DE60127281T2

DE60127281T2 - Spl7, pflanzenläsionbildungunterdrückungsgen und dessen verwendung

Info

Publication number: DE60127281T2
Application number: DE60127281T
Authority: DE
Inventors: Masahiro Tsukuba-shi YANO; Utako Tsukuba-shi YAMANOUCHI
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-18
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2021-10-19
Also published as: EP1325956B1; AU768139B2; CN1401003A; US20040058324A1; EP1325956A1; EP1325956A4; WO2002033092A1; DE60127281D1; AU9596101A; KR20020071890A; US7329544B2; CA2395453C; JP2002125672A; CA2395453A1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das bei der Bildung von Läsionen bei Pflanzen und an Wärmebelastungsbeständigkeit bei Pflanzen beteiligt ist, sowie Verfahren zum Modifizieren von Pflanzen über das Gen. Die vorliegende Erfindung ist auf dem Gebiet der Landwirtschaft, einschließlich der Pflanzenzüchtungstechnologie nützlich.
Hintergrund der Erfindung
In der Vergangenheit sind verschiedene mutierte Stämme von Reis produziert worden. Diese umfassen mutierte Stämme, bei denen während des Wachstums von Reis läsionsartige nekrotische Flecken auf dem Blatt gebildet werden (1) (Rice Genetics Newsletter 12, 9–153 (1995)). Diese Läsionsbildung tritt bei diesen mutierten Stämmen bei hoher Temperatur und starker Licht auf, wodurch eine Beziehung zwischen den mutierten Genen und der Vermeidung von Schäden durch Licht oder Wärme nahe gelegt wird (T. Fuse et al., Physiol. Plant 89, 799–804 (1993)). Andererseits wird davon ausgegangen, dass diese Gene mit Überempfindlichkeitsreaktionen in Pflanzenzellen und daraus resultierendem Zelltod in Verbindung stehen, weil manche Pflanzen, die Läsionen bilden, gegenüber Infektionen pathogener Mikroorganismen resistent sind (T. Kawasaki und K. Shimamoto, Cell Engineering Supplement "Plant Cell Engineering Series 8: Disease Resistance of Plants at Molecular Level", 124–130 (1997)).
Deshalb kann die Identifikation dieses mutierten Gens in diesen mutierten Stämmen gemeinsam mit der Isolierung des entsprechenden Wildtypgens eine Unterdrückung von Läsionsbildung und erhöhte Restenz gegenüber Belastungen wie Licht und Wärme bei Reispflanzen durch Einführung des Gens in willkürliche Sorten mittels Transformationsverfahren ermöglichen.
Es bestand daher im Fachgebiet einn Bedarf daran, das mutierte Gen in diesen mutierten Stämmen zu identifizieren und auch das entsprechende Wildtypgen zu identifizieren.
Offenbarung der Erfindung
Dieser Bedarf im Fachgebiet führte zur vorliegenden Erfindung, deren Ziel es ist, ein neues Gen zu isolieren, das mit der Unterdrückung der Läsionsbildung bei Pflanzen in Verbindung steht. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Pflanzen unter Nutzung des neuen Gens zu modifizieren.
Um das Ziel zu erreichen, das mutierte Gen zu identifizieren und auch das entsprechende Wildtypgen zu isolieren, führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung umfassende Forschung durch Fokussierung auf Spl7, worin ein mutiertes Gen auf Chromosom 5 existiert, unter mutierten Stämmen, die läsionsartige nekrotische Flecken auf dem Blatt in Verbindung mit dem Wachstum von Reis induzierten, durch.
Erstens führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Kopplungsanalyse durch und glichen die Spl7-Genregion von künstlichen Hefechromosom-("yeast artificial chromosome"-, YAC-)Klonen ab. Insbesondere wurde eine Kopplungsanalyse einer großen segregierenden Population durchgeführt, was für die Isolierung des Spl7-Gens essenziell war. Weiters wurden YAC-Klone in Nachbarschaft zum Spl7-Genlocus durch Verwendung der YAC-Genomklonbibliothek identifiziert, die im Rice Genome Research Program hergestellt wurde. Dann wurden die Endfragmente der identifizierten YAC-Klone isoliert und abgeglichen, um zu zeigen, dass die YAC-Klone eine Spl7-Genregion umfassen (2C).
Die vorliegenden Erfinder wählten 9-PAC-Klone aus einer genomischen PAC-Klon-Bibliothek von Nipponbare aus, die im Rahmen des Rice Genome Research Program geschaffen wurde, wobei STS-Primersets verwendet wurden, die aus dem RFLP-Marker C11368 hergestellt wurden, ein Gen auf demselben Locus wie der Spl7-Locus. Diese PAC-Klone wurden abgeglichen, um den PAC-Klon anzuzeigen, der einen Spl7-Locus enthielt (2D).
Anhand einer feinabgestuften ("small scale") genetischen Karte, die unter Einsatz von Endfragmenten von YAC- und PAC-Klonen, die in der Spl7-Region abgeglichen wurden, als neue RFLP-Marker oder CAPS-Marker erzeugt worden war, wurde gezeigt, dass der Spl7-Locus in einer Genomregion von etwa 16 kb zwischen den RFLP-Markern P461H4T und P693G10S (2) vorliegt.
Es wurde die Nucleotidsequenz der genomischen Kandidatenregion analysiert. Basierend auf den Sequenzinformationen wurde ein neuer CAPS-Marker hergestellt, um die Kandidatenregion weiter abzugrenzen, und es wurde geschlossen, dass das Spl7-Gen auf einer Genomregion von etwa 3 kb zwischen den CAPS-Markern S12C6-6d und HsfC3-3' (3) vorliegt.
