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Fachgebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Nucleinsäuren, die Proteine des Breitadernvirus
des Salats codieren, auf Proteine, die von den Nucleinsäuren codiert
werden, und auf ihre Herstellung und Verwendung.
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Technischer
Hintergrund
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Das
Breitadernvirus des Salats (LBVV; lettuce big-vein virus) ist ein
Virus, das zu den Varicosaviren gehört, besteht aus zwei RNAs (7,0
kb und 6,5 kb RNA) und behält
ein Hüllprotein
von 48 kDa zurück.
LBVV ist ein Bodenvirus, das durch Olpidum brassicae im Boden verbreitet
wird, und in den USA, Australien, Neuseeland, Japan und Europa vorkommt.
Da dieses Virus Salatpflanzen infiziert und deren Qualität und Ausbeute merklich
reduziert, ist es ein ernstes Problem bei der Salatherstellung.
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Leider
wurde bisher noch nicht die Existenz eines Gens beschrieben, das
Salatpflanzen resistent gegen dieses Virus macht. Zwar sind mehrere
Kultursorten, wie Entrée,
Sea Green und Pacific, als LBVV-resistente Kultursorten kommerziell
erhältlich,
doch ist ihre Resistenz gering. Es wurde also noch keine grundlegende
Lösung
für die
durch LBVV verursachten Krankheitsschäden gefunden.
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Die
Aufklärung
der genetischen Information des Virus ist ein wichtiger Schritt
zur Verhinderung von durch das Virus verursachten Krankheitsschäden. Die
Isolierung und Reinigung von LBVV sind aber aus Gründen wie
der Instabilität
der Viruspartikel, den Neigung der Viruspartikel, leicht miteinander
zu aggregieren, und der äußerst niedrigen
Konzentration des Virus in Pflanzen äußerst schwierig. Obwohl bisher
zwei erfolgreiche Beispiele für
die Reinigung des Virus beschrieben wurden (S. Kuwata et al. (1983),
Annals of the Phytopathological Society of Japan, 49, 246–251; und
H.J. Vetten et al. (1987), Journal of Phytopathology, 120, 53–59), ist
die Reproduzierbarkeit gering, und die gereinigten Mengen sind äußerst niedrig.
Folglich wurde in Bezug auf LBVV noch überhaupt keine genetische Information
aufgeklärt.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wurde in Anbetracht der obigen Umstände erreicht,
und Ziele der vorliegenden Erfindung bestehen darin, Proteine des
Breitadernvirus des Salats (LBVV; lettuce big-vein virus) und Nucleinsäuren, die
die Proteine codieren, zu isolieren und ihre Struktur aufzuklären. Außerdem besteht
ein weiteres Ziel der Erfindung darin, Salatpflanzen durch Expression
der Nucleinsäure
oder ihrer Antisense-Nucleinsäure
in Salat eine Resistenz gegen LBVV zu verleihen. Noch ein weiteres
Ziel der vorliegenden Erfindung besteht überdies darin, ein Verfahren
zum Diagnostizieren einer Infektion durch LBVV anzugeben, indem
man die Nucleinsäure
oder ein durch die Nucleinsäure
codiertes Protein nachweist.
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LBVV
ist ein RNA-Virus, und wenn eine DNA, die ein Protein des Virus
codiert, oder deren Antisense-DNA in einer Pflanze exprimiert wird,
können
die Produktion und Funktion von LBVV-Proteinen wahrscheinlich auf
dem Transcriptionsniveau oder Translationsniveau gehemmt werden
(P.F. Tennant et al. (1994), Phytopathology, 84, 1359–1366; C.C.
Huntley & T.C.
Hall (1993), Virology, 192, 290–297;
D.C. Baulcombe (1996), The Plant Cell, 8, 1833–1844).
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung konzentrierten sich auf diese
Idee und isolierten die Gene, die LBVV-Proteine codieren, um gegen
LBVV resistenten Salat zu produzieren.
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Insbesondere
erhielten die Erfinder zuerst hochgereinigtes LBVV und unterzogen
dieses dann einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, um das Hüllprotein
nachzuweisen, aus dem das Virus besteht. Das nachgewiesene Hüllprotein
wurde gereinigt und dann zu Peptiden zersetzt, und anschließend wurden
die partiellen Aminosäuresequenzen
der Peptide nach dem Edman-Verfahren bestimmt. Außerdem wurde
eine RNA, die das Hüllprotein
von LBVV codiert, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kloniert,
wobei man Primer verwendete, die auf der Grundlage von Information
aus den bestimmten Aminosäuresequenzen
gestaltet wurden, und anschließend
wurde die Nucleotidsequenz der RNA bestimmt.
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Um
das Gen zu bestimmen, das die volle Länge des Hüllproteins von LBVV codiert,
wurden dann RNAs aus gereinigtem Virus und aus mit dem Virus infizierten
Blättern,
die offensichtliche Symptome der Infektion aufwiesen, hergestellt,
und unter Verwendung dieser RNA-Moleküle wurden 3'RACE sowie 5'RACE durchgeführt. Als Ergebnis ist es den
Erfindern nicht nur gelungen, das RNA-Molekül, das LBVV-Hüllprotein codiert,
zu isolieren, sondern auch seine Primärstruktur zu bestimmen. Außerdem ist
es den Erfindern mit dem Genom-Walking-Verfahren gelungen, RNA-Moleküle zu isolieren,
die vier andere nichtstrukturelle Proteine von LBVV codieren, und
ihre Primärstrukturen
ebenfalls zu bestimmen.
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Ähnlich ist
es den Erfinder auch gelungen, ein RNA-Molekül, das ein Polymerase-Protein codiert,
aus hochgereinigtem LBVV zu isolieren.
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Das
isolierte RNA-Molekül
oder sein Antisense-Molekül
kann durch seine Expression Salatpflanzen Resistenz gegen LBVV verleihen,
und dadurch ist es möglich,
die Salatproduktivität
zu verbessern. Außerdem kann
auch eine genetische Diagnose von LBVV durchgeführt werden, indem man auf der
Grundlage von Sequenzinformationen der isolierten RNA-Moleküle einen
LBVV-spezifischen Primer entwirft und verwendet. Weiterhin können auf
der Grundlage der resultierenden Sequenzinformation Antiseren, die
an LBVV-Proteine binden, produziert und für die serologische Diagnose
von LBVV verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage der obigen Ergebnisse
fertiggestellt und stellt LBVV-Proteine, Nucleinsäuren, die
die Proteine codieren, und deren Herstellung und Verwendung bereit.
