KR20170120186A - 곤충 해충을 방제하기 위한 rna 중합효소 ii33 핵산 분자 - Google Patents

곤충 해충을 방제하기 위한 rna 중합효소 ii33 핵산 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충을 포함한, 곤충 해충에서 타겟 코딩 및 전사된 비-코딩 서열의 RNA 간섭-매개 억제를 통해 곤충 해충 방제하기 위한 핵산 분자 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 곤충 해충의 방제에 유용한 핵산 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물을 제조하는 방법, 이에 의해 수득된 식물 세포 및 식물에 관한 것이다.

Description

곤충 해충을 방제하기 위한 RNA 중합효소 II33 핵산 분자
우선권 주장
본 출원은 “RNA POLYMERASE II33 NUCLEIC ACID MOLECULESTO CONTROL INSECT PESTS”로 2015년 3월 13일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 제62/133,210호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 곤충 해충 (예를 들어, 딱정벌레목(coleopteran) 해충 및 노린재목(hemipteran) 해충)에 의해 야기되는 식물 피해의 유전적 방제에 관한 것이다. 특정한 구현예에서, 본 발명은 타겟 코딩 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드의 식별, 및 곤충 해충의 세포에서의 타겟 코딩 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드의 발현을 전사후 저해하거나 억제하여 식물 보호 효과를 제공하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용에 관한 것이다.
서부 옥수수 뿌리벌레(WCR)인 디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)는 북미에서 가장 파괴적인 옥수수 뿌리벌레 종 중 하나이며, 미국 중서부의 옥수수 재배 지역에서 특히 우려되는 사항이다. 북부 옥수수 뿌리벌레(NCR)인 디아브로티카 바르베리 스미스 및 로렌스(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)는 WCR과 거의 동일한 범위에서 공동 서식하는 밀접하게 관련된 종이다. 아메리카에서 유의한 해충인 디아브로티카의 여러 다른 관련된 아종이 존재한다: 멕시코 옥수수 뿌리벌레(MCR), D. 비르기페라 제아에 크리산 및 스미스(D. virgifera zeae Krysan and Smith); 남부 옥수수 뿌리벌레(SCR), D. 운데심푼크타타 호와르디 바버(D. undecimpunctata howardi Barber); D. 발테아타 르콩트(D. balteata LeConte); D. 운데심푼크타타 테넬라(D. undecimpunctata tenella); D. 스페시오사 게르마(D. speciosa Germar); 및 D. u. 데심푼크타타 만네르헤임(D. u. undecimpunctata Mannerheim). 미국 농무부(United States Department of Agriculture)는 옥수수 뿌리벌레가 8억 달러의 수확량 손실 및 2억 달러의 처리 비용을 포함하여 매년 10억 달러의 수익 손실을 유발한다고 추정하고 있다.
WCR 및 NCR 알(egg) 둘 다 여름 동안 토양에 침적된다. 곤충은 겨울 내내 알 단계로 유지된다. 알은 장방형이고, 백색이며, 길이는 0.004 인치 미만이다. 유충은 5월 하순 또는 6월 초순에 부화되고, 정확한 알 부화 시기는 온도차 및 지역에 기인하여 해마다 달라진다. 새로 부화된 유충은 길이가 0.125 인치 미만인 백색 벌레이다. 일단 부화되면, 유충은 옥수수 뿌리를 섭식하기 시작한다. 옥수수 뿌리벌레는 3회의 유충 령기(larval instar)를 거친다. 수주 동안 섭식한 후, 유충은 번데기 단계로 탈피한다. 이들은 토양에서 용화된 후, 7월 및 8월에 토양으로부터 성충으로서 출현한다. 성충 뿌리벌레는 길이가 약 0.25 인치이다.
옥수수 뿌리벌레 유충은 옥수수 및 여러 다른 종의 초목에서 발생을 완료한다. 금강아지풀(yellow foxtail)에서 길러진 유충은 더 늦게 출현하고, 성충으로서 머리통의 크기는 옥수수에서 길러진 유충보다 작다. Ellsbury 등 (2005) Environ. Entomol. 34:627-34. WCR 성충은 옥수수 수염, 화분(pollen), 및 이삭 끝에 노출된 커넬(kernel)을 섭식한다. 옥수수 생식 조직이 존재하기 전에 WCR 성충이 출현하면, 이들은 잎 조직을 섭식할 수 있고, 이에 따라 식물 성장을 저하시키고 때로는 숙주 식물을 죽인다. 그러나, 성충은 선호하는 수염 및 화분을 이용할 수 있게 되면 그쪽으로 빠르게 이동할 것이다. NCR 성충은 또한 옥수수 식물의 생식 조직을 섭식하지만, 대조적으로 옥수수 잎을 섭식하는 경우는 거의 없다.
옥수수에서 뿌리벌레 피해의 대부분은 유충의 섭식에 의해 야기된다. 새로 부화된 뿌리벌레는 초기에는 옥수수의 뿌리털을 섭식하고, 근단으로 파고 들어간다. 유충의 크기가 점점 커짐에 따라, 이들은 일차 뿌리를 섭식하고, 그 안으로 파고 들어간다. 옥수수 뿌리벌레가 풍부하게 존재할 때, 유충의 섭식은 종종 옥수수대의 기저부까지 전면적으로 뿌리 전정(pruning)을 유발한다. 심각한 뿌리 상해는 뿌리가 물과 영양분을 식물 내로 수송할 수 있는 능력을 방해하고, 식물 성장을 감소시키며, 곡실 생산을 감소시켜서, 종종 전체 수확량을 대폭 감소시킨다. 심각한 뿌리 상해는 또한 종종 옥수수 식물을 도복시키며, 이로 인해 수확은 더 어려워지고, 수확량은 더 감소하게 된다. 추가로, 성충이 옥수수 생식 조직을 섭식하게 되면, 이삭 끝의 수염의 전정이 일어날 수 있다. 이러한 "수염 클리핑(silk clipping)"이 화분 방출 동안에 충분히 심각하게 일어난다면, 수분은 파괴될 수 있다.
옥수수 뿌리벌레의 방제는 윤작, 화학적 살곤충제, 생물살충제 (예를 들어, 포자-형성 그람-양성 박테리아인 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis),(Bt)), Bt 독소를 발현하는 트랜스제닉 식물, 또는 그의 조합에 의해 시도될 수 있다. 윤작은 농지 사용에 대해 원치않는 제한이 따른다는 단점으로 고충이 있다. 더욱이, 일부 뿌리벌레 종의 산란은 대두 재배지에서 발생할 수 있으며, 이에 따라 옥수수 및 대두로 실시되는 윤작의 효과를 경감시킬 수 있다.
화학적 살곤충제는 옥수수 뿌리벌레 방제를 달성하기 위해 가장 크게 의존하는 전략이다. 화학적 살곤충제 사용이, 비록 불완전한 옥수수 뿌리벌레 방제 전략이기는 하지만; 살곤충제 사용에도 불구하고 일어날 수 있는 뿌리벌레 피해의 비용에 화학적 살곤충제 비용이 더해질 때, 매년 미국에서는 옥수수 뿌리벌레에 기인하여 10억 달러 초과가 손실될 수 있다. 높은 유충 개체수, 폭우 및 살곤충제(들)의 부적절한 적용은 모두 부적절한 옥수수 뿌리벌레 방제를 야기할 수 있다. 추가로, 살곤충제를 계속해서 사용하게 되면 살곤충제-저항성 뿌리벌레 균주가 선택될 수 있을 뿐만 아니라, 비-타겟 종에 대한 독성으로 인해 환경에 대한 유의한 우려가 제기될 수 있다.
노린재(stink bug) 및 다른 노린재류 곤충 (노린재목)은 또 다른 중요한 농업상 해충 복합체를 구성한다. 전세계적으로 50 종이 넘는 밀접하게 관련된 노린재 종이 작물 피해를 유발하는 것으로 알려져 있다. McPherson & McPherson (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico, CRC Press. 노린재류 곤충은 메이즈(maize), 대두, 과일, 채소 및 곡류를 포함한 수많은 중요한 작물에 존재한다.
노린재는 성충 단계에 도달하기 전에 다수의 약충기(nymph stage)를 거친다. 이 곤충은 약 30-40일 만에 알에서 성충으로 발달한다. 약충 및 성충 둘 다 이들이 구강외 조직 소화 및 괴사를 유발하는 소화 효소를 또한 주사하는 연부 조직으로부터 수액을 섭식한다. 이어서, 소화된 식물 물질 및 영양분이 섭취된다. 식물 관다발계로부터의 물 및 영양분의 고갈은 식물 조직 피해를 야기한다. 발달 중인 곡실 및 종자에 대한 피해는 수확량 및 발아가 유의하게 감소되므로 가장 유의하다. 다수의 세대는 유의한 곤충 압력을 야기하는 온난 기후에서 일어난다. 노린재의 현행 관리는 개별 재배지 기준으로 살곤충제 처리에 의존한다. 따라서, 진행 중인 작물 손실을 최소화하는 대안적인 관리 전략이 긴급히 필요하다.
RNA 간섭 (RNAi)은 내인성 세포 경로를 이용하는 과정이며, 이에 의해 타겟 유전자의 전부, 또는 적절한 크기의 임의의 부분에 특이적인 간섭 RNA (iRNA) 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)는 그에 의해 코딩되는 mRNA의 분해를 야기한다. 최근 수년간, RNAi는 수많은 종 및 실험 시스템; 예를 들어 카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 식물, 곤충 배아 및 조직 배양의 세포에서 유전자 "녹다운(knockdown)"을 수행하는데 사용되었다. 예를 들어, Fire 등 (1998) Nature 391:806-11; Martinez 등 (2002) Cell 110:563-74; McManus 및 Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47을 참조한다.
RNAi는 다이서(DICER) 단백질 복합체를 포함한 내인성 경로를 통해 mRNA의 분해를 달성한다. DICER는 긴 dsRNA 분자를, 소형 간섭 RNA (siRNA)로 불리는, 대략 20개의 뉴클레오티드의 짧은 단편으로 절단한다. siRNA는 2개의 단일-가닥 RNA: 운반자 가닥(passenger strand) 및 가이드 가닥(guide strand)으로 풀린다. 운반자 가닥은 분해되고, 가이드 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 혼입된다. 마이크로 리보핵산(micro ribonucleic acid, miRNA)은 혼성화된 운반자 가닥과 가이드 가닥을 연결하는 폴리뉴클레오티드 "루프"를 포함하는 전구체 분자로부터 절단되는, 구조적으로 매우 유사한 분자들이며, 이들은 유사하게 RISC 내로 혼입될 수 있다. 가이드 가닥이 상보적 mRNA 분자에 특이적으로 결합하고, RISC 복합체의 촉매 성분인 아르고노트(Argonaute)에 의한 절단을 유도할 때, 전사후 유전자 침묵이 일어난다. 이 과정은, 예컨대 식물, 선충류 및 일부 곤충 같은 일부 진핵생물에서는 초기에 siRNA 및/또는 miRNA의 농도가 제한됨에도 불구하고, 유기체 전반에 걸쳐 전신 확산되는 것으로 공지되어 있다.
siRNA 및/또는 miRNA에 상보적인 전사물 만 절단되고 분해되며, 따라서 mRNA 발현의 녹다운은 서열 특이적이다. 식물에는, DICER 유전자의 여러 가지 작용기가 존재한다. RNAi의 유전자 침묵 효과는 수일 동안 지속되며, 실험 조건 하에서, 표적화된 전사물의 90% 이상이 감소할 수 있고, 결과적으로 대응하는 단백질의 수준이 감소할 수 있다. 곤충에는, 적어도 두 개의 DICER 유전자가 있는데, DICER1는 Argonaute1에 의한 miRNA-매개 분해를 촉진시킨다. Lee 등 (2004) Cell 117 (1):69-81. DICER2는 Argonaute2에 의한 siRNA-매개 분해를 촉진시킨다.
미국 특허 제7,612,194호 및 미국 특허 공개 번호 제2007/0050860호, 제2010/0192265호 및 제2011/0154545호는, D. v. 비르기페라 르콩트 번데기로부터 단리된 9112개의 발현된 서열 태그 (EST) 서열의 라이브러리를 개시한다. 미국 특허 제7,612,194호 및 미국 특허 공개 번호 제2007/0050860호에는, 식물 세포에서의 안티-센스 RNA의 발현을 위한 것으로 본원에 개시된 D. v. 비르기페라 액포-형 H+-ATPase (V-ATPase)의 여러 특정한 부분적 서열 중 1개에 상보적인 핵산 분자를 프로모터에 작동가능하게 연결시키는 것이 제시되어 있다. 미국 특허 공개 번호 제2010/0192265호는, 식물 세포에서의 안티-센스 RNA의 발현을 위한 미지의 개시되지 않은 기능의 D. v. 비르기페라 유전자의 특정한 부분적 서열 (부분적 서열은 C. 엘레간스에서의 C56C10.3 유전자 산물에 대해 58% 동일한 것으로 기재됨)에 상보적인 핵산 분자에 프로모터를 작동가능하게 연결시키는 것을 제시하고 있다. 미국 특허 공개 번호 제2011/0154545호는, 식물 세포에서의 안티-센스 RNA의 발현을 위한 D. v. 비르기페라 코토머 베타 서브유닛 유전자 중 2개의 특정한 부분적 서열에 상보적인 핵산 분자에 프로모터를 작동가능하게 연결시키는 것을 제시하고 있다. 추가로, 미국 특허 제7,943,819호는, D. v. 비르기페라 르콩트 유충, 번데기 및 해부된 중장으로부터 단리된 906개의 발현된 서열 태그 (EST) 서열의 라이브러리를 개시하고, 식물 세포에서의 이중-가닥 RNA의 발현을 위한 D. v. 비르기페라 적재된 다소포체 단백질 4b 유전자의 특정한 부분적 서열에 상보적인 핵산 분자에 프로모터를 작동가능하게 연결시키는 것을 제시하고 있다.
미국 특허 제7,612,194호 및 미국 특허 공개 번호 제2007/0050860호, 제2010/0192265호 및 제2011/0154545호에는, V-ATPase의 여러 특정한 부분적 서열 및 미지의 기능의 유전자의 특정한 부분적 서열 이외에, RNA 간섭을 위한 것으로 열거된 9천개 넘는 서열 중 임의의 특정한 서열을 사용하는 것에 대한 추가적인 제시가 제공되어 있지 않다. 게다가, 미국 특허 제7,612,194호 및 미국 특허 공개 번호 제2007/0050860호 및 제2010/0192265호 및 제2011/0154545호 중 어는 것도, 제공된 9천개 넘는 서열 중 어느 다른 것이 dsRNA 또는 siRNA로서 사용될 때 옥수수 뿌리벌레 종에서 치명적일 수 있거나 또는 심지어 이와 다르게는 유용할 수 있을 지에 관한 아무런 지침도 제공하고 있지 않다. 미국 특허 제7,943,819호는, 적재된 다소포체 단백질 4b 유전자의 특정한 부분적 서열 이외에, RNA 간섭을 위한 것으로 열거된 9백개 넘는 서열 중 임의의 특정한 서열을 사용하는 것에 대한 아무런 제시도 제공하고 있지 않다. 추가로, 미국 특허 제7,943,819호는, 제공된 9백개 넘는 서열 중 어느 다른 것이 dsRNA 또는 siRNA로 사용될 때 옥수수 뿌리벌레 종에서 치명적일 수 있거나 또는 심지어 이와 다르게는 유용할 수 있을 지에 관한 어떠한 지침도 제공하고 있지 않다. 미국 특허 출원 공개 번호 제U.S. 2013/040173호 및 PCT 출원 공개 번호 WO 2013/169923은, 메이즈에서 RNA 간섭을 위한 디아브로티카 비르기페라 Snf7 유전자로부터 유래된 서열의 사용을 기술하고 있다. (또한 Bolognesi 등 (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534에 개시되어 있음).
옥수수 뿌리벌레 DNA에 상보적인 서열 (예컨대, 상기의 것) 중 압도적 대다수는 dsRNA 또는 siRNA로 사용될 때 옥수수 뿌리벌레 종으로부터의 식물 보호 효과를 제공지 않는다. 예를 들어, Baum 등 (2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326은, RNAi에 의해 여러 WCR 유전자 타겟을 억제하는 효과를 기재한다. 이 저자들은, 그들이 시험한 26개의 타겟 유전자 중 8개는 520 ng/cm2 초과의 매우 높은 iRNA (예를 들어, dsRNA) 농도에서 실험상 유의한 딱정벌레류 해충 사멸률을 제공할 수 없다고 보고하였다.
미국 특허 제7,612,194호 및 미국 특허 공개 번호 제2007/0050860호의 저자들은 서부 옥수수 뿌리벌레를 타겟화하는 옥수수 식물에서의 식물 내 RNAi를 처음으로 보고하였다. Baum 등 (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6. 이 저자들은 트랜스제닉 RNAi 메이즈를 발생시키기 위한 잠재적 타겟 유전자를 스크리닝하기 위한 고처리량 생체 내 식이 RNAi 시스템을 기재한다. 290개 타겟의 초기 유전자 풀 중에서, 단지 14개 만이 유충 방제 잠재력을 나타내었다. 가장 효과적인 이중-가닥 RNA (dsRNA) 중 하나는 액포 ATPase 서브유닛 A (V-ATPase)를 코딩하는 유전자를 타겟화하여, 상응하는 내인성 mRNA의 신속한 억제를 야기하고 낮은 농도의 dsRNA에 의해 특이적 RNAi 반응을 촉발시켰다. 이에 따라, 이 저자들은 가능한 해충 관리 도구로서 식물 내 RNAi에 대한 잠재성을 처음으로 문서화하는 한편, 동시에 유효 타겟은 심지어 비교적 작은 세트의 후보 유전자로부터일지라도, 선험적으로 정확하게 식별될 수 없다는 것을 입증하였다.
본원은, 예를 들어 딱정벌레류 해충, 예컨대 D. v. 비르기페라 르콩트 (서부 옥수수 뿌리벌레, "WCR"); D. 바르베리 스미스 및 로렌스 (북부 옥수수 뿌리벌레, "NCR"); D. u. 호와르디 바버 (남부 옥수수 뿌리벌레, "SCR"); D. v. 제아에 크리산 및 스미스 (멕시코 옥수수 뿌리벌레, "MCR"); D. 발테아타 르콩트; D. u. 테넬라; D. u. 운데심푼크타타 만네르헤임; 및 D. 스페시오사 게르마, 및 노린재류 해충, 예컨대 유쉬스투스 헤로스 (파브르.)(Euschistus heros (Fabr.)) (신열대 갈색 노린재, "BSB"); E. 세르부스 (세이)(E. servus (Say)) (갈색노린재); 네자라 비리둘라 (L.)(Nezara viridula (L.)) (남부 녹색 노린재); 피에조도루스 구일디니이 (웨스트우드)(Piezodorus guildinii (Westwood)) (적색-줄무늬 노린재); 할리오모르파 할리스 (스탈)(Halyomorpha halys (Stal)) (썩덩나무 노린재); 키나비아 힐라레 (세이)(Chinavia hilare (Say)) (녹색 노린재); C. 마르기나툼 (팔리소 드 보부아)(C. marginatum (Palisot de Beauvois)); 디켈롭스 멜라칸투스 (달라스)(Dichelops melacanthus (Dallas)); D. 푸르카투스 (F.)(D. furcatus (F.)); 에데사 메디타분다 (F.)(Edessa meditabunda (F.)); 티안타 페르디토르 (F.)(Thyanta perditor (F.)) (신열대 적색 어깨 노린재); 호르시아스 노빌렐루스 (베르그)(Horcias nobilellus (Berg)) (목화 벌레); 타에디아 스티그모사 (베르그)(Taedia stigmosa (Berg)); 디스데르쿠스 페루비아누스 (구에린-메네빌)(Dysdercus peruvianus (Guerin-Meneville)); 네오메갈로토무스 파르부스 (웨스트우드)(Neomegalotomus parvus (Westwood)); 렙토글로수스 조나투스 (달라스)(Leptoglossus zonatus (Dallas)); 니에스트레아 시다에 (F.)(Niesthrea sidae (F.)); 리구스 헤르페루스 (나이트)(Lygus hesperus (Knight)) (서부 변색 장님노린재); 및 L. 리네올라리스 (팔리소 드 보부아)(L. lineolaris (Palisot de Beauvois))를 포함하는, 곤충 해충의 방제를 위한 핵산 분자 (예를 들어, 타겟 유전자, DNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA), 및 그의 사용 방법을 개시한다. 특정한 예에서, 곤충 해충에서의 하나 이상의 천연(native) 핵산 중 적어도 일부에 대해 상동일 수 있는 예시적인 핵산 분자가 개시된다.
이들 및 추가의 예에서, 천연 핵산은 타겟 유전자일 수 있고, 그의 산물은 예를 들어, 제한하지 않고: 대사 과정에 수반되거나; 유충/약충 발생에 수반될 수 있다. 일부 예에서, 타겟 유전자의 발현을 그에 상동인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 의해 번역후 억제하는 것은 곤충 해충에서 치명적일 수 있거나, 그의 성장 및/또는 생존력을 감소시킬 수 있다. 구체적 예에서, RNA 중합효소 II 33kD 서브유닛 (본원에서, 예를 들어, rpII33라고 지칭함) 또는 rpII33 상동체는 전사후 침묵을 위한 타겟 유전자로서 선택될 수 있다. 특정한 예에서, 전사후 억제에 유용한 타겟 유전자는 RNA 중합효소 II33 유전자이며, 상기 유전자는 본원에서 디아브로티카 비르기페라 rpII33-1 (예를 들어, 서열번호:1), D. 비르기페라 rpII33-2 (예를 들어, 서열번호:3), 상기 유전자는 본원에서 유쉬스투스 헤로스 rpII33-1 (예를 들어, 서열번호:76), 또는 E. 헤로스 rpII33-2 (예를 들어, 서열번호:78)로 지칭된다. 따라서, 서열번호:1; 서열번호:1의 상보체; 서열번호:3; 서열번호:3의 상보체; 서열번호:76; 서열번호:76의 상보체; 서열번호:78; 서열번호:78의 상보체; 및/또는 상기 중 어느 하나의 단편 (예를 들어, 서열번호:5-8, 및 서열번호:80-82)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자가 본원에 개시된다.
또한, 타겟 유전자 산물 (예를 들어, rpII33 유전자의 산물) 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 개시된다. 예를 들어, 핵산 분자는 서열번호:2 (D. 비르기페라 RPII33-1), 서열번호:4 (D. 비르기페라 RPII33-2), 서열번호:77 (E. 헤로스 RPII33-1), 또는 서열번호:79 (E. 헤로스 RPII33-2); 및/또는 D. 비르기페라 rpII33-1, D. 비르기페라 rpII33-2, E. 헤로스 rpII33-1, 또는 E. 헤로스 rpII33-2의 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 추가로, 타겟 유전자 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 역 상보체인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 개시된다.
또한, 곤충 해충 타겟 유전자, 예를 들어 rpII33 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 특정한 구현예에서, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA는 유전자-변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관 내 또는 생체 내에서 생산될 수 있다. 특정한 예에서, rpII33 유전자 (예를 들어, 서열번호:1; 서열번호:3; 서열번호:76; 및/또는 서열번호:78), 예를 들어, WCR rpII33 유전자 (예를 들어, 서열번호:1 및/또는 서열번호:3) 또는 BSB rpII33 유전자 (예를 들어, 서열번호:76 및/또는 서열번호:78)의 전부 또는 일부에 상보적인 iRNA 분자를 생산하는데 사용될 수 있는 cDNA 분자가 개시된다.
추가로, 딱정벌레류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단, 및 딱정벌레류 해충 보호를 식물에게 제공하기 위한 수단이 개시된다. 딱정벌레류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단은 서열번호:94-97; 및 그의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드로 이루어진 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자이다. 노린재류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 기능적 등가물은 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 및/또는 서열번호:8을 포함하는 딱정벌레 rpII33 유전자의 전부 또는 일부에 실질적으로 상동인 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. 딱정벌레류 해충 보호를 식물에게 제공하기 위한 수단은 프로모터에 작동가능하게 연결된 딱정벌레류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자이며, 여기서 DNA 분자는 식물의 게놈 내로 편입될 수 있다.
또한 노린재류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단, 및 노린재류 해충 보호를 식물에게 제공하기 위한 수단이 개시된다. 노린재류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단은 서열번호:100-102 및 그의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드로 이루어진 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자이다. 노린재류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 기능적 등가물은 서열번호:80, 서열번호:81, 및/또는 서열번호:82를 포함하는 딱정벌레 rpII33 유전자의 전부 또는 일부에 실질적으로 상동인 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. 노린재류 해충 보호를 식물에게 제공하기 위한 수단은 프로모터에 작동가능하게 연결된 노린재류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 분자이며, 여기서 DNA 분자는 식물의 게놈 내로 편입될 수 있다.
곤충 해충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류 해충)에 의한 흡수 시 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자를 곤충 해충에게 제공하는 것을 포함하는, 곤충 해충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류 해충)의 집단을 방제하는 방법이 개시된다.
일부 구현예에서 딱정벌레류 해충의 집단을 방제하는 방법은 서열번호:92; 서열번호:92의 상보체; 서열번호:93; 서열번호:93의 상보체; 서열번호:94; 서열번호:94의 상보체; 서열번호:95; 서열번호:95의 상보체; 서열번호:96; 서열번호:96의 상보체; 서열번호:97; 서열번호:97의 상보체; 딱정벌레류 해충 (예를 들어, WCR)의 천연 rpII33 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드; 딱정벌레류 해충의 천연 rpII33 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:1, 3, 및 5-8 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호:1, 3, 및 5-8 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 상보체;로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 포함하는 iRNA 분자를 딱정벌레류 해충에게 제공하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 노린재류 해충의 집단을 방제하는 방법은 서열번호:98; 서열번호:98의 상보체; 서열번호:99; 서열번호:99의 상보체; 서열번호:100; 서열번호:100의 상보체; 서열번호:101; 서열번호:101의 상보체; 서열번호:102; 서열번호:102의 상보체; 노린재류 해충 (예를 들어, BSB)의 천연 rpII33 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드; 노린재류 해충의 천연 rpII33 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 노린재류 유기체 (예를 들어, BSB)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호:76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 상보체;로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 포함하는 iRNA 분자를 노린재류 해충에게 제공하는 것을 포함한다.
특정한 구현예에서, 곤충 해충에 의한 흡수 시 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 iRNA는 서열번호:1; 서열번호:1의 상보체; 서열번호:3; 서열번호:3의 상보체; 서열번호:76; 서열번호:76의 상보체; 서열번호:78; 서열번호:78의 상보체; 서열번호:1, 3, 및 5-8 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:1, 3, 및 5-8 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 노린재류 유기체 (예를 들어, BSB)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체;로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 포함하는 DNA로부터 전사된다.
또한, 먹이-기반 검정에서 또는 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA를 발현하는 유전자-변형된 식물 세포에서, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA이 곤충 해충에게 제공될 수 있는 방법이 본원에 개시된다. 이들 및 추가의 예에서, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA는 해충에 의해 섭취될 수 있다. 이어서, 본 발명의 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA의 섭취는 해충에서 RNAi를 발생시킬 수 있고, 그 결과 해충의 생존력에 필수적인 유전자의 침묵을 초래할 수 있고, 궁극적으로는 치사에 이르게 할 수 있다. 따라서, 곤충 해충의 양친 방제에 유용한 예시적인 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 핵산 분자가 곤충 해충에게 제공되는 방법이 개시된다. 특정한 예에서, 본 발명의 핵산 분자의 사용에 의해 방제되는 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충은 WCR, NCR, SCR, D. 운데심푼크타타 호와르디, D. 발테아타, D. 운데심푼크타타 테넬라, D. 스페시오사, D. u. 운데심푼크타타, BSB, E. 세르부스, 네자라 비리둘라, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 키나비아 힐라레, C. 마르기나툼, 디켈롭스 멜라칸투스, D. 푸르카투스, 에데사 메디타분다, 티안타 페르디토르, 호르시아스 노빌렐루스, 타에디아 스티그모사, 디스데르쿠스 페루비아누스, 네오메갈로토무스 파르부스, 렙토글로수스 조나투스, 니에스트레아 시다에, 리구스 헤르페루스, 또는 L. 리네올라리스일 수 있다.
상기 및 다른 특징들은 첨부된 도면 1 내지 2을 참고하여 진행되는, 여러 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1은 단일 쌍의 프라이머를 사용하여 단일 전사 주형으로부터 dsRNA를 생성하는데 사용된 전략의 도해를 포함한다.
도 2는 2개의 전사 주형으로부터 dsRNA를 생성하는데 사용된 전략의 도해를 포함한다.
서열 목록
첨부된 서열 목록에 확인된 핵산 서열은 37 C.F.R. § 1.822에서 규정된 바와 같은, 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다. 열거된 핵산 및 아미노산 서열은 기재된 방식으로 배열된 뉴클레오티드 및 아미노산 단량체를 갖는 분자 (즉, 각각 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드)를 규정한다. 열거된 핵산 및 아미노산 서열은 또한 각각 기재된 방식으로 배열된 뉴클레오티드 및 아미노산 단량체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 속을 규정한다. 유전자 암호의 중복성을 고려하여, 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 또한 참조 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 속을 기재하는 것으로 이해될 것이다. 추가로, 아미노산 서열이 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ORF 속을 기재하는 것으로 이해될 것이다.
