CA2512644A1 - Gene de resistance a aphis gossypii - Google Patents
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Abstract
La présente invention est relative au clonage du gène Vat intervenant dans l a résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledi t puceron, ainsi qu'à l'identification de nouveaux marqueurs de ce gène.</SDOA B>
Description
GENE DE RESISTANCE A APHIS GOSSYPII
La présente invention est relative à de nouveaux moyens de lutte contre les insectes ravageurs, et notamment contre les pucerons.
Les insectes ravageurs constituent une des préoccupations majeures en agriculture. Outre les dégâts produits par les insectes eux-mémes, l'attaque par ces insectes favorise très souvent la transmission et l'infection des plantes par des maladies bactériennes, virales ou fongiques.
Parmi les ravageurs, les pucerons (également dénommés aphides) sont les plus courants. Il en existe plus de 4000 espèces dont les plus répandues sont lllyzus persicae et Aphis gossypü.
Chaque espèce possède un cycle de vie particulier et un ensemble d'hôtes privilégiés. Les aphides sont des organismes extrêmement dynamiques, qui s'adaptent rapidement aux conditions environnementales. Cette rapide adaptation est essentiellement due aux diverses stratégies reproductives développées par les aphides. Selon les conditions ~ climatiques, les aphides se reproduisent par voie sexuée ou asexuée et sont ovipares ou vivipares. Ils peuvent ou non être ailés, facilitant ainsi leur passage d'une plante à une autre. Grâce à cette grande faculté d'adaptation et de reproduction, l'infestation totale d'une culture en plein champ et a fortiori en serre est extrêmement rapide. Un seul individu donne naissance à un nombre de larves compris entre 40 et 100.
Le puceron du cotonnier ou du melon Aphis gossypü est présent dans l~
plupart des régions du monde à l'exception des plus septentrionales. Il est capable d'effectuer un cycle complet de développement et de se reproduire en moins d'une semaine. Grâce à ses facultés d' adaptation et de reproduction, un grand nombre de générations peut être produit en une saison quelles qu'en soient les conditions climatiques.
Le puceron du melon a un large spectre d'hôtes (environ 700 plantes cultivées ou sauvages dont une cinquantaine en France). Parmi celles-ci, les plus sensibles sont les cucurbitacées dont par exemple le melon, la courgette, le concombre, les malvacées comme le cotonnier ou l'hibiscus et dans une moindre mesure les solanacées et les rutacées comme les agrumes.
Le puceron du melon colonise principalement la face inférieure des feuilles, les bourgeons et jeunes pousses. En puisant dans le phloème ses éléments nutritifs, le puceron détourne les ressources de la plante et l'affaiblit. Les tissus colonisés deviennent chlorotiques, les feuilles s'enroulent sur elles même et le rendement de la photosynthèse diminue. Le puceron sécrète un miellat très riche en sucres servant de substrat à des champignons saprophytes comme la fumagine qui dépose un voile noir sur la feuille réduisant encore les capacités de photosynthèse de la plante et provoquant une forte dépréciation commerciale des légumes et des fruits atteints. De surcroît, le puceron est un
La présente invention est relative à de nouveaux moyens de lutte contre les insectes ravageurs, et notamment contre les pucerons.
Les insectes ravageurs constituent une des préoccupations majeures en agriculture. Outre les dégâts produits par les insectes eux-mémes, l'attaque par ces insectes favorise très souvent la transmission et l'infection des plantes par des maladies bactériennes, virales ou fongiques.
Parmi les ravageurs, les pucerons (également dénommés aphides) sont les plus courants. Il en existe plus de 4000 espèces dont les plus répandues sont lllyzus persicae et Aphis gossypü.
Chaque espèce possède un cycle de vie particulier et un ensemble d'hôtes privilégiés. Les aphides sont des organismes extrêmement dynamiques, qui s'adaptent rapidement aux conditions environnementales. Cette rapide adaptation est essentiellement due aux diverses stratégies reproductives développées par les aphides. Selon les conditions ~ climatiques, les aphides se reproduisent par voie sexuée ou asexuée et sont ovipares ou vivipares. Ils peuvent ou non être ailés, facilitant ainsi leur passage d'une plante à une autre. Grâce à cette grande faculté d'adaptation et de reproduction, l'infestation totale d'une culture en plein champ et a fortiori en serre est extrêmement rapide. Un seul individu donne naissance à un nombre de larves compris entre 40 et 100.
Le puceron du cotonnier ou du melon Aphis gossypü est présent dans l~
plupart des régions du monde à l'exception des plus septentrionales. Il est capable d'effectuer un cycle complet de développement et de se reproduire en moins d'une semaine. Grâce à ses facultés d' adaptation et de reproduction, un grand nombre de générations peut être produit en une saison quelles qu'en soient les conditions climatiques.
Le puceron du melon a un large spectre d'hôtes (environ 700 plantes cultivées ou sauvages dont une cinquantaine en France). Parmi celles-ci, les plus sensibles sont les cucurbitacées dont par exemple le melon, la courgette, le concombre, les malvacées comme le cotonnier ou l'hibiscus et dans une moindre mesure les solanacées et les rutacées comme les agrumes.
Le puceron du melon colonise principalement la face inférieure des feuilles, les bourgeons et jeunes pousses. En puisant dans le phloème ses éléments nutritifs, le puceron détourne les ressources de la plante et l'affaiblit. Les tissus colonisés deviennent chlorotiques, les feuilles s'enroulent sur elles même et le rendement de la photosynthèse diminue. Le puceron sécrète un miellat très riche en sucres servant de substrat à des champignons saprophytes comme la fumagine qui dépose un voile noir sur la feuille réduisant encore les capacités de photosynthèse de la plante et provoquant une forte dépréciation commerciale des légumes et des fruits atteints. De surcroît, le puceron est un
2 PCT/FR2004/000050 vecteur de nombreux virus qu'il introduit directement dans le phloème de la plante lorsqu'il en pique les vaisseaux.
La lutte chimique est actuellement encore la plus répandue. Elle présente toutefois de nombreux inconvénients. Les produits utilisés ont fréquemment un spectre d'action large, et détruisent en même temps que les pucerons les insectes bénéfiques. Les risques de pollution de l'environnement sont également importants : les aphicides font en effet partie des produits les plus toxiques pour l'homme, la faune utile et l'environnement (Recueil des effets non intentionnels des produits phytosanitaires, Acta 1998, 256p, BERGER et VAN HOLST, 2001, environ. Sci. Pollut. Res. Int., 8, 109-112). Par ailleurs, le puceron Aphis gossypü a développé dans certaines régions des résistances aux composés chimiques employés comme les organophosphates, les carbamates, les pyrethroïdes et organochlorés (LARRY et al. the Journal of Cotton Science, 5, 22-29, 2001 ;
DELORME
Pesticide Science, 49, 90-96, 1997).
La lutte biologique consiste à utiliser les prédateurs et parasites naturels d'Aphis gossypü comme par exemple les coccinelles, certains héminoptères ou les champignons pathogènes. Elle n'est toutefois utilisable que pour les cultures sous serre.
Une autre approche repose sur la recherche de variétés naturellement résistantes aux pucerons, et sur leur utilisation pour l'amélioration variétale et la création d'hybrides.
Des variétés résistantes aux pucerons ont ainsi été trouvées notamment chez le blé, le pommier, le pois fourrager, la laitue, la tomate, etc. ..
Chez le melon (Cucumis melo), l'existence d'un locus dominant conférant une résistance au puceron Aphis gossypü, a été découverte chez des lignées de melons originaires d'Extrême-Orient ou d'Inde. Ce locus, qui a été dénommé Ag (pour Aphis gossypü Resistance) ou hat (pour Virus Aphid Transmission Resistance) confère un double phénotype de résistance : une résistance à l'infestation de la plante par Aphis gossypü, et une résistance à la transmission par ce puceron des virus dont il est le vecteur (KISHABA et al., J. Econ. Entomol., 64, 935-937, 1971 ; BOHN et al., J. Amer.
Soc. Hort.
Science, 98, 37-40, 1973 ; LECOQ et al., Phytopathology, 69, 1223-1225, 1979 ;
PITRAT
et LECOQ, Phytopathology, 70, 958-961, 1980).
Le locus hat favorable à la résistance a été introduit par croisement dans différentes variétés de melon commercialisées ; cependant, la création de variétés de melon résistantes aux pucerons par les techniques usuelles d'amélioration variétale demeure longue et coûteuse.
Il appaxaît donc souhaitable d'identifier précisément et de cloner le gène vat, afin de permettre notamment
La lutte chimique est actuellement encore la plus répandue. Elle présente toutefois de nombreux inconvénients. Les produits utilisés ont fréquemment un spectre d'action large, et détruisent en même temps que les pucerons les insectes bénéfiques. Les risques de pollution de l'environnement sont également importants : les aphicides font en effet partie des produits les plus toxiques pour l'homme, la faune utile et l'environnement (Recueil des effets non intentionnels des produits phytosanitaires, Acta 1998, 256p, BERGER et VAN HOLST, 2001, environ. Sci. Pollut. Res. Int., 8, 109-112). Par ailleurs, le puceron Aphis gossypü a développé dans certaines régions des résistances aux composés chimiques employés comme les organophosphates, les carbamates, les pyrethroïdes et organochlorés (LARRY et al. the Journal of Cotton Science, 5, 22-29, 2001 ;
DELORME
Pesticide Science, 49, 90-96, 1997).
La lutte biologique consiste à utiliser les prédateurs et parasites naturels d'Aphis gossypü comme par exemple les coccinelles, certains héminoptères ou les champignons pathogènes. Elle n'est toutefois utilisable que pour les cultures sous serre.
Une autre approche repose sur la recherche de variétés naturellement résistantes aux pucerons, et sur leur utilisation pour l'amélioration variétale et la création d'hybrides.
Des variétés résistantes aux pucerons ont ainsi été trouvées notamment chez le blé, le pommier, le pois fourrager, la laitue, la tomate, etc. ..
Chez le melon (Cucumis melo), l'existence d'un locus dominant conférant une résistance au puceron Aphis gossypü, a été découverte chez des lignées de melons originaires d'Extrême-Orient ou d'Inde. Ce locus, qui a été dénommé Ag (pour Aphis gossypü Resistance) ou hat (pour Virus Aphid Transmission Resistance) confère un double phénotype de résistance : une résistance à l'infestation de la plante par Aphis gossypü, et une résistance à la transmission par ce puceron des virus dont il est le vecteur (KISHABA et al., J. Econ. Entomol., 64, 935-937, 1971 ; BOHN et al., J. Amer.
Soc. Hort.
Science, 98, 37-40, 1973 ; LECOQ et al., Phytopathology, 69, 1223-1225, 1979 ;
PITRAT
et LECOQ, Phytopathology, 70, 958-961, 1980).
Le locus hat favorable à la résistance a été introduit par croisement dans différentes variétés de melon commercialisées ; cependant, la création de variétés de melon résistantes aux pucerons par les techniques usuelles d'amélioration variétale demeure longue et coûteuse.
Il appaxaît donc souhaitable d'identifier précisément et de cloner le gène vat, afin de permettre notamment
3 PCT/FR2004/000050 - de transférer l'allèle Yat favorable à la résistance, par transgenèse, à des variétés de melon sensibles à Aphis gossypü, et également à d'autres espèces sensibles à ce puceron et pour lesquelles aucune résistance naturelle n'a été détectée, telles que par exemple la courgette, le concombre ou le cotonnier ; l'allèle du gène hat favorable à la résistance peut aussi être transféré dans des espèces de plantes sensibles à
la transmission virale par les pucerons, comme par exemple les solanacées, notamment la tomate ;
- de rechercher des orthologues du gène hat chez d'autres espèces que le melon ;
- de définir de nouveaux marqueurs, utilisables notamment dans le cadre des techniques classiques de sélection variétale, pour faciliter l'identification de variétés résistantes, et/ou le suivi de l'introgression du caractère de résistance dans des variétés d'intérêt agronomique.
Le gène T~at a été localisé sur le chromosome V du melon en position sub-télomérique (PERIN et al., Theor Appl Genet, 104, 1017-1034, 2002).
Plusieurs séquences homologues à des gènes de résistance ont été cartographiées dans cette région (KLINGER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126, 56-63, 2001 ; BROTMAN et al., Theor.
Apl. Genet., 104, 1055-1063, 2002), ce qui permet de supposer que le gène fat appartient à la superfamille des NBS-LRR, dont font partie un grand nombre de gènes de résistance actuellement clonés.
Cette superfamille regroupe des gènes contenant un site de liaison à un nucléotide (NBS pour nucleotide binding site) et des séquences répétées riches en leucine (LRR pour leucine-rich repeats). Il a été observé que des séquences homologues à des NBS-LRR étaient liées au locus hat (KLINGLER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126, 56-63, 2001). Parmi ces homologues de gènes de résistance, NBS-2, NBS46-7, NBSSa et NBSSb ont été localisés respectivement à 4,75, 7,5, 10 et 11 cM de Yat ;
cependant, aucune d'entre elles ne coségrège avec le locus Yat (BROTMAN et al., Theor.
Appl.
Genet., 104, 1055-1063, 2002).
Les Inventeurs ont construit une banque BAC (bacterial artificial chromosome) à partir d'ADN génomique de melon homozygote pour l'allèle Pat favorable à la résistance à Aphis gossypü et à la résistance à la transmission virale par ce vecteur. Ils ont parallèlement défini des marqueurs encadrant plus précisément le locus hat que les marqueurs connus dans l'art antérieur. Le criblage de la banque BAC à l'aide de ces marqueurs a permis d'identifier des clones portant la totalité du locus Yat.
Le sous-clonage de l'un de ces clones a permis d'obtenir un fragment d'ADN génomique de 11000 pb environ contenant le gène hat. La séquence de ce fragment est représentée sur la Figure 1 (les 4 exons sont surlignés en gris et les 3 introns sont soulignés), ainsi que dans la liste de séquences en annexe sous le numéro
la transmission virale par les pucerons, comme par exemple les solanacées, notamment la tomate ;
- de rechercher des orthologues du gène hat chez d'autres espèces que le melon ;
- de définir de nouveaux marqueurs, utilisables notamment dans le cadre des techniques classiques de sélection variétale, pour faciliter l'identification de variétés résistantes, et/ou le suivi de l'introgression du caractère de résistance dans des variétés d'intérêt agronomique.
Le gène T~at a été localisé sur le chromosome V du melon en position sub-télomérique (PERIN et al., Theor Appl Genet, 104, 1017-1034, 2002).
Plusieurs séquences homologues à des gènes de résistance ont été cartographiées dans cette région (KLINGER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126, 56-63, 2001 ; BROTMAN et al., Theor.
Apl. Genet., 104, 1055-1063, 2002), ce qui permet de supposer que le gène fat appartient à la superfamille des NBS-LRR, dont font partie un grand nombre de gènes de résistance actuellement clonés.
Cette superfamille regroupe des gènes contenant un site de liaison à un nucléotide (NBS pour nucleotide binding site) et des séquences répétées riches en leucine (LRR pour leucine-rich repeats). Il a été observé que des séquences homologues à des NBS-LRR étaient liées au locus hat (KLINGLER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126, 56-63, 2001). Parmi ces homologues de gènes de résistance, NBS-2, NBS46-7, NBSSa et NBSSb ont été localisés respectivement à 4,75, 7,5, 10 et 11 cM de Yat ;
cependant, aucune d'entre elles ne coségrège avec le locus Yat (BROTMAN et al., Theor.
Appl.
Genet., 104, 1055-1063, 2002).
Les Inventeurs ont construit une banque BAC (bacterial artificial chromosome) à partir d'ADN génomique de melon homozygote pour l'allèle Pat favorable à la résistance à Aphis gossypü et à la résistance à la transmission virale par ce vecteur. Ils ont parallèlement défini des marqueurs encadrant plus précisément le locus hat que les marqueurs connus dans l'art antérieur. Le criblage de la banque BAC à l'aide de ces marqueurs a permis d'identifier des clones portant la totalité du locus Yat.
Le sous-clonage de l'un de ces clones a permis d'obtenir un fragment d'ADN génomique de 11000 pb environ contenant le gène hat. La séquence de ce fragment est représentée sur la Figure 1 (les 4 exons sont surlignés en gris et les 3 introns sont soulignés), ainsi que dans la liste de séquences en annexe sous le numéro
4 PCT/FR2004/000050 SEQ ~ NO: 1. La séquence de l'ADNc correspondant a également été obtenue et la séquence polypeptidique correspondante a été déterminée. Ces séquences d'ADNc et polypeptidique sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3.
Un paralogue du gène Tlat, ci-après dénommé Yat-litre a également été
isolé à partir de la banque BAC. La séquence de ce gène hat-litre est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4. La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique déduite sont respectivement représentées en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6.
La Figure 2 montre l'alignement de séquence entre l'ADNc de Irat et l'ADNc de vat-litre. L'ADNc de hat comprend 4422 pb alors que l'ADNc de hat litre ne comprend que 4233 pb du fait d'une délétion de 195 pb localisée entre les positions 3014 et 3210 de la séquence de T~at et d'une addition de 6 pb localisée entre les positions 3649 et 3656 de la séquence de Yat-litre. Les séquences de Tlat et Trat litre présentent 92,4%
d'identité entre elles.
La Fïgure 3 montre l' alignement des séquences des protéines VAT et VAT-litre déduites qui se composent respectivement de 1473 acides aminés et 1410 acides aminés. Les séquences de VAT et VAT-litre présentent environ 90% d'identité
entre elles.
Le gène Yat et Yat-litre sont liés génétiquement et physiquement (séparés de 17 kb). Des plantes recombinantes entre vat et Yat-litre ont été
identifiées par analyse génétique. Les plantes portant uniquement le gène Yat-litre sont sensibles à
la colonisation et à la transmission des virus par A. gossypü. Au contraire, les plantes portant uniquement le gène Yat sont résistantes à la colonisation et à la transmission des virus par A. gossypü.
Donc, le gène Yat est nécessaire et suffisant pour conférer le double phénotype décrit précédemment.
La présente invention a pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi a) un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ;
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ;
c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b).
Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité de séquence indiqués ici pour les séquences nucléotidiques ou peptidiques se réfèrent à la valeur obtenue, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence, avec la suite logicielle BLAST (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997) en
Un paralogue du gène Tlat, ci-après dénommé Yat-litre a également été
isolé à partir de la banque BAC. La séquence de ce gène hat-litre est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4. La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique déduite sont respectivement représentées en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6.
La Figure 2 montre l'alignement de séquence entre l'ADNc de Irat et l'ADNc de vat-litre. L'ADNc de hat comprend 4422 pb alors que l'ADNc de hat litre ne comprend que 4233 pb du fait d'une délétion de 195 pb localisée entre les positions 3014 et 3210 de la séquence de T~at et d'une addition de 6 pb localisée entre les positions 3649 et 3656 de la séquence de Yat-litre. Les séquences de Tlat et Trat litre présentent 92,4%
d'identité entre elles.
La Fïgure 3 montre l' alignement des séquences des protéines VAT et VAT-litre déduites qui se composent respectivement de 1473 acides aminés et 1410 acides aminés. Les séquences de VAT et VAT-litre présentent environ 90% d'identité
entre elles.
Le gène Yat et Yat-litre sont liés génétiquement et physiquement (séparés de 17 kb). Des plantes recombinantes entre vat et Yat-litre ont été
identifiées par analyse génétique. Les plantes portant uniquement le gène Yat-litre sont sensibles à
la colonisation et à la transmission des virus par A. gossypü. Au contraire, les plantes portant uniquement le gène Yat sont résistantes à la colonisation et à la transmission des virus par A. gossypü.
Donc, le gène Yat est nécessaire et suffisant pour conférer le double phénotype décrit précédemment.
La présente invention a pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi a) un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ;
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ;
c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b).
Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité de séquence indiqués ici pour les séquences nucléotidiques ou peptidiques se réfèrent à la valeur obtenue, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence, avec la suite logicielle BLAST (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997) en
5 PCT/FR2004/000050 utilisant les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité
de la séquence de référence.
On définit comme polynucléotide « codant pour » un polypeptide donné, tout polynucléotide contenant l'information génétique permettant la synthèse dudit polypeptide.
Ainsi, des polynucléotides conformes à (invention codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis g~ssypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron, comprennent notamment le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 et le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2.
La présente invention inclut également tout fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 20 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 50 pb d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus. Des fragments préférés sont ceux d'un quelconque des polynucléotides de séquence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5 ou ceux capables de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec l'un de ces polynucléotides ou son complémentaire.
