含まれる。これらの種からこれまでにＣＪＡＳ１相同的ヌクレオチド配列が同定された。
【００９９】
より最近開発されたストラテジーを用いてＣＪＡＳ１関連配列の発現を操作することも可能である。ＣＪＡＳ１関連遺伝子の発現の減少の機構として、リボザイムを用いることは当業者の技術範囲内である。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングおよび染色体歩行は、例えばSambrook ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour N. Y. (1989)に記載の当業者に周知のさらなる技術である。そのような技術を用いて簡単にＣＪＡＳ１遺伝子のプロモーター配列を得ることが出来、ＣＪＡＳ１ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを単離することが出来る。このようにして種子発達の正常条件下でのＣＪＡＳ１の発現を評価することが出来る。この遺伝子ファミリーおよび関連する遺伝子ファミリーの遺伝子発現を制御するさらなる方法を開発するためにプロモーター領域を単離して研究することも出来る。
【０１００】
ＣＪＡＳ１によってコードされるタンパク質の機能については、ＣＪＡＳ１の推定アミノ酸配列はシロイヌナズナ(A. thaliana)のＧＭＰ合成酵素様タンパク質（受託番号ＡＡＣ６３６６５＆ＡＡＣ６３６８１）に対し６３％の同一性を有していた。ＣＪＡＳ１のＯＲＦは計算分子量２８．４ｋＤａの２５０アミノ酸のポリペプチドをコードしていた。該ポリペプチドは、それぞれクラスＩグルタミンアミドトランスフェラーゼ（ＧＭＰ合成酵素）の特徴を表す数アミノ酸の２つのドメインを含んでいた（ＫＩＬＧＩＣＦＧＨＱおよびＨＬＦＣＩＱＧＨＰＥＹＮ）（図５を参照されたい）。
【０１０１】
ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、大腸菌ＧＭＰ合成酵素突然変異体ｇｈｔ１に形質転換した（Van Lookeren Campagne ら,. J. Biol. Chem. 266,16448-16452 1991）が、相補性は観察されなかった。したがって、該タンパク質は基質として芳香族化合物を利用するＧＭＰ合成酵素とは異なるアミドトランスフェラーゼ活性をコードしていると推論される。これは繊維（および種皮）の形成に関与する別の経路であり芳香族化合物を利用する経路であるフェニルプロパノイド経路に見られる類似の工程と似ている。フェニルプロパノイド経路においては芳香族アミノ酸であるＬ−フェニルアラニンが、酵素ファニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）の基質である。ＰＡＬの酵素活性は脱アミノ化により桂皮酸の形成を導き、徐々にリグニンモノマーの形成を導く。今回の場合、ＣＪＡＳ１はおそらく別の二次代謝産物経路において利用されるリアーゼ活性をコードする酵素のサブユニットであり、該酵素活性の減少（遺伝子発現のアンチセンスＲＮＡ阻害によって証明されるように）は、フェノール関連化合物の形成の変化をもたらす。この変化により、種子におけるその他の化合物、特に、繊維形成に関与していることが知られている化合物の形成にさらに影響を及ぼすと考えられる。
【０１０２】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０３】
塩化銅処理によって誘導される遺伝子のクローニング
この実施例においては誘導植物細胞および非誘導植物細胞のディファレンシャルスクリーニングを用いて塩化銅処理によって優先的に誘導されるｃＤＮＡを単離した。アブラナ属カリナタ(Brassica carinata)（育種系統Ｃ９０−１１６３、Agriculture and Agri-Food Canada Research Station, Saskatoon)をNutricote14-14-14肥料で改変したTerra-Lite-Redi-Earthにおいて栽培した。該植物をConviron Model PGV36グロースチャンバーで日中温度２１℃／夜間温度１９℃で明期１６時間にて栽培した。Sylvania長期実用４０Ｗ白熱電球およびSylvania冷白色蛍光灯２１５Ｗによって与えられる光強度は１８０／μＥｓ／ｍ２であった。アブラナ属カリナタ(Brassica carinata)種の植物を５ｍＭの塩化銅を流れ出すまで葉に噴霧することによって処理した。Ｈ２Ｏまたは５ｍＭＣｕＣｌ２を噴霧して１２時間後に、４週齢のアブラナ属カリナタ(Brassica carinata)植物の葉からトータルＲＮＡを抽出した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを公表された手順（Wu, W. (1997) Methods in Gene Biotechnology. Boca Raton, FL: CRC Press）にしたがって、オリゴ（ｄＴ）−セルロース樹脂(Life technologies)を用いてトータルＲＮＡから単離した。ＸｈｏＩおよびＰａｃＩオリゴ−ｄＴプライマーを用いてＣｕＣｌ２処理された葉のＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成を開始した。セカンドストランド合成およびクローニングは、λＺＡＰＩＩｃＤＮＡ合成キット(Stratagene)の製造業者の指示にしたがって行った。
【０１０４】
インビボマスエクスティンクションを製造業者(Stratagene)の指示にしたがってλＺＡＰＩＩｃＤＮＡについて行った。ファージミドＤＮＡを１９２のランダムに選択したコロニーから単離し、各ＤＮＡ試料のおよそ１００ｎｇを二枚のＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロンメンブレン（Amersham Pharmacia Biotech.)にドットブロットした。Ｈ２ＯおよびＣｕＣｌ２処理した葉からのＲＮＡを供給業者(Life technologies)の指示にしたがってオリゴ−ｄＴをプライマーとしてｓｓｃＤＮＡへと逆転写（Superscript II)した。その結果得られたＤＮＡをHifh Prime (Roche Molecular Biochemicals)を用いて標識した。ハイブリダイゼーションは４２℃で一晩、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ（２０ｘＳＳＰＥ、ｐＨ７．４＝１７４ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２７．６ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、７．４ｇ／ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ）、５ｘデンハルト（５０ｘデンハルト＝１０ｇ／ｌフィコール分子量およそ４００ｋＤａ、１０ｇ／ｌポリビニルピロリドン分子量３６０ｋＤａ、１０ｇ／ｌウシ血清アルブミン）、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ一本鎖魚ＤＮＡ(Roche Molecular Biochemicals)中で行った。メンブレンを２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ、ｐＨ７．０＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．０５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで室温で１５分間洗浄し、その後０．２ｘＳＳＣ、０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで３回、それぞれ６０−６５℃で１５分間洗浄し、ついでＸ線フィルム(Kodak, XAR-5)に露出してオートラジオグラフィーを行った。５’−ｃＤＮＡ末端のラピッド増幅を５’−ＲＡＣＥシステム（Version 2.0)キットを用いて製造業者(Life technologies)の指示に記載のように行った。ＰＣＲ産物を配列決定用のベクターｐＣＲ２．１(Invitorogen)にクローニングした。
【０１０５】
多くの配列が既知の遺伝子、特に防御応答に関与する遺伝子に対して類似性を示した。これらの配列についてはさらなる研究を行わなかった。しかし少数のｃＤＮＡは既知の配列に対して相同的ではなく、これらのｃＤＮＡをユニーク防御関連配列として特異的に同定した。これらのｃＤＮＡのうちの１つ、ＣＪＡＳ１の配列を配列番号１に示す。ＣＪＡＳ１の推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【実施例２】
【０１０６】
防御関連配列を用いたアンチセンス遺伝子の構築
塩化銅によって特異的に誘導され既知の機能を有する遺伝子のいずれにも相同性を示さないｃＤＮＡを用いてアンチセンスＲＮＡ形質転換ベクターを構築した。２つの(duplicate)３５Ｓプロモーターを含む植物形質転換ベクターをアンチセンス配列の発現用に用いた。形質転換ベクターはＲＤ４００(Datla, R. S. S., Hammerlindl, J. K., Panchuk, B., Pelcher, L. E., および Keller, W., 1992, Gene 211: 383-384）であった。
【０１０７】
アンチセンスＲＮＡ遺伝子の構築のために用いた植物形質転換ベクターは、標準的ベクター／インサートライゲーション技術を用いて２つの(double)３５Ｓプロモーターに対してアンチセンス方向に防御関連ｃＤＮＡを挿入（ライゲーション）することによって構築した。ｃＤＮＡの方向は制限酵素切断地図作成により確認した。ベクターに挿入したｃＤＮＡの制限酵素切断地図を図１に示す。
【実施例３】
【０１０８】
アンチセンス形質転換ベクターによる植物の形質転換
防御関連ｃＤＮＡを用いて作成されたアンチセンス遺伝子を担持する植物形質転換ベクターを用いて植物形質転換を行った。形質転換に用いた植物種はアブラナ属カリナタ(Brassica carinata)の選抜株(selection)であり、最初に塩化銅処理したものと同じ選抜株であった。アブラナ属カリナタ(B. carinata)の選抜株は暗色の厚い種皮を有する。形質転換にはアグロバクテリウム・トゥミファシエンス(Agrobacterium tumifaciens)株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０（KonczC. & Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396）を用いた。形質転換ベクターを標準的技術を用いてアグロバクテリウム株に導入した。植物外植片を３日間共培養し、選抜培地に移した。植物をカナマイシンで選抜した。
【実施例４】
【０１０９】
黄色種子の形質転換植物の単離
形質転換したアブラナ属カリナタ(B. carinata)を目視による特徴づけによって分析した。植物内でのアンチセンスＲＮＡ発現方法により分析した５つの独立のｃＤＮＡのうち、アンチセンス方向のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）を含む１つのベクターから、黄色種皮を有する形質転換植物が多数生じた。対照形質転換植物および４つの他のｃＤＮＡで形質転換した植物では暗色の種皮が優勢であった。野生型アブラナ属カリナタ(Brassica carinata)とアンチセンスＣＪＡＳ１（配列番号１）を発現するトランスジェニックアブラナ属カリナタ(Brassica carinata)から得られた種子試料の比較を図２ａおよび図２ｂに示す。
【実施例５】
【０１１０】
黄色種子形質の分離
ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡを３５Ｓプロモーターの制御下にアンチセンス方向に含む形質転換植物を自家受粉させ、その結果生じた子孫について黄色種子の存在が観察された。ほとんどの植物系統において黄色種子：暗色種子は３：１の比で観察され、アンチセンス遺伝子の単一部位での挿入が示された。
【実施例６】
【０１１１】
形質転換系統の繊維含量
トランスジェニック系統および非トランスジェニック系統からの種子を粗繊維含量について分析した。パーセント粗繊維、酸性界面活性剤繊維および中性界面活性剤繊維の方法は、the Association of Official Agricultural Chemistsから発行されているthe book Dietary fiber Analysis and Applications (セクションまたは方法指定), 7.061-7.065 および National Forage Testing Association procedures 4.1, and 5.1.に記載のように行った。それぞれ別々に由来するトランスジェニック系統に事象(event)として名称をつけた。これらの事象は表１においてアブラナ属カリナタ事象 （B. carinata Events）と称される。分析した１３のトランスジェニック系統のうち５つが３０％を超える粗繊維含量の減少を示し、さらに４つの系統が統計的に粗繊維含量レベルの減少を示した。したがって１３のトランスジェニック系統のうち９系統がアンチセンス方向でのＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）の発現の結果として繊維含量の減少を示した。
【０１１２】
試験したすべてのトランスジェニック事象のパーセント粗繊維（リグニン画分、セルロース性画分、ヘミセルロース性画分およびペクチン画分を表す）はヌル対照よりも低かった（表１および図３）。粗繊維含量が最も減少したのは事象９０−１８−１から観察されたものであった。これはヌル対照よりも３６．３％低かった（表１および図３）。４つのその他の独立の事象、９０−６−１、９０−１７−１、９０−２５−１および９０−３４はヌル対照よりも少なくとも３０％低い粗繊維レベルを有することが見出された（図３）。
【０１１３】
表１：温室栽培したトランスジェニックアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）からの繊維分析の要約。値は２つの別々の測定の平均として表す。パーセント粗繊維、酸性界面活性剤繊維および中性界面活性剤繊維の方法はAOAC 7.061-7.065, NFTA 4.1, NFTA 5.1, (the Association of Official Agricultural Chemists および the National Forage Testing Associationに概説されている方法の指定, 前述を参照) に記載のように行った。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】
試験したすべてのトランスジェニック事象の酸性界面活性剤繊維含量はヌル対照と比較して減少していた（図４）。酸性界面活性剤繊維（ＡＤＦ）分析は酸に溶解しないセルロース性残基および酸安定性リグニン残基を測定する傾向に有る。事象９０−１８−１ではヌル対照と比較してＡＤＦ含量が４０％減少していることが観察された（表１および図４）。粗繊維が最も減少していた（図３）５つの事象（９０−１８−１，９０−６−１，９０−１７−１，９０−２５−１および９０−３４）ではヌル対照と比較してＡＤＦ含量ももっとも減少していることが見出された（図４）。データは、これらの５つの事象ではヌル対照と比較して酸不溶性リグニンおよびセルロース性画分が減少していることを示唆する。
【０１１６】
中性界面活性剤繊維（ＮＤＦ）分析はミールに存在するリグニン（不溶性および酸可溶性）画分、セルロース性画分およびヘミセルロース性画分を測定する傾向に有る。事象９０−６−１、９０−２５−１および９０−３４−１ではそれぞれＮＤＦが１３．５％、１３．９％、および１３．３％減少していた（図５）。事象９０−６−１、９０−２５−１および９０−３４−１では粗繊維含量およびＡＤＦも最も減少していた（図３および図４）。
【実施例７】
【０１１７】
アンチセンス形質転換ベクターによるアブラナ（Brassica napus）植物の形質転換
