DE60123080T2

DE60123080T2 - Nukleinsaeuren, die für lbvv (lettuce big-vein virus) proteine kodieren und deren verwendung

Info

Publication number: DE60123080T2
Application number: DE60123080T
Authority: DE
Inventors: Takahide Zentsuji-shi SASAYA; Hiroki Fukuyama-shi KOGANEZAWA
Original assignee: Inc ADMINISTRATIVE AGENCY; National Agriculture and Bio Oriented Research Organization NARO; National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: Inc Administrative Agency National A Jp
Priority date: 2000-05-22
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: EP1312677B1; EP1312677A4; JPWO2001090362A1; US7279335B2; US20070264690A1; ES2272474T3; WO2001090362A1; US20040014032A1; DE60123080D1; EP1312677A1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Nucleinsäuren, die Proteine des Breitadernvirus des Salats codieren, auf Proteine, die von den Nucleinsäuren codiert werden, und auf ihre Herstellung und Verwendung.
Technischer Hintergrund
Das Breitadernvirus des Salats (LBVV; lettuce big-vein virus) ist ein Virus, das zu den Varicosaviren gehört, besteht aus zwei RNAs (7,0 kb und 6,5 kb RNA) und behält ein Hüllprotein von 48 kDa zurück. LBVV ist ein Bodenvirus, das durch Olpidum brassicae im Boden verbreitet wird, und in den USA, Australien, Neuseeland, Japan und Europa vorkommt. Da dieses Virus Salatpflanzen infiziert und deren Qualität und Ausbeute merklich reduziert, ist es ein ernstes Problem bei der Salatherstellung.
Leider wurde bisher noch nicht die Existenz eines Gens beschrieben, das Salatpflanzen resistent gegen dieses Virus macht. Zwar sind mehrere Kultursorten, wie Entrée, Sea Green und Pacific, als LBVV-resistente Kultursorten kommerziell erhältlich, doch ist ihre Resistenz gering. Es wurde also noch keine grundlegende Lösung für die durch LBVV verursachten Krankheitsschäden gefunden.
Die Aufklärung der genetischen Information des Virus ist ein wichtiger Schritt zur Verhinderung von durch das Virus verursachten Krankheitsschäden. Die Isolierung und Reinigung von LBVV sind aber aus Gründen wie der Instabilität der Viruspartikel, den Neigung der Viruspartikel, leicht miteinander zu aggregieren, und der äußerst niedrigen Konzentration des Virus in Pflanzen äußerst schwierig. Obwohl bisher zwei erfolgreiche Beispiele für die Reinigung des Virus beschrieben wurden (S. Kuwata et al. (1983), Annals of the Phytopathological Society of Japan, 49, 246–251; und H.J. Vetten et al. (1987), Journal of Phytopathology, 120, 53–59), ist die Reproduzierbarkeit gering, und die gereinigten Mengen sind äußerst niedrig. Folglich wurde in Bezug auf LBVV noch überhaupt keine genetische Information aufgeklärt.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde in Anbetracht der obigen Umstände erreicht, und Ziele der vorliegenden Erfindung bestehen darin, Proteine des Breitadernvirus des Salats (LBVV; lettuce big-vein virus) und Nucleinsäuren, die die Proteine codieren, zu isolieren und ihre Struktur aufzuklären. Außerdem besteht ein weiteres Ziel der Erfindung darin, Salatpflanzen durch Expression der Nucleinsäure oder ihrer Antisense-Nucleinsäure in Salat eine Resistenz gegen LBVV zu verleihen. Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht überdies darin, ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Infektion durch LBVV anzugeben, indem man die Nucleinsäure oder ein durch die Nucleinsäure codiertes Protein nachweist.
LBVV ist ein RNA-Virus, und wenn eine DNA, die ein Protein des Virus codiert, oder deren Antisense-DNA in einer Pflanze exprimiert wird, können die Produktion und Funktion von LBVV-Proteinen wahrscheinlich auf dem Transcriptionsniveau oder Translationsniveau gehemmt werden (P.F. Tennant et al. (1994), Phytopathology, 84, 1359–1366; C.C. Huntley & T.C. Hall (1993), Virology, 192, 290–297; D.C. Baulcombe (1996), The Plant Cell, 8, 1833–1844).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung konzentrierten sich auf diese Idee und isolierten die Gene, die LBVV-Proteine codieren, um gegen LBVV resistenten Salat zu produzieren.
Insbesondere erhielten die Erfinder zuerst hochgereinigtes LBVV und unterzogen dieses dann einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, um das Hüllprotein nachzuweisen, aus dem das Virus besteht. Das nachgewiesene Hüllprotein wurde gereinigt und dann zu Peptiden zersetzt, und anschließend wurden die partiellen Aminosäuresequenzen der Peptide nach dem Edman-Verfahren bestimmt. Außerdem wurde eine RNA, die das Hüllprotein von LBVV codiert, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kloniert, wobei man Primer verwendete, die auf der Grundlage von Information aus den bestimmten Aminosäuresequenzen gestaltet wurden, und anschließend wurde die Nucleotidsequenz der RNA bestimmt.
Um das Gen zu bestimmen, das die volle Länge des Hüllproteins von LBVV codiert, wurden dann RNAs aus gereinigtem Virus und aus mit dem Virus infizierten Blättern, die offensichtliche Symptome der Infektion aufwiesen, hergestellt, und unter Verwendung dieser RNA-Moleküle wurden 3'RACE sowie 5'RACE durchgeführt. Als Ergebnis ist es den Erfindern nicht nur gelungen, das RNA-Molekül, das LBVV-Hüllprotein codiert, zu isolieren, sondern auch seine Primärstruktur zu bestimmen. Außerdem ist es den Erfindern mit dem Genom-Walking-Verfahren gelungen, RNA-Moleküle zu isolieren, die vier andere nichtstrukturelle Proteine von LBVV codieren, und ihre Primärstrukturen ebenfalls zu bestimmen.
Ähnlich ist es den Erfinder auch gelungen, ein RNA-Molekül, das ein Polymerase-Protein codiert, aus hochgereinigtem LBVV zu isolieren.