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Insbesondere
stellt die vorliegende Erfindung Folgendes bereit:
- (1) eine isolierte Nucleinsäure,
die ein Protein des Breitadernvirus des Salats codiert, wobei die
Nucleinsäure
aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus
(a) einer Nucleinsäure, die ein Protein codiert,
das die Aminosäuresequenz
von einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und SEQ ID Nr. 13 umfasst;
und
(b) der Nucleinsäure
von (a), die den codierenden Bereich der Nucleotidsequenz von SEQ
ID Nr. 1 oder 12 umfasst,
besteht;
- (2) die Nucleinsäure
gemäß (1), wobei
die Nucleinsäure
eine RNA ist;
- (3) die Nucleinsäure
gemäß (1), wobei
die Nucleinsäure
eine DNA ist;
- (4) eine DNA, die eine Sense-RNA codiert, die zu einem komplementären Strang
der Nucleinsäure
gemäß (2) komplementär ist;
- (5) eine DNA, die eine Antisense-RNA codiert, die zu der Nucleinsäure gemäß (2) komplementär ist;
- (6) eine DNA, die eine RNA mit Ribozymaktivität codiert,
die spezifisch die Nucleinsäure
gemäß (2) spaltet;
- (7) einen Vektor, der die Nucleinsäure gemäß (3) umfasst;
- (8) eine transformierte Zelle, die die Nucleinsäure gemäß (3) oder
den Vektor gemäß (7) umfasst;
- (9) ein Protein, das von der Nucleinsäure gemäß (1) codiert wird;
- (10) einen Antikörper,
der an das Protein gemäß (9) bindet;
- (11) ein Verfahren zur Herstellung des Proteins gemäß (9), wobei
das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Kultivieren
der transformierten Zelle gemäß (8); und
(b)
Gewinnen eines exprimierten Proteins aus der transformierten Zelle
oder deren Kulturüberstand;
- (12) einen Vektor, der die DNA gemäß einem der Punkte (4) bis
(6) umfasst;
- (13) eine transformierte Salatzelle, die die Nucleinsäure gemäß (1), die
DNA gemäß einem
der Punkte (4) bis (6) oder den Vektor gemäß (7) oder (12) umfasst;
- (14) eine transformierte Salatpflanze, die die transformierte
Salatzelle gemäß (13) umfasst;
- (15) eine transformierte Salatpflanze, die ein Nachkomme oder
ein Klon der transformierten Salatpflanze gemäß (14) ist;
- (16) ein Fortpflanzungsmaterial der transformierten Salatpflanze
gemäß (14) oder
(15), wobei das Fortpflanzungsmaterial die Nucleinsäure gemäß (1), die
DNA gemäß einem
der Punkte (4) bis (6) oder den Vektor gemäß (7) oder (12) umfasst; und
- (17) ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Infektion, die
durch das Breitadernvirus des Salats verursacht wird, wobei das
Verfahren den folgenden Schritt umfasst:
Nachweisen der
Nucleinsäure
gemäß (1) oder
Nachweisen des Proteins gemäß (9) in
Salatzellen oder in Olpidium brassicae, einem Pilz, der das Breitadernvirus
des Salats überträgt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt LBVV-Proteine und Nucleinsäuren, die
die Proteine codieren, bereit. Die von der vorliegenden Erfindung
umfasste Nucleotidsequenz von cDNA, die LBVV-Proteine codiert und
von den Erfindern isoliert wurde, ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt, und
die Aminosäuresequenzen
der von der cDNA codierten Proteine sind in SEQ ID Nr. 2 bis 6 gezeigt.
Die isolierte cDNA ist eine Sequenz von 6078 Nucleotiden und codiert
fünf Proteine.
Protein 1 (Hüllprotein:
Beispiel 1) hat eine Translationsstartstelle an Nucleotid 209 und
codiert 397 Aminosäuren
(der isolierte Klon wurde "LBVV-cp" genannt/SEQ ID Nr.
2); Protein 2 (Beispiel 3) hat eine Translationsstartstelle an Nucleotid
1492 und codiert 333 Aminosäuren
(SEQ ID Nr. 3); Protein 3 (Beispiel 3) hat eine Translationsstartstelle
an Nucleotid 2616 und codiert 290 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 4); Protein
4 (Beispiel 3) hat eine Translationsstartstelle an Nucleotid 3842
und codiert 164 Aminosäuren
(SEQ ID Nr. 5); und Protein 5 (Beispiel 3) hat eine Translationsstartstelle
an Nucleotid 4529 und codiert 368 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 6).
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Außerdem ist
die ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasste Nucleotidsequenz
von cDNA (Beispiel 4), die eine Polymerase von LBVV codiert und
von den Erfindern isoliert wurde, in SEQ ID Nr. 12 gezeigt, und
die Aminosäuresequenz
des von der cDNA codierten Proteins ist in SEQ ID Nr. 13 gezeigt
(der isolierte Klon wurde "LBVV-L" genannt). Die isolierte
cDNA ist eine Sequenz von 6793 Nucleotiden, hat eine Translationsstartstelle
an Nucleotid 337 und codiert 2040 Aminosäuren.
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Außerdem haben
die Erfinder aufgedeckt, dass LBVV ein Negativ-Strang-RNA-Virus ist, das mehr
positive Stränge
als gewöhnlich
in seinen Viruspartikeln enthält.
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Dies
ist das erste Beispiel für
einen Nachweis der Gene und Proteinprimärstrukturen von LBVV.
