JP2002125672A - 植物の病斑形成を抑制する遺伝子Ｓｐｌ７およびその利用 - Google Patents

植物の病斑形成を抑制する遺伝子Ｓｐｌ７およびその利用

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Masahiro Yano
昌裕 矢野
Utako Yamauchi
歌子 山内
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National Institute of Agrobiological Sciences
Society for Techno Innovation of Agriculture Forestry and Fisheries
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物の病斑形成の抑制に関与する新規な遺伝
子を提供すること、および該遺伝子を利用して植物を改
良することを目的とする。 【解決手段】 連鎖解析によりイネの病斑形成を抑制す
る遺伝子Spl7を単離することに成功した。該遺伝子の導
入により植物の熱ストレス耐性を向上させ、病斑形成を
抑制し得ることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物の病斑形成お
よび熱ストレス耐性に関与する遺伝子および該遺伝子を
利用した植物の改変に関する。本発明は、植物の品種改
良などの分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】イネには多種多様の突然変異系統が作出
されている。そのなかにはイネの成長に伴って葉身に病
斑様の壊死斑が形成される突然変異系統が存在する（図
１）（Rice Genetics Newsletter 12, 9-153 (199
5)）。これらの突然変異系統ではその病斑形成が高温や
強光において生じることが知られており、変異遺伝子は
光あるいは熱障害の回避に関与していることが推定され
ている（Fuse, T. et.al. Physiol. Plant. 89, 799-80
4 (1993)）。一方、この病斑が形成された植物は、病原
微生物の感染に抵抗性になるものもあることから、これ
らの遺伝子が細胞の過敏感反応とそれに引き続く細胞死
に関わることも推定されている（Kawasaki, T.and Shim
amoto, K. 細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ８ 分
子レベルからみた植物の耐病性124-130(1997)）。
【０００３】従って、これら突然変異系統における変異
遺伝子が同定され、対応する野生型遺伝子が単離されれ
ば、これを形質転換法により任意の品種に導入すること
によって、それらの系統の病斑形成の抑制や光や熱など
に対するストレス耐性の向上を図ることができる可能性
がある。そこで、これら突然変異系統における変異遺伝
子の同定および対応する野生型遺伝子の単離が望まれて
いた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の
病斑形成の抑制に関与する新規な遺伝子を提供すること
にある。さらに、本発明は、該遺伝子を利用して植物を
改良することをも目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく、イネの成長に伴って葉身に病斑様の壊死
斑が形成される突然変異系統のうち、第5染色体上に変
異遺伝子が存在するSpl7に着目し、その変異遺伝子を同
定し、対応する野生型遺伝子を単離すべく鋭意研究を行
なった。
【０００６】本発明者らは、まず、連鎖解析および酵母
人工染色体（YAC）クローンによるSpl7遺伝子領域の整
列化を行った。具体的には、Spl7遺伝子単離に不可欠で
ある、大規模分離集団の連鎖解析を行った。また、イネ
ゲノム解析研究において作出されたYACクローンの整列
化地図を利用して、Spl7遺伝子座近傍に存在するYACク
ローンを特定した。さらに特定されたYACクローンの末
端断片を単離し、整列化することにより、Spl7遺伝子領
域を含むYACクローンを明らかにした（図2C）。
【０００７】Spl7遺伝子の候補領域をさらに絞り込むた
めに、本発明者等は、Spl7遺伝子座と同座のRFLPマーカ
ーC11368をSTS化したプライマーセットを用いて、イネ
ゲノム解析研究において作成された日本晴ゲノムのPAC
クローンライブラリーから、9種類のPACクローンを選抜
した。これらPACクローンを整列化し、Spl7遺伝子座を
含むPACクローンを明らかにした（図2D）。
【０００８】Spl7領域に整列化されたYACおよびPACクロ
ーンの末端断片をクローン化し、それらを新たなRFLPマ
ーカーあるいはCAPSマーカーとして、詳細な遺伝地図を
作成したところ、Spl7遺伝子座はRFLPマーカーP461H4T
およびP693G10Sに挟み込まれる約16kbのゲノム領域に存
在することが明らかとなった（図2）。
【０００９】このゲノム候補領域の塩基配列解析を行な
い、その情報を利用して、新たなCAPSマーカーを作成
し、候補領域のさらなる絞り込みを行った結果、Spl7遺
伝子はCAPSマーカーS12C6-6dおよびHsfC3-3'に挟み込ま
れる約3kbのゲノム領域に存在することが明らかとなっ
た（図3）。
【００１０】この候補ゲノム領域の塩基配列に対して遺
伝子予測ならびに類似性検索を行ったところ、トマト、
アラビドプシスなどで単離されているHsf遺伝子と類似
した構造を示す遺伝子のみが予測されたため、この遺伝
子をSpl7遺伝子の候補とし、突然変異系統KL210の該当
領域の塩基配列を決定した。その結果、突然変異遺伝子
の塩基配列に、野生型遺伝子に対して、1塩基置換が見
出された（図４）。このため、この塩基置換に対応する
アミノ酸置換が突然変異系統のspl7タンパク質の機能の
消失、あるいは低下の原因であると考えられた。
【００１１】さらに、本発明者等は、Spl7遺伝子の候補
として特定されたゲノム領域をアグロバクテリウムを介
して形質転換可能なベクターに組み込んでspl7突然変異
系統に導入した。形質転換個体を、自然日長条件の隔離
温室で栽培して、病斑の形成を調査した結果、対照個体
（ベクターのみを導入）では、突然変異系統と同様に、
生育後期になって病斑が形成されたのに対し、候補遺伝
子が導入された個体については、すべての個体で病斑の
形成が認められなかった（図5）。即ち、候補遺伝子領
域が、突然変異系統KL210の病斑形成を抑制する機能を
有することが判明した。さらに1コピーの導入遺伝子が
組み込まれたと考えられる個体の自殖後代を栽培したと
ころ、病斑が形成される個体と形成されない個体の分離
比が期待比に適合した。これにより候補遺伝子がSpl7遺
伝子であることが判明した。
【００１２】さらに、本発明者等は、病斑形成に必要な
条件の検討を行なった結果、病斑形成にはある程度の高
温が不可欠であり（図6）、紫外線もまた病斑形成を促
進する条件の一つであることを見出した（図7）。この
事実から、Spl7遺伝子は高温ストレスの回避あるいは除
去において重要な役割を果たしていることが推定され
た。従って、Spl7遺伝子を発現するトランスジェニック
植物を作出することにより、本来植物がもつ熱ストレス
の回避能力を高め、植物の病斑形成を抑制することが可
能になると考えられる。
【００１３】即ち、本発明者らは、植物の病斑形成の抑
制に関与する遺伝子を単離することに成功すると共に、
該遺伝子を利用して植物の病斑形成を抑制することが可
能であること、さらには該遺伝子を利用して植物の熱ス
トレス耐性を向上させることが可能であることを見出
し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１４】本発明は、より具体的には、（１） 植物
の病斑形成を抑制する機能を有する植物由来のタンパク
質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記
載のDNA、 （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするDNA。 （ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含
むDNA。 （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１ま
たは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／また
は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
するDNA。 （ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 （２） 植物の熱ストレス耐性を向上させる機能を有す
る植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から