Das isolierte RNA-Molekül oder sein Antisense-Molekül kann durch seine Expression Salatpflanzen Resistenz gegen LBVV verleihen, und dadurch ist es möglich, die Salatproduktivität zu verbessern. Außerdem kann auch eine genetische Diagnose von LBVV durchgeführt werden, indem man auf der Grundlage von Sequenzinformationen der isolierten RNA-Moleküle einen LBVV-spezifischen Primer entwirft und verwendet. Weiterhin können auf der Grundlage der resultierenden Sequenzinformation Antiseren, die an LBVV-Proteine binden, produziert und für die serologische Diagnose von LBVV verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage der obigen Ergebnisse fertiggestellt und stellt LBVV-Proteine, Nucleinsäuren, die die Proteine codieren, und deren Herstellung und Verwendung bereit.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Folgendes bereit:

(1) eine isolierte Nucleinsäure, die ein Protein des Breitadernvirus des Salats codiert, wobei die Nucleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (a) einer Nucleinsäure, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und SEQ ID Nr. 13 umfasst; und (b) der Nucleinsäure von (a), die den codierenden Bereich der Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder 12 umfasst, besteht;
(2) die Nucleinsäure gemäß (1), wobei die Nucleinsäure eine RNA ist;
(3) die Nucleinsäure gemäß (1), wobei die Nucleinsäure eine DNA ist;
(4) eine DNA, die eine Sense-RNA codiert, die zu einem komplementären Strang der Nucleinsäure gemäß (2) komplementär ist;
(5) eine DNA, die eine Antisense-RNA codiert, die zu der Nucleinsäure gemäß (2) komplementär ist;
(6) eine DNA, die eine RNA mit Ribozymaktivität codiert, die spezifisch die Nucleinsäure gemäß (2) spaltet;
(7) einen Vektor, der die Nucleinsäure gemäß (3) umfasst;
(8) eine transformierte Zelle, die die Nucleinsäure gemäß (3) oder den Vektor gemäß (7) umfasst;
(9) ein Protein, das von der Nucleinsäure gemäß (1) codiert wird;
(10) einen Antikörper, der an das Protein gemäß (9) bindet;
(11) ein Verfahren zur Herstellung des Proteins gemäß (9), wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren der transformierten Zelle gemäß (8); und (b) Gewinnen eines exprimierten Proteins aus der transformierten Zelle oder deren Kulturüberstand;
(12) einen Vektor, der die DNA gemäß einem der Punkte (4) bis (6) umfasst;
(13) eine transformierte Salatzelle, die die Nucleinsäure gemäß (1), die DNA gemäß einem der Punkte (4) bis (6) oder den Vektor gemäß (7) oder (12) umfasst;
(14) eine transformierte Salatpflanze, die die transformierte Salatzelle gemäß (13) umfasst;
(15) eine transformierte Salatpflanze, die ein Nachkomme oder ein Klon der transformierten Salatpflanze gemäß (14) ist;
(16) ein Fortpflanzungsmaterial der transformierten Salatpflanze gemäß (14) oder (15), wobei das Fortpflanzungsmaterial die Nucleinsäure gemäß (1), die DNA gemäß einem der Punkte (4) bis (6) oder den Vektor gemäß (7) oder (12) umfasst; und
(17) ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Infektion, die durch das Breitadernvirus des Salats verursacht wird, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst:

Die vorliegende Erfindung stellt LBVV-Proteine und Nucleinsäuren, die die Proteine codieren, bereit. Die von der vorliegenden Erfindung umfasste Nucleotidsequenz von cDNA, die LBVV-Proteine codiert und von den Erfindern isoliert wurde, ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt, und die Aminosäuresequenzen der von der cDNA codierten Proteine sind in SEQ ID Nr. 2 bis 6 gezeigt. Die isolierte cDNA ist eine Sequenz von 6078 Nucleotiden und codiert fünf Proteine. Protein 1 (Hüllprotein: Beispiel 1) hat eine Translationsstartstelle an Nucleotid 209 und codiert 397 Aminosäuren (der isolierte Klon wurde "LBVV-cp" genannt/SEQ ID Nr. 2); Protein 2 (Beispiel 3) hat eine Translationsstartstelle an Nucleotid 1492 und codiert 333 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 3); Protein 3 (Beispiel 3) hat eine Translationsstartstelle an Nucleotid 2616 und codiert 290 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 4); Protein 4 (Beispiel 3) hat eine Translationsstartstelle an Nucleotid 3842 und codiert 164 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 5); und Protein 5 (Beispiel 3) hat eine Translationsstartstelle an Nucleotid 4529 und codiert 368 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 6).
Außerdem ist die ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasste Nucleotidsequenz von cDNA (Beispiel 4), die eine Polymerase von LBVV codiert und von den Erfindern isoliert wurde, in SEQ ID Nr. 12 gezeigt, und die Aminosäuresequenz des von der cDNA codierten Proteins ist in SEQ ID Nr. 13 gezeigt (der isolierte Klon wurde "LBVV-L" genannt). Die isolierte cDNA ist eine Sequenz von 6793 Nucleotiden, hat eine Translationsstartstelle an Nucleotid 337 und codiert 2040 Aminosäuren.
Außerdem haben die Erfinder aufgedeckt, dass LBVV ein Negativ-Strang-RNA-Virus ist, das mehr positive Stränge als gewöhnlich in seinen Viruspartikeln enthält.
Dies ist das erste Beispiel für einen Nachweis der Gene und Proteinprimärstrukturen von LBVV.
Zu den Nucleinsäuren, die LBVV-cp-Protein (LBVV-Protein 1), die LBVV-Proteine 2 bis 5 oder das LBVV-L-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codieren, gehören eine DNA und eine RNA. Die DNA umfasst eine cDNA und eine chemisch synthetisierte DNA, und die RNA umfasst eine virale genomische RNA, mRNA und synthetische RNA. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung kann vom Fachmann mit Hilfe von herkömmlichen Mitteln hergestellt werden. Insbesondere eine DNA des ersten Stranges kann synthetisiert werden, indem man eine reverse Transcriptionsreaktion durchführt und als Matrize Folgendes verwendet: (1) eine RNA, die durch Deproteinieren von gereinigtem Virus nach einem Verfahren wie dem SDS-Phenol-Verfahren hergestellt wird; oder (2) die Gesamtnucleinsäuren, die nach dem CTAB-Verfahren usw. aus einem virusinfizierten Blatt isoliert wurden, wobei an einen anhand der Sequenz einer Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung gestalteten Primer oder einen statistischen Primer verwendete. Aus der nach diesem Verfahren hergestellten DNA des ersten Stranges kann eine DNA des zweiten Stranges nach dem Verfahren von Gubler & Hoffman (U. Gubler und B.J. Hoffman (1983), Gene 25, 263–269) synthetisiert werden, und die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen kommerziell erhältlichen Plasmiden oder Phagemidvektoren kloniert werden. Alternativ dazu kann eine DNA, die eine RNA des Virus codiert, durch Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert werden, wobei man einen Primer verwendet, der anhand der Sequenz einer Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung gestaltet wurde, und die DNA des ersten Strangs als Matrize verwendet, und die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung kann durch TA-Klonierung unter Verwendung des pGEM^®-T-Vektors usw. oder durch Klonieren in verschiedenen kommerziell erhältlichen Plasmidvektoren kloniert werden, indem man eine Restriktionsenzymstelle zu dem Primer hinzufügt.
Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung kann auch für die Herstellung eines rekombinanten Proteins oder für die Herstellung von gegen LBVV resistentem Salat verwendet werden.
Ein rekombinantes Protein wird gewöhnlich hergestellt, indem man eine DNA, die ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor einfügt, den Vektor in eine geeignete Zelle einführt, die transformierten Zellen kultiviert, die Zellen das rekombinante Protein exprimieren lässt und das exprimierte Protein reinigt. Ein rekombinantes Protein kann auch als Fusionsprotein mit anderen Proteinen exprimiert werden, so dass es sich leicht reinigen lässt, zum Beispiel als Fusionsprotein mit maltosebindendem Protein in Escherichia coli (New England Biolabs, USA, Vektor-pMAL-Reihe), als Fusionsprotein mit Glutathion-5-Transferase (GST) (Amersham Pharmacia Biotech, Vektor-pGEX-Reihe) oder mit Histidin markiert (Novagen, pET-Reihe). Die Wirtszelle unterliegt keiner Einschränkung, solange die Zelle für die Expression des rekombinanten Proteins geeignet ist. Es ist möglich, neben der oben erwähnten E. coli Hefen oder verschiedene Tier-, Pflanzen- oder Insektenzellen zu verwenden, indem man den Expressionsvektor ändert. Ein Vektor kann nach einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Verfahren in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zum Beispiel kann ein Transformationsverfahren unter Verwendung von Calciumionen (Mandel, M. und Higa, A. (1970), Journal of Molecular Biology, 53, 158–162, Hanahan, D. (1983), Journal of Molecular Biology, 166, 557–580) verwendet werden, um einen Vektor in E. coli einzuführen. Ein in Wirtszellen exprimiertes rekombinantes Protein kann nach bekannten Verfahren aus den Wirtszellen oder ihrem Kulturüberstand isoliert und gereinigt werden. Wenn ein rekombinantes Protein als Fusionsprotein mit maltosebindendem Protein oder anderen Partnern exprimiert wird, kann das rekombinante Protein leicht durch Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Das resultierende Protein kann verwendet werden, um einen Antikörper herzustellen, der an das Protein bindet. Zum Beispiel kann ein polyklonaler Antikörper hergestellt werden, indem man Immuntiere, wie Kaninchen, mit einem gereinigten Protein der vorliegenden Erfindung oder einem Teil davon immunisiert, nach einer bestimmten Zeit Blut abnimmt und Gerinnsel entfernt. Ein monoklonaler Antikörper kann hergestellt werden, indem man Myelomzellen mit den antikörperbildenden Zellen von Tieren, die mit dem obigen Protein oder einem Teil davon immunisiert sind, fusioniert, eine monoklonale Zelle, die einen gewünschten Antikörper exprimiert (Hybridom), isoliert und den Antikörper aus der Zelle gewinnt. Der erhaltene Antikörper kann verwendet werden, um ein Protein der vorliegenden Erfindung zu reinigen oder nachzuweisen. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst Antiserum, polyklonalen Antikörper, monoklonalen Antikörper und ein Fragment davon.
Im Falle der Herstellung von LBVV-resistentem Salat sollte eine DNA, die die Produktion und Funktion von LBVV-Proteinen reprimiert, in Salatzellen eingeführt werden, und die resultierenden transformierten Salatzellen sollten regeneriert werden.
Eine DNA, die eine RNA codiert, welche mit einem der beiden Stränge (Sense-Strang oder komplementärer Strang) einer LBVV-Proteine codierenden RNA hybridisiert, kann als DNA verwendet werden, die die Produktion und Funktion der LBVV-Proteine reprimiert.
Beispiele für eine DNA, die eine RNA codiert, welche mit einem viralen genomischen Sense-Strang und mit mRNAs hybridisiert, sind eine DNA, die eine Antisense-RNA codiert, die zu dem Transcriptionsprodukt einer von den Erfindern isolierten DNA, die das in einem der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und SEQ ID Nr. 13 beschriebene Protein codiert (vorzugsweise einer DNA, die einen codierenden Bereich der in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 12 beschriebenen Nucleotidsequenz umfasst), komplementär ist. Hier bedeutet der Ausdruck "komplementär" auch "nicht vollständig komplementär", solange die Produktion von LBVV-Proteinen effektiv gehemmt werden kann. Die transcribierte RNA weist vorzugsweise 90% oder mehr Komplementarität und am meisten bevorzugt 95% oder mehr Komplementarität zu der RNA, die das Ziel-LBVV-Protein codiert, auf. Hier bezieht sich der Ausdruck "Komplementarität" auf den Prozentanteil der Zahl von Nucleotiden, die komplementäre Basenpaare bilden, bezogen auf die Gesamtzahl von Basenpaaren in einem Bereich, wo die beiden Sequenzen einander entsprechen, und zwar in dem Fall, dass die Sequenzen so aneinander ausgerichtet werden, dass die Zahl von komplementären Basenpaaren maximiert ist.
Die von den Erfindern isolierte DNA, die eine Sense-RNA codiert, die zu einem komplementären RNA-Strang, der das in einem der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und SEQ ID Nr. 13 beschriebene Protein codiert (vorzugsweise einer RNA, die einen codierenden Bereich der in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 12 beschriebenen Nucleotidsequenz umfasst), komplementär ist, kann als DNA verwendet werden, die eine RNA codiert, die mit einem komplementären Strang viraler genomischer RNA hybridisiert. Hier bedeutet der Ausdruck "komplementär" auch "nicht vollständig komplementär", solange die Produktion von LBVV-Proteinen effektiv gehemmt werden kann. Die transcribierte Sense-RNA weist vorzugsweise 90% oder mehr Komplementarität und am meisten bevorzugt 95% oder mehr Komplementarität zu der RNA (komplementärer Strang), die das Ziel-LBVV-Protein codiert, auf.