Es wurde eine Genprognose- und Ähnlichkeitssuche bezüglich der Nucleotidsequenz der Kandidaten-Genomregion durchgeführt. Dies ergab, dass es nur einen prognostizierten ORF gab, der eine ähnliche Sequenz wie das Hsf-Gen aufwies, das aus Pflanzen, wie z.B. Tomate und Arabidopsis, isoliert wurde. Daher wurde angenommen, dass das Gen ein Kandidat für das Spl7-Gen war, und die Nucleotidsequenz der entsprechenden Region in einem mutierten Stamm KL210 wurde bestimmt. Das Ergebnis lieferte eine Nucleotidsubstitution in der Nucleotidsequenz des mutierten Gens im Vergleich zum Wildtypgen (4). Eine mit der Nucleotidsubstitution korrelierende Aminosäuresubstitution wurde als Grund für den Verlust oder die Abnahme der Funktion des Spl7-Proteins angesehen.
Weiters führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die genomische Region (die als Kandidat für das Spl7-Gen spezifiziert worden war) durch Insertion dieser Region in einen Vektor, der unter Verwendung von Agrobacterium transformiert werden kann, in den Spl7-mutierten Stamm ein. Die transformierten Pflanzen wurden in einer isolierten Wachstumskammer unter Bedingungen natürlicher Lichtperioden gezüchtet, um die Bildung von Läsionen zu überwachen. Läsionen waren auf beiden Kontrollpflanzen (die nur mit dem Vektor transformiert wurden) und mutierten Stämmen in der späten Wachstumsphase zu beobachten, während die Pflanzen, die mit dem Kandidatengen transformiert worden war, keinerlei Läsionen bildeten (5). Daher kann der Schluss gezogen werden, dass die Kandidaten-Genregion die Läsionsbildung im mutierten Stamm KL210 unterdrückte. Weiters war bei geselbsteter Nachkommenschaft transgener Pflanzen das Segregationsverhältnis zwischen Pflanzen, die Läsionen bildeten, und jenen, die keine bildeten, an das erwartete Verhältnis angepasst. Deshalb wurde der Schluss gezogen, dass das Kandidatengen das Spl7-Gen war.
Weiters untersuchten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die für Läsionsbildung notwendigen Bedingungen. Es wurde entdeckt, dass sowohl hohe Temperaturen (6) als auch ultraviolette Strahlung Bedingungen sind, die eine Läsionsbildung fördern (7). Diese Tatsache zeigt, dass das Spl7-Gen eine wichtige Rolle bei der Prävention von Belastungen durch hohe Temperaturen bei Pflanzen spielt. Daher wird durch die Züchtung transgener Pflanzen, die das Spl7-Gen exprimieren, ermöglicht, die inherente Fähigkeit von Pflanzen, Wärmebelastungen zu vermeiden und Läsionsbildung auf Pflanzen zu unterdrücken, zu verstärken.
In anderen Worten haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung erfolgreich ein Gen isoliert, das an der Unterdrückung von Läsionsbildung bei Pflanzen beteiligt ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass dieses Gen die Läsionsbildung auf Pflanzen unterdrücken kann und dass die Widerstandsfähigkeit gegen Wärmebelastung bei Pflanzen mittels dieses Gens erhöht werden kann, wodurch die vorliegende Erfindung entstanden ist.
Genauer gesagt stellt diese Erfindung Folgendes bereit:

(1) DNA, die für ein von Pflanzen abstammendes Protein kodiert, das die Bildung von Läsionen bei Pflanzen unterdrückt, wobei die DNA aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) DNA, die für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst; (b) DNA, welche die kodierende Region der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 umfasst; (c) DNA, die für ein Protein kodiert, das zumindest 50 % Identität mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst; und (d) DNA, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit DNA zu hybridisieren, die aus der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 besteht.
(2) DNA, die für ein von Pflanzen stammendes Protein kodiert, das die Widerstandsfähigkeit von Pflanzen gegen Wärmebelastung erhöht, worin die DNA aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) DNA, die für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst; (b) DNA, welche die kodierende Region der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 umfasst; (c) DNA, die für ein Protein kodiert, das zumindest 50 % Identität mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst; (d) DNA, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit DNA zu hybridisieren, die aus der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 besteht.
(3) Einen Vektor, der DNA gemäß (1) oder (2) umfasst.
(4) Eine transformierte Zelle, in die DNA gemäß (1) oder (2) oder ein Vektor gemäß (3) eingeführt worden ist.
(5) Eine transformierte Zelle gemäß (4), worin die transformierte Zelle eine Pflanzenzelle ist.
(6) Ein Protein, für das DNA gemäß (1) oder (2) kodiert.
(7) Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß (6), worin das Verfahren Folgendes umfasst: das Kultivieren einer transformierten Zelle gemäß (4) und das Gewinnen eines exprimierten Proteins aus der transformierten Zelle oder aus deren Kulturüberstand.
(8) Eine Pflanzentransformante, die eine transformierte Zelle gemäß (5) umfasst.
(9) Eine Pflanzentransformante, die ein Nachkomme oder ein Klon einer Pflanzentransformante gemäß (8) ist.
(10) Transformiertes Zuchtmaterial für eine Pflanzentransformante gemäß (8) oder (9).
(11) Ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanzentransformante gemäß (8), worin das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Einführen von DNA gemäß (1) oder (2) in eine Pflanzenzelle und (b) das Regenerieren einer Pflanze aus der Pflanzenzelle.
(12) Ein Verfahren zur Unterdrückung der Bildung von Läsionen bei Pflanzen, wobei das Verfahren den Schritt des Exprimierens von DNA gemäß (1) in Zellen der Pflanze umfasst.
(13) Ein Verfahren zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit von Pflanzen gegen Wärmebelastung, worin das Verfahren den Schritt des Exprimierens von DNA gemäß (2) in Zellen der Pflanzen umfasst.
(14) Sowie einen Antikörper, der sich spezifisch an ein Protein gemäß (6) bindet.

Die vorliegende Erfindung stellt DNA bereit, die für ein Spl7-Protein kodiert. Die Nucleotidsequenz der genomischen Spl7-DNA von Nipponbare-Reis ist in Seq.-ID Nr. 1 angeführt, und die Aminosäuresequenz eines Proteins, für das die DNA kodiert, ist in Seq.-ID Nr. 2. dargestellt. Es ist bekannt, dass das Spl7-Gen an der Unterdrückung der Bildung von Läsionen bei Reis beteiligt ist. Es existiert irgendwo innerhalb der breiten Region von Chromosom 5. Allerdings war das Spl7-Gen nie zuvor identifiziert oder isoliert worden. Nach der Durchführung umfassender Forschungen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung letztlich die Region identifiziert, in der sich das Gen befindet, und waren die ersten, die dieses Gen als einzelnes Gen isoliert haben.