この実施例では、アンチセンス方向にＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）を含む植物形質転換ベクターを用いて暗色の厚い種皮を有するアブラナ（Brassica napus）植物を形質転換した。形質転換にはアグロバクテリウム・トゥミファシエンス（Agrobacterium tumifaciens）株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０(KonczC. & Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) を用いた。形質転換ベクターを標準的技術を用いてアグロバクテリウム（Agrobacterium）株に導入した。植物外植片を３日間共培養し、次いで選抜培地に移した。植物をカナマイシンで選抜した。多数のトランスジェニック植物系統を回収し、自家受粉させ種皮の色を分析した。以下の表２に結果を示し、アンチセンス方向でのＣＪＡＳ１（配列番号１）の発現はアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）以外の植物種においてもより明るい種皮の色を生じさせることが出来ることが例示される。
【０１１８】
表２：様々な形質転換事象についての温室栽培されたトランスジェニックアブラナ（Brassica napus）からの種皮の色の分析の要約。先の実施例において記載したものと同じ形質転換コンストラクトを用いた。種子は目視観察によって別々に評価した。形質転換事象の大部分の平均的種子色は、野生型非改変アブラナ（Brassica napus）のものより明るかった。
【０１１９】
【表２】
【実施例８】
【０１２０】
アブラナ属カリナタ（B. carinata）におけるＣＪＡＳ１発現
野生型アブラナ属植物から採取した様々な植物組織のノザンブロットによりＣＪＡＳ１遺伝子発現を調べた（データは示さず）。
【０１２１】
ＣＪＡＳ１遺伝子は多くの組織−根、茎、葉、花芽、長角果−における構成的発現は低いということが見出された。花芽および長角果における転写産物の量はその他の組織よりわずかに多かった。転写産物の量は、Ｃｕ，ＭｅＪＡ，ＳＡおよびＡＢＡ処理によりさらに増加した。興味深いことにＣＪＡＳ１の増加した転写産物の蓄積の時期は処理によって異なる。ＣｕおよびＭｅＪＡに対する迅速な応答は膜損傷に感受性の制御機構を示唆する。４種類の化合物によるＣＪＡＳ１転写の活性化は並外れているが、先例のないものではない。
【実施例９】
【０１２２】
ＢｃＣＪＡＳ１の発現に対する阻害剤の効果
一酸化窒素（ＮＯ）スカベンジャーである２−フェニル−４,４,５,５−テトラメチルイミダゾリノン−３−オキシド−１−オキシル（ＰＴＩＯ）、タンパク質ホスファターゼタイプ１および２Ａ阻害剤であるオカダ酸（ＯＫＡ）、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン（ＳＴＡＵ）およびタンパク質翻訳阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）のアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）におけるＣＪＡＳ１の誘導／発現に対する効果を測定した。これらの阻害剤研究からのデータ（示さず）は、不安定タンパク質またはリン酸化を必要とするタンパク質によって、ＣＪＡＳ１の発現が積極的に抑制され、あるいは、転写産物が迅速にターンオーバーされることを示唆する。ＳＴＡＵはＣＪＡＳ１発現の誘導においてＭｅＪＡと相乗的に作用した。非誘導物質においてもＰＴＩＯ、ＯＫＡ、ＳＴＡＵおよびシクロヘキシミドはすべてＣＪＡＳ１転写産物蓄積を増加させた。ＮＯ除去がどのようにして転写を活性化するのか理解しがたいが、ＮＯによるウサギ糸球小体細胞におけるＬ−型Ｃａ２＋チャンネルの阻害が最近報告された。それゆえＰＴＩＯ処理はＣａ２＋チャンネル活性の上昇を間接的にもたらし、その活性の上昇が、順次ＣＪＡＳ１転写を刺激するようである。
【０１２３】
これらの結果は、ＣＪＡＳ１遺伝子が通常のハウスキーピング機能およびストレス応答に関与している可能性を示唆する。
【０１２４】
サザンブロット分析により、アブラナ属カリナタ（B. carinata）ゲノム中に当該遺伝子が２−４コピー存在することが示された。
【実施例１０】
【０１２５】
アブラナ属カリナタ（Brassica carinata）からの第二のＣＪＡＳ１相同的ｃＤＮＡの単離
本出願の発明者らは（製造業者の指示にしたがって）Invitrogen Generacer ５’ＲＡＣＥキットを用い、５ｍＭ ＣａＣｌ２を噴霧したアブラナ属カリナタ（B. carinata）の葉の組織からＲＮＡを単離し、アブラナ属カリナタ（Brassica carinata）のＣＪＡＳ１（配列番号１）に相同的なさらなるヌクレオチド配列が単離できるかを調べた。対応するプロトコールは、増幅工程前に切断された転写産物を除くことにより全長のｍＲＮＡのみの増幅を保証するものである。この方法はｍＲＮＡキャップ依存性であり、それゆえ全長であって５’キャップ構造と３’ポリＡテイルの両方を含むｍＲＮＡのみを選抜するものである。目的のｃＤＮＡを次いでＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ配列（配列番号１）の最初の１０４４塩基対に基く遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーを以下に示す：
ＴＷ１＝５’ＣＣＴＴＣＡＣＧＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧ３’（配列番号６）
ＴＷ２＝５’ＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣ３’（配列番号７）。
【０１２６】
この手法により配列番号１に対して相同的なアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）からの４０９塩基対のｃＤＮＡ断片が増幅および精製された。Generacer-由来アブラナ属カリナタ（B. carinata）産物の５’末端の配列アラインメントはこのｃＤＮＡ（配列番号３の５'末端に対応する）と最初に同定されたＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）が同一ではないことを示す。この点について、それぞれ図６ａおよび６ｂに示すように、ヌクレオチドおよびペプチド配列アラインメントはこの領域において８６％の類似性があり、最初の４０９ｂｐにおいて２つの配列の間に４９ヌクレオチド（および５アミノ酸）の違いが有ることを示す。ヌクレオチドの差の大部分は、最初のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡクローンには見られないGeneracer産物における１０ヌクレオチドの挿入を含む５’非翻訳領域において見られた。しかしながら、最初のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡにおいて、Generacer産物には見られない４つのさらなるヌクレオチドが存在した。 アミノ酸変化のうち３つは保存的であったが、残りの２つは非極性アミノ酸から塩基性アミノ酸への置換であった。
【０１２７】
それゆえアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）における２コピーのＣＪＡＳ１遺伝子にはわずかな配列変動が存在し、同時にアミノ酸も変動していた。ＣＪＡＳ１遺伝子は推定グルタミンアミドトランスフェラーゼドメインをコードする。データベースのタンパク質に対する類似性に基き、それはヘテロダイマー酵素のサブユニットのようである。
【実施例１１】
【０１２８】
アブラナ（Brassica napus）からのＢｃＣＪＡＳ１のホモログの単離
５ｍＭ ＣｕＣｌ２を噴霧したアブラナ（Brassica napus）の葉から単離したトータルＲＮＡを用いて本発明者らは、実施例１０にしたがって同じプライマー（配列番号６および７）を用いてGeneracer ５’ＲＡＣＥプロトコールを行った。このようにして本発明者らは実施例１０においてアブラナ属カリナタ（Brassica carinata ）から得た部分ＣＪＡＳ１配列と同一の、部分的ｃＤＮＡアブラナ（Brassica napus）ヌクレオチド配列を単離するのに成功した。このアブラナ（Brassica napus）産物の配列を用いて、全長アブラナ（Brassica napus）ｃＤＮＡを増幅するための遺伝子特異的プライマーを設計した。全長アブラナ（Brassica napus）産物を増幅するために用いたプライマーは、オリゴｄＴと以下のプライマーであった：
ＴＷ８＝５’ＡＴＴＧＣＡＣＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴ３’（配列番号８）。
【０１２９】
このようにしてＰＣＲ増幅によりアブラナ（Brassica napus）からの全長ＣＪＡＳ１ホモログを単離することに成功し、該ｃＤＮＡの配列を標準的ＤＮＡ配列決定技術を用いて特徴づけした。全長ｃＤＮＡ産物の配列を配列番号３に示し、対応する予測ペプチド配列を配列番号４に示す。
【０１３０】
全長アブラナ（Brassica napus）ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号３）に加えて、以下のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）遺伝子配列に基くプライマーを用いてＣＪＡＳ１様遺伝子について部分ｃＤＮＡ配列を得た。
ｇｂＡＡＣ６３６８１に基く、
ＴＷ１０＝５’ＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＣＣＴＡＴＴＧＴＴＴ３’（配列番号９）
ｅｍｂＣＡＢ７９７７３に基く、
ＴＷ１２＝５’ＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＡＣＴＡ３’（配列番号１０）
【０１３１】
アブラナ（Brassica napus）から得たこのさらなるＣＪＡＳ１様部分ｃＤＮＡの配列を配列番号５に示す。
【実施例１２】
【０１３２】
アブラナ（B. napus）のサザンブロット分析
遺伝子コピー数を調べ、遺伝子変動を調べ、関連遺伝子が存在するかを決定するために、アブラナ（Brassica napus）についてサザンブロット分析を行った（Sambrook ら, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)にしたがった）。ＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化した。ＢａｍＨＩは３つの酵素のなかで唯一ｃＤＮＡ配列の内部を切断するものであるため２つのハイブリダイズする断片が生じるはずである。各消化産物をゲルで泳動してブロットを配列番号３の最初の４０９ヌクレオチドを含む短い５’アブラナ（B. napus） Generacer産物をプローブとして探索した。低いストリンジェンシーでの洗浄を行い、ブロットをオートラジオグラフィーで現像した。
【０１３３】
予想した通り、ＣＪＡＳ１遺伝子のほぼ同一コピーに対応する２つの強くハイブリダイズする断片がＢａｍＨＩゲノム消化産物のレーンにおいて観察された。この消化産物において４つの弱くハイブリダイズする断片も観察された。１つの強くハイブリダイズする断片がＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡにおいて存在した。さらに１から２の弱くハイブリダイズする断片がこの消化産物において観察された。ＳａｌＩ消化したＤＮＡにおいては１つの強くハイブリダイズする断片のみが観察された。それゆえＣＪＡＳ１は密接に関連する遺伝子ファミリーのメンバーではない。アブラナ（B. napus）ゲノムにおいて離れた関係に有る２から４の遺伝子が存在する可能性が有る。
【実施例１３】
【０１３４】
コンピュータに基く配列データベースの探索によるＣＪＡＳ１遺伝子（およびコードされるペプチド）に相同性を有するヌクレオチドおよびペプチド配列の同定
図７に示すように本発明者らは手操作によってＣＪＡＳ１の推定アミノ酸配列（配列番号１から得た）と、いくつかの細菌性アミドトランスフェラーゼのＧ−型ＧＡＴドメインとのアラインメントを作成した。配列類似性は明らかに存在するが、明らかにＣＪＡＳ１ｃＤＮＡは合成酵素ドメインをコードするものではない（図７には示さず）。
【０１３５】
デフォールトパラメータを用いるＮＣＢＩのヌクレオチドおよびタンパク質データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいてもＣＪＡＳ１（配列番号１）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を用いた。その結果、ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡに対して８６％の同一性を有する、ＢＡＣ Ｆ１７Ｉ２３（登録番号ＡＦ１６０１８２）からのシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ゲノム配列が明らかとなった。３つのその他の関連タンパク質は配列番号１に対して５９−７０％の相同性を有していた。アブラナ科ファミリーの植物におけるこの類似性は予期せぬものではない。その他の植物種において相同的活性が見出されることが予測される。配列番号１にコードされる推定ペプチド配列（即ち配列番号２）と、ＢＬＡＳＴサーチによって同定された５つの対応するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ペプチド配列とのペプチド配列アラインメントを図８に示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１３６】
配列番号６ ＴＭ１プライマー
配列番号７ ＴＭ２プライマー
配列番号８ ＴＭ８プライマー
配列番号９ ＴＭ１０プライマー
配列番号１０ ＴＭ１２プライマー
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１はＣＪＡＳ１ｃＤＮＡを含む植物形質転換ベクターを示す。矢印は３５Ｓプロモーターからのアンチセンス発現方向を示す。
【図２ａ】図２ａは野生型アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの種子を示す。
【図２ｂ】図２ｂはＣＪＡＳ１（配列番号１）をアンチセンス方向に発現するトランスジェニックアブラナ属カリナタから得た種子を示す。
【図３】図３はトランスジェニックアブラナ属における粗繊維の減少のグラフ表示を示す。
【図４】図４はトランスジェニックアブラナ属における酸性界面活性剤繊維の減少のグラフ表示を示す。
【図５】図５はトランスジェニックアブラナ属における中性界面活性剤繊維の減少のグラフ表示を示す。
【図６ａ】図６ａは最初のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの配列番号１）の５’−末端およびアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から得た第二の相同的ｃＤＮＡクローン（アブラナ属アブラナ（Brassica napus）から得た全長ｃＤＮＡである配列番号３の５’−末端と同一）との配列アラインメントを示す。
【図６ｂ】図６ｂは最初のＣＪＡＳ１遺伝子産物の予測ペプチド配列（アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの配列番号２）のアミノ末端と配列番号４に示す予測ペプチド配列との配列アラインメントを示す。
【図７】図７は配列番号１からの選択された領域と、いくつかのクラスＩグルタミンアミドトランスフェラーゼの２つのドメインからの既知のペプチド配列との手操作によるアラインメントを示す。
【図８】図８は配列番号２と、実施例１３に記載のようにＢＬＡＳＴサーチから同定されたシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)からの相同的ペプチド配列との配列アラインメントを示す。