Um die Expression des Zielgens effektiv zu hemmen, sollten die oben beschriebenen Antisense- und Sense-DNAs wenigstens 15 Nucleotide, vorzugsweise wenigstens 100 Nucleotide und besonders bevorzugt wenigstens 500 Nucleotide lang sein. Diese DNAs sind im Allgemeinen kürzer als 5 kb und vorzugsweise kürzer als 2,5 kb.
Außerdem ist es wahrscheinlich, dass eine DNA, die ein Ribozym codiert, das wenigstens einen der Stränge einer RNA, der LBVV-Proteine codiert, spaltet, als DNA verwendet werden kann, die die Produktion der LBVV-Proteine reprimiert.
Ein Ribozym ist ein RIVA-Molekül, das katalytische Aktivitäten aufweist. Es gibt viele Ribozyme mit verschiedenen Aktivitäten. Die Erforschung der Ribozyme als RNA-spaltende Enzyme ermöglichte die Gestaltung eines Ribozyms, das RNA ortsspezifisch spaltet. Während einige Ribozyme des Gruppe-I-Intron-Typs oder die in RNase P enthaltene M1RNA aus 400 Nucleotiden oder mehr bestehen, haben andere, die zum Hammerhead-Typ oder Haarnadeltyp gehören, eine Akti vitätsdomäne von etwa 40 Nucleotiden (Makoto Koizumi und Eiko Ohtsuka (1990), Tanpakushitsu Kakusan Kohso (Nucleic acid, Protein and Enzyme) 35: 2191–2200).
Die Selbstspaltungsdomäne eines Ribozyms des Hammerhead-Typs spaltet auf der 3'-Seite von C15 der Sequenz G13U14C15. Die Bildung eines Nucleotidpaars zwischen U14 und A auf der neunten Position gilt als wichtig für die Ribozymaktivität. Weiterhin hat sich gezeigt, dass die Spaltung auch dann erfolgt, wenn das Nucleotid auf der 15. Position A oder U anstelle von C ist (M. Koizumi et al. (1988), FEBS Letters, 228: 228–230). Wenn die Substratbindungsstelle des Ribozyms so gestaltet ist, dass sie komplementär zu den der Zielstelle benachbarten RNA-Sequenzen ist, kann man ein restriktionsenzymartiges RNA-spaltendes Ribozym schaffen, das die Sequenz UC, UU oder UA innerhalb der Ziel-RNA erkennt (M. Koizumi et al. (1988), FEBS Letters, 239: 285; Makoto Koizumi und Eiko Ohtsuka (1990), Tanpakushitsu Kakusan Kohso (Protein, Nucleic acid and Enzyme), 35: 2191–2200; M. Koizumi et al. (1989), Nucleic Acids Research, 17: 7059–7071). Zum Beispiel im LBVV-cp-Gen, in den Genen von LBVV-Protein 2 bis 5 oder im LBVV-L-Gen (SEQ ID Nr. 1 oder 12) gibt es eine Menge von Stellen, die als Ribozym-Angriffspunkt verwendet werden können.
Das Ribozym des Haarnadeltyps ist für die vorliegende Erfindung ebenfalls geeignet. Ein Ribozym des Haarnadeltyps findet sich zum Beispiel im Minusstrang der Satelliten-RNA des Tabakringfleckenvirus (J. M. Buzayan, Nature 323: 349–353 (1986)). Von diesem Ribozym wurde auch gezeigt, dass es RNA zielspezifisch spaltet (Y. Kikuchi und N. Sasaki (1992), Nucleic Acids Research, 19: 6751–6775; Yo Kikuchi (1992), Kagaku To Seibutsu (Chemistry and Biology) 30: 112–118).
Das zur Spaltung der Zielstelle gestaltete Ribozym wird mit einem Promotor, wie dem Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor, und mit einer Transcriptionsterminationssequenz fusioniert, so dass es in Pflanzenzellen transcribiert wird. Wenn jedoch zusätzliche Sequenzen an das 5'-Ende oder das 3'-Ende der transcribierten RNA angefügt wurden, kann die Ribozymaktivität verloren gehen. In diesem Fall kann man ein zusätzliches Trimm-Ribozym platzieren, das in cis die Funktion ausübt, auf der 5'- oder 3'-Seite des Ribozymteils ein Stück abzuschneiden, um den Ribozymteil genau aus der transcribierten RNA, die das Ribozym enthält, herauszuschneiden (K. Taira et al. (1990), Protein Eng. 3: 733–738; A.M. Dzaianott und J.J. Bujarski (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4823–4827; C.A. Grosshands und R.T. Cech (1991), Nucleic Acids Research, 19: 3875–3880; K. Taira et al. (1991), Nucleic Acid Research, 19: 5125–5130). Mehrere Stellen innerhalb des Zielgens können gespalten werden, indem man diese Struktureinheiten in Tandem-Anordnung bringt und dadurch größere Wirkungen erreicht (N. Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271–1279 (1992)). Durch Verwendung solcher Ribozyme ist es möglich, die Transcriptionsprodukte des Zielgens in der vorliegenden Erfindung spezifisch zu spalten und dadurch die Expression des Gens zu reprimieren.
Vektoren, die für die Transformation von Salatzellen verwendet werden, unterliegen keiner Einschränkung, solange der Vektor in den Zellen eine insertierte DNA exprimieren kann. Zum Beispiel können Vektoren verwendet werden, die Promotoren für die konstitutive Genexpression in Salatzellen (z.B. Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor) sowie Promotoren, die durch exogene Reize induzierbar sind, umfassen. Beispiele für geeignete Vektoren schließen den binären pBI-Vektor ein. Die "Salatzelle", in die der Vektor eingeführt werden soll, umfasst verschiedene Formen von Salatzellen, wie kultivierte Zellsuspensionen, Protoplasten, Blattabschnitte und Kallus.
Ein Vektor kann nach bekannten Verfahren in Salatzellen eingeführt werden, wie nach dem Polyethylenglycolverfahren, Polykation-Verfahren, Elektroporation, Agrobacterium-vermittelte Übertragung und Teilchenbeschuss. Zum Beispiel ist das in der Literatur (S.Z. Pang et al. (1996), The Plant Journal, 9, 899–909) beschriebene Verfahren zu bevorzugen.