Das Spl7-Protein besitzt eine Funktion, die Bildung von durch Wärmebelastung verursachten Läsionen bei Reis zu unterdrücken. Weiters ergibt sich aus der Struktur des Spl7-Proteins die Beziehung zwischen dem Spl7-Protein und der Transkriptionsregulierung von Hitzeschockprotein-Genen. Kürzlich wurde berichtet, dass ein Hitzeschockprotein eng mit der Vermeidung von Wärmebelastung bei Pflanzen in Verbindung steht (C. Queitsch et al., Plant Cell 12, 479–492 (2000)). Deshalb wird der Schluss gezogen, dass Widerstandsfähigkeit gegen Wärmebelastung erhöht und die Bildung von Läsionen dadurch unterdrückt werden kann, dass Pflanzen mit DNA transformiert werden, die für das Spl7-Protein kodiert.
Für das Spl7-Protein kodierende DNA der vorliegenden Erfindung umfasst genomische DNA, cDNA, und chemisch synthetisierte DNA. Genomische DNA und cDNA können gemäß herkömmlichen fachbekannten Verfahren erzeugt werden. Genauer gesagt kann genomische DNA wie folgt hergestellt werden: (1) Extrahieren genomischer DNA aus Reissorten, die über das Spl7-Gen verfügen (z.B. Nipponbare); (2) Erzeugen einer genomischen Bibliothek (unter Einsatz eines Vektors, wie z.B. Plasmid, Phage, Cosmid, BAC, PAC etc.); (3) Ausbreiten der Bibliothek; und (4) Durchführen von Koloniehybridisierung oder Plaquehybridisierung unter Einsatz einer Sonde, die auf der Basis von DNA hergestellt wird, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert (z.B. Seq.-ID Nr. 1). Alternativ dazu kann genomische DNA mittels PCR unter Einsatz von Primern hergestellt werden, die für DNA spezifisch sind, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert (Seq.-ID Nr. 1). Andererseits kann cDNA wie folgt hergestellt werden: (1) Synthetisieren von cDNAs basierend auf mRNAs, die aus Reissorten extrahiert wurden, die über das Spl7Gen verfügen (z.B. Nipponbare); (2) Erzeugen einer cDNA-Bibliothek durch Einführen der synthetisierten cDNA in Vektoren, wie z.B. λZAP; (3) Ausbreiten der cDNA-Bibliothek; und (4) Durchführen von oben beschriebener Koloniehybridisierung oder Plaque-Hybridisierung. Alternativ dazu kann cDNA auch mittels PCR erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst die in den Ansprüchen definierten DNAs, die für Proteine (Nipponbare) kodieren, die funktionell dem Spl7-Protein der Seq.-ID Nr. 2 entsprechen. Obwohl es keine Einschränkung hinsichtlich der Pflanzenspezies gibt, aus der DNA der vorliegenden Erfindung stammt, sind es bevorzugt Gramineae und insbesondere Reis. Dabei bedeutet der Ausdruck "funktionell dem Spl7-Protein entsprechend", wie hierin verwendet, dass das Zielprotein die Funktion hat, die Bildung von Läsionen bei Pflanzen zu unterdrücken, und/oder die Funktion, die Widerstandsfähigkeit gegen Wärmebelastung zu steigern.
Beispiele für solche DNAs umfassen jene kodierenden Mutanten, Derivate, Allele, Varianten und Homologe, welche eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfassen, in der eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert, addiert und/oder insertiert wurden, unter der Voraussetzung, dass sie wie in den beiliegenden Ansprüchen definiert sind.
Dem Fachmann bekannte Beispiele für Verfahren zur Herstellung von DNA, die für ein Protein kodiert, das geänderte Aminosäuren umfasst, umfassen ortsspezifische Mutagenese (W. Kramer und H. J. Fritz, "Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA", Methods in Enzymology 154, 350–367 (1987)). Die Aminosäuresequenz eines Proteins kann auch in der Natur aufgrund einer Mutation seiner entsprechenden Nucleotidsequenz mutiert werden. DNA, die für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz des natürlichen Spl7-Proteins aufweist, in der eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert und/oder addiert wurden, sind ebenfalls im Schutzumfang von DNA der vorliegenden Erfindung enthalten – unter der Voraussetzung, dass sie für ein Protein kodiert, das funktionell dem natürlichen Spl7-Protein (Seq.-ID Nr. 2) entspricht, und unter der Voraussetzung, dass sie so beschaffen ist wie in den beiliegenden Ansprüchen definiert. Außerdem sind auch Nucleotidsequenzmutanten im Schutzumfang von DNA der vorliegenden Erfindung enthalten, die keine Aminosäuresequenzänderungen im Protein bewirken (Degenerationsmutanten).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bestimmen können, ob eine DNA für ein Protein kodierte, das die Bildung von Läsionen bei Pflanzen unterdrückt, indem die betreffende DNA in einen geeigneten Vektor eingeführt wurde, ein Spl7-mutierter Stamm damit transformiert wurde und beobachtet wurde, ob die Bildung von Läsio nen auf dem mutierten Stamm unterdrückt wurde oder nicht (in Beispiel 6 beschrieben). Andererseits kann mithilfe der folgenden Schritte bestimmt werden, ob DNA für ein Protein kodiert, das über eine die Widerstandsfähigkeit gegen Wärmebelastung von Pflanzen erhöhende Funktion verfügt, oder nicht: Einführung der betreffenden DNA in einen geeigneten Vektor, Transformation des Wildtypstamms mit dem Vektor, Beobachtung des Wachstums des Stammes sowohl unter Bedingungen hoher Temperaturen (etwa 40°C) als auch unter Bedingungen niedriger Temperaturen (etwa 25°C); und dann Vergleich des Rückgangs der Wachstumsrate des transformierten Wildtypstamms unter hohen Temperaturen mit dem des Wildtypstamms. Es wird davon ausgegangen, dass die betreffende DNA eine Funktion aufweist, Pflanzen Widerstandsfähigkeit gegenüber Wärmebelastung zu verleihen, wenn der Rückgang der Wachstumsrate unter den Bedingungen hoher Temperaturen geringer ist als jener beim Wildtypstamm.