D'autres fragments préférés sont ceux de l'un quelconque des polynucléotides SEQ ID NO
: 1 ou SEQ ID NO : 2, qui ne sont pas présents dans les polynucléotides SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5, ou des fragments qui sont capables de s'hybrider sélectivement avec l'un des polynucléotides SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, sans s'hybrider avec les polynucléotides SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5.
Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métïer en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5°C à 10°C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son complémentaire.
On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) conforme à (invention tout polynucléotide qui lorsqu'il est hybridé en conditions stringentes avec une banque d'acide nucléique de melon (notamment une banque d'ADN génomique ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucléotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour d'autres protéines de la famille NBS-LRR.
de la séquence de référence.
On définit comme polynucléotide « codant pour » un polypeptide donné, tout polynucléotide contenant l'information génétique permettant la synthèse dudit polypeptide.
Ainsi, des polynucléotides conformes à (invention codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis g~ssypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron, comprennent notamment le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 et le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2.
La présente invention inclut également tout fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 20 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 50 pb d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus. Des fragments préférés sont ceux d'un quelconque des polynucléotides de séquence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5 ou ceux capables de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec l'un de ces polynucléotides ou son complémentaire.
D'autres fragments préférés sont ceux de l'un quelconque des polynucléotides SEQ ID NO
: 1 ou SEQ ID NO : 2, qui ne sont pas présents dans les polynucléotides SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5, ou des fragments qui sont capables de s'hybrider sélectivement avec l'un des polynucléotides SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, sans s'hybrider avec les polynucléotides SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5.
Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métïer en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5°C à 10°C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son complémentaire.
On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) conforme à (invention tout polynucléotide qui lorsqu'il est hybridé en conditions stringentes avec une banque d'acide nucléique de melon (notamment une banque d'ADN génomique ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucléotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour d'autres protéines de la famille NBS-LRR.
6 PCT/FR2004/000050 La présente invention a également pour objet des sondes polynucléotidiques ou des amorces d'amplification obtenues à partir de polynucléotides a) ou b) conformes à l'invention ou des fragments de ceux-ci.
La présente invention englobe également tout polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à
la transmission virale par ledit puceron, et pouvant être obtenu à partir d'une banque d'ADN
génomique ou d'ADNc de plante par criblage de ladite banque à l'aide de sondes ou d'amorces conformes à (invention.
Ceci inclut notamment d'autres allèles du gène Irat de melon, et notamment d'autres allèles capables de conférer une résistance au puceron Aphis gossypü
et/ou à la transmission virale par ledit puceron, ainsi que des orthologues du gène Yat chez des plantes autres que le melon, notamment chez d'autres cucurbitacées telles que la courgette et le concombre, et de manière plus générale chez des plantes susceptibles d'être infectées par Aphis gossypü (par exemple des malvacées comme le cotonnier) et/ou sensibles à la transmission virale par ledit puceron (par exemple des solanacées comme la tomate).
La présente invention englobe également des marqueurs génétiques permettant la détection de la présence ou de l'absence chez une plante, et notamment chez le melon, d'un allèle du gène Yat favorable à la résistance à la colonisation par le puceron Aphis gossypü et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
Des marqueurs génétiques conformes à l'invention, comprennent notamment les marqueurs suivants : L273, L246, V681, V 1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, marqueur D.
Les marqueurs E et D sont plus particulièrement utilisables pour différencier les gènes Irat et Tlat-like chez PI161375.
Ces marqueurs sont utilisables notamment chez les cucurbitacées, en particulier le melon. Ils peuvent également être utilisés chez d'autres plantes, par exemple des malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus ou des solanacées telles que la tomate.
Les marqueurs conformes à (invention sont respectivement définis par les amorces suivantes F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8) F2-B2 Eco : ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) F2 Eco : GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10)
La présente invention englobe également tout polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à
la transmission virale par ledit puceron, et pouvant être obtenu à partir d'une banque d'ADN
génomique ou d'ADNc de plante par criblage de ladite banque à l'aide de sondes ou d'amorces conformes à (invention.
Ceci inclut notamment d'autres allèles du gène Irat de melon, et notamment d'autres allèles capables de conférer une résistance au puceron Aphis gossypü
et/ou à la transmission virale par ledit puceron, ainsi que des orthologues du gène Yat chez des plantes autres que le melon, notamment chez d'autres cucurbitacées telles que la courgette et le concombre, et de manière plus générale chez des plantes susceptibles d'être infectées par Aphis gossypü (par exemple des malvacées comme le cotonnier) et/ou sensibles à la transmission virale par ledit puceron (par exemple des solanacées comme la tomate).
La présente invention englobe également des marqueurs génétiques permettant la détection de la présence ou de l'absence chez une plante, et notamment chez le melon, d'un allèle du gène Yat favorable à la résistance à la colonisation par le puceron Aphis gossypü et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
Des marqueurs génétiques conformes à l'invention, comprennent notamment les marqueurs suivants : L273, L246, V681, V 1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, marqueur D.
Les marqueurs E et D sont plus particulièrement utilisables pour différencier les gènes Irat et Tlat-like chez PI161375.
Ces marqueurs sont utilisables notamment chez les cucurbitacées, en particulier le melon. Ils peuvent également être utilisés chez d'autres plantes, par exemple des malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus ou des solanacées telles que la tomate.
Les marqueurs conformes à (invention sont respectivement définis par les amorces suivantes F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8) F2-B2 Eco : ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) F2 Eco : GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10)
7 PCT/FR2004/000050 V681 : GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11) V681R : GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) V588 : CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) VSS1R : GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14) V432 : AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15) V432R : TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) GRP805 : ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17) GRP805R : AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18) M8:
M8 : CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) M8R : TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Marqueur E
LRRl : CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21) LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) Marqueur D
LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) LRR1R : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24) D'autres marqueurs génétiques de résistance au puceron A. gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron peuvent également être définis à
partir des séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, en comparant ces séquences avec leurs homologues obtenus à partir de plantes sensibles à A. gossypü et/ou à la transmission virale par ce puceron, afin de détecter les polyrnorphismes existant entre ces séquences, et de déterminer la forme associée à la résistance et la forme associée à la sensibilité.
Ces polymorphismes peuvent être situés dans les régions codantes du gène Yat, et se traduire par des modifications de la séquence peptidique de la protéine VAT. Il peut également s'agir de polyrnorphismes situés dans la région 5' non codante ou dans les introns du gène Irat, ou de polymorphismes situés dans les régions codantes mais ne se~traduisant pas par une modification de séquence de la protéine VAT.
Lorsqu'un polymorphisme a été ainsi identifié, il est possible de l'utiliser comme marqueur génétique de résistance ou de sensibilité, et de définir des outils (sondes d'acide nucléique, amorces d'amplification, enzymes de restriction) permettant de distinguer ses différentes formes.
La présente invention englobe également l'utilisation d'au moins un polynucléotide ou d'au moins un marqueur génétique conforme à l'invention pour la
M8 : CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) M8R : TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Marqueur E
LRRl : CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21) LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) Marqueur D
LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) LRR1R : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24) D'autres marqueurs génétiques de résistance au puceron A. gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron peuvent également être définis à
partir des séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, en comparant ces séquences avec leurs homologues obtenus à partir de plantes sensibles à A. gossypü et/ou à la transmission virale par ce puceron, afin de détecter les polyrnorphismes existant entre ces séquences, et de déterminer la forme associée à la résistance et la forme associée à la sensibilité.
Ces polymorphismes peuvent être situés dans les régions codantes du gène Yat, et se traduire par des modifications de la séquence peptidique de la protéine VAT. Il peut également s'agir de polyrnorphismes situés dans la région 5' non codante ou dans les introns du gène Irat, ou de polymorphismes situés dans les régions codantes mais ne se~traduisant pas par une modification de séquence de la protéine VAT.
Lorsqu'un polymorphisme a été ainsi identifié, il est possible de l'utiliser comme marqueur génétique de résistance ou de sensibilité, et de définir des outils (sondes d'acide nucléique, amorces d'amplification, enzymes de restriction) permettant de distinguer ses différentes formes.
La présente invention englobe également l'utilisation d'au moins un polynucléotide ou d'au moins un marqueur génétique conforme à l'invention pour la
8
9 PCT/FR2004/000050 détection de la présence, chez une plante, d'un allële du gène hat favorable à
la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
La présente invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation de la résistance ou de la sensibilité d'une plante au puceron Aphis gossypü, et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène vat présente chez ladite plante.
La présente invention a également pour objet des amorces oligonucléotidiques utilisables pour la mise en oeuvre des méthodes de détection définies ci-dessus.
En particulier la présente invention a pour objet - tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène TTat comprenant au moins un polymorphisme associé à la résistance ou la sensibilité à
Aphis gossypü etlou à la transmission virale par ledit puceron ;
- tout couple d'amorces permettant l'amplification de l'un des marqueurs L273, L246, V681, V1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, ou marqueur D, mentionnés ci-dessus.
Lâ présente invention a également pour objet des kits pour la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'invention. Ces kits comprennent au moins un couple d'amorces conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs permettant la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification, à des moyens de détection du produit d'amplification, à une ou plusieurs enzymes de restriction, etlou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'amplification.
La présente invention a aussi pour objet - une cassette d'expression comprenant un polynucléotide conforme à
l'invention, et notamment un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au 'puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
- un vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte approprié, d'un polynucléotide ou d'une cassette d'expression conforme à
l'invention.
La présente invention englobe également un procédé de production d'un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte, procaryote ou eucaryote, par un polynucléotide conforme à l'invention côdant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à
la transmission virale par ledit puceron, et la récupération dudit polypeptide produit par ladite cellule.
La présente invention a aussi pour objet un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de rrianière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3, ainsi que des fragments d'au moins 5, de préférence au moins 10, et de manière tout à fait préférée au moins 15 acides aminés consécutifs dudit polypeptide.
La présente invention englobe aussi des cellules-hôtes génétiquement transformées par un polynucléotide ou une cassette d'expression conforme à
(invention.
Les cellules hôtes peuvent être des cellules eucaryotes ou procaryotes. A
titre d'exemples on citera des bactéries, notamment E. coli ou Agrobacterium, des levures, par exemple Saccharomyces, des cellules animales ou, préférentiellement, des cellules végétales.
La présente invention englobe également des plantes transgéniques génétiquement transformées par un polynucléotide conforme à l'invention.
Les techniques classiques de construction de vecteurs recombinants, de transformation de cellules ou d'organismes hôte, et de production de protéines recombinantes, sont utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention.
Le choix du vecteur-hôte, et des séquences de régulation de l'expression seront effectuées en fonction de la cellule hôte ou de l'organisme hôte choisi et de l'application envisagée.
La transformation génétique de plantes par un polynucléotide conforme à
l'invention permet l'obtention de plantes transgéniques résistantes au puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention, pour augmenter la résistance d'une plante au puceron Aphis gossypü.
La présente invention a ainsi plus particulièrement pour objet un procédé
de production d'une plante transgénique résistante au puceron Aphis gossypü
et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation génétique de ladite plante par un polynucléotide conforme à l'invention.
Ladite plante est avantageusement choisie parmi les espèces sensibles à
Aphis gossypü, notamment parmi les cucurbitacées telles que le melon, le concombre ou la courgette, ou les malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus, ou parmi les espèces sensibles aux virus transmis par A. gossypü, notamment parmi les solanacées telles que la tomate ou le piment.
En outre, la sur-expression du gène T~at à un niveau élevé peut conduire à
une résistance constitutive de la plante contre des agents pathogènes plus variés chez le melon ou dans d'autres espèces végétales (cucurbitacées, solanacées ou malvacées). Par exemple, cette sur-expression peut permettre à la plante de reconnaitre des pucerons WO 2004/072109 1~ PCT/FR2004/000050 phylogénétiquement éloignés de Aphis gossypü ou de conférer une résistance constitutive faible qui retardera le cycle infectieux des agents pathogènes en général.
Pour cela, on peut produire des plantes transgéniques qui expriment le gène Yat sous contrôle d'un promoteur fort (35S) et donc qui l'exprimeront à un niveau supérieur à celui qu'il a lorsqu'il est sous contrôle de son propre promoteur. Cependant, il faudra nécessairement contrôler l'expression du gène à son plus juste niveau afin d'éviter des effets néfastes sur la biologie de la plante (mort cellulaire par exemple).
La transformation génétique des plantes peut être effectuée par les méthodes classiques connues en elles-mêmes de l'homme du métier.
A titre d'exemples non limitatifs, pour la transformation des cucurbitacées et notamment du melon, on pourra utiliser les techniques décrites par GUIS
et al. (Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 15, 289-31 l, 1998 ;
Scientia horticulturae, 84, 91-99, 2000). Pour la transformation du cotonnier on pourra utiliser les techniques décrites par PANNETIER et al. (Euphytica, 96, 163-166, 1997). Pour la transformation de la tomate, il est possible d'utiliser les protocoles décrits par HAMZA et CHUPEAU (J. Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993).
Alternativement, des plantes possédant une résistance accrue au puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron, peuvent être obtenues par mutagenèse dirigée, afin d'introduire dans l'allèle du géne ï~at présent chez lesdites plantes les modifications nécessaires pour conférer cette résistance.
Des méthodes de mutagenèse dirigée utilisables dans le cadre de la présente invention sont connues en elles-mêmes de l'homme du métier ; elles sont par exemples décrites dans l'ouvrage de D. TAGU (eds 1NRA 1999).
L'invention concerne également les plantes transformées obtenues par un procédé de transgenèse ou de mutagenèse dirigée conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes. L'invention englobe également les produits obtenus à partir de ces plantes, tels qu'organes ou tissus végétaux, cellules, semences etc.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la définition de marqueurs associés au gène Irat, le clonage de ce gène et l'utilisation dudit gène pour obtenir des plantes résistantes au puceron A. gossypü et/ou à la transmission virale.
EXEMPLE 1: IDENTIFICATION DU GENE T~AT PAR UNE APPROCHE
GENETIQUE
- Création de la bangue BAC
Une banque BAC d'ADN génomique de melon (variété PI 161375 résistante à Aphis gossypü et à la transmission virale par ce puceron) représentant environ 29 équivalents génome a été construite. La première partie de la banque BAC
comporte 66048 clones (ADN digéré par BamHI, Hindlll), la seconde 56448 clones (ADN
digéré par EcoR~.
- Criblage de la bangue BAC et choix du clone BAC porteur du locus T~at Afin d'identifier le clone porteur du gène Yat, la banque a été criblée à
l'aide de marqueurs flanquant le locus Yat. Plusieurs clones BAC couvrant le locus vat ont été identifiés et ordonnés. A partir de ces clones BAC de nouveaux marqueurs ont été
générés. Le clone BAC 3.18.9 porteur d'une insertion de 170 kb comprenant le locus Yat a été choisi pour l'identification du gène hat et séquencé. Ce clone comprend les marqueurs L273 et L246 encadrant le locus Yat. Dix plantes recombinantes sur 6000 plantes issues d'une population backcross [(Védrantais(sensible) x PI 161375 (résistant)) x Védrantais]
ont été identifiées entre le marqueur L273 et le gène T~at, alors qu'une seule a été identifiée entre le marqueur L246 et le gène Yat.
Le marqueur L273 est défini par les amorces:
F2-B2 :GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) et F2-Br :TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8) Le produit d'amplification obtenu à partir d'ADN génomique de la variété Védrantais (Vilmorin) (sensible à Aphis gossypü) ou de la variété PI
(accession d'origine coréenne multipliée par l'1NR.A) (résistante à A.
gossypü) a une longueur de 210 pb. Le produit d'amplification possède un site de restriction BsiWI dans la variété PI 161375 conduisant à l'obtention de deux fragments de 181 pb et 29 pb. En revanche, la digestion par l'enzyme BsrGI restreint l'amplifiat de Védrantais en trois fragments : 153 pb, 28 pb et 29 pb et celui de PI 161375 en deux fragments de 182 pb et 28 pb.
Le marqueur L246 est défini par les amorces:
F2-B2 Eco:ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) et F2 Eco:GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 173 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme EcoRh conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 144 pb et 29 pb.
A partir du clone BAC 3-18-9 possédant les deux marqueurs L273 et L246, des oligonucléotides (Tableau 1) ont été désignés'dans la région comprise entre ces deux marqueurs afin d'en réduire l'intervalle et de délimiter précisément le gène hat.
Le marqueur V432 est défini par les amorces:
V432:AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO: 15) et V432R:TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 432pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme HaeII
conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 223 pb et 209 pb.
Ce site de restriction est absent chez la variété Védrantais.
Le marqueur V681 est défini par les amorces V681: GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ 117 NO : 11) et V681R: GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 681 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède deux sites de restriction pour l'enzyme Rsal conduisant à l'obtention de trois fragments respectivement de 435 pb, 221 pb et 25 pb. Ces sites de restriction sont absents chez la variété Védrantais.
Le marqueur V 1684 est défini par les amorces V588 :CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) et VSS1R :GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14) Le fragment amplifié dans la variété Védrantais mesure environ 1300 pb tandis que dans la variété PI161375, l'amplifiat mesure 1684 pb. Il s'agit dans ce cas, d'un polymorphisme de taille.
Ces marqueurs, ainsi que les marqueurs D, E, et M8 (cf. exemple 4 ci-dessous) et les oligonucléotides les définissant sont indiqués dans le Tableau 1 ci-après TahlPai i 1 MarqueursOligonuclotides5' Squence oligonuclotide 3' L273 F2-B2 GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO
: 7) F2-Br TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO
: 8) L246 F2-B2 Eco ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID
NO : 9) F2 Eco GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID
NO : 10) V681 V681 GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11 ) V681R GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) V1684 V588 CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) V551R GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14) V432 V432 AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15) V432R TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) GRP805 GRP805 ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17) GRP805R AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18) M8 M8 CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO :
19) M8R TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO
: 20) MarqueurLRR1 CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21 E ) LRR842R CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) MarqueurLRR915 AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) D
LRR1R GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24) Des combinaisons de ces oligonucléotides (Tableau 2) ont été utilisées pour amplifier l'ADN de plantes backcross issues du croisement [F1(Védrantais x PI
161375) x Védrantais] et qui présentent des événements de recombinaison à
proximité du locus Tlat.
Les résultats sont illustrés par le Tableau 2 ci-après, et la Figure 4.
TahlPai ~ ~
MarqueurL273 GRP805 V432 V1684 Vat V681L246 M8 Oli o F2-B2GRP805 V432 V588 :Q V681F2-B2EcoM8 1 ~
Oli o F2-BrGRP805RV432R V551 ,~ V681F2Eco M8R
2 R ~, R
~
~
DigestionBsrGl_ Haell Pas de ~ v,. RsalEcoRV Aat Sapl II
n, di estion L :0 , Vdrantais+28pb805 432pb 1 00 ~ 681 173 228 p b . b c pb pb pb '~ +29 p .
m b 182pb805 223pb ~ 435pb144pb 195 pb ~ pb E PI 161375+28 + 508 +209 1684pb a ~ +221+29 +33 Q b pb b ~ pb b b p p p p 297 +25 b b P20 82 - + + + R + + +
P6 93 - - + + R + + +
P147 - - + + R - + +
+
848 - _ _ _ S _ _ +
P4 23 + - - - S - - -P1174 + - - - S - - -- P35 35 + - - - S - - -P35 53 + _ _ - S _ _ _ 310 + + _ _ S _- - _ P26 64 + + + _ S _ _ _ P10 35 + + + + S _ _ _ P49 40 + + ~ + ~ + ~- - _ _ ~ ~ ~ +
Ces résultats montrent que La plante P26 64 présente un événement de recombinaison entre le marqueur V432 et le gène T~at.
La plante P49 40 présente un événement de recombinaison entre le marqueur L246 et le gène hat.
La plante P10 35 présente un événement de recombinaison entre le marqueur V1684 et le gène Tlat. Comme le marqueur V1684 comprend l'ATG du gène Yat, cette plante présente une recombinaison intragénique détruisant la fonction du gène.
Le marqueur V681 co-ségrège avec le gène Tlat.
Ces données permettent donc d'identifier génétiquement le gène hat.
EXEMPLE 2 : SOUS-CLONAGE ET VERIFICATION DE LA SEQUENCE DU
GENE YAT
Un sous clonage du gène T~at a été réalisé dans le vecteur pGEM~3Zf+
(Promega). Pour ee faire, une digestion du clone BAC 3-18-9 avec l'enzyme de restriction Mscl a été réalisée. Chaque fragment ainsi généré a été ligué dans le vecteur pGEM~3Zf+
(Promega) puis criblé avec les marqueurs flanquant le gène T~at ou internes à
ce gène.
Un clone de 18185 pb contenant le gène hat a été identifié (Clone C7.1).