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Zu
den Nucleinsäuren,
die LBVV-cp-Protein (LBVV-Protein 1), die LBVV-Proteine 2 bis 5
oder das LBVV-L-Protein gemäß der vorliegenden
Erfindung codieren, gehören
eine DNA und eine RNA. Die DNA umfasst eine cDNA und eine chemisch
synthetisierte DNA, und die RNA umfasst eine virale genomische RNA, mRNA
und synthetische RNA. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung
kann vom Fachmann mit Hilfe von herkömmlichen Mitteln hergestellt
werden. Insbesondere eine DNA des ersten Stranges kann synthetisiert werden,
indem man eine reverse Transcriptionsreaktion durchführt und
als Matrize Folgendes verwendet: (1) eine RNA, die durch Deproteinieren
von gereinigtem Virus nach einem Verfahren wie dem SDS-Phenol-Verfahren
hergestellt wird; oder (2) die Gesamtnucleinsäuren, die nach dem CTAB-Verfahren
usw. aus einem virusinfizierten Blatt isoliert wurden, wobei an
einen anhand der Sequenz einer Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung
gestalteten Primer oder einen statistischen Primer verwendete. Aus
der nach diesem Verfahren hergestellten DNA des ersten Stranges
kann eine DNA des zweiten Stranges nach dem Verfahren von Gubler & Hoffman (U. Gubler
und B.J. Hoffman (1983), Gene 25, 263–269) synthetisiert werden,
und die Nucleinsäure der
vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen kommerziell erhältlichen
Plasmiden oder Phagemidvektoren kloniert werden. Alternativ dazu
kann eine DNA, die eine RNA des Virus codiert, durch Polymerase-Kettenreaktion
amplifiziert werden, wobei man einen Primer verwendet, der anhand
der Sequenz einer Nucleinsäure
der vorliegenden Erfindung gestaltet wurde, und die DNA des ersten
Strangs als Matrize verwendet, und die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung
kann durch TA-Klonierung unter Verwendung des pGEM®-T-Vektors
usw. oder durch Klonieren in verschiedenen kommerziell erhältlichen
Plasmidvektoren kloniert werden, indem man eine Restriktionsenzymstelle
zu dem Primer hinzufügt.
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Eine
Nucleinsäure
der vorliegenden Erfindung kann auch für die Herstellung eines rekombinanten
Proteins oder für
die Herstellung von gegen LBVV resistentem Salat verwendet werden.
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Ein
rekombinantes Protein wird gewöhnlich
hergestellt, indem man eine DNA, die ein Protein der vorliegenden
Erfindung codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor einfügt, den
Vektor in eine geeignete Zelle einführt, die transformierten Zellen
kultiviert, die Zellen das rekombinante Protein exprimieren lässt und
das exprimierte Protein reinigt. Ein rekombinantes Protein kann
auch als Fusionsprotein mit anderen Proteinen exprimiert werden,
so dass es sich leicht reinigen lässt, zum Beispiel als Fusionsprotein
mit maltosebindendem Protein in Escherichia coli (New England Biolabs,
USA, Vektor-pMAL-Reihe), als Fusionsprotein mit Glutathion-5-Transferase (GST)
(Amersham Pharmacia Biotech, Vektor-pGEX-Reihe) oder mit Histidin
markiert (Novagen, pET-Reihe). Die Wirtszelle unterliegt keiner
Einschränkung,
solange die Zelle für
die Expression des rekombinanten Proteins geeignet ist. Es ist möglich, neben
der oben erwähnten
E. coli Hefen oder verschiedene Tier-, Pflanzen- oder Insektenzellen
zu verwenden, indem man den Expressionsvektor ändert. Ein Vektor kann nach
einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Verfahren in eine Wirtszelle
eingeführt
werden. Zum Beispiel kann ein Transformationsverfahren unter Verwendung
von Calciumionen (Mandel, M. und Higa, A. (1970), Journal of Molecular
Biology, 53, 158–162,
Hanahan, D. (1983), Journal of Molecular Biology, 166, 557–580) verwendet
werden, um einen Vektor in E. coli einzuführen. Ein in Wirtszellen exprimiertes
rekombinantes Protein kann nach bekannten Verfahren aus den Wirtszellen
oder ihrem Kulturüberstand
isoliert und gereinigt werden. Wenn ein rekombinantes Protein als
Fusionsprotein mit maltosebindendem Protein oder anderen Partnern
exprimiert wird, kann das rekombinante Protein leicht durch Affinitätschromatographie
gereinigt werden.
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Das
resultierende Protein kann verwendet werden, um einen Antikörper herzustellen,
der an das Protein bindet. Zum Beispiel kann ein polyklonaler Antikörper hergestellt
werden, indem man Immuntiere, wie Kaninchen, mit einem gereinigten
Protein der vorliegenden Erfindung oder einem Teil davon immunisiert,
nach einer bestimmten Zeit Blut abnimmt und Gerinnsel entfernt.
Ein monoklonaler Antikörper
kann hergestellt werden, indem man Myelomzellen mit den antikörperbildenden
Zellen von Tieren, die mit dem obigen Protein oder einem Teil davon
immunisiert sind, fusioniert, eine monoklonale Zelle, die einen
gewünschten
Antikörper
exprimiert (Hybridom), isoliert und den Antikörper aus der Zelle gewinnt.
Der erhaltene Antikörper
kann verwendet werden, um ein Protein der vorliegenden Erfindung
zu reinigen oder nachzuweisen. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung
umfasst Antiserum, polyklonalen Antikörper, monoklonalen Antikörper und
ein Fragment davon.
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Im
Falle der Herstellung von LBVV-resistentem Salat sollte eine DNA,
die die Produktion und Funktion von LBVV-Proteinen reprimiert, in
Salatzellen eingeführt
werden, und die resultierenden transformierten Salatzellen sollten
regeneriert werden.
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Eine
DNA, die eine RNA codiert, welche mit einem der beiden Stränge (Sense-Strang oder komplementärer Strang)
einer LBVV-Proteine codierenden RNA hybridisiert, kann als DNA verwendet
werden, die die Produktion und Funktion der LBVV-Proteine reprimiert.
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Beispiele
für eine
DNA, die eine RNA codiert, welche mit einem viralen genomischen
Sense-Strang und mit mRNAs hybridisiert, sind eine DNA, die eine
Antisense-RNA codiert, die zu dem Transcriptionsprodukt einer von
den Erfindern isolierten DNA, die das in einem der Sequenzen SEQ
ID Nr. 2 bis 6 und SEQ ID Nr. 13 beschriebene Protein codiert (vorzugsweise
einer DNA, die einen codierenden Bereich der in SEQ ID Nr. 1 oder
SEQ ID Nr. 12 beschriebenen Nucleotidsequenz umfasst), komplementär ist. Hier
bedeutet der Ausdruck "komplementär" auch "nicht vollständig komplementär", solange die Produktion
von LBVV-Proteinen
effektiv gehemmt werden kann. Die transcribierte RNA weist vorzugsweise
90% oder mehr Komplementarität
und am meisten bevorzugt 95% oder mehr Komplementarität zu der
RNA, die das Ziel-LBVV-Protein codiert, auf. Hier bezieht sich der
Ausdruck "Komplementarität" auf den Prozentanteil
der Zahl von Nucleotiden, die komplementäre Basenpaare bilden, bezogen
auf die Gesamtzahl von Basenpaaren in einem Bereich, wo die beiden
Sequenzen einander entsprechen, und zwar in dem Fall, dass die Sequenzen
so aneinander ausgerichtet werden, dass die Zahl von komplementären Basenpaaren
maximiert ist.