DNA, die für ein Protein kodiert, das funktionell dem Spl7-Protein entspricht, das in Seq.-ID Nr. 2 beschrieben ist, kann beispielsweise nach fachbekannten Verfahren erzeugt werden. Die Verfahren umfassen: Verfahren unter Einsatz von Hybridisierungstechniken (E. M. Southern, Journal of Molecular Biology 98, 503 (1975)) und Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Verfahren (R. K. Saiki et al.; Science 230, 1350–1354 (1985); R.K. Saiki et al., Science 239, 487–491 (1988)). Es ist für den Fachmann ein Routinevorgang, DNA mit hoher Homologie zum Spl7-Gen aus Reis und anderen Pflanzen unter Verwendung der Nucleotidsequenz des Spl7-Gens (Seq.-ID Nr. 1) oder Teilen davon als Sonde und von Oligonucleotiden, die spezifisch an eine Nucleotidsequenz des Spl7-Gens hybridisieren, als Primer zu isolieren. Derartige DNA, die für Proteine kodiert, die funktionell mit dem Spl7-Protein äquivalent sind, und die durch Hybridisierungs- oder PCR-Verfahren erhalten werden kann, wie in den Ansprüchen definiert, liegt im Schutzumfang von DNA dieser Erfindung.
Hybridisierungsreaktionen zur Isolierung von DNA werden bevorzugt unter stringenten Bedingungen ausgeführt. Stringente Hybridisierungsbedingungen gemäß vorliegender Erfindung umfassen Bedingungen wie: 6 M Harnstoff, 0,4 % SDS; und 0,5 × SSC. Es wird DNA mit höherer Homologie erwartet, wenn die Hybridisierung unter Bedingungen höherer Stringenz durchgeführt wird, wie z.B. 6 M Harnstoff, 0,4 % SDS und 0,1 × SSC. Es wird erwartet, dass die DNA, die unter solchen Bedingungen isoliert wird, für ein Protein kodiert, das einen hohen Grad an Aminosäurehomologie mit dem Spl7-Protein (Seq.-ID Nr. 2) aufweist. Wie hierin verwendet steht der Ausdruck "hohe Homologie" der gesamten Aminosäuresequenz für eine Identität von zumindest 50 % oder mehr, vorzugsweise 70 % oder mehr und noch bevorzugter 90 % oder mehr (z.B. 95 % oder mehr). Der Grad an Sequenzhomologie kann mittels der Programme BLASTn (auf Nucleotidebene) und BLASTx (auf Aminosäureebene) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990)) bestimmt werden. Diese Programme basieren auf dem BLAST-Algorithmus von Karlin und Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264–2268 (1990) und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873–5877 (1993)). Zur Analyse von Nucleotidsequenzen nach BLASTN, werden die Parameter beispielsweise auf Score = 100 und Wortlänge = 12 eingestellt. Andererseits werden die Parameter, die für die Analyse von Aminosäuresequenzen mittels BLASTX verwendet werden, auf Score = 50 und Wortlänge = 3 eingestellt. Es werden Standardparameter jedes Programms verwendet, wenn das BLAST- und das Gapped-BLAST-Programm verwendet werden. Spezifische Vorgangsweisen für eine solche Analyse sind fachbekannt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
DNA der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise zur Produktion rekombinanter Proteine verwendet werden, um Pflanzentransformanten mit unterdrückter Läsionsbildung oder erhöhter Widerstandsfähigkeit gegen Wärme zu produzieren, usw.
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein rekombinantes Protein allgemein durch Einführen von DNA, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor, durch Einführen des Vektors in eine geeignete Zelle, durch Kultivieren der transformierten Zellen, durch die Ermöglichung, dass Zellen das rekombinante Protein exprimieren, und durch Reinigung des exprimierten Proteins hergestellt. Ein rekombinantes Protein kann als Fusionsprotein mit anderen Proteinen exprimiert werden, um einfacher gereinigt werden zu können, z.B. als Fusionsprotein mit Maltosebindungsprotein in Escherichia coli (New England Biolabs, USA, Vektoren der pMAL-Reihe), als Fusionsprotein mit Glutathion-S-transferase (GST) (Amersham Pharmacia Biotech, Vektoren der pGEX-Reihe) oder markiert mit Histidin (Novagen, pET-Reihe). Die Wirtszelle ist nicht auf einen bestimmten Typ beschränkt, solange die Zelle zur Expression des rekombinanten Proteins geeignet ist. Es ist möglich, Hefe-, verschiedene Tier-, Pflanzen- oder Insektenzellen neben den oben beschriebenen E. coli-Zellen zu verwenden. Ein Vektor kann über eine Vielzahl fachbekannter Verfahren in eine Wirtszelle eingeführt werden. Beispielsweise kann ein Transformationsverfahren unter Verwendung von Kalziumionen (M. Mandel und A. Higa, Journal of Molecular Biology 53, 158–162 (1970); D. Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557–580 (1983)) verwendet werden, um einen Vektor in E. coli einzuführen. Ein rekombinantes Protein, das in Wirtszellen exprimiert wird, kann aus den Wirtszellen oder deren Kulturüberstand mithilfe von Standardverfahren gereinigt und gewonnen werden. Wenn ein rekombinantes Protein als Fusionsprotein mit Maltosebindungsprotein oder anderen Partnern exprimiert wird, kann das rekombinante Protein einfach mittels Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Das resultierende Protein kann verwendet werden, um einen Antikörper herzustellen, der sich an das Protein bindet. Zum Beispiel kann ein polyklonaler Antikörper mittels Immunisierung von Tieren (wie z.B. Kaninchen) mit einem gereinigten Protein der vorliegenden Erfindung oder einem Teil davon, gefolgt von der Abnahme von Blut des Tieres nach einem bestimmten Zeitraum und Entfernung der Blutgerinnsel hergestellt werden. Ein monoklonaler Antikörper kann durch Fusionieren von Myelomzellen mit antikörperbildenden Zellen von Tieren, die mit dem obigen Protein oder einem Teil davon immunisiert wurden, Isolieren einer monoklonalen Zelle, die einen gewünschten Antikörper exprimiert (Hybridom), und Gewinnung des Antikörpers aus der Zelle hergestellt werden. Der Antikörper, der mithilfe dieses Verfahrens hergestellt wird, kann verwendet werden, um ein Protein der vorliegenden Erfindung zu reinigen oder zu detektieren. Dementsprechend umfasst ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung Antikörper, die sich spezifisch an Proteine der Erfindung binden.