Le séquençage des extrémités du clone C7.1, des restrictions enzymatiques ainsi que le séquençage du gène Yat avec les oligonucléotides du Tableau 1 ont permis de vérifier qu'il s'agissait bien du gène T~at. La séquence d'une portion de 11097 pb de ce clone est représentée sur la Figure 1, ainsi que dans la liste de séquences en annexe (SEQ ID NO: 1).
EXEMPLE 3 : OBTENTION DE L'ADNc DU GENE YAT
L'ADNc a été obtenu en utilisant le kit MarathonTM cDNA clone kit, (Clontech). Cet ADNc est représenté sur la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
Le gène Tlat comporte 4 exons et 3 introns Le premier exon comporte 2367pb et s'étend de la base 1 du codon d'initiation ATG (correspondant à la position 2344 selon SEQ ID NO : 1) à la base 2367 (correspondant à la position 4710 selon SEQ ID NO : 1).
Le premier intron s'étend de la base 2368 à la base 2921 (4711 à 5264 selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième exon s'étend de la base 2922 à la base 4055 (5265 à 6398 selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième intron s'étend de la base 4056 à la base 4876 (6399 à 7219 selon SEQ ID NO : 1).
Le troisième exon s'étend de la base 4877 à la base 5734 (7220 à 8077 selon SEQ ID NO : 1).
Le troisième intron s'étend de la base 5735 à la base 5833 (8078 à 8176 selon SEQ ID NO : 1).
Le quatrième exon s'étend de la base 5834 à la base 5896 (8177 à 8239 selon SEQ ID NO : 1).
EXEMPLE 4 : DISTINCTION ENTRE LE GENE VAT ET LE GENE VAT-LIKE
Lors du criblage précédent, un clone portant un homologue du gène hat (Yat-litre) a été identifié (93,8% d'identité au niveau nucléique et 89,9% au niveau protéique). La séquence de Trat-litre est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4.
Les gènes Yat et Yat-litre sont liés génétiquement et physiquement puisqu'ils sont séparés de 17 kb.
Deux marqueurs (marqueur D et marqueur E) permettent de distinguer le gène T~at du gëne Yat-litre chez PI 161375.
Le marqueur E est défini par les amorces LRRl :CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21) et LRR842R:CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) Ce marqueur permet d'amplifier chez PI 161375 un fragment de 1722 pb correspondant au gène T~at, et un fragment de 1527 pb correspondant au gène T~at-litre.
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais a sur gel d'agarose une longueur d'environ 1,3 kb.
Le marqueur D est défini par les amorces LRR915:AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) et LRR1R:GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24) Ce marqueur permet d'amplifier chez PI161375 un fragment de 1549 pb correspondant au gène Yat et un fragment de 1372 pb correspondant au gène hat litre.
Chez Védrantais, le marqueur permet d'amplifier 4 fragments d'ADN d'environ 750 pb, 900 pb, 1100 pb, 1300 pb.
Les marqueurs L246 et M8 permettent de caractériser des recombinants entre le gène vat et le gène hat-litre et de distinguer génétiquement ces deux gènes.
Le marqueur M8 est défini par les amorces MS :CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) et M8R :TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais et PI 161375 a une longueur de 228 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme AatII
conduisant à
l'obtention de deux fragments respectivement de 195 pb et 33 pb.
En effet, des plantes recombinantes entre les gènes Vat et Vat-litre ont été
identifiées au sein de la population backcross [F1(Védrantais x PI 161375) x Védrantais].
Les plantes portant uniquement le gène Vat-litre sont sensibles à Aphis gossypü, par exemple, la plante 848 (tableau 2). A l'inverse, les plantes ne possédant pas le gène Vat like sont résistantes aux pucerons A. gossypü, par exemple la plante P4940 (Tableau 2).
EXEMPLE 5 . CONSTRUCTION D'UN VECTEUR D'EXPRESSION
CONTENANT LE G~NE YAT
L'ADN génomique du gène vat sans son promoteur est introduit dans le vecteur binaire pain 61 (BENDAHMANE et al., The Plant Journal 32, 195-204, 2002 ;
séquence également disponible sur le site http://www.sainsbury-laboratory.ac.uk/david-baulcombe/Services/pBin6l.doc) contenant notamment le gène chimérique NOS/NPTII, le marqueur de sélection de résistance à la kanamycine et le promoteur p35S. Le gène Yat en orientation sens est introduit après le promoteur p35S. Le vecteur pBin61 est introduit dans différentes souches d'Agrobacterium turnefaciens (LBA4404, C58C1-pch32 ) Alternativement, l'ADN génomique complet, comprenant 2,5 kb environ en amont et en aval du gène Yat afin de s'assurer de la présence du promoteur et des séquences régulatrices, est introduit en bouts francs dans le vecteur SLJ7292 (JONES et al., Transgenic Research, 1, 285- 30 297, 1992) et pain 19 (BEVAN et al., Nucleic Acids Res 12 : 8711-8721, 1984). Les vecteurs binaires SLJ7292 et pain 19 contenant le gène Yat sont introduits dans différentes souches d'Agrobacte~ium tumefaciens (LBA4404, C58C1-pch32, C58C1-pMP90)(SCHWEITZER et al., Plasmid, 4(2), 196-204, 1980 ;
GOODNER et al., Science, 294(5550), 2323-2328, 2001), ou C58pGV2260 (DEBLAERE.
et al., Nucleic Acids Res. 13, 4777-4788, 1985).
Le tableau 3 indique les constructions utilisées en fonction des plantes.
TahlPan R
Nom romoteursouche Plasmide antibioti ues Plante B1-1 Vat C58C1- ch32Bin 19 kanam cine 50m Melon, lL tomate B1-3 Vat C58C1-pMP90pBin19 kanamycine (50mg/L)Melon, gentamycine tomate, 20m lL cotonnier pGV2260 Vat C58C1- pain 19 kanamycine (50mg/L)Cotonnier Vat-Vat pGV2260 carbencilline (50 mg/L) rifam cine 50m /L
Vat 11.1Vat LBA4404 SLJ7292 ttracycline Cotonnier (5mg/L) streptomycine (300mg/L) rifam cine 50m lL
A6-3 35S C58C1-pch32pain 61 kanamycine (50mg/L)Melon, ttracycline tomate, (5mg/L) cotonnier 35C 35S-GUS LBA4404 B1121 kanam cine 50m Melon /L
EXEMPLE 6 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE MELON
- Obtention de plantes de melon génétiguement transformées Le protocole suivi est adapté à partir de celui de GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 84, 91-99, 2000).
De jeunes expiants de feuilles de melon sensible de la variété Védrantais (VILMOR1N) sont incubés sous agitation dans une suspension d'Agrobacterium tumefaciens (106 à 108 celluleslmL), pendant 30 minutes. Les transformations sont réalisées avec les constructions décrites dans l'exemple 5.
Les expiants potentiellement transformés sont ensuite transférés sur du papier Whatman n°1 pendant 10 minutes, puis incubés 2 jours à
27°C à l'obscurité sur un milieu de coculture contenant 1 ~.M de 6-benzylaminopurine (BAP), 1 ~,M de 6-(g,g-diméthylallylamino)-purine (2iP), 0,2mM d'acétosyringone et 0,7g.L-1 d'agar.
La régénération des expiants foliaires est obtenue en utilisant les conditions décrites par KATHAL et al. (Plant Cell Reports, 7, 449-451, 1988) avec quelques modifications. Les expiants foliaires sont transférés sur un milieu de régénération composé du milieu MURASHIGE et SKOOG (MS) (Physiol. Plant, 15, 473-497, 1962) supplémenté avec 1 ~.M de 6-benzylaminopurine (BAP), 1 ~,M de 6-(g,g diméthylallylamino)-purine (2iP), contenant 100 mg.L-1 de kanamycine et 225 mg.L -1 de timentin et solidifié dans l'agar 0,7g.L -1.
Après 3 semaines de culture, les bourgeons formés sur les expiants foliaires sont excisés et ïncubés sur un milieu de développement constitué par le milieu MS
supplémenté avec 1 ~.M de BAP et 0,3~.M d'acide gibbérélique (GA3) contenant mg.L-1 de kanamycine et 225 mg.L '1 de timentin et solidifié dans 0,7g.L-1 d'agar.
Les bourgeons sont ensuite placés dans le milieu d'enracinement constitué par le milieu MS sans régulateur de croissance et contenant les mêmes quantités d'antibiotiques et d'agar.
Dès que les racines apparaissent, les plantules sont acclimatées selon GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 69, 199-206, 1997) et transférées en serre suivant les pratiques culturales décrites par AYUB et al. (Nature Biotechnology, 14, 862-866, 1996).
Les plantes régénérées et enracinées sont analysées par cytométrie de flux. Seules les plantes diploïdes sont conservées et étudiées au niveau moléculaire par PCR pour vérifier la présence du transgène.
Pour révéler la présence du gène Pat, la paire d'amorces V1684 (SEQ ID
N° 13 et 14) située au niveau du promoteur Yat et la paire d'amorces D
(SEQ ID N° 23 et 24) située au milieu du gène hat comme décrites dans l'exemple 1, sont utilisées.
Les conditions de PCR sont les suivantes Mélange réactionnel : eau qsp 1 O~.L ; tampon l OX 1 ~.L ; dNTP's (4mM) 0,6~L ; amorce 1 (10 pM) 0,4~L et amorce 2 (10 pM) 0,4~L ; Taq Takara (SU/~.L) 0,08~L ; ADN 1,2~,L.
- Conditions de PCR utilisées:
étape 1 : 2 mn à 94°C
étape 2 dénaturation : 30 sec à 94°C
étape 3 appariement : 45 sec à 60°C
étape 4 élongation : 2 mn à 72°C
étape 5 : 30 cycles de l'étape 2 à l'étape 4 étape 6 : 10 mn à 72°C
b- Pour révéler la présence du gène nptll de résistance à la kanamycine, les amorces Kana II : 5'-CCGGCTACCTGCCCATTC-3' (SEQ ID NO : 25) et Kana III : 5'-GCGATAGAAGGCGATGCG-3' (SEQ ID NO : 26) sont utilisées dans les conditions suivantes - Mélange réactionnel : eau qsp 1 O~,L ; tampon l OX 1 ~.L ; MgCl2 (25mM) 0,6~,L ; dNTP's (4mM) 0,2~L ; amorce 1 (10 pM) 0,4~.L et amorce 2 (10 pM) 0,4~.L ; Taq Promega (SU/~L) 0,04~L ; ADN 1,2~L.
- Conditions de PCR utilisées:
étape 1 : 2 min à 94°C
étape 2 dénaturation : 30 sec à 94°C
étape 3 appariement : 1 min à 53°C
étape 4 élongation : 1 min à 72°C
étape 5 : 30 cycles de l'étape 2 à l'étape 4 étape 6 : 10 min à 72°C
c- Pour vérifier qu'aucune amplification n'est due à la présence de bactéries résiduelles dans les tissus étudiés, les plantes sont également testées par PCR avec les amorces PicA+
(ATGCGCATGAGGCTCGTCTTCGAG ; SEQ ID NO : 27) et PicA-(GACGCAACGCATCCTCGATCAGCT; SEQ ID NO: 28) spécifiques de l'ADN
chromosomique des souches C58 d'A. tumefaciens ; le mélange réactionnel et les conditions de PCR étant identiques à ceux utilisés vis-vis du gène nptll.
Plusieurs séries de transformations sont réalisées sur melon à partir des différentes constructions présentées dans l'exemple 5. Les résultats de ces transformations sont synthétisés dans le tableau 4.
Tahlaai ~ 4 Nombre de Nombre expiantsplantes Nombre de plantes diplides positives en GnotypeConstructionen culture racines PCR
di lides Vat Vat nptllmarqueurmarqueurPicA+/PicA-VdrantaisB1-1 100 2 2* 2* 2* 0 VdrantaisB1-3 106 0 0 0 0 0 VdrantaisA6-3 112 0 0 0 0 0 Vdrantais 0 0 0 0 tmoin sensible P1161375 0 + + 0 tmoin rsistant Vat "' Deux plantes dipldides de melon Védrantais (M~ et M4) obtenues sur le meure expiant a parer ae la construction B1-1 sont identifiées comme porteuses de l'insert contenant les gènes nptll et Vaf.
Deux transformants porteurs du gène T~at du génotype Védrantais orit été
obtenus par ce premier protocole.
Les plantes racinées diploïdes sont bouturées i~ vitro sur milieu dépourvu d'antibiotiques, puis sevrées et acclimatées en chambre climatisée (8h de nuit à 18°C-16h de jour à 24°C) pendant 4 semaines avant la réalisation des tests biologiques.
Alternativement, la méthode de transformation génétique d'expiants cotylédonnaires décrite dans le brevet EP0412912 (LIMAGRAIN) a également été
suivie.
Environ 10 000 expiants du génotype de melon ClTzl ont été inoculés avec la bactérie C58C1pmp90 porteuse de la construction pVat-gène Vat. Les plantes régénérées et enracinées sur le milieu pourvu de 100 mg. L-1 de kanamycine ont été analysées par PCR
pour vérifier la présence des transgènes : raptll et hat. Les amorces et conditions PCR
utilisées sont celles décrites ci-dessus. 27 évènements de transformation ont été identifiés comme porteurs du gène nptll.
Au total, 2 transformants porteurs du gène Vat du génotype Védrantais ont été obtenus par le premier protocole et 27 transformants ont été obtenus par le second protocole.
WO 2004/072109 2~ PCT/FR2004/000050 - Mesure de la résistance à la colonisation uar A ~ossynü
Le clone Nml collecté sur des melons (G. LABONNE, INRA , Montpellier) et décrit comme le clone 13 (LUPOLI et al., Entomologia Experimentalis et Applicata, 65, 291-300, 1992) est utilisé. Les pucerons A. gossypü sont élevés sur melon Védrantais en chambre de culture (16 heures de jour à 24°C et 8 heures de nuit à 18°C).
Les plantes ih vitro issues des expériences de transformation génétique ainsi que des mises en germination in vitro des plantes témoin ont été
acclimatées i~ vivo pendant 10 jours.
Le test de résistance à la colonisation par A. gossypü est adapté de PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). Les adultes aptères sont prélevés avec un pinceau fin et mis à jeûner pendant 1 heure dans une boîte de Pétri. Dix pucerons sont déposés sur deux feuilles étalées de chaque plante à tester. 48 heures aprés dépôt, le nombre de pucerons fixés sur les feuilles est comptabilisé. A 48 heures, sur les plantes sensibles les 10 pucerons déposés sont fixés alors que sur les plantes résistantes seuls quelques pucerons (en général moins de 5) restent sur les feuilles. Puis 7 jours après infestation, le nombre de pucerons adultes et de larves, ainsi que leur stade de développement est observé. Au bout de cette période sur les plantes sensibles, une nouvelle génération de pucerons est produite (plus de 100 pucerons présents en moyenne) et de nombreuses larves sont présentes (également plus de 100). Sur les plantes résistantes, quelques adultes (en général moins de 5) restent sur les feuilles et seules quelques larves peu développées sont présentes (moins de 30). Dans chaque test, le témoin sensible utilisé
est le cultivar Védrantais et le témoin résistant est le cultivar Margot homozygote pour le locus hat.
Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 5 et 6 WO 2004/072109 ~1 PCT/FR2004/000050 TahlPai ~ .r, Observations Observations 48h 7 jours Plantes Nombre Nombre Nombre Nombre Nombre plantes plantes tantes testes p plantes plantes rsistantessensiblesrsistantessensibles Tmoin sensible10 0 10 0 10 Vdrantais Tmoin rsistant10 10 0 10 0 Mar ot M4 I 12 - I 12 ~ 12 0 ~ ah~eau H
Plante Nombre Nombre mo ndividus mo en en d'i 7 'ours d'individus 48h s adultes larves adultes larves Tmoin sensible9 84 116 128 Vdrantais ~
Tmoin rsistant 2,5 3,2 1,1 18 Mar ot M1 3,6 17* 8,7* 34*
M4 3,2 10 4,5 30 esnme sur les plantes résistantes Alternativement, on peut déposer 3 pucerons au lieu de 10 sur les feuilles de chaque plante à tester. Les pucerons peuvent être maintenus en cage ou non.
Sept jours aprës le dépôt des pucerons, le nombre de pucerons adultes et de larves présents sur les plantes sont comptés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 7:
TahlPai i 7 N
Nombre Nombre Nombre Nombre de Nombre de de de de plantulesplantuleslantules plantules l P plantules Remarques c acclimatesinoculesrsistantesintermdiairessensibles one CITz15 5 0 0 5 Tmoin sensible CITz35 5 5 0 0 Tmoin rsistant V2.3 9 9 0 0 9 Sensible Prsence de V2.4 6 4 2 2 0 boutons floraux V2.1212 11 0 0 11 Sensble V2.156 6 6 0 0 Rsistant V3.1 12 12 12 0 0 Rsistant V3.6 4 4 4 0 0 Rsistant V 7 7 7 0 0 Rsistant 4.18 V4.457 7 0 0 7 Sensible V7.197 7 7 0 0 Rsistant V7.257 7 0 0 7 Sensible V8.268 7 0 0 7 Sensible Ces résultats monirent que les clones M1, M4, V2.15, V3.1, V3.6, V4.18 et V7.19 sont résistants aux pucerons.
- Mesure de la résistance à la transmission des virus uar A. gossypü.
Les tests de transmission virale sont réalisés essentiellement comme décrit par PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). La souche I17F
du CMV (Cucumber Mosaic Virus) peut être utilisée pour les tests de transmission par A.
gossypü chez les plantes transformées et les lignées témoins Védrantais et Margot. Le virus est multiplié sur melons Védrantais par inoculation mécanique. Après 1 heure de jeûne, les pucerons adultes sont déposés pour 5 minutes d'acquisition sur les feuilles virosées placées en boîte de Pétri. Les pucerons sont ensuite transférés sur les plantes à
tester. Environ 15 minutes après dépôt des pucerons virulifères, les pucerons sont retirés au pinceau puis les plantes sont traitées avec un insecticide et mises en chambre de culture (12 heures de jour à
24°C et 12 heures de nuit à 18°C). Quinze jours après inoculation, les plantes sensibles à la transmission du CMV par A. gossypü développent des symptômes de mosaïque sévères.
Les plantes résistantes ne présentent aucun symptôme et le virus n'est pas détecté par ELISA dans ces plantes. Le test ELISA suit le protocole décrit pas CLARI~ et ADAMS (J.
Gen. Virol, 34, 475-483, 1977) avec un anticorps dirigé contre la protéine de capside du CMV (ADGEN, fourni par la société LCA, Bordeaux, France).
EXEMPLE 7 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LA TOMATE
Transformation de la tomate Le protocole de transformation est adapté de HAMZA et CHUPEAU (J.
Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993) par P. Rousselle (1NRA, Montfavet, France) à
partir de cotylédons de plusieurs génotypes Férum (lignée INRA), et Montfavet 63.5 (hybride F 1 ).
Les souches utilisées pour la transformation sont celles décrites dans l'exemple 5. Les plantes régénérées et enracinées sont analysées par cytométrie de flux et seules les plantes diploïdes sont conservées.
Les analyses moléculaires ayant pour objet de vérifier la présence de l'insert contenant le gène nptll et le gène Yat ainsi que son expression dans le génome des plantes régénérées sont effectuées par PCR et RT-PCR. Les conditions PCR
utilisées sont identiques à celles décrites dans l'exemple 6. Quatre paires d'amorces ont été
utilisées V 1684 (SEQ ID N° 13 et SEQ ID N° 14) située au niveau du promoteur Tlat, les paires d'amorces des marqueurs D (SEQ ID N°23 et SEQ ID N°24) et E (SEQ
ID N°21 et SEQ
ID N°22) situées au milieu du gène Trat et les amorces V632 qui amplifient un fragment situé en 3' du gène. Les séquences des amorces V632 sont les suivantes Vat 6328 : CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ 1D NO : 29) Vat 632F : CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO : 30) Plusieurs séries de transformations sont réalisées sur tomate à partir des différentes constructions (tableau 8) et sur deux génotypes différents Ferum et Montfavet (INRA). .
Tahlc~i i f2 NombreNombre expiantsplantes GnotypeConstruction Nombre de plantes positives en PCR
en racines culturedi Idides Vat Vat Vat Vat picA+
nptllmarqueurmarqueurmarqueurmarqueurIPicA-Ferum B1-1 120 0 0 0 0 0 0 0 Ferum B1-2 105 3 3 3 2* 2* 2* 0 Ferum B1-3 90 0 0 0 0 0 0 0 Ferum A6-3 120 0 0 0 0 0 0 0 MontfavetB1-1 90 1 1 1 1 1 1 0 MontfavetB 1-2 80 6 6 3 4 4 4 0 MontfavetB1-3 80 3 3 3 2 2 2 0 MontfavetA6-3 91 11 10 ** 9 10 10 0 Ferum 0 0 0 0 0 0 tmoin sensible non transform Montfavet 0 0 0 0 0 0 tmoin sensible *
Deux plantes (T2 et T7) ont intgr l'insert en entier.