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Die
von den Erfindern isolierte DNA, die eine Sense-RNA codiert, die
zu einem komplementären RNA-Strang,
der das in einem der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und SEQ ID Nr.
13 beschriebene Protein codiert (vorzugsweise einer RNA, die einen
codierenden Bereich der in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 12 beschriebenen
Nucleotidsequenz umfasst), komplementär ist, kann als DNA verwendet
werden, die eine RNA codiert, die mit einem komplementären Strang
viraler genomischer RNA hybridisiert. Hier bedeutet der Ausdruck "komplementär" auch "nicht vollständig komplementär", solange die Produktion
von LBVV-Proteinen effektiv gehemmt werden kann. Die transcribierte
Sense-RNA weist vorzugsweise 90% oder mehr Komplementarität und am
meisten bevorzugt 95% oder mehr Komplementarität zu der RNA (komplementärer Strang),
die das Ziel-LBVV-Protein
codiert, auf.
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Um
die Expression des Zielgens effektiv zu hemmen, sollten die oben
beschriebenen Antisense- und Sense-DNAs wenigstens 15 Nucleotide,
vorzugsweise wenigstens 100 Nucleotide und besonders bevorzugt wenigstens
500 Nucleotide lang sein. Diese DNAs sind im Allgemeinen kürzer als
5 kb und vorzugsweise kürzer
als 2,5 kb.
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Außerdem ist
es wahrscheinlich, dass eine DNA, die ein Ribozym codiert, das wenigstens
einen der Stränge
einer RNA, der LBVV-Proteine codiert, spaltet, als DNA verwendet
werden kann, die die Produktion der LBVV-Proteine reprimiert.
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Ein
Ribozym ist ein RIVA-Molekül,
das katalytische Aktivitäten
aufweist. Es gibt viele Ribozyme mit verschiedenen Aktivitäten. Die
Erforschung der Ribozyme als RNA-spaltende Enzyme ermöglichte
die Gestaltung eines Ribozyms, das RNA ortsspezifisch spaltet. Während einige
Ribozyme des Gruppe-I-Intron-Typs oder die in RNase P enthaltene
M1RNA aus 400 Nucleotiden oder mehr bestehen, haben andere, die
zum Hammerhead-Typ oder Haarnadeltyp gehören, eine Akti vitätsdomäne von etwa
40 Nucleotiden (Makoto Koizumi und Eiko Ohtsuka (1990), Tanpakushitsu
Kakusan Kohso (Nucleic acid, Protein and Enzyme) 35: 2191–2200).
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Die
Selbstspaltungsdomäne
eines Ribozyms des Hammerhead-Typs spaltet auf der 3'-Seite von C15 der
Sequenz G13U14C15. Die Bildung eines Nucleotidpaars zwischen U14
und A auf der neunten Position gilt als wichtig für die Ribozymaktivität. Weiterhin
hat sich gezeigt, dass die Spaltung auch dann erfolgt, wenn das Nucleotid
auf der 15. Position A oder U anstelle von C ist (M. Koizumi et
al. (1988), FEBS Letters, 228: 228–230). Wenn die Substratbindungsstelle
des Ribozyms so gestaltet ist, dass sie komplementär zu den
der Zielstelle benachbarten RNA-Sequenzen ist, kann man ein restriktionsenzymartiges
RNA-spaltendes Ribozym schaffen, das die Sequenz UC, UU oder UA
innerhalb der Ziel-RNA erkennt (M. Koizumi et al. (1988), FEBS Letters,
239: 285; Makoto Koizumi und Eiko Ohtsuka (1990), Tanpakushitsu
Kakusan Kohso (Protein, Nucleic acid and Enzyme), 35: 2191–2200; M.
Koizumi et al. (1989), Nucleic Acids Research, 17: 7059–7071).
Zum Beispiel im LBVV-cp-Gen, in den Genen von LBVV-Protein 2 bis
5 oder im LBVV-L-Gen (SEQ ID Nr. 1 oder 12) gibt es eine Menge von
Stellen, die als Ribozym-Angriffspunkt verwendet werden können.
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Das
Ribozym des Haarnadeltyps ist für
die vorliegende Erfindung ebenfalls geeignet. Ein Ribozym des Haarnadeltyps
findet sich zum Beispiel im Minusstrang der Satelliten-RNA des Tabakringfleckenvirus
(J. M. Buzayan, Nature 323: 349–353
(1986)). Von diesem Ribozym wurde auch gezeigt, dass es RNA zielspezifisch spaltet
(Y. Kikuchi und N. Sasaki (1992), Nucleic Acids Research, 19: 6751–6775; Yo
Kikuchi (1992), Kagaku To Seibutsu (Chemistry and Biology) 30: 112–118).
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Das
zur Spaltung der Zielstelle gestaltete Ribozym wird mit einem Promotor,
wie dem Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor, und mit einer Transcriptionsterminationssequenz
fusioniert, so dass es in Pflanzenzellen transcribiert wird. Wenn
jedoch zusätzliche
Sequenzen an das 5'-Ende
oder das 3'-Ende
der transcribierten RNA angefügt
wurden, kann die Ribozymaktivität
verloren gehen. In diesem Fall kann man ein zusätzliches Trimm-Ribozym platzieren,
das in cis die Funktion ausübt,
auf der 5'- oder
3'-Seite des Ribozymteils
ein Stück
abzuschneiden, um den Ribozymteil genau aus der transcribierten
RNA, die das Ribozym enthält,
herauszuschneiden (K. Taira et al. (1990), Protein Eng. 3: 733–738; A.M.
Dzaianott und J.J. Bujarski (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
4823–4827;
C.A. Grosshands und R.T. Cech (1991), Nucleic Acids Research, 19: 3875–3880; K.
Taira et al. (1991), Nucleic Acid Research, 19: 5125–5130).
Mehrere Stellen innerhalb des Zielgens können gespalten werden, indem
man diese Struktureinheiten in Tandem-Anordnung bringt und dadurch größere Wirkungen
erreicht (N. Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186:
1271–1279
(1992)). Durch Verwendung solcher Ribozyme ist es möglich, die
Transcriptionsprodukte des Zielgens in der vorliegenden Erfindung
spezifisch zu spalten und dadurch die Expression des Gens zu reprimieren.