각 핵산 서열의 단지 한 가닥만이 제시되지만, 디스플레이된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 상보적 가닥이 포함되는 것으로 이해된다. 일차 핵산 서열의 상보체 및 역 상보체는 일차 서열에 의해 필연적으로 개시되기 때문에, 핵산 서열의 상보적 서열 및 역 상보적 서열은, 그것이 달리 명확하게 언급되지 않는 한 (또는 서열이 나타나는 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한), 핵산 서열에 대한 임의의 참조에 의해 포함된다. 추가로, RNA 가닥의 뉴클레오티드 서열은 그것이 전사되는 DNA의 서열에 의해 결정되는 것으로 기술분야에서 이해되고 있기 때문에 (티민 (T)이 우라실 (U) 핵염기로 치환되는 것 제외), RNA 서열은 그것을 코딩하는 DNA 서열에 대한 임의의 참조에 의해 포함된다. 첨부된 서열 목록에서:
서열번호:1은 본원에서 일부 경우에 WCR rpII33-1로 지칭되는 예시적인 WCR rpII33 DNA를 제시한다:
GCCGATGCCATACATACGCTTAAAACATCGTATCTGCTCAGTTCTTTAATTAACACTGAAGAAAATCGAATTATAAAATGCCCTACGCTAACACACCGTCAGTACAAATTTCTGAACTAACCGATGAAAATGTTAAGTTCGTCGTTGAGGACACAGACCTTAGCTTGGCAAACAGTCTACGTCGTGTTTTCATCGCTGAAACTCCAACCCTAGCAATCGATTGGGTTCAATTCGAAGCCAACTCCACTGTACTGGCAGATGAATTCCTTGCCCATCGAATTGGCTTGATTCCATTGATTTCCGATGAGGTAGTGGACAGAATCCAAAACACTCGTGAATGTTCATGCTTGGACTTTTGCACCGAGTGCAGTGTGGAATTTACATTGGATGTCAAATGCAGCGACGAACATACGCGCCACGTTACCACGGCCGATTTAAAGTCCAGTGACGCACGAGTGCTACCAGTTACGTCCAGACATCGCGATGACGAGGACAACGAATATGGAGAGACGAACGATGAAATTCTGATCATCAAACTGCGCAAAGGTCAAGAGCTGAAGTTGCGAGCATACGCGAAAAAGGGTTTCGGCAAGGAACATGCCAAATGGAATCCAACGGCTGGCGTTAGCTTTGAATACGATCCAGTCAATTCGATGAGACATACCCTGTACCCGAAGCCGGACGAATGGCCGAAAAGTGAGCACACCGAACTTGACGATGATCAATACGAAGCTGAATATAACTGGGAGGCTAAGCCGAACAAGTTTTTCTTCAACGTTGAGTCGAGTGGTGCACTTCGACCGGAAAACATTGTGCTGATGGGAGTCAAAGTTTTGAAAAACAAATTGTCCAATCTACAGACGCAGTTAAGTCACGAATTGACTACAAACGATGCGCTCGTGATTCAGTAAAAGCAGCGATCCCATTGAATTTCTTCAAAATCTTGTTTTTTTCCTCTAAG
서열번호:2는 본원에서 일부 경우에 WCR rpII33-1로 지칭되는 예시적인 WCR rpII33 DNA에 의해 코딩된 rpII33 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제시한다:
MPYANTPSVQISELTDENVKFVVEDTDLSLANSLRRVFIAETPTLAIDWVQFEANSTVLADEFLAHRIGLIPLISDEVVDRIQNTRECSCLDFCTECSVEFTLDVKCSDEHTRHVTTADLKSSDARVLPVTSRHRDDEDNEYGETNDEILIIKLRKGQELKLRAYAKKGFGKEHAKWNPTAGVSFEYDPVNSMRHTLYPKPDEWPKSEHTELDDDQYEAEYNWEAKPNKFFFNVESSGALRPENIVLMGVKVLKNKLSNLQTQLSHELTTNDALVIQ
서열번호:3은 본원에서 일부 경우에 WCR rpII33-2로 지칭되는 추가로 예시적인 WCR rpII33 DNA를 제시한다:
ACACTATAGGAACAATTTTTGACATGTTGACTAAAGATCTTGTTCAAATAGACTAGAAATAAAATTTTGAATCCAAAAAAAAAAA
서열번호:4는 추가로 예시적인 WCR rpII33 DNA (즉, rpII33-2)에 의해 코딩된 WCR rpII33 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제시한다:
MPYANQPSVHITDLTDDNCKFYIEDTDLSVANSIRRVLIAETPTLAIDWVKLEANSTVLSDEFLAHRIGLIPLVSDEVVQRLQYPRDCVCLDFCQECSVEFTLDVKCTDDQTRHVTTADFKSSDPRVIPATSKHRDDESSEYGETDEILIIKLRKGQELKVKAYAKKGFGKEHAKWNPTCGVAFEYDPDNAMRHTLFPKPDEWPKSEYSELEDDQYEAPYNWELKPNKFFYNVEAAGLLKPENIVIMGVAMLKEKLSNLQTQLSHELTPDVLAIPI
서열번호:5는 일부 예에서 dsRNA의 생산에 사용된, 본원에서 일부 경우에 WCR rpII33-1 reg1 (영역 1)로 지칭되는 예시적인 WCR rpII33 DNA를 제시한다:
GAATTCCTTGCCCATCGAATTGGCTTGATTCCATTGATTTCCGATGAGGTAGTGGACAGAATCCAAAACACTCGTGAATGTTCATGCTTGGACTTTTGCACCGAGTGCAGTGTGGAATTTACATTGGATGTCAAATGCAGCGACGAACATACGCGCCACGTTACCACGGCCGATTTAAAGTCCAGTGACGCACGAGTGCTACCAGTTACGTCCAGACATCGCGATGACGAGGACAACGAATATGGAGAGACGAACGATGAAATTCTGATCATCAAACTGCGCAAAGGTCAAGAGCTGAAGTTGCGAGCATACGCGAAAAAGGGTTTCGGCAAGGAACATGCCAAATGGAATCCAACGGCTGGCGTTAGCTTTGAATACGATCCAGTCAATTCGATGAGACATACCCTGTACCCGAAGCCGGACGAATGGCCGAAAAGTGAGCACACCGAACTTGACGATGATCAATACGAAGCTGAATATAAC
서열번호:6은 일부 예에서 dsRNA의 생산에 사용된, 본원에서 일부 경우에 WCR rpII33-2 reg1 (영역 1)로 지칭되는 추가로 예시적인 WCR rpII33 DNA를 제시한다:
GTTCTCAGTGATGAATTTTTAGCACACCGAATTGGATTGATACCATTAGTTTCCGATGAAGTTGTACAAAGATTACAATATCCTAGGGACTGCGTATGTCTCGATTTTTGTCAAGAATGCAGTGTTGAATTTACTTTAGATGTAAAATGTACAGATGATCAAACTCGACATGTAACAACTGCCGATTTTAAATCTAGTGATCCACGAGTCATACCAGCTACTTCCAAACATCGTGATGATGAATCCTCAGAGTATGGTGAAACAGATGAAATTCTTATTATTAAACTGCGAAAGGGTCAAGAGCTTAAAGTTAAAGCGTATGCCAAAAAAGGCTTTGGAAAAGAGCATGCCAAATGGAATCCTACATGTGGTGTTGCCTTTGAATATGATCCTGATAACGCTATGAGACATACATTATTTCCTAAACCAGACGAATGGCCTAAAAGTGAATACAGCGAATTAGAAGATGATCAGTATGAAGCTCCATATAACTGGG
서열번호:7은 일부 예에서 dsRNA의 생산에 사용된, 본원에서 일부 경우에 WCR rpII33-2 v1 (버전 1)로 지칭되는 추가로 예시적인 WCR rpII33 DNA를 제시한다:
CTTTAGATGTAAAATGTACAGATGATCAAACTCGACATGTAACAACTGCCGATTTTAAATCTAGTGATCCACGAGTCATACCAGCTACTTCCAAACATCGTGATGATGAATCCTCAGAGTATGGTGAAACAG
서열번호:8은 일부 예에서 dsRNA의 생산에 사용된, 본원에서 일부 경우에 WCR rpII33-2 v2 (버전 2)로 지칭되는 추가로 예시적인 WCR rpII33 DNA를 제시한다:
GCGTATGCCAAAAAAGGCTTTGGAAAAGAGCATGCCAAATGGAATCCTACATGTGGTGTTGCCTTTGAATATGATCCTGATAACGCTATGAGACATACATTATTTCCTAAACCAGACGAATGGCC
서열번호:9는 T7 파지 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열번호:10은 예시적인 YFP 코딩 서열의 단편을 제시한다.
서열번호:11-18은 rpII33-1 reg1, rpII33-2 reg1, rpII33-2 v1, 및 rpII33-2 v2를 포함하는 예시적인 WCR rpII-33 서열의 부분들을 증폭시키는데 사용된 프라이머를 제시한다.
서열번호:19는 예시적인 YFP 유전자를 제시한다.
서열번호:20은 아넥신 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열번호:21은 아넥신 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열번호:22는 베타 스펙트린 2 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열번호:23은 베타 스펙트린 2 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열번호:24는 mtRP-L4 영역 1의 DNA 서열을 제시한다.
서열번호:25는 mtRP-L4 영역 2의 DNA 서열을 제시한다.
서열번호:26-53은 dsRNA 합성을 위해 아넥신, 베타 스펙트린 2, mtRP-L4 및 YFP의 유전자 영역을 증폭시키는데 사용된 프라이머를 제시한다.
서열번호:54는 TIP41-유사 단백질을 코딩하는 메이즈 DNA 서열을 제시한다.
서열번호:55은 T20VN 프라이머 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열번호:56-60은 메이즈 내의 dsRNA 전사물 발현 분석에 사용된 프라이머 및 프로브를 제시한다.
서열번호:61은 이원 벡터 백본 검출에 사용된 SpecR 코딩 영역의 부분의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열번호:62는 게놈 카피수 분석에 사용된 AAD1 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열번호:63은 메이즈 인버타제 유전자의 DNA 서열을 제시한다.
서열번호:64-72는 유전자 카피수 결정 및 이원 벡터 백본 검출에 사용된 DNA 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열번호:73-75는 dsRNA 전사물 메이즈 발현 분석에 사용된 프라이머 및 프로브를 제시한다.
서열번호:76은 본원에서 일부 경우에 BSB rpII33-1로 지칭되는 예시적인 BSB rpII33 DNA를 제시한다:
CTAAAATATAAACTTTCTGATTTATTAATTCAATTGAGTCATGAATCAGCTGGCCAAGTTGATCATATGCCTGTTTAACCAGTTTTTGTGATAAATTATTATCTGAAATAATTCAATTATTATATTTATATTAATGTAAAATAAAAAGAAATTTGATAACTGAAAAAAAAAAAAAAAAATCTATTGAAAGAATACATTCATTAATACCTTTCTAAAGAAAAATTATTCAATTTAAAATTGTTGCCAAAAAGTATTCAGCATTTTTTTAAAATTCAATCTAGGCATATACTACTGTAAATAAATACAAACAATACTTTCATTTTTGTACTGTTCTAAAAATTGT
서열번호:77은 예시적인 BSB rpII33 DNA (즉, BSB rpII33-1)에 의해 코딩된 BSB rpII33 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제시한다:
MPYANQPSVHVSDLTDDNVKFQIEDTELSVANSLRRVFIAETPTLAIDWVQLSANSTVLSDEFIASRIGLIPLTSDAAVEKLIYSRDCNCTDFCPSCSVEFTLDVKCVDDQTRHVTTADLKTADPCVVPATSKNRDADANEYGESDDILIVKLRKGQELKLRAFAKKGFGKEHAKWNPTAGVCFEYDPDNSMRHTLFPKPDEWPKSEYTELDEDQYEAPFNWEAKPNKFFFNVESCGSLRPENIVLKGVEVLKYKLSDLLIQLSHESAGQVDHMPV
서열번호:78은 본원에서 일부 경우에 BSB rpII33-2로 지칭되는 예시적인 BSB rpII33 DNA를 제시한다:
TGTAAAACTTGTTCTTTAAGATCTCAAGACCTTTTATTAGAACATCTACAGGCTTAAGAGAGCCCTCTACAACTTCTACGTCCATGTGCACCGTGTCTATTTCACAAAGGAGATCTGGTTCTTCCTCCTCAACCATCGGCCAGTCCTTCTTAAGCGTATCTTCTGTCCAGTAGTTTGTGGACCTAGTCTTATTGGTTCTATCATACTCGAACCCGACAACAGAGACAGGAGACCACTTGGCATGCATCCTCCCTATCCCCTTCCTAGCAATACACCTAATTTTCAGGCTTTGATTCTTCCCAAGTTTTGCAATTACCGGTGTGCTTTTTATAAAAGTCTCGTCACTGTCAAATTTTATGTCTTTACAAGTCACGTTAAGGGGGGTCTCTGAGGTGTTGCTAACATCAAGTTCCATCTCTACGGAACAACGAGAGCAAAGCTCATCACAGTCACACTCTTCTTTATACACAAGCTCTTTCTTTGAGTACATTGGGATAAGCCCAAGGGACTGTGCCAATACTTCATCGGGGAGGACCGTGTTGTTTTTGATGATTTCGACGAGATCTATTGCGATAGTAGGTACTTCAGATAAGAGGATTCTCCTTAGAGCATTAGCATAGGAGACTGTAATCCCAGTGAGAGTGAATTTGATGTGTTCGTCGTTTTGTTCGTGAATTGTAATTTTCATGAGAAAGCTGGAGGGCAAAAGAAATGAAGTAAATTTAGAAGGGAACACCTGTGAAGTATGATCGACTACG
서열번호:79는 예시적인 BSB rpII33 DNA (즉, BSB rpII33-2)에 의해 코딩된 추가적인 BSB rpII33 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제시한다:
MKITIHEQNDEHIKFTLTGITVSYANALRRILLSEVPTIAIDLVEIIKNNTVLPDEVLAQSLGLIPMYSKKELVYKEECDCDELCSRCSVEMELDVSNTSETPLNVTCKDIKFDSDETFIKSTPVIAKLGKNQSLKIRCIARKGIGRMHAKWSPVSVVGFEYDRTNKTRSTNYWTEDTLKKDWPMVEEEEPDLLCEIDTVHMDVEVVEGSLKPVDVLIKGLEILKNKFY
서열번호:80은 일부 예에서 dsRNA의 생산에 사용된, 본원에서 일부 경우에 BSB_rpII33-1 reg1 (영역 1)로 지칭되는 예시적인 BSB rpII33 DNA를 제시한다:
GGTGAATCAGATGATATTTTGATTGTTAAATTAAGAAAAGGACAAGAGCTTAAATTGAGGGCCTTTGCTAAGAAAGGTTTTGGTAAGGAACATGCTAAGTGGAATCCTACTGCTGGGGTTTGTTTTGAGTATGACCCTGACAACTCAATGAGGCATACACTGTTTCCAAAACCAGATGAGTGGCCAAAAAGTGAATATACTGAATTAGATGAGGATCAGTATGAAGCTCCATTTAATTGGGAAGCCAAACCTAAC
서열번호:81은 일부 예에서 dsRNA의 생산에 사용된, 본원에서 일부 경우에 BSB_rpII33-1 v1 (버전 1)로 지칭되는 추가로 예시적인 BSB rpII33 DNA를 제시한다:
TTGTTTTGAGTATGACCCTGACAACTCAATGAGGCATACACTGTTTCCAAAACCAGATGAGTGGCCAAAAAGTGAATATACTGAATTAGATGAGGATCAGTATGAAGCTCC
서열번호:82는 일부 예에서 dsRNA의 생산에 사용된, 본원에서 일부 경우에 BSB_rpII33-2 reg1 (영역 1)로 지칭되는 추가로 예시적인 BSB rpII33 DNA를 제시한다:
CGTCGAAATCATCAAAAACAACACGGTCCTCCCCGATGAAGTATTGGCACAGTCCCTTGGGCTTATCCCAATGTACTCAAAGAAAGAGCTTGTGTATAAAGAAGAGTGTGACTGTGATGAGCTTTGCTCTCGTTGTTCCGTAGAGATGGAACTTGATGTTAGCAACACCTCAGAGACCCCCCTTAACGTGACTTGTAAAGACATAAAATTTGACAGTGACGAGACTTTTATAAAAAGCACACCGGTAATTGCAAAACTTGGGAAGAATCAAAGCCTGAAAATTAGGTGTATTGCTAGGAAGGGGATAGGGAGGATGCATGCCAAGTGGTCTCCTGTCTCTGTTGTCGGGTTCGAGTATGATAGAACCAATAAGACTAGGTCCACAAACTACTGGACAG
서열번호:83-88은 일부 예에서 dsRNA의 생산에 사용된, rpII33-1 reg1, rpII33-2 reg1, 및 rpII33-1 v1를 포함하는 예시적인 BSB rpII-33 서열의 부분들을 증폭시키는데 사용된 프라이머를 제시한다.
서열번호:89는 일부 예에서 dsRNA의 센스 가닥의 생산에 사용된, 예시적인 YFP v2 DNA를 제시한다.
서열번호:90 및 91 은 일부 예에서 dsRNA의 생산에 사용된, YFP 서열 YFP v2의 PCR 증폭에 사용된 프라이머를 제시한다.
서열번호:92-102는 예시적인 rpII33 폴리뉴클레오티드 및 그의 단편을 포함하는 핵산으로부터 전사된 예시적인 RNA를 제시한다.
서열번호:103은 센스 폴리뉴클레오티드, 루프 서열 (이탤릭체), 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 (밑줄표시)를 함유하는; 디아브로티카 rpII33-2 v1 dsRNA를 코딩하는 예시적인 DNA를 제시한다:
CTTTAGATGTAAAATGTACAGATGATCAAACTCGACATGTAACAACTGCCGATTTTAAATCTAGTGATCCACGAGTCATACCAGCTACTTCCAAACATCGTGATGATGAATCCTCAGAGTATGGTGAAACAGGAAGCTAGTACCAGTCATCACGCTGGAGCGCACATATAGGCCCTCCATCAGAAAGTCATTGTGTATATCTCTCATAGGGAACGAGCTGCTTGCGTATTTCCCTTCCGTAGTCAGAGTCATCAATCAGCTGCACCGTGTCGTAAAGCGGGACGTTCGCAAGCTCGTCCGCGGTA CTGTTTCACCATACTCTGAGGATTCATCATCACGATGTTTGGAAGTAGCTGGTATGACTCGTGGATCACTAGATTTAAAATCGGCAGTTGTTACATGTCGAGTTTGATCATCTGTACATTTTACATCTAAAG
서열번호:104는 센스 폴리뉴클레오티드, 루프 서열 (이탤릭체), 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 (밑줄표시)를 함유하는; 디아브로티카 rpII33-2 v2 dsRNA를 코딩하는 예시적인 DNA를 제시한다:
GCGTATGCCAAAAAAGGCTTTGGAAAAGAGCATGCCAAATGGAATCCTACATGTGGTGTTGCCTTTGAATATGATCCTGATAACGCTATGAGACATACATTATTTCCTAAACCAGACGAATGGCCGAAGCTAGTACCAGTCATCACGCTGGAGCGCACATATAGGCCCTCCATCAGAAAGTCATTGTGTATATCTCTCATAGGGAACGAGCTGCTTGCGTATTTCCCTTCCGTAGTCAGAGTCATCAATCAGCTGCACCGTGTCGTAAAGCGGGACGTTCGCAAGCTCGTCCGCGGTA GGCCATTCGTCTGGTTTAGGAAATAATGTATGTCTCATAGCGTTATCAGGATCATATTCAAAGGCAACACCACATGTAGGATTCCATTTGGCATGCTCTTTTCCAAAGCCTTTTTTGGCATACGC
서열번호:105-106은 dsRNA 발현 분석에 사용된 프로브를 제시한다.
서열번호:107은 dsRNA 내의 개재 루프를 코딩하는 예시적인 DNA 뉴클레오티드 서열을 제시한다.
서열번호:108-109는 예시적인 rpII33-2 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 핵산으로부터 전사된 예시적인 dsRNA를 제시한다.
서열번호:110-111은 메이즈 내의 dsRNA 전사물 발현 분석에 사용된 프라이머를 제시한다.
발명의 상세한 설명
I. 여러 구현예의 개관
본 발명자들은 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 식물에 대한 가장 가능성있는 타겟 해충 종 중 하나; 서부 옥수수 뿌리벌레를 사용하여, 곤충 해충 관리를 위한 도구로서 RNA 간섭 (RNAi)을 개발하였다. 지금까지는, 뿌리벌레 유충에서 RNAi에 대한 타겟으로서 제안된 대부분의 유전자가 그 목적을 실제로 달성하지 못한다. 본원에서, 본 발명자들은 예를 들어 iRNA 분자가 rpII33 dsRNA 섭취 또는 주사를 통해 전달되는 경우에, 치사 표현형을 갖는 것으로 제시된, 예시적인 곤충 해충, 서부 옥수수 뿌리벌레, 및 신열대 갈색 노린재에서의 RNA 중합효소 33 (rpII33)의 RNAi-매개 녹다운을 기재한다. 본원의 구현예에서, 곤충에의 섭식에 의해 rpII33 dsRNA를 전달하는 능력은 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및 노린재류) 해충 관리에 매우 유용한 RNAi 효과를 부여한다. rpII33-매개 RNAi를 다른 유용한 RNAi 타겟(예를 들어, ROP (미국 특허 출원 공개 번호 제14/577811호), RNAPII (미국 특허 출원 공개 번호 제14/577854호), 미국 특허 출원 번호 제62/133214호에 기재된, RNA 중합효소 I1 RNAi 타겟, 미국 특허 출원 번호 제62/133202호에 기재된, RNA 중합효소 II215 RNAi 타겟, ncm (미국 특허 출원 번호 제62/095487호), Dre4 (미국 특허 출원 번호 제14/705,807호), COPI 알파(미국 특허 출원 번호 제62/063,199호), COPI 베타(미국 특허 출원 번호 제62/063,203호), COPI 감마(미국 특허 출원 번호 제62/063,192호), 및 COPI 델타(미국 특허 출원 번호 제62/063,216호)과 조합함으로써, 예를 들어 유충 뿌리벌레에서, 다수 타겟 서열에 영향을 미치는 잠재력은, RNAi 기술을 수반하는 곤충 해충 관리에 대한 지속가능한 접근법의 개발 기회를 증가시킬 수 있다.
곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충 침입의 유전적 방제를 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 곤충 해충 집단의 RNAi-매개 방제를 위한 타겟 유전자로서 사용하기 위한, 곤충 해충의 생활주기에 필수적인 하나 이상의 유전자(들)를 식별하는 방법이 또한 제공된다. RNA 분자를 코딩하는 DNA 플라스미드 벡터는 성장, 생존 및/또는 발생에 필수적인 하나 이상의 타겟 유전자(들)를 억제하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 곤충 해충에서의 타겟 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자를 통해 타겟 유전자의 발현을 전사후 저해하거나 또는 타겟 유전자를 억제하는 방법이 제공된다. 이들 및 추가 구현예에서, 해충은 타겟 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자의 전부 또는 일부로부터 전사되는 하나 이상의 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA 분자를 섭취할 수 있고, 이에 의해 식물-보호 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 일부 구현예는 타겟 유전자(들)의 코딩 및/또는 비-코딩 서열에 상보적인 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA를 사용하여, 타겟 유전자 산물의 발현을 서열 특이적으로 억제해서 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충의 적어도 부분적인 방제를 달성하는 것을 수반한다. 예를 들어, 서열번호:1, 3, 76, 및 78, 및 그의 단편 중 하나에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일련의 단리 및 정제된 핵산 분자가 개시된다. 일부 구현예에서, 안정화된 dsRNA 분자는 타겟 유전자의 전사후 침묵 또는 억제를 위해, 이들 폴리뉴클레오티드, 그의 단편 또는 이들 폴리뉴클레오티드 중 하나를 포함하는 유전자로부터 발현될 수 있다. 소정의 구현예에서, 단리 및 정제된 핵산 분자는 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 전부 또는 일부를 포함한다.
일부 구현예는 적어도 하나의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자(들)를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 DNA를 그의 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포)를 수반한다. 특정한 구현예에서, 코딩된 dsRNA 분자(들)는 곤충(예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에 의해 섭취되었을 때 생산되어 해충에서의 타겟 유전자를 전사후 침묵시키거나 또는 그의 발현을 억제할 수 있다. 재조합 DNA는, 예를 들어 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나; 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 단편; 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 하나를 포함하는 유전자의 부분적인 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 및/또는 그의 상보체를 포함할 수 있다.
일부 구현예는 서열번호:92, 서열번호:93, 서열번호:98, 또는 서열번호:99 (예를 들어, 서열번호:94-97, 100-102을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드)의 전부 또는 일부를 포함하는 적어도 하나의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자(들)를 코딩하는 재조합 DNA, 또는 그의 상보체를 그의 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포를 수반한다. 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에 의해 섭취되었을 때, iRNA 분자(들)는 해충에서 타겟 rpII33 DNA (예를 들어, 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 포함하는 DNA)를 침묵시키거나 또는 그의 발현을 억제할 수 있고, 이에 의해 해충에서 성장, 발생, 생존력 및/또는 섭식을 중지시킬 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 적어도 하나의 RNA 분자를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 DNA를 그의 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포는 형질전환된 식물 세포일 수 있다. 일부 구현예는 이러한 형질전환된 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물을 수반한다. 이러한 트랜스제닉 식물에 더하여, 각각의 것이 재조합 DNA(들)를 포함하는 것인, 임의의 트랜스제닉 식물 세대의 자손 식물, 트랜스제닉 종자 및 트랜스제닉 식물 산물이 모두 제공된다. 특정한 구현예에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 이들 및 다른 구현예에서, dsRNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포로부터 단리될 수 있다. 특정한 구현예에서, 트랜스제닉 식물은 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)), 대두 (글리신 맥스(Glycine max)), 목화 (고시피움 속(Gossypium sp.)), 및 포아세아에(Poaceae) 과의 식물을 포함하는 군으로부터 선택되는 식물이다.
다른 구현예는 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충 세포에서의 타겟 유전자의 발현을 조정하는 방법을 수반한다. 이들 및 다른 구현예에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 제공될 수 있다. 특정한 구현예에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 이는 또한 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정한 구현예에서, 곤충 해충 세포에서의 타겟 유전자의 발현을 조정하는 방법은 (a) dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계; (b) 복수의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물이 발생하도록 하는데 충분한 조건 하에 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계; (c) 벡터가 게놈 내로 편입된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계; 및 (d) 선택된 형질전환된 식물 세포가, 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 식물은, 그의 게놈 내에 벡터가 편입되어 있고 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는 식물 세포로부터 재생될 수 있다.
또한 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 벡터가 그의 게놈 내에 편입되어 있는 트랜스제닉 식물이 또한 개시되며, 여기서 트랜스제닉 식물은 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함한다. 특정한 구현예에서, 식물에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA 분자의 발현은 형질전환된 식물 또는 식물 세포(예를 들어, 형질전환된 식물, 식물의 부분과 접촉하는(예를 들어, 뿌리) 또는 식물 세포 상에서의 섭식에 의함) 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류) 해충의 세포에서 타겟 유전자의 발현을 조정하는데 충분하여, 해충의 성장 및/또는 생존이 억제된다. 본원에 개시된 트랜스제닉 식물은 곤충 해충 침입에 대해 보호 및/또는 증진된 보호를 표시할 수 있다. 특정한 트랜스제닉 식물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충(들)에 대한 보호 및/또는 증진된 보호를 디스플레이할 수 있다: WCR; BSB; NCR; SCR; MCR; D. 발테아타 르콩트; D. u. 테넬라; D. u. 운데심푼크타타 만네르헤임; D. 스페시오사 게르마; 유쉬스투스 헤로스 (Fabr.); E. 세르부스 (Say); 네자라 비리둘라 (L.); 피에조도루스 구일디니이 (웨스트우드); 할리오모르파 할리스(Stal); 키나비아 힐라레 (Say); C. 마르기나툼 (팔리소 드 보부아); 디켈롭스 멜라칸투스 (달라스); D. 푸르카투스 (F.); 에데사 메디타분다 (F.); 티안타 페르디토르 (F.); 호르시아스 노빌렐루스 (베르그); 타에디아 스티그모사 (베르그); 디스데르쿠스 페루비아누스 (구에린-메네빌); 네오메갈로토무스 파르부스 (웨스트우드); 렙토글로수스 조나투스 (달라스); 니에스트레아 시다에 (F.); 리구스 헤르페루스 (Knight); 및 L. 리네올라리스 (팔리소 드 보부아).
또한 방제제, 예컨대 iRNA 분자를 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에게 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 이러한 방제제는 직접 또는 간접적으로, 곤충 해충 집단이 섭식, 성장할 수 있는 능력에 장애를 유발할 수 있거나 또는 다르게는 숙주에 피해를 유발할 수 있다. 일부 구현예에서, 안정화된 dsRNA 분자를 곤충 해충에게 전달해서 해충에서의 적어도 하나의 타겟 유전자를 억제함으로써, 해충 숙주에서 RNAi를 발생시키고 식물 피해를 감소 또는 제거하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 곤충 해충에서의 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법은 해충에서의 성장, 생존, 및/또는 발생을 중지시키도록 야기할 수 있다.
일부 구현예에서, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충 침입을 제거 또는 감소시키는 것을 달성하기 위해 식물, 동물, 및/또는 식물 또는 동물의 환경에서 사용하기 위한 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자를 포함하는 조성물 (예를 들어, 국소 조성물)이 제공된다. 특정한 구현예에서, 조성물은 곤충 해충에게 섭식될 영양 조성물 또는 먹이원, 또는 RNAi 베이트(bait)일 수 있다. 일부 구현예는 해충에게 이용가능한 영양 조성물 또는 먹이원을 제조하는 것을 포함한다. iRNA 분자를 포함하는 조성물을 섭취하게 되면 해충의 하나 이상의 세포에 의해 흡수될 수 있고, 차례로 해충의 세포(들)에서 적어도 하나의 타겟 유전자의 발현이 억제될 수 있다. iRNA 분자를 포함하는 하나 이상의 조성물을 해충의 숙주에 제공함으로써 곤충 해충 침입에 의한 식물 또는 식물 세포의 섭취 또는 그에 대한 피해는 해충이 존재하는 임의의 숙주 조직 또는 환경 내 또는 그 상에서 제한되거나 제거될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에 의한 피해를 방제하기 위한 다른 방법 및 조성물과 함께 조합되어 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 곤충 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 것으로 본원에 기재된 바와 같은 iRNA 분자는 곤충 해충에 대해 효과적인 하나 이상의 화학적 작용제, 이러한 해충에 대해 효과적인 생물살충제, 윤작, RNAi-매개 방법 및 RNAi 조성물의 특징들과 상이한 특징을 나타내는 재조합 유전자 기술 (예를 들어, 곤충 해충에게 유해한 단백질 (예를 들어, Bt 독소 및 PIP-1 폴리펩티드 (미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0007292 A1 참조))의 식물에서의 재조합적 생산), 및/또는 다른 iRNA 분자의 재조합 발현의 추가적인 사용을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
II. 약어
BSB 신열대 갈색 노린재 (유쉬스투스 헤로스)
dsRNA 이중-가닥 리보핵산
EST 발현 서열 태그
GI 성장 억제
NCBI 국립 생물 정보 센터
gDNA 게놈 데옥시리보핵산
iRNA 억제 리보핵산
ORF 오픈 리딩 프레임
RNAi 리보핵산 간섭
miRNA 마이크로 리보핵산
shRNA 짧은 헤어핀 리보핵산
siRNA 소형 억제 리보핵산
hpRNA 헤어핀 리보핵산
UTR 비번역 영역
WCR 서부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트)
NCR 북부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 바르베리 스미스 및 로렌스)
MCR 멕시코 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 비르기페라 제아에 크리산 및 스미스)
PCR 중합효소 연쇄 반응
qPCR 정량적 중합효소 연쇄 반응
RISC RNA-유도 침묵 복합체
SCR 남부 옥수수 뿌리벌레 (디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디 바버)
SEM 평균의 표준 오차
YFP 노랑 형광 단백질
III. 용어
이어지는 설명 및 표들에서, 수많은 용어가 사용된다. 주어진 이러한 용어의 범주를 포함하여, 본 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다:
딱정벌레류 해충(Coleopteran pest): 본원에 사용된 용어 "딱정벌레류 해충"은 옥수수 및 다른 볏과 식물(true grass)을 포함한, 농업 작물 및 작물 산물을 섭식하는, 디아브로티카 속의 해충 곤충을 포함한, 딱정벌레목의 곤충을 지칭한다. 특정한 예에서, 딱정벌레류 해충은 D. v. 비르기페라 르콩트 (WCR); D. 바르베리 스미스 및 로렌스 (NCR); D. u. 호와르디 (SCR); D. v. 제아에 (MCR); D. 발테아타 르콩트; D. u. 테넬라; D. u. 운데심푼크타타 만네르헤임; 및 D. 스페시오사 게르마를 포함하는 목록으로부터 선택된다.
(유기체와) 접촉: 핵산 분자에 관하여, 본원에 사용된 용어 유기체 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류 해충) "와 접촉하다" 또는 "에 의해 흡수되다"는 것은, 유기체 내로의 핵산 분자의 내재화, 예를 들어, 제한하지 않고: 유기체에 의한 분자의 섭취 (예를 들어, 섭식에 의함); 핵산 분자를 포함하는 조성물과 유기체를 접촉시키는 것; 및 핵산 분자를 포함하는 용액으로 유기체를 담그는 것을 포함한다.
콘티그(contig): 본원에 사용된 용어 "콘티그"는 단일 유전자 소스로부터 유래된 중첩 DNA 절편의 세트로부터 재구성되는 DNA 서열을 지칭한다.
옥수수 식물(corn plant): 본원에 사용된 용어 "옥수수 식물"은 제아 메이스 (Zea mays) (메이즈) 종의 식물을 지칭한다.