Die Regeneration einer Salatpflanze aus transformierten Salatzellen kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren je nach Art der Salatzellen durchgeführt werden. Beispiele für zu bevorzugende Regenerationsverfahren sind in der Literatur beschrieben (S. Enomoto et al. (1990), Plant Cell Reports, 9, 6–9). Sobald eine transformierte Salatpflanze, in deren Genom die DNA der vorliegenden Erfindung eingeführt ist, erhalten wurde, ist es möglich, Nachkommen der Pflanze durch geschlechtliche Fortpflanzung zu gewinnen. Alternativ dazu können auch Pflanzen durch Massenproduktion aus Fortpflanzungsmaterialien (zum Beispiel Samen, Knollen, Kallus, Protoplasten usw.) gewonnen werden, die von der Pflanze oder Nachkommen oder Klonen davon erhalten wurden. Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzenzellen, die mit der DNA der vorliegenden Erfindung transformiert sind; Pflanzen, die diese Zellen umfassen; Nachkommen und Klone der Pflanzen; und Fortpflanzungsmaterialien der Pflanzen und ihrer Nachkommen und Klone.
Außerdem gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Infektion mit LBVV an. Eine Ausführungsform des diagnostischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst das Nachweisen einer LBVV-RNA oder einer RNA, die das virale Protein codiert, unter Verwendung eines Primers oder einer Sonde. Als Sonde oder Primer kann eine Nucleinsäure verwendet werden, die wenigstens 15 Nucleotide umfasst, die zu einer DNA, die das in einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und 13 beschriebene LBVV-Protein codiert, homolog oder komplementär ist. Die Nucleinsäure ist vorzugsweise eine Nucleinsäure, die spezifisch mit einer DNA hybridisiert, die das in einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und 13 beschriebene LBVV-Protein codiert.
Der Primer oder die Sonde kann markiert sein, falls notwendig. Beispiele für Marker schließen einen radioaktiven Marker ein.
Bei dieser Diagnose wird zum Beispiel eine Testprobe aus Salat, von dem man annimmt, dass er mit dem Breitadernvirus des Salats infiziert sein könnte, aus Olpidium, das das Virus beherbergt, oder aus Boden, der das Virus enthält, hergestellt, und mit der Probe wird eine PCR unter Verwendung des obigen Primers oder ein Northern-Blotting unter Verwendung der obigen Sonde durchgeführt.
Eine weitere Ausführungsform des diagnostischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das durch das Nachweisen von LBVV-Proteinen unter Verwendung von Antikörper gekennzeichnet ist. Der bei dieser Diagnose verwendete Antikörper kann zum Beispiel durch Synthetisieren eines Peptids unter Verwendung des antigenen Bereichs, der aufgrund der resultierenden Aminosäuresequenzen (eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und 13) angenommen wird, durch Binden des Peptids an ein Trägerprotein, wie KLH oder BSA, und durch Immunisieren von Kaninchen mit diesem Protein hergestellt werden. Außerdem kann der Antikörper auch durch Markieren von LBVV-Proteinen mit Histidin unter Verwendung des QIAexpress-Typ-IV-Kits (QIAGEN), durch Exprimieren des markierten Proteins in E. coli und durch Immunisieren von Kaninchen mit dem resultierenden Protein produziert werden. Der Antikörper kann gegebenenfalls markiert werden. Beispiele für Marker schließen einen Enzymmarker ein. Anstatt den Antikörper selbst direkt zu markieren, kann der Antikörper außerdem auch über eine Substanz, wie Protein A, die an den Antikörper bindet, markiert werden, wobei anschließend das Zielprotein nachgewiesen wird.
Bei dieser Diagnose wird eine Testprobe zum Beispiel aus Salat, von dem man annimmt, dass er mit dem Breitadernvirus des Salats infiziert sein könnte, aus Olpidium, das das Virus beherbergt, oder aus Boden, der das Virus enthält, hergestellt, und dann wird mit der Probe ein ELISA oder ein Western-Blotting unter Verwendung des obigen Antikörpers durchgeführt.
Beste Methode zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand der Beispiele ausführlich erläutert, soll aber nicht auf diese beschränkt sein.
[Beispiel 1] Klonierung des Hüllproteingens des Breitadernvirus des Salats (LBVV)
Eine Probe von kontaminiertem Boden aus einem Salatfeld (Kultursorte: Cisco) in der Präfektur Kagawa in Japan, das im Jahre 1997 charakteristische Breitadernsymptome zeigte, wurde genommen. Das Virus wurde in Ruhesporen in trockenem Boden gehalten, der im Labor aufbewahrt wurde. Cisco, eine Salat-Kultursorte, wurde für die Virusreinigung verwendet, und das Virus wurde durch reguläre Übertragung in Boden eingeimpft.
Die Virusreinigung wurde durchgeführt, indem man das Verfahren von Kuwata et al. (S. Kuwata et al. (1983), Annals of the Phytopathological Society of Japan, 49, 246–251) modifizierte. Der erste Schritt des Sedimentierens von Virionen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit wurde weggelassen. Die Virusfraktion wurde durch Behandeln mit 1% Triton-X und 1% Brij-35 und anschließende Cs₂SO₄-Dichtegradientenzentrifugation erhalten. Als das nach diesem Reinigungsverfahren erhaltene gereinigte Virus einer SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese unterzogen wurde, wurde nur eine einzige Bande bei 48 kDa nachgewiesen. Da durch Elektronenmikroskopie außerdem nur Haufen von LBVV-Partikeln beobachtet wurden, während andere Verunreinigungen nicht beobachtet wurden, wurde angenommen, dass das resultierende Virus eine beträchtlich hohe Reinheit hat.
Nach der Behandlung des gereinigten Virus mit Proteinase-K-SDS wurde eine Extraktion der viralen Nucleinsäure durch Phenol/Chloroform und Ethanolfällung durchgeführt. Die gereinigte virale Nucleinsäure wurde nach Denaturierung mit Dimethylsulfoxid zur Synthese der cDNA des ersten Stranges verwendet. Poly(A)+-RNA wurde aus dem virusinfizierten Salatblatt isoliert, das offensichtliche Breitadernsymptome zeigte, wobei man den Dynabeads^®-mRNA-DIRECT^TM-Kit (Dynal^®) verwendete. Eine Synthese der cDNA des ersten Strangs wurde durchgeführt, indem man eine reverse Transcriptionsreaktion mit SUPER-SCRIPT^TM-II-RNase-H^–-Reverser-Transcriptase (Gibco BRL) unter Verwendung eines statistischen Primers oder eines Oligo-dT-BamHI-Primers durchführte.