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Vektoren,
die für
die Transformation von Salatzellen verwendet werden, unterliegen
keiner Einschränkung,
solange der Vektor in den Zellen eine insertierte DNA exprimieren
kann. Zum Beispiel können
Vektoren verwendet werden, die Promotoren für die konstitutive Genexpression
in Salatzellen (z.B. Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor) sowie Promotoren,
die durch exogene Reize induzierbar sind, umfassen. Beispiele für geeignete
Vektoren schließen
den binären
pBI-Vektor ein.
Die "Salatzelle", in die der Vektor
eingeführt
werden soll, umfasst verschiedene Formen von Salatzellen, wie kultivierte
Zellsuspensionen, Protoplasten, Blattabschnitte und Kallus.
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Ein
Vektor kann nach bekannten Verfahren in Salatzellen eingeführt werden,
wie nach dem Polyethylenglycolverfahren, Polykation-Verfahren, Elektroporation,
Agrobacterium-vermittelte Übertragung
und Teilchenbeschuss. Zum Beispiel ist das in der Literatur (S.Z.
Pang et al. (1996), The Plant Journal, 9, 899–909) beschriebene Verfahren
zu bevorzugen.
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Die
Regeneration einer Salatpflanze aus transformierten Salatzellen
kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren je nach Art der Salatzellen
durchgeführt
werden. Beispiele für
zu bevorzugende Regenerationsverfahren sind in der Literatur beschrieben
(S. Enomoto et al. (1990), Plant Cell Reports, 9, 6–9). Sobald eine
transformierte Salatpflanze, in deren Genom die DNA der vorliegenden
Erfindung eingeführt
ist, erhalten wurde, ist es möglich,
Nachkommen der Pflanze durch geschlechtliche Fortpflanzung zu gewinnen.
Alternativ dazu können
auch Pflanzen durch Massenproduktion aus Fortpflanzungsmaterialien
(zum Beispiel Samen, Knollen, Kallus, Protoplasten usw.) gewonnen
werden, die von der Pflanze oder Nachkommen oder Klonen davon erhalten
wurden. Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzenzellen, die mit
der DNA der vorliegenden Erfindung transformiert sind; Pflanzen,
die diese Zellen umfassen; Nachkommen und Klone der Pflanzen; und Fortpflanzungsmaterialien
der Pflanzen und ihrer Nachkommen und Klone.
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Außerdem gibt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren einer
Infektion mit LBVV an. Eine Ausführungsform
des diagnostischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst
das Nachweisen einer LBVV-RNA oder einer RNA, die das virale Protein
codiert, unter Verwendung eines Primers oder einer Sonde. Als Sonde
oder Primer kann eine Nucleinsäure
verwendet werden, die wenigstens 15 Nucleotide umfasst, die zu einer
DNA, die das in einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und 13 beschriebene
LBVV-Protein codiert, homolog oder komplementär ist. Die Nucleinsäure ist
vorzugsweise eine Nucleinsäure,
die spezifisch mit einer DNA hybridisiert, die das in einer der
Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und 13 beschriebene LBVV-Protein codiert.
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Der
Primer oder die Sonde kann markiert sein, falls notwendig. Beispiele
für Marker
schließen
einen radioaktiven Marker ein.
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Bei
dieser Diagnose wird zum Beispiel eine Testprobe aus Salat, von
dem man annimmt, dass er mit dem Breitadernvirus des Salats infiziert
sein könnte,
aus Olpidium, das das Virus beherbergt, oder aus Boden, der das
Virus enthält,
hergestellt, und mit der Probe wird eine PCR unter Verwendung des
obigen Primers oder ein Northern-Blotting unter Verwendung der obigen
Sonde durchgeführt.
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Eine
weitere Ausführungsform
des diagnostischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist ein
Verfahren, das durch das Nachweisen von LBVV-Proteinen unter Verwendung
von Antikörper
gekennzeichnet ist. Der bei dieser Diagnose verwendete Antikörper kann
zum Beispiel durch Synthetisieren eines Peptids unter Verwendung
des antigenen Bereichs, der aufgrund der resultierenden Aminosäuresequenzen
(eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 6 und 13) angenommen wird,
durch Binden des Peptids an ein Trägerprotein, wie KLH oder BSA,
und durch Immunisieren von Kaninchen mit diesem Protein hergestellt
werden. Außerdem kann
der Antikörper
auch durch Markieren von LBVV-Proteinen mit Histidin unter Verwendung
des QIAexpress-Typ-IV-Kits (QIAGEN), durch Exprimieren des markierten
Proteins in E. coli und durch Immunisieren von Kaninchen mit dem
resultierenden Protein produziert werden. Der Antikörper kann
gegebenenfalls markiert werden. Beispiele für Marker schließen einen
Enzymmarker ein. Anstatt den Antikörper selbst direkt zu markieren,
kann der Antikörper
außerdem
auch über
eine Substanz, wie Protein A, die an den Antikörper bindet, markiert werden,
wobei anschließend
das Zielprotein nachgewiesen wird.
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Bei
dieser Diagnose wird eine Testprobe zum Beispiel aus Salat, von
dem man annimmt, dass er mit dem Breitadernvirus des Salats infiziert
sein könnte,
aus Olpidium, das das Virus beherbergt, oder aus Boden, der das
Virus enthält,
hergestellt, und dann wird mit der Probe ein ELISA oder ein Western-Blotting
unter Verwendung des obigen Antikörpers durchgeführt.
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Beste Methode
zur Durchführung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand der Beispiele ausführlich erläutert, soll
aber nicht auf diese beschränkt
sein.
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[Beispiel 1] Klonierung
des Hüllproteingens
des Breitadernvirus des Salats (LBVV)
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Eine
Probe von kontaminiertem Boden aus einem Salatfeld (Kultursorte:
Cisco) in der Präfektur
Kagawa in Japan, das im Jahre 1997 charakteristische Breitadernsymptome
zeigte, wurde genommen. Das Virus wurde in Ruhesporen in trockenem
Boden gehalten, der im Labor aufbewahrt wurde. Cisco, eine Salat-Kultursorte, wurde
für die
Virusreinigung verwendet, und das Virus wurde durch reguläre Übertragung
in Boden eingeimpft.