（ｄ）のいずれかに記載のDNA、 （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするDNA、 （ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含
むDNA、 （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１ま
たは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／また
は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
するDNA。 （ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 （３） （１）または（２）に記載のDNAを含むベクタ
ー、（４） （１）または（２）に記載のDNAまたは
（３）に記載のベクターが導入された形質転換細胞、
（５） 植物細胞である、（４）に記載の形質転換細
胞、（６） （１）または（２）に記載のDNAによりコ
ードされるタンパク質、（７） （４）に記載の形質転
換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清か
ら発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（６）
に記載のタンパク質の製造方法、（８） （５）に記載
の形質転換細胞を含む形質転換植物体、（９） （８）
に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、
形質転換植物体、（１０） （８）または（９）に記載
の形質転換植物体の繁殖材料、（１１） （８）に記載
の形質転換植物体の製造方法であって、（１）または
（２）に記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞か
ら植物体を再生させる工程を含む方法、（１２）
（１）に記載のDNAを植物体の細胞内で発現させること
を特徴とする、植物の病斑形成を抑制する方法、（１
３） （２）に記載のDNAを植物体の細胞内で発現させ
ることを特徴とする、植物の熱ストレス耐性を向上させ
る方法、（１４） （６）に記載のタンパク質に結合す
る抗体、および（１５） 配列番号：１に記載の塩基配
列からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも1
5ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、を提供する
ものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明は、Spl7タンパク質をコー
ドするDNAを提供する。イネ日本晴のSpl7ゲノムDNAの塩
基配列を配列番号：１に、該DNAがコードするタンパク
質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。Spl7遺伝子
は、イネの病斑形成の抑制に関与する遺伝子として、こ
れまでイネ第５染色体という広大な領域のいずれかの場
所に存在するものとして知られていたが、その同定およ
び単離には至っていなかった。本発明者らは、複雑なス
テップを経て遂にその存在領域を解明し、単一の遺伝子
として該遺伝子を単離することに初めて成功した。
【００１６】Spl7タンパク質は、熱ストレスによって生
じるイネの病斑形成を抑制する作用をもつ。また、その
構造から、熱ショックタンパク質遺伝子の転写調節に関
わっていることが推定される。熱ショックタンパク質の
一つが、植物の熱ストレスの回避に大きく関与している
ことが最近報告されている（Queitsch, C. et al. Plan
t Cell 12, 479-492 (2000)）。従って、Spl7タンパク
質をコードするDNAで植物を形質転換することにより、
植物の熱ストレス耐性を向上させることができるととも
に、病斑形成を抑制することができると考えられる。
【００１７】本発明のSpl7タンパク質をコードするDNA
には、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれ
る。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常
套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNA
は、例えば、Spl7遺伝子を有するイネ品種 （例えば、
日本晴）からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラ
リー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コス
ミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展
開して、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、
配列番号：1）を基に調製したプローブを用いてコロニ
ーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダ
イゼーションを行うことにより調製することが可能であ
る。また、本発明タンパク質をコードするDNA（例え
ば、配列番号：1）に特異的なプライマーを作成し、こ
れを利用したPCRをおこなうことによって調製すること
も可能である。また、cDNAは、例えば、Spl7遺伝子を有
するイネ品種（例えば、日本晴）から抽出したmRNAを基
にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してc
DNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同
様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラーク
ハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCR
を行うことにより調製することが可能である。
【００１８】本発明は、配列番号：2に記載のSpl7タン
パク質（日本晴）と機能的に同等なタンパク質をコード
するDNAを包含する。本発明のDNAの由来する植物種に特
に制限はないが、好ましくはイネ科植物由来であり、最
も好ましくはイネ由来である。ここで「Spl7タンパク質
と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質が
植物の病斑形成を抑制する機能および／または植物の熱
ストレス耐性を向上させる機能を有することを指す。
【００１９】このようなDNAには、例えば、配列番号：2
に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ
酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ
酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導
体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００２０】アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコ
ードするDNAを調製するための当業者によく知られた方
法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（K
ramer, W.& Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-dire
cted construction of mutagenesis via gapped duplex
DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げら
れる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク
質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても
生じ得る。このように天然型のSpl7タンパク質をコード
するアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が
置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタン
パク質をコードするDNAであっても、天然型のSpl7タン
パク質（配列番号：2）と同等の機能を有するタンパク
質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、
たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク
質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあ
り、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
【００２１】あるDNAが植物の病斑形成を抑制するタン