Eine Pflanzentransformante mit unterdrückter Bildung von Läsionen oder verstärkter Widerstandsfähigkeit gegen Wärme kann unter Einsatz von DNA der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Speziell wird DNA, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, in einen geeigneten Vektor eingeführt, der Vektor in eine Pflanzenzelle eingeführt und die resultierende transformierte Pflanzenzelle regeneriert.
Vektoren, die zur Transformation der Pflanzenzelle verwendet werden, sind nicht auf einen bestimmten Typ beschränkt, solange der Vektor insertierte Gene in Pflanzenzellen exprimiert. Beispielsweise können Vektoren verwendet werden, die Promotoren für konstitutive Genexpression in Pflanzenzellen (z.B. Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotor) und Promotoren, die durch exogene Reize induzierbar sind, umfassen. Der hierin verwendete Begriff "Pflanzenzelle" umfasst verschiedene Formen von Pflanzenzellen, wie z.B. kultivierte Zellsuspensionen, Protoplasten, Blattschnitte und Kallus.
Ein Vektor kann mittels bekannter Verfahren, wie z.B. das Polyethylenglykol-Verfahren, Elektroporation, agrobacteriumvermittelten Transfer und Teilchenbeschuss, in Pflanzenzellen eingeführt werden. Pflanzen können aus transformierten Pflanzenzellen mittels fachbekannter Verfahren, abhängig vom Typ der Pflanzenzelle, regeneriert werden (Toki et al., Plant Physiol. 100, 1503–1507 (1995)). Einige der Transformations- und Regenerationsverfahren für Reispflanzen umfassen: (1) Einführung von Genen in Protoplasten unter Einsatz von Polyethylenglykol und Regenerierung der Pflanze (geeignet für Indica-Reissorten) (S. K. Datta, in "Gene Transfer to Plants", I. Potrykus und Spangenberg (Hrsg.), 66–74 (1995)); (2) Einführen von Genen in Protoplasten unter Einsatz von elektrischen Impulsen und Regenerierung der Pflanze (für Japonica-Reissorten geeignet) (Toki et al.; Plant Physiol. 100, 1503–1507 (1992)), (3) direktes Einführen von Genen in Zellen mittels Teilchenbeschuss und Regenerierung der Pflanze (Christou et al. Bio/Technology 9, 957–962 (1991)); (4) Einführen von Genen unter Einsatz von Agrobacterium und Regenerierung der Pflanze (Hiei et al., Plant J. 6, 271–282 (1994)). Diese Verfahren sind gut etablierte, fachbekannte Verfahren und werden auf dem Fachgebiet der vorliegenden Erfindung umfassend eingesetzt. Diese Verfahren können in der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise angewandt werden.
Sobald eine transformierte Pflanze erhalten wurde, welche die DNA der vorliegenden Erfindung in das Genom eingeführt enthält, ist es möglich, durch sexuelle oder vegetative Fortpflanzung Nachkommen dieser Pflanze zu erhalten. Alternativ dazu können Pflanzen aus Zuchtmaterialien (z.B. Samen, Früchte, Ähren, Knollen, Knöllchen, Tubs, Kallus, Protoplasten etc.), die aus der Pflanze erhalten werden, sowie durch Nachkommen oder Klone davon massenproduziert werden. Pflanzenzellen, die mit DNA der vorliegenden Erfindung transformiert wurden, Pflanzen, die diese Zellen umfassen, Nachkommen und Klone dieser Pflanzen, sowie Zuchtmaterial, das von der Pflanze erhalten wurde, ihre Nachkommen und Klone sind allesamt im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
Pflanzen, die wie zuvor beschrieben erzeugt wurden, weisen erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen Wärmebelastung und unterdrückte Bildung von Läsionen im Vergleich zu Wildtyppflanzen auf. Unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann die Produktivität wertvoller Feldfrüchte wie Reis erhöht werden, was von großem Vorteil ist.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Fotos eines Blatts der Spl7-Mutante KL210 (linkes Feld) und eines Blatts von Nipponbare (rechtes Feld).
2 zeigt eine feinabgestufte Kopplungskarte des Spl7-Genregion und einer Abgleichskarte von genomischen Klonen. A und B stehen für Genkarten, die aus einer Segregationspopulation aus 298 Individuen bzw. 2944 Individuen erstellt wurde. C und D stehen für Abgleichskarten, die aus YAC- bzw. PAC-Klonen von Nipponbare erstellt wurden.
3 zeigt eine feinabgestufte Genkarte der Spl7-Genregion und eine Karte, welche die Kandidaten-Genomregion und das prognostizierte Gen darauf zeigt.
4 zeigt die Struktur des Kandidaten-Spl7-Gens und vergleicht die genomische Nucleotidsequenz von Nipponbare mit der von KL210.
5 sind Fotos eines Blatts der Spl7-Mutante KL210 (linkes Bild) und eines Blatts der Transformante (4 Bilder rechts davon).
6 stellt die Beziehung zwischen den für die Bildung einer Läsion auf Spl7-Mutanten erforderlichen Tagen und der mittleren Temperatur unter natürlichen Wachstumsbedingungen dar.
7 sind Fotos eines Blatts der Spl7-Mutante KL210, die unter Abblocken ultravioletter Strahlen gezüchtet wurde (linkes Bild), und eines Blatts, das ohne Blockieren ultravioletter Strahlen gezüchtet wurde (rechtes Bild).
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Verweis auf Beispiele spezifisch veranschaulicht, ist aber nicht als darauf beschränkt zu verstehen.