Die Bestimmung der internen Aminosäuresequenzen des LBVV-Hüllproteins wurde in der unten beschriebenen Weise durchgeführt. Nachdem gereinigtes LBVV einer 12,5%-SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese unterzogen worden war, wurden die Polypeptide auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, und die interessierende Bande wurde ausgeschnitten, und dann erfolgte eine Carboxy methylierung und Behandlung mit Lysyl-Endopeptidase. Nach der Behandlung wurden 38 Peptidfragmente des LBVV-Hüllproteins durch Umkehrphasen-HPLC erhalten, und die Aminosäuresequenzen von mehreren internen Peptidfragmenten wurden bestimmt.
Ein 5LB111-Primer (GARWSITGGGAYGAYGARWSIAC/SEQ ID Nr. 7) und 3LB171-Primer (GCRTCDATRTARTCIACICCIGG/SEQ ID Nr. 8) wurden auf der Grundlage von ESWDDESTIAMP und NLEVPGVDYIDA der resultierenden Aminosäuresequenzen gestaltet. Unter Verwendung dieser Primer und von Takara-Taq (Takara) wurde eine PCR durchgeführt, und es wurde ein PCR-Produkt von 274 bp erhalten. Das resultierende PCR-Produkt wurde unter Verwendung von pGEM^®-T Easy Vector Systems (Promega) kloniert, und seine Nucleotidsequenz wurde bestimmt.
Um die volle Länge des Hüllproteingens von LBVV zu bestimmen, wurden 3'RACE oder 5'RACE unter Verwendung einer RNA aus dem gereinigten Virus oder einer Poly(A)+-RNA aus dem LBVV-infizierten Blatt durchgeführt. Im Falle von 3'RACE wurde ein 891-bp-PCR-Produkt unter Verwendung einer Poly(A)+-RNA aus dem LBVV-infizierten Blatt erhalten, wobei man den Oligo-dT-BamHI-Primer und den 5LB171-Primer (AAYYTIGARGTICCIGGIGTIGA/SEQ ID Nr. 9) verwendete. Im Falle von 5'RACE wurde ein 760-bp-PCR-Produkt mit dem 5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (Gibco BRL), erhalten, wobei man eine RNA aus gereinigtem Virus oder eine Poly(A)+-RNA aus dem LBVV-infizierten Blatt verwendete und den 3LB5R4-Primer (GTTTTTGACCCTGATAG/SEQ ID Nr. 10) und 3LB5R5-Primer (GTCGACTCTAGACACTTGTTGTTTGTCGTG/SEQ ID Nr. 11) verwendete. Die resultierenden PCR-Produkte wurden unter Verwendung von pGEM^®-T Easy Vector Systems (Promega) kloniert, und die Nucleotidsequenzen wurden für wenigstens sechs Klone oder mehr bestimmt. Außerdem wurden das 500- und das 700-bp-PCR-Produkt aus dem Bereich in der Nähe des Hüllproteingens unter Verwendung von gegenseitig überlappenden virusspezifischen Primern umkloniert. Wenigstens drei Klone wurden aus jedem Bereich sequenziert, und die Nucleotidsequenz des Hüllproteingens wurde bestätigt.
Eine Sequenz von 1425 Nucleotiden wurde unter Verwendung des obigen Verfahrens bestimmt. Dieses Gen hatte eine Translationsstartstelle bei Nucleotid 209 und codierte 397 Aminosäuren (siehe SEQ ID Nr. 1).
[Beispiel 2] Herstellung von transformiertem Salat
(1) Sterilisierung und Kultivierung von Salatsamen
Salatsamen wurden mehrere Sekunden lang in 70% Ethanol eingetaucht, und dann erfolgte eine Behandlung während 15 Minuten in einer Sterilisationslösung (10% Natriumhypochlorit, 0,05% Tween-20). Dann wurden die Samen mit sterilisiertem Wasser abgespült, auf Hyponex-Agar-Medium (hergestellt durch Auflösen von 3,0 g Hyponex-Pulver, 10,0 g Saccharose und 8,0 g Agar in einem Liter destilliertem Wasser und dann Einstellen des pH-Werts auf 5,8 mit 1 N NaOH) in einer Pflanzenbox ausgesät und etwa 2 Wochen lang unter Lichtbedingungen bei 25 bis 28°C wachsen gelassen, bis das echte Blatt etwa 5 cm erreichte.
(2) Kultivierung von und Impfung mit Agrobacterium
Agrobacterium wurde in flüssiges YEB-Medium (hergestellt durch Auflösen von 1,0 g Hefeextrakt, 5,0 g Rinderextrakt, 5,0 g Pepton, 5,0 g Saccharose und 0,5 g MgSO₄·7H₂O in einem Liter destilliertem Wasser und dann Einstellen des pH-Werts auf 7,0 mit 1 N NaOH), das 250 μg/ml Streptomycin, 5 μg/ml Rifampicin und 50 μg/ml Kanamycin umfasste, eingeimpft und dann über Nacht bei 28°C unter Schütteln kultiviert. Dann wurde die Agrobacterium-Kulturflüssigkeit in frischem YEB-Medium (das die oben genannten Antibiotika enthielt) subkultiviert und zusätzlich einen Tag lang bei 28°C unter Schütteln kultiviert.
Die jungen Salatpflanzen, bei denen das echte Blatt auf etwa 5 cm gewachsen war, wurden auf Kunststoff-Petri-Schalen übergeführt, das echte Blatt wurde in Stücke geschnitten, die etwa 5 mm maßen, und die Stücke der Blätter wurden 1 Minute lang in zehnfach verdünnte Agrobacterium-Kulturflüssigkeit eingetaucht. Dann wurden die Stücke auf Medium nach Murashige & Skoog (MS-Medium) (pH 5,8), das 3% Saccharose, 0,5 ppm Benzyladeninphosphat (BAP), 0,1 ppm Naphthalinessigsäure (NAA) und 0,8% Agar umfasste, in 15 bis 20 Stücken/Platte angeordnet und 2 Tage lang bei 25°C unter Bedingungen von 2000 lux cokultiviert. Nach dem Cokultivieren wurden die Stücke 7 Tage lang unter sterilen Bedingungen in MS-Medium (pH 5,8) kultiviert, das 3% Saccharose, 0,5 ppm BAP, 0,1 ppm NAA, 250 μg/ml Carbenicillin und 0,8% Agar umfasste.