발현: 본원에 사용된, 코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자 또는 트랜스젠)의 "발현"은 핵산 전사 단위(예를 들어, gDNA 또는 cDNA 포함)의 코딩된 정보가 세포의 작동적, 비-작동적 또는 구조적 일부로 전환되는 과정을 지칭하며, 종종 단백질의 합성을 포함한다. 유전자 발현은 외부 신호; 예를 들어, 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 세포, 조직 또는 유기체를 노출시키는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자의 발현은 DNA에서 RNA를 거쳐 단백질까지의 경로 중 어디에서나 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은, 예를 들어, 전사, 번역, RNA 수송 및 가공, 중간 분자, 예컨대 mRNA의 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특이적 단백질 분자가 제조된 후에 그의 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해를 통해서, 또는 이들의 조합에 의해 일어난다. 유전자 발현은 비제한적으로, 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯, 또는 시험관 내, 계 내 또는 생체 내 단백질 활성 검정(들)을 포함한, 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
유전 물질: 본원에 사용된 용어 "유전 물질"은 모든 유전자 및 핵산 분자, 예컨대 DNA 및 RNA를 포함한다.
노린재류 해충(Hemipteran pest): 본원에 사용된 용어 "노린재류 해충"은 예를 들어, 제한하지 않고, 광범위한 숙주 식물을 섭식하며 구멍내고 빨아먹는 구강 부분을 갖는 노린재과(Pentatomidae), 장님노린재과(Miridae), 별노린재과(Pyrrhocoridae), 허리노린재과(Coreidae), 호리허리노린재과(Alydidae) 및 잡초노린재과(Rhopalidae)의 곤충을 포함한, 노린재목의 해충 곤충을 지칭한다. 특정한 예에서, 노린재류 해충은 유쉬스투스 헤로스 (파브르.) (신열대 갈색 노린재), 네자라 비리둘라 (L.) (남부 녹색 노린재), 피에조도루스 구일디니이 (웨스트우드) (적색-줄무늬 노린재), 할리오모르파 할리스 (Stal) (썩덩나무노린재), 키나비아 힐라레 (세이) (녹색 노린재), 유쉬스투스 세르부스 (세이) (갈색 노린재), 디켈롭스 멜라칸투스 (달라스), 디켈롭스 푸르카투스 (F.), 에데사 메디타분다 (F.), 티안타 페르디토르 (F.) (신열대 적색 어깨 노린재), 키나비아 마르기나툼 (팔리소 드 보부아), 호르시아스 노빌렐루스 (베르그) (목화 벌레), 타에디아 스티그모사 (베르그), 디스데르쿠스 페루비아누스 (구에린-메네빌), 네오메갈로토무스 파르부스 (웨스트우드), 렙토글로수스 조나투스 (달라스), 니에스트레아 시다에 (F.), 리구스 헤르페루스 (나이트) (서부 변색 장님노린재), 및 리구스 리네올라리스 (팔리소 드 보부아)를 포함하는 목록으로부터 선택된다.
억제: 본원에 사용된 용어 "억제"는 코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자)에 대한 효과를 기재하는데 사용되는 경우에, 코딩 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 mRNA, 및/또는 코딩 폴리뉴클레오티드의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 산물의 세포 수준에서의 측정가능한 감소를 지칭한다. 일부 예에서, 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현은 발현이 대략적으로 제거되도록 억제될 수 있다. "특이적 억제"는 특이적 억제가 달성되는 세포에서 결과적으로 다른 코딩 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 유전자)의 발현에는 영향을 미치지 않으면서 타겟 코딩 폴리뉴클레오티드를 억제하는 것을 지칭한다.
곤충: 해충과 관련하여 본원에 사용된 용어 "곤충 해충"은 구체적으로 딱정벌레류 곤충 해충을 포함한다. 일부 예에서, 용어 "곤충 해충"은 구체적으로 D. v. 비르기페라 르콩트 (WCR); D. 바르베리 스미스 및 로렌스 (NCR); D. u. 호와르디 (SCR); D. v. 제아에 (MCR); D. 발테아타 르콩트; D. u. 테넬라; D. u. 운데심푼크타타 만네르헤임; 및 D. 스페시오사 게르마를 포함하는 목록으로부터 선택된 디아브로티카 속의 딱정벌레류 해충을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 용어는 또한 일부 다른 곤충 해충; 예를 들어, 노린재류 곤충 해충을 포함한다.
단리된(isolated): "단리된" 생물학적 성분 (예컨대, 핵산 또는 단백질)은 성분에 화학적 또는 기능적 변화를 일으키면서, 자연 발생하는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질)으로부터, 성분이 실질적으로 분리되거나, 그를 제외하고 생산되거나 또는 그로부터 정제된 것이다 (예를 들어, 핵산은 염색체 내의 나머지 DNA에 핵산을 연결하는 화학 결합을 파괴함으로써 염색체로부터 단리될 수 있음). "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 또한, 상기 용어는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질 및 펩티드를 포함한다.
핵산 분자: 본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 RNA, cDNA, gDNA 및 상기한 것의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있는, 클레오티드의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 핵염기는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 어느 한 유형의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 핵산 분자는 통상적으로 달리 명시되지 않는 한, 적어도 10개의 염기 길이이다. 관례상, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 분자의 5' 말단에서 3' 말단으로 판독된다. 핵산 분자의 "상보체"는 핵산 분자의 핵염기와 염기 쌍을 형성할 수 있는 핵염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다 (즉, A-T/U, 및 G-C).
일부 구현예는 mRNA 분자의 상보체인 RNA 분자로 전사되는 주형 DNA를 포함하는 핵산을 포함한다. 이들 구현예에서, mRNA 분자로 전사된 핵산의 상보체는 5'에서 3' 배향으로 존재함으로써, RNA 중합효소(DNA를 5'에서 3' 방향으로 전사함)는 mRNA 분자에 혼성화할 수 있는 상보체로부터 핵산을 전사할 것이다. 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 또는 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 따라서 용어 "상보체(complement)"는 참조 핵산의 핵염기와 염기 쌍을 형성할 수 있는, 5'에서 3'으로, 핵염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 마찬가지로, 달리 명확하게 언급되지 않는 한 (또는 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한), 핵산의 "역 상보체(reverse complement)"는 역 배향의 상보체를 지칭한다. 상기한 것이 하기 예시에서 보여지고 있다:
ATGATGATG 폴리뉴클레오티드
TACTACTAC 상기 폴리뉴클레오티드의 "상보체"
CATCATCAT 상기 폴리뉴클레오티드의 "역 상보체"
본 발명의 다른 구현예는 헤어핀 RNA-형성 iRNA 분자를 포함한다. 이들 iRNA 분자에서, RNA 간섭에 의해 타겟화될 핵산의 상보체 및 역 상보체 둘 다가 동일한 분자 내에서 발견될 수 있고, 이에 따라 단일-가닥 RNA 분자는 상보적 및 역 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 영역에 걸쳐 "폴드 오버"되어 스스로 혼성화할 수 있다.
"핵산 분자"는 모든 폴리뉴클레오티드, 예를 들어: 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA; 단일-가닥 형태의 RNA; 및 이중-가닥 형태의 RNA (dsRNA)를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 개별 단일-가닥으로서 또는 듀플렉스로 핵산의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 지칭한다. 용어 "리보핵산" (RNA)은 iRNA (억제 RNA), dsRNA (이중-가닥 RNA), siRNA (소형 간섭 RNA), shRNA (소형 헤어핀 RNA), mRNA (메신저 RNA), miRNA (마이크로-RNA), hpRNA (헤어핀 RNA), tRNA (상응하는 아실화된 아미노산이 적재된 또는 적재되지 않은 운반 RNA), 및 cRNA (상보적 RNA)를 포함한다. 용어 "데옥시리보핵산" (DNA)은 cDNA, gDNA, 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산," 및 그의 "단편"은 예를 들어 gDNA, 리보솜 RNA, 운반 RNA, 메신저 RNA, 오페론, 및 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하거나 코딩하도록 개조될 수 있는 보다 소형의 조작된 폴리뉴클레오티드를 전부 포함하는 용어로 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 짧은 핵산 중합체이다. 올리고뉴클레오티드는 보다 긴 핵산 절편들의 절단에 의해서나, 개별 뉴클레오티드 전구체의 중합에 의해 형성될 수 있다. 자동화된 합성기로 인해 최대 수백 개의 염기 길이의 올리고뉴클레오티드의 합성이 가능하다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 핵산에 결합할 수 있기 때문에, DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA로 구성된 올리고뉴클레오티드(올리고데옥시리보뉴클레오티드)는 DNA의 증폭을 위한 기술인, PCR에서 사용될 수 있다. PCR에서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 "프라이머"로 지칭되고, 이는 DNA 중합효소가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고 상보적 가닥을 복제하도록 한다.
핵산 분자는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-자연적 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 표지, 메틸화, 유사체에 의한 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비전하 결합: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등; 전하 결합: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제(intercalator): 예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등; 킬레이트제; 알킬화제; 및 변형된 연결기: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 듀플렉스, 트리플렉스, 헤어핀, 원형 및 패드록 입체형태를 포함한, 임의의 위상 입체형태를 또한 포함한다.
DNA와 관련하여 본원에 사용된 용어 "코딩 폴리뉴클레오티드", "구조적 폴리뉴클레오티드" 또는 "구조적 핵산 분자"는 적절한 조절 요소의 제어 하에 놓였을 때, 전사 및 mRNA를 통해, 궁극적으로는 폴리펩티드로 번역되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. RNA와 관련하여, 용어 "코딩 폴리뉴클레오티드"는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 코딩 폴리뉴클레오티드의 경계는 5'-말단의 번역 개시 코돈 및 3'-말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 폴리뉴클레오티드는 gDNA; cDNA; EST; 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드"는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되지 않는 mRNA 분자의 절편, 예컨대 5'UTR, 3'UTR 및 인트론 절편을 지칭한다. 또한, "전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드"는 세포에서 기능하는 RNA, 예를 들어 구조적 RNA (예를 들어, 5S rRNA, 5.8S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA, 및 28S rRNA 등에 의해 예시되는 바와 같은 리보솜 RNA (rRNA) 등); 운반 RNA (tRNA); 및 snRNA, 예컨대 U4, U5, U6 등으로 전사되는 핵산을 지칭한다. 전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어 제한하지 않고, 종종 소형 박테리아 비-코딩 RNA를 설명하는데 사용되는 용어인, 소형 RNA (sRNA); 소형 핵소체 RNA (snoRNA); 마이크로 RNA (miRNA); 소형 간섭 RNA (siRNA); 피위-상호작용 RNA (piRNA); 및 긴 비-코딩 RNA를 포함한다. 또한 추가로, "전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드"는 핵산에서 유전자내 "스페이서"로서 천연적으로 존재할 수 있고 RNA 분자로 전사되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
치사 RNA 간섭(lethal RNA interference): 본원에 사용된 용어 "치사 RNA 간섭"은 예를 들어 dsRNA, miRNA, siRNA, shRNA 및/또는 hpRNA가 전달되는 대상 개체의 사멸 또는 생존율 감소를 야기하는 RNA 간섭을 지칭한다.
게놈: 본원에 사용된 용어 "게놈"은 세포의 핵 내에서 발견되는 염색체 DNA를 지칭하고, 또한 세포의 준세포 성분 내에서 발견되는 소기관 DNA를 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, DNA 분자는 DNA 분자가 식물 세포의 게놈 내로 편입되도록 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, DNA 분자는 식물 세포의 핵 DNA 내로 편입될 수 있거나, 또는 식물 세포의 엽록체 또는 미토콘드리아의 DNA 내로 편입될 수 있다. 용어 "게놈"은, 그것이 박테리아에 적용되는 경우에는, 박테리아 세포 내의 염색체 및 플라스미드 둘 다를 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, DNA 분자는 DNA 분자가 박테리아의 게놈 내로 편입되도록 박테리아 내로 도입될 수도 있다. 이들 및 추가 구현예에서, DNA 분자는 안정적인 플라스미드로서 또는 거기에 염색체-통합될 수 있거나 또는 위치할 수 있다.
서열 동일성: 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 최대로 상응하도록 정렬하였을 때 동일한, 2개의 분자의 서열에서의 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 분자의 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있으며, 여기서 비교 윈도우에서의 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여, 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 양쪽의 서열에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우에서의 위치의 총수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 참조 서열과의 비교시 모든 위치에서 동일한 서열은 참조 서열에 대해 100% 동일하다고 말할 수 있으며, 그 반대의 경우도 그러하다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 본 기술분야에 주지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이, 예를 들어 하기에 기재되어 있다: Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman 및 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson 및 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins 및 Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins 및 Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet 등 (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang 등 (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson 등 (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana 등 (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고찰은, 예를 들어 Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10에서 찾아볼 수 있다.
국립 생물 정보 센터 (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul 등 (1990))은 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다)를 포함한 여러 소스로부터와 인터넷 상에서 이용가능하다. 이 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 설명은 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션 하에 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 변수로 설정된 디폴트 BLOSUM62 행렬을 사용하는 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능이 사용될 수 있다. 참조 폴리뉴클레오티드의 서열에 대해 서열 유사성이 훨씬 더 큰 핵산은 이 방법에 의해 평가하는 경우에 증가하는 백분율 동일성을 나타낼 것이다.
특이적으로 혼성화가능한/특이적으로 상보적인: 본원에 사용된 용어 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 핵산 분자와 타겟 핵산 분자 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 이루어지도록 하는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화는 2개의 핵산 분자의 핵염기 사이의 역평행 정렬의 형성을 수반한다. 이어서, 2개의 분자는 대향 가닥 상의 상응하는 염기와 수소 결합을 형성하여 듀플렉스 분자를 형성할 수 있으며, 이것이 충분히 안정적인 경우에 본 기술분야에 주지된 방법을 사용하여 검출가능하다. 폴리뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능하도록 그의 타겟 핵산에 대해 100% 상보적이어야 할 필요는 없다. 그러나, 특이적인 혼성화를 위해 존재해야 하는 상보성의 양은 사용되는 혼성화 조건의 함수이다.
특정한 엄중도를 초래하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 속성 및 혼성화 핵산의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 비록 세척 횟수 또한 엄중도에 영향을 미치지만, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히 Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄중도를 결정할 것이다. 특정한 엄중도를 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 Sambrook 등 (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; 및 Hames 및 Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985에 논의되어 있다. 핵산의 혼성화에 관한 추가의 상세한 지침 및 안내는, 예를 들어, Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; 및 Ausubel 등, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 "엄중 조건"은 혼성화 분자의 서열과, 타겟 핵산 분자 내의 상동 폴리뉴클레오티드 사이에 20% 미만의 미스매치가 존재하는 경우에만 혼성화가 일어나게 되는 조건을 포괄한다. "엄중 조건"은 추가로 특정한 수준의 엄중도를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "중간 정도의 엄중도" 조건은 20% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자들이 혼성화되지 않을 조건이고; "고 엄중도" 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열들이 혼성화되지 않을 조건이고; "매우 고도의 엄중도" 조건은 5% 초과의 미스매치를 갖는 서열들이 혼성화되지 않을 조건이다.
하기는 대표적인 비제한적 혼성화 조건이다.
고 엄중도 조건 (적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드를 검출함): 16시간 동안 65℃에서 5x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 15분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 20분 동안 65℃에서 0.5x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
중간 정도의 엄중도 조건 (적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드를 검출함): 16-20시간 동안 65-70℃에서 5x-6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 5-20분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 30분 동안 55-70℃에서 1x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
비-엄중 대조군 조건 (적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드가 혼성화될 것임): 16-20시간 동안 실온 내지 55℃에서 6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 20-30분 동안 실온 내지 55℃에서의 2x-3x SSC 완충제 중에서의 적어도 2회 세척.
핵산과 관련하여, 본원에 사용된 용어 "실질적으로 상동인" 또는 "실질적 상동성"은 엄중 조건 하에서 참조 핵산에 혼성화하는 인접 핵염기를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 참조 핵산에 실질적으로 상동인 핵산은 엄중 조건 (예를 들어, 상기에 기재된 중간 정도의 엄중도 조건) 하에서 참조 핵산에 혼성화하는 핵산이다. 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드는 약 80% 내지 100% 서열 동일성, 예컨대 79%; 80%; 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94%; 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 및 약 100%를 가질 수 있다. 실질적 상동성의 특성은 특이적 혼성화와 밀접한 관련이 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 특이적 결합을 요망하는 조건 하에서, 예를 들어 엄중한 혼성화 조건 하에서 핵산의 비-타겟 폴리뉴클레오티드에 대한 비-특이적 결합을 피하는데 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에 특이적으로 혼성화가능하다.
본원에 사용된 용어 "오르토로그(ortholog)"는 공통 조상 핵산으로부터 진화하였고, 2 이상의 종에서 동일한 기능을 보유할 수 있는 2 이상의 종에서의 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 2개의 핵산 분자는 5'에서 3' 방향으로 판독된 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 3'에서 5' 방향으로 판독했을 때 다른 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드와 상보적인 경우에 "완전한 상보성"을 나타낸다고 언급된다. 참조 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 참조 폴리뉴클레오티드의 역 상보체와 동일한 서열을 나타낼 것이다. 이들 용어 및 설명은 본 기술분야에 잘 정의되어 있으며, 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해된다.
작동가능하게 연결된(operably linked): 제1 폴리뉴클레오티드가 제2 폴리뉴클레오티드와 기능적 관계에 있을 때, 제1 폴리뉴클레오티드는 제2 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 것이다. 재조합적으로 생산되었을 때, 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 인접해 있고, 동일한 리딩 프레임 내에서 (예를 들어, 번역 융합된 ORF 내에서) 2개의 단백질-코딩 영역을 필요할 경우 연결한다. 그러나, 핵산은 작동가능하게 연결되기 위해 인접해 있을 필요는 없다.
조절 유전 요소 및 코딩 폴리뉴클레오티드를 참조하여 사용되는 경우에, 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 요소가 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 요소" 또는 "제어 요소"는 전사의 시기 및 수준/양, RNA 가공 또는 안정성, 또는 회합된 코딩 폴리뉴클레오티드의 번역에 영향을 미치는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 조절 요소는 프로모터; 번역 리더; 인트론; 인핸서; 스템-루프 구조; 리프레서 결합 폴리뉴클레오티드; 종결 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 폴리아데닐화 인식 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 특정한 조절 요소는 거기에 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 특정한 조절 요소는 이중-가닥 핵산 분자의 회합된 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다.
프로모터: 본원에 사용된 용어 "프로모터"는 전사 시작점으로부터 상류에 위치할 수 있고, RNA 중합효소, 및 전사를 개시하는 다른 단백질의 인식 및 결합에 수반될 수 있는 DNA 영역을 지칭한다. 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터일 수 있다. 발생 제어 하에 있는 프로모터의 예는 소정의 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 헛물관 또는 후막조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 "조직-선호"인 것으로 지칭된다. 소정의 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적"인 것으로 지칭된다. "세포 유형-특이적" 프로모터는 주로 하나 이상 기관의 소정의 세포 유형, 예를 들어 뿌리 또는 잎의 도관 세포에서의 발현을 구동한다. "유도성" 프로모터는 환경 제어 하에 있을 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시할 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건 및 광의 존재를 포함한다. 조직-특이적, 조직-선호, 세포 유형 특이적 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에서, 또는 대부분의 세포 또는 조직 유형에서 활성일 수 있는 프로모터이다.
임의의 유도성 프로모터가 본 발명의 일부 구현예에서 사용될 수 있다. Ward 등 (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366 참조. 유도성 프로모터의 경우에, 유도제에 대한 반응으로 전사 속도가 증가한다. 예시적인 유도성 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 구리에 반응하는 ACEI 시스템 유래 프로모터, 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 대해 반응하는, 메이즈 유래 In2 유전자; Tn10 유래 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도될 수 있는, 스테로이드 호르몬 유전자 유래 유도성 프로모터 (Schena 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).
예시적인 구성적 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 식물 바이러스 유래 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 유래 35S 프로모터; 벼 액틴 유전자 유래 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 메이즈 H3 히스톤 프로모터; 및 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조적 유전자에 대해 5'의 Xba1/NcoI 단편인, ALS 프로모터 (또는 상기 Xba1/NcoI 단편과 유사한 폴리뉴클레오티드) (국제 PCT 공개 번호 WO96/30530).
추가로, 임의의 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터가 본 발명의 일부 구현예에서 이용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 식물은 특이적 조직에서 배타적으로 또는 우선적으로 코딩 폴리뉴클레오티드의 산물을 생산할 수 있다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 종자-선호 프로모터, 예컨대 파세올린(phaseolin) 유전자 유래의 것; 잎-특이적 및 광-유도성 프로모터, 예컨대 캡(cab) 또는 루비스코(rubisco) 유래의 것; 꽃밥-특이적 프로모터, 예컨대 LAT52 유래의 것; 화분-특이적 프로모터, 예컨대 Zm13 유래의 것; 및 소포자-선호 프로모터, 예컨대 apg 유래의 것.
대두 식물: 본원에 사용된 용어 "대두 식물"은 글리신(Glycine) 속 유래의 종의 식물; 예를 들어 G. 맥스(G. max)를 지칭한다.
형질전환: 본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질도입"은 하나 이상의 핵산 분자(들)를 세포 내로 전달하는 것을 지칭한다. 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 편입에 의해 또는 에피솜 복제에 의해, 세포에 의해 안정적으로 복제될 때 세포는 상기 세포 내로 형질도입된 핵산 분자에 의해 "형질전환된다". 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 분자가 이러한 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm 등 (1986) Nature 319:791-3); 리포펙션 (Felgner 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주사 (Mueller 등 (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 전달 (Fraley 등 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접 DNA 흡수; 및 미세발사체 충격 (Klein 등 (1987) Nature 327:70).
트랜스젠(transgene): 외인성 핵산. 일부 예에서, 트랜스젠은 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충에서 발견되는 핵산 분자에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA의 하나 또는 둘 다의 가닥(들)을 코딩하는 DNA일 수 있다. 추가의 예에서, 트랜스젠은 안티센스 폴리뉴클레오티드일 수도 있으며, 여기서 안티센스 폴리뉴클레오티드의 발현은 타겟 핵산의 발현을 억제함으로써 RNAi 표현형을 생성한다. 추가의 예에서, 트랜스젠은 유전자 (예를 들어, 제초제-내성 유전자, 산업상 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자)일 수 있다. 이들 및 다른 예에서, 트랜스젠은 트랜스젠의 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)를 함유할 수 있다.
벡터: 예를 들어 형질전환된 세포를 생산하기 위해 세포 내로 도입되는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제가 가능한 유전 요소, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터의 예는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터는 또한 안티센스 분자를 생성하는 것을 포함한 하나 이상의 유전자, 및/또는 선택성 마커 유전자 및 본 기술분야에 공지되어 있는 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환 또는 감염시킴으로써 세포가 핵산 분자 및/또는 벡터에 의해 코딩된 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 선택적으로 핵산 분자를 세포 내로 진입시키는데 도움을 주는 물질(예를 들어, 리포솜, 단백질 코팅 등)을 포함한다.
수확량(yield): 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장하는 동일한 성장 지역에 있는 확인(check) 품종의 수확량에 비해 약 100% 이상의 안정화된 수확량. 특정한 구현예에서, "개선된 수확량" 또는 "수확량 개선"은 재배품종이, 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장하는 작물에게 유해한 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충을 유의한 밀도로 함유하는 동일한 성장 위치에 있는 확인 품종의 수확량에 비해 105% 이상의 안정화된 수확량을 가지며, 본원의 조성물 및 방법에 의해 타겟화되었다는 것을 의미한다.
구체적으로 명시 또는 암시되지 않는 한, 용어 단수 형태는 본원에 사용된 "적어도 하나"를 의미한다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 통상의 용어에 관한 정의는, 예를 들어 Lewin's Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs 등. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 찾아볼 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 백분율은 중량 기준이고 모든 용매 혼합물 비율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.
IV. 곤충 해충 서열을 포함하는 핵산 분자
A. 개관
곤충 해충의 방제에 유용한 핵산 분자가 본원에 기재된다. 일부 예에서, 곤충 해충은 딱정벌레류 (예를 들어, 디아브로티카 속의 종들) 또는 노린재류 (예를 들어, 유쉬스투스 속의 종들) 곤충 해충이다. 기재된 핵산 분자는 타겟 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 천연 유전자 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드), dsRNA, siRNA, shRNA, hpRNA, 및 miRNA를 포함한다. 예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충에서의 하나 이상의 천연 핵산의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적일 수 있는 dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및/또는 hpRNA 분자가 일부 구현예에서 기재된다. 이들 및 추가 구현예에서, 천연 핵산(들)은 하나 이상의 타겟 유전자(들)일 수 있고, 그의 산물은 예를 들어, 제한하지 않고, 대사공정에 수반되거나 유충/약충 발생에 수반될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는, 핵산 분자가 특이적으로 상보적인 적어도 하나의 천연 핵산(들)을 포함하는 세포 내로 도입되었을 때, 세포에서 RNAi를 개시할 수 있고, 그 결과 천연 핵산(들)의 발현을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 예에서, 그에 특이적으로 상보적인 핵산 분자에 의한 타겟 유전자의 발현의 감소 또는 제거는 해충의 성장, 발생 및/또는 섭식의 감소 또는 중지를 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 곤충 해충에서의 적어도 하나의 타겟 유전자가 선택될 수 있으며, 여기서 타겟 유전자는 rpII33 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 딱정벌레류 해충에서의 타겟 유전자가 선택되며, 여기서 타겟 유전자는 서열번호:1, 3, 및 5-8 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 노린재류 해충에서의 타겟 유전자가 선택되며, 여기서 타겟 유전자는 서열번호:76, 78, 및 80-82 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구현예에서, 타겟 유전자는 rpII33 폴리뉴클레오티드의 단백질 산물의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한 (예를 들어, 적어도 84%, 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 100% 동일한) 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 인 실리코(in silico) 역 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자일 수 있다. 타겟 유전자는 곤충 해충에서의 임의의 rpII33 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 그의 전사후 억제는 해충의 성장, 생존 및/또는 생존력에 유해한 효과를 가져서, 예를 들어 식물에게 해충에 대한 보호 이익을 제공한다. 특정한 예에서, 타겟 유전자는 서열번호:2; 서열번호:4; 서열번호:77; 또는 서열번호:79의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95% 동일한, 약 96% 동일한, 약 97% 동일한, 약 98% 동일한, 약 99% 동일한, 약 100% 동일한, 또는 100% 동일한 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 인 실리코 역 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이다.
그의 발현이 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에서 코딩 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 천연 RNA 분자의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자를 발생시키는, DNA가 본 발명에 따라 제공된다. 일부 구현예에서, 발현된 RNA 분자가 곤충 해충에 의해 섭취된 후, 해충의 세포에서 코딩 폴리뉴클레오티드의 하향-조절이 수득될 수 있다. 특정한 구현예에서, 해충의 세포에서의 코딩 서열의 하향-조절이 수득될 수 있다. 특정한 구현예에서, 곤충 해충의 세포에서의 코딩 서열의 하향-조절은 해충의 성장, 발생 및/또는 생존에 대해 유해한 효과를 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 타겟 폴리뉴클레오티드는 전사된 비-코딩 RNA, 예컨대 5'UTR; 3'UTR; 스플라이싱된 리더; 인트론; 아우트론 (예를 들어, 트랜스 스플라이싱에서 후속 변형되는 5'UTR RNA); 도나트론 (예를 들어, 트랜스 스플라이싱을 위한 공여자 서열을 제공하는데 요구되는 비-코딩 RNA); 및 타겟 곤충 해충 유전자의 다른 비-코딩 전사된 RNA를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 모노-시스트론 및 폴리-시스토론 유전자 둘 다로부터 유래될 수 있다.
또한 본원에서는 일부 구현예와 관련하여 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에서의 타겟 핵산의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iRNA 분자(예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)가 기재된다. 일부 구현예에서, iRNA 분자는 복수의 타겟 핵산; 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 타겟 핵산의 전부 또는 일부에 상보적인 폴리뉴클레오티드(들)를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, iRNA 분자는 유전자-변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관 내 또는 생체 내에서 생산될 수 있다. 또한, 곤충 해충에서의 타겟 핵산의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA가 개시된다. 특정한 숙주 타겟을 안정적으로 형질전환시키는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물이 추가로 기재된다. 형질전환된 숙주 타겟은 재조합 DNA 구축물로부터 dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA 및/또는 hpRNA 분자를 유효 수준으로 발현할 수 있다. 따라서, 또한 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터가 기재되며, 여기서 폴리뉴클레오티드(들)의 발현은 곤충 해충에서 타겟 핵산의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 인접 핵염기의 스트링을 포함하는 RNA 분자를 초래한다.
특정한 예에서, 딱정벌레류 또는 노린재류 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 다음을 포함할 수 있다: rpII33 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열번호:1, 3, 및 5-8 중 어느 하나)를 포함하는 디아브로티카 유기체로부터 단리된 천연 핵산의 전부 또는 일부; rpII33 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열번호:76, 78, 및 80-82 중 어느 하나)를 포함하는 노린재류 유기체로부터 단리된 천연 핵산의 전부 또는 일부; 발현되었을 때 rpII33에 의해 코딩된 천연 RNA 분자의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자를 발생시키는 DNA; rpII33의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA); rpII33의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자, 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA; 및 특정한 숙주 타겟의 안정적인 형질전환을 달성하는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물, 여기서 형질전환된 숙주 타겟은 상술한 핵산 분자 중 하나 이상을 포함한다.
B. 핵산 분자
본 발명은 특히, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충의 세포, 조직 또는 기관에서의 타겟 유전자 발현을 억제하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자; 및 세포 또는 미생물에서 iRNA 분자로서 발현되어 곤충 해충의 세포, 조직 또는 기관에서 타겟 유전자 발현을 억제할 수 있는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명의 일부 구현예는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 초과) 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다: 서열번호:1 또는 3; 서열번호:1 또는 3의 상보체; 서열번호:1 또는 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편 (예를 들어, 서열번호:5-8 중 어느 하나); 서열번호:1 또는 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체.
본 발명의 다른 구현예는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 초과) 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다: 서열번호:76 또는 78; 서열번호:76 또는 78의 상보체; 서열번호:76 또는 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편 (예를 들어, 서열번호:80-82 중 어느 하나); 서열번호:76 또는 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체 (예를 들어, BSB)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체.
특정한 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 iRNA의 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 해충의 성장, 발생 및/또는 섭식을 억제한다. 일부 구현예에서, 곤충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 iRNA를 포함하는 식물 물질 또는 베이트(bait)를 섭식하는 것을 통해서 일어난다. 일부 구현예에서, 곤충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 곤충을 포함하는 식물을 iRNA를 포함하는 조성물로 분사하는 것을 통해서 일어난다.
일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 초과) 폴리뉴클레오티드(들)를 포함할 수 있다: 서열번호:92; 서열번호:92의 상보체; 서열번호:93; 서열번호:93의 상보체; 서열번호:92 또는 93의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편(예를 들어, 서열번호:94-97); 서열번호:92 또는 93의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:94-97 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:94-97 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:94-97 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호:94-97 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체.
다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 초과) 폴리뉴클레오티드(들)를 포함할 수 있다: 서열번호:98; 서열번호:98의 상보체; 서열번호:99; 서열번호:99의 상보체; 서열번호:98 또는 서열번호:99의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편 (예를 들어, 서열번호:100-102); 서열번호:98 또는 서열번호:99의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:100-102 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체 (예를 들어, BSB)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:100-102 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:100-102 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호:100-102 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체.
특정한 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 해충의 생존, 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 억제한다.