Dans la troisime plante seul le gne nptll et une fraction du gne Vat (incluant le marqueur V1684) ont t intgrs.
**
La construction contient le gne Vat sous contrle du promoteur ;
la paire d'amorces (situ sur une rgion du promoteur Vat) ne permet pas de cribler les transformants.
Les analyses molculaires par RT-PCR
sur la plante et un tmoin Ferum avec la paire d'amorces du marqueur D
(selon les conditions dcrites dans l'exemple 6) ont permis de rvler l'expression du gne fat dans la plante transforme (T7) L'ensemble des amorces utilisées sur les plantes transformées du génotype Montfavet permet de déterminer 14 plantes provenant d'expiants différents ayant intégré la totalité du transgène.
Au total, 2 plantes du génotype Ferum et 14 plantes du génotype Montfavet 63.5 ont intégré le gène hat.
Seules les plantes transformées sont bouturées, sevrées et acclimatées en chambre climatisée (8h de nuit à 18°C-16h de jour à 24°C) pendant 4 semaines avant la réalisation des tests biologiques. Seules les deux plantes Ferum ont été
analysées à ce jour.
- Mesure de la transmission virale La méme souche d'A. gossypü (Nml) et le même protocole de transmission par A. gossypü que pour les tests de résistance à la transmission du virus sur melon sont utilisés. Le virus choisi est le CMV (virus de la mosaïque du concombre) souche I17F qui infecte le melon et la tomate. Cette souche est efficacement transmise à la tomate, lorsqu'elle est inoculée mécaniquement ou transmise par Myzus persicae (JACQUEMOND et al., Molecular Breeding, 8(1), 85-94, 2001). Le virus est multiplié sur r plantules de melon Védrantais. L'acquisition du CMV par A. gossypü est faite sur ces plantules de melon infectées. La transmission est faite sur des plantules de tomate issues d'in vitro au stade 5 feuilles ou sur plantules issues de semis au stade 2 feuilles (environ 5 semaines après semis) en déposant 10 pucerons virulifères sur chaque plante.
Le taux de transmission sur chaque génotype (tomates témoins et transformées) est évalué
sur au minimum 2 répétitions de 20 plantes. La variété témoin sensible est la variété
Férum.
Le test ELISA suit le protocole décrit par CLARK et ADAMS (J. Gen.
Virol., 34, 475-483, 1977) avec un anticorps dirigé contre la protéine de capside du CMV
(ADGEN, fourni par la société LCA, Bordeaux, France).
Les premiers résultats obtenus sur un faible effectif de plantes sont décrits dans le tableau 9.
TahlPan 9 Nombre Evaluation 21 'ours a rs infection lantes Plantes p Nombre plantes Nombre plantes non testes infectes infectes*
Ferum tmoin sensible6 6 0 Ferum T1 9 9 0 Ferum T2 3 2 1 Ferum T7 6 3 3 au~m k;C ue ~ymyrnes ei ae mrus aeiecie par c~mH
Les plantes dn code T1, porteur d'un gène hat tronqué, et celles du témoin sensible sont infectées à 100%. Dans quelques plantes transformées des codes T2 et T7, le virus n'a pas été transmis, ce qui suggère que le gène Irat aurait un effet sur la résistance à la transmission virale par A. gossypü chez les tomates transgéniques ayant intégré T~at.
EXEMPLE 8 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE COTONNIER
- Transformation du cotonnier La transformation génétique du cotonnier (Gossypium hirsutum L.) est basée sur la régénération de transformants via un processus d'embryogenèse somatique publié par SHOEMAKER et al. (Plant Cell Reports, 3, 178-181, 1986) et par TROLINDER et GOODIN (Plant Cell Reports, 6, 231-234, 1987). Ce procédé de transformation utilise la bactérie Agrobactenium tumefaciens comme vecteur de transformation selon UMBECK et al. (Biotechnology, 5, 263-266, 1987) et FIROOZABADY et al. (Plant Molecular Biology, 10, 105-116, 1987) avec quelques modifications et adaptations par rapport aux publications mentionnées. Les souches d'Agrobactéries utilisées pour la transformation sont les mêmes que celles décrites dans l'exemple 5 et notamment les souches LBA4404, C58C1pGV2260 et C58C1pMP90. La première souche contient soit le plasmide pSLJ7292 composé entre autre du gène de résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur Nos et le gène Yat sous contrôle de son propre promoteur, soit le plasmide pain 61 qui comprend le gène hat sous contrôle du promoteur 355. Les deux autres souches sont porteuses du plasmide pBinl9 composé entre autre du gène de résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur Nos et le gène hat sous contrôle de son propre promoteur.
- Résénération du cotonnier Des expiants d'hypocotyles (variété Coker 310) prélevées sur des jeunes plantes cultivées en conditions aseptiques sont utilisés. Ils sont mis en présence de l'Agrobactérie pendant 20 minutes puis mis en culture 48 heures sur un milieu de culture (milieu de base) composé des éléments minéraux de MURASHIGE et SKOOG (MS), 30 g L-I de glucose, les vitamines de MOREL et WETMORE (Am. J. Bot. 38, 141-143, 1951), 0,1 à 0,05 mg L-1 d' acide 2,4 dichlorophenoxyacétique et 0,1 à 0,01 mg L-1 de kinétine. Ce milieu ne contient ni agent de sélection ni antibiotique ayant pour but de stopper la croissance de la bactérie. Après cette période de co-culture, les expiants sont repiqués sur le même milieu additionné de kanamycine à la concentration 25 mg L-1 et de céfotaxime à
la concentration 500 mg L-1. Les expiants sont ensuite repiqués tous les 15 jours sur ce même milieu. Les cals issus de la prolifération des cellules transformées apparaissent après 3 à 5 semaines de culture. Lorsque leur taille atteint environ 0,5 cm de diamètre, ils sont isolés et repiqués sur le même milieu dans lequel la concentration en céfotaxime a été
réduite de moitié et la concentration en substances de croissance (acide 2,4 dichlorophenoxyacétique et kinétine) a été également réduite. Les repiquages interviennent ensuite toutes les 2 semaines jusqu'à l'apparition des tissus embryonnaires.
Selon le comportement des cals, des séquences de milieux variant pour la concentration en substances de croissance peuvent être appliquées. Les tissus embryonnaires sont isolés sur le milieu de base sans ajout de substances de croissance. Sur ce milieu une certaine proportion des pro-embryons se développe en plantules. Ces dernières sont transférées en tube sur un support de vermiculite « arrosé » par le milieu de base liquide dépourvu de substances de croissance et où le saccharose remplace le glucose. Lorsqu'elles atteignent une taille d'environ 4-6 cm, elles sont directement transférées en serre de type S2.
L'analyse moléculaire ayant pour objet de vérifier la présence du gène vat et son expression dans le génome des plantes régénérées est effectuée par PCR. Une paire d'amorces est utilisée pour amplifier le gène rapt II. Deux paires d'amorces ont été
utilisées pour le gène Pat : la première paire appelée 632 amplifie un fragment de hat situé
en 3' du gène, la seconde appelée LRR amplifie un fragment situé dans le milieu du gène.
Les séquences de la paire d'amorces utilisées pour amplifier le gène nptll sont les suivantes Kana III GCGATAGAAGGCGATGCG (SEQ ID NO : 26) kana R CCGGCTACCTGCCATTCG (SEQ ID NO : 31) Les séquences de la paire d'amorces 632 sont les suivantes Vat632F : CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO : 30) Vat632R : CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ ID NO : 29) Les séquences de la paire d'amorces LRR sont les suivantes LRR F : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTAC (SEQ ID NO : 32) LRR R : CCTTAGAGAAGAATGAAGTCTC (SEQ ID NO : 33) Les conditions de PCR sont les suivantes, quelles que soient les amorces utilisées Pour 25 ~,L de milieu réactionnel Eau 9,5 ~.L
tampon lOX : 2,S~,L
dNTP (2,SmM) : 2~.L
Oligo 1 (10 ~,M) : 2,5 ~.L
Oligo 2 (10 ~,M) 2,5 ~,L
Taq (Su/wL) : 0,25 ~L
ADN : 5 ~.L
programme 3 minutes à 94°C
puis 35 cycles de : 30 secondes à 94°C - 45 secondes à 59°C - 45 secondes à 72°C.
Au total après 8 mois, 12 plantes transformées ont été transférées en serre ; elles sont issues de 5 souches embryogènes différentes. Parmi celles-ci 2 sont issues de 2 souches différentes pour lesquelles l'amplification du gène hat a été
obtenue dans les conditions de PCR présentées ci-dessus. Les autres sont issues de souches pour lesquelles (amplification du gène nptll a été obtenu mais pas celle du gène Yat. Il n'est pas impossible qu'elles représentent des faux négatifs dans la mesure où en faisant varier la quantité de matrice il a été possible d'obtenir une amplification à la bonne taille avec un extrait qui s'était avéré précédemment négatif.
Mesure de la résistance à l'infection par Aphis ~ossynü
Un clone d'A. gossypü prélevé sur cotonnier (origine Ile de la Réunion) est utilisé et maintenu sur cotonnier. En effet, il a été montré que les populations d'A.
gossypü sont fortement structurées génétiquement en fonction de la plante hôte (VANLERBERGHE-MASUTTI et CHAVIGNY, Molecular Ecology, 7, 905-914, 1998).
Le test est réalisé selon le même protocole que sur melon mais avec des conditions de culture des plantes adaptées au cotonnier. Les cotonniers sont maintenus en serre de type WO 2004/072109 2~ PCT/FR2004/000050 S2 à une température de 28°C à 30°C, un éclairage d'appoint, en intensité et en durée, est apporté pour une photopériode de 12-12.
En plus de l'évaluation de la résistance réalisée comme pour le test melon, une évaluation plus précise de l'histoire de vie des pucerons sur les plantes transformées (durée des différents stades larvaires, durée de survie des adultes, taux d'accroissement intrinsèque,...) (XIA et al. Entomologia Experimentalis et Applicata, 90, 25-35, 1999) peut être également réalisée afin de détecter des effets éventuellement plus faibles du gène hat sur A. gossypü en situation hétérologue.
SEQUENCE LISTING
<110> GENOPLANTE-VALOR
DOGIMONT, Catherine BENDAHMANE, Abdelhafid PITRAT, Michel BURGET-BIGEARD, Emilie HAGEN, Lynda LE MENN, Aline PAUQUET, Jérôme ROUSSELLE, Patrick CABOCHE, Michel CHOVELON, Véronique <120> GENS DE RESISTANCE A APHIS GOSSYPII
<130> MJPbv1516/11 <150> FR 03 00287 <151> 2003-01-13 <160> 33 <l70> Patentln version 3.1 <210> 1 <2l1> 10922 <212> DNA
<213> Cucumis melo <220>
<221> exon <222> (2344)..(4710) <223>
<220>
<221> Intron <222> (4711)..(5264) <223>
<220>
<221> exon <222> (5265)..(6398) <223>
<220>
<221> Intron <222> (6399)..(7219) <223>
<220>
<221> exon <222> (7220)..(8077) <223>
<220>
<221> Intron <222> (8078)..(8176) <223>
<220>
<221> exon <222> (8177)..(8239) <223>
<400>
ccggagtgtacataataaggagacaccatcacaagtcttgaagctttggcgctcttgaaa60 ttcagcttttaaattaattagtcatgtttttcaaatatataacataggagaatatgagtt120 ttgcgtcaaatcccatcttggcagagtgtattttgatgaaattccttattggaaggaact180 gccatatttttagaatttggaatctgtaaagttattctcatgtggttttttgggcagtgg240 agggagttggagaagttgattggtgtgcagatctatgtataggacagatcattgaagagg300 aaaaaagaattggaatattagggatttggttaattaagcaatatgggaagttggatttca360 gaattgcaattcatgattgggtttcgatttaggaagaatggacttgcaaattcaatttaa420 cataaaatttcttttttttttcctaaattaatttttatttgatcttcggactcatccaat480 gcaatttacaggtcactacaaacaatatccatgtcagcacacataacgtgtctagtagac540 attacgttaacttaatgtaggaaacaaaaagaaaaacgaaaaaggcaagaaatgaaaaag600 gaaacgttgtgtatgatgattaaaatgtacgttgatagctaaattcaactttgttcttca660 ttagcaacaacaagggacaacaaaatgaaaatttcagcacagttatggaatgttgaagaa720 gaaggtgacgagagagatgccacatcataaaaaattaatattataatcatttttgtcaca780 tcagttttctgattacttatatttaacctacacatcattttgccgttactcaactaacga840 tcgatatgacctttaaagctcgatgattaaaatgtttattttgaactttcagggactata900 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la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
La présente invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation de la résistance ou de la sensibilité d'une plante au puceron Aphis gossypü, et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène vat présente chez ladite plante.
La présente invention a également pour objet des amorces oligonucléotidiques utilisables pour la mise en oeuvre des méthodes de détection définies ci-dessus.
En particulier la présente invention a pour objet - tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène TTat comprenant au moins un polymorphisme associé à la résistance ou la sensibilité à
Aphis gossypü etlou à la transmission virale par ledit puceron ;
- tout couple d'amorces permettant l'amplification de l'un des marqueurs L273, L246, V681, V1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, ou marqueur D, mentionnés ci-dessus.
Lâ présente invention a également pour objet des kits pour la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'invention. Ces kits comprennent au moins un couple d'amorces conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs permettant la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification, à des moyens de détection du produit d'amplification, à une ou plusieurs enzymes de restriction, etlou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'amplification.
La présente invention a aussi pour objet - une cassette d'expression comprenant un polynucléotide conforme à
l'invention, et notamment un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au 'puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
- un vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte approprié, d'un polynucléotide ou d'une cassette d'expression conforme à
l'invention.
La présente invention englobe également un procédé de production d'un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte, procaryote ou eucaryote, par un polynucléotide conforme à l'invention côdant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à
la transmission virale par ledit puceron, et la récupération dudit polypeptide produit par ladite cellule.
La présente invention a aussi pour objet un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de rrianière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3, ainsi que des fragments d'au moins 5, de préférence au moins 10, et de manière tout à fait préférée au moins 15 acides aminés consécutifs dudit polypeptide.
La présente invention englobe aussi des cellules-hôtes génétiquement transformées par un polynucléotide ou une cassette d'expression conforme à
(invention.
Les cellules hôtes peuvent être des cellules eucaryotes ou procaryotes. A
titre d'exemples on citera des bactéries, notamment E. coli ou Agrobacterium, des levures, par exemple Saccharomyces, des cellules animales ou, préférentiellement, des cellules végétales.
La présente invention englobe également des plantes transgéniques génétiquement transformées par un polynucléotide conforme à l'invention.
Les techniques classiques de construction de vecteurs recombinants, de transformation de cellules ou d'organismes hôte, et de production de protéines recombinantes, sont utilisables pour la mise en oeuvre de la présente invention.
Le choix du vecteur-hôte, et des séquences de régulation de l'expression seront effectuées en fonction de la cellule hôte ou de l'organisme hôte choisi et de l'application envisagée.
La transformation génétique de plantes par un polynucléotide conforme à
l'invention permet l'obtention de plantes transgéniques résistantes au puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention, pour augmenter la résistance d'une plante au puceron Aphis gossypü.
La présente invention a ainsi plus particulièrement pour objet un procédé
de production d'une plante transgénique résistante au puceron Aphis gossypü
et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation génétique de ladite plante par un polynucléotide conforme à l'invention.
Ladite plante est avantageusement choisie parmi les espèces sensibles à
Aphis gossypü, notamment parmi les cucurbitacées telles que le melon, le concombre ou la courgette, ou les malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus, ou parmi les espèces sensibles aux virus transmis par A. gossypü, notamment parmi les solanacées telles que la tomate ou le piment.
En outre, la sur-expression du gène T~at à un niveau élevé peut conduire à
une résistance constitutive de la plante contre des agents pathogènes plus variés chez le melon ou dans d'autres espèces végétales (cucurbitacées, solanacées ou malvacées). Par exemple, cette sur-expression peut permettre à la plante de reconnaitre des pucerons WO 2004/072109 1~ PCT/FR2004/000050 phylogénétiquement éloignés de Aphis gossypü ou de conférer une résistance constitutive faible qui retardera le cycle infectieux des agents pathogènes en général.
Pour cela, on peut produire des plantes transgéniques qui expriment le gène Yat sous contrôle d'un promoteur fort (35S) et donc qui l'exprimeront à un niveau supérieur à celui qu'il a lorsqu'il est sous contrôle de son propre promoteur. Cependant, il faudra nécessairement contrôler l'expression du gène à son plus juste niveau afin d'éviter des effets néfastes sur la biologie de la plante (mort cellulaire par exemple).
La transformation génétique des plantes peut être effectuée par les méthodes classiques connues en elles-mêmes de l'homme du métier.
A titre d'exemples non limitatifs, pour la transformation des cucurbitacées et notamment du melon, on pourra utiliser les techniques décrites par GUIS
et al. (Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 15, 289-31 l, 1998 ;
Scientia horticulturae, 84, 91-99, 2000). Pour la transformation du cotonnier on pourra utiliser les techniques décrites par PANNETIER et al. (Euphytica, 96, 163-166, 1997). Pour la transformation de la tomate, il est possible d'utiliser les protocoles décrits par HAMZA et CHUPEAU (J. Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993).
Alternativement, des plantes possédant une résistance accrue au puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron, peuvent être obtenues par mutagenèse dirigée, afin d'introduire dans l'allèle du géne ï~at présent chez lesdites plantes les modifications nécessaires pour conférer cette résistance.
Des méthodes de mutagenèse dirigée utilisables dans le cadre de la présente invention sont connues en elles-mêmes de l'homme du métier ; elles sont par exemples décrites dans l'ouvrage de D. TAGU (eds 1NRA 1999).
L'invention concerne également les plantes transformées obtenues par un procédé de transgenèse ou de mutagenèse dirigée conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes. L'invention englobe également les produits obtenus à partir de ces plantes, tels qu'organes ou tissus végétaux, cellules, semences etc.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la définition de marqueurs associés au gène Irat, le clonage de ce gène et l'utilisation dudit gène pour obtenir des plantes résistantes au puceron A. gossypü et/ou à la transmission virale.
EXEMPLE 1: IDENTIFICATION DU GENE T~AT PAR UNE APPROCHE
GENETIQUE
- Création de la bangue BAC
Une banque BAC d'ADN génomique de melon (variété PI 161375 résistante à Aphis gossypü et à la transmission virale par ce puceron) représentant environ 29 équivalents génome a été construite. La première partie de la banque BAC
comporte 66048 clones (ADN digéré par BamHI, Hindlll), la seconde 56448 clones (ADN
digéré par EcoR~.
- Criblage de la bangue BAC et choix du clone BAC porteur du locus T~at Afin d'identifier le clone porteur du gène Yat, la banque a été criblée à
l'aide de marqueurs flanquant le locus Yat. Plusieurs clones BAC couvrant le locus vat ont été identifiés et ordonnés. A partir de ces clones BAC de nouveaux marqueurs ont été
générés. Le clone BAC 3.18.9 porteur d'une insertion de 170 kb comprenant le locus Yat a été choisi pour l'identification du gène hat et séquencé. Ce clone comprend les marqueurs L273 et L246 encadrant le locus Yat. Dix plantes recombinantes sur 6000 plantes issues d'une population backcross [(Védrantais(sensible) x PI 161375 (résistant)) x Védrantais]
ont été identifiées entre le marqueur L273 et le gène T~at, alors qu'une seule a été identifiée entre le marqueur L246 et le gène Yat.
Le marqueur L273 est défini par les amorces:
F2-B2 :GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) et F2-Br :TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8) Le produit d'amplification obtenu à partir d'ADN génomique de la variété Védrantais (Vilmorin) (sensible à Aphis gossypü) ou de la variété PI
(accession d'origine coréenne multipliée par l'1NR.A) (résistante à A.
gossypü) a une longueur de 210 pb. Le produit d'amplification possède un site de restriction BsiWI dans la variété PI 161375 conduisant à l'obtention de deux fragments de 181 pb et 29 pb. En revanche, la digestion par l'enzyme BsrGI restreint l'amplifiat de Védrantais en trois fragments : 153 pb, 28 pb et 29 pb et celui de PI 161375 en deux fragments de 182 pb et 28 pb.
Le marqueur L246 est défini par les amorces:
F2-B2 Eco:ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) et F2 Eco:GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 173 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme EcoRh conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 144 pb et 29 pb.