(3) Selektion und Kultivierung von Transformanten
Nach einer sterilen Kultur wurden die Stücke auf MS-Medium (pH 5,8), das 3% Saccharose, 0,5 ppm BAP, 0,1 ppm NAA, 250 μg/ml Carbenicillin, 50 mg/ml Kanamycin und 0,8% Agar umfasste, übertragen und bei 25°C unter Bedingungen von 2000 lux kultiviert. Die Stücke wurden etwa alle 2 Wochen subkultiviert, und eine Regeneration wurde nach etwa 2 bis 3 Monaten aus denjenigen Pflanzen beobachtet, die mit Agrobacterium geimpft worden waren.
Die redifferenzierten Individuen wurden auf MS-Medium (pH 5,8), das 3% Saccharose, 0,3 ppm BAP, 500 μg/ml Carbenicillin und 0,8% Agar umfasste, übertragen und etwa alle 2 Wochen subkultiviert. Wenn die redifferenzierten Individuen eine Größe von etwa 3 cm erreichten, wurden Schnittstücke davon eingefügt und in 1/2-faches Agarmedium, das 500 μg/ml Carbenicillin enthielt, gepflanzt und Wurzeln bilden gelassen.
(4) Salatakklimatisierung und Probenahme von Samen
In dem Stadium, in dem die redifferenzierten Individuen Wurzeln gebildet hatten und die Schösslinge bis 1 bis 2 cm gewachsen waren, wurden die Schösslinge abgeschnitten, und die Schnittstücke wurden in Vermiculit, das in eine 500-fach verdünnte wässrige Lösung von Hyponex eingetaucht worden war, gepflanzt und Wurzeln bilden gelassen. Die Pflanzen wurden akklimatisiert, indem man den Deckel der Pflanzenbox allmählich öffnete und so für Belüftung sorgte. Nachdem sich die Pflanzen ausreichend akklimatisiert hatten, wurden sie in einem geschlossenen Treibhaus (maximale Lufttemperatur: 30°C, natürlicher Lichtrhyth mus) dauerhaft in Polypot gepflanzt, der Kureha-Gartenerde (Kureha engei baido) umfasste. Dann ließ man sie schießen und blühen, und es wurden Samenproben genommen.
[Beispiel 3] Klonierung des LBVV-RNA2-Gens
Eine Probe von kontaminiertem Boden aus einem Salatfeld (Kultursorte: Cisco) in der Präfektur Kagawa in Japan, das im Jahre 1997 charakteristische Breitadernsymptome zeigte, wurde genommen. Das Virus wurde in Ruhesporen in trockenem Boden gehalten, der im Labor aufbewahrt wurde. Cisco, eine Salat-Kultursorte, wurde für die Virusreinigung verwendet, und das Virus wurde durch reguläre Übertragung in Boden eingeimpft.
Die Virusreinigung und RNA-Reinigung wurden gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die Synthese von cDNA und Bestimmung der Nucleotidsequenz erfolgten im Einklang mit dem Verfahren von C.F. Fazeli & M.A. Rezaian (Journal of General Virology, 81, 605–615) unter Verwendung eines Genom-Walking-Verfahrens, bei dem die Sequenz verlängert wird, indem man einen Primer für die Stromabwärtsrichtung synthetisierte. Zuerst wurde auf der Grundlage von Beispiel 1 ein virusspezifischer 5LB5R3-Primer (AGCTCTGAACAACGACATG/SEQ ID Nr. 16) hergestellt, und eine erste cDNA wurde mit SUPERSCRIPT^TM-II-RNase-H^–-Reverser-Transcriptase unter Verwendung einer RNA aus dem gereinigten LBVV als Matrize synthetisiert. Dann wurde eine zweite cDNA mit einem Klenow-Fragment (Takara) unter Verwendung des universellen Primers dN6 (5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNN-3'/SEQ ID Nr. 14) synthetisiert. Nach der Entfernung von überschüssigem Primer mit dem GlassMax DNA Isolation Spin Cartridge System (Gibco BRL) wurden eine PCR durchgeführt, wobei man den virusspezifischen Primer und einen universellen Primer (5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC-3'/SEQ ID Nr. 15) verwendete, und das resultierende PCR-Produkt wurde unter Verwendung von pGEM^®-T Easy Vector Systems kloniert. Dann wurde die Nucleotidsequenz bestimmt. Dann wurde dasselbe Verfahren viermal wiederholt, wobei bis zu 5177 Nucleotide bestimmt wurden. Die Bestimmung des 3'-Terminus von RNA2 wurde durch 5'RACE durchgeführt (Anmerkung: da gereinigte LBVV-RNA sowohl einen positiven Strang als auch einen negativen Strang enthält, kann nicht nur der 5'-Terminus, sondern auch der 3'-Terminus durch 5'RACE bestimmt werden), und eine Sequenz von 6078 Nucleotiden wurde bestimmt, die Gene für fünf Proteine umfasste, die von LBVV codiert wurden (SEQ ID Nr. 1). Weiterhin wurden die 500- bis 700-bp-Produkte von RNA2 unter Verwendung von gegenseitig überlappenden virusspezifischen Primern umkloniert. Wenigstens drei Klone wurden aus jedem Bereich sequenziert, und die Nucleotidsequenz von RNA2 wurde bestätigt.
Eine Sequenz von 6078 Nucleotiden wurde unter Verwendung des obigen Verfahrens bestimmt. Dieses Gen codierte fünf Proteine. Protein 1 (Hüllprotein: Beispiel 1) hatte eine Translationsstartstelle an Nucleotid 209 und codierte 397 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 2), Protein 2 hatte eine Translationsstartstelle an Nucleotid 1492 und codierte 333 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 3), Protein 3 hatte eine Translationsstartstelle an Nucleotid 2616 und codierte 290 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 4), Protein 4 hatte eine Translationsstartstelle an Nucleotid 3842 und codierte 164 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 5), und Protein 5 hatte eine Translationsstartstelle an Nucleotid 4529 und codierte 368 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 6). Als die Homologie der Aminosäuresequenzen mit anderen Viren verglichen wurde, wurde nur Protein 1 (Hüllprotein) als homolog zu dem Nucleocapsidprotein (Hüllprotein) von Viren, die zur Familie Rhabdoviridae gehören, beobachtet.