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、植物における種皮の形成および種子の繊維含量に関係する植物遺伝子に関する。特に、本発明はアブラナ属およびその他の種からの種皮の形成および種子の繊維含量に関与する植物遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
植物の種子は胚および子葉を含む多種類の組織を含み、それらは通常種皮と称される厚い木化した組織の層に包まれている。一般に、種皮は植物種子の消化不能な繊維の総含量のかなりの部分を含む。繊維含量が減少した植物種子は、飼料生産物として使用するための多くの利点をもたらす。したがって、種皮組成の変化、および種子のその他の組織の組成の変化によって繊維含量が減少すると、現在飼料として用いられている植物種子の改良がもたらされる。
【０００３】
種皮は発芽前の種子を保護する機械的障壁を提供し、それにより種子は休眠を維持でき、あるいは機械的攻撃に抵抗できる。植物種の中には非常に強い種皮を有するためかなりの機械的および環境的侵襲に抵抗し得るものもある。植物種の中にはより薄い種皮を有するため機械的障害からの保護の程度が限られているものもある。種皮の性質は遺伝的に決定され、典型的には植物種の生物学および生態学に相関する。
【０００４】
商業的に関心を持たれている多くの作物種においては、種皮が高レベルの消化不能な繊維を含有する傾向にあり、油用、食物用またはその他の産物用の種子の加工において廃棄産物となることがよくあるため、厚い種皮は一般に望ましくない。種皮は植物種子食物の繊維含量のかなりの部分に寄与している。したがって、種皮の減少は多くの作物種における作物改良の重要な目的である。しかし、種子自体の保護のための種皮の重要性により、種皮をいくらか減少させても、種子の収穫、加工、または定植の間の損傷または障害から種子を保護することが出来る。したがって、種皮の大きさおよび組成と、種皮が提供する機械的障壁機能の間のバランスが保持されなければならない。
【０００５】
種皮（または外皮）の組成も多くの作物種、特に飼料用のものの改良のために考慮される。植物種子からの食物の繊維含量は食料の製造のために考慮される重要なものである。多くの用途のための飼料産物の繊維レベルは注意深く維持されなければならない。というのは食物繊維が高レベルであると食物の有用性が低くなり、食物の有用性が制限される場合があるからである。植物細胞壁は食物繊維の大部分を構成し、この繊維は比較的少ない数の開始化合物からなり、それらは多種類の最終産物へと組み込まれる。細胞壁の基質は多くの繊維構成物を含み、この繊維は共有結合および非共有結合した様々なポリマーからなる。
【０００６】
共有「繊維」結合の例は、ペクチンおよび非セルロース多糖においてみられるもののようなエステル型架橋結合糖残基および架橋結合リグニンおよびエクステンシン分子を含む。非共有「繊維」結合は、セルロース繊維における結合およびペクチン間のＣａ＋＋イオン架橋を含む。アブラナ属の種子の細胞壁およびそれに付随する「繊維」成分は一次細胞壁およびいくらかの特殊化した型のものを含む。種子は３つの主要部分、子葉、胚軸、貯蔵組織からなる。子葉は一般に、厚い、木化およびコルク質化した、様々な消化不能な化合物が組み込まれた細胞壁を含む果皮および外種皮とは対照的に、薄い壁の柔細胞である。したがって、外皮を取る手段は、高繊維含量の種子の部分の物理的分離において明らかに有用である。外皮は重量ベースでは種子の比較的小さい部分であるが、種子の繊維含量のかなりの量を含む。しかし繊維含量をさらに減少させるのが望ましい。
【０００７】
残念ながら、植物における各細胞型の繊維成分の正確な生化学的組成は決定されていない。それゆえすべての「繊維」総含有量は帰納的結果になりがちであり、繊維成分の正確な組成を正確に反映するものではない。もっとも簡単で一般的なレベルにおいて植物細胞壁または繊維は主に４つの複雑な化合物から構成される。これらはセルロース、非セルロース多糖、タンパク質およびフェノール化合物即ちリグニンである。セルロースは単純な化合物でありグルコースの繰り返し残基からなるが、この分子の正確な超分子構造は複雑である。非セルロース多糖は酸性ペクチン多糖、ヘミセルロースおよび様々な構造的に異なる糖のポリマーからなる。繊維には多くのタンパク質成分もあり、その大部分は多くの化合物のさらなる架橋のための骨格を形成する独特のタンパク質であるエクステンシンである。もちろんリグニンは主要なフェノール性成分である。たいていこれらの化合物は全く食事において単胃動物には有効利用されない。
【０００８】
種子および種子食物における繊維含量は一般に粗繊維、酸性界面活性剤繊維または中性界面活性剤繊維として表される。粗繊維（ＣＦ）は典型的には種子のリグニン画分、セルロース性画分、ヘミセルロース性画分およびペクチン画分を含む。酸性界面活性剤繊維（ＡＤＦ）は典型的にはセルロース性画分および酸安定性リグニン画分を含み、中性界面活性剤繊維（ＮＤＦ）は、リグニン、セルロースおよびヘミセルロース成分を表す傾向にある。したがって、繊維という語は多くの異なる化学成分を意味し得る。これらの様々な繊維成分のレベルの決定方法は、ＡＯＡＣ（Association of Official Agricultural Chemists)法にしたがって標準化されている。
【０００９】
種子食物の消化可能性は繊維成分の組成に依存している。種皮または外皮のなかには高度に木化していて一般に摂取後の分解に対して耐性であるものもある一方、種皮の中には動物の腸において簡単に分解できる組成を有するものもある。したがって、繊維含量の低い種皮が作物改良の重要な目的である。同様に種皮の組成は種子およびタンパク質、デンプンまたは油などの種子産物の加工にも影響を及ぼすため、より加工しやすい種皮が好ましい。これは、色素レベルの低い種皮または二次代謝産物組成が変化した種皮も含む。
【００１０】
一般にアブラナ属の脂肪種子作物は粉砕技術の使用によって油およびミールへと加工される。油は種子の破壊の後、種子から抽出され、残った固体物質をミールと称する。一般に種皮はミール画分に見られ、加工の前に種皮を除去する（種子の外皮を取り除く）ことは可能であるが、外皮の除去には余分のコストがかかり、余分の廃棄産物を生み出す。
【００１１】
アブラナ属においては、多くのタイプの脂肪種子品種があり、高エルカ酸、ナタネ、およびキャノーラ品質の品種が含まれる。キャノーラ品質の品種は、食用油用に栽培される脂肪種子アブラナ属の種の中で最も主要な型である。キャノーラ品質とは高価値の食用油を提供する、グルコシノラート(glucosinolate)およびエルカ酸含量が少ない特定の油組成のものを指す。高レベルのエルカ酸を産生するアブラナ属の品種は工業的目的で栽培され、ナタネ系統は食用油生産には一般に用いられておらず、例外的に市場が低品質のナタネ油を許容するような特定の状況および場所において用いられるに過ぎない。ナタネは広範に栽培されてはいるが、ナタネ油はキャノーラ品質の油のように高価に売れるものではない。したがって、キャノーラ品質の品種は産業において高い価値を有するものである。
【００１２】
多くのアブラナ属の種は典型的には暗色の種皮を有する種子を産生し、いくらかの種は黄色の種皮を有する種子を産生する。キャノーラ品質の脂肪種子であるアブラナ（Brassica napus)の通常の黒色種皮は、キャノーラ種子の典型的な加工においてキャノーラ品種の油とミールの両方に望ましくない外観の特性を与える。キャノーラ種子を粉砕する際、油画分とミール画分は分離され、それらには種皮または種皮にみられる色素が混入する。油は加工の初期段階に暗色となり、それによって外観が悪くなる。ミールにおいては明色のミールに混入したわずかの黒色種皮により、昆虫がはびこったようにみえるようになる。したがって色のより明るい種皮がキャノーラ粉砕産業において有用である。
【００１３】
種皮が少ないキャノーラ品質のアブラナ属の種子の育種がキャノーラ育種家にとって重要な目的である。アブラナ属の種の中には、色が黄色の種皮を有するものがあり、その黄色は一般により薄くサイズの小さい種皮に関連していることが判明した。黄色の種皮は繊維含量も少ないようであり、通常暗色の厚い木化した種皮に付随する特定の色素または二次代謝産物を含まないためにより消化性がよいようである。アブラナ属の黄色い種子の種から得られるミールは通常繊維含量が少なく、パーセンテージベースでより高いタンパク質含量を有する産物を提供するため、より価値が高い。したがって、種皮のサイズの減少によって多くの利点がもたらされる。したがって、黄色い種皮を有するアブラナ(Brassica napus)種の開発がアブラナ属脂肪種子産業の重要な目標である。
【００１４】
アブラナ属において黄色い種皮の形成をコードする遺伝子の新規な供給源を見出すための上記の目標について研究がなされてきた。例えば、Wu- JiangSheng ら、 1997, Study on a new germplasm resource of a dominant gene controlling yellow seed coat in Brassica napus L., Journal of Huazhong-Agricultural-University., 16: 1,26-28., Wu-JiangSheng ら、 1998, A study on the inheritance of a yellow-seeded mutant of rapeseed (Brassica napus L.)., Chinese- Journal-of-Oil-Crop-Sciences 20: 3,6-9., Li-JiaNa ら、 1998, An initial study of the inheritance of seed colour in yellow-seeded rapeseed (Brassica napus) lines with different genetic backgrounds., Chinese-Journal-of-Oil-Crop-Sciences 20: 4, 16-19を参照されたい。しかし、同定された形質のほとんどはキャノーラ品質のアブラナ属育種系統への単純な遺伝子移入には適していない。
【００１５】
アブラナ(Brassica napus)へ黄色の種皮を導入するその他の試みとしては、食用脂肪種子品質の育種系統へと開発されたその他のアブラナ属の種から黄色種子の形質を遺伝子移入することが含まれる。このような研究の例としては、Barcikowska ら、 1997, Seed coat pigmentation-F2 yellow-seed forms of Brassica juncea Coss X B. carinata Braun. Rosliny-Oleiste 18: 1, 99-102., Meng-JinLing ら, 1998, The production of yellow-seeded Brassica napus (AACC) through crossing interspecific hybrids of B. campestris (AA) and B. carinata (BBCC) with B. napus. Euphutica. 103: 3,329-333., Qi- CunKou ら、 1996, Studies on the transfer of yellow-seeded trait from Brassica carinata to B. napus. Jiangsu-Journal-of-Agricultural-Sciences 12: 2,23-28、が含まれる。このような種間交雑種から黄色種子系統を得ることは可能であるが、その結果得られる系統はその形質に関して不安定であることが多く、育種工程での形質の安定化および管理は、信頼できないものであることが多い。
【００１６】
したがって、形質を安定化させる手段を提供するためにいくらかの実験がなされてきた。例えば、Vyvadilova ら、 1999, The use of doubled haploids to stabilize yellow-seededness in oilseed rape (Brassica napus)., Czech-Journal-of- Genetics-and-Plant-Breeding. 35: 1,7-9を参照されたい。しかし、黄色種子品種を慣用的に安定化させかつ得る能力は予測不能であり、都合よく達成されない。
【００１７】
より効率的に黄色種子のアブラナ属の品種の産生を管理する手段として、黄色種子形質と同時分離する分子マーカーを同定するための研究もなされてきた。それには以下のものが含まれる: Chen-BY ら、1997, Identification and chromosomal assignment of RAPD markers linked with a gene for seed colour in a Brassica campestris-alboglabra addition line., Hereditas- Landskrona 126: 2,133-138., および Deynze-AE-van ら, 1995, The identification of restriction fragment length polymorphisms linked to seed colour genes in Brassica napus., Genome 38: 3,534-542。
【００１８】
アブラナ属において黄色い種子の着色をもたらすような変異を選抜する研究もなされてきた。ＷＯ９８４９８８９Ａ１には小胞子培養の使用および変異系統の選抜によってナタネ系統から黄色種子の特性を選抜する方法が教示されているが、その結果得られる植物はキャノーラ品質の系統へと育種しなければならず、黄色い種皮を含むキャノーラ品質の系統を作り出すには困難かつ面倒な工程を経なければならない。
【００１９】
こういった研究にもかかわらず、アブラナ属において繊維含量が低く、黄色種子形質の都合のよい供給源あるいは、その他のアブラナ属の種において天然に生じた形質を操作する都合のよい手段はいまだに見出されていない。さらに、繊維含量が低い黄色種子の品種の開発は多くのアブラナ属の脂肪種子育種計画のもっとも望ましい目的である。しかし今日までこれを達成するのは困難であった。したがって、商業的に栽培されているアブラナ(Brassica napus)脂肪種子作物のほぼすべてがいまだに暗色種子の特徴を有し、わずかのものだけが様々な程度に黄色い種子特性を有するに過ぎない。従来のキャノーラ品種の繊維含量は、低繊維、黄色種子品種の生産への努力がなされているにもかかわらず、いまだに変わらないままである。したがって、黄色種子キャノーラ品種を開発することがアブラナ属脂肪種子産業の重要な目的である。
【００２０】
アブラナ科のファミリーのメンバーを含む、アブラナ属の種に関して繊維含量を減らし、種皮の色を操作する手段の開発により、種皮の色および特性が望ましくない種からキャノーラ品質の作物種を開発する可能性が開ける。それゆえ、繊維含量が低く、種皮が変化した作物、特にアブラナ科作物を開発する能力は、新規な脂肪種子およびミール作物のさらなる開発において重要な要素である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
３．発明の概要
本発明の目的は植物種子における繊維の形成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は植物種子の種皮の形成に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は植物の種子の繊維含量を減少させるための植物を改変する方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は植物の種子の色を変化させるために植物を改変する方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は非改変植物と比べて繊維含量が減少したトランスジェニック植物を作成することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は非改変植物と比べて種子の色が変化したトランスジェニック植物を作成することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