[Beispiel 1]
Herstellung einer Genkarte
Eine feinabgestufte Kopplungsanalyse einer Spl7-Region, die für Positionsklonierung essentiell ist, wurde unter Einsatz einer Segregationspopulation in großem Maßstab durchgeführt. 298 Individuen der F2-Population, die durch Kreuzung des Spl7-mutierten Stamms mit SL18 erhalten wurde, wurden als Population für die Kopplungsanalyse verwendet. SL18 hat einen genetischen Hintergrund von Nipponbare, und sein Chromosom 5 wurde durch das von Kasalath ersetzt. Gemäß der Kopplungsanalyse, die RFLP-Marker verwendet, wurde festgestellt, dass der Spl7-Locus zwischen den RFLP-Markern S869 und R2781 liegt und mit C11368, S2581, S1762, S1831 und B344 gemeinsam segregiert wird (2A).
Weiters wurden 2646 Individuen der F2-Population zur Kopplungsanalyse verwendet, um eine feinabgestufte genetische Karte der Spl7-Region zu erzeugen. CAPS-("cleaved amplified polymorphic sequence", gespaltene amplifizierte Polymorph-Sequenz-)Marker wurden für wirksame Analyseprozesse verwendet. Genauer gesagt wurden Pflanzen mit Chromosomenrekombinationen in Nachbarschaft zu Spl7 in der F2-Population unter Einsatz der CAPS-Marker 3869 und R2781 gescreent, wobei jeder Marker zu Spl7 benachbart ist. Dementsprechend konnten 65 Rekombinanten selektiert werden (2B). Unter Verwendung dieser Rekombinanten wurde eine feinabgestufte Kopplungskarte mit RFLP-Markern erzeugt, die wie nachstehend beschrieben hergestellt wurden.
[Beispiel 2]
Abgleich der Spl7-Genregion unter Einsatz von künstlichen Hefechromosom-(YAC-)Klonen und von P1 stammenden künstlichen Chromosom-(PAC-)Klonen YAC-Klone, welche die Nucleotidsequenz der DNA-Marker S869, C11368, 82581 und R2781 umfassten, die an den Spl7-Locus angrenzten, wurden unter Einsatz der Abgleichskarte von Nipponbare-YAC-Klonen im Rice Genome Research Program (2C) hergestellt. Zusätzlich wurden Endfragmente der angegebenen YAC-Kone, Y4666, Y2205, Y3824c, Y6089 und Y2288 mithilfe des Kassettenverfahrens zum Abgleich der angegebenen YAC-Klone isoliert. Die Ergebnisse zeigten, dass die YAC-Klone Y4666, Y2205 und Y3824c die Spl7-Genregion umfassten (2C).
Weiters wurde zur Eingrenzung der Kandidatenregion für das Spl7-Gen der STS-Primersatz (die Primer 5'-GACCTGTGCTCTGCCTTTCT-3'/Seq.-ID Nr. 3 und 5'-GTATGCCAACTGCTCAACTT-3'/Seq.-ID Nr. 4; amplifiziertes genomisches Fragment mit 0,4 kb), der aus dem RFLP-Marker C11368 erzeugt wurde, der an derselben Position wie der Spl7-Locus lag, zum Screening der Nipponbare-PAC-Klon-Bibliothek (mittlere Insertlänge 112 kb; 18.432 Klone; etwa das 4,5fache des Reisgenoms) eingesetzt, die im Zuge des Rice Genome Research Program hergestellt wurde (Baba et al., Bull. Natl. Inst. Agrobiol. Resour. 14, 24–36 (2000)). Als Folge wurden 9 PAC-Klone selektiert. Durch Abgleich dieser PAC-Klone wurde gezeigt, dass 8 PAC-Klone, die durch P0029H1 dargestellt sind, den Spl7-Locus enthielten (2D).
[Beispiel 3]
Eingrenzung der Spl7-Genregion
Die Endfragmente von YAC- und PAC-Klonen, die durch Abgleich als innerhalb der Spl7-Region liegend ermittelt wurden, wurden kloniert und als neue RFLP- oder CAPS-Marker zur Herstellung einer feinabgestuften genetischen Karte verwendet. Das Ergebnis zeigte, dass der Spl7-Locus in einer Genomregion zwischen den RFLP-Markern P461H4T und P693G10S liegt und gemeinsam mit RFLP-Marker C11368B segregiert wird. Dementsprechend wurde gezeigt, dass der Spl7-Locus in einer Genomregion von etwa 16 kb zwischen den zwei Markern liegt (2).
[Beispiel 4]
Identifizierung der Kandidaten-Genomregion durch Nucleotidsequenzanalyse
Die Kandidaten-Genomregion von 16 kb im PAC-Klon P0029H1, von der erwartet wird, dass sie das Spl7-Gen enthält, wurde Nucleotidsequenzanalyse unterzogen. Die Nucleotidsequenz wurde durch Subklonierung der Kandidatenregion erst mit den Restriktionsenzymen Not I und Sal I und dann mit verschiedenen anderen Restriktionsenzymen, gefolgt vom Farbstoff-Primer-Verfahren analysiert. CAPS-Marker wurden unter Nutzung der durch Kopplungsanalyse bestimmten Nucleotidsequenzinformation der Kandidatenregion neu erstellt, um die Kandidatenregion weiter einzugrenzen. Das Spl7-Gen segregierte gemeinsam mit dem CPAS-Marker HsfC2-1 (Primer 5'-TCTCTCTCGTTCGTTCCCCG-3'/Seq.-ID Nr. 5 und 5'-TGGATAAATGGAGATGGGCA-3'/Seq. ID. Nr. 6; Restriktionenzym Apa I), und bei S12C6-6d (Primer 5'-TCGGCATCGGCTATTATCGG-3'/Seq.-ID Nr. 7 und 5'-GATTTCGGGATACTGTGCGT/Seq.-ID Nr. 8; Restriktionsenzym N1a III) und HsfC3-3' (Primer 5'-ACGATGTGTTTTGGGAGCGG-3'/Seq.-ID Nr. 9 und 5'-GACCTGTGCTCTGCCTTTCT-3/Seq.-ID Nr. 10; Restriktionsenzym N1a III) wurden 3 bzw. 7 Rekombinanten identifiziert.