パク質をコードするか否かは、実施例６に記載のよう
に、被検DNAを適当なベクターに組み込んで、spl7突然
変異系統に導入し、この突然変異系統における病斑形成
が抑制されるか否かを観察することにより評価すること
ができる。また、あるDNAが植物の熱ストレス耐性を向
上させる機能を有するタンパク質をコードするか否か
は、次ぎの様にして評価すればよい。即ち、被検DNAを
適当なベクターに組み込んで、野生型系統に導入し、こ
の系統を高温条件（40℃程度）および低温（25℃程度）
の栽培下で観察し、高温における生育速度あるいは生育
量の低下が野生型系統に比較して、軽度である場合に、
被検DNAが植物の熱ストレス耐性を付与させる機能を有
するタンパク質をコードすると評価すればよい。
【００２２】配列番号：2に記載のSpl7タンパク質と機
能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するた
めに、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブ
リダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journa
l of Molecular Biology, 98, 503）やポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. (1985) Scie
nce, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al. (1988) Sc
ience, 239, 487-491）を利用する方法が挙げられる。
即ち、当業者にとっては、Spl7遺伝子の塩基配列（配列
番号：1）もしくはその一部をプローブとして、またSpl
7遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして、イネや他の植物からSpl7遺伝
子と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行い
うることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR
技術により単離しうるSpl7タンパク質と同等の機能を有
するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含
まれる。
【００２３】このようなDNAを単離するためには、好ま
しくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーシ
ョン反応を行なう。本発明においてストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4%SDS、
0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシー
のハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジ
ェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xS
SCの条件を用れば、より相同性の高いDNAの単離を期待
することができる。これにより単離されたDNAは、アミ
ノ酸レベルにおいて、Spl7タンパク質のアミノ酸配列
（配列番号：2）と高い相同性を有すると考えられる。
高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％
以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90
％以上（例えば、95%以上）の配列の同一性を指す。配
列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ
酸レベル）のプログラムを利用して決定することができ
る。
【００２４】本発明のDNAは、例えば、組み換えタンパ
ク質の調製や、病斑形成が抑制されたあるいは熱ストレ
ス耐性が向上した形質転換植物体の作出などに利用する
ことが可能である。
【００２５】組み換えタンパク質を調製する場合には、
通常、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発
現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入
し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精
製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなど
の目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発
現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主とし
てマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として
調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベク
ターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラ
ーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Ame
rsham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリー
ズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novage
n社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。
宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した
細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例え
ば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いるこ
とが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当
業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例
えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用し
た導入方法（Mandel, M.& Higa, A. (1970) Journal of
Molecular Biology, 53, 158-162、Hanahan, D. (198
3) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580）を
用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換え
タンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当
業者に公知の方法により精製し、回収することが可能で
ある。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タ
ンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合
には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能であ
る。
【００２６】得られた組換えタンパク質を用いれば、こ
れに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポ
リクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若し
くはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫
し、一定期間のにちに血液を採取し、血ぺいを除去する
ことにより調製することが可能である。また、モノクロ
ーナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫
した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目
的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリ
ドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調
製することができる。これにより得られた抗体は、本発
明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能
である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗
体が含まれる。
【００２７】本発明のDNAを利用して病斑形成が抑制さ