소정의 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 dsRNA 분자는 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나를 포함하는 타겟 유전자로부터의 전사물에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편을 포함하며, 곤충 해충에서의 그 타겟 유전자의 억제는 해충의 성장, 발생 또는 다른 생물학적 기능에 필수적인 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 작용제의 감소 또는 제거를 야기한다. 선택된 폴리뉴클레오티드는 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나; 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 인접 단편; 및 상기 중 어느 하나의 상보체에 대해 약 80%에서 약 100%까지 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 선택된 폴리뉴클레오티드는 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나; 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 인접 단편; 및 상기 중 어느 하나의 상보체에 대해 79%; 80%; 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94%; 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 또는 약 100% 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 또는 미생물에서 iRNA 분자로서 발현되어 타겟 유전자 발현을 억제할 수 있는 DNA 분자는 하나 이상의 타겟 곤충 해충 종 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류 해충 종)에서 발견되는 천연 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 단일 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 또는 DNA 분자는 복수의 이러한 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드로부터의 키메라로서 구축될 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 "스페이서"에 의해 분리된 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 스페이서는, 이것이 요망되는 경우, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 이차 구조 형성을 용이하게 하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 한 구현예에서, 스페이서는 mRNA에 대한 센스 또는 안티센스 코딩 폴리뉴클레오티드의 일부이다. 스페이서는 대안적으로 핵산 분자에 공유 연결될 수 있는 뉴클레오티드 또는 그의 상동체의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, DNA 분자는 하나 이상의 상이한 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 iRNA 분자 각각은 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 서로 상보적이다. 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자 내에서 스페이서에 의해 연결될 수 있다. 스페이서는 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드의 일부로 구성될 수 있다. 제1 및 제2 뉴클레오티드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자의 발현은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드의 특이적 분자내 염기-쌍형성에 의해 dsRNA 분자의 형성으로 이어질 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 곤충 해충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류 해충)에 천연인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 타겟 유전자, 또는 전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드), 그의 유도체, 또는 그에 상보적 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일할 수 있다.
dsRNA 핵산 분자는 중합된 리보뉴클레오티드의 이중 가닥을 포함하고, 포스페이트-당 백본 또는 뉴클레오시드로의 변형을 포함할 수 있다. RNA 구조에서의 변형은 특이적인 억제가 이루어질 수 있도록 조절(tailor)될 수 있다. 한 구현예에서, dsRNA 분자는 편재하는 효소 공정을 통해 변형될 수 있으며, 이에 의해 siRNA 분자가 생성될 수 있다. 이러한 효소 공정은 시험관 내 또는 생체 내에서 RNase III 효소, 예컨대 진핵생물에서는 DICER를 이용할 수 있다. Elbashir 등 (2001) Nature 411:494-8; 및 Hamilton 및 Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2을 참조한다. DICER 또는 기능상 등가인 RNAse III 효소는 보다 큰 dsRNA 가닥 및/또는 hpRNA 분자를, 각각의 길이가 약 19-25개의 뉴클레오티드인 보다 작은 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)로 절단한다. 이들 효소에 의해 생산된 siRNA 분자는 2 내지 3개의 뉴클레오티드 3' 오버행, 및 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는다. RNAse III 효소에 의해 생성된 siRNA 분자는 풀린 상태이고, 세포에서 단일-가닥 RNA로 분리된다. 이어서, siRNA 분자는 타겟 유전자로부터 전사된 RNA와 특이적으로 혼성화되고, 이후 양쪽 RNA 분자 모두는 고유한 세포 RNA-분해 메카니즘에 의해 분해된다. 이러한 공정을 통해 타겟 유기체에서의 타겟 유전자에 의해 코딩된 RNA가 효과적으로 분해 또는 제거될 수 있다. 그 결과는 타겟화된 유전자의 전사후 침묵이다. 일부 구현예에서, 내인성 RNAse III 효소에 의해 이종 핵산 분자로부터 생산된 siRNA 분자는 곤충 해충에서의 타겟 유전자의 하향-조절을 효율적으로 매개할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 생체 내 분자간 혼성화를 통해 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 단일-가닥 RNA 분자로 전사될 수 있는 적어도 하나의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 dsRNA는 통상적으로 자기-조립되고, 타겟 유전자의 전사후 억제를 달성하기 위해 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류) 해충의 영양 공급원으로 제공될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 핵산 분자는, 각각 곤충 해충에서 상이한 타겟 유전자에 특이적으로 상보적인 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 핵산 분자가 dsRNA 분자로서 예를 들어 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충에게 제공되었을 때, dsRNA 분자는 해충에서 적어도 2개의 상이한 타겟 유전자의 발현을 억제한다.
C. 핵산 분자 수득
곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및 노린재류) 해충에서의 다양한 폴리뉴클레오티드가 핵산 분자, 예컨대 iRNA 및 iRNA를 코딩하는 DNA 분자를 설계하기 위한 타겟으로서 사용될 수 있다. 그러나, 천연 폴리뉴클레오티드를 선택하는 것은 간단한 과정이 아니다. 예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류 해충에서 단지 소수의 천연 폴리뉴클레오티드만이 유효 타겟일 것이다. 특정한 천연 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 핵산 분자에 의해 효과적으로 하향-조절될 수 있는지 여부, 또는 특정한 천연 폴리뉴클레오티드의 하향-조절이 곤충 해충의 성장, 생존력, 섭식 및/또는 생존에 유해한 효과를 가질 것인지 여부를 확신을 가지고 예측할 수 없다. 대부분의 천연 딱정벌레류 및 노린재류 해충 폴리뉴클레오티드, 예컨대 이들로부터 단리된 EST (예를 들어, 미국 특허 제7,612,194호에 열거된 딱정벌레류 해충 폴리뉴클레오티드)는 해충의 성장 및/또는 생존력에 유해한 효과를 갖지 않는다. 또한 곤충 해충에 유해한 효과를 가질 수 있는 천연 폴리뉴클레오티드 중 어느 것이 숙주 식물에서 이러한 천연 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 분자를 발현시키고 숙주 식물에는 해를 끼치지 않으면서 해충이 섭식하였을 때 그에 대해 유해한 효과를 제공하도록 하기 위한 재조합 기술에 사용될 수 있는지를 예측하는 것은 불가능하다.
일부 구현예에서, 핵산 분자 (예를 들어, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류) 해충의 숙주 식물에 제공하고자 하는 dsRNA 분자)는, 예컨대 대사 또는 이화 생화학적 경로, 세포 분열, 에너지 대사, 소화, 숙주 식물 인식 등에 관여하는 폴리펩티드와 같이, 해충 발생 및/또는 생존에 필수적인 단백질 또는 단백질의 일부를 코딩하는 cDNA를 타겟화하도록 선택된다. 본원에 기재된 바와 같이, 적어도 하나의 절편이 타겟 해충 유기체의 세포에서 생산되는 RNA의 적어도 실질적으로 동일한 절편에 특이적으로 상보적인, 하나 이상의 dsRNA를 함유하는 조성물을 타겟 해충 유기체가 섭취하면 타겟은 사멸되거나 또는 다르게 억제될 수 있다. 곤충 해충으로부터 유래된, DNA 또는 RNA인 폴리뉴클레오티드를 사용하여 해충에 의한 침입에 대해 저항성인 식물 세포를 구축할 수 있다. 예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충의 숙주 식물 (예를 들어, Z. 메이스 또는 G. 맥스)은 본원에 제공된 바와 같은 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 함유하도록 형질전환될 수 있다. 숙주 내로 형질전환되는 폴리뉴클레오티드는 형질전환된 숙주 내의 세포에서 또는 생물학적 유체에서 dsRNA 구조로 형성되는 하나 이상의 RNA를 코딩할 수 있고, 이에 따라 해충이 트랜스제닉 숙주와 영양면에서 관계를 맺게 되면/그러한 때에 dsRNA는 이용가능하게 된다. 이는 해충의 세포에서 하나 이상의 유전자의 발현의 억제를 야기할 수 있고, 궁극적으로 사멸 또는 그의 성장 또는 발생의 억제를 야기할 수 있다.
일부 구현예에서, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류) 해충의 성장 및 발생에 필수적으로 수반되는 유전자가 타겟화된다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 타겟 유전자는, 예를 들어 해충 생존력, 운동, 이동, 성장, 발생, 감염성, 및 섭식 장소 확립에서 중요한 역할을 하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 타겟 유전자는 하우스키핑 유전자 또는 전사 인자일 수 있다. 추가로, 본 발명에서 사용하기 위한 천연 곤충 해충 폴리뉴클레오티드는 또한 식물, 바이러스, 박테리아 또는 곤충 유전자의 상동체 (예를 들어, 오르토로그)로부터 유래될 수 있으며, 그의 기능은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 그의 폴리뉴클레오티는 타겟 해충의 게놈 중 타겟 유전자와 특이적으로 혼성화가능하다. 혼성화에 의해 공지된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 상동체를 식별하는 방법은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자를 생산하기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 수득하는 방법을 제공한다. 이러한 한 구현예는 (a) 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류) 해충에서 dsRNA-매개 유전자 억제시 하나 이상의 타겟 유전자(들)를 그의 발현, 기능 및 표현형에 대해 분석하는 단계; (b) dsRNA-매개 억제 분석에서 변경된 (예를 들어, 감소된) 성장 또는 발생 표현형을 디스플레이하는 타겟화된 해충으로부터의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상동체의 전부 또는 일부를 포함하는 프로브로 cDNA 또는 gDNA 라이브러리를 프로빙하는 단계; (c) 프로브와 특이적으로 혼성화되는 DNA 클론을 식별하는 단계; (d) 단계 (b)에서 식별된 DNA 클론을 단리하는 단계; (e) 단계 (d)에서 단리된 클론을 포함하는 cDNA 또는 gDNA 단편을 서열분석하고, 여기서 서열분석된 핵산 분자는 RNA 또는 그의 상동체의 전부 또는 실질적인 부분을 포함하는 것인, 단계; 및 (f) 유전자, 또는 siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, 또는 dsRNA의 전부 또는 실질적인 부분을 화학적으로 합성하는 단계를 포함한다.
추가 구현예에서, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자의 실질적인 부분을 생산하기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편을 수득하는 방법은 (a) 타겟화된 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류) 해충으로부터의 천연 폴리뉴클레오티드의 부분에 특이적으로 상보적인 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 클로닝 벡터에 존재하는 cDNA 또는 gDNA 삽입물을 증폭시키고, 여기서 증폭된 핵산 분자는 siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, 또는 dsRNA 분자의 실질적인 부분을 포함하는 것인, 단계를 포함한다.
핵산은 수많은 접근법에 의해 단리, 증폭 또는 생산될 수 있다. 예를 들어, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자는 gDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 유래된 타겟 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 타겟 유전자 또는 타겟 전사된 비-코딩 폴리뉴클레오티드) 또는 그의 부분의 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. DNA 또는 RNA는 타겟 유기체로부터 추출될 수 있고, 핵산 라이브러리는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 그로부터 제조될 수 있다. 타겟 유기체로부터 생성된 gDNA 또는 cDNA 라이브러리는 PCR 증폭 및 타겟 유전자의 서열분석에 사용될 수 있다. 확인된 PCR 산물은 시험관 내 전사를 위한 주형으로서 사용될 수 있고, 이에 의해 최소 프로모터와 함께 센스 및 안티센스 RNA가 생성될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 자동화된 DNA 합성기 (예를 들어, P.E. Biosystems, Inc. (캘리포니아주 포스터시티) 모델 392 또는 394 DNA/RNA 합성기)를 사용하는 것, 표준 화학, 예컨대 포스포라미다이트 화학을 사용하는 것을 포함한 수많은 기술 중 어느 하나에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, Ozaki 등 (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; 및 Agrawal 등 (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423 참조). 예를 들어, Beaucage 등 (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; 미국 특허 제4,980,460호, 제4,725,677호, 제4,415,732호, 제4,458,066호, 및 제4,973,679호를 참조한다. 비-천연 백본 기, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포라미다이트 등을 생성하는 대안적 화학이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자는 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수동 또는 자동화된 반응을 통해, 또는 생체 내에서 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포 내에서 화학적으로 또는 효소적으로 생산될 수 있다. RNA는 또한 부분 또는 총 유기 합성에 의해 생산될 수 있고, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드가 시험관 내 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다. RNA 분자는 세포 RNA 중합효소 또는 박테리오파지 RNA 중합효소 (예를 들어, T3 RNA 중합효소, T7 RNA 중합효소 및 SP6 RNA 중합효소)에 의해 합성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및 발현에 유용한 발현 구축물은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 WO97/32016; 및 미국 특허 제5,593,874호, 제5,698,425호, 제5,712,135호, 제5,789,214호, 및 제5,804,693호를 참조한다. 화학적으로 또는 시험관 내 효소적 합성에 의해 합성된 RNA 분자는 세포 내로 도입되기 전에 정제될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 용매 또는 수지를 사용한 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의해 혼합물로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 화학적으로 또는 시험관 내 효소적 합성에 의해 합성된 RNA 분자는, 예를 들어 샘플 가공에 기인한 손실을 피하기 위해, 정제하지 않거나 최소의 정제를 수행한 후에 사용될 수 있다. RNA 분자는 보관을 위해 건조될 수 있거나 또는 수용액 중에 용해될 수 있다. 용액은 dsRNA 분자 듀플렉스 가닥의 어닐링 및/또는 안정화를 촉진시키기 위해 완충제 또는 염을 함유할 수 있다.
특정 구현예들에서, dsRNA 분자는 단일 자기-상보적 RNA 가닥에 의해 또는 2개의 상보적 RNA 가닥으로부터 형성될 수 있다. dsRNA 분자는 생체 내 또는 시험관 내에서 합성될 수 있다. 세포의 내인성 RNA 중합효소는 생체 내에서 1 또는 2개의 RNA 가닥의 전사를 매개할 수 있거나, 또는 클로닝된 RNA 중합효소는 생체 내 또는 시험관 내에서 전사를 매개하는데 사용될 수 있다. 곤충 해충에서의 타겟 유전자의 전사후 억제는 (예를 들어, 조직-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 기관, 조직 또는 세포 유형에서의 특이적인 전사에 의해; (예를 들어, 감염, 스트레스, 온도 및/또는 화학적 유도제에 대해 반응성인 유도성 프로모터의 사용에 의해) 숙주에서의 환경 조건의 자극에 의해; 및/또는 (예를 들어, 발생 단계-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 발생 단계 또는 연령에서의 조작적 전사에 의해 숙주-타겟화될 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내에서 전사되었든지 간에, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 가닥은 폴리아데닐화될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있고, 세포의 번역 기구에 의해 폴리펩티드로 번역될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다.
D. 재조합 벡터 및 숙주 세포 형질전환
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포) 내로 도입시키기 위한 DNA 분자를 제공하며, 여기서 DNA 분자는, RNA로 발현되어 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에 의해 섭취되었을 때, 해충의 세포, 조직 또는 기관에서 타겟 유전자의 억제를 달성하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 식물 세포에서 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자로서 발현되어 곤충 해충에서 타겟 유전자 발현을 억제할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 발현을 개시 또는 증진시키기 위해, 이러한 재조합 핵산 분자는 하나 이상의 조절 요소를 포함할 수 있으며, 조절 요소는 iRNA로서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 식물에서 유전자 억제 분자를 발현시키는 방법은 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 WO06/073727; 및 미국 특허 공개 번호 2006/0200878 Al을 참조한다.
구체적 구현예에서, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 재조합 DNA 분자는 섭취시 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충 세포에서 내인성 타겟 유전자(들)의 발현을 억제할 수 있는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩할 수 있다. 많은 구현예에서, 전사된 RNA는 안정화된 형태; 예를 들어 헤어핀 및 스템 및 루프 구조로 제공될 수 있는 dsRNA 분자를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 1개의 가닥은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드로부터의 전사에 의해 형성될 수 있다: 서열번호:1, 3, 76, 및 78 중 어느 하나; 서열번호:1, 3, 76, 및 78 중 어느 하나의 상보체; 서열번호:1, 3, 76, 및 78 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편 (예를 들어, 서열번호:5-8, 및 80-82); 서열번호:1, 3, 76, 및 78 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체 (예를 들어, WCR)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체 (예를 들어, BSB)의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체.
다른 구현예에서, dsRNA 분자의 1개의 가닥은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드로부터의 전사에 의해 형성될 수 있다: 서열번호:5-8 및 80-82; 서열번호:5-8 및 80-82 중 어느 하나의 상보체; 서열번호:5-8 및 80-82 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호:5-8 및 80-82 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체.
특정한 구현예에서, dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩하는 재조합 DNA 분자는 코딩 영역을 포함할 수 있고, 여기서 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드는, 적어도 1개의 프로모터에 대해, 하나의 폴리뉴클레오티드가 센스 배향, 및 다른 폴리뉴클레오티드가 안티센스 배향이 되도록 배열되고, 여기서 센스 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 약 5 (~5) 내지 약 1000 (~1000)개의 뉴클레오티드의 스페이서에 의해 결합 또는 연결된다. 스페이서는 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 사이에 루프를 형성할 수 있다. 센스 폴리뉴클레오티드 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드는 타겟 유전자 (예를 들어, 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나를 포함하는 rpII33 유전자) 또는 그의 단편에 대해 실질적으로 상동일 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서, 재조합 DNA 분자는 스페이서 없이 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 RNA를 코딩할 수 있다. 구현예들에서, 센스 코딩 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 코딩 폴리뉴클레오티드는 상이한 길이일 수 있다.
곤충 해충에 유해 효과를 갖거나 또는 해충과 관련하여 식물 보호 효과를 갖는 것으로 확인된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 적절한 발현 카세트의 생성을 통해 발현된 dsRNA 분자 내로 용이하게 편입될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드는 타겟 유전자 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나, 및 상기 중 어느 하나의 단편을 포함하는 rpII33 유전자)에 상응하는 제1 절편을 취하고; 이러한 폴리뉴클레오티드를, 제1 절편에 상동 또는 상보적이지 않은 제2 절편 스페이서 영역에 연결시키고; 이를 제3 절편에 연결시키는 것에 의해 스템 및 루프 구조를 갖는 헤어핀으로서 발현될 수 있으며, 여기서 제3 절편의 적어도 일부분은 제1 절편에 실질적으로 상보적이다. 이러한 구축물은 제1 절편과 제3 절편과의 분자내 염기-쌍형성에 의해 스템 및 루프 구조를 형성하며, 여기서 루프 구조는 제2 절편을 포함하고 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0048814 및 2003/0018993; 및 국제 PCT 공개 번호 WO94/01550 및 WO98/05770을 참조한다. dsRNA 분자는, 예를 들어 이중-가닥 구조의 형태로, 예컨대 스템-루프 구조 (예를 들어, 헤어핀)로 생성될 수 있고, 이에 의해 천연 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충 폴리뉴클레오티드에 대해 타겟화된 siRNA의 생산은 타겟화된 유전자의 단편의 공동-발현에 의해 증진되고, 예를 들어 추가의 식물 발현가능한 카세트 상에서 siRNA의 생산이 증진되거나 또는 메틸화가 감소됨으로써 dsRNA 헤어핀 프로모터의 전사 유전자 침묵이 방지된다.
본 발명의 소정의 구현예는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 식물 내로 도입 (즉, 형질전환)하여 하나 이상의 iRNA 분자가 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충-억제성 수준으로 발현되도록 하는 것을 포함한다. 재조합 DNA 분자는, 예를 들어 벡터, 예컨대 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주의 게놈 내로 도입하고자 하는 총 DNA를 함께 함유하는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. 추가로, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 다른 DNA 요소의 발현을 구동하도록 하나 이상의 숙주에서 기능하는 적합한 프로모터의 제어 하의 벡터 내로 적절하게 삽입될 수 있다. 이러한 목적을 위해 많은 벡터가 이용가능하고, 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정한 숙주 세포에 주로 좌우될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (예를 들어, DNA의 증폭 또는 DNA의 발현), 및 그와 상용성인 특정한 숙주 세포에 따라 각종 성분을 함유한다.
트랜스제닉 식물에게 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충으로부터의 보호를 부여하기 위해, 재조합 DNA는, 예를 들어 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 분자)로 전사될 수 있다. iRNA 분자는 숙주 식물 종에게 피해를 야기할 수 있는 곤충 해충 내의 대응하는 전사된 폴리뉴클레오티드에 대해 실질적으로 상동이고 특이적으로 혼성화가능한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 해충은, 예를 들어 iRNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 숙주 식물의 세포 또는 유체를 섭취함으로써, 트랜스제닉 숙주 식물의 세포에서 전사되는 iRNA 분자와 접촉할 수 있다. 따라서, 특정한 예에서, 타겟 유전자의 발현은 트랜스제닉 숙주 식물에 침입하는 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충 내에서 iRNA 분자에 의해 억제된다. 일부 구현예에서, 타겟 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충에서의 타겟 유전자의 발현 억제로 인해 식물은 해충에 의한 공격으로부터 보호될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 식물 세포와 영양면에서 관계를 맺고 있는 곤충 해충에게 iRNA 분자를 전달할 수 있도록 하기 위해서는, 식물 세포에서 iRNA 분자가 발현 (즉, 전사)되어야 한다. 따라서, 재조합 핵산 분자는 숙주 세포, 예컨대 핵산 분자가 증폭되어야 하는 박테리아 세포, 및 핵산 분자가 발현되어야 하는 식물 세포에서 기능하는 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 이종 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 유도성, 바이러스성, 합성 또는 구성적 프로모터를 포함하며, 이들 모두 본 기술분야에 주지되어 있다. 이러한 프로모터를 기재하는 비-제한적인 예는 미국 특허 제6,437,217호 (메이즈 RS81 프로모터); 제5,641,876호 (벼 액틴 프로모터); 제6,426,446호 (메이즈 RS324 프로모터); 제6,429,362호 (메이즈 PR-1 프로모터); 제6,232,526호 (메이즈 A3 프로모터); 제6,177,611호 (구성적 메이즈 프로모터); 제5,322,938호, 제5,352,605호, 제5,359,142호, 및 제5,530,196호 (CaMV 35S 프로모터); 제6,433,252호 (메이즈 L3 올레오신 프로모터); 제6,429,357호 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 제6,294,714호 (광-유도성 프로모터); 제6,140,078호 (염-유도성 프로모터); 제6,252,138호 (병원성-유도성 프로모터); 제6,175,060호 (인 결핍-유도성 프로모터); 제6,388,170호 (양방향성 프로모터); 제6,635,806호 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 공개 번호 제2009/757,089호 (메이즈 엽록체 알돌라제 프로모터)를 포함한다. 추가의 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9) 및 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (이는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도성 플라스미드 상에 운반됨); 콜리모바이러스 프로모터(caulimovirus promoter), 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus, CaMV) 19S 프로모터 (Lawton 등 (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell 등 (1985) Nature 313:810-2); 피그워트 모자이크 바이러스(figwort mosaic virus) 35S-프로모터 (Walker 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang 및 Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합체 프로모터 (Chandler 등 (1989) Plant Cell 1:1175-83); 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV 35S (미국 특허 제5,322,938호, 제5,352,605호, 제5,359,142호 및 제5,530,196호); FMV 35S (미국 특허 제6,051,753호, 및 제5,378,619호); PC1SV 프로모터 (미국 특허 제5,850,019호); SCP1 프로모터 (미국 특허 제6,677,503호); 및 AGRtu.nos 프로모터 (GenBank™ 수탁 번호 V00087; Depicker 등 (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan 등 (1983) Nature 304:184-7)을 포함한다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 조직-특이적 프로모터, 예컨대 뿌리-특이적 프로모터를 포함한다. 뿌리-특이적 프로모터는 배타적으로 또는 우선적으로 뿌리 조직에서의 작동가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동한다. 뿌리-특이적 프로모터의 예는 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,110,732호; 제5,459,252호 및 제5,837,848호; 및 Opperman 등 (1994) Science 263:221-3; 및 Hirel 등 (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18을 참조. 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 딱정벌레류 해충 방제를 위한 폴리뉴클레오티드 또는 단편은, 그 폴리뉴클레오티드 또는 단편에 대해 반대쪽 전사 방향으로 배향되어 있으며 트랜스제닉 식물 세포에서 작동가능한, 2개의 뿌리-특이적 프로모터 사이에 클로닝될 수 있고, 여기서 발현됨으로써 트랜스제닉 식물 세포에서 RNA 분자를 생산할 수 있고, 이후 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 식물 조직에서 발현된 iRNA 분자는 곤충 해충에 의해 섭취될 수 있고, 이에 의해 타겟 유전자 발현 억제가 달성될 수 있다.
임의적으로 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 요소는 프로모터 요소와, 번역 리더 요소로서 기능하는 코딩 폴리뉴클레오티드 사이에 위치하는 5'UTR을 포함한다. 번역 리더 요소는 완전히 가공된 mRNA에 존재하며, 그것은 일차 전사물의 가공 및/또는 RNA 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 번역 리더 요소의 예는 메이즈 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 제5,362,865호), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, Turner 및 Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36을 참조한다. 5'UTR의 비제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 제5,659,122호); PhDnaK (미국 특허 제5,362,865호); AtAnt1; TEV (Carrington 및 Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (GenBank™ 수탁 번호 V00087; 및 문헌 Bevan 등 (1983) Nature 304:184-7)를 포함한다.
임의적으로 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 요소는 또한 3' 비-번역 요소, 3' 전사 종결 영역 또는 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한 유전 요소이며, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 가공에 영향을 미칠 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 mRNA 전구체의 3' 말단에의 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드 첨가를 초래하도록 기능한다. 폴리아데닐화 요소는 다양한 식물 유전자로부터 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비-제한적인 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; Fraley 등 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)이다. 상이한 3' 비-번역 영역의 사용에 관한 예는 Ingelbrecht 등, (1989) Plant Cell 1:671-80에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비-제한적인 예는 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi 등 (1984) EMBO J. 3:1671-9) 및 AGRtu.nos (GenBank™ 수탁 번호 E01312)로부터의 하나를 포함한다.
일부 구현예는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 상기 기재된 조절 요소 중 적어도 하나를 포함하는 단리되고 정제된 DNA 분자를 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있다. 발현되었을 때, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에서의 천연 RNA 분자의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 iRNA 분자(들)를 생성한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드(들)는 타겟화된 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충 RNA 전사물 내에 존재하는 폴리리보뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 코딩하는 절편을 포함할 수 있고, 타겟화된 해충 전사물의 전부 또는 일부의 역위 반복부를 포함할 수 있다. 식물 형질전환 벡터는 하나 초과의 타겟 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 이에 의해 타겟 곤충 해충의 하나 이상의 집단 또는 종의 세포에서 둘 이상의 유전자의 발현을 억제하기 위한 하나 초과의 dsRNA의 생산이 가능하다. 상이한 유전자에 존재하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드의 절편은 트랜스제닉 식물에서의 발현을 위해 단일 조성 핵산 분자로 조합될 수 있다. 이러한 절편은 인접해 있을 수 있거나 또는 스페이서에 의해 분리되어 있을 수 있다.
다른 구현예들에서, 이미 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드(들)를 함유하고 있는 본 발명의 플라스미드는 동일한 플라스미드에서 추가의 폴리뉴클레오티드(들)의 순차적인 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 여기서 추가의 폴리뉴클레오티드(들)는 원래의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드(들)와 동일한 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 다수 타겟 유전자의 억제를 위한 것으로 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제하고자 하는 다수 유전자는 동일한 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류) 해충 종으로부터 수득할 수 있으며, 이는 핵산 분자의 유효성을 증진시킬 수 있다. 다른 구현예들에서, 유전자는 상이한 곤충 해충으로부터 유래될 수 있으며, 이는 작용제(들)가 유효한 해충의 범위를 확장시킬 수 있다. 억제를 위해 또는 발현 및 억제의 조합을 위해 다수 유전자가 타겟화되는 경우에, 폴리시스트론 DNA 요소가 조작될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 식물 세포와 같은 형질전환된 세포 상에 선택성 표현형을 부여하는 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택성 마커는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 세포의 선택에 또한 사용될 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, 제네티신(Geneticin) (G418), 블레오마이신, 히그로마이신 등), 또는 제초제 내성 (예를 들어, 글리포세이트 등)을 코딩할 수 있다. 선택성 마커의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 카나마이신 저항성을 코딩하고 카나마이신, G418 등의 사용의 경우에 선택될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 코딩하는 bar 유전자; 글리포세이트 내성을 코딩하는 돌연변이체 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제(nitrilase) 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 내성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (ALS) 유전자; 및 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린 등에 대한 저항성을 부여하는 다수 선택성 마커가 이용가능하다. 이러한 선택성 마커의 예는, 예를 들어 미국 특허 제5,550,318호; 제5,633,435호; 제5,780,708호 및 제6,118,047호에 예시되어 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 또한 스크리닝 마커를 포함할 수 있다. 스크리닝 마커는 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝 마커는 다양한 발색원성 기질이 공지된 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자 (GUS) (Jefferson 등 (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); 식물 조직에서 안토시아닌 안료 (적색)의 생산을 조절하는 산물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta 등 (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18 th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); β-락타마제 유전자 (Sutcliffe 등 (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); 다양한 발색원성 기질이 공지된 효소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PADAC, 발색원성 세팔로스포린); 루시페라제 유전자 (Ow 등 (1986) Science 234:856-9); 발색원성 카테콜을 전환시키는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowski 등 (1983) Gene 46(2-3):247-55); 아밀라제 유전자 (Ikatu 등 (1990) Bio/Technol. 8:241-2); 티로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이들은 차례로 멜라닌으로 축합됨)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz 등 (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); 및 α-갈락토시다제를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산 분자는 트랜스제닉 식물을 생성하고, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에 대해 감수성이 감소된 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해 상기 식물에서 이종 핵산을 발현시키는 방법에서 사용될 수 있다. 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 iRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자를 식물 형질전환 벡터 내로 삽입하고, 이들을 식물 내로 도입함으로써 제조될 수 있다.
숙주 세포를 형질전환시키는 적합한 방법은, 예컨대 원형질체의 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,508,184호 참조), 건조/억제-매개 DNA 흡수에 의해 (예를 들어, Potrykus 등 (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8 참조), 전기천공에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,384,253호 참조), 탄화규소 섬유와의 교반에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호 참조), 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,563,055호; 제5,591,616호; 제5,693,512호; 제5,824,877호; 제5,981,840호; 및 제6,384,301호 참조) 및 DNA-코팅된 입자의 가속화 (예를 들어, 미국 특허 제5,015,580호; 제5,550,318호; 제5,538,880호; 제6,160,208호; 제6,399,861호; 및 제6,403,865호 참조) 등에 의해 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 특히 옥수수를 형질전환시키는데 유용한 기술은, 예를 들어 미국 특허 제7,060,876호 및 제5,591,616호; 및 국제 PCT 공개 WO95/06722에 기재되어 있다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 실질적으로 임의의 종의 세포는 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 편입된다. 다세포 종의 경우에, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체로 재생될 수 있다. 이들 기술 중 어느 하나를 사용함으로써, 예를 들어 트랜스제닉 식물의 게놈 중에 1 종 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있다.
발현 벡터를 식물 내로 도입하는데 가장 널리 사용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. A. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 A. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. A. 투메파시엔스 및 A. 리조게네스의 각각 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전 형질전환을 담당하는 유전자를 운반한다. Ti (종양-유도)-플라스미드는 형질전환된 식물로 전달되는, T-DNA로서 공지된 큰 절편을 함유한다. Ti 플라스미드의 또 다른 절편인 Vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역은 말단 반복물에 의해 경계지어진다. 변형된 이원 벡터에서, 종양-유도성 유전자는 결실되었고, Vir 영역의 기능을 이용하여 T-DNA 보더 요소에 의해 경계지어진 외래 DNA를 전달한다. T-영역은 또한 트랜스제닉 식물 및 세포의 효율적인 회수를 위한 선택성 마커, 및 dsRNA 코딩 핵산과 같은 전달을 위한 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다.