Somit wurde gezeigt, dass das Spl7-Gen in einer Genomregion von etwa 3 kb zwischen den CAPS-Markern S12C6-6d und HsfC3-3' (3) lag. Weiters wurde die Genprognose- und Ähnlichkeitssuche bezüglich Nucleotidsequenz der Kandidaten-Genomregion durchgeführt, wobei nur ein Gen prognostiziert wurde, das eine ähnliche Nucleotidsequenz wie das Hsf-Gen aufweist, das aus Pflanzen wie Tomate und Arabidopsis isoliert wurde (3). Es zeigt sich, dass das Hsf-Gen als transkriptionsregulierender Faktor eines durch Hitzeschock induzierten Proteins wirkt.
[Beispiel 5]
Nucleotidsequenzanalyse des Spl7-Kandidatengens
Unter Einsatz des Hsf-ähnlichen Gens als Kandidat für das Spl7-Gen wurde die Nucleotidsequenz der entsprechenden Region im mutierten Stamm KL210 bestimmt. Speziell wurde die Nucleotidsequenzanalyse durch Klonierung von Produkten von genomischer PCR und RT-PCR unter Einsatz von Primern durchgeführt, die dazu geschaffen worden waren, die entsprechenden Nucleotide basierend auf den bereits erhaltenen Nucleotidsequenzinformationen von Nipponbare zu amplifizieren. Eine Substitution eines Nucleotids konnte durch Vergleich der Nucleotidsequenz des Wildtyps mit jener der mutierten Gene detektiert werden. Wie prognostiziert wurde, führt die Nucleotidsubstition zu einer Substitution von Tryptophan zu Cystein (4). Die substituierte Aminosäure ist ein Teil jener Aminosäuren, die im Hsf-Gen stark konserviert sind. Daher scheint die Aminosäuresubstitution der Grund für den Verlust der Spl7-Proteinfunktion in mutierten Stämmen zu sein.
[Beispiel 6]
Verifizierung der Kandidatengenfunktion durch Transformation
Das 5,6-kb-NspV-BglIII-Fragment der Nipponbare-Genomregion, das die prognostizierte 5'-Stromauf-Promotorregion umfasst, die als Kandidat für das Spl7-Gen spezifiziert wurde, wurde in Vektor pPZP2H-lac insertiert, sodass es zur Transformation mittels Agrobacterium verwendet werden konnte. Die Transformation wurde gemäß dem Verfahren von Toki (Plant Mol. Biol. Rep. 15, 16–21 (1997)) entweder unter Ein satz des Vektors Nr. 178, der zusammen mit dem Fragment eingeführt wird, oder des Vektors alleine durchgeführt. Der Spl7-mutierte Stamm KL210 wurde als Stamm für die Transformation verwendet. 150 bzw. 50 hygromycinresistente Individuen wurden durch einen Transformationsversuch unter Einsatz des 5,6-kb-NspV-BglII-Fragments und des Vektors alleine erhalten. Die Integration des Kandidatengens wurde durch ein PCR-Verfahren unter Einsatz kandidatengenspezifischer Primer (Sense-Strang 5'-GTCTCCGTGGCCGTGGCTGA-3'/Seq.-ID Nr 11 und Antisense-Strang 5'-AACGAGGAATCTTAGAAGGG-3'/Seq.-ID Nr. 12) bestätigt.
Das Ergebnis zeigt, dass alle 150 Transformanten das Kandidatengen enthielten. Die Transformanten wurden in einem isolierten Gewächshaus unter Bedingungen einer natürlichen Tageslänge (im März aus einer Wachstumskammer in ein isoliertes Treibhaus (Tsukuba) transferiert) gezüchtet, um die Bildung von Läsionen zu untersuchen. Als Ergebnis bildeten die Pflanzen, die mit dem Vektor alleine transformiert waren, im späten Stadium des Wachstums ähnlich wie der mutierte Stamm KL210 Läsionen, während keine Bildung von Läsionen auf irgendeiner Pflanze zu beobachten war, in die das Kandidatengen eingeführt worden war (5). Weiters wurden von den 24 selbstbestäubten Nachkommen, von denen erwartet wurde, dass sie nur mit einer Kopie des Transgens transformiert waren, bei 6 Pflanzen Läsionen gebildet und bei 18 Pflanzen nicht. Das resultierende Segregationsverhältnis stimmte mit dem erwarteten Verhältnis von 1:3 überein. Diese Ergebnisse zeigen, dass es die Funktion der Kandidaten-Genregion (NSpV-BglII mit 5,6 kb) ist, die Bildung von Läsionen auf dem mutierten Stamm KL210 zu unterdrücken, und auch, dass das Kandidatengen das Spl7-Gen ist.
[Beispiel 7]
Für Läsionsbildung erforderliche Bedingungen
Die Anzahl der Tage, die für die Bildung von Läsionen beim Spl7-mutierten Stamm KL210 notwendig sind, wurden durch Säen von KL210 und Nipponbare, die über das Wildtypgen verfügten, in einem Intervall von 14 Tagen, beginnend am 17. Mai 1999 untersucht. Die Anzahl der Tage, die für die Bildung von Läsionen erforderlich war, nahm bei Pflanzen, die bis zum 23. August ausgesät wurden, ab und stieg bei jenen, die am 6. September ausgesät wurden, an (6). Andererseits stieg die mittlere Temperatur von der Aussaat bis zur Bildung von Läsionen bis zum 9. August an und ging danach wieder zurück (6). Die kürzeste Zeit bis zur Bildung von Läsionen betrug 11 Tage für jene Pflanzen, die am 23. August ausgesät wurden, als die mittlere Temperatur zurückgegangen war. Allerdings wurde die höchste Temperatur von 36°C 1999 kurz vor der Bildung von Läsionen verzeichnet. Mehr Tage (mehr als 60 Tage nach der Aussat) sind für die Bildung von Läsionen auf Pflanzen erforderlich, die in Wachstumskammern im Winter gezüchtet werden. Weiters wurde im Winter auch der Grad der Läsionsbildung unterdrückt. Als Pflanzen in einer Wachstumskammer wuchsen, in der die Temperatur 26°C oder weniger betrug, zeigten sich während keiner Wachstumsperiode Läsionen, während in einer Wachstumskammer, in der die Temperatur 37°C betrug, nach einem Monat Läsionen auftraten. Aus diesen Ergebnissen wurde der Schluss gezogen, dass hohe Temperaturen zu einem gewissen Grad für die Bildung von Läsionen essentiell sind, und außerdem, dass hohe Temperaturen die Bildung von Läsionen verstärken.