A partir du clone BAC 3-18-9 possédant les deux marqueurs L273 et L246, des oligonucléotides (Tableau 1) ont été désignés'dans la région comprise entre ces deux marqueurs afin d'en réduire l'intervalle et de délimiter précisément le gène hat.
Le marqueur V432 est défini par les amorces:
V432:AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO: 15) et V432R:TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 432pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme HaeII
conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 223 pb et 209 pb.
Ce site de restriction est absent chez la variété Védrantais.
Le marqueur V681 est défini par les amorces V681: GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ 117 NO : 11) et V681R: GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 681 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède deux sites de restriction pour l'enzyme Rsal conduisant à l'obtention de trois fragments respectivement de 435 pb, 221 pb et 25 pb. Ces sites de restriction sont absents chez la variété Védrantais.
Le marqueur V 1684 est défini par les amorces V588 :CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) et VSS1R :GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14) Le fragment amplifié dans la variété Védrantais mesure environ 1300 pb tandis que dans la variété PI161375, l'amplifiat mesure 1684 pb. Il s'agit dans ce cas, d'un polymorphisme de taille.
Ces marqueurs, ainsi que les marqueurs D, E, et M8 (cf. exemple 4 ci-dessous) et les oligonucléotides les définissant sont indiqués dans le Tableau 1 ci-après TahlPai i 1 MarqueursOligonuclotides5' Squence oligonuclotide 3' L273 F2-B2 GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO
: 7) F2-Br TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO
: 8) L246 F2-B2 Eco ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID
NO : 9) F2 Eco GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID
NO : 10) V681 V681 GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11 ) V681R GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) V1684 V588 CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) V551R GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14) V432 V432 AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15) V432R TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) GRP805 GRP805 ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17) GRP805R AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18) M8 M8 CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO :
19) M8R TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO
: 20) MarqueurLRR1 CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21 E ) LRR842R CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) MarqueurLRR915 AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) D
LRR1R GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24) Des combinaisons de ces oligonucléotides (Tableau 2) ont été utilisées pour amplifier l'ADN de plantes backcross issues du croisement [F1(Védrantais x PI
161375) x Védrantais] et qui présentent des événements de recombinaison à
proximité du locus Tlat.
Les résultats sont illustrés par le Tableau 2 ci-après, et la Figure 4.
TahlPai ~ ~
MarqueurL273 GRP805 V432 V1684 Vat V681L246 M8 Oli o F2-B2GRP805 V432 V588 :Q V681F2-B2EcoM8 1 ~
Oli o F2-BrGRP805RV432R V551 ,~ V681F2Eco M8R
2 R ~, R
~
~
DigestionBsrGl_ Haell Pas de ~ v,. RsalEcoRV Aat Sapl II
n, di estion L :0 , Vdrantais+28pb805 432pb 1 00 ~ 681 173 228 p b . b c pb pb pb '~ +29 p .
m b 182pb805 223pb ~ 435pb144pb 195 pb ~ pb E PI 161375+28 + 508 +209 1684pb a ~ +221+29 +33 Q b pb b ~ pb b b p p p p 297 +25 b b P20 82 - + + + R + + +
P6 93 - - + + R + + +
P147 - - + + R - + +
+
848 - _ _ _ S _ _ +
P4 23 + - - - S - - -P1174 + - - - S - - -- P35 35 + - - - S - - -P35 53 + _ _ - S _ _ _ 310 + + _ _ S _- - _ P26 64 + + + _ S _ _ _ P10 35 + + + + S _ _ _ P49 40 + + ~ + ~ + ~- - _ _ ~ ~ ~ +
Ces résultats montrent que La plante P26 64 présente un événement de recombinaison entre le marqueur V432 et le gène T~at.
La plante P49 40 présente un événement de recombinaison entre le marqueur L246 et le gène hat.
La plante P10 35 présente un événement de recombinaison entre le marqueur V1684 et le gène Tlat. Comme le marqueur V1684 comprend l'ATG du gène Yat, cette plante présente une recombinaison intragénique détruisant la fonction du gène.
Le marqueur V681 co-ségrège avec le gène Tlat.
Ces données permettent donc d'identifier génétiquement le gène hat.
EXEMPLE 2 : SOUS-CLONAGE ET VERIFICATION DE LA SEQUENCE DU
GENE YAT
Un sous clonage du gène T~at a été réalisé dans le vecteur pGEM~3Zf+
(Promega). Pour ee faire, une digestion du clone BAC 3-18-9 avec l'enzyme de restriction Mscl a été réalisée. Chaque fragment ainsi généré a été ligué dans le vecteur pGEM~3Zf+
(Promega) puis criblé avec les marqueurs flanquant le gène T~at ou internes à
ce gène.
Un clone de 18185 pb contenant le gène hat a été identifié (Clone C7.1).
Le séquençage des extrémités du clone C7.1, des restrictions enzymatiques ainsi que le séquençage du gène Yat avec les oligonucléotides du Tableau 1 ont permis de vérifier qu'il s'agissait bien du gène T~at. La séquence d'une portion de 11097 pb de ce clone est représentée sur la Figure 1, ainsi que dans la liste de séquences en annexe (SEQ ID NO: 1).
EXEMPLE 3 : OBTENTION DE L'ADNc DU GENE YAT
L'ADNc a été obtenu en utilisant le kit MarathonTM cDNA clone kit, (Clontech). Cet ADNc est représenté sur la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
Le gène Tlat comporte 4 exons et 3 introns Le premier exon comporte 2367pb et s'étend de la base 1 du codon d'initiation ATG (correspondant à la position 2344 selon SEQ ID NO : 1) à la base 2367 (correspondant à la position 4710 selon SEQ ID NO : 1).
Le premier intron s'étend de la base 2368 à la base 2921 (4711 à 5264 selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième exon s'étend de la base 2922 à la base 4055 (5265 à 6398 selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième intron s'étend de la base 4056 à la base 4876 (6399 à 7219 selon SEQ ID NO : 1).
Le troisième exon s'étend de la base 4877 à la base 5734 (7220 à 8077 selon SEQ ID NO : 1).
Le troisième intron s'étend de la base 5735 à la base 5833 (8078 à 8176 selon SEQ ID NO : 1).
Le quatrième exon s'étend de la base 5834 à la base 5896 (8177 à 8239 selon SEQ ID NO : 1).
EXEMPLE 4 : DISTINCTION ENTRE LE GENE VAT ET LE GENE VAT-LIKE
Lors du criblage précédent, un clone portant un homologue du gène hat (Yat-litre) a été identifié (93,8% d'identité au niveau nucléique et 89,9% au niveau protéique). La séquence de Trat-litre est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4.
Les gènes Yat et Yat-litre sont liés génétiquement et physiquement puisqu'ils sont séparés de 17 kb.
Deux marqueurs (marqueur D et marqueur E) permettent de distinguer le gène T~at du gëne Yat-litre chez PI 161375.
Le marqueur E est défini par les amorces LRRl :CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21) et LRR842R:CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) Ce marqueur permet d'amplifier chez PI 161375 un fragment de 1722 pb correspondant au gène T~at, et un fragment de 1527 pb correspondant au gène T~at-litre.
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais a sur gel d'agarose une longueur d'environ 1,3 kb.
Le marqueur D est défini par les amorces LRR915:AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) et LRR1R:GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24) Ce marqueur permet d'amplifier chez PI161375 un fragment de 1549 pb correspondant au gène Yat et un fragment de 1372 pb correspondant au gène hat litre.
Chez Védrantais, le marqueur permet d'amplifier 4 fragments d'ADN d'environ 750 pb, 900 pb, 1100 pb, 1300 pb.
Les marqueurs L246 et M8 permettent de caractériser des recombinants entre le gène vat et le gène hat-litre et de distinguer génétiquement ces deux gènes.
Le marqueur M8 est défini par les amorces MS :CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) et M8R :TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais et PI 161375 a une longueur de 228 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme AatII
conduisant à
l'obtention de deux fragments respectivement de 195 pb et 33 pb.
En effet, des plantes recombinantes entre les gènes Vat et Vat-litre ont été
identifiées au sein de la population backcross [F1(Védrantais x PI 161375) x Védrantais].
Les plantes portant uniquement le gène Vat-litre sont sensibles à Aphis gossypü, par exemple, la plante 848 (tableau 2). A l'inverse, les plantes ne possédant pas le gène Vat like sont résistantes aux pucerons A. gossypü, par exemple la plante P4940 (Tableau 2).
EXEMPLE 5 . CONSTRUCTION D'UN VECTEUR D'EXPRESSION
CONTENANT LE G~NE YAT
L'ADN génomique du gène vat sans son promoteur est introduit dans le vecteur binaire pain 61 (BENDAHMANE et al., The Plant Journal 32, 195-204, 2002 ;
séquence également disponible sur le site http://www.sainsbury-laboratory.ac.uk/david-baulcombe/Services/pBin6l.doc) contenant notamment le gène chimérique NOS/NPTII, le marqueur de sélection de résistance à la kanamycine et le promoteur p35S. Le gène Yat en orientation sens est introduit après le promoteur p35S. Le vecteur pBin61 est introduit dans différentes souches d'Agrobacterium turnefaciens (LBA4404, C58C1-pch32 ) Alternativement, l'ADN génomique complet, comprenant 2,5 kb environ en amont et en aval du gène Yat afin de s'assurer de la présence du promoteur et des séquences régulatrices, est introduit en bouts francs dans le vecteur SLJ7292 (JONES et al., Transgenic Research, 1, 285- 30 297, 1992) et pain 19 (BEVAN et al., Nucleic Acids Res 12 : 8711-8721, 1984). Les vecteurs binaires SLJ7292 et pain 19 contenant le gène Yat sont introduits dans différentes souches d'Agrobacte~ium tumefaciens (LBA4404, C58C1-pch32, C58C1-pMP90)(SCHWEITZER et al., Plasmid, 4(2), 196-204, 1980 ;
GOODNER et al., Science, 294(5550), 2323-2328, 2001), ou C58pGV2260 (DEBLAERE.
et al., Nucleic Acids Res. 13, 4777-4788, 1985).
Le tableau 3 indique les constructions utilisées en fonction des plantes.
TahlPan R
Nom romoteursouche Plasmide antibioti ues Plante B1-1 Vat C58C1- ch32Bin 19 kanam cine 50m Melon, lL tomate B1-3 Vat C58C1-pMP90pBin19 kanamycine (50mg/L)Melon, gentamycine tomate, 20m lL cotonnier pGV2260 Vat C58C1- pain 19 kanamycine (50mg/L)Cotonnier Vat-Vat pGV2260 carbencilline (50 mg/L) rifam cine 50m /L
Vat 11.1Vat LBA4404 SLJ7292 ttracycline Cotonnier (5mg/L) streptomycine (300mg/L) rifam cine 50m lL
A6-3 35S C58C1-pch32pain 61 kanamycine (50mg/L)Melon, ttracycline tomate, (5mg/L) cotonnier 35C 35S-GUS LBA4404 B1121 kanam cine 50m Melon /L
EXEMPLE 6 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE MELON
- Obtention de plantes de melon génétiguement transformées Le protocole suivi est adapté à partir de celui de GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 84, 91-99, 2000).
De jeunes expiants de feuilles de melon sensible de la variété Védrantais (VILMOR1N) sont incubés sous agitation dans une suspension d'Agrobacterium tumefaciens (106 à 108 celluleslmL), pendant 30 minutes. Les transformations sont réalisées avec les constructions décrites dans l'exemple 5.
Les expiants potentiellement transformés sont ensuite transférés sur du papier Whatman n°1 pendant 10 minutes, puis incubés 2 jours à
27°C à l'obscurité sur un milieu de coculture contenant 1 ~.M de 6-benzylaminopurine (BAP), 1 ~,M de 6-(g,g-diméthylallylamino)-purine (2iP), 0,2mM d'acétosyringone et 0,7g.L-1 d'agar.
La régénération des expiants foliaires est obtenue en utilisant les conditions décrites par KATHAL et al. (Plant Cell Reports, 7, 449-451, 1988) avec quelques modifications. Les expiants foliaires sont transférés sur un milieu de régénération composé du milieu MURASHIGE et SKOOG (MS) (Physiol. Plant, 15, 473-497, 1962) supplémenté avec 1 ~.M de 6-benzylaminopurine (BAP), 1 ~,M de 6-(g,g diméthylallylamino)-purine (2iP), contenant 100 mg.L-1 de kanamycine et 225 mg.L -1 de timentin et solidifié dans l'agar 0,7g.L -1.
Après 3 semaines de culture, les bourgeons formés sur les expiants foliaires sont excisés et ïncubés sur un milieu de développement constitué par le milieu MS
supplémenté avec 1 ~.M de BAP et 0,3~.M d'acide gibbérélique (GA3) contenant mg.L-1 de kanamycine et 225 mg.L '1 de timentin et solidifié dans 0,7g.L-1 d'agar.
Les bourgeons sont ensuite placés dans le milieu d'enracinement constitué par le milieu MS sans régulateur de croissance et contenant les mêmes quantités d'antibiotiques et d'agar.
Dès que les racines apparaissent, les plantules sont acclimatées selon GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 69, 199-206, 1997) et transférées en serre suivant les pratiques culturales décrites par AYUB et al. (Nature Biotechnology, 14, 862-866, 1996).
Les plantes régénérées et enracinées sont analysées par cytométrie de flux. Seules les plantes diploïdes sont conservées et étudiées au niveau moléculaire par PCR pour vérifier la présence du transgène.
Pour révéler la présence du gène Pat, la paire d'amorces V1684 (SEQ ID
N° 13 et 14) située au niveau du promoteur Yat et la paire d'amorces D
(SEQ ID N° 23 et 24) située au milieu du gène hat comme décrites dans l'exemple 1, sont utilisées.
Les conditions de PCR sont les suivantes Mélange réactionnel : eau qsp 1 O~.L ; tampon l OX 1 ~.L ; dNTP's (4mM) 0,6~L ; amorce 1 (10 pM) 0,4~L et amorce 2 (10 pM) 0,4~L ; Taq Takara (SU/~.L) 0,08~L ; ADN 1,2~,L.
- Conditions de PCR utilisées:
étape 1 : 2 mn à 94°C
étape 2 dénaturation : 30 sec à 94°C
étape 3 appariement : 45 sec à 60°C
étape 4 élongation : 2 mn à 72°C
étape 5 : 30 cycles de l'étape 2 à l'étape 4 étape 6 : 10 mn à 72°C
b- Pour révéler la présence du gène nptll de résistance à la kanamycine, les amorces Kana II : 5'-CCGGCTACCTGCCCATTC-3' (SEQ ID NO : 25) et Kana III : 5'-GCGATAGAAGGCGATGCG-3' (SEQ ID NO : 26) sont utilisées dans les conditions suivantes - Mélange réactionnel : eau qsp 1 O~,L ; tampon l OX 1 ~.L ; MgCl2 (25mM) 0,6~,L ; dNTP's (4mM) 0,2~L ; amorce 1 (10 pM) 0,4~.L et amorce 2 (10 pM) 0,4~.L ; Taq Promega (SU/~L) 0,04~L ; ADN 1,2~L.
- Conditions de PCR utilisées:
étape 1 : 2 min à 94°C
étape 2 dénaturation : 30 sec à 94°C
étape 3 appariement : 1 min à 53°C
étape 4 élongation : 1 min à 72°C
étape 5 : 30 cycles de l'étape 2 à l'étape 4 étape 6 : 10 min à 72°C
c- Pour vérifier qu'aucune amplification n'est due à la présence de bactéries résiduelles dans les tissus étudiés, les plantes sont également testées par PCR avec les amorces PicA+
(ATGCGCATGAGGCTCGTCTTCGAG ; SEQ ID NO : 27) et PicA-(GACGCAACGCATCCTCGATCAGCT; SEQ ID NO: 28) spécifiques de l'ADN
chromosomique des souches C58 d'A. tumefaciens ; le mélange réactionnel et les conditions de PCR étant identiques à ceux utilisés vis-vis du gène nptll.
Plusieurs séries de transformations sont réalisées sur melon à partir des différentes constructions présentées dans l'exemple 5. Les résultats de ces transformations sont synthétisés dans le tableau 4.
Tahlaai ~ 4 Nombre de Nombre expiantsplantes Nombre de plantes diplides positives en GnotypeConstructionen culture racines PCR
di lides Vat Vat nptllmarqueurmarqueurPicA+/PicA-VdrantaisB1-1 100 2 2* 2* 2* 0 VdrantaisB1-3 106 0 0 0 0 0 VdrantaisA6-3 112 0 0 0 0 0 Vdrantais 0 0 0 0 tmoin sensible P1161375 0 + + 0 tmoin rsistant Vat "' Deux plantes dipldides de melon Védrantais (M~ et M4) obtenues sur le meure expiant a parer ae la construction B1-1 sont identifiées comme porteuses de l'insert contenant les gènes nptll et Vaf.
Deux transformants porteurs du gène T~at du génotype Védrantais orit été
obtenus par ce premier protocole.
Les plantes racinées diploïdes sont bouturées i~ vitro sur milieu dépourvu d'antibiotiques, puis sevrées et acclimatées en chambre climatisée (8h de nuit à 18°C-16h de jour à 24°C) pendant 4 semaines avant la réalisation des tests biologiques.
Alternativement, la méthode de transformation génétique d'expiants cotylédonnaires décrite dans le brevet EP0412912 (LIMAGRAIN) a également été
suivie.
Environ 10 000 expiants du génotype de melon ClTzl ont été inoculés avec la bactérie C58C1pmp90 porteuse de la construction pVat-gène Vat. Les plantes régénérées et enracinées sur le milieu pourvu de 100 mg. L-1 de kanamycine ont été analysées par PCR
pour vérifier la présence des transgènes : raptll et hat. Les amorces et conditions PCR
utilisées sont celles décrites ci-dessus. 27 évènements de transformation ont été identifiés comme porteurs du gène nptll.
Au total, 2 transformants porteurs du gène Vat du génotype Védrantais ont été obtenus par le premier protocole et 27 transformants ont été obtenus par le second protocole.
WO 2004/072109 2~ PCT/FR2004/000050 - Mesure de la résistance à la colonisation uar A ~ossynü
Le clone Nml collecté sur des melons (G. LABONNE, INRA , Montpellier) et décrit comme le clone 13 (LUPOLI et al., Entomologia Experimentalis et Applicata, 65, 291-300, 1992) est utilisé. Les pucerons A. gossypü sont élevés sur melon Védrantais en chambre de culture (16 heures de jour à 24°C et 8 heures de nuit à 18°C).
Les plantes ih vitro issues des expériences de transformation génétique ainsi que des mises en germination in vitro des plantes témoin ont été
acclimatées i~ vivo pendant 10 jours.
Le test de résistance à la colonisation par A. gossypü est adapté de PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). Les adultes aptères sont prélevés avec un pinceau fin et mis à jeûner pendant 1 heure dans une boîte de Pétri. Dix pucerons sont déposés sur deux feuilles étalées de chaque plante à tester. 48 heures aprés dépôt, le nombre de pucerons fixés sur les feuilles est comptabilisé. A 48 heures, sur les plantes sensibles les 10 pucerons déposés sont fixés alors que sur les plantes résistantes seuls quelques pucerons (en général moins de 5) restent sur les feuilles. Puis 7 jours après infestation, le nombre de pucerons adultes et de larves, ainsi que leur stade de développement est observé. Au bout de cette période sur les plantes sensibles, une nouvelle génération de pucerons est produite (plus de 100 pucerons présents en moyenne) et de nombreuses larves sont présentes (également plus de 100). Sur les plantes résistantes, quelques adultes (en général moins de 5) restent sur les feuilles et seules quelques larves peu développées sont présentes (moins de 30). Dans chaque test, le témoin sensible utilisé
est le cultivar Védrantais et le témoin résistant est le cultivar Margot homozygote pour le locus hat.
Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 5 et 6 WO 2004/072109 ~1 PCT/FR2004/000050 TahlPai ~ .r, Observations Observations 48h 7 jours Plantes Nombre Nombre Nombre Nombre Nombre plantes plantes tantes testes p plantes plantes rsistantessensiblesrsistantessensibles Tmoin sensible10 0 10 0 10 Vdrantais Tmoin rsistant10 10 0 10 0 Mar ot M4 I 12 - I 12 ~ 12 0 ~ ah~eau H
Plante Nombre Nombre mo ndividus mo en en d'i 7 'ours d'individus 48h s adultes larves adultes larves Tmoin sensible9 84 116 128 Vdrantais ~
Tmoin rsistant 2,5 3,2 1,1 18 Mar ot M1 3,6 17* 8,7* 34*
M4 3,2 10 4,5 30 esnme sur les plantes résistantes Alternativement, on peut déposer 3 pucerons au lieu de 10 sur les feuilles de chaque plante à tester. Les pucerons peuvent être maintenus en cage ou non.