따라서, 일부 구현예들에서, 식물 형질전환 벡터는 A 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 (예를 들어, 미국 특허 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937 및 5,501,967; 및 유럽 특허 번호 EP 0 122 791 참조) 또는 A. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래된다. 추가의 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어, 제한하지 않고 Herrera-Estrella 등 (1983) Nature 303:209-13; Bevan 등 (1983) Nature 304:184-7; Klee 등 (1985) Bio/Technol. 3:637-42에 의해; 및 유럽 특허 번호 EP 0 120 516에 기재된 것, 및 상기 중 어느 하나로부터 유래된 것을 포함한다. 식물과 상호작용하는 다른 박테리아, 예컨대 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium) 및 메소리조비움(Mesorhizobium)은 자연적으로 변형되어 수많은 다양한 식물로의 유전자 전달을 매개할 수 있다. 이들 식물-연관 공생 박테리아는 결손된(disarmed) Ti 플라스미드 및 적합한 이원 벡터 둘 다의 획득에 의해 유전자 전달에 적격으로 만들 수 있다.
외인성 DNA를 수용자 세포에 제공한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가 배양 및 식물 재생을 위해 식별된다. 형질전환된 세포를 식별할 수 있는 능력을 개선시키기 위해, 형질전환체를 생성하는데 사용된 형질전환 벡터와 함께, 상기 기재된 바와 같은 선택성 또는 스크리닝 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선택성 마커가 사용되는 경우, 세포를 선택적 작용제 또는 작용제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 형질전환된 세포가 식별된다. 스크리닝 마커가 사용되는 경우에, 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택적 작용제에 대한 노출에서 생존하는 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 스코어링된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함시킴으로써 변형될 수 있다. 식물 재생 노력을 시작하는 데 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 수동 선택을 수회에 걸쳐 반복 수행한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 상태가 될 때까지 (예를 들어, 적어도 2주) 성장 조절제를 포함하는 기초 배지 상에서 조직을 유지시킬 수 있고, 이어서 이를 싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 싹이 충분히 형성될 때까지 주기적으로 배양물을 옮긴다. 일단 싹이 형성되고 나면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 일단 뿌리가 형성되고 나면, 추가의 성장 및 성숙을 위해 식물을 토양으로 옮길 수 있다.
재생 식물에 관심 핵산 분자 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충에서의 타겟 유전자 발현을 억제하는 하나 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 DNA)가 존재하는지 여부를 확인하기 위해, 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR 및 핵산 서열분석; 생화학적 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해, 또는 효소 기능에 의해 단백질 산물의 존재를 검출하는 것; 식물 일부 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 전체 재생 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
통합 사건은, 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 분석될 수 있다. PCR 유전자형결정은 게놈 내로 편입된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 gDNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서 PCR 증폭 산물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형결정 방법은 널리 기재되어 있고 (예를 들어, Rios 등 (2002) Plant J. 32:243-53), 세포 배양물을 포함한 임의의 식물 종 (예를 들어, Z. 메이스 또는 G. 맥스) 또는 조직 유형으로부터 유래된 gDNA에 적용될 수 있다.
아그로박테리움-의존성 형질전환 방법을 이용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로는 하나의 염색체 내로 삽입된 단일 재조합 DNA를 함유한다. 단일 재조합 DNA의 폴리뉴클레오티드는 "트랜스제닉 사건" 또는 "통합 사건"으로서 언급된다. 이러한 트랜스제닉 식물은 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드에 대해 이형접합이다. 일부 구현예에서, 트랜스젠과 관련하여 동형접합인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자를 함유하는 독립 분리개체 트랜스제닉 식물을, 예를 들어 T0 식물과 유성 생식으로 성적 교배 (자가수분)시켜 T1 종자를 생산함으로써 수득할 수 있다. 생산된 T1 종자의 4분의 1은 트랜스젠에 대해 동형접합일 것이다. T1 종자의 발아는, 전형적으로 이형접합체와 동형접합체 사이의 구별을 가능하게 하는 SNP 검정 또는 열 증폭 검정 (즉, 접합성 검정)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 생성한다.
특정한 구현예에서, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충-억제성 효과를 갖는, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종 또는 그 초과의 상이한 iRNA 분자가 식물 세포에서 생산된다. iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)는 상이한 형질전환 사건에서 도입된 다수 핵산으로부터, 또는 단일 형질전환 사건에서 도입된 단일 핵산으로부터 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 iRNA 분자는 단일 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 다른 구현예에서, 복수의 iRNA 분자는 다수 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 하나 이상의 곤충 해충 내의 상이한 유전자좌 (예를 들어, 서열번호:1, 3, 76 및 78에 의해 규정된 유전자좌)에 각각 상동인 다수 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단일 iRNA 분자는, 동일한 종의 곤충 해충으로 이루어진 상이한 집단, 또는 상이한 종의 곤충 해충 둘 다에서 발현될 수 있다.
재조합 핵산 분자를 사용한 식물의 직접적인 형질전환에 더하여, 트랜스제닉 식물은 적어도 하나의 트랜스제닉 사건을 갖는 제1 식물을 이러한 사건이 결여된 제2 식물과 교배시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자를, 형질전환에 용이한 제1 식물 계통 내로 도입해서 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있고, 트랜스제닉 식물을 제2 식물 계통과 교배시켜서 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제2 식물 계통 내로 유전자이입시킬 수 있다.
일부 측면에서, 형질전환된 식물 세포로부터 유래된 트랜스제닉 식물에 의해 생산되는 종자 및 범용 제품이 포함되며, 여기서 상기 종자 및 범용 제품은 검출가능한 양의 본 발명의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 범용 제품은, 예를 들어 트랜스제닉 식물을 수득하고, 그로부터 먹이 또는 사료를 제조함으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 범용 제품은, 예를 들어, 제한하지 않고 다음을 포함한다: 식물의 분말, 오일, 분쇄 또는 통 곡물 또는 종자, 및 본 발명의 핵산 중 하나 이상을 포함하는 재조합 식물 또는 종자의 임의의 분말, 오일 또는 분쇄 또는 통 곡물을 포함하는 임의의 먹이 제품. 하나 이상의 범용품 또는 범용 제품에서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 검출은, 사실상 범용품 또는 범용 제품이 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충을 방제하기 위한 목적으로 본 발명의 iRNA 분자 중 하나 이상을 발현하도록 설계된 트랜스제닉 식물로부터 생산되었다는 것의 증거가 된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 종자는 또한 다음을 비제한적으로 포함하는, 그의 게놈 내의 적어도 하나의 다른 트랜스제닉 사건을 포함할 수 있다: 서열번호:1, 서열번호:3, 서열번호:76, 및 서열번호:78에 의해 규정된 것 이외의 딱정벌레류 또는 노린재류 해충에서의 유전자좌, 예컨대 예를 들어 Caf1-180 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174258), VatpaseC (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174259), Rho1 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174260), VatpaseH (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0198586), PPI-87B (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091600), RPA70 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091601), RPS6 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0097730), ROP (미국 특허 출원 공개 번호 14/577811), RNAPII (미국 특허 출원 공개 번호 14/577854), Dre4 (미국 특허 출원 번호 14/705,807), ncm (미국 특허 출원 번호 62/095487), COPI 알파 (미국 특허 출원 번호 62/063,199), COPI 베타 (미국 특허 출원 번호 62/063,203), COPI 감마 (미국 특허 출원 번호 62/063,192), COPI 델타 (미국 특허 출원 번호 62/063,216), RNA 중합효소 I1 (미국 특허 출원 번호 62/133214), 및 RNA 중합효소 II215 (미국 특허 출원 번호 62/133202)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자좌를 타겟화하는 iRNA 분자로 전사되는 트랜스제닉 사건; 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충 이외의 유기체 (예를 들어, 식물-기생 선충류)에서의 유전자; 살곤충 단백질을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 바실루스 투린기엔시스 살곤충 단백질, 및 PIP-1 폴리펩티드); 제초제 내성 유전자 (예를 들어, 글리포세이트에 대해 내성을 제공하는 유전자); 및 트랜스제닉 식물에서 바람직한 표현형, 예컨대 증가된 수확량, 변경된 지방산 대사 또는 세포질 웅성 불임의 회복에 기여하는 유전자를 타겟화하는 iRNA 분자로 전사되는 트랜스제닉 사건. 특정한 구현예에서, 본 발명의 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물에서 다른 곤충 방제 및 질병 형질과 조합되어서 식물 질병 및 곤충 피해의 증진된 방제를 위한 목적하는 형질을 달성할 수 있다. 별개의 작용 방식을 사용하는 곤충 방제 형질을 조합하면, 예를 들어 재배지에서 형질(들)에 대한 저항성이 발생될 확률은 감소할 것이기 때문에, 단일 방제 형질을 보유하는 식물에 비해 내구성이 더 우수한 보호된 트랜스제닉 식물을 제공할 수 있다.
V. 곤충 해충에서의 타겟 유전자 억제
A. 개관
본 발명의 일부 구현예에서, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충 방제에 유용한 적어도 하나의 핵산 분자를 곤충 해충에게 제공할 수 있으며, 여기서 핵산 분자는 해충에서 RNAi-매개 유전자 침묵을 일으킨다. 특정한 구현예에서, iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)는 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충에게 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 곤충 해충 방제에 유용한 핵산 분자는 핵산 분자를 해충과 접촉시킴으로써 해충에게 제공될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 곤충 해충 방제에 유용한 핵산 분자는 해충의 섭식 기질로, 예를 들어 영양 조성물로 제공될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 곤충 해충 방제에 유용한 핵산 분자는 해충이 섭취하는 핵산 분자를 포함하는 식물 물질의 섭취를 통해 제공될 수 있다. 소정의 구현예에서, 핵산 분자는, 예를 들어 식물 세포를 재조합 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 것에 의해 및 형질전환된 식물 세포로부터의 식물 물질 또는 전체 식물의 재생에 의해 식물 물질 내로 도입된 재조합 핵산의 발현을 통해 식물 물질에 존재한다.
일부 구현예에서, 해충은 국소 조성물 (예를 들어, 분무에 의해 적용된 조성물) 또는 RNAi 베이트(bait)와의 접촉을 통해 해충에서 RNAi-매개 유전자 침묵을 일으키는 핵산 분자와 접촉된다. RNAi 베이트는 dsRNA가 먹이 또는 유인책 또는 둘 다와 혼합될 때 형성된다. 해충이 베이트를 먹으면 그들은 또한 dsRNA를 소비한다. 베이트는 과립, 젤, 유동성 분말, 액체 또는 고형물의 형태를 취할 수 있다. 특정 구현예에서, rpII33는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제8,530,440호에 기재된 것과 같은 베이트 제형에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 베이트의 경우, 베이트는 곤충 해충의 환경 내부 또는 주변에 놓여지며, 예를 들어 WCR은 베이트와 접촉하게 되고 그리고/또는 유인될 수 있다.
B. RNAi-매개 타겟 유전자 억제
소정의 구현예들에서, 본 발명은, 예를 들어 타겟 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 1개의 가닥을 포함하는 iRNA 분자를 설계함으로써, 곤충 해충 (예를 들어, 딱정벌레류 (예를 들어, WCR, SCR 및 NCR) 또는 노린재류 (예를 들어, BSB) 해충)의 전사체(transcriptome)에서 필수 천연 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 필수 유전자)을 타겟화하도록 설계될 수 있는 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)를 제공한다. 이렇게 설계된 iRNA 분자의 서열은 타겟 폴리뉴클레오티드의 그것과 동일할 수 있거나, 또는 iRNA 분자와 그의 타겟 폴리뉴클레오티드 사이의 특이적인 혼성화를 방지하지 못하는 미스매치를 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 iRNA 분자는 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에서의 유전자 억제 방법에서 사용될 수 있고, 이에 의해 식물 (예를 들어, iRNA 분자를 포함하는 보호되는 형질전환된 식물) 상의 해충에 의해 유발되는 피해 수준 또는 발생률이 감소될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유전자 억제"는 발현의 전사후 억제 및 전사 억제를 포함하는 유전자 또는 코딩 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질 발현의 감소를 포함하는, mRNA로의 유전자 전사 및 후속하는 mRNA의 번역의 결과로서 생산된 단백질의 수준을 감소시키기 위한 주지의 방법 중 어느 하나를 지칭한다. 전사후 억제는 억제를 위해 타겟화된 유전자로부터 전사된 mRNA의 전부 또는 일부와, 억제를 위해 사용된 상응하는 iRNA 분자 사이의 특이적 상동성에 의해 매개된다. 추가로, 전사후 억제는 리보솜에 의한 결합을 위해 세포에서 이용가능한 mRNA 양의 실질적인 측정가능한 감소를 지칭한다.
iRNA 분자가 dsRNA 분자인 특정 구현예에서, dsRNA 분자는 효소 DICER에 의해 짧은 siRNA 분자 (대략 20개의 뉴클레오티드 길이)로 절단될 수 있다. dsRNA 분자에 대한 DICER 활성에 의해 생성된 이중-가닥 siRNA 분자는 2개의 단일-가닥 siRNA: "운반자 가닥" 및 "가이드 가닥"으로 분리될 수 있다. 운반자 가닥은 분해될 수 있고, 가이드 가닥은 RISC 내로 편입될 수 있다. 가이드 가닥과, mRNA 분자의 특이적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드와의 특이적인 혼성화에 이어서, 효소 아르고노트(Argonaute) (RISC 복합체의 촉매 성분)에 의한 절단에 의해 전사후 억제가 일어난다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 임의의 형태의 iRNA 분자가 사용될 수 있다. dsRNA 분자는 전형적으로 제조 동안, 및 iRNA 분자를 세포에 제공하는 단계 동안, 단일-가닥 RNA 분자보다 더 안정적이고, 이는 또한 전형적으로 세포에서 보다 안정적이라는 것을 본 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어 siRNA 및 miRNA 분자는 일부 구현예에서 동일하게 유효할 수 있지만, dsRNA 분자는 그의 안정성에 기인하여 선택될 수 있다.
소정의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자가 제공되며, 폴리뉴클레오티드는 시험관 내에서 발현되어 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충의 게놈 내의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 핵산 분자에 실질적으로 상동인 iRNA 분자를 생산할 수 있다. 소정의 구현예에서, 시험관 내 전사된 iRNA 분자는 스템-루프 구조를 포함하는 안정화된 dsRNA 분자일 수 있다. 곤충 해충이 시험관 내 전사된 iRNA 분자와 접촉한 후에, 해충에서의 타겟 유전자 (예를 들어, 필수 유전자)의 전사후 억제가 일어날 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드)를 포함하는 핵산 분자의 발현은 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에서의 타겟 유전자의 전사후 억제 방법에 사용되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열번호:1; 서열번호:1의 상보체; 서열번호:3; 서열번호:3의 상보체; 서열번호:5; 서열번호:5의 상보체; 서열번호:6; 서열번호:6의 상보체; 서열번호:7; 서열번호:7의 상보체; 서열번호:8; 서열번호:8의 상보체; 서열번호:1 또는 서열번호:3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:1 또는 서열번호:3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:76; 서열번호:76의 상보체; 서열번호:78; 서열번호:78의 상보체; 서열번호:76 또는 서열번호:78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:76 또는 서열번호:78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 노린재류 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 상보체; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:80-82 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 폴리뉴클레오티드의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체. 소정의 구현예에서, 상기 중 어느 하나와 적어도 약 80% (예를 들어, 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 및 100%) 동일한 핵산 분자의 발현이 사용될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충의 적어도 1개의 세포에 존재하는 RNA 분자에 특이적으로 혼성화되는 핵산 분자가 발현될 수 있다.
본원에서 RNAi 전사후 억제 시스템이 유전자 돌연변이, 균주 다형성, 또는 진화적 분기에 기인하여 예측될 수 있는 타겟 유전자 중의 서열 변이를 견딜 수 있다는 것은 일부 구현예의 중요한 특징이다. 도입된 핵산 분자가 타겟 유전자의 일차 전사 산물 또는 완전 가공된 mRNA에 특이적으로 혼성화가능하다면, 도입된 핵산 분자는 타겟 유전자의 일차 전사 산물 또는 완전 가공된 mRNA에 절대적으로 상동일 필요는 없을 수 있다. 더욱이, 도입된 핵산 분자는 타겟 유전자의 일차 전사 산물 또는 완전 가공된 mRNA에 비해, 전장일 필요는 없을 수 있다.
본 발명의 iRNA 기술을 사용한 타겟 유전자 억제는 서열-특이적이며; 즉, iRNA 분자(들)에 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드가 유전적 억제를 위해 타겟화된다. 일부 구현예에서, 타겟 유전자의 부분과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자가 억제에 사용될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 타겟 폴리뉴클레오티드에 비해 1개 이상의 삽입, 결실 및/또는 점 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 RNA 분자가 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, iRNA 분자 및 타겟 유전자의 부분은, 예를 들어 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100%, 및 100% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 대안적으로, dsRNA 분자의 듀플렉스 영역은 타겟 유전자 전사물의 부분과 특이적으로 혼성화가능할 수 있다. 특이적으로 혼성화가능한 분자에서, 보다 큰 상동성을 나타내는 전장보다 짧은 폴리뉴클레오티드는 보다 긴, 덜 상동인 폴리뉴클레오티드를 보완한다. 타겟 유전자 전사물의 부분과 동일한 dsRNA 분자의 듀플렉스 영역의 폴리뉴클레오티드의 길이는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500개, 또는 적어도 약 1000개 염기일 수 있다. 일부 구현예에서, 20-100개 초과의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, 약 200-300개 초과의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, 타겟 유전자의 크기에 따라, 약 500-1000개 초과의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 해충 (예를 들어, 딱정벌레류 또는 노린재류)에서 타겟 유전자의 발현은 해충의 세포 내에서 적어도 10%; 적어도 33%; 적어도 50%; 또는 적어도 80%만큼 억제될 수 있고, 이에 의해 유의한 억제가 일어난다. 유의한 억제는 역치를 초과하여 억제됨으로써 검출가능한 표현형 (예를 들어, 성장 중지, 섭식 중지, 발생 중지, 유도된 사멸률 등)이 나타나거나, 또는 억제되는 타겟 유전자에 상응하는 RNA 및/또는 유전자 산물이 검출가능하게 감소하게 되는 것을 지칭한다. 비록 본 발명의 소정의 구현예에서 억제는 실질적으로 해충의 모든 세포에서 일어나지만, 다른 구현예에서는 억제가 오직 타겟 유전자를 발현하는 하위세트의 세포에서만 일어난다.
일부 구현예에서, 전사 억제는 프로모터 DNA 또는 그의 상보체에 대해 실질적 서열 동일성을 나타내는 dsRNA 분자의 세포내 존재에 의해 매개되어, "프로모터 트랜스 억제"로 지칭되는 효과가 발휘된다. 유전자 억제는, 예를 들어 dsRNA 분자를 함유하는 식물 물질을 섭취하거나 또는 그와 접촉함으로써 이러한 dsRNA 분자를 섭취하거나 또는 그와 접촉할 수 있는 곤충 해충에서의 타겟 유전자에 대해 효과적일 수 있다. 프로모터 트랜스 억제에 사용하기 위한 dsRNA 분자는 곤충 해충의 세포에서의 하나 이상의 상동인 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제 또는 저해할 수 있도록 특이적으로 설계될 수 있다. 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위한 안티센스 또는 센스 배향의 RNA에 의한 전사후 유전자 억제는 미국 특허 제5,107,065호; 제5,759,829호; 제5,283,184호; 및 제5,231,020호에 개시되어 있다.
C. 곤충 해충에 제공된 iRNA 분자의 발현
곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에서의 RNAi-매개 유전자 억제를 위한 iRNA 분자의 발현은 많은 시험관 내 또는 생체 내 포맷 중 어느 하나로 수행될 수 있다. 이어서, iRNA 분자는, 예를 들어 iRNA 분자를 해충과 접촉시킴으로써, 또는 해충이 iRNA 분자를 섭취하도록 하거나 또는 다르게는 내재화하도록 함으로써 곤충 해충에게 제공될 수 있다. 일부 구현예는 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충의 형질전환된 숙주 식물, 형질전환된 식물 세포 및 형질전환된 식물의 자손을 포함한다. 형질전환된 식물 세포 및 형질전환된 식물은, 예를 들어 이종 프로모터의 제어 하에 iRNA 분자 중 하나 이상을 발현하여 해충 보호 효과를 제공하도록 조작될 수 있다. 따라서, 섭식 동안 곤충 해충이 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 소비하였을 때, 해충은 트랜스제닉 식물 또는 세포에서 발현된 iRNA 분자를 섭취할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 iRNA 분자 생산을 위해 매우 다양한 원핵 및 진핵 미생물 숙주 내로 도입될 수 있다. 용어 "미생물"은 원핵 및 진핵 종, 예컨대 박테리아 및 진균류를 포함한다.
유전자 발현의 조정은 이러한 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에서 유전자 발현을 억제하는 방법은 해충의 숙주의 조직에, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 전사 후에 형성된 적어도 하나의 dsRNA 분자를 유전자 억제량으로 제공하는 것을 포함하며, 이의 적어도 하나의 절편은 곤충 해충의 세포 내의 mRNA에 상보적이다. 곤충 해충에 의해 섭취되는, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자와 같은 변형된 형태를 포함한 dsRNA 분자는 예를 들어 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78 및 80-82로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, rpII33 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자와 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 100% 동일할 수 있다. 따라서, 곤충 해충 내로 도입되었을 때, 거기에서 내인성 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 타겟 코딩 폴리뉴클레오티드의 발현을 저해 또는 억제하는 것인, dsRNA 분자를 제공하기 위한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 및 재조합 DNA 구축물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단리된 및 실질적으로 정제된 핵산 분자가 제공된다.
특정한 구현예는 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 식물 해충에서의 하나 이상의 타겟 유전자(들)의 전사후 억제를 위해, 및 식물 해충 집단의 방제를 위해 iRNA 분자를 전달하기 위한 전달 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 전달 시스템은 숙주 트랜스제닉 식물 세포, 또는 숙주 세포에서 전사된 RNA 분자를 포함하는 숙주 세포의 내용물의 섭취를 포함한다. 이들 및 추가 구현예에서, 본 발명의 안정화된 dsRNA 분자를 제공하는 재조합 DNA 구축물을 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물이 생성된다. 특정한 iRNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포 및 트랜스제닉 식물은 본 발명의 iRNA 분자 (예를 들어, 안정화된 dsRNA 분자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터를 구축하고; 식물 세포 또는 식물을 형질전환시키고; 전사된 iRNA 분자를 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물을 생성하는 재조합 DNA 기술 (그의 기본 기술은 본 기술분야에 주지되어 있음)을 사용함으로써 생산될 수 있다.
트랜스제닉 식물에게 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충으로부터의 보호를 부여하기 위해, 재조합 DNA 분자를, 예를 들어 iRNA 분자, 예컨대 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자 또는 hpRNA 분자로 전사시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자는 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 이러한 dsRNA 분자는 부분적으로는, 숙주 식물에 침입할 수 있는 유형인 곤충 해충 내 DNA로부터 전사된 상응하는 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 해충 내 타겟 유전자의 발현은 dsRNA 분자에 의해 억제되고, 해충에서의 타겟 유전자의 발현의 억제는 해충에 대해 보호되고 있는 트랜스제닉 식물을 야기한다. dsRNA 분자의 조정 효과는, 예를 들어 하우스키핑 유전자를 포함한, 세포 대사 또는 세포 형질전환을 담당하는 내인성 유전자; 전사 인자; 탈피-관련 유전자; 및 세포 대사 또는 정상적인 성장 및 발생에 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 다른 유전자를 포함한, 해충에서 발현되는 다양한 유전자에 적용될 수 있는 것으로 나타났다.
생체 내 트랜스젠 또는 발현 구축물로부터의 전사를 위해, 일부 구현예에서는 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일렌서 및 폴리아데닐화 신호)을 사용하여 RNA 가닥 (또는 가닥들)을 전사시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같이, iRNA 분자를 생산하는데 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 식물 숙주 세포에서 기능적인 하나 이상의 프로모터 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 통상적으로 숙주 게놈 내에 상주하는 내인성 프로모터일 수 있다. 작동가능하게 연결된 프로모터 요소의 제어 하에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 추가로 그의 전사 및/또는 생성된 전사물의 안정성에 유리한 영향을 미치는 추가의 요소에 플랭킹될 수 있다. 이러한 요소는 작동가능하게 연결된 프로모터의 상류, 발현 구축물의 3' 말단의 하류에 위치할 수 있고, 프로모터의 상류 및 발현 구축물의 3' 말단의 하류 둘 다에 존재할 수 있다.
일부 구현예는 식물을 섭식하는 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에 의해 유발되는 숙주 식물(예를 들어, 옥수수 식물)에 대한 피해를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포를 숙주 식물에 제공하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자(들)는 해충(들)에 의한 섭취 시 해충(들) 내에서의 타겟 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하도록 기능하고, 발현 억제는 해충(들)의 사멸 및/또는 감소된 성장을 야기하고, 이에 의해 해충(들)에 의해 유발되는 숙주 식물에 대한 피해가 감소된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자(들)는 dsRNA 분자를 포함한다. 이들 및 추가 구현예에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자(들)는 곤충 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나의 폴리뉴클레오티드로 이루어진다.
다른 구현예들에서, 옥수수 작물의 수확량을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자를 옥수수 식물 내로 도입하는 단계; 옥수수 식물을 재배하여 상기 핵산을 포함하는 iRNA 분자가 발현되도록 하는 단계이며, 여기서 상기 핵산을 포함하는 iRNA 분자의 발현은 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충 피해 및/또는 성장을 억제함으로써, 해충 침입에 기인한 수확량 손실을 감소시키거나 또는 제거하는 것인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 구현예에서, 핵산 분자(들)는 곤충 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 예에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
소정의 구현예들에서, 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충에서 타겟 유전자의 발현을 조정하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 본 발명의 적어도 하나의 iRNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계이며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 전사 종결 요소에 작동가능하게 연결된 것인 단계; 복수의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물이 발생하도록 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계; 폴리뉴클레오티드가 그의 게놈 내로 편입된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계; 형질전환된 식물 세포를 편입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 iRNA 분자의 발현에 대해 스크리닝하는 단계; iRNA 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물 세포를 선택하는 단계; 및 선택된 트랜스제닉 식물 세포를 곤충 해충에게 섭식시키는 단계를 포함한다. 식물은 또한 편입된 핵산 분자에 의해 코딩된 iRNA 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 일부 구현예에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 구현예에서, 핵산 분자(들)는 곤충 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나 초과의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 예에서, 핵산 분자(들)는 딱정벌레류 및/또는 노린재류 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 iRNA 분자는 식물 세포의 게놈 내로 편입된 재조합 유전자로부터의 발현 산물로서, 또는 식재하기 전 종자에 적용되는 코팅제 또는 종자 처리제 내로 혼입되는 것으로, 식물 종 (예를 들어, 옥수수 또는 대두)의 종자 내에 혼입될 수 있다. 재조합 유전자를 포함하는 식물 세포는 트랜스제닉 사건인 것으로 간주된다. 곤충 (예를 들어, 딱정벌레류 및/또는 노린재류) 해충으로의 iRNA 분자의 전달을 위한 전달 시스템이 또한 본 발명의 구현예에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 iRNA 분자는 해충(들)의 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 도입 방법은 곤충 해충(들)에 대한 숙주로부터의 식물 조직과 iRNA를 직접 혼합하는 것, 뿐만 아니라 본 발명의 iRNA 분자를 포함하는 조성물을 숙주 식물 조직에 적용시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자는 식물 표면 상에 분무될 수 있다. 대안적으로, iRNA 분자는 미생물에 의해 발현될 수 있고, 미생물은 식물 표면 상에 적용될 수 있거나 또는 물리적인 수단, 예컨대 주사에 의해 뿌리 또는 줄기 내로 도입될 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 트랜스제닉 식물은 또한 식물에 침입하는 것으로 공지된 곤충 해충을 사멸시키는데 충분한 양으로 적어도 1 종의 iRNA 분자를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생산된 iRNA 분자는 또한 농업상의 일반적인 관행과 일치하는 방식으로 제제화될 수 있고, 곤충 해충에 의한 식물 피해를 방제하기 위한 분무식 제품으로서 사용될 수 있다. 제제는 효율적으로 잎을 피복시키는데 요구되는 적절한 아주반트 (예, 스티커 및 습윤제) 뿐만 아니라 UV 피해로부터 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)를 보호하기 위한 UV 보호제를 포함할 수 있다. 이러한 첨가제는 생물살곤충제 산업에서 통상적으로 사용되며, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 주지되어 있다. 이러한 적용예들은 다른 분무식 살곤충제 적용예 (생물학적 기반 또는 다른 것)과 함께 조합되어서 해충으로부터의 식물 보호를 증진시킬 수 있다.
본원에 인용된 공개, 특허 및 특허출원을 포함한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명시적 세부사항과 불일치하지 않는 정도로 본원에 참조로 포함되고, 마치 각각의 참고문헌이 개별적이면서 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어지며 그 전문이 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 그렇게 포함된다. 본원에 논의된 참고문헌들은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서의 아무 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 그러한 개시내용을 앞서는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기 실시예는 소정의 특정한 특징 및/또는 측면을 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 개시내용을 기재된 특정한 특색 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 수행 양식
I. 여러 구현예의 개관
트랜스제닉 식물의 개발은 점차 복잡해지고 있으며, 전형적으로 다수의 트랜스젠을 단일 유전자좌 내로 적체 (stacking)해야 한다. Xie 등 (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):6779을 참조한다. 각각의 트랜스젠은 일반적으로 발현을 위한 독특한 프로모터를 필요로 하므로, 하나의 유전자 적체물 내에서 상이한 트랜스젠을 발현시키기 위해 다수의 프로모터가 요구된다. 유전자 적체물의 크기를 증가시키는 것 외에도, 이는 종종 상이한 트랜스젠의 유사한 수준으로의 발현 패턴을 수득하기 위해 동일한 프로모터의 반복된 사용을 야기한다. 이러한 접근법은 종종 동일한 프로모터에 의해 유도되는 다수의 트랜스젠의 발현이 유전자 침묵 또는 HBGS를 야기할 수 있기 때문에 문제가 된다. 반복된 프로모터에서 경쟁하는 전사 인자 (TF)-결합 부위가 과다하면 내인성 TF의 고갈을 야기할 수 있고 전사 하향조절을 야기할 수 있다. 트랜스젠의 침묵은 트랜스젠의 발현에 의해 생산된 트랜스제닉 식물의 성능에 바람직하지 않다. 트랜스젠 내의 반복적인 서열은 종종 유전자 좌 내의 (intralocus) 상동성 재조합을 야기하여 폴리뉴클레오티드 배열 및 바람직하지 않은 표현형 또는 작물학적 성능을 야기한다.
기초 연구 또는 생물공학 응용에 사용되는 식물 프로모터는 일반적으로 단일 방향이며, 이의 3’ 말단 (하류)에서 융합된 하나의 유전자만을 조절한다. 다양한 원하는 형질 및 특성을 가진 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해, 원하는 형질 및 특성을 코딩하는 트랜스젠의 발현을 유도하기 위해 전개되는 프로모터의 수를 감소시키는 것이 유용하다. 특히, 대사 조작 (engineering) 및 특성 적체를 위해 다수의 트랜스젠을 식물에 도입할 필요가 있는 응용에서, 다수의 트랜스젠의 발현을 유도하기 위해 다수의 프로모터가 필요하다. 프로모터 측부의 2개의 트랜스젠의 발현을 유도할 수 있는 단일 벼 유비퀴틴-3 합성 양방향 프로모터를 개발함으로써, 트랜스제닉 작물의 개발에 필요한 총 프로모터의 수가 감소될 수 있으며, 이에 따라 동일한 프로모터의 반복된 사용을 줄이고, 트랜스제닉 구축물의 크기를 감소시키고/시키거나 HBGS의 가능성을 감소시킬 수 있다. 이러한 프로모터는 DNA의 신규 또는 합성 스트레치에 공지된 시스-요소를 도입하거나, 대안적으로 하나의 프로모터의 도메인이 다른 이종 프로모터로부터의 기능적으로 동등한 도메인으로 대체되는 “도메인 스와핑”에 의해 생산될 수 있다.