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Die
Virusreinigung wurde durchgeführt,
indem man das Verfahren von Kuwata et al. (S. Kuwata et al. (1983),
Annals of the Phytopathological Society of Japan, 49, 246–251) modifizierte.
Der erste Schritt des Sedimentierens von Virionen durch Zentrifugation
bei niedriger Geschwindigkeit wurde weggelassen. Die Virusfraktion
wurde durch Behandeln mit 1% Triton-X und 1% Brij-35 und anschließende Cs2SO4-Dichtegradientenzentrifugation
erhalten. Als das nach diesem Reinigungsverfahren erhaltene gereinigte
Virus einer SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
unterzogen wurde, wurde nur eine einzige Bande bei 48 kDa nachgewiesen.
Da durch Elektronenmikroskopie außerdem nur Haufen von LBVV-Partikeln
beobachtet wurden, während
andere Verunreinigungen nicht beobachtet wurden, wurde angenommen,
dass das resultierende Virus eine beträchtlich hohe Reinheit hat.
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Nach
der Behandlung des gereinigten Virus mit Proteinase-K-SDS wurde
eine Extraktion der viralen Nucleinsäure durch Phenol/Chloroform
und Ethanolfällung
durchgeführt.
Die gereinigte virale Nucleinsäure wurde
nach Denaturierung mit Dimethylsulfoxid zur Synthese der cDNA des
ersten Stranges verwendet. Poly(A)+-RNA wurde aus dem virusinfizierten
Salatblatt isoliert, das offensichtliche Breitadernsymptome zeigte, wobei
man den Dynabeads®-mRNA-DIRECTTM-Kit (Dynal®)
verwendete. Eine Synthese der cDNA des ersten Strangs wurde durchgeführt, indem
man eine reverse Transcriptionsreaktion mit SUPER-SCRIPTTM-II-RNase-H–-Reverser-Transcriptase
(Gibco BRL) unter Verwendung eines statistischen Primers oder eines
Oligo-dT-BamHI-Primers durchführte.
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Die
Bestimmung der internen Aminosäuresequenzen
des LBVV-Hüllproteins
wurde in der unten beschriebenen Weise durchgeführt. Nachdem gereinigtes LBVV
einer 12,5%-SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese unterzogen worden war,
wurden die Polypeptide auf eine Nitrocellulosemembran übertragen,
und die interessierende Bande wurde ausgeschnitten, und dann erfolgte
eine Carboxy methylierung und Behandlung mit Lysyl-Endopeptidase.
Nach der Behandlung wurden 38 Peptidfragmente des LBVV-Hüllproteins
durch Umkehrphasen-HPLC erhalten, und die Aminosäuresequenzen von mehreren internen
Peptidfragmenten wurden bestimmt.
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Ein
5LB111-Primer (GARWSITGGGAYGAYGARWSIAC/SEQ ID Nr. 7) und 3LB171-Primer (GCRTCDATRTARTCIACICCIGG/SEQ
ID Nr. 8) wurden auf der Grundlage von ESWDDESTIAMP und NLEVPGVDYIDA
der resultierenden Aminosäuresequenzen
gestaltet. Unter Verwendung dieser Primer und von Takara-Taq (Takara)
wurde eine PCR durchgeführt,
und es wurde ein PCR-Produkt von 274 bp erhalten. Das resultierende PCR-Produkt
wurde unter Verwendung von pGEM®-T
Easy Vector Systems (Promega) kloniert, und seine Nucleotidsequenz
wurde bestimmt.
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Um
die volle Länge
des Hüllproteingens
von LBVV zu bestimmen, wurden 3'RACE
oder 5'RACE unter Verwendung
einer RNA aus dem gereinigten Virus oder einer Poly(A)+-RNA aus
dem LBVV-infizierten Blatt durchgeführt. Im Falle von 3'RACE wurde ein 891-bp-PCR-Produkt
unter Verwendung einer Poly(A)+-RNA aus dem LBVV-infizierten Blatt
erhalten, wobei man den Oligo-dT-BamHI-Primer und den 5LB171-Primer
(AAYYTIGARGTICCIGGIGTIGA/SEQ ID Nr. 9) verwendete. Im Falle von
5'RACE wurde ein
760-bp-PCR-Produkt mit dem 5'RACE
System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (Gibco
BRL), erhalten, wobei man eine RNA aus gereinigtem Virus oder eine
Poly(A)+-RNA aus dem LBVV-infizierten
Blatt verwendete und den 3LB5R4-Primer (GTTTTTGACCCTGATAG/SEQ ID
Nr. 10) und 3LB5R5-Primer (GTCGACTCTAGACACTTGTTGTTTGTCGTG/SEQ ID
Nr. 11) verwendete. Die resultierenden PCR-Produkte wurden unter Verwendung
von pGEM®-T
Easy Vector Systems (Promega) kloniert, und die Nucleotidsequenzen
wurden für wenigstens
sechs Klone oder mehr bestimmt. Außerdem wurden das 500- und
das 700-bp-PCR-Produkt aus dem Bereich in der Nähe des Hüllproteingens unter Verwendung
von gegenseitig überlappenden
virusspezifischen Primern umkloniert. Wenigstens drei Klone wurden
aus jedem Bereich sequenziert, und die Nucleotidsequenz des Hüllproteingens
wurde bestätigt.
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Eine
Sequenz von 1425 Nucleotiden wurde unter Verwendung des obigen Verfahrens
bestimmt. Dieses Gen hatte eine Translationsstartstelle bei Nucleotid
209 und codierte 397 Aminosäuren
(siehe SEQ ID Nr. 1).
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[Beispiel 2] Herstellung
von transformiertem Salat
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(1) Sterilisierung und
Kultivierung von Salatsamen
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Salatsamen
wurden mehrere Sekunden lang in 70% Ethanol eingetaucht, und dann
erfolgte eine Behandlung während
15 Minuten in einer Sterilisationslösung (10% Natriumhypochlorit,
0,05% Tween-20). Dann wurden die Samen mit sterilisiertem Wasser
abgespült,
auf Hyponex-Agar-Medium (hergestellt durch Auflösen von 3,0 g Hyponex-Pulver,
10,0 g Saccharose und 8,0 g Agar in einem Liter destilliertem Wasser
und dann Einstellen des pH-Werts auf 5,8 mit 1 N NaOH) in einer
Pflanzenbox ausgesät
und etwa 2 Wochen lang unter Lichtbedingungen bei 25 bis 28°C wachsen
gelassen, bis das echte Blatt etwa 5 cm erreichte.