Sept jours aprës le dépôt des pucerons, le nombre de pucerons adultes et de larves présents sur les plantes sont comptés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 7:
TahlPai i 7 N
Nombre Nombre Nombre Nombre de Nombre de de de de plantulesplantuleslantules plantules l P plantules Remarques c acclimatesinoculesrsistantesintermdiairessensibles one CITz15 5 0 0 5 Tmoin sensible CITz35 5 5 0 0 Tmoin rsistant V2.3 9 9 0 0 9 Sensible Prsence de V2.4 6 4 2 2 0 boutons floraux V2.1212 11 0 0 11 Sensble V2.156 6 6 0 0 Rsistant V3.1 12 12 12 0 0 Rsistant V3.6 4 4 4 0 0 Rsistant V 7 7 7 0 0 Rsistant 4.18 V4.457 7 0 0 7 Sensible V7.197 7 7 0 0 Rsistant V7.257 7 0 0 7 Sensible V8.268 7 0 0 7 Sensible Ces résultats monirent que les clones M1, M4, V2.15, V3.1, V3.6, V4.18 et V7.19 sont résistants aux pucerons.
- Mesure de la résistance à la transmission des virus uar A. gossypü.
Les tests de transmission virale sont réalisés essentiellement comme décrit par PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). La souche I17F
du CMV (Cucumber Mosaic Virus) peut être utilisée pour les tests de transmission par A.
gossypü chez les plantes transformées et les lignées témoins Védrantais et Margot. Le virus est multiplié sur melons Védrantais par inoculation mécanique. Après 1 heure de jeûne, les pucerons adultes sont déposés pour 5 minutes d'acquisition sur les feuilles virosées placées en boîte de Pétri. Les pucerons sont ensuite transférés sur les plantes à
tester. Environ 15 minutes après dépôt des pucerons virulifères, les pucerons sont retirés au pinceau puis les plantes sont traitées avec un insecticide et mises en chambre de culture (12 heures de jour à
24°C et 12 heures de nuit à 18°C). Quinze jours après inoculation, les plantes sensibles à la transmission du CMV par A. gossypü développent des symptômes de mosaïque sévères.
Les plantes résistantes ne présentent aucun symptôme et le virus n'est pas détecté par ELISA dans ces plantes. Le test ELISA suit le protocole décrit pas CLARI~ et ADAMS (J.
Gen. Virol, 34, 475-483, 1977) avec un anticorps dirigé contre la protéine de capside du CMV (ADGEN, fourni par la société LCA, Bordeaux, France).
EXEMPLE 7 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LA TOMATE
Transformation de la tomate Le protocole de transformation est adapté de HAMZA et CHUPEAU (J.
Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993) par P. Rousselle (1NRA, Montfavet, France) à
partir de cotylédons de plusieurs génotypes Férum (lignée INRA), et Montfavet 63.5 (hybride F 1 ).
Les souches utilisées pour la transformation sont celles décrites dans l'exemple 5. Les plantes régénérées et enracinées sont analysées par cytométrie de flux et seules les plantes diploïdes sont conservées.
Les analyses moléculaires ayant pour objet de vérifier la présence de l'insert contenant le gène nptll et le gène Yat ainsi que son expression dans le génome des plantes régénérées sont effectuées par PCR et RT-PCR. Les conditions PCR
utilisées sont identiques à celles décrites dans l'exemple 6. Quatre paires d'amorces ont été
utilisées V 1684 (SEQ ID N° 13 et SEQ ID N° 14) située au niveau du promoteur Tlat, les paires d'amorces des marqueurs D (SEQ ID N°23 et SEQ ID N°24) et E (SEQ
ID N°21 et SEQ
ID N°22) situées au milieu du gène Trat et les amorces V632 qui amplifient un fragment situé en 3' du gène. Les séquences des amorces V632 sont les suivantes Vat 6328 : CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ 1D NO : 29) Vat 632F : CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO : 30) Plusieurs séries de transformations sont réalisées sur tomate à partir des différentes constructions (tableau 8) et sur deux génotypes différents Ferum et Montfavet (INRA). .
Tahlc~i i f2 NombreNombre expiantsplantes GnotypeConstruction Nombre de plantes positives en PCR
en racines culturedi Idides Vat Vat Vat Vat picA+
nptllmarqueurmarqueurmarqueurmarqueurIPicA-Ferum B1-1 120 0 0 0 0 0 0 0 Ferum B1-2 105 3 3 3 2* 2* 2* 0 Ferum B1-3 90 0 0 0 0 0 0 0 Ferum A6-3 120 0 0 0 0 0 0 0 MontfavetB1-1 90 1 1 1 1 1 1 0 MontfavetB 1-2 80 6 6 3 4 4 4 0 MontfavetB1-3 80 3 3 3 2 2 2 0 MontfavetA6-3 91 11 10 ** 9 10 10 0 Ferum 0 0 0 0 0 0 tmoin sensible non transform Montfavet 0 0 0 0 0 0 tmoin sensible *
Deux plantes (T2 et T7) ont intgr l'insert en entier.
Dans la troisime plante seul le gne nptll et une fraction du gne Vat (incluant le marqueur V1684) ont t intgrs.
**
La construction contient le gne Vat sous contrle du promoteur ;
la paire d'amorces (situ sur une rgion du promoteur Vat) ne permet pas de cribler les transformants.
Les analyses molculaires par RT-PCR
sur la plante et un tmoin Ferum avec la paire d'amorces du marqueur D
(selon les conditions dcrites dans l'exemple 6) ont permis de rvler l'expression du gne fat dans la plante transforme (T7) L'ensemble des amorces utilisées sur les plantes transformées du génotype Montfavet permet de déterminer 14 plantes provenant d'expiants différents ayant intégré la totalité du transgène.
Au total, 2 plantes du génotype Ferum et 14 plantes du génotype Montfavet 63.5 ont intégré le gène hat.
Seules les plantes transformées sont bouturées, sevrées et acclimatées en chambre climatisée (8h de nuit à 18°C-16h de jour à 24°C) pendant 4 semaines avant la réalisation des tests biologiques. Seules les deux plantes Ferum ont été
analysées à ce jour.
- Mesure de la transmission virale La méme souche d'A. gossypü (Nml) et le même protocole de transmission par A. gossypü que pour les tests de résistance à la transmission du virus sur melon sont utilisés. Le virus choisi est le CMV (virus de la mosaïque du concombre) souche I17F qui infecte le melon et la tomate. Cette souche est efficacement transmise à la tomate, lorsqu'elle est inoculée mécaniquement ou transmise par Myzus persicae (JACQUEMOND et al., Molecular Breeding, 8(1), 85-94, 2001). Le virus est multiplié sur r plantules de melon Védrantais. L'acquisition du CMV par A. gossypü est faite sur ces plantules de melon infectées. La transmission est faite sur des plantules de tomate issues d'in vitro au stade 5 feuilles ou sur plantules issues de semis au stade 2 feuilles (environ 5 semaines après semis) en déposant 10 pucerons virulifères sur chaque plante.
Le taux de transmission sur chaque génotype (tomates témoins et transformées) est évalué
sur au minimum 2 répétitions de 20 plantes. La variété témoin sensible est la variété
Férum.
Le test ELISA suit le protocole décrit par CLARK et ADAMS (J. Gen.
Virol., 34, 475-483, 1977) avec un anticorps dirigé contre la protéine de capside du CMV
(ADGEN, fourni par la société LCA, Bordeaux, France).
Les premiers résultats obtenus sur un faible effectif de plantes sont décrits dans le tableau 9.
TahlPan 9 Nombre Evaluation 21 'ours a rs infection lantes Plantes p Nombre plantes Nombre plantes non testes infectes infectes*
Ferum tmoin sensible6 6 0 Ferum T1 9 9 0 Ferum T2 3 2 1 Ferum T7 6 3 3 au~m k;C ue ~ymyrnes ei ae mrus aeiecie par c~mH
Les plantes dn code T1, porteur d'un gène hat tronqué, et celles du témoin sensible sont infectées à 100%. Dans quelques plantes transformées des codes T2 et T7, le virus n'a pas été transmis, ce qui suggère que le gène Irat aurait un effet sur la résistance à la transmission virale par A. gossypü chez les tomates transgéniques ayant intégré T~at.
EXEMPLE 8 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE COTONNIER
- Transformation du cotonnier La transformation génétique du cotonnier (Gossypium hirsutum L.) est basée sur la régénération de transformants via un processus d'embryogenèse somatique publié par SHOEMAKER et al. (Plant Cell Reports, 3, 178-181, 1986) et par TROLINDER et GOODIN (Plant Cell Reports, 6, 231-234, 1987). Ce procédé de transformation utilise la bactérie Agrobactenium tumefaciens comme vecteur de transformation selon UMBECK et al. (Biotechnology, 5, 263-266, 1987) et FIROOZABADY et al. (Plant Molecular Biology, 10, 105-116, 1987) avec quelques modifications et adaptations par rapport aux publications mentionnées. Les souches d'Agrobactéries utilisées pour la transformation sont les mêmes que celles décrites dans l'exemple 5 et notamment les souches LBA4404, C58C1pGV2260 et C58C1pMP90. La première souche contient soit le plasmide pSLJ7292 composé entre autre du gène de résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur Nos et le gène Yat sous contrôle de son propre promoteur, soit le plasmide pain 61 qui comprend le gène hat sous contrôle du promoteur 355. Les deux autres souches sont porteuses du plasmide pBinl9 composé entre autre du gène de résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur Nos et le gène hat sous contrôle de son propre promoteur.
- Résénération du cotonnier Des expiants d'hypocotyles (variété Coker 310) prélevées sur des jeunes plantes cultivées en conditions aseptiques sont utilisés. Ils sont mis en présence de l'Agrobactérie pendant 20 minutes puis mis en culture 48 heures sur un milieu de culture (milieu de base) composé des éléments minéraux de MURASHIGE et SKOOG (MS), 30 g L-I de glucose, les vitamines de MOREL et WETMORE (Am. J. Bot. 38, 141-143, 1951), 0,1 à 0,05 mg L-1 d' acide 2,4 dichlorophenoxyacétique et 0,1 à 0,01 mg L-1 de kinétine. Ce milieu ne contient ni agent de sélection ni antibiotique ayant pour but de stopper la croissance de la bactérie. Après cette période de co-culture, les expiants sont repiqués sur le même milieu additionné de kanamycine à la concentration 25 mg L-1 et de céfotaxime à
la concentration 500 mg L-1. Les expiants sont ensuite repiqués tous les 15 jours sur ce même milieu. Les cals issus de la prolifération des cellules transformées apparaissent après 3 à 5 semaines de culture. Lorsque leur taille atteint environ 0,5 cm de diamètre, ils sont isolés et repiqués sur le même milieu dans lequel la concentration en céfotaxime a été
réduite de moitié et la concentration en substances de croissance (acide 2,4 dichlorophenoxyacétique et kinétine) a été également réduite. Les repiquages interviennent ensuite toutes les 2 semaines jusqu'à l'apparition des tissus embryonnaires.
Selon le comportement des cals, des séquences de milieux variant pour la concentration en substances de croissance peuvent être appliquées. Les tissus embryonnaires sont isolés sur le milieu de base sans ajout de substances de croissance. Sur ce milieu une certaine proportion des pro-embryons se développe en plantules. Ces dernières sont transférées en tube sur un support de vermiculite « arrosé » par le milieu de base liquide dépourvu de substances de croissance et où le saccharose remplace le glucose. Lorsqu'elles atteignent une taille d'environ 4-6 cm, elles sont directement transférées en serre de type S2.
L'analyse moléculaire ayant pour objet de vérifier la présence du gène vat et son expression dans le génome des plantes régénérées est effectuée par PCR. Une paire d'amorces est utilisée pour amplifier le gène rapt II. Deux paires d'amorces ont été
utilisées pour le gène Pat : la première paire appelée 632 amplifie un fragment de hat situé
en 3' du gène, la seconde appelée LRR amplifie un fragment situé dans le milieu du gène.
Les séquences de la paire d'amorces utilisées pour amplifier le gène nptll sont les suivantes Kana III GCGATAGAAGGCGATGCG (SEQ ID NO : 26) kana R CCGGCTACCTGCCATTCG (SEQ ID NO : 31) Les séquences de la paire d'amorces 632 sont les suivantes Vat632F : CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO : 30) Vat632R : CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ ID NO : 29) Les séquences de la paire d'amorces LRR sont les suivantes LRR F : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTAC (SEQ ID NO : 32) LRR R : CCTTAGAGAAGAATGAAGTCTC (SEQ ID NO : 33) Les conditions de PCR sont les suivantes, quelles que soient les amorces utilisées Pour 25 ~,L de milieu réactionnel Eau 9,5 ~.L
tampon lOX : 2,S~,L
dNTP (2,SmM) : 2~.L
Oligo 1 (10 ~,M) : 2,5 ~.L
Oligo 2 (10 ~,M) 2,5 ~,L
Taq (Su/wL) : 0,25 ~L
ADN : 5 ~.L
programme 3 minutes à 94°C
puis 35 cycles de : 30 secondes à 94°C - 45 secondes à 59°C - 45 secondes à 72°C.
Au total après 8 mois, 12 plantes transformées ont été transférées en serre ; elles sont issues de 5 souches embryogènes différentes. Parmi celles-ci 2 sont issues de 2 souches différentes pour lesquelles l'amplification du gène hat a été
obtenue dans les conditions de PCR présentées ci-dessus. Les autres sont issues de souches pour lesquelles (amplification du gène nptll a été obtenu mais pas celle du gène Yat. Il n'est pas impossible qu'elles représentent des faux négatifs dans la mesure où en faisant varier la quantité de matrice il a été possible d'obtenir une amplification à la bonne taille avec un extrait qui s'était avéré précédemment négatif.
Mesure de la résistance à l'infection par Aphis ~ossynü
Un clone d'A. gossypü prélevé sur cotonnier (origine Ile de la Réunion) est utilisé et maintenu sur cotonnier. En effet, il a été montré que les populations d'A.
gossypü sont fortement structurées génétiquement en fonction de la plante hôte (VANLERBERGHE-MASUTTI et CHAVIGNY, Molecular Ecology, 7, 905-914, 1998).
Le test est réalisé selon le même protocole que sur melon mais avec des conditions de culture des plantes adaptées au cotonnier. Les cotonniers sont maintenus en serre de type WO 2004/072109 2~ PCT/FR2004/000050 S2 à une température de 28°C à 30°C, un éclairage d'appoint, en intensité et en durée, est apporté pour une photopériode de 12-12.
En plus de l'évaluation de la résistance réalisée comme pour le test melon, une évaluation plus précise de l'histoire de vie des pucerons sur les plantes transformées (durée des différents stades larvaires, durée de survie des adultes, taux d'accroissement intrinsèque,...) (XIA et al. Entomologia Experimentalis et Applicata, 90, 25-35, 1999) peut être également réalisée afin de détecter des effets éventuellement plus faibles du gène hat sur A. gossypü en situation hétérologue.