본원의 구현예는 오리자 사티바 (Oryza sativa) (벼) 유비퀴틴-3 유전자 (예컨대, Rubi3)로부터의 단일 방향 프로모터가 프로모터의 각 말단의 하나에서 하나의 프로모터가 2개의 유전자의 발현을 직접 유도할 수 있도록 하는 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 설계하는데 사용되는 공정을 사용한다. 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터는 당업자에게 하여금 동일한 프로모터의 반복된 사용을 줄이고 트랜스제닉 구축물의 크기를 감소시키면서 트랜스젠을 식물 세포 및 식물에 적체할 수 있도록 할 수 있다. 또한, 단일 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 가진 2개의 유전자의 발현 조절은 또한 예컨대 2개의 유전자 각각이 숙주에서 단일 형질에 기여할 때 유용할 수 있는 것과 같은 동일한 조건 하에 2개의 유전자를 동시에 발현시킬 수 있는 능력을 제공할 수 있다. 식물에서 프로모터의 양방향 기능의 사용은, 제아 메이스 (Zea mays) 유비퀴틴 1 프로모터 (국제 특허 공개 제 WO2013101343 A1호), CaMV 35 프로모터 (Barfield 및 Pua (1991) Plant Cell Rep. 10(67):30814; Xie 등 (2001), 전술됨), 및 마스 (mas) 프로모터 (Velten 등 (1984) EMBO J. 3(12):272330; Langridge 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:321923)을 포함하여 일부 경우에서 보고되어 왔다.
식물 유전자에서 전사 개시 및 유전자 발현의 조절은 프로모터 내에 집합적으로 배열된 다양한 DNA 서열 요소에 의해 유도된다. 진핵 생물 프로모터는 최소 핵심 프로모터 요소 (minP), 및 추가의 상류 조절 서열 (URS)로 이루어져 있다. 핵심 프로모터 요소는 전사의 정확한 개시를 유도하기에 충분한 연속적인 DNA 서열의 최소한의 스트레치이다. 식물에서의 핵심 프로모터는 또한 전사 개시와 관련된 CAAT 및 TATA 박스와 같은 표준 영역을 포함한다. TATA 박스 요소는 통상적으로 전사 개시 부위의 약 20 내지 35 뉴클레오티드 상류에 위치한다.
minP의 활성화는 다양한 단백질이 결합하고 이어서 전사 개시 복합체와 상호작용하는 URS에 의존한다. URS는 URS를 포함하는 프로모터의 시공간 발현 패턴을 결정하는 DNA 서열을 포함한다. 프로모터의 극성은 종종 minP의 배향에 의해 결정되는 반면, URS는 양극성이다 (즉, 이의 배향과 무관하게 기능함).
일부 구현예의 특이적인 실시예에서, 본래의 제아 메이스로부터 유도된 변형된 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 (ZmUbi1)의 최소 핵심 프로모터 요소 (minUbi10P)는 식물에서 기능하여 전술된 양방향 프로모터와 관련하여 독특한 발현 제어 특성을 제공하는 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 조작하기 위해 사용된다. 구현예는, 천연 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 (minPZmUbi1)로부터 유도된 최소 핵심 프로모터 요소 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 포함한다.
본래 제아 메이스 c.v. B73으로부터 유도된 ZmUbi1 프로모터는 전사 시작 부위의 약 899 염기 5’ 이내, 그리고 추가로 전사 시작 부위의 약 1,093 염기 3’ 이내의 옥수수 게놈에 위치한 서열을 포함한다. Christensen 등 (1992) Plant Mol. Biol. 18(4):67589 (제아 메이스 c.v. B73 ZmUbi1 유전자를 기술함). 일부 실시예에서 사용되는 B73으로부터 유도된 변형된 ZmUbi1 프로모터는 TATA 박스; 2개의 중첩된 열 쇼크 일치 (consensus) 요소; 본원에서 ZmUbi1 엑손으로 지칭되는, 전사 시작 부위의 바로 근접의 82 또는 83 뉴클레오티드 (기준 가닥에 따라) 리더 서열; 및 1015 내지 1016 뉴클레오티드 인트론을 포함하는 약 2 kb 프로모터이다. 제아 종 및 제아 메이스 유전자형으로부터 유도된 다른 옥수수 유비퀴틴 프로모터 변이체는 TATA 요소 및 상류 열 쇼크 일치 요소로 이루어진 minP 요소 주변에 높은 서열 보존성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 구현예는 합성 양방향성 식물 프로모터의 제작을 위해 최소 핵심 프로모터 요소로서 ZmUbi1 프로모터의 이러한 짧은 (약 200 nt) 고도로 보존된 영역 (예컨대, 서열번호:2)의 사용에 의해 예시된다.
본래 오리자 사티바로부터 유도된 벼 유비퀴틴-3 프로모터는 전사 시작 부위의 약 1,990 염기 5’ 이내의 벼 게놈에 위치한 서열을 포함한다. E Sivamani, 및 R Qu (2006) Expression enhancement of a rice polyubiquitin promoter. Plant Molecular Biology 60: 225-239. 일부 실시예에서 사용되는 오리자 사티바로부터 유도된 변형된 벼 유비퀴틴-3 프로모터는 TATA 박스, 5’ UTR/인트론 서열, 및 벼 유비퀴틴-3 코딩 서열의 시작 부위에 위치한 하류 인핸싱 요소를 포함하는 약 2 kb의 프로모터이다. 오리자 종 및 오리자 사티바 유전자형으로부터 유도된 다른 벼 유비퀴틴-3 프로모터 변이체는 이러한 프로모터 요소 주위에 높은 서열 보존성을 나타낼 수 있다.
II. 약어
AtUbi10 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10
BCA 비신코닌 산
CaMV 꽃양배추 모자이크 바이러스
CsVMV 카사바 잎맥 모자이크 바이러스
CTP 클로로플라스트 전사 펩티드
HBGS 상동성-기반 유전자 침묵화
minUbi1P ZmUbi1 최소 핵심 프로모터
OLA 올리고 라이게이션 증폭
PCR 중합효소 연쇄 반응
RCA 회전 환 증폭
RUbi3 벼 유비퀴틴-3
RT-PCR 역전사 효소 PCR
SNuPE 단일 뉴클레오티드 프라이머 신장
URS 상류 조절 서열
ZmUbi1 제아 메이스 유비퀴틴 1
III. 용어
본 출원서 전반에 걸쳐 다수의 용어가 사용된다. 주어진 이러한 용어의 범주를 포함하여, 본 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다:
인트론: 본원에 사용된 용어 "인트론"은 전사되지만 번역되지 않는 유전자 (또는 관심있는 발현된 폴리뉴클레오티드 서열)에 포함된 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 인트론은 발현된 DNA 서열 내의 비 번역 핵산 서열뿐만 아니라 이로부터 전사된 RNA 분자 내의 상응하는 서열을 포함한다.
단리된(isolated): "단리된" 생물학적 구성성분 (예컨대 핵산 또는 단백질)은 구성성분이 자연적으로 발생하는 (즉, 다른 염색체 및 염색체 외 DNA및 RNA, 및 단백질) 유기체의 세포에서 다른 생물학적 구성성분으로부터 실질적으로 분리되거나, 분리되어 생산되거나 또는 분리되어 정제되어, 구성성분의 화학적 또는 기능적 변화에 영향을 미친다(예컨대, 핵산은 핵산과 염색체의 나머지 DNA를 연결하는 화학 결합을 파괴함으로써 염색체로부터 단리 될 수 있음). "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 이 용어는 또한 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질 및 펩티드뿐만 아니라 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질을 포함한다.
유전자 발현: 핵산 전사 단위 (예컨대, 게놈 DNA 포함)의 코딩된 정보가 종종 단백질의 합성을 포함하여 작동적 (operational), 비 작동적 또는 구조적 세포 부분으로 전환되는 과정. 유전자 발현은 외부 신호; 예를 들어, 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 세포, 조직 또는 유기체를 노출시키는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자의 발현은 DNA에서 RNA를 거쳐 단백질까지의 경로 중 어디에서나 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은, 예를 들어, 전사, 번역, RNA 수송 및 가공, 중간 분자, 예컨대 mRNA의 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특이적 단백질 분자가 제조된 후에 그의 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해를 통해서, 또는 이들의 조합에 의해 일어난다. 유전자 발현은 비제한적으로, 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯, 또는 시험관 내, 계 내 또는 생체 내 단백질 활성 검정(들)을 포함한, 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
상동성-기반 유전자 침묵화: 본원에서 사용된 용어 “상동성-기반 유전자 침묵화” (HBGS)는 전사적 유전자 침묵화 및 전사 후 유전자 침묵화 둘 모두를 포함하는 유전적 용어이다. 연결되어 있지 않은 침묵화 유전자좌에 의한 타겟 유전자좌의 침묵화는, 프로모터에 상응하는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 또는 전사된 서열의 생산에 의해 각각 전사 억제 (전사 유전자 침묵화; TGS) 또는 mRNA 분해 (전사 후 유전자 침묵화; PTGS)로부터 기인할 수 있다. 각각의 공정에서 별개의 세포 구성성분의 관련은 dsRNA-유도된 TGS 및 PTGS가 고대 공통의 기작의 다양화로 인해 야기되었을 가능성이 있음을 시사한다. 그러나, TGS와 PTGS의 엄격한 비교는 일반적으로 별개의 침묵화 유전자좌의 분석에 의존하기 때문에 달성하기가 어려웠다. 우리는 상이한 타겟 유전자의 프로모터 및 전사된 서열에 상응하는 dsRNA의 생산으로 인해, TGS 및 PTGS 둘 모두를 유발하는 단일 트랜스젠 유전자좌를 기술한다. Mourrain 등 (2007) Planta 225:36579. siRNA는 상동성 서열에 대한 TGS 및 PTGS를 유발하는 실제 분자일 가능성이 있다: 이러한 모델에서 siRNA는 시스 및 트랜스로 내인성 프로모터 내로의 트랜스젠 서열의 메틸화 확산을 통해 상동성 서열의 침묵화 및 메틸화를 유발한다. Id.
핵산 분자: 본원에 사용된 용어 "핵산 분자"(또는 “핵산” 또는 “폴리뉴클레오티드”)는 RNA, cDNA, 게놈 DNA 및 상기한 것의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있는, 클레오티드의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 어느 한 유형의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 핵산 분자는 통상적으로 달리 명시되지 않는 한, 적어도 10개의 염기 길이이다. 이 용어는 중간 길이의 RNA 또는 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 이 용어는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 자연 발생적인 뉴클레오티드 및 자연발생적 및/또는 비-자연발생적인 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 변형된 뉴클레오티드 둘 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
핵산 분자는 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-자연적 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 표지, 메틸화, 유사체에 의한 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비전하 결합: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등; 전하 결합: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제(intercalator): 예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등; 킬레이트제; 알킬화제; 및 변형된 연결기: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 듀플렉스, 트리플렉스, 헤어핀, 원형 및 패드록 입체형태를 포함한, 임의의 위상 입체형태를 또한 포함한다.
전사는 DNA 가닥을 따라 5’에서 3’ 방식으로 진행된다. 이는 RNA가 성장 사슬의 3’ 말단에 리보뉴클레오티드-5’-트리포스페이트를 연속적으로 첨가함으로써 만들어짐을 의미한다 (피로포스페이트를 필수적으로 제거함). 선형 또는 환형 핵산 분자에서, 별개의 요소 (예컨대, 특정 뉴클레오티드 서열)은 이들이 그 요소로부터 5’ 방향에서 동일한 핵산에 결합되거나 결합될 것인 경우 추가의 요소에 대해 “상류” 또는 “5’”으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 별개의 요소는 이들이 그 요소로부터 3’ 방향에서 동일한 핵산 분자에 결합되어 있거나 결합될 것인 경우 추가의 요소에 대해 “하류” 또는 “3’”일 수 있다.
본원에서 사용된 염기 “위치”는 지정된 핵산 내의 주어진 염기 또는 뉴클레오티드 잔기의 위치를 지칭한다. 지정된 핵산은 기준 핵산과의 정렬 (하기 참조)에 의해 정의될 수 있다.
혼성화: 올리고뉴클레오티드 및 이의 유사체는 왓슨-크릭 (Watson-Crick), 후그스틴 (Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합을 포함하는 수소 결합에 의해 상보적인 염기 사이에서 혼성화된다. 일반적으로, 핵산 분자는 피리미딘 (시토신 (C), 우라실 (U), 및 티민 (T)) 또는 퓨린 (아데닌 (A) 및 구아닌 (G)) 중 어느 하나인 질소성 염기로 이루어져 있다. 이러한 질소성 염기는 피리미딘과 퓨린 사이에 수소 결합을 형성하며, 이러한 피리미딘과 퓨린의 결합은 “염기쌍”으로 지칭된다. 보다 구체적으로, A는 T 또는 U와 수소 결합을 하고, G는 C와 결합할 것이다. “상보적”은 2개의 별개의 핵산 서열 또는 동일한 핵산 서열의 2개의 별개의 영역 사이에서 발생하는 염기 쌍을 지칭한다.
“특이적으로 혼성화가능한” 및 “특이적으로 상보적”은 올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA 타겟간의 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능하기 위한 이의 타겟 서열과 100% 상보적일 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드는 타겟 DNA 또는 RNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합이 타겟 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 방해할 때 특이적으로 혼성화될 수 있으며, 특이적 결합이 바람직한 조건 하에서, 예컨대 생체 내 분석 또는 시스템인 경우 생리학적 조건 하에서 비-타겟 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 비-특이적인 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 있다. 이러한 결합은 특이적인 혼성화라고 지칭된다.
특정한 엄중도를 초래하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 속성 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 비록 세척 횟수 또한 엄중도에 영향을 미치지만, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히 Na+ 및/또는 Mg2+ 농도)가 혼성화의 엄중도를 결정할 것이다. 특정한 엄중도를 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산은 Sambrook 등 (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs 9 and 11에 논의되어 있다.
본원에 사용된 "엄중 조건"은 혼성화 분자와, DNA 타겟 사이에 50% 미만의 미스매치가 존재하는 경우에만 혼성화가 일어나게 되는 조건을 포괄한다. "엄중 조건"은 추가로 특정한 수준의 엄중도를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "중간 정도의 엄중도" 조건은 50% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자들이 혼성화되지 않을 조건이고; "고 엄중도" 조건은 20% 초과의 미스매치를 갖는 서열들이 혼성화되지 않을 조건이고; "매우 고도의 엄중도" 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열들이 혼성화되지 않을 조건이다.
특정 구현예에서, 엄중 조건은 65℃에서 혼성화 후, 65℃에서 40분 동안 0.1x SSC/0.1% SDS로 세척하는 것을 포함할 수 있다.
하기는 대표적인 비제한적 혼성화 조건이다:
매우 고도의 엄중도: 16시간 동안 65℃에서 5x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 15분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 20분 동안 65℃에서 0.5x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
고 엄중도: 16-20시간 동안 65-70℃에서 5x-6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 5-20분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 30분 동안 55-70℃에서 1x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
중간 정도의 엄중도: 16-20시간 동안 실온 내지 55℃에서 6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 20-30분 동안 실온 내지 55℃에서의 2x-3x SSC 완충제 중에서의 적어도 2회 세척.
특정 구현예에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 매우 높은 엄중도 혼성화 조건 하에서 결합된 채로 유지될 수 있다. 이러한 구현예 및 추가의 구현예에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 높은 엄중도 혼성화 조건 하에서 결합된 채로 유지될 수 있다. 이러한 구현예 및 추가의 구현예에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 중간 정도의 엄중도 혼성화 조건 하에서 결합된 채로 유지될 수 있다.
올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 짧은 핵산 중합체이다. 올리고뉴클레오티드는 보다 긴 핵산 절편들의 절단에 의해서나, 개별 뉴클레오티드 전구체의 중합에 의해 형성될 수 있다. 자동화된 합성기로 인해 최대 수백 개의 염기 쌍인 올리고뉴클레오티드의 합성이 가능하다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있기 때문에, DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA로 구성된 올리고뉴클레오티드(올리고데옥시리보뉴클레오티드)는 작은 DNA 서열을 증폭하기 위한 기법인 PCR에서 사용될 수 있다. PCR에서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 "프라이머"로 지칭되고, 이는 DNA 중합효소가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고 상보적 가닥을 복제하도록 한다.
서열 동일성: 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 최대로 상응하도록 정렬하였을 때 동일한, 두 서열에서의 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열 또는 아미노산 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있으며, 여기서 비교 윈도우에서의 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여, 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 양쪽의 서열에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우에서의 위치의 총수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 본 기술분야에 주지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이, 예를 들어 하기에 기재되어 있다: Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman 및 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson 및 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:23744; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet 등 (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang 등 (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson 등 (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana 등 (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고찰은, 예를 들어 Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10에서 찾아볼 수 있다.
국립 생물 정보 센터 (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul 등 (1990))은 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다)를 포함한 여러 소스로부터와 인터넷 상에서 이용가능하다. 이 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 설명은 인터넷 상에서 BLAST의 "도움말" 섹션 하에 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 변수를 사용하여 BLAST (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능이 사용될 수 있다. 참조 서열에 대해 서열 유사성이 훨씬 더 큰 핵산 서열은 이 방법에 의해 평가하는 경우에 증가하는 백분율 동일성을 나타낼 것이다.
작동가능하게 연결된(operably linked): 제1핵산 서열이 제2핵산 서열과 기능적인 관계에 있는 경우 제1핵산 서열은 제2핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 예컨대, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 코딩 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 재조합적으로 생산되었을 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 일반적으로 인접해 있고, 동일한 리딩 프레임 내에서 (예를 들어, 번역 융합된 ORF 내에서) 2개의 단백질-코딩 영역을 필요할 경우 연결한다. 그러나, 요소는 작동가능하게 연결되기 위해 인접해 있을 필요는 없다.
프로모터: 일반적으로 전사에 필요한 상류 (유전자의 5’ 영역 방향)에 위치하는 DNA 영역이다. 프로모터는 이들이 제어하는 유전자를 적절하게 활성화시키거나 억제할 수 있다. 프로모터는 전사 인자에 의해 인식되는 특이적인 서열을 포함할 수 있다. 이러한 요소는 프로모터 DNA 서열에 결합하여 유전자의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소인 RNA 중합 효소의 동원을 야기할 수 있다.
형질전환된: 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 편입에 의해 또는 에피솜 복제에 의해, 세포에 의해 안정적으로 복제될 때 세포는 상기 세포 내로 형질도입된 핵산 분자에 의해 "형질전환된다". 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 분자가 이러한 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm 등 (1986) Nature 319:791-3); 리포펙션 (Felgner 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주사 (Mueller 등 (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 전달 (Fraley 등 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접 DNA 흡수; 휘스커-매개 형질전환; 및 미세발사체 충격 (Klein 등 (1987) Nature 327:70).
트랜스젠(transgene): 외인성 핵산 서열. 일 실시예에서, 트랜스젠은 유전자 서열 (예를 들어, 제초제-내성 유전자, 산업상 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자)이다. 또 다른 실시예에서, 트랜스젠은 안티센스 핵산 서열이며, 여기에서, 안티센스 핵산 서열의 발현은 타겟 핵산 서열의 발현을 저해한다. 트랜스젠은 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예컨대, 프로모터)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 관심있는 핵산 서열은 트랜스젠이다. 그러나, 다른 구현예에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열은 내인성 핵산 서열이이고, 이때, 상기 내인성 핵산 서열의 추가의 게놈 복사본이 바람직하며, 또는, 숙주 유기체에서 타겟 핵산 분자의 서열에 대해 안티센스 배향인 폴리뉴클레오티드 서열이다.
트랜스제닉 사건 (transgenic event:) 트랜스제닉 “사건”은 이형 DNA, 즉 관심있는 트랜스젠을 포함하는 핵산 구축물로 식물 세포를 형질전환하고, 상기 식물의 게놈 내에 트랜스젠의 삽입으로 인해 야기된 식물 집단을 재생시키고, 특정 게놈 위치 내로의 삽입에 의해 특징화된 특정 식물의 선별에 의해 생산되는 것이다. 이러한 용어 “사건”은 본래의 형질전환체 및 이형 DNA를 포함하는 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 “사건”은 또한 형질전환체와 게놈/트랜스젠 DNA를 포함하는 또 다른 변이체간의 성적인 이종교배에 의해 생산된 자손을 지칭한다. 반복되는 부모와의 반복되는 여교배 (backcrossing) 후에도, 삽입된 트랜스젠 DNA 및 형질전환된 부모로부터의 측부 게놈 DNA (게놈/트랜스젠 DNA)는 동일한 염색체 위치에서 교배 자손에 존재한다. 용어 “사건”은 또한 본래의 형질전환체 및 삽입된 DNA를 포함하는 하나의 부모 계 (예컨대, 본래의 형질전환체 및 자가수정에 의한 자손) 및 삽입된 DNA를 포함하지 않는 부모계의 성적인 교배 결과로서 관심있는 트랜스젠을 포함하는 삽입된 DNA를 수용하는 자손에 이식될 것으로 기대되는 삽입된 DNA 바로 인접의 측부 게놈 서열을 포함하는 이의 자손으로부터의 DNA를 포함한다.
벡터: 세포 내로 도입되어서, 형질전환된 세포를 생산하는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제가 가능한 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 또는 외인성 DNA를 세포 내로 이동시키는 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선택성 마커 유전자 및 본 기술분야에 공지되어 있는 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환 또는 감염시킴으로써 세포가 핵산 분자 및/또는 벡터에 의해 코딩된 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 선택적으로 핵산 분자를 세포 내로 진입시키는데 도움을 주는 물질(예를 들어, 리포솜, 단백질 코딩 등)을 포함한다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의를, 예컨대 다음에서 찾아볼 수 있다: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 등 (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
본원에서 사용된 문구 “하나의 (a, an)” 및 “그 (the)”는 문맥이 분명하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 인용을 포함한다.
IV. 합성 양방향 프로모터, RUbi3, 및 이를 포함하는 핵산
본 발명은 양방향 프로모터로서 기능할 수 있는 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 합성 양방향 프로모터는 관심있는 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예컨대, 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터는 유전자 (예컨대, 2개의 유전자, 프로모터의 각각의 말단에 있는 것)를 코딩하는 관심있는 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 관심있는 적어도 하나의 (예컨대, 하나 또는 둘 모두) 뉴클레오티드 서열 전사를 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 벼 유비퀴틴 3 프로모터의 URS를 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터에 삽입시킴으로써, 특정 발현 및 조절 패턴 (예컨대, 벼 유비퀴틴 3 프로모터의 제어 하에 유전자에 의해 나타나는 바와 같이)이 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터에 작동적으로 연결된 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 달성될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는 합성 양방향 프로모터의 조작을 위해 단일 방향 옥수수 유비퀴틴-1 유전자 (ZmUbi1) 프로모터로부터의 최소 핵심 프로모터 요소를 천연 프로모터의 것과 상이한 분자 맥락 (context)에 삽입시킴으로써 본원에서 예시된다. 이러한 최소 핵심 프로모터 요소는 본원에서 “minUbi1P”로 지칭되며, 길이가 약 200 nt이다. 다수의 제아 종 및 Z. 메이스 유전자형으로부터의 minUbi1P 요소의 서열분석 및 분석은 기능적인 minUbi1P 요소가 고도로 보존되어, 예컨대 서열번호:2의 minUbi1P 요소와 약 적어도 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 및/또는 적어도 약 100%의 서열 동일성을 공유하는 경우 minUbi1P 요소가 전사 개시자로서의 이의 기능을 보존할 수 있음을 밝혔다. 본 발명의 일부 구현예에서 유용할 수 있는 minUbi1P 요소의 특성은, 예컨대, 제한 없이, 전술된 핵산 서열의 높은 보존성, 적어도 하나의 TATA 박스의 존재, 및/또는 적어도 하나의 (예컨대, 2개) 열 쇼크 일치 요소의 존재를 포함할 수 있다. 특정 minUbi1P 요소에서, 하나 이상의 열 쇼크 일치 요소는 minUbi1P 서열 내에 중첩되어 있을 수 있다.
구현예들에서, 합성 양방향 프로모터의 조작을 위해 천연 프로모터 (즉, 벼 유비퀴틴 3)의 것과 상이한 분자 맥락에 minUbi1P 요소를 삽입시키는 공정은 벼 유비퀴틴 3 프로모터의 나머지 서열에 대해 minUbi1P 요소의 배향을 역전시키면서, 벼 유비퀴틴 3 프로모터 핵산에 minUbi1P 요소를 삽입시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터는 벼 유비퀴틴 3 프로모터 뉴클레오티드 서열에 대해 역 배향으로 이의 3’에 위치한 minUbi1P 최소 핵심 프로모터 요소를 포함할 수 있으며, 이는 벼 유비퀴틴 3 프로모터 뉴클레오티드 서열의 3’에 위치한 관심있는 핵산 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 예컨대, minUbi1P 요소는 벼 유비퀴틴 3 프로모터의 3’ 말단에 역 배향으로 삽입될 수 있다.
합성 양방향 벼 유비퀴틴 3 프로모터는 또한 minUbi1P 요소 및 천연 벼 유비퀴틴 3 프로모터 요소 외에 하나 이상의 추가 서열 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 양방향 벼 유비퀴틴 3 프로모터는 프로모터 URS, 엑손 (예컨대, 리더 또는 신호 펩티드), 인트론, 스페이서 서열, 및/또는 전술된 것의 임의의 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다. 비제한적인 예시에서, 합성 양방향 벼 유비퀴틴 3 프로모터는 벼 유비퀴틴 3 또는 ZmUbi1 프로모터로부터의 URS 서열, 벼 유비퀴틴 3 또는 ZmUbi1 유전자로부터의 인트론, 벼 유비퀴틴 3 또는 ZmUbi1 유전자로부터의 리더 펩티드를 코딩하는 엑손, 벼 유비퀴틴 3 또는 ZmUbi1 유전자로부터의 인트론, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
합성 양방향 벼 유비퀴틴 3 프로모터는 또한 minUBi1P 요소 및 minUbi1P를 포함하는 천연 프로모터 벼 유비퀴틴 3 요소 외에 하나 이상의 추가 서열 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 양방향 벼 유비퀴틴 3 프로모터는 프로모터 URS, 엑손 (예컨대, 리더 또는 신호 펩티드), 인트론, 스페이서 서열, 및 또는 전술된 것의 임의의 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다. 비제한적인 예시에서, 합성 양방향 벼 유비퀴틴 3 프로모터는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터로부터의 URS 서열, ADH 유전자로부터의 인트론, 제아 메이스 유비퀴틴 유전자로부터의 리더 펩티드를 코딩하는 엑손, 제아 메이스 유비퀴틴 유전자로부터의 인트론, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
프로모터 URS를 포함하는 프로모터의 일부 구현예에서, URS는 합성 프로모터에 특정 조절 특성을 부여하기 위해 선택될 수 있다. 공지된 프로모터는 작동가능하게 연결된 유전자에 미치는 조절 유형이 광범위하게 다양하며 (예컨대, 환경 반응, 발달 단서, 및 공간 정보), 이형 프로모터 내에 삽입된 URS는 전형적으로 URS가 이의 천연 프로모터 및 작동가능하게 연결된 유전자에 대해 나타내는 제어 유형을 유지한다. Langridge 등 (1989), 전술됨. 특성분석이 되어 있고 일부 구현예에 따른 합성 양방향 벼 유비퀴틴 3 프로모터 내에 포함된 URS를 포함할 수 있는 진핵생물 프로모터의 예는, 예컨대 비제한적으로 다음을 포함한다: 미국특허 제6,437,217호 (옥수수 RS81 프로모터); 제5,641,876호 (벼 액틴 프로모터), 제6,426,446호 (옥수수 RS324 프로모터); 제6,429,362호 (옥수수 PR1 프로모터); 제6,232,526호 (옥수수 A3 프로모터); 제6,177,611호 (구성적인 옥수수 프로모터); 제6,433,252호 (옥수수 L3 올레오신 프로모터); 제6,429,357호 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 제5,837,848호 (뿌리-특이적 프로모터); 제6,294,714호 (광-유도성 프로모터); 제6,140,078호 (염-유도성 프로모터); 제6,252,138호 (병원균유도성 프로모터); 제6,175,060호 (인 결핍-유도성 프로모터); 제6,388,170호 (양방향 프로모터); 제6,635,806호 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 연속특허출원 제09/757,089호 (옥수수 클로로플라스트 알돌라아제 프로모터)에 기술된 것들.
추가의 예시적인 원핵생물 프로모터는 노팔린 합성효소 (NOS) 프로모터 (Ebert 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); 옥토핀 합성효소 (OCS) 프로모터 (아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도성 플라스미드 상에 운반됨); 칼리모바이러스 프로모터 예컨대 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton 등 (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell 등 (1985) Nature 313:810-2); 현삼 (figwort) 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (Walker 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 합성효소 프로모터 (Yang 및 Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합 프로모터 (Chandler 등 (1989) Plant Cell 1:1175-83); CaMV35S (미국특허 제 5,322,938호, 제5,352,605호, 제5,359,142호, 및 제5,530,196호); FMV35S (미국특허 제 6,051,753호, 및 제5,378,619호); PC1SV 프로모터 (미국특허 제5,850,019호); SCP1 프로모터 (미국특허 제6,677,503호); 및 아그로박테리움 투메파시엔스 Nos 프로모터 (GenBank 수탁 번호 V00087; Depicker 등 (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan 등 (1983) Nature 304:184-7) 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터는 엑손을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 특정 세포 아래 위치 및/또는 구획에 표적화하거나 수송하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 구현예 및 다른 구현예에서, 코딩 서열 (엑손)은 나머지 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터 서열과 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 사이의 핵산 분자 내에 삽입될 수 있다. 이러한 요소는 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터가 폴리펩티드의 나머지와 기능적인 관계로 삽입된 코딩 서열에 의해 코딩된 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (또는 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 2개의 폴리펩티드-코딩 서열 중 하나 또는 둘 모두)의 발현을 촉진시키도록 숙련된 전문가의 재량에 따라 배열될 수 있다. 특정 실시예에서, 리더, 전이 또는 신호 펩티드를 코딩하는 엑손 (예컨대, 제아 메이스 Ubi1 리더 펩티드)이 삽입될 수 있다.
합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터 내에 삽입된 엑손에 의해 코딩될 수 있는 펩티드는, 예컨대 제한 없이 다음을 포함한다: 유비퀴틴 (예컨대, 제아 메이스 Ubi1) 리더 펩티드, 국제 PCT 공개번호 제WO 2008/105890호의 다이캄바 모노옥시게나아제 (DMO)의 클로로플라스트 타겟화에 대한 예시와 같은 클로로플라스트 전이 펩티드 (CTP) (예컨대, A. 탈리아나 EPSPS CTP (Klee 등 (1987) Mol. Gen. Genet. 210:437-42), 및 페투니아 하이브리다 EPSPS CTP (della-Cioppa 등 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7)).