れたあるいは熱ストレス耐性が向上した形質転換植物体
を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードする
DNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導
入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させ
る。
【００２８】植物細胞の形質転換に用いられるベクター
としては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可
能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内
での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例
えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモータ
ー）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性
化されるプロモーターを有するベクターを用いることも
可能である。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態
の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、
葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００２９】植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチ
レングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーシ
ョン）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティク
ルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることが
できる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物
細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可
能である（Tokiら (1995) Plant Physiol. 100:1503-15
07参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を
作出する手法については、ポリエチレングリコールによ
りプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イ
ネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K.
(1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and S
pangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによりプロト
プラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適
している）を再生させる方法（Toki et al (1992) Plan
t Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法に
より細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方
法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-
962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入
し、植物体を再生させる方法（Hiei et al. (1994) Pla
nt J. 6: 271-282.）など、いくつかの技術が既に確立
し、本願発明の技術分野において広く用いられている。
本発明においては、これらの方法を好適に用いることが
できる。
【００３０】一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入され
た形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖
または無性生殖により子孫を得ることが可能である。ま
た、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料
（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カル
ス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体
を量産することも可能である。本発明には、本発明のDN
Aが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物
体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、
およびクローンの繁殖材料が含まれる。このようにして
作出された植物体は、野生型植物体と比較して、熱スト
レス耐性が向上され、病斑形成が抑制されうる。本発明
の手法を用いれば、イネなどの有用農作物の生産性を向
上させることができ非常に有益である。
【００３１】また、本発明は、配列番号：1に記載の塩
基配列からなる本発明のDNAまたはその相補鎖に相補的
な少なくとも15ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド
を提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対
からなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。
また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌク
レオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、
少なくとも70% 、好ましくは少なくとも80% 、より好ま
しくは90% 、さらに好ましくは95% 以上の塩基配列の同
一性を有すればよい。このようなDNAは、本発明のDNAの
検出や単離を行なうためのプローブとして、また、増幅
を行うためのプライマーとして有用である。
【００３２】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものでは
ない。
【００３３】[実施例１] 遺伝地図作成 マップベースクローニングに不可欠な大規模分離集団に
よるSpl7領域の詳細な連鎖解析を行った。連鎖解析用の
集団はspl7突然変異系統と、日本晴の遺伝的背景ををも
ち、第５染色体がKasalathの染色体に置換されたSL18の
交配により得られたF2集団298個体を用いた。RFLPマー
カーによる連鎖解析の結果、spl7 遺伝子座はRFLPマー
カーS869およびR2781の間に存在し、C11368、S2581、S1
762、S1831、B344と共分離することが明らかとなった
（図2A）。
【００３４】精度の高いspl7領域の遺伝地図を作成する
ために、さらに2646個体のF2集団を連鎖解析に用いた。
解析作業を効率化するためにCAPS (Cleaved Amplified
Polymorphic Sequence)マーカーを用いた。すなわちF2
集団の各個体について、Spl7の両側に存在するCAPSマー
カーS869およびR2781を利用して、Spl7近傍の染色体組
み換え個体を選抜した。その結果、65個体の組み換え個
体が選抜できた（図2B）。さらにそれらの個体を用い
て、以下の取り組みにおいて作出されたRFLPマーカーに
よる詳細な連鎖地図作成を行った。
【００３５】[実施例２] 酵母人工染色体（YAC）クロ
ーンならびにP1由来人工染色体（PAC）クローンによるS
pl7遺伝子領域の整列化 イネゲノム解析研究において作出された日本晴YACクロ
ーンの整列化地図を利用して、Spl7遺伝子座近傍に存在
するDNAマーカーS869、C11368、S2581、およびR2781の
塩基配列を有するYACクローンを特定した（図2C）。さ
らに特定されたYACクローンY4666、Y2205、Y3824c、Y60
89およびY2288の末端断片をカセット法により単離し、
特定できたYACクローンを整列化した。その結果、YACク
ローンY4666、Y2205、Y3824cはSpl7遺伝子領域を含むこ
とが明かとなった（図2C）。
【００３６】さらにSpl7遺伝子の候補領域を絞り込むた
めに、Spl7遺伝子座と同座のRFLPマーカーC11368をSTS
化したプライマーセット（プライマー5'-GACCTGTGCTCTG
CCTTTCT-3' ／配列番号：３および5'-GTATGCCAACTGCTCA
ACTT-3'／配列番号：４、増幅ゲノム断片0.4kb）を用い
て、イネゲノム解析研究において作成された日本晴ゲノ