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(2) Kultivierung von und
Impfung mit Agrobacterium
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Agrobacterium
wurde in flüssiges
YEB-Medium (hergestellt durch Auflösen von 1,0 g Hefeextrakt,
5,0 g Rinderextrakt, 5,0 g Pepton, 5,0 g Saccharose und 0,5 g MgSO4·7H2O in einem Liter destilliertem Wasser und
dann Einstellen des pH-Werts auf 7,0 mit 1 N NaOH), das 250 μg/ml Streptomycin,
5 μg/ml
Rifampicin und 50 μg/ml
Kanamycin umfasste, eingeimpft und dann über Nacht bei 28°C unter Schütteln kultiviert.
Dann wurde die Agrobacterium-Kulturflüssigkeit in frischem YEB-Medium
(das die oben genannten Antibiotika enthielt) subkultiviert und
zusätzlich
einen Tag lang bei 28°C
unter Schütteln
kultiviert.
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Die
jungen Salatpflanzen, bei denen das echte Blatt auf etwa 5 cm gewachsen
war, wurden auf Kunststoff-Petri-Schalen übergeführt, das echte Blatt wurde
in Stücke
geschnitten, die etwa 5 mm maßen,
und die Stücke
der Blätter
wurden 1 Minute lang in zehnfach verdünnte Agrobacterium-Kulturflüssigkeit
eingetaucht. Dann wurden die Stücke
auf Medium nach Murashige & Skoog
(MS-Medium) (pH 5,8), das 3% Saccharose, 0,5 ppm Benzyladeninphosphat
(BAP), 0,1 ppm Naphthalinessigsäure
(NAA) und 0,8% Agar umfasste, in 15 bis 20 Stücken/Platte angeordnet und
2 Tage lang bei 25°C
unter Bedingungen von 2000 lux cokultiviert. Nach dem Cokultivieren
wurden die Stücke
7 Tage lang unter sterilen Bedingungen in MS-Medium (pH 5,8) kultiviert, das
3% Saccharose, 0,5 ppm BAP, 0,1 ppm NAA, 250 μg/ml Carbenicillin und 0,8%
Agar umfasste.
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(3) Selektion und Kultivierung
von Transformanten
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Nach
einer sterilen Kultur wurden die Stücke auf MS-Medium (pH 5,8),
das 3% Saccharose, 0,5 ppm BAP, 0,1 ppm NAA, 250 μg/ml Carbenicillin,
50 mg/ml Kanamycin und 0,8% Agar umfasste, übertragen und bei 25°C unter Bedingungen
von 2000 lux kultiviert. Die Stücke
wurden etwa alle 2 Wochen subkultiviert, und eine Regeneration wurde
nach etwa 2 bis 3 Monaten aus denjenigen Pflanzen beobachtet, die
mit Agrobacterium geimpft worden waren.
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Die
redifferenzierten Individuen wurden auf MS-Medium (pH 5,8), das
3% Saccharose, 0,3 ppm BAP, 500 μg/ml
Carbenicillin und 0,8% Agar umfasste, übertragen und etwa alle 2 Wochen
subkultiviert. Wenn die redifferenzierten Individuen eine Größe von etwa
3 cm erreichten, wurden Schnittstücke davon eingefügt und in
1/2-faches Agarmedium, das 500 μg/ml
Carbenicillin enthielt, gepflanzt und Wurzeln bilden gelassen.
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(4) Salatakklimatisierung
und Probenahme von Samen
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In
dem Stadium, in dem die redifferenzierten Individuen Wurzeln gebildet
hatten und die Schösslinge bis
1 bis 2 cm gewachsen waren, wurden die Schösslinge abgeschnitten, und
die Schnittstücke
wurden in Vermiculit, das in eine 500-fach verdünnte wässrige Lösung von Hyponex eingetaucht
worden war, gepflanzt und Wurzeln bilden gelassen. Die Pflanzen
wurden akklimatisiert, indem man den Deckel der Pflanzenbox allmählich öffnete und
so für
Belüftung
sorgte. Nachdem sich die Pflanzen ausreichend akklimatisiert hatten,
wurden sie in einem geschlossenen Treibhaus (maximale Lufttemperatur:
30°C, natürlicher
Lichtrhyth mus) dauerhaft in Polypot gepflanzt, der Kureha-Gartenerde
(Kureha engei baido) umfasste. Dann ließ man sie schießen und blühen, und
es wurden Samenproben genommen.
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[Beispiel 3] Klonierung
des LBVV-RNA2-Gens
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Eine
Probe von kontaminiertem Boden aus einem Salatfeld (Kultursorte:
Cisco) in der Präfektur
Kagawa in Japan, das im Jahre 1997 charakteristische Breitadernsymptome
zeigte, wurde genommen. Das Virus wurde in Ruhesporen in trockenem
Boden gehalten, der im Labor aufbewahrt wurde. Cisco, eine Salat-Kultursorte, wurde
für die
Virusreinigung verwendet, und das Virus wurde durch reguläre Übertragung
in Boden eingeimpft.
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Die
Virusreinigung und RNA-Reinigung wurden gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die
Synthese von cDNA und Bestimmung der Nucleotidsequenz erfolgten
im Einklang mit dem Verfahren von C.F. Fazeli & M.A. Rezaian (Journal of General
Virology, 81, 605–615)
unter Verwendung eines Genom-Walking-Verfahrens, bei dem die Sequenz
verlängert
wird, indem man einen Primer für
die Stromabwärtsrichtung
synthetisierte. Zuerst wurde auf der Grundlage von Beispiel 1 ein
virusspezifischer 5LB5R3-Primer (AGCTCTGAACAACGACATG/SEQ ID Nr.
16) hergestellt, und eine erste cDNA wurde mit SUPERSCRIPTTM-II-RNase-H–-Reverser-Transcriptase
unter Verwendung einer RNA aus dem gereinigten LBVV als Matrize
synthetisiert. Dann wurde eine zweite cDNA mit einem Klenow-Fragment
(Takara) unter Verwendung des universellen Primers dN6 (5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNN-3'/SEQ ID Nr. 14) synthetisiert.
Nach der Entfernung von überschüssigem Primer
mit dem GlassMax DNA Isolation Spin Cartridge System (Gibco BRL)
wurden eine PCR durchgeführt,
wobei man den virusspezifischen Primer und einen universellen Primer
(5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC-3'/SEQ ID Nr. 15) verwendete,
und das resultierende PCR-Produkt wurde unter Verwendung von pGEM®-T
Easy Vector Systems kloniert. Dann wurde die Nucleotidsequenz bestimmt.