SEQUENCE LISTING
<110> GENOPLANTE-VALOR
DOGIMONT, Catherine BENDAHMANE, Abdelhafid PITRAT, Michel BURGET-BIGEARD, Emilie HAGEN, Lynda LE MENN, Aline PAUQUET, Jérôme ROUSSELLE, Patrick CABOCHE, Michel CHOVELON, Véronique <120> GENS DE RESISTANCE A APHIS GOSSYPII
<130> MJPbv1516/11 <150> FR 03 00287 <151> 2003-01-13 <160> 33 <l70> Patentln version 3.1 <210> 1 <2l1> 10922 <212> DNA
<213> Cucumis melo <220>
<221> exon <222> (2344)..(4710) <223>
<220>
<221> Intron <222> (4711)..(5264) <223>
<220>
<221> exon <222> (5265)..(6398) <223>
<220>
<221> Intron <222> (6399)..(7219) <223>
<220>
<221> exon <222> (7220)..(8077) <223>
<220>
<221> Intron <222> (8078)..(8176) <223>
<220>
<221> exon <222> (8177)..(8239) <223>
<400>
ccggagtgtacataataaggagacaccatcacaagtcttgaagctttggcgctcttgaaa60 ttcagcttttaaattaattagtcatgtttttcaaatatataacataggagaatatgagtt120 ttgcgtcaaatcccatcttggcagagtgtattttgatgaaattccttattggaaggaact180 gccatatttttagaatttggaatctgtaaagttattctcatgtggttttttgggcagtgg240 agggagttggagaagttgattggtgtgcagatctatgtataggacagatcattgaagagg300 aaaaaagaattggaatattagggatttggttaattaagcaatatgggaagttggatttca360 gaattgcaattcatgattgggtttcgatttaggaagaatggacttgcaaattcaatttaa420 cataaaatttcttttttttttcctaaattaatttttatttgatcttcggactcatccaat480 gcaatttacaggtcactacaaacaatatccatgtcagcacacataacgtgtctagtagac540 attacgttaacttaatgtaggaaacaaaaagaaaaacgaaaaaggcaagaaatgaaaaag600 gaaacgttgtgtatgatgattaaaatgtacgttgatagctaaattcaactttgttcttca660 ttagcaacaacaagggacaacaaaatgaaaatttcagcacagttatggaatgttgaagaa720 gaaggtgacgagagagatgccacatcataaaaaattaatattataatcatttttgtcaca780 tcagttttctgattacttatatttaacctacacatcattttgccgttactcaactaacga840 tcgatatgacctttaaagctcgatgattaaaatgtttattttgaactttcagggactata900 taaatgtatatatatcaacttcaaatcttagcggtcaaaagtgcattttgttttagttta960 aaacaccgagatgtgacgattaataatgcctacacactcacgtactcacacatgcagtga1020 gttttttatgttttttttacacacattagacgcaaattgaattcctaattccattcccta1080 agacaagtttctaatgacttatacaattcacataggcatgcatgcagaacaagcgaaaaa1140 cgacgaatttaccttaagaaaatggcccaaccaaccacttacacaatctcaggcatacca1200 ttccccgggatgaaagaattttgcctgtaattcattcgatctcaggcatacaatgcatcg1260 agaagacgcaaaatgaaagacaaaagtatagaacaacacaatcctgtacttcattttaaa1320 cgatagttttcaaatttaacgatcgtgtagatcatgatacacgatctcgagccttagtgg1380 caccgagatggcccgagatgaaagaattatgtctttattttattcgatattaagcataca1440 ttacttcgagatgaaagacctctacctttagttattcgatctcgagccttaattgaatcg1500 agatgacccaagattgatagatcgcaaagaagatatatatcgtaagggcatatatgaaat1560 ttatgaaaatacgatcatgtgtcataaacttttcttattttgttatatagaccgtaaata1620 ttatagattttggttacatttgtgtaaattactctatttttttttagtaaaacaaatgaa1680 ttaaattttttaaaaaaaaattattgagagttgaagtaattgggtgttttctaaaagatt1740 gaaataaatacctttattaactttgcaaatatattttcaaagaggctaacaaatcaaata1800 tattttctaaaaaaatcacattgcgttggggataaggtaagagtaatggaaaaatgaaag1860 gttgtgaacaattcgtactcttacttatgagatttgacagaacaaatatttttcaaatac1920 tctttttacgttttcttttttaaaattaaataacaaatacttttccactgcttttctttt1980 cttccattgactcctcaactaataattttggtcttcccattattatcttc-ttcttcttca2040 tttttctctgcactgtctcttctccatttcaacatcttcttatatcttcattcaggttaa2100 atatttcatcccttaccatttttatttacattttccatctgatcatttctatacttataa2160 actcgataatttgtttagactttctttagatagtttttacttggtgatctgtatgtgttc2220 actcctacttttctgttaggcaaaatcttcaaaattattatggttcattcctcgtggttt2280 tttagctcttcaagtatttttgtaggttttgatccttttcaagctcaagaacagaggata2340 ata atg act gca att gcc 2388 gac atc aaa gaa tac ctt att act tca gtc Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr gtt gag cct gtt gga cgc caa ctt ggt tat gta ttt ttc att cgt tcc 2436 Val Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser aac ttt caa aaa ctt aag act caa gta gaa aag ctg aag att aca aga 2484 Asn Phe Gln Lys Leu Lys Thr Gln Val Glu Lys Leu Lys Ile Thr Arg gag tct gtg caa cac aag atc cat agt gca aga aga aat gct gaa gac 2532 Glu Ser Val Gln His Lys Ile His Ser Ala Arg Arg Asn Ala Glu Asp ata aaacct gccgttgag gaatgg ttgaaaaag gtcgatgac tttgtc 2580 Ile LysPro AlaValGlu GluTrp LeuLysLys ValAspAsp PheVal cga gaatct gacgagata ttagcc aatgaaggt ggacatggt ggactc 2628 Arg GluSer AspGluIle LeuAla AsnGluGly GlyHisGly GlyLeu tgt tccacc tatttggtc caacga cacaagtta agtagaaaa gcaagc 2676 Cys SerThr TyrLeuVal GlnArg HisLysLeu SerArgLys AlaSer aaa atggta gatgaggtt cttgag atgaaaaat gagggggaa agtttt 2724 Lys MetVal AspGluVal LeuGlu MetLysAsn GluGlyGlu SerPhe gat atggta tcctataaa agtgtt atcccatca gttgattgt tcactt 2772 Asp MetVal SerTyrLys SerVal IleProSer ValAspCys SerLeu cca aaagtg cctgacttt cttgac tttgagtca agaaagtcg attatg 2820 Pro LysVal ProAspPhe LeuAsp PheGluSer ArgLysSer IleMet 145 150 l55 gaa caaatc atggatgca ctatct gatggtaat gtccatagg attgga 2868 Glu GlnIle MetAspAla LeuSer AspGlyAsn ValHisArg IleGly 160 165 l70 175 gta tatggg atggggggt gttggc aaaacaatg ctagtgaag gatatt 2916 Val TyrGly MetGlyGly ValGly LysThrMet LeuValLys AspIle 180 185 l90 tta agaaaa attgtggag agtaag aagcctttt gatgaggtg gtaaca 2964 Leu ArgLys IleValGlu SerLys LysProPhe AspGluVal ValThr tcc acgatc agccaaaca ccagat tttagaagt atccaagga caacta 3012 Ser ThrIle SerGlnThr ProAsp PheArgSer IleGlnGly GlnLeu gct gacaag ctaggtttg aaattc gaacaagaa acaatagaa ggaagg 3060 Ala AspLys LeuGlyLeu LysPhe GluGlnGlu ThrIleGlu GlyArg gctact attcta cgaaagagg ttaaag atggagaga agtatccta gtt 3108 AlaThr IleLeu ArgLysArg LeuLys MetGluArg SerIleLeu Val gtgttg gatgat gtttgggag tatatt gatttggaa actatagga att 3156 ValLeu AspAsp ValTrpGlu TyrIle AspLeuGlu ThrIleGly Ile ccaagt gttgaa gatcatacg gggtgc aagatcttg tttaccact agg 3204 ProSer ValGlu AspHisThr GlyCys LysIleLeu PheThrThr Arg attaaa catttg atctcaaat caaatg tgcgccaat aaaattttt gag 3252 IleLys HisLeu IleSerAsn GlnMet CysAlaAsn LysIlePhe Glu ataaaa gtttta ggaaaagat gagtca tggaattta tttaaggca atg 3300 IleLys ValLeu GlyLysAsp GluSer TrpAsnLeu PheLysAla Met gcaggt 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IleSerSer SerLeuLeu GlnGln TyrSer gagtatggg tgcaattat gtgaaaatg catgatatg gttcgt gatgta 3780 GluTyrGly CysAsnTyr ValLysMet HisAspMet ValArg AspVal gccctatta attgcatct aagaatgaa cacgtacgt acattg agctat 3828 AlaLeuLeu IleAlaSer LysAsnGlu HisValArg ThrLeu SerTyr gtgaaaaga tcgaatgaa gaatgggaa gaagagaaa ctattg ggtaat 3876 ValLysArg SerAsnGlu GluTrpGlu GluGluLys LeuLeu GlyAsn cataccgca gtgttcatt gatggttta cattatcct ctcccg aagtta 3924 HisThrAla ValPheIle AspGlyLeu HisTyrPro LeuPro LysLeu acgttaccc aaagttcaa ttattaagg ttagttgca aaatat tgttgg 3972 ThrLeuPro LysValGln LeuLeuArg LeuValAla LysTyr CysTrp gaacataat aagcgtgtg tcggtggta gaaactttt tttgaa gaaatg 4020 GluHs Asn LysArgVal SerValVal GluThrPhe PheGlu GluMet aaagagctc aaaggttta gtagtagaa aacgtaaat atatca ttgatg 4068 LysGluLeu LysGlyLeu ValValGlu AsnValAsn IleSer LeuMet caacgacca tctgatgtt tactcctta gcaaacatc agagta ttacgt 4116 GlnArgPro SerAspVal TyrSerLeu AlaAsnIle ArgVal LeuArg ttggaaaga tgtcaatta ttagggagc atagattgg attggt gaatta 4164 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10 PCT/FR2004/000050 His Asn Met Leu Glu Ser Lys Gln Trp Glu Thr Ser Ser Ser Ser aag gtacgtatat attctacaag aaaacatgtt tgttcaattt aattttcaga 6448 Lys aaataaattgttttcaagaattagttgaacagaattggttctgttagttgaacagagttt 6508 taaagaaaacaaattattatgtttgttctagaaacctatggaaattagtgttattagggg 6568 ttaattatttacctgaattaaaaaagaataagcaagtaaaccgcttaattttaatatgtt 6628 tatcaatagaaattaggatccgtttggattgacttgaatgatatgttttcctggaaagaa 6688 actcatttttgtttgaactcatttttatgaaaattggctaaaatatatttaaaaaattag 6748 gtggctttcaaatattcaattttttttttaaaataacttattttttgaattaaacactcc 6808 aaaatgtaattcaaaaacacccctaagttaattagatatataattaatacataaattat 6868 taattttatttagttgagttaaattagttttaatgcaaacaataatatatttttatagcc 6928 aatatacaagaatgaaagtaagaaaagaagacaaaaaaaaatgatatgttaattagaatt 6988 ttacataaagaatgatctgattaaaagctaatctctatcgatatagttttttaattatat 7048 taaatatagtaagtagtccattataataattgaatttttttgtaccaaattaattaaact 7108 aattctttttactaattattgaatatttaagatatttttggctaattaattaataatttg 7168 tgtgcaaatataagttattattgcatttatttaatagattttgatcatcag gat ggg 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Leu ValGluAsp Met AsnVal IleThrArg GluTyrTrp Glu gat aat gtt gat acc gga att cca aat tta ttt gcc gaa cag 8077 Asp Asn Val Asp Thr Gly Ile Pro Asn Leu Phe Ala Glu Gln gtttgtatat ttaattacct tttcatattt ggtaataatt aatttttatt atttgtgtgt 8137 tagagtatga actttaatga atttatttaa ttaatgcag agt ttg gag gaa aac 8191 Ser Leu Glu Glu Asn cga tct gaa aat tct tct tct tcg aag aat aat gtt gag aaa gaa 8236 Arg Ser Glu Asn Ser Ser Ser Ser Lys Asn Asn Val Glu Lys Glu taa ggaattatat ggatattgtt gtacactact taatatatca tttcatccac 8289 aaggaaaagg tcagaatctt gaaatcctcc attctttttt atgagagaat atcatccaat 8349 gtcaaattga aaagtctcga tagatttgtt aaattaactt ttgatacaag tcataaaatg 8409 ttaattagta taataataat atatctgatc ccatcaaatt aattagaagt aacgacaaat 8469 ttaacttctg taatatcaat tcaatttgat gtctcaatca actgcataaa atttgatgtc 8529 acaaatttaa cttctgtaat gtgaatcttt tttttttttc cctttgcaca taaaaccaac 8589 aagttaaaat agatataaca aagaatttaa ttcacatata ataaattcat ccaatataat 8649 gttctttcac ctttttctct ctttcacaaa actgtaataa taatatctac 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ttgctattta ttattgattg ttctaatgat atcaattgtt gtttgattaa gatctaataa 10620 tattggttgt caattataga aattgttata tgataatgat tgtaaaattg ttgatgatac 10680 tgattgttgt ttgaatataa caatcaatga tattgattgt tgtttgattg ctctcagatt 10740 actatctacg cctttaaact aatattaatt gat 10773 <210> 5 <211> 4919 <212> DNA
<213> Cucumis melo <400>
attattatggttcattcctcgtggttttttagctcttcaagtatttttgtaggttttgat60 ccttttcaagctcaagaacagaggataataatggacatccttatttcagtcactgcaaaa120 attgctgaatacactgttgagcctgttggacgccaacttggttatgtatttttcattcgt180 tccaactttcaaaaacttaagactcaagtagaaaagctgaagattacaagagagtctgtg240 caacacaagatccatagtgcaagaagaaatgctgaagacataaaacctgccgttgaggaa300 tggttgaaaaaggtcgatgactttgttcgagaatctgacgagatattagccaatgaaggt360 ggacatggtggactctgttccacctatttggtccaacgacacaagttaagtagaaaagca420 agcaaaatggtagatgaggttcttgagatgaaaaatgagggggaaagttttgatatggta480 tcctataaaagtgttatcccatcagttgattgttcacttccaaaagtgcctgactttatt540 gactttgagtcaagaaagtcgattatggaacaaatcatggatgcactatctgatggtaat600 gtccataggattggagtatatgggatggggggtgttggcaaaacaatgctagtgaaggat660 attttaagaaaaattgtggagagtaagaagccttttgatgaggtggtaacatccacgatc720 agccaaacaccagattttagaagtatccaaggacaactagctgacaagctaggtttgaaa780 ttcgaacaagaaacaatagaaggaagggctactattctacgaaagaggttaaagatggag840 agaagtatcctagttgtgttggatgatgtttgggagtatattgatttggaaactatagga900 attccaagtgttgaagatcatacggggtgcaagatcttgtttaccactaggattaaacat960 ttgatctcaaatcaaatgtgcgccaataaaatttttgagataaaagttttaggaaaagat1020 gagtcatggaatttatttaaggcaatggcaggtgacattgttgatgcaagtgatttgaag1080 cctatagccattcgaattgtgagagaatgtgcaggtttgcctattgctattactactgtt1140 gctaaggcattacgaaataaaccttccgacatttggaatgatgccttagatcagcttaaa1200 agtgttgatgtgggtatggcaaacattggagaaatggaaaagaaagtgtatttgtcacta1260 aaactgagttacgattgcttgggatatgaagaggtgaagttattattcttgttatgcagc1320 atgtttccagaagactttagcattgacgtggaagggttgcatgtatatgccatgggcatg1380 ggattcttacatggtgttgatactgtggtaaaaggacgacgtaggataaaaaaattggtt1440 gatgatcttatatcttcttctttgcttcaacaatattctgagtatgggtgcaattatgtg1500 aaaatgcatgatatggttcgtgatgtagccctattaattgcatctaagaatgaacacgta1560 cgtacattgagctatgtgaaaagatcgaatgaagaatgggaagaagagaaactattgggt1620 aatcatactgcagtgttcattgatggtttacattatcctctcccgaagttaacgttaccc1680 aaagttcaattattaaggttagttgcacaagattgttgggaacataataagcgtgtgtcg1740 gtggtagaaactttttttgaagaaatgaaagagctcaaaggtttagtattagcaaacgta1800 aatatatcattgatgcaacgaacatctgatctttactccttagcaaacatcagagtatta1860 cgtttgcaaagctgtaatttattagggagcatagattggattggtgaattaaaaaagctt1920 WO 2004/072109 ~7 PCT/FR2004/000050 gaaattcttgattttataggatctaacatcacacaaattcctacaaccatgagccaattg1980 acacaactcaaagtgttaaatttatcttcttgtcatcaactcaaggtaattccaccaaat2040 attctttcaaagttgacaaaactggaagaattaagtctggaaacttttgatagatgggaa2100 ggagaagaatggtatgaaggaaggaaaaatgctagcctttctgaactcaagtgcttgcga2160 catctttatgctttaaatttaaccattcaagatgaagaaattatgccaaaagatttgttt2220 ttagctgaggagttgaagcttcaaaaattcaacatttgtattggttaccaaagcaaatta2280 aagtatacttttggacccacaaacagaatcaaaaacttcattgcaatcaagatggaatca2340 ggaaggtgcttggataattggataaaaaatttgttaaagaggtcggacaatgtgtttttg2400 gaaggatcaatttgttcaaaggttctccactcagaattggtaggtgcaaatgacttcgta2460 tcgcttcctaatttggagaagttggaaattgtgaatgcaaagagtttgaagatgatatgg2520 agcaataacgtgccaattcttaattccttttccaaactcgaggaaataaaaatttattca2580 tgcaacaatcttcaaaaagtattatttcctccaaatatgatggacattctcacatgcctt2640 aaagtcttagagatcaaaaattgtgatttgttggaagggatatttgaagcgcaagagcca2700 attagtgttgttgagagcaataatttacccattcttaattccttttccaaactcgaggaa2760 ataagaatttggtcatgcaacaatcttcaaaaagtattatttccttcaaatatgatgggc2820 attcttccatgccttaaagtcttagatattagaggttgtgaattgttggaagggatattt2880 gaagtgcaagagccaattagtgttgttgagagcaatagtgtacccattcttaattccttt2940 tccaaactcgagaaaataagaatttggtcatgcaacaatcttcaaaaaatattatttcct3000 tcaaatatgatgggcattcttacatgccttaaagtcttagagatcagagattgtgaattg3060 ttggaagggatatttgaagtgcaagagccaattagtgttgttgaagcgagtcctatcgtg3120 ctccaaaatttaattaggttggaattatataatcttccaaaccttgagtacgtgtggagc3180 aaaaatccttgtgagcttctgagtttggaaaatataaaaagtttgaccattgaggaatgt3240 ccaagacttagaagagaatactcagtcaaaattttcaagccacttcaatatgtaagcata3300 gatatcaaacaattgatgaaggttattgagaaggaaaagtcagcagatcataatatgttg3360 gaatcaaagcaatgggagacttcttcttcttctaaggatggggttctacggctgggagat3420 ggttctaagttgtttccaaatcttaaaagtttgaagctatatggttttgttgattataac3480 tcaacccatttaccaatggaaatgttgcaaatcttattccaacttaaacactttgaattg3540 gaaggagcatttattgaagaaattttccccagcaatatactgatttcaagctctatggat3600 ttacagagtttggctctatataaactacccaagcttaagcatttgtggagtgaagaatgc3660 tcacgaaacaatatcacctcagttcttcaacatttgatttttctaagaatttcagattgt3720 ggaagattgagtagtttaactttagtgtcatcattagtgtgttttacaaacttgaaaagt3780 cttgcggtttataaatgtgatagactaacccatttgctgaatccttcgatggctacaacg3840 cttgtgcaacttcaagatttgacaataaaagaatgcaaaagaatgagaagtgtaattgag3900 gaaggatcaaccgaagaagatggaaatgatgaaatggttgtattcaacaacctacgacat3960 ttatacatttttaattgttccaacctaacaagcttttattgtgggagatgcatcgttaaa4020 ttcccatgtttggaaagagtattcattcaaaattgtcctgaaatgaaggtcttttcactt4080 ggaattgtaagcacgcctcgtttgaaatatgaaaagtttactttaatgaatgattacgat4140 gataaatggtgtcatctgaaatatcccaaatatatgttggtggaagatatgaatgtcatc4200 WO 2004/072109 ~g PCT/FR2004/000050 accagagaatattgggaggataatgttgataccggaattccaaatttatttgccgaacag4260 agtttggaggaaaaccgatctgaaaattcttcttcttcaaagaataatgttgagaaagaa4320 taaggaattatatggatattgttgtacactacttaatatatcatttcatccacaaggaaa4380 aggaagctgccaaataacctactcaatcctagcagatgcgttctttgcaagccggctgtc4440 gaagacttgaaccatattttcacaacctgtgccaattcgcaaatagcctctgggtcaaac4500 tgcacgacaaaattggtggaaactttgatacaaacagtatcaaagccctctgttggtctc4560 ttggctcgctgaaacaatcaaacagaaagaacatcattctctcgatgtaggtgtggatct4620 tcttttgtccatttgggtggaaagaaacaataggattttcatagacatagaaagaagctt4680 agtcacatttgggaagatatcgaaactttgattggaccatggtcgagtagaaacaaaatg4740 ttcaaagactacaatccaacatcaatctttaaactttagagctttgttagattaatgttt4800 gttgtatatggcttccctgtggccaaagaaatatacattgtaacaatggtttgatgaaat4860 gataatgaagtggtatggtgttaaaatcacctttatcactctgtgtttcaatttcaaaa 4919 <210> 6 <211> 1410 <212> PRT
<213> Cucumis melo <400> 6 Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr Val Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser Asn Phe Gln Lys Leu Lys Thr Gln Val Glu Lys Leu Lys Ile Thr Arg Glu Ser Val Gln His Lys Ile His Ser Ala Arg Arg Asn Ala Glu Asp Ile Lys Pro Ala Val Glu Glu Trp Leu Lys Lys Val Asp Asp Phe Val Arg Glu Ser Asp Glu Ile Leu Ala Asn Glu Gly Gly His Gly Gly Leu Cys Ser Thr Tyr Leu Val Gln Arg His Lys Leu Ser Arg Lys Ala Ser Lys Met Val Asp Glu Val Leu Glu Met Lys Asn Glu Gly Glu Ser Phe Asp 115 120 l25 Met Val Ser Tyr Lys Ser Val Ile Pro Ser Val Asp Cys Ser Leu Pro Lys Val Pro Asp Phe Ile Asp Phe Glu Ser Arg Lys Ser Ile Met Glu G1n Ile Met Asp Ala Leu Ser Asp Gly Asn Val His Arg Ile Gly Val 165 170 l75 Tyr Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Met Leu Val Lys Asp Ile Leu Arg Lys Ile Val Glu Ser Lys Lys Pro Phe Asp Glu Val Val Thr Ser Thr Ile Ser Gln Thr Pro Asp Phe Arg Ser Ile Gln Gly Gln Leu Ala Asp Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Gln Glu Thr Ile Glu Gly Arg Ala Thr Ile Leu Arg Lys Arg Leu Lys Met Glu Arg Ser Ile Leu Val Val Leu Asp Asp Val Trp Glu Tyr Ile Asp Leu Glu Thr Ile Gly Ile Pro Ser Val Glu Asp His Thr Gly Cys Lys Ile Leu Phe Thr Thr Arg Ile Lys His Leu Ile Ser Asn Gln Met Cys Ala Asn Lys Tle Phe Glu Ile 290 295 ~ 300 Lys Val Leu Gly Lys Asp Glu Ser Trp Asn Leu Phe Lys Ala Met Ala Gly Asp Ile Val Asp Ala Ser Asp Leu Lys Pro Ile Ala Ile Arg Ile Val Arg Glu Cys Ala Gly Leu Pro Ile Ala Ile Thr Thr Val Ala Lys Ala Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asp Ile Trp Asn Asp Ala Leu Asp Gln Leu Lys Ser Val Asp Val Gly Met Ala Asn Ile Gly Glu Met Glu Lys Lys Val Tyr Leu Ser Leu Lys Leu Ser Tyr Asp Cys Leu Gly Tyr Glu Glu Val Lys Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Met Phe Pro Glu Asp Phe Ser Ile Asp Val Glu Gly Leu His Val Tyr Ala Met Gly Met Gly Phe Leu His Gly Val Asp Thr Val Val Lys Gly Arg Arg Arg Ile Lys Lys WO 2004/072109 3~ PCT/FR2004/000050 Leu Val Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Gln Gln Tyr Ser Glu Tyr Gly Cys Asn Tyr Val Lys Met His Asp Met Val Arg Asp Val Ala Leu Leu Ile Ala Ser Lys Asn Glu His Val Arg Thr Leu Ser Tyr Val Lys Arg Ser Asn Glu Glu Trp Glu Glu Glu Lys Leu Leu Gly Asn His Thr Ala Val Phe Ile Asp Gly Leu His Tyr Pro Leu Pro Lys Leu Thr Leu Pro Lys Val Gln Leu Leu Arg Leu Va1 Ala Gln Asp Cys Trp Glu His Asn Lys Arg Val Ser Val Val Glu Thr Phe Phe Glu Glu Met Lys Glu Leu Lys Gly Leu Val Leu Ala Asn Val Asn Ile Ser Leu Met Gln Arg Thr Ser Asp Leu Tyr Ser Leu Ala Asn Ile Arg Val Leu Arg Leu Gln Ser Cys Asn Leu Leu Gly Ser Ile Asp Trp Ile Gly Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ile Leu Asp Phe Ile Gly Ser Asn Ile Thr Gln Ile Pro Thr Thr Met Ser Gln Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Asn Leu Ser Ser Cys His Gln Leu Lys Val Ile Pro Pro Asn Ile Leu Ser Lys Leu Thr Lys Leu Glu Glu Leu Ser Leu Glu Thr Phe Asp Arg Trp Glu Gly Glu Glu Trp Tyr Glu Gly Arg Lys Asn Ala Ser Leu Ser Glu Leu Lys Cys Leu Arg His Leu Tyr Ala Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asp Glu Glu Ile Met Pro Lys Asp Leu Phe Leu Ala Glu Glu Leu Lys Leu Gln Lys Phe Asn Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Lys Leu Lys Tyr Thr Phe Gly Pro, Thr Asn Arg Ile Lys Asn Phe Ile Ala Ile Lys Met Glu Ser Gly Arg Cys Leu Asp Asn Trp Ile Lys Asn Leu Leu Lys Arg Ser Asp Asn Val Phe Leu Glu Gly Ser Ile Cys Ser Lys Val Leu His Ser Glu Leu Val Gly Ala Asn Asp Phe Val Ser Leu Pro Asn Leu Glu Lys Leu Glu Ile Val Asn Ala Lys Ser Leu Lys Met Ile Trp Ser Asn Asn Val Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Lys Ile Tyr Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Pro Asn Met Met Asp Ile Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Lys Asn Cys Asp Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Asn Leu Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile Leu Pro Cys Leu Lys Val Leu Asp Ile Arg Gly Cys Glu Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Ser Val Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Lys Ile Arg Ile Trp Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Ile Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Arg Asp Cys Glu Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ala Ser Pro Ile Val Leu Gln Asn Leu Ile Arg Leu Glu Leu Tyr Asn Leu Pro Asn Leu Glu Tyr Val Trp Ser Lys Asn Pro Cys Glu Leu Leu Ser Leu Glu Asn Ile Lys Ser Leu Thr Ile Glu Glu Cys Pro Arg Leu Arg Arg Glu Tyr Ser Val Lys Ile Phe Lys Pro Leu Gln Tyr Val Ser Ile Asp Ile Lys Gln Leu Met Lys Val Ile Glu Lys Glu Lys Ser Ala Asp His Asn Met Leu Glu Ser Lys Gln Trp Glu Thr Ser Ser Ser Ser Lys Asp G1y Val Leu Arg Leu Gly Asp Gly Ser Lys Leu Phe Pro Asn Leu Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gly Phe Val Asp Tyr Asn Ser Thr His Leu Pro Met Glu Met Leu Gln Ile Leu Phe Gln Leu Lys His Phe Glu Leu Glu Gly Ala Phe Ile Glu Glu Ile Phe Pro Ser Asn Ile Leu Ile Ser Ser Ser Met Asp Leu Gln Ser Leu Ala Leu Tyr Lys Leu Pro Lys Leu Lys His Leu Trp Ser Glu Glu Cys Ser Arg Asn Asn Ile Thr Ser Val Leu Gln His Leu Ile Phe Leu Arg Ile Ser Asp Cys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Thr Leu Val Ser Ser Leu Val Cys Phe Thr Asn Leu Lys Ser Leu Ala Val Tyr Lys Cys Asp Arg Leu Thr His Leu Leu Asn Pro Ser Met Ala Thr Thr Leu Val Gln Leu Gln Asp Leu Thr Ile Lys Glu Cys Lys Arg Met Arg Ser Val Ile Glu Glu Gly Ser Thr Glu Glu Asp Gly Asn Asp Glu Met Val Val Phe Asn Asn Leu Arg His Leu Tyr Ile Phe Asn Cys Ser Asn Leu Thr Ser Phe Tyr Cys Gly Arg Cys Ile Val Lys Phe Pro Cys Leu Glu Arg Val Phe Ile Gln Asn Cys Pro Glu Met Lys Val Phe Ser Leu Gly Ile Val Ser Thr Pro Arg Leu LysTyr Glu LysPheThr Leu MetAsn AspTyrAsp Asp LysTrp CysHis Leu LysTyrPro Lys TyrMet LeuValGlu Asp MetAsn ValIle Thr ArgGluTyr Trp GluAsp AsnValAsp Thr GlyIle ProAsn Leu PheAlaGlu Gln SerLeu GluGluAsn Arg SerGlu AsnSer Ser SerSerLys Asn AsnVal GluLysGlu <210> 7 <211> 27 <212> DNA