ムのPACクローンライブラリー（平均インサート長 112
kb, 18432クローン；イネゲノムの約4.5倍に相当）を選
抜した（Baba et al (2000). Bull. Natl. Inst. Agrob
iol. Resour. 14, 24-36.）。その結果、9種類のPACク
ローンが選抜できた。さらにこれらのPACクローンの整
列化を行ったところ、P0029H1に代表される8種類のPAC
クローンがSpl7遺伝子座を含むことが明らかとなった
（図2D）。
【００３７】[実施例３] Spl7遺伝子領域の絞り込み Spl7領域に整列化されたYACおよびPACクローンの末端断
片をクローン化し、それらを新たなRFLPマーカーあるい
はCAPSマーカーとして、詳細な遺伝地図を作成したとこ
ろ、Spl7遺伝子座はRFLPマーカーP461H4TおよびP693G10
Sに挟み込まれるゲノム領域に存在し、RFLPマーカーC11
368Bとは共分離することが明らかとなった。この結果、
Spl7遺伝子座は2つのマーカーに挟まれる約16kbのゲノ
ム領域に存在することが明らかとなった（図2）。
【００３８】[実施例４] 塩基配列解析による候補遺伝
子領域の特定 Spl7遺伝子を含むと考えられるPACクローンP0029H1か
ら、16kbのゲノム候補領域の塩基配列解析を行なった。
塩基配列の解析は候補領域を制限酵素NotI, SalIでサブ
クローン化したものを、さらに種々の制限酵素でサブク
ローン化し、dye-primer法により行った。連鎖解析によ
り特定された候補遺伝子領域内の塩基配列情報を利用し
て、新たなCAPSマーカーを作成し、候補領域のさらなる
絞り込みを行った。Spl7遺伝子はCAPSマーカーHsfC2-1
（プライマー5'-TCTCTCTCGTTCGTTCCCCG-3'／配列番号：
５および5'-TGGATAAATGGAGATGGGCA-3'／配列番号：６、
制限酵素ApaI）と共分離し、S12C6-6d（プライマー5'-T
CGGCATCGGCTATTATCGG-3'／配列番号：７および5'-GATTT
CGGGATACTGTGCGT-3' ／配列番号：８、制限酵素NlaII
I）と、HsfC3-3'（プライマー5'-ACGATGTGTTTTGGGAGCGG
-3'／配列番号：９および5'-GACCTGTGCTCTGCCTTTCT-3'
／配列番号：１０、制限酵素NlaIII）との間にそれぞれ
3および7個の組み換え個体を検出した。
【００３９】以上の結果から、Spl7遺伝子はCAPSマーカ
ーS12C6-6dおよびHsfC3-3'に挟み込まれる約3kbのゲノ
ム領域に存在することが明らかとなった（図3）。この
候補ゲノム領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに
類似性検索を行ったところ、トマト、アラビドプシスな
どで単離されているHsf遺伝子と類似した構造を示す遺
伝子のみが予測された（図3）。この遺伝子は熱ショッ
ク誘導タンパク質の転写調節因子として、その機能が明
らかにされている。
【００４０】[実施例５] Spl7候補遺伝子の塩基配列解
析 Hsf様遺伝子をSpl7遺伝子の候補とし、突然変異系統KL2
10の該当領域の塩基配列を決定した。塩基配列解析は、
既に得られている日本晴の塩基配列情報から該当部分を
増幅できるプライマーを設計し、ゲノムPCRおよびRT-PC
R産物をクローン化することによって行った。野生型と
突然変異遺伝子の塩基配列を比較したところ、1塩基置
換が見出された。この塩基置換により、予測アミノ酸の
トリプトファンからシステインへの置換を生じる（図
4）。置換されるアミノ酸はHsf遺伝子に高度に保存され
るアミノ酸の一部であり、このアミノ酸置換が突然変異
系統のspl7タンパク質の機能の消失、あるいは低下の原
因であると考えられた。
【００４１】[実施例６] 形質転換による候補遺伝子の
機能の同定 Spl7遺伝子の候補として特定された5'上流予測プロモー
ター領域を含む日本晴のゲノム領域NspV-BglII 5.6kb断
片を、アグロバクテリウムを介して形質転換可能なベク
ターpPZP2H-lacに組み込んだ。この断片を導入したベク
ター＃178ならびにベクターのみを用い、土岐の方法（P
lant Mol. Biol. Rep. 15:16-21, 1997）により形質転
換を行なった。形質転換する系統にはspl7突然変異系統
KL210を用いた。 NspV-BglII 5.6kb断片の形質転換実
験から150個体、ベクターのみからは50個体のハイグロ
マイシン耐性個体を得た。候補遺伝子に特異的なプライ
マー（センス鎖5'-GTCTCCGTGGCCGTGGCTGA-3'／配列番
号：１１）および （アンチセンス鎖5'-AACGAGGAATCTTA
GAAGGG-3'／配列番号：１２）を用いて、導入した領域
が組み込まれたか否かをPCR法により調査した。
【００４２】その結果、150個体すべての形質転換体に
ついて、候補遺伝子が組み込まれていることが判明し
た。これらの個体を、自然日長条件の隔離温室（3月に
培養室から隔離温室(つくば市)に移す）で栽培して、病
斑の形成を調査した。その結果、ベクターのみを導入し
た個体は、突然変異系統KL210と同様に、生育後期にな
って病斑が形成されたのに対して、候補遺伝子が導入さ
れた個体については、すべての個体で病斑の形成が認め
られなかった（図5）。さらに1コピーの導入遺伝子が組
み込まれたと考えられる個体の自殖後代24個体を栽培し
たところ、病斑が形成される個体と形成されない個体が
6および18個体に分離し、この分離比が期待比1：3 に適
合した。これらの結果から、候補遺伝子領域（NspV-Bgl
II 5.6kb）には、突然変異系統KL210の病斑形成を抑制
する機能を有することが判明し、候補遺伝子がSpl7遺伝
子であると判断した。
【００４３】[実施例７] 病斑形成に必要な条件 Spl7突然変異系統 KL210および野生型遺伝子をもつ日本
晴を平成11年5月17日から14日間隔で播種し、KL210に病
斑が出現するまでに必要な日数を調査した。この所要日
数は8月23日の播種まで減少し、9月6日の播種では増加
した（図6）。一方、播種から病斑が出現するまでの期
間の平均気温は8月9日まで上昇し、それ以降、下降して
いた（図6）。8月23日の播種では、平均気温が下降して
いるにもかかわらず病斑が出現するまでの日数が１１日
という最短を記録しているが、病斑出現の直前に、平成
11年最高気温の36℃が記録されていた。病斑の出現は、
冬場の温室で育成した場合、多くの日数（播種後60日以
上）を必要とし、病斑の出現程度も低く抑えられること
が観察されている。また、気温が26℃を上回らないグロ
ースチャンバーで育成した場合、生育期間を通じて全く
病斑の出現が見られなかったが、37℃の培養庫では１ヶ
月で病斑が出現した。これらの結果より、病斑形成には
ある程度の高温が不可欠であり、かつ高温条件によって
促進されると推定された。
【００４４】次に、KL210と日本晴を、紫外線遮断シー
トおよび紫外線を遮らないビニールシートで覆って育成
した。どちらのシートで覆って育成した場合も、KL210
には播種後25日目に病斑の出現が見られたが、紫外線を
遮らなかったものに比べ、紫外線を遮断したもののほう
が出現程度が低く抑えられた（図7）。この結果より、
紫外線は病斑形成を促進する条件のひとつであることが
示された。以上の結果から、マップベースクローニング
法により候補として絞り込まれたHsf様遺伝子がイネ病
斑形成抑制遺伝子Spl7であることが判明した。本成果は
植物におけるHsf様遺伝子の生物的機能を証明した初め
てのケースである。
【００４５】
【発明の効果】熱帯原産の植物、例えばイネは、ムギ類
に比較してある程度の高温に対して適応し、熱ストレス
に対する耐性を獲得している。しかしながら近年、地球
温暖化の影響により植物の生育する温度がこれまで以上
に上昇傾向にある。この状況下、今後の作物生産の安定
確保のためには、熱ストレス耐性を効率的に付与する手
法が望まれている。熱ストレス耐性機構については、こ
れまで不明な点が多く、その改変においても、積極的に
向上させる有効な手法はなかった。熱ストレスが効果的
に付与できれば、今後、生じる温暖化においても、これ
まで同様の安定した食料生産が確保できるばかりでな
く、従来は不可能であった地域への作物栽培が可能とな
る。本発明のSpl7遺伝子は植物の熱ストレス耐性を向上
させ、病斑形成を抑制する機能を有するため、これら目
的に大きく貢献し得るものである。