본 발명의 일부 구현예에서, 인트론이 또한, 예컨대 나머지 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터 서열과 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터에 삽입될 수 있다. 일부 실시예에서, 합성 벼 유비퀴틴 3 양방향 프로모터 내에 삽입된 인트론은, 제한 없이, 번역 개시 서열의 완전하게 가공된 mRNA 상류에 존재하는 번역 리더 서열로서 기능하는 5’ UTR일 수 있다 (이러한 번역 리더 서열은 mRNA로의 1차 전사 가공, mRNA 안정성, 및/또는 번역 효율에 영향을 미칠 수 있음). 번역 리더 서열의 예는 메이즈 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 제5,362,865호), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, Turner 및 Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36을 참조한다. 5'UTR의 비제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 제5,659,122호); PhDnaK (미국 특허 제5,362,865호); AtAnt1; TEV (Carrington 및 Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (GenBank 수탁 번호 V00087; 및 문헌 Bevan 등 (1983) Nature 304:184-7)를 포함한다. 특정 실시예에서, 제아 메이스 유비퀴틴 1 인트론은 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터에 삽입될 수 있다.
합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터 내에 선택적으로 삽입될수 있는 추가의 서열은, 예컨대 제한 없이 다음을 포함한다: 3' 비번역된 서열, 3' 전사 종결 영역, 및 폴리아데닐화 영역. 이들은 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 서열)의 하류에 위치하는 유전적인 요소이며, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사, mRNA 가공, 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 mRNA 전구체의 3' 말단에의 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드 첨가를 초래하도록 기능할 수 있다. 폴리아데닐화 서열은 천연 유전자, 다양한 식물 유전자 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비-제한적인 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; Fraley 등 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)이다. 상이한 3' 비-번역 영역의 사용에 관한 예는 Ingelbrecht 등, (1989) Plant Cell 1:671-80에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비-제한적인 예는 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi 등 (1984) EMBO J. 3:1671-9) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 Nos 유전자 (GenBank 수탁 번호 E01312)로부터의 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터는 프로모터를 포함하는 핵산을 타겟 유기체의 게놈 내의 특정 유전자좌에 타겟화하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예컨대, 숙주에서 게놈 DNA 서열의 분절 (예컨대, 드물거나 독특한 게놈 DNA 서열)과 상동성인 하나 이상의 서열이 포함될 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 상동성 서열은 숙주 게놈의 상동성 DNA의 부위에서 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 포함하는 핵산의 재조합 및 통합을 유도할 수 있다. 특정 실시예에서, 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터는 드물거나 독특한 위치에서 서열을 인식하여 드물거나 독특한 위치에서 통합을 용이하게 하는 조작된 뉴클레아제 효소를 사용하여 상기 프로모터를 포함하는 핵산을 숙주 게놈의 드물거나 독특한 위치에 표적화하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레아제 효소로서 징크-핑거 엔도뉴클레아제를 사용하는 이러한 표적화된 통합 시스템이 미국특허출원 제13/011,735호에 기술되어 있으며, 이의 전체의 내용이 참조로써 본원에 포함되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 형질을 포함하는 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열을 구현예로서 추가로 포함한다. 형질은 살충제 저항 형질, 제초제 내성 형질, 질소 사용 효율 형질, 물 사용 효율 형질, 영양 품질 형질, DNA 결합 형질, 선택성 마커 형질, 및 이들의 임의의 조합일 수 있다.
추가의 구현예에서, 형질은 트랜스제닉 사건으로서 트랜스제닉 식물 세포 내에 통합된다. 추가의 구현예에서, 트랜스제닉 사건은 범용 제품을 생산한다. 따라서, 조성물은 본 발명의 형질전환 식물 세포로부터 유도되며, 이때, 상기 조성물은 식사, 밀가루, 단백질 농축물, 또는 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 범용 제품이다. 추가의 구현예에서, 형질전환된 식물 세포로부터 유래된 트랜스제닉 식물에 의해 생산되는 범용 제품이 포함되며, 여기서 상기 범용 제품은 검출가능한 양의 본 발명의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 범용 제품은, 예를 들어 트랜스제닉 식물을 수득하고, 그로부터 먹이 또는 사료를 제조함으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 범용 제품은, 예를 들어, 제한하지 않고 다음을 포함한다: 식사, 오일, 식물의 분쇄 또는 통 곡물 또는 종자, 및 본 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 임의의 식사, 오일, 재조합 식물 또는 종자의 분쇄 또는 통 곡물 중 임의의 것을 포함하는 임의의 먹이 제품. 하나 이상의 범용품 또는 범용 제품에서 본 발명의 하나 이상의 서열을 검출하는 것은 실제로 상품 또는 상품성 산물이 하나 이상의 농경적 형질을 표현하도록 고안된 트랜스제닉 식물로부터 생산된다는 사실의 증거이다.
합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 포함하는 핵산은 예컨대, 비제한적으로 다음과 같이 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 생산될 수 있다: RCA, PCR 증폭, RT-PCR 증폭, OLA, 및 SNuPE를 포함. 이러한 기법 및 다른 동등한 기법이 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예컨대, 제한 없이 다음에 기술되어 있다: Sambrook 등 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001; 및 Ausubel 등 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998. 전술된 설명서 모두를 포함하여 상기 인용 된 모든 참고 문헌은 본원에 제공된 임의의 도면, 도 및/또는 표를 포함하여 전체가 본 명세서에 통합된다.
V. 합성 양방향 프로모터인 RUbi3을 포함하는 핵산 분자의 세포로의 전달
본 발명은 또한 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 포함하는 핵산 분자로 세포를 형질전환시키는 방법을 제공한다. 핵산 분자를 식물에 도입하기 위한 당업계에 공지된 다수의 기술 중 임의의 방법이, 예컨대 하나 이상의 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 숙주 식물 게놈에 도입하고/하거나 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 관심있는 폴리뉴클레오티드를 추가로 도입하기 위한 구현예에 따라 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 포함하는 핵산 분자로 식물을 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
적절한 식물의 형질전환 방법은 예컨대 제한없이 DNA가 세포 내로 도입될 수 있는 임의의 방법을 포함한다: 전기천공 (예컨대, 미국특허 제5,384,253호 참조), 미세발사 충격 (예컨대, 미국특허 제5,015,580호, 제5,550,318호, 제5,538,880호, 제6,160,208호, 제6,399,861호, 및 제6,403,865호 참조), 아그로박테리움-매개 형질전환 (예컨대, 미국특허 제5,635,055호, 제5,824,877호, 제5,591,616호, 제5,981,840호, 및 제6,384,301호 참조), 및 원형질체 형질전환 (예컨대, 미국특허 제5,508,184호 참조). 전술된 바와 같은 기법의 적용을 통해, 사실상 임의의 식물 종의 세포가 안정하게 형질전환될 수 있고, 이러한 세포는 당업계에 공지된 기법에 의해 트랜스제닉 식물로 발달될 수 있다. 예컨대, 목화 형질전환과 관련하여 특히 유용할 수 있는 기법이 미국특허 제5,846,797호, 제5,159,135호, 제5,004,863호, 및 제6,624,344호에 기술되어 있고; 특히 브라시카 (Brassica) 식물의 형질전환 기법이, 예컨대 미국특허 제5,750,871호에 기술되어 있고; 콩 형질전환 기법이, 예컨대 미국특허 제6,384,301호에 기술되어 있고; 옥수수 형질전환 기법이, 예컨대 미국특허 제7,060,876호 및 제5,591,616호, 및 국제 PCT 공개 제 WO 95/06722호에 기술되어 있다.
수용체 세포에 외인성 핵산 전달을 수행한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가 배양 및 식물 재생을 위해 식별된다. 형질전환된 세포를 식별할 수 있는 능력을 개선시키기 위해, 형질전환체를 생성하는데 사용된 형질전환 벡터와 함께, 상기 기재된 바와 같은 선택성 또는 스크리닝 마커 유전자를 사용하고자 할 수 있다. 이러한 경우, 잠재적으로 형질전환된 세포 집단은 선택적인 제제 또는 제제에 세포를 노출시킴으로써 분석될 수 있거나, 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝 될 수 있다.
선택적 작용제에 대한 노출에서 생존하는 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 스코어링된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함시킴으로써 변형될 수 있다. 식물 재생 노력을 시작하는 데 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 수동 선택을 수회에 걸쳐 반복 수행한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 상태가 될 때까지 (예를 들어, 적어도 2주) 성장 조절제를 포함하는 기초 배지 상에서 조직을 유지시킬 수 있고, 이어서 이를 싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 싹이 충분히 형성될 때까지 주기적으로 배양물을 옮긴다. 일단 싹이 형성되고 나면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 일단 뿌리가 형성되고 나면, 추가의 성장 및 성숙을 위해 식물을 토양으로 옮길 수 있다.
재생 식물에서 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 포함하는 목적하는 핵산 분자의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR; 생화학적 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해, 또는 효소 기능에 의해 단백질 산물의 존재를 검출하는 것; 식물 일부 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 전체 재생 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
표적화된 통합 사건은, 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 스크리닝될 수 있다. PCR 유전자형결정은 게놈 내로 편입된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서 PCR 증폭 산물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형결정 방법은 널리 기재되어 있고 (예를 들어, Rios, G. 등 (2002) Plant J. 32:243-53 참조), 세포 배양물을 포함한 임의의 식물 종 또는 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 타겟 서열 및 도입된 서열 둘 모두를 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합은 PCR 증폭 반응에서 순차적으로 또는 다중화로 사용될 수 있다. 타겟 부위에 어닐링되도록 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머, 도입된 핵산 서열, 및/또는 이들 둘의 조합이 생산될 수 있다. 따라서, PCR 유전자형 분석 전략은, 예컨대 제한 없이 다음을 포함할 수 있다: 식물 게놈에서 특이적 서열 증폭, 식물 게놈에서 다수의 특이적 서열 증폭, 식물 게놈에서 비-특이적 서열 증폭, 및 전술된 것들 중 임의의 것의 조합. 당업자는 게놈을 조사하기 위해 프라이머 및 증폭 반응의 추가적인 조합을 고안할 수 있다. 예컨대, 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 도입된 핵산 서열의 경계 외부의 타겟에 특이적인 핵산 서열에 어닐링되도록 설계될 수 있다.
순방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머는 도입된 핵산 서열, 예컨대 그 안에 포함된 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 코딩 영역에 상응하는 서열, 또는 핵산 분자의 다른 부분에 어닐링 되도록 고안될 수 있다. 이러한 프라이머는 전술된 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 원하는 서열에 따라 합성될 수 있고 상업적으로 이용가능하다 (예컨대, 아이오와주 코라빌 소재 Integrated DNA Technologies, Inc.로부터). 증폭은 클로닝 및 서열분석 후에, 또는 증폭 산물의 직접적인 서열 분석 후에 수행될 수 있다. 당업자는 PCR 유전자형 분석 동안 생산된 증폭 산물의 분석을 위한 대안적인 방법을 고려할 수 있다. 일 구현예에서, 유전자 타겟에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 증폭에서 사용된다.
VI. 합성 양방향 프로모터인 RUbi3을 포함하는 세포, 세포배양, 조직, 및 유기체
본 발명의 일부 구현예는 또한 예컨대 핵산 구축물에 존재할 수 있는, 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 포함하는 세포를 제공한다. 특정 실시예에서, 일부 구현예에 따른 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터는 식물 세포 및 식물에서 트랜스젠의 발현을 조절하기 위한 조절 서열로서 사용될 수 있다. 일부 이러한 실시예에서, 관심있는 (예컨대, 트랜스젠) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 양방향 RUbi3 프로모터의 사용은 주어진 수의 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는데 필요한 상동성 프로모터의 수를 감소시킬 수 있고/있거나, 주어진 수의 관심있는 뉴클레오티드 서열의 도입에 요구되는 핵산 구축물의 크기를 감소시킬 수 있다. 또한, 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터의 사용은 동일한 조건 하에 (즉, RUbi3 프로모터가 활성인 조건 하) 2개의 작동가능하게 연결된 관심있는 뉴클레오티드 서열을 동시에 발현할 수 있도록 할 수 있다. 이러한 실시예는, 예컨대 2개의 작동가능하게 연결된 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열 각각이 관심있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 숙주에서 단일 형질에 기여하고, 관심있는 뉴클레오티드 서열의 동시 발현이 형질전환 숙주에서 형질의 발현에 유리하게 영향을 미치는 경우 특히 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터 및/또는 관심있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물은 식물에서 관심있는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 부여된 (예컨대, 도입된, 향상된, 또는 기여된) 하나 이상의 바람직한 형질을 가질 수 있다. 이러한 형질은, 예컨대 제한 없이 다음을 포함할 수 있다: 곤충, 다른 해충 및 질병 유발제에 대한 내성; 제초제 내성; 향상된 안정성, 수율, 또는 유효 기간; 환경적인 내성; 제약 생산; 산업 제품 생산; 및 영양 강화. 일부 실시예에서, 바람직한 형질은 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터를 포함하는 핵산 분자로 식물을 형질전환시키는 것에 의해 부여될 수 있다. 일부 실시예에서, 바람직한 형질은, 교배를 통해 자손 식물로서 생산된 식물에 부여될 수 있으며, 이때, 상기 형질은 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 부모 식물로부터 상기 식물에 전달된 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 관심있는 뉴클레오티드 서열에 의해 부여될 수 있다.
일부 구현예에 따른 형질전환 식물은 본 발명의 핵산 분자로 형질전환될 수 있거나 본 발명의 핵산 분자로 형질전환된 식물과 교배될 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 따라서, 식물은 쌍자엽 식물일 수 있다. 일부 실시예에 유용한 쌍자엽 식물의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 알팔파, 콩, 브로콜리, 양배추, 캐놀라, 당근, 꽃양배추, 샐러리, 배추 (Chinese cabbage), 목화, 오이, 가지, 상추, 멜론, 완두콩, 후추, 땅콩, 감자, 호박, 무, 유채, 시금치, 콩, 스쿼시, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토, 및 수박. 일부 실시예에서 사용하기 위한 단자엽 식물의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 브라치포디움, 옥수수, 양파, 벼, 수수, 밀, 호밀, 기장, 사탕수수, 오트, 라이밀, 스위치그라스 (switchgrass), 및 잔디풀.
일부 구현예에서, 트랜스제닉 식물은 임의의 방식으로 사용되거나 배양될 수 있으며, 이때, 합성 벼 유비퀴틴-3 양방향 프로모터 및/또는 작동가능하게 연결된 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열이 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 식물은, 본 발명에 다른 핵산 분자로 형질전환됨으로써, 특히 하나 이상의 바람직한 특성 또는 트랜스제닉 사건을 갖도록 조작될 수 있으며, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 재배되거나 배양될 수 있다.
하기 실시예는 소정의 특정한 특징 및/또는 구현예를 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 개시내용을 기재된 특정한 특징 또는 구현예들로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
샘플 제조 및 생물검정
수많은 dsRNA 분자 (rpII33-1 reg1 (서열번호:5), rpII33-2 reg1 (서열번호:6), rpII33-2 v1 (서열번호:7), 및 rpII33-2 v2 (서열번호:8)에 상응하는 것 포함)를 MEGAscript® T7 RNAi kit (LIFE TECHNOLOGIES, 캘리포니아주 칼스배드) 또는 T7 신속 고수율 RNA 합성 키트 (NEW ENGLAND BIOLABS, 온타리오주 휘트비)를 사용하여 합성 및 정제하였다. 정제된 dsRNA 분자를 TE 완충제 중에서 제조하였고, 모든 생물검정은 이러한 완충제로 이루어진 대조군 처리를 함유하였으며, 이는 WCR (디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트)의 사멸 또는 성장 억제에 대한 배경 체크로서의 역할을 하였다. 생물검정 완충제 중 dsRNA 분자의 농도는 NANODROP™ 8000 분광광도계 (Thermo Scientific, 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 측정하였다.
성충 곤충 유충을 사용하여 수행된 생물검정에서 인공 곤충 먹이에 대한 곤충 활성에 대해 샘플을 시험하였다. WCR 알은 Crop Characteristics, Inc. (미네소타주 파밍톤)로부터 입수하였다.
생물검정은 곤충 생물검정을 위해 특이적으로 설계된 128-웰 플라스틱 트레이 (C-D International, 뉴저지주 피트만)에서 수행하였다. 각 웰은 딱정벌레류 곤충의 성장을 위해 설계된 인공 먹이 대략 1.0 mL를 함유하였다. dsRNA 샘플의 60 μL 분취물을 각 웰의 먹이 표면 상에 피펫팅 (40 μL/cm2)함으로써 전달하였다. 웰 내 표면적 (1.5 cm2)의 제곱 센티미터당 dsRNA의 양(ng/cm2)으로서 dsRNA 샘플 농도를 계산하였다. 먹이 표면 상의 액체가 증발될 때까지 또는 먹이 내로 흡수될 때까지 처리된 트레이를 흄 후드에 유지시켰다.
우화 몇 시간 이내에, 개별 유충을 습윤된 낙타털 브러시를 사용하여 채취하고, 처리된 먹이 상에 침적시켰다 (웰당 1 또는 2마리의 유충). 이어서, 128-웰 플라스틱 트레이 중 침입된 웰을 투명 플라스틱 접착 시트로 밀봉하고, 가스 교환이 이루어지도록 환기시켰다. 생물검정 트레이를 9일 동안 제어된 환경 조건 (28℃, ~40% 상대 습도, 16:8 (명기:암기)) 하에 유지시키고, 그 시간 후 각 샘플에 노출된 곤충의 총 수, 사멸된 곤충의 수 및 생존한 곤충의 중량을 기록하였다. 각 처리에 대해 평균 퍼센트 사멸률 및 평균 성장 억제를 계산하였다. 성장 억제 (GI)는 하기와 같이 계산하였다:
GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)],
여기서 TWIT는 처리군에서 살아있는 곤충의 총 중량이고;
TNIT는 처리군에서의 곤충의 총수이고;
TWIBC는 배경 체크 (완충제 대조군)에서 살아있는 곤충의 총 중량이고; 그리고
TNIBC는 배경 체크 (완충제 대조군)에서의 곤충의 총 수이다.
통계 분석은 JMP™ 소프트웨어 (SAS, 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 수행하였다.
LC50 (치사 농도)은 시험 곤충의 50%가 사멸된 투여량으로서 정의된다. GI50 (성장 억제)은 시험 곤충의 평균 성장 (예를 들어, 살아있는 중량)이 배경 체크 샘플에서 보이는 평균 값의 50%인 투여량으로서 정의된다.
반복된 생물검정은 특정한 샘플 섭취가 옥수수 뿌리벌레 유충의 놀라운 예상외의 사멸 및 성장 억제를 야기한다는 것을 입증하였다.
실시예 2: 후보 타겟 유전자의 식별
RNAi 트랜스제닉 식물 곤충 보호 기술에 의한 방제를 위한 후보 타겟 유전자 서열을 제공하기 위해, 풀링된 전사체 분석(transcriptome analysis)에 대해 다수의 발생 단계의 WCR (디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트)로부터 곤충을 선택하였다.
한 사례에서, 하기 페놀/TRI REAGENT®-기반 방법 (Molecular Research Center, 오하이오주 신시내티)을 사용하여 약 0.9 gm 전체 제1령 WCR 유충; (부화 후 4 내지 5일; 16℃에서 유지)으로부터 총 RNA를 단리하고, 정제하였다:
균질 현탁액을 수득할 때까지, 실온에서 10 mL의 TRI REAGENT®를 사용하여 15 mL 균질화기에서 유충을 균질화시켰다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 균질물을 1.5 mL 미세원심분리기 튜브로 분배하고 (튜브당 1 mL), 200 μL의 클로로포름을 첨가하고, 혼합물을 15초 동안 강력하게 진탕시켰다. 추출을 통해 실온에서 10분 동안 정치시킨 후, 4℃에서 12,000 x g로 원심분리에 의해 상을 분리하였다. 상부 상 (약 0.6 mL 포함)을 또 다른 멸균 1.5 mL 튜브 내로 조심스럽게 옮기고, 동등 부피의 실온 이소프로판올을 첨가하였다. 실온에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션한 후, 혼합물을 12,000 x g (4℃ 또는 25℃)로 8분 동안 원심분리하였다.
상청액을 조심스럽게 제거하여 폐기하고, 75% 에탄올을 사용하여 볼텍싱하여 RNA 펠릿을 2회에 걸쳐 세척하고, 각 세척 후에는 7,500 x g (4℃ 또는 25℃)로 5분 동안 원심분리에 의해 회수하였다. 에탄올을 조심스럽게 제거하고, 펠릿을 3 내지 5분 동안 공기-건조되게 한 다음, 뉴클레아제-무함유 멸균수 중에 용해시켰다. 260 nm 및 280 nm에서의 흡광도 (A)를 측정함으로써 RNA 농도를 결정하였다. 약 0.9 gm의 유충으로부터의 전형적인 추출을 통해 1 mg 넘는 총 RNA를 수득하였으며, 이때 A260/A280 비는 1.9였다. 이와 같이 추출된 RNA를 추가로 가공할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
분취물을 1% 아가로스 겔을 통해 전개시킴으로써 RNA 품질을 결정하였다. 오토클레이브된 용기 내에서 DEPC (디에틸 피로카르보네이트)-처리된 물로 희석된 오토클레이브된 10x TAE 완충제 (트리스-아세테이트 EDTA; 1x 농도는 0.04 M 트리스-아세테이트, 1 mM EDTA (에틸렌디아민 테트라-아세트산 나트륨 염), pH 8.0)를 사용하여 아가로스 겔 용액을 제조하였다. 1x TAE를 전개 완충제로서 사용하였다. 사용 전에, 전기영동 탱크 및 웰-형성 빗을 RNaseAway™ (Invitrogen Inc., 캘리포니아주 칼스배드)로 세정하였다. 2 μL의 RNA 샘플을 8 μL의 TE 완충제 (10 mM 트리스 HCl pH 7.0; 1 mM EDTA) 및 10 μL의 RNA 샘플 완충제 (Novagen® 카탈로그 번호 70606; EMD4 Bioscience, 뉴저지주 깁스타운)와 혼합하였다. 샘플을 70℃에서 3분 동안 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 웰 당 5 μL (1 μg 내지 2 μg RNA 함유) 로딩하였다. 분자 크기 비교를 위해 상업적으로 입수가능한 RNA 분자량 마커를 별도의 웰에서 동시에 전개시켰다. 겔을 2시간 동안 60 볼트로 전개시켰다.
무작위 프라이밍을 사용하여, 상업용 서비스 제공자 (Eurofins MWG Operon, 앨라배마주 헌츠빌)에 의해 유충의 총 RNA로부터 정규화된 cDNA 라이브러리를 제조하였다. Eurofins MWG Operon에서 GS FLX 454 Titanium™ 시리즈 화학에 의해 1/2 플레이트 규모로 정규화된 유충 cDNA 라이브러리를 서열분석하여, 평균 판독물 길이가 348 bp인 600,000개 초과의 판독물을 생성하였다. 350,000개의 판독물을 50,000개 초과의 콘티그로 조립하였다. 공중이 이용가능한 프로그램인 FORMATDB (NCBI로부터 이용가능)를 사용하여 조립되지 않은 판독물 및 콘티그 둘 다를 BLASTable 데이터베이스로 전환시켰다.
다른 WCR 발생 단계에서 수거된 물질로부터 총 RNA 및 정규화된 cDNA 라이브러리를 유사하게 제조하였다. 다양한 발생 단계를 나타내는 cDNA 라이브러리 구성원을 조합함으로써 타겟 유전자 스크리닝을 위한 풀링된 전사체 라이브러리를 구축하였다.
RNAi 타겟화를 위한 후보 유전자가 해충 곤충에서의 생존 및 성장에 필수적인 것이라고 가정하였다. 하기 기재된 바와 같은 전사체 서열 데이터베이스에서 선택된 타겟 유전자 상동체를 식별하였다. 타겟 유전자의 전장 또는 부분적 서열을 PCR에 의해 증폭시켜 이중-가닥 RNA (dsRNA) 생산을 위한 주형을 제조하였다.
조립되지 않은 디아브로티카 서열 판독물 또는 조립된 콘티그를 함유하는 BLASTable 데이터베이스에 대해 후보 단백질 코딩 서열을 사용하여 TBLASTN 검색을 실행하였다. NCBI 비-중복 데이터베이스에 대해 BLASTX를 사용함으로써 (콘티그 상동성의 경우, e-20 보다 우수한 것, 및 조립되지 않은 서열 판독물 상동성의 경우, e-10 보다 우수한 것으로 정의되는) 디아브로티카 서열에 대한 유의한 히트를 확증하였다. 이러한 BLASTX 검색 결과를 통해, TBLASTN 검색에서 식별된 디아브로티카 상동체 후보 유전자 서열이 실제로 디아브로티카 유전자를 포함하거나, 또는 디아브로티카 서열에 존재하는 비-디아브로티카 후보 유전자 서열에 대한 최상의 히트라는 것을 확증하였다. 몇몇 경우에, 비-디아브로티카 후보 유전자에 대한 상동성에 의해 선택된 디아브로티카 콘티그 또는 조립되지 않은 서열 판독물 중 일부는 중첩되었고, 콘티그의 조립체는 이들 중첩부를 연결하지 못했다는 것이 명확하였다. 그러한 경우에, Sequencher™ v4.9 (Gene Codes Corporation, 미시간주 앤 아버)를 사용하여 서열을 보다 긴 콘티그로 조립하였다.
디아브로티카 rpII33 (서열번호:1 및 서열번호:3)을 코딩하는 여러가지 후보 타겟 유전자를 WCR에서 딱정벌레류 해충 사멸, 성장 억제, 발생 억제, 및/또는 섭식 억제를 야기할 수 있는 유전자로서 식별하였다.
서열번호:1 및 서열번호:3의 폴리뉴클레오티드는 신규하다. 상기 서열은 공공 데이터베이스에 제공되어 있지 않으며, PCT 국제 특허 공개 번호 WO/2011/025860; 미국 특허 출원 번호 20070124836; 미국 특허 출원 번호 20090306189; 미국 특허 출원 번호 US20070050860; 미국 특허 출원 번호 20100192265; 미국 특허 번호 7,612,194; 또는 미국 특허 출원 번호 2013192256에 개시되어 있지 않다. 디아브로티카 rpII33-1 (서열번호:1)은 드로소필라 윌리스토니(Drosophila willistoni)(GENBANK 수탁 번호 XM_002064757.1)의 서열 단편과 다소 관련이 있다. GENBANK에서 발견된 디아브로티카 rpII33-2 (서열번호:3)에 대해 유의한 상동성 뉴클레오티드 서열이 없었다. 디아브로티카 rpII33-1 아미노산 서열 (서열번호:2)의 가장 근접한 상동체는 GENBANK 수탁 번호 XP_001659470.1을 갖는 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) 단백질이다 (94% 유사; 상동성 영역에 걸쳐 87% 동일). 디아브로티카 rpII33-2 아미노산 서열 (서열번호:4)의 가장 근접한 상동체는 GENBANK 수탁 번호 AAE63493.1을 갖는 덴드록토누스 폰데로사에(Dendroctonus ponderosae) 단백질이다 (96% 유사; 상동성 영역에 걸쳐 91% 동일).
rpII33 dsRNA 트랜스젠은 풍부한 RNAi 타겟화 및 상승작용적 RNAi 효과를 제공하기 위해 다른 dsRNA 분자와 조합될 수 있다. rpII33을 타겟화하는 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 옥수수 사건은 옥수수 뿌리벌레에 의한 뿌리 섭식 피해를 방지하는데 유용하다. rpII33 dsRNA 트랜스젠은 곤충 저항성 관리 유전자 피라미드에서 바실루스 투린기엔시스 살곤충 단백질 기술과의 조합을 위한 새로운 작용 방식을 나타내어 이들 뿌리벌레 방제 기술 중 어느 하나에 대해 저항성인 뿌리벌레 집단의 발생을 경감시킨다.
실시예 3: dsRNA 생산 목적 타겟 유전자의 증폭
rpII33 후보 유전자의 서열의 전장 또는 부분적인 클론을 사용하여, dsRNA 합성을 위한 PCR 앰플리콘을 생성하였다. PCR에 의해 각각의 타겟 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키도록 프라이머를 설계하였다. 표 1을 참조한다. 적절한 경우에, T7 파지 프로모터 서열 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA; 서열번호:9)을 증폭된 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 말단 내로 편입시켰다. 표 1을 참조한다. 총 RNA를 TRIzol® (Life Technologies, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 사용하여 WCR로부터 추출한 다음, SuperScriptIII® 제1-가닥 합성 시스템 및 제조업체 Oligo dT 프라임 지침 (Life Technologies, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 사용하여 제1-가닥 cDNA를 제조하는데 사용하였다. 제1-가닥 cDNA는 천연 타겟 유전자 서열의 전부 또는 일부를 증폭시키도록 배치된 대향 프라이머를 사용하는 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. 또한 황색 형광 단백질 (YFP)에 대한 코딩 영역을 포함하는 DNA 클론 (서열번호:10; Shagin 등 (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50)으로부터 dsRNA를 증폭시켰다.
예시적인 rpII-33 타겟 유전자 및 YFP 음성 대조군 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머 및 프라이머 쌍.
유전자 ID 프라이머 ID 서열
쌍 1 rpII33-1 Reg1 Dvv-rpII33-1_For TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAATTCCTTGCCCATCGAATTG (서열번호:11)
Dvv-rpII33-1_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTATATTCAGCTTCGTATTGATC (서열번호:12)
쌍 2 rpII33-2 Reg1 Dvv-rpII33-2_For TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTCTCAGTGATGAATTTTTAGCAC (서열번호:13)
Dvv-rpII33-2_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAGTTATATGGAGCTTCATACTG (서열번호:14)
쌍 3 rpII33-2 v1 Dvv-rpII33-2 v1_For TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTTAGATGTAAAATGTACAGATG (서열번호:15)
Dvv-rpII33-2 v1_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTTTCACCATACTCTGAG (서열번호:16)
쌍 4 rpII33-2 v2 Dvv-rpII33-2_v2_For TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGTATGCCAAAAAAGGCTTTG (서열번호:17)
Dvv-rpII33-2_v2_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGCCATTCGTCTGGTTTAGG (서열번호:18)
쌍 5 YFP YFP-F_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAcaccatgggctccagcggcgccc (서열번호:26)
YFP-R_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAagatcttgaaggcgctcttcagg (서열번호:29)
실시예 4: RNAi 구축물
PCR에 의한 주형 제조 및 dsRNA 합성.
rpII33 및 YFP dsRNA 생산을 위한 특이적 주형을 제공하는데 사용된 전략을 도 1에 제시한다. rpII33 dsRNA 합성에 사용하고자 의도된 주형 DNA는 표 1에서의 프라이머 쌍 및 (PCR 주형으로서) WCR 알, 제1령 유충, 또는 성충으로부터 단리된 총 RNA로부터 제조된 제1 가닥 cDNA를 사용한 PCR에 의해 제조하였다. 각각의 선택된 rpII33 및 YFP 타겟 유전자 영역에 대해, PCR 증폭은 증폭된 센스 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 도입하였다 (YFP 절편은 YFP 코딩 영역의 DNA 클론으로부터 증폭시킴). 이어서, 타겟 유전자의 각 영역에 대한 2개의 PCR 증폭된 단편을 대략 동일한 양으로 혼합하고, 혼합물을 dsRNA 생산을 위한 전사 주형으로서 사용하였다. 도 1을 참조한다. 특정한 프라이머 쌍으로 증폭시킨 dsRNA 주형의 서열은 다음과 같았다: 서열번호:5 (rpII33-1 reg1), 서열번호:6 (rpII33-2 reg1), 서열번호:7 (rpII33-2 ver1), 서열번호:8 (rpII33-2 v2), 및 YFP (서열번호:10). 제조업체의 지침에 따라 Ambion® MEGAscript® RNAi 키트 (Invitrogen) 또는 제조업체의 지침에 따라 HiScribe® T7 In Vitro Transcription Kit (New England Biolabs, 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 곤충 생물검정을 위한 이중-가닥 RNA를 합성하고 정제하였다. NanoDrop™ 8000 분광광도계 (Thermo Scientific, 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 dsRNA의 농도를 측정하였다.