１つの態様において、本発明は、アブラナ属およびアブラナ科の種において典型的な高繊維、暗色種皮の形成に関与するタンパク質をコードする核酸配列を提供する。本発明の核酸は正常な方向と比べてアンチセンス方向に発現させた場合、通常は暗色種皮を有するアブラナ属品種において、繊維含量の減少および黄色種皮の形成を引き起こすことが出来る。さらに本発明の核酸配列はその他の植物品種において発現させて同様の結果を達成することが出来る。
【００２８】
本発明はまた、植物種子の繊維含量の制御に関与するポリヌクレオチド配列を提供する。本発明のポリヌクレオチド配列を植物において正常な方向に対してアンチセンス方向に発現させると、暗色種皮を有する品種の種子に対して粗繊維含量が減少した種子が得られる。
【００２９】
１つの態様において、本発明は、単離ヌクレオチド配列を提供し、該単離ヌクレオチドが以下からなる群から選択されることを特徴とする：
ａ）配列番号１、またはその相補鎖、
ｂ）配列番号３、またはその相補鎖、
ｃ）ヌクレオチド配列ａ）またはｂ）によってコードされるペプチドに対して少なくとも５０％、好ましくは７０％、より好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％の相同性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ここで、該単離ヌクレオチド配列またはその相補鎖は、該ヌクレオチド配列を発現する植物において種子の発生を変化させるタンパク質またはその一部をコードする。
【００３０】
別の態様において、本発明は、単離ヌクレオチド配列を提供し、該単離ヌクレオチド配列は以下からなる群から選択されることを特徴とする：
ａ）配列番号１、またはその相補鎖；
ｂ）配列番号３、またはその相補鎖；および、
ｃ）ストリンジェントな条件（６５℃、６ｘＳＳＣ）下でａ）またはｂ）にハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ここで、該単離ヌクレオチド配列またはその相補鎖は、該ヌクレオチド配列を発現する植物において種子の発生を変化させるタンパク質またはその一部をコードする。
【００３１】
好ましくは本発明のヌクレオチド配列はアブラナ科植物またはアブラナ属の植物に由来のものである。
【００３２】
好ましくは本発明のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列の植物における発現が、非改変植物の種子と比較して、種子の繊維含量を減少させること、および／または植物の種子の色を明るくすること、によって特徴付けられる。
【００３３】
本発明はまた、ペプチドが本発明のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、単離および精製ペプチドを包含する。
【００３４】
別の態様において本発明のヌクレオチド配列は、プロモーターに操作可能に結合したヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現カセットまたはコンストラクトの作成に利用できる。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、上記のコンストラクトによって形質転換された植物細胞によって特徴付けられる植物細胞、および形質転換植物細胞から、植物体全体への再生により得られるトランスジェニック植物を含む。好適な態様において、本発明のトランスジェニック植物はアブラナ科植物またはアブラナ属の植物である。
【００３６】
別の態様において、本発明はまた、植物の種子を改変する方法を提供し、該方法は以下の工程を有することを特徴とする：
（ａ）形質転換され得、植物体全体へと再生され得る植物細胞に、植物における形質転換と選抜に必要とされるＤＮＡ配列に加えて、プロモーターに操作可能に結合した本発明によるヌクレオチド配列を含むコンストラクトを導入する工程；および、
（ｂ）該ヌクレオチド配列を含む植物を回収する工程。
もっとも好ましくは、該方法は、正常な植物からの種子と比較して繊維含量が減量している、および／またはより明るい色を呈する種子を有する植物を作成するものである。その他の態様において該方法は、プロモーターに対して、本発明のヌクレオチド配列をセンスまたはアンチセンス方向に含むコンストラクトの使用を含む。
【００３７】
本発明はまた、種子が該トランスジェニック植物および本明細書に開示する対応する方法から得られることを特徴とする、種子をも含む。
【００３８】
特別の態様において、本発明は配列表において配列番号１、３および５と称する相同的なヌクレオチド配列を開示する。本開示のために、これらの配列を包括的にＣＪＡＳ１と命名する。
【００３９】
本発明は開示したＣＪＡＳ１配列およびそのホモログを用いた植物の形質転換を提供する。植物の種子は、ＣＪＡＳ１配列のセンスまたはアンチセンス部分を含む植物形質転換ベクターまたは該遺伝子のセンスおよびアンチセンス部分の両方を含む二本鎖ＲＮＡによる、植物細胞の形質転換によって改変され得る。
【００４０】
ＣＪＡＳ１配列はまた、当該技術分野に周知の比較技術によって公共データベースに寄託されている関連する相同的配列を同定するためにも使用できるし、様々な植物種からの関連するｃＤＮＡまたはゲノム配列を同定するためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも使用できる。
【００４１】
本発明はさらに本出願において開示されたヌクレオチド配列と実質的に相同的なＤＮＡ配列の同定および単離方法を提供し、該方法は、以下の工程を有することを特徴とする：
ストリンジェントな条件下で本明細書において開示したヌクレオチド配列にハイブリダイズできるディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程；
該ディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを標識する工程；および、
該標識したディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーをプローブとして用いて、該実質的に相同的なＤＮＡ配列についてＤＮＡライブラリーをスクリーニングする工程。
【００４２】
本発明はまた本発明に含まれる単離ヌクレオチド配列の、非改変植物の種子と比較して繊維含量が減少した、および／またはより明るい色を呈する種子を有するトランスジェニック植物を作成するための使用を提供する。
（図面の簡単な説明）
【００４３】
図１：ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡを含む植物形質転換ベクター。矢印は３５Ｓプロモーターからのアンチセンス発現方向を示す。
【００４４】
図２ａ：野生型アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの種子、そして図２ｂ：ＣＪＡＳ１（配列番号１）をアンチセンス方向に発現するトランスジェニックアブラナ属カリナタから得た種子。
【００４５】
図３：トランスジェニックアブラナ属における粗繊維の減少のグラフ表示。
【００４６】
図４：トランスジェニックアブラナ属における酸性界面活性剤繊維の減少のグラフ表示。
【００４７】
図５：トランスジェニックアブラナ属における中性界面活性剤繊維の減少のグラフ表示。
【００４８】
図６ａ：最初のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの配列番号１）の５’−末端およびアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から得た第二の相同的ｃＤＮＡクローン（アブラナ属アブラナ（Brassica napus）から得た全長ｃＤＮＡである配列番号３の５’−末端と同一）との配列アラインメント。
【００４９】
図６ｂ：最初のＣＪＡＳ１遺伝子産物の予測ペプチド配列（アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの配列番号２）のアミノ末端と配列番号４に示す予測ペプチド配列との配列アラインメント。
【００５０】
図７：配列番号１からの選択された領域と、いくつかのクラスＩグルタミンアミドトランスフェラーゼの２つのドメインからの既知のペプチド配列との手操作によるアラインメント。
【００５１】
図８：配列番号２と、実施例１３に記載のようにＢＬＡＳＴサーチから同定されたシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)からの相同的ペプチド配列との配列アラインメント。
【００５２】
５．用語解説
ＤＮＡの増幅／増幅ＤＮＡ：「増幅ＤＮＡ」とは標的核酸配列の核酸増幅の産物を指す。核酸増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む当該技術分野で公知の様々な核酸増幅方法のいずれによっても達成できる。当該技術分野に公知の様々な増幅方法は、とりわけ、米国特許第４６８３１９５号および４６８３２０２号およびInnis ら. (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990に記載されている。
【００５３】
コンストラクト：コンストラクトはベクターおよびベクターに操作可能に結合したインサートを含み、ベクターおよびインサートは複製可能で所望により形質転換可能である。
【００５４】
発現：転写と翻訳との組合せを含む、タンパク質をコードするＤＮＡ配列からのタンパク質産物の生成である。
【００５５】
発現カセット：オープンリーディングフレームまたはその相補鎖と操作可能な関係のプロモーターを含むヌクレオチド配列である。
【００５６】
相同的：配列において互いに相対する個々の残基の化学的性質、順序および位置の点から、他のＤＮＡまたはペプチド配列に類似性を示すＤＮＡまたはペプチド配列。本出願の目的では、特に断りのない限り相同性はＢＬＡＳＴサーチ結果によって特徴付けられる。ＢＬＡＳＴサーチ結果では最適に一致する配列アラインメントが得られる。このように類似または同一の残基を含む配列がアラインされ必要であればギャップが与えられる。それゆえ相同性は類似性または同一性のパーセンテージとして表現され、ここで類似性は類似残基および同一残基の両方を含む。特に断りのない限り、すべてのＢＬＡＳＴサーチは以下を用いて行われる。デフォールトパラメーター：例えば、ギャップ許容、Ｅ−値＝１、所望により選択される生物、低複雑性用フィルタ、標準遺伝コード、ＢＬＯＳＵＭ６２一般目的行列；さらなる情報については、Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/tut1.html.を参照されたい。
【００５７】
同一性：相同的なＤＮＡまたはペプチド配列の比較により、配列の同じ相対位置において同一の残基が同定された後、最適一致アラインメントが得られる。本出願のためには特にことわりのない限り、相同性、最適一致アラインメントおよび同一性はＢＬＡＳＴサーチ結果にしたがって計算される（ＢＬＡＳＴサーチは例えば、ウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から入手できる）。同一性はパーセンテージとして示され、これはアラインされた配列の間のギャップ領域を除いて、比較した配列間で同一の残基のパーセンテージを示す。ＢＬＡＳＴサーチにより、配列間のギャップまたは切断領域を自動的に考慮した標準アラインメント配置が得られ、それにより「最適一致」アラインメントが提供される。
【００５８】
単離：ヌクレオチドまたはペプチドはそれに自然に付随するその他の細胞構成成分（核酸、液体、炭水化物およびその他のヌクレオチドまたはペプチド）から分離されている場合、「単離」されているという。そのようなヌクレオチドまたはペプチドは「純粋な」または「均質な」あるいは「実質的に」純粋なまたは均質なともいう。したがって化学合成されたかまたは組換えのヌクレオチドまたはペプチドは単離されていると考えられる。ヌクレオチドまたはペプチドは試料の重量の少なくとも６０−９０％、好ましくは９５％またはそれ以上、より好ましくは９９％以上がそのヌクレオチドまたはペプチドからなる場合単離されている。タンパク質の純度または均質性は例えばタンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いでポリアクリルアミドゲルの染色時の単一ペプチドバンドの可視化；高速液体クロマトグラフィー；またはその他の通常の方法によって示される。本発明のペプチドは当該技術分野で公知のいかなる手段によって精製してもよい。様々なタンパク質精製方法が、例えば、 Guide to Protein Purification, in Deutscher (ed.), Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; および Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982 に記載されている。
【００５９】
より明るい種子の色／より明るい種皮の色：非トランスジェニック非改変植物からの平均的な色の種子よりも、明るい色の種子または種皮の色を有することをいう。「より明るい」という語は、本発明のトランスジェニック植物と対応する野生型非改変植物との両方から得られる種子の色において自然の変動が存在するという理解のうえで用いられる。それゆえ「より明るい」という語はトランスジェニック植物と非改変植物とから得られる種子を比較して平均的な種子の色または種皮の色を考慮して用いられる。
【００６０】
器官：構造と機能の点から定義される植物の特定の領域。例えば植物の場合、茎、葉、葯、花粉粒または根。
【００６１】
プロモーター：ＤＮＡ配列上またはＤＮＡ配列のグループ上の認識部位であって、ポリペプチドをコードする遺伝子に対する少なくとも１つの発現制御要素を提供し、そこにＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、遺伝子のＲＮＡ合成（転写）が開始する部位。
【００６２】
繊維含量の減少：対応する非トランスジェニック非改変植物由来の種子と比較して、繊維含量が減少している本発明のトランスジェニック植物由来の種子に関する。「繊維含量の減少」という表現は、本発明のトランスジェニック植物および対応する野生型非改変植物の両方から得られる種子の繊維含量において自然の変動が存在するという理解のうえで用いられる。それゆえ、「繊維含量の減少」という表現は、トランスジェニック植物および非改変植物から得られる種子を比較した場合の平均種子繊維含量を考慮して用いられる。
【００６３】
ストリンジェントな条件：「ストリンジェントな条件」という語は、標的核酸（即ち問題の特定の核酸配列）に対する核酸プローブの、Sambrook ら, 1989, 9.52-9.55に記載のハイブリダイゼーション手順によるハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrook ら, 1989, 9.47-9.52,9.56-9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12: 203-213,1984; および Wetmurおよび Davidson, J. Mol. Biol. 31: 349-370,1968も参照されたい。一般に洗浄条件は、研究対象のハイブリッド対の計算Ｔｍ（融解温度）より低いおよそ１２−２０℃の洗浄温度を含む（Sambrook ら, 1989, pp. 9-51)。ハイブリッド対の融解温度は以下の等式によって計算できる。
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／Ｌ）
ここで、Ｌ＝ハイブリッドの塩基対長
例えば、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション条件の典型的なものは、６５℃、６ｘＳＳＣである。
【００６４】
形質転換：外来ＤＮＡ配列（例えば、ベクター、コンストラクト、または組換えＤＮＡ分子）の導入による細胞の改変。
【００６５】
トランスジェニック：細胞の形質転換工程に由来する細胞または生物であり、ここで該細胞または生物は、非トランスジェニック細胞または生物においては本来存在しない、導入された外来ＤＮＡ分子を含む。
【００６６】