【００４６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Agrobiological Resources. Society for Techno-innovation of Agriculture, Forestry and Fisheri es. <120> Gene, Spl7, controlling lesion mimic in plants and its application <130> MOA-A0005 <140> <141> <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5579 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <223> genomic DNA <220> <221> CDS <222> (3711)..(3947) <220> <221> CDS <222> (4185)..(5327) <400> 1 ttcgaagtcc tgagattagc cgatgagagt tatcaagtcg tcagttgtcg gattctttct 60 atattcagtt aaggaaattg atctactaaa ggaagcttat acagaagaga ccgagttcaa 120 agagaatgcg gcatggaaag ttatctatta attaggaata gtttgttagt ttctttttat 180 ctttaggaaa gtgtgtttag tgttctataa gaactttatc ttttcctttt atctttagaa 240 aagtttcttt cttgtctaac aaggacttgt atcaacccat gggtataaat atgtacaccc 300 ggggtctatg taatctatct tcatgatcaa tacaattcag cgcatcgcca ccttttacct 360 tttctacttt attttatcgt ccggcggaac ttggcacctg acacggggct gcatcggtgt 420 tcgatctccg gctaaggggt aagtccaatg ttccgccggc caggcaattg tatcgtttac 480 gtcggcgttg ttcaaggctg catcagtaca ttcgacctct tgcattgctc tagtttggat 540 gatatatttg 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cgcgcgcgcc actgcactag cacggctgca cgccctgcac 3120 ccgttgccac caccaccgcc ttctccgccg cgccgcctcc tctcgcgtct cccgctcgtg 3180 cagggcgcgc gtcgtcgggc gagctgctgc cgtctccgtg gccgtggctg atcaggtgag 3240 aattgagaaa ggttgtgagt tttcgcgtgg ttgtctggtt gattcgatcg tgccggcgcg 3300 ccttggcatg gcaggcaaga ttgtatcagg agataatgaa aaaacataca ctgggctttc 3360 tttttcttaa tttctttgca ttctttgctt cgacggctat ggttgcttga actgttcagg 3420 cggcgccttt gtgtatacac gtgcttgtat gtgatgctct ggtcatttct ttttgcagaa 3480 ctagttggcg ttcgatcgga aagtcgctgt cttttggcga ctcggtgaga atttgcgccg 3540 cggttcaatg tgaaaaattt tggcccgtgg cgagttggat ttggcgccga gtccattcag 3600 gtggttaaga cttgttcgtg ggagagcgaa gctgcgcgcg ttaagaccgg gctccgttct 3660 tgcatcgtgc agagcagctg ctggtttgag aattgagagg cgcggttgac atg gag 3716 Met Glu 1 agt tcc aac ctg ggc ggc ggc ggc ggc gga ggc ggc ggc ggt ggg ccg 3764 Ser Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro 5 10 15 ccg ccg ttc ttg atc aag acg tac gag atg gtg gag gac gcg gcg acc 3812 Pro Pro Phe Leu Ile Lys Thr Tyr Glu Met Val Glu Asp Ala Ala Thr 20 25 30 aac cac gtc gtg tcg tgg ggc ccc ggc ggc gcc agc ttc gtc gtg tgg 3860 Asn His Val Val Ser Trp Gly Pro Gly Gly Ala Ser Phe Val Val Trp 35 40 45 50 aac ccg ctc gac ttc tcc cgt gac ctg ttg ccc aag tac ttc aag cac 3908 Asn Pro Leu Asp Phe Ser Arg Asp Leu Leu Pro Lys Tyr Phe Lys His 55 60 65 aac aac ttc tcc agc ttc atc agg cag ctc aac acc tac gtgagtcaca 3957 Asn Asn Phe Ser Ser Phe Ile Arg Gln Leu Asn Thr Tyr 70 75 aacacaatcc cctttgcttc ttgaaacgaa acaaacattg caacaatcat gtgctactgt 4017 ttgcttgtaa attagtagtt ccttgttctt ggtttgtttg gatgatttta ccattgacac 4077 agcagccggt tttatatagc ctatttgatt ttctgtaaaa tagttcttta ttcttggttg 4137 gtttgaccgt agctgaattt tgacttcaat tggcatcttc ctttcag ggt ttc cga 4193 Gly Phe Arg 80 aaa atc gat cct gag aga tgg gag ttc gca aac gag gat ttc ata aga 4241 Lys Ile Asp Pro Glu Arg Trp Glu Phe Ala Asn Glu Asp Phe Ile Arg 85 90 95 ggg cac acg cac ctt ctg aag aac atc cat cga cgc aag ccc gtg cac 4289 Gly His Thr His Leu Leu Lys Asn Ile His Arg Arg Lys Pro Val His 100 105 110 agc cac tcc ctc cag aac cag ata aac gga cca ctc gcc gaa tcg gag 4337 Ser His Ser Leu Gln Asn Gln Ile Asn Gly Pro Leu Ala Glu Ser Glu 115 120 125 130 agg cgc gag ctc gaa gaa gag atc aac cgg ctc aag tac gag aag agc 4385 Arg Arg Glu Leu Glu Glu Glu Ile Asn Arg Leu Lys Tyr Glu Lys Ser 135 140 145 atc ctc gtc gcg gac ctc cag agg cag aac cag cag cag tac gtg atc 4433 Ile Leu Val Ala Asp Leu Gln Arg Gln Asn Gln Gln Gln Tyr Val Ile 150 155 160 aac tgg cag atg cag gcg atg gaa ggc agg cta gtg gcg atg gag caa 4481 Asn Trp Gln Met Gln Ala Met Glu Gly Arg Leu Val Ala Met Glu Gln 165 170 175 cgg cag aag aac atc gtg gcc tcc ctg tgc gag atg ctg cag aga cgc 4529 Arg Gln Lys Asn Ile Val Ala Ser Leu Cys Glu Met Leu Gln Arg Arg 180 185 190 ggt ggc gcc gtg tcg agc tcg ctg ctg gag tcc gac cat ttc agc aag 4577 Gly Gly Ala Val Ser Ser Ser Leu Leu Glu Ser Asp His Phe Ser Lys 195 200 205 210 aag agg agg gtc ccg aag atg gat ctc ttc gtc gac gat tgc gcg gcg 4625 Lys Arg Arg Val Pro Lys Met Asp Leu Phe Val Asp Asp Cys Ala Ala 215 220 225 ggc gaa gaa cag aag gtg ttc cag ttc cag gga att ggg acg gat gca 4673 Gly Glu Glu Gln Lys Val Phe Gln Phe Gln Gly Ile Gly Thr Asp Ala 230 235 240 ccg gcc atg cct ccc gtg ctt cct