Als Nächstes wurden KL210 und Nipponbare gezüchtet, indem sie mit Folien, die ultraviolette Strahlung abhielten, oder mit Plastikfolien, die UV-Strahlen nicht abhielten, abgedeckt wurden. Egal, mit welcher Folie KL210 abgedeckt wurde, war am 25. Tag nach Aussaat eine Bildung von Läsionen beobachtet. Allerdings war der Grad der Bildung von Läsionen auf Pflanzen, die vor UV-Strahlung geschützt waren, im Vergleich zu jenen unterdrückt, bei denen UV-Strahlen durchgelassen wurden (7). Diese Ergebnisse zeigen, dass UV-Strahlung eine der Bedingungen ist, die für eine verstärkte Bildung von Läsionen erforderlich sind.
In Anlehnung an die oben erhaltenen Ergebnisse wurde der Schluss gezogen, dass das Hsf-ähnliche Gen der Spl7-Genkandidat ist. Dann wurde mittels Positionsklonierungsverfahren festgestellt, dass es das Spl7-Gen ist, das die Bildung von Läsionen bei Reis unterdrückt. Somit wurde die biologische Funktion von Hsf-ähnlichen Genen in Pflanzen zum ersten Mal in der vorliegenden Erfindung bewiesen.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Tropische Pflanzen, z.B. Reis, sind im Vergleich zu Gerste bis zu einem gewissen Grad an hohe Temperaturen angepasst und erwerben daher Widerstandsfähigkeit gegen Wärmebelastung. Allerdings steigt die Wachstumstemperatur von Pflanzen aufgrund der globalen Erwärmung an. Unter solchen Bedingungen waren zur Stabilisierung der zukünftigen Produktion von Feldfrüchten Verfahren erwünscht, die dazu dienen, Pflanzen wirksam Widerstandsfähigkeit gegenüber Wärmebelastung zu verleihen. Viele Punkte im Mechanismus der Widerstandsfähigkeit gegenüber Wärmebelastung bleiben ungeklärt, und es war kein wirksames Verfahren zur positiven Verstärkung der Widerstandsfähigkeit durch Modifikationen bekannt. Indem Pflanzen wirksam Widerstandsfähigkeit gegenüber Wärmebelastung verliehen wird, wird nicht nur die stabile Nahrungsmittelproduktion in heutigem Ausmaß trotz der globalen Erwärmung beibehalten, sondern es wird die Kultivierung von Feldfrüchten in Regionen möglich, wo es bisher nicht möglich war, Pflanzen zu züchten. Das Spl7-Gen der vorliegenden Erfindung verstärkt die Widerstandsfähigkeit gegenüber Wärmebelastung bei Pflanzen und hat eine Funktion, die Bildung von Läsionen auf Pflanzen zu unterdrücken. Daher trägt das Spl7-Gen der vorliegenden Erfindung stark zu den oben genannten Zielen bei. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA, die für ein von Pflanzen stammendes Protein kodiert, das die Bildung von Läsionen bei Pflanzen unterdrückt, wobei die DNA aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) DNA, die für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst; (b) DNA, welche die kodierende Region der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 umfasst; (c) DNA, die für ein Protein kodiert, das zumindest 50 % Identität mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst; und (d) DNA, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit DNA zu hybridisieren, die aus der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 besteht.
DNA, die für ein von Pflanzen stammendes Protein kodiert, das die Widerstandsfähigkeit von Pflanzen gegen Wärmebelastung erhöht, worin die DNA aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) DNA, die für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst; (b) DNA, welche die kodierende Region der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 umfasst; (c) DNA, die für ein Protein kodiert, das zumindest 50 % Identität mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst; und (d) DNA, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit DNA zu hybridisieren, die aus der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 besteht.
DNA nach Anspruch 1 oder 2, worin die DNA für ein Protein kodiert, das zumindest 70 % Identität mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
DNA nach Anspruch 1 oder 2, worin die DNA für ein Protein kodiert, das zumindest 90 % Identität mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
DNA nach Anspruch 1 oder 2, worin die DNA für ein Protein kodiert, das zumindest 95 % Identität mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die DNA von Pflanzen stammt, die der Familie der Gramineae angehören.
Vektor, der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
Transformierte Zelle, in die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Vektor nach Anspruch 7 eingeführt worden ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 8, worin die transformierte Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Protein, für das DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 10, worin das Verfahren Folgendes umfasst: das Kultivieren einer transformierten Zelle nach Anspruch 8; und das Gewinnen eines exprimierten Proteins aus der kultivierten transformierten Zelle oder aus deren Kulturüberstand.
Pflanzentransformante, die eine transformierte Zelle nach Anspruch 9 umfasst.
Pflanzentransformante, die ein Nachkomme oder ein Klon einer Pflanzentransformante nach Anspruch 12 ist.
Transformiertes Zuchtmaterial für eine Pflanzentransformante nach Anspruch 12 oder 13.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanzentransformante nach Anspruch 12, worin das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Einführen von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in eine Pflanzenzelle; und (b) das Regenerieren einer Pflanze aus der Pflanzenzelle.
Verfahren zur Unterdrückung der Bildung von Läsionen bei Pflanzen, wobei das Verfahren den Schritt des Exprimierens von DNA nach Anspruch 1 in Zellen des Pflanzenkörpers umfasst.
Verfahren zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit von Pflanzen gegen Wärmebelastung, worin das Verfahren den Schritt des Exprimierens von DNA nach Anspruch 2 in Zellen der Pflanzen umfasst.
Antikörper, der spezifisch an ein Protein nach Anspruch 10 bindet.