トランスジェニック植物：形質転換植物細胞またはプロトプラスト由来の植物またはその子孫であって、ここで該植物ＤＮＡは同じ株の自然の非トランスジェニック植物には本来存在しない導入された外来ＤＮＡ分子を含む。「トランスジェニック植物」および「形質転換植物」という語は当該技術分野において、そのＤＮＡが外来ＤＮＡ分子を含む植物を定義するために同義語として用いられることがある。しかし形質転換植物細胞またはプロトプラストから得られた再生した植物またはカルスをトランスジェニック植物と称するのがより科学的に正確である。
【００６７】
ベクター：宿主細胞において複製可能なＤＮＡ分子および／またはそれにその他のＤＮＡセグメントが操作可能に結合して、結合したセグメントの複製をもたらすことができるもの。プラスミドはベクターの例である。
６．発明の詳細な記載
【００６８】
本発明はアブラナ科の植物における種子代謝に関与するタンパク質をコードする、一般にＣＪＡＳ１と称される核酸を記載する。本発明者らはＣＪＡＳ１によってコードされる相同的タンパク質が植物に見られる防御応答に関与し、ＣＪＡＳ１が当該技術分野において以前に記載された遺伝子に対して制限された相同性しか示さない新規な遺伝子を表すということを見出した。ＣＪＡＳ１配列はまた、アブラナ属の典型的な暗色の種皮の形成の過程で発現している遺伝子を表す。実験結果より、ＣＪＡＳ１によってコードされるタンパク質は、発達途中の種子において正常に発現した場合、多くのアブラナ属の種においてみられる、繊維含量の多い種皮を含む、通常の暗色の種皮の形成に関与していることが示された。
【００６９】
この点で、ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡを、通常は粗繊維レベルの高い暗色の種皮を有する形質転換植物においてアンチセンス方向に発現させると、予期せぬことに黄色の種皮を有し、および／または粗繊維含量が減少した種子の形成が導かれる。
【００７０】
したがって、本発明は、典型的には暗色の種子であって繊維含量の多い種子が観察される、アブラナ属の品種において繊維含量が低く黄色い色の種子の産生をもたらす。この発明によって従来の育種または突然変異技術では不可能であった、繊維含量が低いまたは繊維含量が低く黄色い種子のキャノーラアブラナ（Brassica napus）を大規模に発生させることが可能となることが予想される。さらにその他の植物種も対応する改変をすることができると考えられる。
【００７１】
ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡの単離は最初、ファイトアレキシン生合成に関与する遺伝子の研究の結果としてアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から達成された。ファイトアレキシンは植物の多くの組織に見られ、細胞防御と二次代謝にしばしば関連している。ファイトアレキシンは典型的には菌類などの病原体に応答して誘導され、様々な化学ストレスによっても誘導される。アブラナ属のファイトアレキシンは、部分的にインドールグルコシノラートを利用する、植物にコードされる酵素活性の結果として形成される。グルコシノラートは一般に栄養分吸収を阻止する性質があると考えられているため、インドールグルコシノラートの生合成は研究対象とされてきた。
【００７２】
ファイトアレキシンの生合成の制御はあまりよく理解されておらず、鍵となる制御段階の同定が植物科学者にとっての目的であった。ファイトアレキシンは細菌または菌類などの種子病原体に対してなんらかの防御を提供すると考えられており、種皮においてしばしば見出されてきた。個々のファイトアレキシンは菌類の制御において有効ではないが、種皮におけるファイトアレキシン類、木化組織およびその他の二次代謝産物の複雑な混合物は種子の疾病に対する強力な障壁を提供し得る。したがって、ファイトアレキシンの生合成は種皮の発達の間に、病原体の侵入のレベルにおいて調節されているようであり、多種類のレベルでの調節が示される。
【００７３】
現在、ファイトアレキシン生合成に関与する遺伝子についてのデータはほとんど存在しない。それゆえ本発明者らはファイトアレキシン生合成の誘導の際に誘導される遺伝子の発現を調査した。塩化銅（ファイトアレキシン生合成のエリシター）の溶液で植物を噴霧することにより、ファイトアレキシンの産生およびその他の植物防御応答が誘導されることが知られている。植物細胞を塩化銅で処理し、塩化銅誘導性遺伝子を表すｃＤＮＡライブラリーを作成した。塩化銅による誘導を示す遺伝子の多数を特徴づけする一方、そのｃＤＮＡ配列を配列決定し、その配列をデータベースエントリーと比較した（実施例を参照されたい）。
【００７４】
塩化銅処理によって特異的に誘導され遺伝子データバンクには存在しなかったｃＤＮＡをトランスジェニック植物を用いる実験に用いた。ここで該トランスジェニック植物は形質転換植物においてｃＤＮＡのアンチセンス鎖を発現する植物形質転換ベクターを用いて作成した。外来遺伝子の発現を形質転換植物において減少させるためのこの技術の適用は、当該技術分野において周知であり、表現型の変化が観察され得る。
【００７５】
アンチセンス遺伝子ベクターを含む形質転換植物は表現型の変化によって目視により調べた。この分析の結果、驚くべきことに、ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）を用いるアンチセンス遺伝子を含む、形質転換ベクターの１つが種皮の色を変化させた。本発明者らはＣＪＡＳ１ｃＤＮＡアンチセンスでの形質転換体の５０％以上が、非改変植物のより暗い色の種子と対比して、より明るい色（黄色）の種子を産生することを観察した。これらの黄色種子から、黄色種子の産生について３：１の比で分離する植物が生じた。種皮の色の変化に加え、トランスジェニック植物種子は粗繊維含量の有意な減少を示した（実施例を参照されたい）。
【００７６】
それゆえ、本発明はＣＪＡＳ１ｃＤＮＡに対応する植物遺伝子の（アンチセンス発現による）阻害により、通常は暗色の種皮が見られるアブラナ属の品種において繊維含量が減少した黄色の種子の産生が導かれるという発明を含む（実施例を参照されたい）。形質の分離の遺伝学により、単一の挿入現象が黄色種子表現型を与えるのに十分であることが示唆される。繊維含量の減少も観察された（実施例を参照されたい）。この遺伝子の発現の減少により、種皮の色および種子の繊維含量の両方を変化させることができるようである。したがって、暗色種子のキャノーラ品種から、繊維含量が低く、および／または黄色い種子のキャノーラの産生のための新規な方法が見出された。
【００７７】
本発明はアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から単離されたＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ配列（配列番号１）およびアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)およびその他の種の植物由来の他の相同的なヌクレオチド配列、およびより明るい色を有し繊維含量が減少した種子を含むトランスジェニック植物の産生のためのそのような相同的ヌクレオチド配列の使用を含む。そのような相同的配列は以下の技術のいずれによっても得ることが出来る。
【００７８】
１）ＤＮＡライブラリースクリーニング
本発明のヌクレオチド配列は、様々な植物種のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、（ディジェネレート）ヌクレオチドプローブを作成するのに用いることが出来る。関連する技術は当該技術分野においてよく理解されており、例えば、Sambrook ら, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)において提供されている。このように本出願の配列に相同的な配列は簡単に入手できる。このため、本出願において開示されたものと有意な配列同一性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド分子が本発明に含まれ、ここで、配列番号１、３または５あるいはその部分が、相同的ポリヌクレオチド分子を探索および単離するためのポリヌクレオチドプローブとして利用される。さらに本出願のものと有意な配列同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明において開示されたものと類似の生化学的特性を有する類似のタンパク質産物を生じさせると予想される。
【００７９】
ＤＮＡライブラリースクリーニングとＰＣＲ増幅技術を用いることにより、本発明者らはアブラナ（Brassica napus)から全長のＣＪＡＳ１相同的ｃＤＮＡ（配列番号３）、アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から部分ＣＪＡＳ１相同的ｃＤＮＡ（これは配列番号３の５’−末端と同一であった）、およびアブラナ（Brassica napus)からもう１つの相同的遺伝子の部分ｃＤＮＡ（配列番号５、後述）を得ることに成功した。この点についての詳細は実施例において記載する。
【００８０】
２）コンピュータに基く相同性サーチ
本出願において開示したヌクレオチドおよびアミノ酸配列を用いて、コンピュータに基くサーチ技術（例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から利用できるＢＬＡＳＴサーチ）により、相同的ヌクレオチドおよびペプチド配列を同定することが出来る。そのような技術は当業者に周知であり本出願の教示にしたがって用いられる相同的ヌクレオチドおよびペプチド配列の同定のために簡単に利用できる。
【００８１】
本発明者らはＢＬＡＳＴサーチを用いてシロイヌナズナ（Alabidopsis thaliana)においてＣＪＡＳ１ホモログを同定することに成功し、これをクローニングして、本発明による繊維含量が減少しているかより明るい色の種子を含むトランスジェニック植物の作成に用いることができる。この点については実施例において詳述する。
【００８２】
それゆえ本発明は相同的ＤＮＡ配列を単離するために当該技術分野で知られている技術によって得られるＤＮＡ配列を含み、ここで該技術は配列番号１、３および５またはその部分から選択される配列に由来するディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブを利用する。あるいは、該技術は相同的ヌクレオチドおよびペプチド配列についてＧｅｎｂａｎｋなどのデータベースをサーチする公知の配列アラインメントプログラムを利用するものであってもよい。アミノ酸配列相同性の程度はそれぞれの同定された配列によって変動する。本発明は対応するポリヌクレオチドによってコードされるペプチド配列について少なくとも５０％の配列相同性を含むポリヌクレオチド配列を含む。理論に拘束されるわけではないが、少なくとも５０％の相同性を有する酵素は範囲が類似した酵素活性を有すると当該技術分野で一般に予想される。この点において酵素の必須の構造特性は酵素の触媒部位のコンフォメーションを固定するように保存される。それゆえ本発明は本出願の配列由来のディジェネレートＤＮＡプローブを用いて、アブラナ属カリナタ(Brassica carinata)、アブラナ(Brassica napus)以外の種のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られるポリヌクレオチド分子も含む。そのような種にはその他のアブラナ科の種およびアブラナ属に含まれる種が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００８３】
本発明は本発明のポリヌクレオチドまたは好適なヌクレオチドデータベース（例えばＧｅｎｂａｎｋ）からの配列アラインメント由来のディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブを用いてＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られるポリヌクレオチド配列も含み、ここで該配列は、配列番号１、３および５によってコードされるペプチドに対して少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性を含むペプチドをコードする。この点で、少なくとも７０％の予想アミノ酸配列相同性を有する相同的タンパク質は本発明によって定義された活性を有するタンパク質を含むと予想され、ここで相同的タンパク質の発現の破壊は繊維含量が減少した、および／またはより明るい色の種子を含む植物を生じさせると予想される。そのようなタンパク質は類似の植物種から由来するものであってもよい。
【００８４】
本発明はまた、配列番号１、３および５によってコードされるペプチドと少なくとも９０％または９５％の配列相同性を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も含む。このクラスの関連タンパク質は非常に類似または同一の触媒活性を有する近接した遺伝子ファミリーメンバーを含む。さらに９０％から９５％のアミノ酸配列相同性を有するペプチドは類似の植物種の機能的ホモログに、あるいは本出願に開示された配列に向けられた突然変異に由来し得る。
【００８５】
部位特異的突然変異誘発技術を本発明のポリヌクレオチド配列に簡単に適用することが出来ることが当業者に理解されるであろう。関連技術が当該技術分野で知られており、例えSambrook ら, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)において提供されている。この点で本発明は配列番号１、３および５に提供されるＤＮＡ配列の単離および特徴づけを教示する。しかし本発明はこれらの特定の配列に限定されるものではない。多数の特異的突然変異誘発技術によって、技術者であればヌクレオチド配列において１または複数の残基を変化させることが出来、それによってその結果発現されるポリペプチド配列を変化させることが出来る。さらに多くの製造業者から入手できる市販の「キット」によっても特異的突然変異誘発を行うことが出来る（例えばPromegaおよびBioradから入手できる）。これらは所望の突然変異を作出するための、抗生物質耐性が変化したプラスミドの使用、ウラシル取りこみおよびＰＣＲ技術を含む。作出された突然変異は点突然変異、欠失および切断を所望により含むものであろう。本発明はそれゆえ本出願において開示されたＣＪＡＳ１ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列の対応する突然変異体も含む。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチド配列は植物体に遺伝物質を伝達させる前に好適なベクターに結合しなければならない。この目的のため、当該技術分野に周知の標準的ライゲーション技術を用いればよい。そのような技術は分子生物学におけるプロトコールに関する標準的テキストから簡単に得られ、好適なリガーゼ酵素は市販されている。
【００８７】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列によってコードされる単離および精製ペプチドも含む。本発明はまた、本発明のペプチドに対して特異的であり本発明のペプチドとその他のポリペプチドを標準的条件下で区別することが出来るポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体も含む。そのような抗体は通常の方法によって作成することができる。様々なイムノアッセイ技術および適用を含む本発明による抗体の調製および使用については、例えばGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., Academic Press, New York, 1986; および Harlow および Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1988を参照されたい。本発明のペプチドおよび抗体は通常の技術によって標識できる。好適な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光試薬、化学発光試薬、磁性粒子などが含まれる。