Dann wurde dasselbe Verfahren viermal wiederholt, wobei bis zu 5177
Nucleotide bestimmt wurden. Die Bestimmung des 3'-Terminus von RNA2 wurde durch 5'RACE durchgeführt (Anmerkung:
da gereinigte LBVV-RNA sowohl einen positiven Strang als auch einen
negativen Strang enthält,
kann nicht nur der 5'-Terminus,
sondern auch der 3'-Terminus
durch 5'RACE bestimmt
werden), und eine Sequenz von 6078 Nucleotiden wurde bestimmt, die Gene
für fünf Proteine
umfasste, die von LBVV codiert wurden (SEQ ID Nr. 1). Weiterhin
wurden die 500- bis 700-bp-Produkte von RNA2 unter Verwendung von
gegenseitig überlappenden
virusspezifischen Primern umkloniert. Wenigstens drei Klone wurden
aus jedem Bereich sequenziert, und die Nucleotidsequenz von RNA2 wurde
bestätigt.
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Eine
Sequenz von 6078 Nucleotiden wurde unter Verwendung des obigen Verfahrens
bestimmt. Dieses Gen codierte fünf
Proteine. Protein 1 (Hüllprotein:
Beispiel 1) hatte eine Translationsstartstelle an Nucleotid 209
und codierte 397 Aminosäuren
(SEQ ID Nr. 2), Protein 2 hatte eine Translationsstartstelle an
Nucleotid 1492 und codierte 333 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 3), Protein
3 hatte eine Translationsstartstelle an Nucleotid 2616 und codierte
290 Aminosäuren
(SEQ ID Nr. 4), Protein 4 hatte eine Translationsstartstelle an
Nucleotid 3842 und codierte 164 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 5), und Protein
5 hatte eine Translationsstartstelle an Nucleotid 4529 und codierte
368 Aminosäuren
(SEQ ID Nr. 6). Als die Homologie der Aminosäuresequenzen mit anderen Viren
verglichen wurde, wurde nur Protein 1 (Hüllprotein) als homolog zu dem
Nucleocapsidprotein (Hüllprotein)
von Viren, die zur Familie Rhabdoviridae gehören, beobachtet.
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[Beispiel 4] Klonierung
des LBVV-Polymerase-Gens
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Eine
Probe von kontaminiertem Boden aus einem Salatfeld (Kultursorte:
Cisco) in der Präfektur
Kagawa in Japan, das im Jahre 1997 charakteristische Breitadernsymptome
zeigte, wurde genommen. Das Virus wurde in Ruhesporen in trockenem
Boden gehalten, der im Labor aufbewahrt wurde. Cisco, eine Salat-Kultursorte, wurde
für die
Virusreinigung verwendet, und das Virus wurde durch reguläre Übertragung
in Boden eingeimpft.
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Die
Virusreinigung wurde in derselben Weise wie bei dem Verfahren zur
Virusreinigung von Beispiel 1 durchgeführt. Die Extraktion von hochreiner
LBVV-RNA wurde in der unten beschriebenen Weise durchgeführt. Nach
der Behandlung des gereinigten Virus mit Proteinase-K-SDS wurde
sie mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Nachdem
die virale Nucleinsäure
dann mit DNase behandelt und mit dem RNaid® Kit
(BIO 101) weiter gereinigt worden war, wurde eine 7,3-kb-RNA von
zwei LBVV-RNAs durch Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel (SeaPlaque
GTG Agarose, FMC) isoliert und für
die Synthese von cDNA verwendet. Die Synthese von cDNA wurde nach
dem Verfahren von P. Froussard (Nucleic Acids Research, 20, 2900) durchgeführt. Kurz
gesagt, eine erste cDNA wurde mit der SUPERSCRIPTTM-II-RNase-H–-Reversen-Transcriptase
unter Verwendung des universellen Primers dN6 (5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNN-3'/SEQ ID Nr. 14) durchgeführt. Dann
wurde eine zweite cDNA mit einem Klenow-Fragment synthetisiert,
eine PCR wurde unter Verwendung eines universellen Primers (5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC-3'/SEQ ID Nr. 15) durchgeführt, und
das resultierende PCR-Produkt wurde unter Verwendung von pGEM®-T
Easy Vector Systems kloniert. Dann wurde die Nucleotidsequenz bestimmt.
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Acht
partielle LBVV-Polymerase-Gen-Fragmente von etwa 500 bp wurden erhalten.
Beide Enden des Polymerase-Gens wurden durch 5'RACE aufgefüllt, und die Lücken zwischen
den Fragmenten wurden durch RT-PCR aufgefüllt, wodurch eine Sequenz von
6793 Nucleotiden bestimmt wurde, die das Polymerase-Gen in voller
Länge (SEQ
ID Nr. 12) enthielt. Weiterhin wurden die 500- bis 700-bp-PCR-Produkte
des Polymerase-Gens unter Verwendung von gegenseitig überlappenden
virusspezifischen Primern umkloniert. Wenigstens drei Klone wurden
aus jedem Bereich sequenziert, und die Nucleotidsequenz des Polymerase-Gens
wurde bestätigt.
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Dieses
Gen codierte 2040 Aminosäuren
mit einer Translationsstartstelle an Nucleotid 337 (SEQ ID Nr. 13).
Als die Homologie der Aminosäuresequenz
mit anderen Viren verglichen wurde, wurde bestätigt, dass das Protein homolog
zu den Polymerasen von Viren ist, die zur Ordnung Mononegavirales
gehören,
insbesondere von Viren, die zur Familie der Rhabdoviridae gehören, und
vier Motive beibehalten hat, die als verantwortlich für die Polymerase-Aktivität gelten.
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Gewerbliche
Anwendbarkeit
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wurden Nucleinsäuren
isoliert, die Proteine von LBVV codieren, und ihre Primärstruktur
wurde aufgeklärt.
Es wurde daher möglich,
eine Salatpflanze, die Resistenz gegen das Virus aufweist, zu produzieren,
indem man die Nucleinsäure
oder ihre Antisense-Nucleinsäure
in Salat exprimiert. Außerdem
wurde es möglich,
eine Diagnose einer Infektion mit LBVV vorzunehmen, indem man die
Nucleinsäure
oder ein davon codiertes Protein nachweist.
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