<2l3> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR F2-B2 du marqueur L273 <400> 7 ggagagagaa tccgggacta agtgact <210> 8 <211> 29 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR F2-Br du marqueur L273 <400> 8 taaccacctt ttccgatcaa atttcgtac 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR F2-B2 Eco du marqueur L246 <400> 9 attgatgaat ctacactcct cgatctcttc 30 <210> 10 <2l1> 30 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR F2 Eco du marqueur L246 <400> 10 gagttcaatc catttcaatg atttaagata 30 <210> 11 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR V681 du marqueur V681 <400> 11 ggaatcttgt tgaggccgag aggg 24 <210> l2 <2ll> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR V681R du marqueur V681 <400> 12 gttgtatatg gcttccctgt agcc <210> 13 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR V588 du marqueur V1684 <400> 13 caacaggctc aacagtgtat tcgg 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA
<213> Artifïcial sequence <220>
<223> amorce PCR V551R du marqueur V1684 <400> l4 gaagaaggtg acgagagaga tgcc 24 <210> l5 <211> 24 <212>~ DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR V432 du marqueur V432 <400> 15 aacttctcca actccctcca ctgc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR V432R du marqueur V432 <400> 16 ttagagtggc aaagggaaga tggg <210> 17 <21l> 24 <2l2> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR GRP805 du marqueur GRP805 <400> 17 atcccctgtt tccttcaaca accc 24 <210> 18 <21l> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR GRP805R du marqueur GRP805 <400> 18 aacccccaag aagaagaaca accc 24 <210> 19 <2ll> 26 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR M8 du marqueur M8 <400> 19 ccgacgcatc tcccgacgcg ttgttg 26 <210> 20 <211> 27 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR M8R du marqueur M8 <400> 20 tcgtgaaggg ttttggagag tgagaaa 27 <210> 21 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR1 du marqueur E
<400> 21 ccttagaaga agatgaagtc tccc 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR842R du marqueur E
<400> 22 ctccactcag aattggtagg tgcc 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR915 du marqueur D
<400> 23 aacaacttag aaccatctcc cagc 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA
<2l3> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR1 du marqueur D
<400> 24 gttgttgaga gcaatagtgt accc 24 <210> 25 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR Kana II
<400> 25 ccggctacct gcccattc 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR Kana III
<400> 26 gcgatagaag gcgatgcg <210> 27 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR PicaA+
<400> 27 atgcgcatga ggctcgtctt cgag 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA
<213> Artïficial sequence <220>
<223> amorce PCR PicaA-<400> 28 gacgcaacgc atcctcgatc agct 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificïal sequence <220>
<223> amorce PCR Vat 6328 <400> 29 ctggtgatga cattcatatc ttcc 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR Vat 632F
<400> 30 cccagcaaca tactgattcc aagc . 24 <210> 31 <211> 1s <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR Kana R
<400> 31 ccggctacct gccattcg 18 <210> 32 <211> 22 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR F
<400> 32 gttgttgaga gcaatagtgt ac 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR R
<400> 33 ccttagagaa gaatgaagtc tc 22
<213> Cucumis melo <400> 2 attattatggttcattcctcgtggttttttagctcttcaagtatttttgtaggttttgat60 ccttttcaagctcaagaacagaggataataatggacatccttatttcagtcactgcaaaa120 attgccgaatacactgttgagcctgttggacgccaacttggttatgtatttttcattcgt180 tccaactttcaaaaacttaagactcaagtagaaaagctgaagattacaagagagtctgtg240 caacacaagatccatagtgcaagaagaaatgctgaagacataaaacctgccgttgaggaa300 tggttgaaaaaggtcgatgactttgtccgagaatctgacgagatattagccaatgaaggt360 ggacatggtggactctgttccacctatttggtccaacgacacaagttaagtagaaaagca420 agcaaaatggtagatgaggttcttgagatgaaaaatgagggggaaagttttgatatggta480 tcctataaaagtgttatcccatcagttgattgttcacttccaaaagtgcctgactttctt540 gactttgagt caagaaagtc gattatggaa caaatcatgg atgcactatc tgatggtaat 600 gtccatagga ttggagtata tgggatgggg ggtgttggca aaacaatgct agtgaaggat 660 attttaagaa aaattgtgga gagtaagaag ccttttgatg aggtggtaac atccacgatc 720 agccaaacac cagattttag aagtatccaa ggacaactag ctgacaagct aggtttgaaa 780 ttcgaacaag aaacaataga aggaagggct actattctac gaaagaggtt aaagatggag 840 agaagtatcc tagttgtgtt ggatgatgtt tgggagt'ata ttgatttgga aactatagga 900 attccaagtg ttgaagatca tacggggtgc aagatcttgt ttaccactag gattaaacat 960 ttgatctcaa atcaaatgtg cgccaataaa atttttgaga taaaagtttt aggaaaagat 1020 gagtcatgga atttatttaa ggcaatggca ggtgacattg ttgatgcaag tgatttgaag 1080 cctatagcca ttcgaattgt gagagaatgt gcaggtttgc ctattgctat tactactgtt 1140 gctaaggcat tacgaaataa accttccgac atttggaatg atgccttaga tcagcttaaa 1200 actgttgatg tgggtatggc aaacattgga gaaatggaaa agaaagtgta tttgtcacta 1260 aaactgagtt acgattgctt gggatatgaa gaggtgaagt tattattctt gttatgcagc 1320 atgtttccag aagactttag cattgacgtg gaagggttgc atgtatatgc catgggcatg 1380 ggattcttac atggtgttga tactgtggta aaaggacgac gtaggataaa aaaattggtt 1440 gatgatctta tatcttcttc tttgcttcaa caatattctg agtatgggtg caattatgtg 1500 aaaatgcatg atatggttcg tgatgtagcc ctattaattg catctaagaa tgaacacgta 1560 cgtacattga gctatgtgaa aagatcgaat gaagaatggg aagaagagaa actattgggt 1620 aatcataccg cagtgttcat tgatggttta cattatcctc tcccgaagtt aacgttaccc 1680 aaagttcaat tattaaggtt agttgcaaaa tattgttggg 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<213> Cucumis melo <400>
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<213> Cucumis melo <400>
attattatggttcattcctcgtggttttttagctcttcaagtatttttgtaggttttgat60 ccttttcaagctcaagaacagaggataataatggacatccttatttcagtcactgcaaaa120 attgctgaatacactgttgagcctgttggacgccaacttggttatgtatttttcattcgt180 tccaactttcaaaaacttaagactcaagtagaaaagctgaagattacaagagagtctgtg240 caacacaagatccatagtgcaagaagaaatgctgaagacataaaacctgccgttgaggaa300 tggttgaaaaaggtcgatgactttgttcgagaatctgacgagatattagccaatgaaggt360 ggacatggtggactctgttccacctatttggtccaacgacacaagttaagtagaaaagca420 agcaaaatggtagatgaggttcttgagatgaaaaatgagggggaaagttttgatatggta480 tcctataaaagtgttatcccatcagttgattgttcacttccaaaagtgcctgactttatt540 gactttgagtcaagaaagtcgattatggaacaaatcatggatgcactatctgatggtaat600 gtccataggattggagtatatgggatggggggtgttggcaaaacaatgctagtgaaggat660 attttaagaaaaattgtggagagtaagaagccttttgatgaggtggtaacatccacgatc720 agccaaacaccagattttagaagtatccaaggacaactagctgacaagctaggtttgaaa780 ttcgaacaagaaacaatagaaggaagggctactattctacgaaagaggttaaagatggag840 agaagtatcctagttgtgttggatgatgtttgggagtatattgatttggaaactatagga900 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aatatatcattgatgcaacgaacatctgatctttactccttagcaaacatcagagtatta1860 cgtttgcaaagctgtaatttattagggagcatagattggattggtgaattaaaaaagctt1920 WO 2004/072109 ~7 PCT/FR2004/000050 gaaattcttgattttataggatctaacatcacacaaattcctacaaccatgagccaattg1980 acacaactcaaagtgttaaatttatcttcttgtcatcaactcaaggtaattccaccaaat2040 attctttcaaagttgacaaaactggaagaattaagtctggaaacttttgatagatgggaa2100 ggagaagaatggtatgaaggaaggaaaaatgctagcctttctgaactcaagtgcttgcga2160 catctttatgctttaaatttaaccattcaagatgaagaaattatgccaaaagatttgttt2220 ttagctgaggagttgaagcttcaaaaattcaacatttgtattggttaccaaagcaaatta2280 aagtatacttttggacccacaaacagaatcaaaaacttcattgcaatcaagatggaatca2340 ggaaggtgcttggataattggataaaaaatttgttaaagaggtcggacaatgtgtttttg2400 gaaggatcaatttgttcaaaggttctccactcagaattggtaggtgcaaatgacttcgta2460 tcgcttcctaatttggagaagttggaaattgtgaatgcaaagagtttgaagatgatatgg2520 agcaataacgtgccaattcttaattccttttccaaactcgaggaaataaaaatttattca2580 tgcaacaatcttcaaaaagtattatttcctccaaatatgatggacattctcacatgcctt2640 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gaaggagcatttattgaagaaattttccccagcaatatactgatttcaagctctatggat3600 ttacagagtttggctctatataaactacccaagcttaagcatttgtggagtgaagaatgc3660 tcacgaaacaatatcacctcagttcttcaacatttgatttttctaagaatttcagattgt3720 ggaagattgagtagtttaactttagtgtcatcattagtgtgttttacaaacttgaaaagt3780 cttgcggtttataaatgtgatagactaacccatttgctgaatccttcgatggctacaacg3840 cttgtgcaacttcaagatttgacaataaaagaatgcaaaagaatgagaagtgtaattgag3900 gaaggatcaaccgaagaagatggaaatgatgaaatggttgtattcaacaacctacgacat3960 ttatacatttttaattgttccaacctaacaagcttttattgtgggagatgcatcgttaaa4020 ttcccatgtttggaaagagtattcattcaaaattgtcctgaaatgaaggtcttttcactt4080 ggaattgtaagcacgcctcgtttgaaatatgaaaagtttactttaatgaatgattacgat4140 gataaatggtgtcatctgaaatatcccaaatatatgttggtggaagatatgaatgtcatc4200 WO 2004/072109 ~g PCT/FR2004/000050 accagagaatattgggaggataatgttgataccggaattccaaatttatttgccgaacag4260 agtttggaggaaaaccgatctgaaaattcttcttcttcaaagaataatgttgagaaagaa4320 taaggaattatatggatattgttgtacactacttaatatatcatttcatccacaaggaaa4380 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<213> Cucumis melo <400> 6 Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr Val Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser Asn Phe Gln Lys Leu Lys Thr Gln Val Glu Lys Leu Lys Ile Thr Arg Glu Ser Val Gln His Lys Ile His Ser Ala Arg Arg Asn Ala Glu Asp Ile Lys Pro Ala Val Glu Glu Trp Leu Lys Lys Val Asp Asp Phe Val Arg Glu Ser Asp Glu Ile Leu Ala Asn Glu Gly Gly His Gly Gly Leu Cys Ser Thr Tyr Leu Val Gln Arg His Lys Leu Ser Arg Lys Ala Ser Lys Met Val Asp Glu Val Leu Glu Met Lys Asn Glu Gly Glu Ser Phe Asp 115 120 l25 Met Val Ser Tyr Lys Ser Val Ile Pro Ser Val Asp Cys Ser Leu Pro Lys Val Pro Asp Phe Ile Asp Phe Glu Ser Arg Lys Ser Ile Met Glu G1n Ile Met Asp Ala Leu Ser Asp Gly Asn Val His Arg Ile Gly Val 165 170 l75 Tyr Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Met Leu Val Lys Asp Ile Leu Arg Lys Ile Val Glu Ser Lys Lys Pro Phe Asp Glu Val Val Thr Ser Thr Ile Ser Gln Thr Pro Asp Phe Arg Ser Ile Gln Gly Gln Leu Ala Asp Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Gln Glu Thr Ile Glu 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<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR F2 Eco du marqueur L246 <400> 10 gagttcaatc catttcaatg atttaagata 30 <210> 11 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
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<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR V588 du marqueur V1684 <400> 13 caacaggctc aacagtgtat tcgg 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA
<213> Artifïcial sequence <220>
<223> amorce PCR V551R du marqueur V1684 <400> l4 gaagaaggtg acgagagaga tgcc 24 <210> l5 <211> 24 <212>~ DNA
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<223> amorce PCR V432 du marqueur V432 <400> 15 aacttctcca actccctcca ctgc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA
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<223> amorce PCR GRP805R du marqueur GRP805 <400> 18 aacccccaag aagaagaaca accc 24 <210> 19 <2ll> 26 <212> DNA
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<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR1 du marqueur E
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<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR842R du marqueur E
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<223> amorce PCR LRR915 du marqueur D
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<2l3> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR1 du marqueur D
<400> 24 gttgttgaga gcaatagtgt accc 24 <210> 25 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR Kana II
<400> 25 ccggctacct gcccattc 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR Kana III
<400> 26 gcgatagaag gcgatgcg <210> 27 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR PicaA+
<400> 27 atgcgcatga ggctcgtctt cgag 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA
<213> Artïficial sequence <220>
<223> amorce PCR PicaA-<400> 28 gacgcaacgc atcctcgatc agct 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificïal sequence <220>
<223> amorce PCR Vat 6328 <400> 29 ctggtgatga cattcatatc ttcc 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR Vat 632F
<400> 30 cccagcaaca tactgattcc aagc . 24 <210> 31 <211> 1s <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR Kana R
<400> 31 ccggctacct gccattcg 18 <210> 32 <211> 22 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR F
<400> 32 gttgttgaga gcaatagtgt ac 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR LRR R
<400> 33 ccttagagaa gaatgaagtc tc 22
Claims (18)
1) Polynucléotide isolé choisi parmi:
a) un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ;
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ;
c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b).
a) un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ;
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ;
c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b).
2) Polynucléotide selon la revendication 1, choisi parmi:
a) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 ;
b) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2 ;
c) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ou du polynucléotide b) ;
d) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec l'un quelconque des polynucléotides a), b) ou c).
a) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 ;
b) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2 ;
c) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ou du polynucléotide b) ;
d) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec l'un quelconque des polynucléotides a), b) ou c).
3) Polynucléotide constitué par un fragment d'au moins 10 pb d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
4) Polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, et pouvant être obtenu par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc d'une plante à l'aide d'au moins une sonde d'acide nucléique et/ou d'au moins un couple d'amorces d'amplification obtenus à partir d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3.
5) Marqueur génétique permettant la détection de la présence ou de l'absence d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance à Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les marqueurs suivants : L273, L246, V681, V1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, marqueur D, respectivement définis par les amorces suivantes:
F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8) F2-B2 Eco : ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) F2 Eco : GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10) V681:
V681 : GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11) V681R : GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) V1684:
V588: CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) V551R: GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14) V432:
V432: AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15) V432R: TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) GRP805:
GRP805: ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17) GRP805R: AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18) M8:
M8: CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) M8R: TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Marqueur E:
LRR1 : CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21) LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) Marqueur D:
LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) LRR1R : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8) F2-B2 Eco : ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) F2 Eco : GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10) V681:
V681 : GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11) V681R : GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) V1684:
V588: CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) V551R: GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14) V432:
V432: AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15) V432R: TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) GRP805:
GRP805: ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17) GRP805R: AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18) M8:
M8: CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) M8R: TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Marqueur E:
LRR1 : CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21) LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) Marqueur D:
LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) LRR1R : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
6) Couple d'amorces permettant l'amplification de l'un des marqueurs tel que défini dans la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi:
- le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 7 et SEQ
ID NO : 8, - le couple d'amorces constitué par les polunucléotides SEQ ID NO : 9 et SEQ
ID NO : 10, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 20, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22, et - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24.
- le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 7 et SEQ
ID NO : 8, - le couple d'amorces constitué par les polunucléotides SEQ ID NO : 9 et SEQ
ID NO : 10, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 20, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22, et - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24.
7) Kit pour détecter la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 6.
8) Utilisation d'au moins un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3 pour détecter la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
9) Utilisation d'au moins un marqueur génétique selon la revendication 5 pour détecter la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
10) Utilisation selon une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que ladite plante est une cucurbitacée.
11) Procédé de détection de la résistance ou de la sensibilité d'une plante au puceron Aphis gossypii et/ou de la résistance à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène Vat présente chez ladite plante.
12) Cassette d'expression comprenant un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
13) Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3 ou une cassette d'expression selon la revendication 12.
14) Cellule génétiquement transformée par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3.
15) Utilisation d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la production d'une plante transgénique résistante au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron.
16) Plante transgénique génétiquement transformée par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
17) Plante transgénique selon la revendication 16, choisie parmi les cucurbitacées, les malvacées et les solanacées.
18) Polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il possède au moins 80% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO : 3.
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