【００８８】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列によって形質転換された植物細胞および形質転換植物細胞の増殖から得られた植物も含む。生物学的方法および物理的方法を含む、植物の形質転換の多くの方法が開発されており、植物形質転換プロトコールについては例えば、Miki ら,"Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants"in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. および Thompson, J. E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pages 67-88を参照されたい。さらに発現ベクターおよび植物細胞または組織のインビトロ培養方法、植物の形質転換および再生も利用できる。例えば、Gruber ら,"Vectors for Plant Transformation"in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. および Thompson, J. E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pages 89-119を参照されたい。
【００８９】
以下は例示であって限定的なものではない。
【００９０】
Ａ．アグロバクテリウム媒介形質転換：植物への発現ベクターの導入方法の１つはアグロバクテリウムの自然の形質転換システムに基く。例えば、Horsch ら, Science 227: 1229 (1985)を参照されたい。A. tumefaciens およびA. rhizongenesは、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原体土壌細菌である。A. tumefaciens およびA. rhizongenesのそれぞれＴｉおよびＲｉプラスミドは植物の遺伝的形質転換に必要な遺伝子を担持する。たとえば、Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10 : 1 (1991)を参照されたい。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム媒介遺伝子移入方法についての記載は、Gruber ら, 前掲, Miki ら, 前掲, および Moloney ら, Plant Cell Reports 8: 238 (1989). Bechtold ら、 C. R. Acad. Sci. Paris Life Sciences, 316: 1194-9 (1993)によって提供される。
【００９１】
Ｂ．直接遺伝子移入：アグロバクテリウム媒介形質転換の代わりとして集合的に直接遺伝子移入と称されるいくつかの植物形質転換方法が開発されている。植物形質転換の一般的に適用可能な方法は、微粒子媒介形質転換であり、ここでＤＮＡは１から４μＭの大きさの微粒子の表面に担持される。発現ベクターは遺伝子銃装置によって植物組織に導入され、該装置は植物細胞壁および細胞膜を貫通するのに十分な速さである３００から６００ｍ／ｓの速さに微粒子を加速する。Sanford ら, Part. Sci. Technol. 5: 27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6: 299 (1988), Klein ら, Bio/Technology 6: 559-563 (1988), Sanford, J. C., Physiol Plant 79: 206 (1990), Klein ら, Biotechnology 10: 268 (1992)。１９９１年５月１４日発行の米国特許第５０１５５８０号 (Christouら); １９９４年１月２１日発行の米国特許第５３２２７８３号 (Tomesら)も参照されたい。
【００９２】
もう１つの植物へのＤＮＡの物理的送達方法は標的細胞の超音波処理である。Zhang ら, Bio/Technology 9: 996 (1991)。あるいはリポソームまたはスフェロプラスト融合を用いて発現ベクターを植物に導入する。Deshayes ら, EMBO J., 4 : 2731 (1985), Christou ら、Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 3962 (1987)。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニルアルコールまたはポリ−Ｌ−オルニチンを用いたプロトプラストへのＤＮＡの直接取りこみも報告されている。Hain ら, Mol. Gen. Genet. 199 : 161 (1985) および Draper ら, Plant Cell Physiol. 23: 451 (1982)。プロトプラストおよび細胞全体および組織のエレクトロポレーションも記載されている。Donn ら、 Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p 53 (1990); D'Halluinら, Plant Cell 4: 1495-1505 (1992) および Spencer ら、Plant Mol. Biol. 24: 51-61 (1994)。
【００９３】
標的細胞または組織の形質転換後、上記の選抜可能なマーカー遺伝子の発現により、現在当該技術分野で周知の再生および選抜方法を用いて形質転換細胞、組織および／または植物の優先的選抜が可能となる。
【００９４】
上記の形質転換方法はトランスジェニック品種を産生するために典型的に用いられるものである。トランスジェニック品種を次にその他の（非形質転換または形質転換）品種と交雑し、新規なトランスジェニック品種を産生することができる。
【００９５】
あるいは、上記形質転換技術を用いて特定の系統へと操作された遺伝形質は、植物育種分野に周知の従来からの戻し交配技術を用いて他の系統へと移すことが出来る。例えば、戻し交配アプローチを用いて公共の非優良品種から、操作された形質を優良品種へと移すことが出来るし、ゲノム内に外来遺伝子を含む品種からその遺伝子を含まない多くの品種へと形質を移すことも出来る。本明細書において用いる場合はその文脈によって、「交雑」はＸとＹとの単純な交雑または戻し交配工程を指す。いったんトランスジェニック植物が確立するとその植物の種子の表現型の決定が重要となる。したがって、本発明の好適な態様において植物の種子を改変する方法が提供され、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）形質転換可能で植物体全体へと再生可能な植物細胞に、植物の形質転換および選抜に必要なＤＮＡ配列に加えて、プロモーターに操作可能に結合した本発明に含まれるヌクレオチド配列によるヌクレオチド配列を含むコンストラクトを導入する工程；および、
（ｂ）ヌクレオチド配列を含む植物を回収する工程。
【００９６】
ポリヌクレオチドＣＪＡＳ１は転写調節領域と比較して、アンチセンス（アンチセンスＲＮＡによる阻害用）方向でもセンス（共抑制(co-suppression)による阻害用）方向であってもよく、あるいは二本鎖ＲＮＡ干渉を誘導するためにセンスおよびアンチセンスＲＮＡの組合せであってもよいことが当業者に明らかであろう (Chuang および Meyerowitz, PNAS 97: 4985-4990,2000, Smith ら, Nature 407: 319-320,2000）。その他の遺伝子阻害の方法も本発明の枠内であると考えられる。
【００９７】
転写調節領域はプロモーター領域と呼ばれることがよくあり、本発明の枠内において用いられる多数のプロモーターが存在する。好適なプロモーターはアンチセンス遺伝子の発現を、種皮の形成に寄与または関与する種子組織または種子内の組織に限定するプロモーターである。好適なプロモーターにはアブラナ属ナピン（Brassica napin)およびアブラナ科のプロモーター、マメフォゼアリンプロモーターまたはダイズコングリシニンプロモーターが含まれる。その他のプロモーターのタイプとしては限定されるものではないが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、器官特異的プロモーター、発達特異的プロモーター、強いプロモーター、弱いプロモーターなどが含まれる。
【００９８】
重要なことは、本発明は本発明の方法によって作成されたトランスジェニック植物およびその生産物および種子を含むということであり、ここで本発明のヌクレオチド配列は選択された植物種に形質転換されて発現する。本発明のトランスジェニック植物は、本発明のヌクレオチド配列の植物における形質転換および発現が、繊維含量が減少した、および／またはより明るい色の種子に関する所望の表現型をもたらすことを条件にして、植物種の点では限定されない。特に好適な種としてはアブラナ科品種およびアブラナ属の品種が含まれる。より好適な植物種としてはアブラナ属カリナタ(Brassica carinata)およびアブラナ(Brassica napus)が含まれる。これらの種からこれまでにＣＪＡＳ１相同的ヌクレオチド配列が同定された。
【００９９】
より最近開発されたストラテジーを用いてＣＪＡＳ１関連配列の発現を操作することも可能である。ＣＪＡＳ１関連遺伝子の発現の減少の機構として、リボザイムを用いることは当業者の技術範囲内である。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングおよび染色体歩行は、例えばSambrook ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour N. Y. (1989)に記載の当業者に周知のさらなる技術である。そのような技術を用いて簡単にＣＪＡＳ１遺伝子のプロモーター配列を得ることが出来、ＣＪＡＳ１ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを単離することが出来る。このようにして種子発達の正常条件下でのＣＪＡＳ１の発現を評価することが出来る。この遺伝子ファミリーおよび関連する遺伝子ファミリーの遺伝子発現を制御するさらなる方法を開発するためにプロモーター領域を単離して研究することも出来る。
【０１００】
ＣＪＡＳ１によってコードされるタンパク質の機能については、ＣＪＡＳ１の推定アミノ酸配列はシロイヌナズナ(A. thaliana)のＧＭＰ合成酵素様タンパク質（受託番号ＡＡＣ６３６６５＆ＡＡＣ６３６８１）に対し６３％の同一性を有していた。ＣＪＡＳ１のＯＲＦは計算分子量２８．４ｋＤａの２５０アミノ酸のポリペプチドをコードしていた。該ポリペプチドは、それぞれクラスＩグルタミンアミドトランスフェラーゼ（ＧＭＰ合成酵素）の特徴を表す数アミノ酸の２つのドメインを含んでいた（ＫＩＬＧＩＣＦＧＨＱおよびＨＬＦＣＩＱＧＨＰＥＹＮ）（図５を参照されたい）。
【０１０１】
ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、大腸菌ＧＭＰ合成酵素突然変異体ｇｈｔ１に形質転換した（Van Lookeren Campagne ら,. J. Biol. Chem. 266,16448-16452 1991）が、相補性は観察されなかった。したがって、該タンパク質は基質として芳香族化合物を利用するＧＭＰ合成酵素とは異なるアミドトランスフェラーゼ活性をコードしていると推論される。これは繊維（および種皮）の形成に関与する別の経路であり芳香族化合物を利用する経路であるフェニルプロパノイド経路に見られる類似の工程と似ている。フェニルプロパノイド経路においては芳香族アミノ酸であるＬ−フェニルアラニンが、酵素ファニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）の基質である。ＰＡＬの酵素活性は脱アミノ化により桂皮酸の形成を導き、徐々にリグニンモノマーの形成を導く。今回の場合、ＣＪＡＳ１はおそらく別の二次代謝産物経路において利用されるリアーゼ活性をコードする酵素のサブユニットであり、該酵素活性の減少（遺伝子発現のアンチセンスＲＮＡ阻害によって証明されるように）は、フェノール関連化合物の形成の変化をもたらす。この変化により、種子におけるその他の化合物、特に、繊維形成に関与していることが知られている化合物の形成にさらに影響を及ぼすと考えられる。
【０１０２】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０３】
塩化銅処理によって誘導される遺伝子のクローニング
この実施例においては誘導植物細胞および非誘導植物細胞のディファレンシャルスクリーニングを用いて塩化銅処理によって優先的に誘導されるｃＤＮＡを単離した。アブラナ属カリナタ(Brassica carinata)（育種系統Ｃ９０−１１６３、Agriculture and Agri-Food Canada Research Station, Saskatoon)をNutricote14-14-14肥料で改変したTerra-Lite-Redi-Earthにおいて栽培した。該植物をConviron Model PGV36グロースチャンバーで日中温度２１℃／夜間温度１９℃で明期１６時間にて栽培した。Sylvania長期実用４０Ｗ白熱電球およびSylvania冷白色蛍光灯２１５Ｗによって与えられる光強度は１８０／μＥｓ／ｍ２であった。アブラナ属カリナタ(Brassica carinata)種の植物を５ｍＭの塩化銅を流れ出すまで葉に噴霧することによって処理した。Ｈ２Ｏまたは５ｍＭＣｕＣｌ２を噴霧して１２時間後に、４週齢のアブラナ属カリナタ(Brassica carinata)植物の葉からトータルＲＮＡを抽出した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを公表された手順（Wu, W. (1997) Methods in Gene Biotechnology. Boca Raton, FL: CRC Press）にしたがって、オリゴ（ｄＴ）−セルロース樹脂(Life technologies)を用いてトータルＲＮＡから単離した。ＸｈｏＩおよびＰａｃＩオリゴ−ｄＴプライマーを用いてＣｕＣｌ２処理された葉のＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成を開始した。セカンドストランド合成およびクローニングは、λＺＡＰＩＩｃＤＮＡ合成キット(Stratagene)の製造業者の指示にしたがって行った。
【０１０４】
インビボマスエクスティンクションを製造業者(Stratagene)の指示にしたがってλＺＡＰＩＩｃＤＮＡについて行った。ファージミドＤＮＡを１９２のランダムに選択したコロニーから単離し、各ＤＮＡ試料のおよそ１００ｎｇを二枚のＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロンメンブレン（Amersham Pharmacia Biotech.)にドットブロットした。Ｈ２ＯおよびＣｕＣｌ２処理した葉からのＲＮＡを供給業者(Life technologies)の指示にしたがってオリゴ−ｄＴをプライマーとしてｓｓｃＤＮＡへと逆転写（Superscript II)した。その結果得られたＤＮＡをHifh Prime (Roche Molecular Biochemicals)を用いて標識した。ハイブリダイゼーションは４２℃で一晩、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ（２０ｘＳＳＰＥ、ｐＨ７．４＝１７４ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２７．６ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、７．４ｇ／ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ）、５ｘデンハルト（５０ｘデンハルト＝１０ｇ／ｌフィコール分子量およそ４００ｋＤａ、１０ｇ／ｌポリビニルピロリドン分子量３６０ｋＤａ、１０ｇ／ｌウシ血清アルブミン）、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ一本鎖魚ＤＮＡ(Roche Molecular Biochemicals)中で行った。メンブレンを２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ、ｐＨ７．０＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．０５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで室温で１５分間洗浄し、その後０．２ｘＳＳＣ、０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで３回、それぞれ６０−６５℃で１５分間洗浄し、ついでＸ線フィルム(Kodak, XAR-5)に露出してオートラジオグラフィーを行った。５’−ｃＤＮＡ末端のラピッド増幅を５’−ＲＡＣＥシステム（Version 2.0)キットを用いて製造業者(Life technologies)の指示に記載のように行った。ＰＣＲ産物を配列決定用のベクターｐＣＲ２．１(Invitorogen)にクローニングした。