[Beispiel 4] Klonierung des LBVV-Polymerase-Gens
Eine Probe von kontaminiertem Boden aus einem Salatfeld (Kultursorte: Cisco) in der Präfektur Kagawa in Japan, das im Jahre 1997 charakteristische Breitadernsymptome zeigte, wurde genommen. Das Virus wurde in Ruhesporen in trockenem Boden gehalten, der im Labor aufbewahrt wurde. Cisco, eine Salat-Kultursorte, wurde für die Virusreinigung verwendet, und das Virus wurde durch reguläre Übertragung in Boden eingeimpft.
Die Virusreinigung wurde in derselben Weise wie bei dem Verfahren zur Virusreinigung von Beispiel 1 durchgeführt. Die Extraktion von hochreiner LBVV-RNA wurde in der unten beschriebenen Weise durchgeführt. Nach der Behandlung des gereinigten Virus mit Proteinase-K-SDS wurde sie mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Nachdem die virale Nucleinsäure dann mit DNase behandelt und mit dem RNaid^® Kit (BIO 101) weiter gereinigt worden war, wurde eine 7,3-kb-RNA von zwei LBVV-RNAs durch Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel (SeaPlaque GTG Agarose, FMC) isoliert und für die Synthese von cDNA verwendet. Die Synthese von cDNA wurde nach dem Verfahren von P. Froussard (Nucleic Acids Research, 20, 2900) durchgeführt. Kurz gesagt, eine erste cDNA wurde mit der SUPERSCRIPT^TM-II-RNase-H^–-Reversen-Transcriptase unter Verwendung des universellen Primers dN6 (5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNN-3'/SEQ ID Nr. 14) durchgeführt. Dann wurde eine zweite cDNA mit einem Klenow-Fragment synthetisiert, eine PCR wurde unter Verwendung eines universellen Primers (5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC-3'/SEQ ID Nr. 15) durchgeführt, und das resultierende PCR-Produkt wurde unter Verwendung von pGEM^®-T Easy Vector Systems kloniert. Dann wurde die Nucleotidsequenz bestimmt.
Acht partielle LBVV-Polymerase-Gen-Fragmente von etwa 500 bp wurden erhalten. Beide Enden des Polymerase-Gens wurden durch 5'RACE aufgefüllt, und die Lücken zwischen den Fragmenten wurden durch RT-PCR aufgefüllt, wodurch eine Sequenz von 6793 Nucleotiden bestimmt wurde, die das Polymerase-Gen in voller Länge (SEQ ID Nr. 12) enthielt. Weiterhin wurden die 500- bis 700-bp-PCR-Produkte des Polymerase-Gens unter Verwendung von gegenseitig überlappenden virusspezifischen Primern umkloniert. Wenigstens drei Klone wurden aus jedem Bereich sequenziert, und die Nucleotidsequenz des Polymerase-Gens wurde bestätigt.
Dieses Gen codierte 2040 Aminosäuren mit einer Translationsstartstelle an Nucleotid 337 (SEQ ID Nr. 13). Als die Homologie der Aminosäuresequenz mit anderen Viren verglichen wurde, wurde bestätigt, dass das Protein homolog zu den Polymerasen von Viren ist, die zur Ordnung Mononegavirales gehören, insbesondere von Viren, die zur Familie der Rhabdoviridae gehören, und vier Motive beibehalten hat, die als verantwortlich für die Polymerase-Aktivität gelten.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden Nucleinsäuren isoliert, die Proteine von LBVV codieren, und ihre Primärstruktur wurde aufgeklärt. Es wurde daher möglich, eine Salatpflanze, die Resistenz gegen das Virus aufweist, zu produzieren, indem man die Nucleinsäure oder ihre Antisense-Nucleinsäure in Salat exprimiert. Außerdem wurde es möglich, eine Diagnose einer Infektion mit LBVV vorzunehmen, indem man die Nucleinsäure oder ein davon codiertes Protein nachweist.
Sequenzprotokoll

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die ein Protein des Breitadernvirus des Salats codiert, wobei die Nucleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (a) einer Nucleinsäure, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und SEQ ID Nr. 13 umfasst; und (b) der Nucleinsäure von (a), die den codierenden Bereich der Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder 12 umfasst, besteht.
Isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure eine RNA ist.
Isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure eine DNA ist.
DNA, die eine Sense-RNA codiert, die zu einem komplementären Strang der Nucleinsäure gemäß Anspruch 2 komplementär ist.
DNA, die eine Antisense-RNA codiert, die zu der Nucleinsäure gemäß Anspruch 2 komplementär ist.
DNA, die eine RNA mit Ribozymaktivität codiert, die spezifisch die Nucleinsäure gemäß Anspruch 2 spaltet.
Vektor, der die Nucleinsäure gemäß Anspruch 3 umfasst.
Transformierte Zelle, die die Nucleinsäure gemäß Anspruch 3 oder den Vektor gemäß Anspruch 7 umfasst.
Protein, das von der Nucleinsäure gemäß Anspruch 1 codiert wird.
Antikörper, der an das Protein gemäß Anspruch 9 bindet.
Verfahren zur Herstellung des Proteins gemäß Anspruch 9, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren der transformierten Zelle gemäß Anspruch 8; und (b) Gewinnen eines exprimierten Proteins aus der transformierten Zelle oder deren Kulturüberstand.
Vektor, der die DNA gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 umfasst.
Transformierte Salatzelle, die die Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, die DNA gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 oder den Vektor gemäß Anspruch 7 oder 12 umfasst.
Transformierte Salatpflanze, die die transformierte Salatzelle gemäß Anspruch 13 umfasst.
Transformierte Salatpflanze, die ein Nachkomme oder ein Klon der transformierten Salatpflanze gemäß Anspruch 14 ist.
Fortpflanzungsmaterial der transformierten Salatpflanze gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei das Fortpflanzungsmaterial die Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, die DNA gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 oder den Vektor gemäß Anspruch 7 oder 12 umfasst.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Infektion, die durch das Breitadernvirus des Salats verursacht wird, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst: Nachweisen der Nucleinsäure gemäß Anspruch 1 oder Nachweisen des Proteins gemäß Anspruch 9 in Salatzellen oder in Olpidium, einem Pilz, der das Breitadernvirus des Salats überträgt.