gtg acc aat ggt gag gct ttt gac 4721 Pro Ala Met Pro Pro Val Leu Pro Val Thr Asn Gly Glu Ala Phe Asp 245 250 255 agg gtt gag ctg agc ctg gtc tcc ctg gag aaa ctc ttc cag aga gca 4769 Arg Val Glu Leu Ser Leu Val Ser Leu Glu Lys Leu Phe Gln Arg Ala 260 265 270 aat gat gct tgc aca gct gct gaa gaa atg tac tcc cat ggt cat ggt 4817 Asn Asp Ala Cys Thr Ala Ala Glu Glu Met Tyr Ser His Gly His Gly 275 280 285 290 ggt act gaa ccc agc act gct ata tgt cct gaa gag atg aac act gct 4865 Gly Thr Glu Pro Ser Thr Ala Ile Cys Pro Glu Glu Met Asn Thr Ala 295 300 305 cca atg gag aca ggc atc gat ctt cag tta cca gct agc ctc cat ccc 4913 Pro Met Glu Thr Gly Ile Asp Leu Gln Leu Pro Ala Ser Leu His Pro 310 315 320 agc tca ccc aac aca ggg aat gcc cat ctc cat tta tcc act gaa ctc 4961 Ser Ser Pro Asn Thr Gly Asn Ala His Leu His Leu Ser Thr Glu Leu 325 330 335 aca gag tct cca ggt ttt gtg cag agt cca gag ctg cca atg gca gag 5009 Thr Glu Ser Pro Gly Phe Val Gln Ser Pro Glu Leu Pro Met Ala Glu 340 345 350 att cgt gaa gat atc cat gtg aca aga tac cca aca caa gct gat gta 5057 Ile Arg Glu Asp Ile His Val Thr Arg Tyr Pro Thr Gln Ala Asp Val 355 360 365 370 aat tct gag att gcc tcc tcc act gat act tca caa gat ggc acg tca 5105 Asn Ser Glu Ile Ala Ser Ser Thr Asp Thr Ser Gln Asp Gly Thr Ser 375 380 385 gaa act gaa gct tcg cat gga ccg acc aac gat gtg ttt tgg gag cgg 5153 Glu Thr Glu Ala Ser His Gly Pro Thr Asn Asp Val Phe Trp Glu Arg 390 395 400 ttc ctc aca gag act cca cgg tca tgt ttg gat gag tca gaa aga caa 5201 Phe Leu Thr Glu Thr Pro Arg Ser Cys Leu Asp Glu Ser Glu Arg Gln 405 410 415 gag tct ccc aag gac gat gta aaa gca gaa tta ggc tgc aat ggc ttc 5249 Glu Ser Pro Lys Asp Asp Val Lys Ala Glu Leu Gly Cys Asn Gly Phe 420 425 430 cat cac cgg gag aag gtt gat cag atc acc gag caa atg ggg cac ctt 5297 His His Arg Glu Lys Val Asp Gln Ile Thr Glu Gln Met Gly His Leu 435 440 445 450 gct tca gcc gag cag act ctg cat acc tga tgcagtaata ccatttgcgc 5347 Ala Ser Ala Glu Gln Thr Leu His Thr 455 460 ggattcatag ttcgtgtgta aattagcgaa gatgtaaatt atagcttaga tcggattaga 5407 ggcttgcgtg ttactttaca gatttcaacc ttttattaga ttacaatagg tctttcacaa 5467 tttatgattc tgttctatcc gctgactact gtgcataaat tttttttagt agaccatatc 5527 catttttgta ctccattgcc cttctaagat tcctcgttaa aatctcagat ct 5579 <210> 2 <211> 459 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Glu Ser Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Pro Pro Pro Phe Leu Ile Lys Thr Tyr Glu Met Val Glu Asp Ala 20 25 30 Ala Thr Asn His Val Val Ser Trp Gly Pro Gly Gly Ala Ser Phe Val 35 40 45 Val Trp Asn Pro Leu Asp Phe Ser Arg Asp Leu Leu Pro Lys Tyr Phe 50 55 60 Lys His Asn Asn Phe Ser Ser Phe Ile Arg Gln Leu Asn Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Arg Lys Ile Asp Pro Glu Arg Trp Glu Phe Ala Asn Glu Asp Phe 85 90 95 Ile Arg Gly His Thr His Leu Leu Lys Asn Ile His Arg Arg Lys Pro 100 105 110 Val His Ser His Ser Leu Gln Asn Gln Ile Asn Gly Pro Leu Ala Glu 115 120 125 Ser Glu Arg Arg Glu Leu Glu Glu Glu Ile Asn Arg Leu Lys Tyr Glu 130 135 140 Lys Ser Ile Leu Val Ala Asp Leu Gln Arg Gln Asn Gln Gln Gln Tyr 145 150 155 160 Val Ile Asn Trp Gln Met Gln Ala Met Glu Gly Arg Leu Val Ala Met 165 170 175 Glu Gln Arg Gln Lys Asn Ile Val Ala Ser Leu Cys Glu Met Leu Gln 180 185 190 Arg Arg Gly Gly Ala Val Ser Ser Ser Leu Leu Glu Ser Asp His Phe 195 200 205 Ser Lys Lys Arg Arg Val Pro Lys Met Asp Leu Phe Val Asp Asp Cys 210 215 220 Ala Ala Gly Glu Glu Gln Lys Val Phe Gln Phe Gln Gly Ile Gly Thr 225 230 235 240 Asp Ala Pro Ala Met Pro Pro Val Leu Pro Val Thr Asn Gly Glu Ala 245 250 255 Phe Asp Arg Val Glu Leu Ser Leu Val Ser Leu Glu Lys Leu Phe Gln 260 265 270 Arg Ala Asn Asp Ala Cys Thr Ala Ala Glu Glu Met Tyr Ser His Gly 275 280 285 His Gly Gly Thr Glu Pro Ser Thr Ala Ile Cys Pro Glu Glu Met Asn 290 295 300 Thr Ala Pro Met Glu Thr Gly Ile Asp Leu Gln Leu Pro Ala Ser Leu 305 310 315 320 His Pro Ser Ser Pro Asn Thr Gly Asn Ala His Leu His Leu Ser Thr 325 330 335 Glu Leu Thr Glu Ser Pro Gly Phe Val Gln Ser Pro Glu Leu Pro Met 340 345 350 Ala Glu Ile Arg Glu Asp Ile His Val Thr Arg Tyr Pro Thr Gln Ala 355 360 365 Asp Val Asn Ser Glu