【０１０５】
多くの配列が既知の遺伝子、特に防御応答に関与する遺伝子に対して類似性を示した。これらの配列についてはさらなる研究を行わなかった。しかし少数のｃＤＮＡは既知の配列に対して相同的ではなく、これらのｃＤＮＡをユニーク防御関連配列として特異的に同定した。これらのｃＤＮＡのうちの１つ、ＣＪＡＳ１の配列を配列番号１に示す。ＣＪＡＳ１の推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【実施例２】
【０１０６】
防御関連配列を用いたアンチセンス遺伝子の構築
塩化銅によって特異的に誘導され既知の機能を有する遺伝子のいずれにも相同性を示さないｃＤＮＡを用いてアンチセンスＲＮＡ形質転換ベクターを構築した。２つの(duplicate)３５Ｓプロモーターを含む植物形質転換ベクターをアンチセンス配列の発現用に用いた。形質転換ベクターはＲＤ４００(Datla, R. S. S., Hammerlindl, J. K., Panchuk, B., Pelcher, L. E., および Keller, W., 1992, Gene 211: 383-384）であった。
【０１０７】
アンチセンスＲＮＡ遺伝子の構築のために用いた植物形質転換ベクターは、標準的ベクター／インサートライゲーション技術を用いて２つの(double)３５Ｓプロモーターに対してアンチセンス方向に防御関連ｃＤＮＡを挿入（ライゲーション）することによって構築した。ｃＤＮＡの方向は制限酵素切断地図作成により確認した。ベクターに挿入したｃＤＮＡの制限酵素切断地図を図１に示す。
【実施例３】
【０１０８】
アンチセンス形質転換ベクターによる植物の形質転換
防御関連ｃＤＮＡを用いて作成されたアンチセンス遺伝子を担持する植物形質転換ベクターを用いて植物形質転換を行った。形質転換に用いた植物種はアブラナ属カリナタ(Brassica carinata)の選抜株(selection)であり、最初に塩化銅処理したものと同じ選抜株であった。アブラナ属カリナタ(B. carinata)の選抜株は暗色の厚い種皮を有する。形質転換にはアグロバクテリウム・トゥミファシエンス(Agrobacterium tumifaciens)株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０（KonczC. & Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396）を用いた。形質転換ベクターを標準的技術を用いてアグロバクテリウム株に導入した。植物外植片を３日間共培養し、選抜培地に移した。植物をカナマイシンで選抜した。
【実施例４】
【０１０９】
黄色種子の形質転換植物の単離
形質転換したアブラナ属カリナタ(B. carinata)を目視による特徴づけによって分析した。植物内でのアンチセンスＲＮＡ発現方法により分析した５つの独立のｃＤＮＡのうち、アンチセンス方向のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）を含む１つのベクターから、黄色種皮を有する形質転換植物が多数生じた。対照形質転換植物および４つの他のｃＤＮＡで形質転換した植物では暗色の種皮が優勢であった。野生型アブラナ属カリナタ(Brassica carinata)とアンチセンスＣＪＡＳ１（配列番号１）を発現するトランスジェニックアブラナ属カリナタ(Brassica carinata)から得られた種子試料の比較を図２ａおよび図２ｂに示す。
【実施例５】
【０１１０】
黄色種子形質の分離
ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡを３５Ｓプロモーターの制御下にアンチセンス方向に含む形質転換植物を自家受粉させ、その結果生じた子孫について黄色種子の存在が観察された。ほとんどの植物系統において黄色種子：暗色種子は３：１の比で観察され、アンチセンス遺伝子の単一部位での挿入が示された。
【実施例６】
【０１１１】
形質転換系統の繊維含量
トランスジェニック系統および非トランスジェニック系統からの種子を粗繊維含量について分析した。パーセント粗繊維、酸性界面活性剤繊維および中性界面活性剤繊維の方法は、the Association of Official Agricultural Chemistsから発行されているthe book Dietary fiber Analysis and Applications (セクションまたは方法指定), 7.061-7.065 および National Forage Testing Association procedures 4.1, and 5.1.に記載のように行った。それぞれ別々に由来するトランスジェニック系統に事象(event)として名称をつけた。これらの事象は表１においてアブラナ属カリナタ事象 （B. carinata Events）と称される。分析した１３のトランスジェニック系統のうち５つが３０％を超える粗繊維含量の減少を示し、さらに４つの系統が統計的に粗繊維含量レベルの減少を示した。したがって１３のトランスジェニック系統のうち９系統がアンチセンス方向でのＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）の発現の結果として繊維含量の減少を示した。
【０１１２】
試験したすべてのトランスジェニック事象のパーセント粗繊維（リグニン画分、セルロース性画分、ヘミセルロース性画分およびペクチン画分を表す）はヌル対照よりも低かった（表１および図３）。粗繊維含量が最も減少したのは事象９０−１８−１から観察されたものであった。これはヌル対照よりも３６．３％低かった（表１および図３）。４つのその他の独立の事象、９０−６−１、９０−１７−１、９０−２５−１および９０−３４はヌル対照よりも少なくとも３０％低い粗繊維レベルを有することが見出された（図３）。
【０１１３】
表１：温室栽培したトランスジェニックアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）からの繊維分析の要約。値は２つの別々の測定の平均として表す。パーセント粗繊維、酸性界面活性剤繊維および中性界面活性剤繊維の方法はAOAC 7.061-7.065, NFTA 4.1, NFTA 5.1, (the Association of Official Agricultural Chemists および the National Forage Testing Associationに概説されている方法の指定, 前述を参照) に記載のように行った。
【０１１４】
【表１】
試験したすべてのトランスジェニック事象の酸性界面活性剤繊維含量はヌル対照と比較して減少していた（図４）。酸性界面活性剤繊維（ＡＤＦ）分析は酸に溶解しないセルロース性残基および酸安定性リグニン残基を測定する傾向に有る。事象９０−１８−１ではヌル対照と比較してＡＤＦ含量が４０％減少していることが観察された（表１および図４）。粗繊維が最も減少していた（図３）５つの事象（９０−１８−１，９０−６−１，９０−１７−１，９０−２５−１および９０−３４）ではヌル対照と比較してＡＤＦ含量ももっとも減少していることが見出された（図４）。データは、これらの５つの事象ではヌル対照と比較して酸不溶性リグニンおよびセルロース性画分が減少していることを示唆する。
【０１１６】
中性界面活性剤繊維（ＮＤＦ）分析はミールに存在するリグニン（不溶性および酸可溶性）画分、セルロース性画分およびヘミセルロース性画分を測定する傾向に有る。事象９０−６−１、９０−２５−１および９０−３４−１ではそれぞれＮＤＦが１３．５％、１３．９％、および１３．３％減少していた（図５）。事象９０−６−１、９０−２５−１および９０−３４−１では粗繊維含量およびＡＤＦも最も減少していた（図３および図４）。
【実施例７】
【０１１７】
アンチセンス形質転換ベクターによるアブラナ（Brassica napus）植物の形質転換
この実施例では、アンチセンス方向にＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）を含む植物形質転換ベクターを用いて暗色の厚い種皮を有するアブラナ（Brassica napus）植物を形質転換した。形質転換にはアグロバクテリウム・トゥミファシエンス（Agrobacterium tumifaciens）株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０(KonczC. & Schell, J., 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) を用いた。形質転換ベクターを標準的技術を用いてアグロバクテリウム（Agrobacterium）株に導入した。植物外植片を３日間共培養し、次いで選抜培地に移した。植物をカナマイシンで選抜した。多数のトランスジェニック植物系統を回収し、自家受粉させ種皮の色を分析した。以下の表２に結果を示し、アンチセンス方向でのＣＪＡＳ１（配列番号１）の発現はアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）以外の植物種においてもより明るい種皮の色を生じさせることが出来ることが例示される。
【０１１８】
表２：様々な形質転換事象についての温室栽培されたトランスジェニックアブラナ（Brassica napus）からの種皮の色の分析の要約。先の実施例において記載したものと同じ形質転換コンストラクトを用いた。種子は目視観察によって別々に評価した。形質転換事象の大部分の平均的種子色は、野生型非改変アブラナ（Brassica napus）のものより明るかった。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
アブラナ属カリナタ（B. carinata）におけるＣＪＡＳ１発現
野生型アブラナ属植物から採取した様々な植物組織のノザンブロットによりＣＪＡＳ１遺伝子発現を調べた（データは示さず）。
【０１２１】
ＣＪＡＳ１遺伝子は多くの組織−根、茎、葉、花芽、長角果−における構成的発現は低いということが見出された。花芽および長角果における転写産物の量はその他の組織よりわずかに多かった。転写産物の量は、Ｃｕ，ＭｅＪＡ，ＳＡおよびＡＢＡ処理によりさらに増加した。興味深いことにＣＪＡＳ１の増加した転写産物の蓄積の時期は処理によって異なる。ＣｕおよびＭｅＪＡに対する迅速な応答は膜損傷に感受性の制御機構を示唆する。４種類の化合物によるＣＪＡＳ１転写の活性化は並外れているが、先例のないものではない。
【実施例９】
【０１２２】
ＢｃＣＪＡＳ１の発現に対する阻害剤の効果
一酸化窒素（ＮＯ）スカベンジャーである２−フェニル−４,４,５,５−テトラメチルイミダゾリノン−３−オキシド−１−オキシル（ＰＴＩＯ）、タンパク質ホスファターゼタイプ１および２Ａ阻害剤であるオカダ酸（ＯＫＡ）、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン（ＳＴＡＵ）およびタンパク質翻訳阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）のアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）におけるＣＪＡＳ１の誘導／発現に対する効果を測定した。これらの阻害剤研究からのデータ（示さず）は、不安定タンパク質またはリン酸化を必要とするタンパク質によって、ＣＪＡＳ１の発現が積極的に抑制され、あるいは、転写産物が迅速にターンオーバーされることを示唆する。ＳＴＡＵはＣＪＡＳ１発現の誘導においてＭｅＪＡと相乗的に作用した。非誘導物質においてもＰＴＩＯ、ＯＫＡ、ＳＴＡＵおよびシクロヘキシミドはすべてＣＪＡＳ１転写産物蓄積を増加させた。ＮＯ除去がどのようにして転写を活性化するのか理解しがたいが、ＮＯによるウサギ糸球小体細胞におけるＬ−型Ｃａ２＋チャンネルの阻害が最近報告された。それゆえＰＴＩＯ処理はＣａ２＋チャンネル活性の上昇を間接的にもたらし、その活性の上昇が、順次ＣＪＡＳ１転写を刺激するようである。
【０１２３】
これらの結果は、ＣＪＡＳ１遺伝子が通常のハウスキーピング機能およびストレス応答に関与している可能性を示唆する。
【０１２４】
サザンブロット分析により、アブラナ属カリナタ（B. carinata）ゲノム中に当該遺伝子が２−４コピー存在することが示された。
【実施例１０】
【０１２５】
アブラナ属カリナタ（Brassica carinata）からの第二のＣＪＡＳ１相同的ｃＤＮＡの単離
本出願の発明者らは（製造業者の指示にしたがって）Invitrogen Generacer ５’ＲＡＣＥキットを用い、５ｍＭ ＣａＣｌ２を噴霧したアブラナ属カリナタ（B. carinata）の葉の組織からＲＮＡを単離し、アブラナ属カリナタ（Brassica carinata）のＣＪＡＳ１（配列番号１）に相同的なさらなるヌクレオチド配列が単離できるかを調べた。対応するプロトコールは、増幅工程前に切断された転写産物を除くことにより全長のｍＲＮＡのみの増幅を保証するものである。この方法はｍＲＮＡキャップ依存性であり、それゆえ全長であって５’キャップ構造と３’ポリＡテイルの両方を含むｍＲＮＡのみを選抜するものである。目的のｃＤＮＡを次いでＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ配列（配列番号１）の最初の１０４４塩基対に基く遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーを以下に示す：
ＴＷ１＝５’ＣＣＴＴＣＡＣＧＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧ３’（配列番号６）
ＴＷ２＝５’ＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣ３’（配列番号７）。
【０１２６】
この手法により配列番号１に対して相同的なアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）からの４０９塩基対のｃＤＮＡ断片が増幅および精製された。Generacer-由来アブラナ属カリナタ（B. carinata）産物の５’末端の配列アラインメントはこのｃＤＮＡ（配列番号３の５'末端に対応する）と最初に同定されたＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号１）が同一ではないことを示す。この点について、それぞれ図６ａおよび６ｂに示すように、ヌクレオチドおよびペプチド配列アラインメントはこの領域において８６％の類似性があり、最初の４０９ｂｐにおいて２つの配列の間に４９ヌクレオチド（および５アミノ酸）の違いが有ることを示す。ヌクレオチドの差の大部分は、最初のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡクローンには見られないGeneracer産物における１０ヌクレオチドの挿入を含む５’非翻訳領域において見られた。しかしながら、最初のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡにおいて、Generacer産物には見られない４つのさらなるヌクレオチドが存在した。 アミノ酸変化のうち３つは保存的であったが、残りの２つは非極性アミノ酸から塩基性アミノ酸への置換であった。
【０１２７】
それゆえアブラナ属カリナタ（Brassica carinata）における２コピーのＣＪＡＳ１遺伝子にはわずかな配列変動が存在し、同時にアミノ酸も変動していた。ＣＪＡＳ１遺伝子は推定グルタミンアミドトランスフェラーゼドメインをコードする。データベースのタンパク質に対する類似性に基き、それはヘテロダイマー酵素のサブユニットのようである。
【実施例１１】
【０１２８】
アブラナ（Brassica napus）からのＢｃＣＪＡＳ１のホモログの単離
５ｍＭ ＣｕＣｌ２を噴霧したアブラナ（Brassica napus）の葉から単離したトータルＲＮＡを用いて本発明者らは、実施例１０にしたがって同じプライマー（配列番号６および７）を用いてGeneracer ５’ＲＡＣＥプロトコールを行った。このようにして本発明者らは実施例１０においてアブラナ属カリナタ（Brassica carinata ）から得た部分ＣＪＡＳ１配列と同一の、部分的ｃＤＮＡアブラナ（Brassica napus）ヌクレオチド配列を単離するのに成功した。このアブラナ（Brassica napus）産物の配列を用いて、全長アブラナ（Brassica napus）ｃＤＮＡを増幅するための遺伝子特異的プライマーを設計した。全長アブラナ（Brassica napus）産物を増幅するために用いたプライマーは、オリゴｄＴと以下のプライマーであった：
ＴＷ８＝５’ＡＴＴＧＣＡＣＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴ３’（配列番号８）。
【０１２９】
このようにしてＰＣＲ増幅によりアブラナ（Brassica napus）からの全長ＣＪＡＳ１ホモログを単離することに成功し、該ｃＤＮＡの配列を標準的ＤＮＡ配列決定技術を用いて特徴づけした。全長ｃＤＮＡ産物の配列を配列番号３に示し、対応する予測ペプチド配列を配列番号４に示す。
【０１３０】
全長アブラナ（Brassica napus）ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（配列番号３）に加えて、以下のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）遺伝子配列に基くプライマーを用いてＣＪＡＳ１様遺伝子について部分ｃＤＮＡ配列を得た。
ｇｂＡＡＣ６３６８１に基く、
ＴＷ１０＝５’ＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＣＣＴＡＴＴＧＴＴＴ３’（配列番号９）
ｅｍｂＣＡＢ７９７７３に基く、
ＴＷ１２＝５’ＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＧＧＡＣＴＡ３’（配列番号１０）
【０１３１】
アブラナ（Brassica napus）から得たこのさらなるＣＪＡＳ１様部分ｃＤＮＡの配列を配列番号５に示す。
【実施例１２】
【０１３２】
アブラナ（B. napus）のサザンブロット分析
遺伝子コピー数を調べ、遺伝子変動を調べ、関連遺伝子が存在するかを決定するために、アブラナ（Brassica napus）についてサザンブロット分析を行った（Sambrook ら, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)にしたがった）。ＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化した。ＢａｍＨＩは３つの酵素のなかで唯一ｃＤＮＡ配列の内部を切断するものであるため２つのハイブリダイズする断片が生じるはずである。各消化産物をゲルで泳動してブロットを配列番号３の最初の４０９ヌクレオチドを含む短い５’アブラナ（B. napus） Generacer産物をプローブとして探索した。低いストリンジェンシーでの洗浄を行い、ブロットをオートラジオグラフィーで現像した。
【０１３３】
予想した通り、ＣＪＡＳ１遺伝子のほぼ同一コピーに対応する２つの強くハイブリダイズする断片がＢａｍＨＩゲノム消化産物のレーンにおいて観察された。この消化産物において４つの弱くハイブリダイズする断片も観察された。１つの強くハイブリダイズする断片がＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡにおいて存在した。さらに１から２の弱くハイブリダイズする断片がこの消化産物において観察された。ＳａｌＩ消化したＤＮＡにおいては１つの強くハイブリダイズする断片のみが観察された。それゆえＣＪＡＳ１は密接に関連する遺伝子ファミリーのメンバーではない。アブラナ（B. napus）ゲノムにおいて離れた関係に有る２から４の遺伝子が存在する可能性が有る。
【実施例１３】
【０１３４】
コンピュータに基く配列データベースの探索によるＣＪＡＳ１遺伝子（およびコードされるペプチド）に相同性を有するヌクレオチドおよびペプチド配列の同定
図７に示すように本発明者らは手操作によってＣＪＡＳ１の推定アミノ酸配列（配列番号１から得た）と、いくつかの細菌性アミドトランスフェラーゼのＧ−型ＧＡＴドメインとのアラインメントを作成した。配列類似性は明らかに存在するが、明らかにＣＪＡＳ１ｃＤＮＡは合成酵素ドメインをコードするものではない（図７には示さず）。
【０１３５】
デフォールトパラメータを用いるＮＣＢＩのヌクレオチドおよびタンパク質データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいてもＣＪＡＳ１（配列番号１）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を用いた。その結果、ＣＪＡＳ１ｃＤＮＡに対して８６％の同一性を有する、ＢＡＣ Ｆ１７Ｉ２３（登録番号ＡＦ１６０１８２）からのシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ゲノム配列が明らかとなった。３つのその他の関連タンパク質は配列番号１に対して５９−７０％の相同性を有していた。アブラナ科ファミリーの植物におけるこの類似性は予期せぬものではない。その他の植物種において相同的活性が見出されることが予測される。配列番号１にコードされる推定ペプチド配列（即ち配列番号２）と、ＢＬＡＳＴサーチによって同定された５つの対応するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ペプチド配列とのペプチド配列アラインメントを図８に示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１３６】
配列番号６ ＴＭ１プライマー
配列番号７ ＴＭ２プライマー
配列番号８ ＴＭ８プライマー
配列番号９ ＴＭ１０プライマー
配列番号１０ ＴＭ１２プライマー
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１はＣＪＡＳ１ｃＤＮＡを含む植物形質転換ベクターを示す。矢印は３５Ｓプロモーターからのアンチセンス発現方向を示す。
【図２ａ】図２ａは野生型アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの種子を示す。
【図２ｂ】図２ｂはＣＪＡＳ１（配列番号１）をアンチセンス方向に発現するトランスジェニックアブラナ属カリナタから得た種子を示す。
【図３】図３はトランスジェニックアブラナ属における粗繊維の減少のグラフ表示を示す。
【図４】図４はトランスジェニックアブラナ属における酸性界面活性剤繊維の減少のグラフ表示を示す。
【図５】図５はトランスジェニックアブラナ属における中性界面活性剤繊維の減少のグラフ表示を示す。
【図６ａ】図６ａは最初のＣＪＡＳ１ｃＤＮＡ（アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの配列番号１）の５’−末端およびアブラナ属カリナタ（Brassica carinata)から得た第二の相同的ｃＤＮＡクローン（アブラナ属アブラナ（Brassica napus）から得た全長ｃＤＮＡである配列番号３の５’−末端と同一）との配列アラインメントを示す。
【図６ｂ】図６ｂは最初のＣＪＡＳ１遺伝子産物の予測ペプチド配列（アブラナ属カリナタ（Brassica carinata)からの配列番号２）のアミノ末端と配列番号４に示す予測ペプチド配列との配列アラインメントを示す。
【図７】図７は配列番号１からの選択された領域と、いくつかのクラスＩグルタミンアミドトランスフェラーゼの２つのドメインからの既知のペプチド配列との手操作によるアラインメントを示す。
【図８】図８は配列番号２と、実施例１３に記載のようにＢＬＡＳＴサーチから同定されたシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)からの相同的ペプチド配列との配列アラインメントを示す。
Claims (30)
- ａ）配列番号１またはその相補鎖；
ｂ）配列番号３またはその相補鎖；
ｃ）ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列によってコードされるペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列；
から選択されることを特徴とする単離ヌクレオチド配列であって、該単離ヌクレオチド配列またはその相補鎖が、該ヌクレオチド配列を発現する植物において種子の発生を変化させるタンパク質またはその部分をコードする、単離ヌクレオチド配列。 - 該単離ヌクレオチド配列が、配列番号１またはその相補鎖によってコードされるペプチドあるいは配列番号３またはその相補鎖によってコードされるペプチドに対して少なくとも９０％の相同性を有するペプチドまたはその部分をコードすることを特徴とする、請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列。
- 該単離ヌクレオチド配列が、配列番号１またはその相補鎖によってコードされるペプチドあるいは配列番号３またはその相補鎖によってコードされるペプチドに対して少なくとも９５％の相同性を有するペプチドまたはその部分をコードすることを特徴とする、請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列。
- 単離ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１またはその相補鎖；
ｂ）配列番号３またはその相補鎖；および、
ｃ）ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
から選択されることを特徴とし、ここで該単離ヌクレオチド配列またはその相補鎖が、該ヌクレオチド配列を発現する植物における種子の発生を変化させるタンパク質またはその部分をコードする、単離ヌクレオチド配列。 - ヌクレオチド配列がアブラナ科植物由来であることを特徴とする、請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列。
- ヌクレオチド配列がアブラナ属の植物由来であることを特徴とする、請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列。
- 植物におけるヌクレオチド配列の発現が、非改変植物と比較して該植物の種子の繊維含量を減少させることを特徴とする、請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列。
- 植物におけるヌクレオチド配列の発現が、非改変植物の種子と比較して該植物の種子の色をより明るくすることを特徴とする、請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列。
- 単離および精製されたペプチドが、請求項１に記載のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、単離および精製されたペプチド。
- プロモーターに操作可能に結合した請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＤＮＡ発現カセット。
- ベクターおよび請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、コンストラクト。
- ヌクレオチド配列がプロモーターに操作可能に結合していることを特徴とする、請求項１１に記載のコンストラクト。
- プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、器官特異的プロモーター、強いプロモーター、および弱いプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のコンストラクト。
- 請求項１１に記載のコンストラクトによって形質転換されていることを特徴とする植物細胞。
- 請求項１４に記載の植物細胞の再生に由来することを特徴とするトランスジェニック植物。
- アブラナ科植物であることを特徴とする請求項１５に記載のトランスジェニック植物。
- アブラナ属であることを特徴とする請求項１５に記載のトランスジェニック植物。
- 植物の種子を改変する方法であって、該方法が以下の工程、
ａ）形質転換可能で植物体全体に再生できる植物細胞に、植物における形質転換および選抜に必要なＤＮＡ配列に加えてプロモーターに操作可能に結合した請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むコンストラクトを導入する工程、および、
ｂ）該ヌクレオチド配列を含む植物を回収する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 該種子の繊維含量が非改変植物の種子と比較して減少していることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
- 該種子が非改変植物の種子と比較してより明るい色の種皮を有することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
- 非改変植物の種子と比較して、該種子の繊維含量が減少しており、該種子がより明るい色の種皮を有することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
- 該ヌクレオチド配列がプロモーターに対してセンス方向に配向していることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
- 該ヌクレオチド配列がプロモーターに対してアンチセンス方向に配向していることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
- 請求項１５に記載の植物から得られることを特徴とする種子。
- 請求項１８に記載の方法によって改変された植物から得られることを特徴とする種子。
- 請求項１に記載のヌクレオチド配列と実質的に相同的なＤＮＡ配列を同定および単離する方法であって、以下の工程、
ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程；
該ディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを標識する工程；そして、
該標識したディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーをプローブとして用いて該実質的に相同的なＤＮＡ配列についてＤＮＡライブラリーをスクリーニングする工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項２６に記載の方法によって得られることを特徴とするＤＮＡ配列。
- プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応による該プライマーの間のＤＮＡ領域を増幅するために、請求項１に記載のヌクレオチド配列の選択された部分にハイブリダイズすることを特徴とするプライマーの対。
- 請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列の使用であって、該使用が非改変植物の種子と比較して繊維含量が減少した種子を有するトランスジェニック植物の作成のためのものであることを特徴とする使用。
- 請求項１に記載の単離ヌクレオチド配列の使用であって、該使用が非改変植物の種子と比較してより明るい色の種子を有するトランスジェニック植物の作成のためのものであることを特徴とする使用。
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