Ile Ala Ser Ser Thr Asp Thr Ser Gln Asp Gly 370 375 380 Thr Ser Glu Thr Glu Ala Ser His Gly Pro Thr Asn Asp Val Phe Trp 385 390 395 400 Glu Arg Phe Leu Thr Glu Thr Pro Arg Ser Cys Leu Asp Glu Ser Glu 405 410 415 Arg Gln Glu Ser Pro Lys Asp Asp Val Lys Ala Glu Leu Gly Cys Asn 420 425 430 Gly Phe His His Arg Glu Lys Val Asp Gln Ile Thr Glu Gln Met Gly 435 440 445 His Leu Ala Ser Ala Glu Gln Thr Leu His Thr 450 455 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 3 gacctgtgct ctgcctttct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 4 gtatgccaac tgctcaactt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 5 tctctctcgt tcgttccccg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 6 tggataaatg gagatgggca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 7 tcggcatcgg ctattatcgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 8 gatttcggga tactgtgcgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 9 acgatgtgtt ttgggagcgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 10 gacctgtgct ctgcctttct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 11 gtctccgtgg ccgtggctga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 12 aacgaggaat cttagaaggg 20
【図面の簡単な説明】
【図１】spl7突然変異体KL210の葉（図左）および日本
晴の葉（図右）を示す写真である。
【図２】Spl7遺伝子領域の詳細な連鎖地図およびゲノム
クローンの整列地図である。AおよびB: 298個体および2
944個体の分離集団により作成した遺伝地図。CおよびD:
日本晴のYACおよびPACクローンによる整列地図。
【図３】Spl7遺伝子領域の詳細な遺伝地図と候補ゲノム
領域ならびに予測遺伝子を示す図である。
【図４】Spl7候補遺伝子の構造と日本晴とKL210のゲノ
ム塩基配列の比較を示す図である。
【図５】spl7突然変異KL210の葉（図左）および形質転
換体の葉（図右4枚）を示す写真である。
【図６】自然栽培条件下におけるspl7突然変異体上の病
斑形成に必要な日数と平均気温との関係を示す図であ
る。
【図７】spl7突然変異KL210を紫外線を遮断して栽培し
た場合の葉（図左）と遮断しない場合の葉（図右）を示
す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者 山内 歌子 茨城県つくば市上横場一杯塚446−１ 社 団法人農林水産先端技術研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 4B024 AA08 CA01 DA01 GA17 4B064 AG01 CA19 CC24 DA11 4B065 AA89X AA89Y AB01 AC02 BA01 CA53 4H045 AA10 BA10 CA31 EA05 FA74

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 植物の病斑形成を抑制する機能を有する
    植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から
    （ｄ）のいずれかに記載のDNA。 （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタン
    パク質をコードするDNA。 （ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含
    むDNA。 （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１ま
    たは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／また
    は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
    するDNA。 （ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとス
    トリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
  2. 【請求項２】 植物の熱ストレス耐性を向上させる機能
    を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記
    （ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。 （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタン
    パク質をコードするDNA。 （ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含
    むDNA。 （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１ま
    たは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／また
    は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
    するDNA。 （ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとス
    トリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のDNAを含むベ
    クター。
  4. 【請求項４】 請求項１または２に記載のDNAまたは請
    求項３に記載のベクターが導入された形質転換細胞。
  5. 【請求項５】 植物細胞である、請求項４に記載の形質
    転換細胞。
  6. 【請求項６】 請求項１または２に記載のDNAによりコ
    ードされるタンパク質。
  7. 【請求項７】 請求項４に記載の形質転換細胞を培養
    し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させた
    タンパク質を回収する工程を含む、請求項６に記載のタ
    ンパク質の製造方法。
  8. 【請求項８】 請求項５に記載の形質転換細胞を含む形
    質転換植物体。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の形質転換植物体の子孫
    またはクローンである、形質転換植物体。
  10. 【請求項１０】 請求項８または９に記載の形質転換植
    物体の繁殖材料。
  11. 【請求項１１】 請求項８に記載の形質転換植物体の製
    造方法であって、請求項１または２に記載のDNAを植物
    細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程
    を含む方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載のDNAを植物体の細胞
    内で発現させることを特徴とする、植物の病斑形成を抑
    制する方法。
  13. 【請求項１３】 請求項２に記載のDNAを植物体の細胞
    内で発現させることを特徴とする、植物の熱ストレス耐
    性を向上させる方法。
  14. 【請求項１４】 請求項６に記載のタンパク質に結合す
    る抗体。
  15. 【請求項１５】 配列番号：１に記載の塩基配列からな
    るDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレ
    オチドからなるポリヌクレオチド。
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