식물 형질전환 벡터의 구축.
화학적으로 합성된 단편 (DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크) 및 표준 분자 클로닝 방법의 조합을 사용하여, rpII33의 절편(서열번호:1, 서열번호:3, 서열번호:76, 또는 서열번호:78)을 포함하는 헤어핀 형성을 위한 타겟 유전자 구축물을 보유하는 진입 벡터를 조립하였다. (단일 전사 단위 내에서) rpII33 타겟 유전자 절편의 2개의 카피를 서로 대향 배향으로 배열함으로써 RNA 일차 전사물에 의한 분자내 헤어핀 형성을 용이하게 하며, 상기 2개의 절편은 링커 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열번호:107, 및 ST-LS1 인트론 (Vancanneyt 등 (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50))에 의해 분리되어 있다. 따라서, 일차 mRNA 전사물은 인트론 서열에 의해 분리된, 서로의 큰 역위 반복부로서 2개의 rpII33 유전자 절편 서열을 함유한다. 프로모터의 카피 (예를 들어, 메이즈 유비퀴틴 1, 미국 특허 제5,510,474호; 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S; 사탕수수 간균형 바드나바이러스(sugarcane bacilliform badnavirus) 프로모터; 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 메이즈 H3 히스톤 프로모터; ALS 프로모터; 파세올린 유전자 프로모터; cab; 루비스코; LAT52; Zm13; 및/또는 apg)를 사용하여 일차 mRNA 헤어핀 전사물의 생산을 구동하고, 3' 비번역 영역(예를 들어, 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자 (ZmPer5 3'UTR v2; 미국 특허 제6,699,984호), AtUbi10, AtEf1, 또는 StPinII)을 포함하는 단편을 사용하여 헤어핀-RNA-발현 유전자의 전사를 종결시킨다.
진입 벡터 pDAB126158 및 pDAB126159은 rpII33의 절편(서열번호:7 및 8)을 포함하는 rpII33-RNA 구축물 (각각, 서열번호:103 및 104)을 포함한다.
상술한 진입 벡터를 통상적인 이원 목표 벡터와의 표준 GATEWAY® 재조합 반응에 사용하여 아그로박테리움-매개 메이즈 배아 형질전환을 위한 rpII33 헤어핀 RNA를 생산한다.
이원 목표 벡터는 식물 작동가능한 프로모터 (예를 들어, 사탕수수 간균형 바드나바이러스 (ScBV) 프로모터(Schenk 등 (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) 및 ZmUbi1(미국 특허 제5,510,474호))의 조절 하의 제초제 내성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (미국 특허 제7,838,733호(B2), 및 Wright 등 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5)를 포함한다. 5'UTR 및 인트론은 프로모터 절편의 3' 말단과 AAD-1 코딩 영역의 개시 코돈 사이에 배치된다. 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 제7,179,902호)을 포함하는 단편을 사용하여 AAD-1 mRNA의 전사를 종결시킨다.
YFP 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는, 음성 대조군 이원 벡터를 전형적인 이원 목표 벡터 및 진입 벡터와의 표준 GATEWAY® 재조합 반응에 의해 구축한다. 이원 목표 벡터는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 조절 하의 제초제 내성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (상기와 같음) 및 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역(ZmLip 3'UTR; 상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
실시예 5: 후보 타겟 유전자의 스크리닝
실시예 2에서 식별된 타겟 유전자 서열을 억제하도록 설계된 합성 dsRNA는 먹이-기반 검정에서 WCR에게 투여되었을 때 사멸 및 성장 억제를 유발하였다.
반복된 생물검정은 rpII33-2 reg1, rpII33-2 v1, 및 rpII33-2 v2으로부터 유래된 dsRNA 제제의 섭취가 각각 서부 옥수수 뿌리벌레 유충의 사멸 및 성장 억제를 야기한다는 것을 입증하였다. 표 2 및 표 3은 이들 dsRNA에 대한 9-일 노출 후 WCR 유충의 먹이-기반 섭식 생물검정의 결과, 뿐만 아니라 황색 형광 단백질 (YFP) 코딩 영역 (서열번호:10)으로부터 제조된 dsRNA의 음성 대조군 샘플에 의해 수득된 결과를 제시한다.
섭식 9일 후에 서부 옥수수 뿌리벌레 유충에 의해 수득된 rpII33 dsRNA 먹이 섭식 검정의 결과. ANOVA 분석은 평균 사멸률% 및 평균 성장 억제% (GI)에서의 유의차를 발견하였다. 평균은 투키-크레이머(Tukey-Kramer) 검정을 사용하여 분리하였다.
유전자 명칭 용량
(ng/cm 2 ) 		N 평균 (사멸률%)
± SEM* 		평균 (GI)
± SEM
rpII33-2 Reg1 500 2 97.06±2.94 (A) 1.00±0.01 (A)
rpII33-2 v1 500 10 88.83±3.09 (A) 0.97±0.01 (A)
rpII33-2 v2 500 10 89.41±1.18 (A) 0.94±0.02 (A)
TE** 0 13 13.62±2.30 (B) 0.06±0.06 (B)
물 0 13 18.32±3.19 (B) -0.03±0.07 (B)
YFP*** 500 13 14.87±2.37 (B) -0.04±0.08 (B)
*SEM = 평균의 표준 오차. 괄호 안의 문자는 통계적 수준을 지정한다. 동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의하게 상이하다 (P<0.05).
**TE = 트리스 HCl (1 mM) 플러스 EDTA (0.1 mM) 완충제, pH7.2.
***YFP = 황색 형광 단백질
WCR 유충에 대한 rpII33 dsRNA의 경구 효력 (ng/cm2)의 요약.
유전자 명칭 LC 50 범위 GI 50 범위
rpII33-2_v1 6.63 8.80 - 11.57 7.03 3.57 - 13.84
rpII33-2_v2 15.84 20.6 - 26.77 15.76 8.38 - 29.64
디아브로티카 종의 소정의 유전자가 RNAi-매개 곤충 방제에 사용될 수 있다는 것은 이전에 시사된 바 있다. 906 개의 서열이 개시되어 있는 미국 특허 공개 번호 제2007/0124836호 및 9,112개의 서열이 개시되어 있는 미국 특허 제7,612,194호를 참조한다. 그러나, RNAi-매개 곤충 방제에 유용한 것으로 시사된 많은 유전자는 디아브로티카를 방제하는데 있어서는 효과가 없는 것으로 결정되었다. 또한, 서열 rpII33-2 v1, rpII33-2 v2, 및 rpII33-2 reg1은 각각 RNAi-매개 곤충 방제에 유용한 것으로 시사된 다른 유전자와 비교하여, 놀라우면서 예상외의 우수한 디아브로티카 방제를 제공하는 것으로 결정되었다.
예를 들어, 미국 특허 제7,612,194호에서 아넥신, 베타 스펙트린 2 및 mtRP-L4는 각각 RNAi-매개 곤충 방제에 효과가 있는 것으로 시사되었다. 서열번호:20은 아넥신 영역 1 (Reg 1)의 DNA 서열이고, 서열번호:21은 아넥신 영역 2 (Reg 2)의 DNA 서열이다. 서열번호:22는 베타 스펙트린 2 영역 1 (Reg 1)의 DNA 서열이고, 서열번호:23은 베타 스펙트린 2 영역 2 (Reg 2)의 DNA 서열이다. 서열번호:24는 mtRP-L4 영역 1 (Reg 1)의 DNA 서열이고, 서열번호:25는 mtRP-L4 영역 2 (Reg 2)의 DNA 서열이다. YFP 서열 (서열번호:10)은 또한 음성 대조군으로서의 dsRNA를 생산하는데 사용되었다.
각각의 상기 언급된 서열을 사용하여 실시예 3의 방법에 의해 dsRNA를 생산하였다. dsRNA 생산을 위한 특이적 주형을 제공하는데 사용된 전략은 도 2에 제시되어 있다. dsRNA 합성에 사용하고자 의도된 주형 DNA는 표 4에서의 프라이머 쌍 및 (PCR 주형으로서) WCR 제1령 유충으로부터 단리된 총 RNA로부터 제조된 제1 가닥 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. (YFP는 DNA 클론으로부터 증폭시킴.) 각각의 선택된 타겟 유전자 영역에 대해, 2회의 개별 PCR 증폭을 수행하였다. 제1 PCR 증폭에서는 증폭된 센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 도입하였다. 제2 반응에서는 안티센스 가닥의 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 혼입시켰다. 이어서, 타겟 유전자의 각 영역에 대한 2개의 PCR 증폭된 단편을 대략 동일한 양으로 혼합하고, 혼합물을 dsRNA 생산을 위한 전사 주형으로서 사용하였다. 도 2를 참조한다. 제조업체의 지침에 따라 Ambion® MEGAscript® RNAi 키트(Invitrogen)를 사용하여 이중-가닥 RNA를 합성하고 정제하였다. NanoDrop™ 8000 분광광도계 (Thermo Scientific, 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 dsRNA의 농도를 측정하고, dsRNA를 각각 상기 기재된 것과 동일한 먹이-기반 생물검정 방법에 의해 시험하였다. 표 4는 아넥신 Reg1, 아넥신 Reg2, 베타 스펙트린 2 Reg1, 베타 스펙트린 2 Reg2, mtRP-L4 Reg1, mtRP-L4 Reg2, 및 YFP dsRNA 분자를 생산하는데 사용된 프라이머의 서열을 열거한다. 표 5에서는 이들 dsRNA 분자에의 9-일 노출 후 WCR 유충의 먹이-기반 섭식 생물검정 결과가 제시한다. 반복된 생물검정은 이들 dsRNA 섭취가 TE 완충제, 물 또는 YFP 단백질의 대조군 샘플에서 보인 것을 초과하는 서부 옥수수 뿌리벌레 유충의 사멸 또는 성장 억제를 야기하지 않았음을 입증하였다.
유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머 및 프라이머 쌍.
유전자
(영역) 		프라이머 ID 서열
쌍 6 YFP YFP-F_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACACCATGGGCTCCAGCGGCGCCC (서열번호:26)
YFP YFP-R AGATCTTGAAGGCGCTCTTCAGG (서열번호:27)
쌍 7 YFP YFP-F CACCATGGGCTCCAGCGGCGCCC (서열번호:28)
YFP YFP-R_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGATCTTGAAGGCGCTCTTCAGG (서열번호:29)
쌍 8 아넥신
(Reg 1)		 Ann-F1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTCCAACAGTGGTTCCTTATC (서열번호:30)
아넥신
(Reg 1)		 Ann-R1 CTAATAATTCTTTTTTAATGTTCCTGAGG (서열번호:31)
쌍 9 아넥신
(Reg 1)		 Ann-F1 GCTCCAACAGTGGTTCCTTATC (서열번호:32)
아넥신
(Reg 1)		 Ann-R1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTAATAATTCTTTTTTAATGTTCCTGAGG (서열번호:33)
쌍 10 아넥신
(Reg 2)		 Ann-F2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGTTACAAGCTGGAGAACTTCTC (서열번호:34)
아넥신
(Reg 2)		 Ann-R2 CTTAACCAACAACGGCTAATAAGG (서열번호:35)
쌍 11 아넥신
(Reg 2)		 Ann-F2 TTGTTACAAGCTGGAGAACTTCTC (서열번호:36)
아넥신
(Reg 2)		 Ann-R2T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTAACCAACAACGGCTAATAAGG (서열번호:37)
쌍 12 Beta-spect2
(Reg 1)		 Betasp2-F1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGATGTTGGCTGCATCTAGAGAA (서열번호:38)
Beta-spect2
(Reg 1)		 Betasp2-R1 GTCCATTCGTCCATCCACTGCA (서열번호:39)
쌍 13 Beta-spect2
(Reg 1)		 Betasp2-F1 AGATGTTGGCTGCATCTAGAGAA (서열번호:40)
Beta-spect2
(Reg 1)		 Betasp2-R1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTCCATTCGTCCATCCACTGCA (서열번호:41)
쌍 14 Beta-spect2
(Reg 2)		 Betasp2-F2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGATGAACACCAGCGAGAAA (서열번호:42)
Beta-spect2
(Reg 2)		 Betasp2-R2 CTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC (서열번호:43)
쌍 15 Beta-spect2
(Reg 2)		 Betasp2-F2 GCAGATGAACACCAGCGAGAAA (서열번호:44)
Beta-spect2
(Reg 2)		 Betasp2-R2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC (서열번호:45)
쌍 16 mtRP-L4
(Reg 1)		 L4-F1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTGAAATGTTAGCAAATATAACATCC (서열번호:46)
mtRP-L4
(Reg 1)		 L4-R1 ACCTCTCACTTCAAATCTTGACTTTG (서열번호:47)
쌍 17 mtRP-L4
(Reg 1)		 L4-F1 AGTGAAATGTTAGCAAATATAACATCC (서열번호:48)
mtRP-L4
(Reg 1)		 L4-R1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCTCTCACTTCAAATCTTGACTTTG (서열번호:49)
쌍 18 mtRP-L4
(Reg 2)		 L4-F2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAAGTCAAGATTTGAAGTGAGAGGT (서열번호:50)
mtRP-L4
(Reg 2)		 L4-R2 CTACAAATAAAACAAGAAGGACCCC (서열번호:51)
쌍 19 mtRP-L4
(Reg 2)		 L4-F2 CAAAGTCAAGATTTGAAGTGAGAGGT (서열번호:52)
mtRP-L4
(Reg 2)		 L4-R2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTACAAATAAAACAAGAAGGACCCC (서열번호:53)
9일 후 서부 옥수수 뿌리벌레 유충에 의해 수득된 먹이 섭식 검정의 결과.
유전자 명칭 용량 (ng/cm 2 ) 평균 살아있는
유충 중량 (mg) 		평균 %
사멸률 		평균 성장 억제
아넥신 -Reg 1 1000 0.545 0 -0.262
아넥신 -Reg 2 1000 0.565 0 -0.301
베타 스펙트린2 Reg 1 1000 0.340 12 -0.014
베타 스펙트린2 Reg 2 1000 0.465 18 -0.367
mtRP-L4 Reg 1 1000 0.305 4 -0.168
mtRP-L4 Reg 2 1000 0.305 7 -0.180
TE 완충제* 0 0.430 13 0.000
물 0 0.535 12 0.000
YFP** 1000 0.480 9 -0.386
*TE = 트리스 HCl (10 mM) 플러스 EDTA (1 mM) 완충제, pH8.
**YFP = 황색 형광 단백질
실시예 6: 살곤충 dsRNA를 포함하는 트랜스제닉 메이즈 조직의 생산
아그로박테리움 -매개 형질전환. 아그로박테리움-매개 형질전환 후, 식물 게놈 내로 안정적으로 편입된 키메라 유전자의 발현을 통해 하나 이상의 살곤충 dsRNA 분자 (예를 들어, rpII33 (예를 들어, 서열번호:1, 서열번호:3)를 포함하는 유전자를 타겟화하는 dsRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 dsRNA 분자)를 생산하는 트랜스제닉 메이즈 세포, 조직 및 식물을 생산하였다. 초이원 또는 이원 형질전환 벡터를 사용하는 메이즈 형질전환 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제8,304,604호에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 형질전환된 조직을 할록시포프(Haloxyfop)-함유 배지에서 성장하는 능력에 의해 선택하고, 적절한 경우에 dsRNA 생산에 대해 스크리닝하였다. 이러한 형질전환된 조직 배양물의 부분은, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 생물검정을 위한 신생 옥수수 뿌리벌레 유충에게 제공한다.
아그로박테리움 배양 개시. 상기 (실시예 4)에 기재된 이원 형질전환 벡터를 보유하는 아그로박테리움 균주 DAt13192 세포 (PCT 국제 특허 공개 번호 WO 2012/016222A2)의 글리세롤 스톡을 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 상에 스트리킹하고 (Watson, 등. (1975) J. Bacteriol. 123:255-264), 3일 동안 20℃에서 성장시킨다. 이어서, 배양물을 동일한 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 (gm/L: 효모 추출물, 10; 펩톤, 10; NaCl, 5) 상에 스트리킹하고, 1일 동안 20℃에서 인큐베이션한다.
아그로박테리움 배양. 실험 당일에, 접종 배지의 원액 및 아세토시린곤을 실험에서의 구축물 수에 적절한 부피로 준비하고, 멸균 일회용 250 mL 플라스크 내로 피펫팅한다. 접종 배지 (Frame 등 (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341)는 다음을 함유하고 있다: 2.2 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민 (Frame 등, 상기 문헌); 68.4 gm/L 수크로스; 36 gm/L 글루코스; 115 mg/L L-프롤린; 및 100 mg/L 미오-이노시톨; pH 5.4). 아세토시린곤을 접종 배지를 함유하는 플라스크에 100% 디메틸 술폭시드 중 1 M 원액으로부터 200 μM의 최종 농도로 첨가하고, 용액을 철저히 혼합한다.
각각의 구축물에 대해, YEP 플레이트로부터의 아그로박테리움의 1 또는 2 접종 루프-풀을 멸균 일회용 50 mL 원심분리 튜브 내의 15 mL의 접종 배지/아세토시린곤 원액에 현탁시키고, 550 nm에서의 용액의 광학 밀도 (OD550)를 분광광도계에서 측정한다. 이어서, 현탁액을 추가의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물을 사용하여 0.3 내지 0.4의 OD550으로 희석시킨다. 이어서, 아그로박테리움 현탁액의 튜브를 실온에서 약 75 rpm으로 설정된 플랫폼 진탕기 상에 수평으로 놓고, 배아 절개를 수행하면서 1 내지 4시간 동안 진탕시킨다.
이삭 멸균 및 배아 단리. 메이즈 미성숙 배아를 온실에서 성장시킨 제아 메이스 근교계 B104의 식물 (Hallauer 등 (1997) Crop Science 37:1405-1406)로부터 수득하고, 자기- 또는 형매-수분시켜 이삭을 생산한다. 수분후(post-pollination) 대략 10 내지 12일에 이삭을 수확한다. 실험 당일에, 도정된 이삭을 상업용 표백제 (Ultra Clorox® Germicidal Bleach(살균 표백제), 6.15% 차아염소산나트륨; 트윈(TWEEN) 20 2 방울 포함)의 20% 용액 중에 침지시키고, 20 내지 30분 동안 진탕시키고, 이어서 층류 후드 내부의 멸균 탈이온수 중에서 3회 헹구어 표면-멸균한다. 미성숙 접합 배아 (1.8 내지 2.2 mm 길이)를 각 이삭으로부터 무균 절개하고, 2 μL의 10% BREAK-THRU® S233 계면활성제 (Evonik Industries; 독일 에센)가 첨가되는, 200 μM 아세토시린곤을 갖는 액체 접종 배지에 적절한 아그로박테리움 세포의 현탁액 2.0 mL를 함유하는 마이크로원심분리 튜브 내로 무작위로 분배한다. 주어진 실험 세트를 위해, 풀링된 이삭으로부터의 배아를 각 형질전환에 사용한다.
아그로박테리움 공동-배양. 단리 후에, 배아를 5분 동안 로커 플랫폼 상에 놓는다. 이어서, 튜브의 내용물을 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바 (3,6-디클로로-o-아니스산 또는 3,6-디클로로-2-메톡시벤조산); 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO3; DMSO 중 200 μM 아세토시린곤; 및 3 gm/L GELZAN™, pH 5.8을 함유하는, 공동-배양 배지(Co-cultivation Medium)의 플레이트 상에 붓는다. 액체 아그로박테리움 현탁액을 멸균 일회용 전달 피펫으로 제거한다. 이어서, 배아를 현미경의 보조 하에 멸균 겸자를 사용하여 배반이 상부를 향하도록 배향시킨다. 플레이트를 닫고, 3M™ MICROPORE™ 의료 테이프로 밀봉하고, 광합성 유효 방사선 (Photosynthetically Active Radiation, PAR)의 대략 60 μmol m-2s-1 에서의 연속광이 있는 25℃의 인큐베이터에 놓는다.
트랜스제닉 사건의 캘러스 선택 및 재생. 공동-배양 기간 후에, 배아를 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바; 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO3; 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 1수화물; PhytoTechnologies Labr.; 캔자스주 레넥사); 250 mg/L 카르베니실린; 및 2.3 gm/L Gelzan™; pH 5.8으로 구성된, 휴지 배지(Resting Medium)로 옮겼다. 36개 이하의 배아를 각 플레이트로 이동시킨다. 플레이트를 투명 플라스틱 상자에 넣고, 7 내지 10일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광이 있는 27℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 100 nM R-할록시포프 산 (0.0362 mg/L; AAD-1 유전자를 보유하는 캘러스의 선택을 위함)을 갖는 휴지 배지 (상기)로 구성된, 선택 배지 I(Selection Medium I) 상에 캘러스화 배아를 옮긴다 (<18/플레이트). 플레이트를 투명한 상자로 복귀시키고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광이 있는 27℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 500 nM R-할록시포프 산 (0.181 mg/L)을 갖는 휴지 배지 (상기)로 구성된, 선택 배지 II에 캘러스화 배아를 옮긴다 (<12/플레이트). 플레이트를 투명한 상자로 복귀시키고, 14일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광이 있는 27℃에서 인큐베이션한다. 이러한 선택 단계는 트랜스제닉 캘러스가 추가로 증식하고 분화될 수 있게 한다.
증식 중인 배아발생 캘러스를 사전-재생(Pre-Regeneration) 배지에 옮긴다 (<9/플레이트). 사전-재생 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 45 gm/L 수크로스; 350 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 미오-이노시톨; 50 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 1.0 mg/L AgNO3; 0.25 gm/L MES; NaOH 중 0.5 mg/L 나프탈렌아세트산; 에탄올 중 2.5 mg/L 아브시스산; 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린; 250 mg/L 카르베니실린; 2.5 gm/L Gelzan™; 및 0.181 mg/L 할록시포프 산; pH 5.8을 함유한다. 플레이트를 투명한 상자에 보관하고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광이 있는 27℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 재생 캘러스를 Phytatrays™ (sigma-aldrich) 내의 재생 배지에 옮기고 (<6/플레이트), 14일 동안 또는 싹 및 뿌리가 발생할 때까지 (대략 160 μmol m-2s-1 PAR에서) 일당 16시간 명기/8시간 암기 하에 28℃에서 인큐베이션한다. 재생 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 60 gm/L 수크로스; 100 mg/L 미오-이노시톨; 125 mg/L 카르베니실린; 3 gm/L Gellan™ 검; 및 0.181 mg/L R-할록시포프 산; pH 5.8을 함유한다. 이어서, 일차 뿌리를 갖는 작은 싹을 단리하고, 선택 없이 신장 배지(Elongation Medium)로 옮긴다. 신장 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 및 3.5 gm/L Gelrite™: pH 5.8를 함유한다.
할록시포프를 함유하는 배지 상에서 성장하는 능력에 의해 선택된 형질전환된 식물 싹을 Phytatrays™로부터 성장 배지 (ProMix BX; Premier Tech Horticulture)로 채워진 작은 용기로 이식하고, 컵 또는 HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS)로 덮고, 이어서 Conviron 성장 챔버 (27℃ 낮/24℃ 밤, 16-시간 광주기, 50-70% RH, 200 μmol m-2s-1 PAR)에서 강화시킨다. 일부 경우에, 추정 트랜스제닉 소식물체를 메이즈 게놈 내로 편입된 AAD1 제초제 내성 유전자를 검출하도록 설계된 프라이머를 사용하는 정량적 실시간 PCR 검정에 의해 트랜스젠 상대 카피수에 대해 분석한다. 추가로, RT-qPCR 검정을 사용하여 추정 형질전환체의 링커 서열의 존재 및/또는 타겟 서열의 존재를 검출한다. 선택된 형질전환된 소식물체를 추가의 성장 및 시험을 위해 온실 내로 이동시킨다.
생물검정 및 종자 생산을 위한 온실에서의 T 0 식물의 전달 및 확립. 식물이 V3-V4 단계에 도달했을 때, 이를 IE Custom Blend (PROFILE/METRO MIX 160) 토양 혼합물로 이식하고, 성장시켜 온실 (광 노출 유형: 광 또는 동화; 높은 광 한계: 1200 PAR; 16-시간 낮 길이; 27℃ 낮/24℃ 밤)에서 개화시킨다.
곤충 생물검정에 사용할 식물을 작은 용기로부터 Tinus™ 350-4 Rootrainers® (Spencer-Lemaire Industries, 캐나다 앨버타주 애치슨)로 이식한다 (Rootrainer® 당 사건당 1그루의 식물). Rootrainers®로 이식한지 대략 4일 후에, 생물검정을 위해 식물을 침입시킨다.
T1 세대의 식물은 비-트랜스제닉 우량 근교계 B104의 식물로부터 수집한 화분 또는 다른 적절한 화분 공여자를 사용하여 T0 트랜스제닉 식물의 수염을 수분시키고 생성된 종자를 식재함으로써 수득한다. 가능할 때 상반 교배를 수행한다.
실시예 7: 트랜스제닉 메이즈 조직의 분자 분석
뿌리 섭식 피해를 평가하는 전날 또는 당일에 온실에서 성장한 식물로부터 수집한 잎으로부터의 샘플에 대해 메이즈 조직의 분자 분석 (예를 들어 RT-qPCR)을 수행한다.
타겟 유전자에 대한 RT-qPCR 검정의 결과를 사용하여 헤어핀 트랜스젠의 발현을 검증한다. 발현된 RNA에서 반복 서열 사이의 개재 서열 (dsRNA 헤어핀 분자의 형성에 필수적임)에 대한 RT-qPCR 검정의 결과를 사용하여 헤어핀 전사물의 존재를 검증한다. 트랜스젠 RNA 발현 수준을 내인성 메이즈 유전자의 RNA 수준에 대해 측정한다.
gDNA에서 AAD1 코딩 영역의 부분을 검출하기 위한 DNA qPCR 분석을 사용하여 트랜스젠 삽입 카피수를 예측한다. 이들 분석을 위한 샘플을 환경 챔버에서 성장시킨 식물로부터 수집한다. 결과를 단일-카피 천연 유전자의 부분을 검출하도록 설계된 검정의 DNA qPCR 결과와 비교하고, 단순 사건 (1 또는 2 카피의 rpII33 트랜스젠을 가짐)을 온실에서 추가의 연구를 위해 진행시킨다.
추가로, 스펙티노마이신-저항성 유전자 (SpecR; T-DNA 밖의 이원 벡터 플라스미드 상에 보유됨)의 부분을 검출하도록 설계된 qPCR 검정을 사용하여 트랜스제닉 식물이 이질 통합된 플라스미드 백본 서열을 함유하는지 여부를 결정한다. RNA 전사물 발현 수준: 타겟 qPCR. 캘러스 세포 사건 또는 트랜스제닉 식물을 타겟 서열의 실시간 정량적 PCR (qPCR)에 의해 분석하여, TIP41-유사 단백질 (즉, GENBANK 수탁 번호 AT4G34270의 메이즈 상동체; 74% 동일성의 tBLASTX 스코어를 가짐)을 코딩하는, 내부 메이즈 유전자 (서열번호:54; GENBANK 수탁 번호 BT069734)의 전사물 수준에 비교하여 트랜스젠의 상대 발현 수준을 결정한다. Norgen BioTek™ Total RNA 단리 키트 (Norgen, 온타리오주 쏘롤드)를 사용하여 RNA를 단리시킨다. 총 RNA를 키트의 제안된 프로토콜에 따라 온-컬럼(on-column) DNAse1 처리에 적용한다. 이어서, RNA를 NanoDrop 8000 분광광도계(Thermo Scientific) 상에서 정량화하고, 농도를 50 ng/μL로 정규화한다. 실질적으로 제조업체의 권고된 프로토콜에 따라, 5 μL의 변성된 RNA와 함께 10 μL 반응 부피로 고용량 cDNA 합성 키트 (INVITROGEN)를 사용하여 제1 가닥 cDNA를 제조한다. 조합된 무작위 프라이머 및 올리고 dT의 작업 스톡을 제조하기 위해, 무작위 프라이머 스톡 혼합물의 1 mL 튜브 내로 100 μM T20VN 올리고뉴클레오티드 (IDT) (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, 이때 V는 A, C 또는 G이고, N은 A, C, G 또는 T임; 서열번호:55)의 10 μL 첨가를 포함하도록 프로토콜을 약간 변형한다.
cDNA 합성 후에, 뉴클레아제-무함유 물을 사용하여 샘플을 1:3으로 희석하고, 검정할 때까지 -20℃에서 보관한다.
타겟 유전자 및 TIP41-유사 전사물에 대한 별개의 실시간 PCR 검정을 10 μL 반응 부피로 LightCycler™ 480 (Roche diagnostics, 인디애나주 인디애나폴리스) 상에서 수행한다. 타겟 유전자 검정을 위해, 프라이머 rpII33 v1 FWD Set 2 (서열번호:56) 및 rpII33 v1 REV Set 2 (서열번호:57), 및 FAM으로 표지된 IDT 커스텀 올리고 프로브 rpII33 v1 PRB Set 2를 사용하여 반응을 실행하고 Zen 및 Iowa Black ??처(서열번호:105)로 이중 ??치하거나; 또는 프라이머 rpII33 v2 FWD Set 2 (서열번호:111) 및 rpII33 v2 REV Set 2 (서열번호:112), 및 FAM으로 표지된 IDT 커스텀 올리고 프로브 rpII33 v2 PRB Set 2를 사용하여 반응을 실행하고 Zen 및 Iowa Black ??처(서열번호:106)로 이중 ??치한다. TIP41-유사 참조 유전자 검정을 위해, 프라이머 TIPmxF (서열번호:58) 및 TIPmxR (서열번호:59), 및 HEX (헥사클로로플루오레신)로 표지된 프로브 HXTIP (서열번호:60)를 사용한다.
모든 검정은 주형을 함유하지 않는 음성 대조군을 포함한다 (혼합물 단독). 표준 곡선을 위해, 샘플의 교차-오염을 체크하기 위해 소스 플레이트에 블랭크 (소스 웰 중 물)를 또한 포함시킨다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 6에 기재된다. 다양한 전사물의 검출을 위한 반응 성분 레시피는 표 7에 개시되고, PCR 반응 조건은 표 8에 요약된다. FAM (6-카르복시 플루오레세인 아미다이트) 형광 모이어티를 465 nm에서 여기시키고, 형광을 510 nm에서 측정하며; HEX (헥사클로로플루오레세인) 형광 모이어티에 대한 상응하는 값은 533 nm 및 580 nm이다.
트랜스제닉 메이즈에서 전사물 수준의 분자 분석을 위한 올리고뉴클레오티드 서열.
타겟 올리고뉴클레오티드 서열
rpII33-2 v1 rpII33-2 v1 FWD Set 2 GATCAAACTCGACATGTAACAACTG (서열번호:56)
rpII33-2 v1 rpII33-2 v1 REV Set 2 GGATTCATCATCACGATGTTTGG (서열번호:57)
rpII33-2 v1 rpII33-2 v1 PRB Set 2 /56-FAM/AGTGATCCA/ZEN/CGAGTCATACCAGCTACT
/3IABkFQ/ (서열번호:105)
RpII33-2 v2 RpII33-2 v2 FWD Set 2 AAAGAGCATGCCAAATGGA (서열번호:110)
RpII33-2 v2 RpII33-2 v2 REV Set 2 GGCCATTCGTCTGGTTTAG (서열번호:111)
RpII33-2 v2 RpII33-2 v2 PRB Set 2 /56-FAM/TGTGGTGTT/ZEN/GCCTTTGAATATGATCCTGA
/3IABkFQ/ (서열번호:106)
TIP41 TIPmxF TGAGGGTAATGCCAACTGGTT (서열번호:58)
TIP41 TIPmxR GCAATGTAACCGAGTGTCTCTCAA (서열번호:59)
TIP41 HXTIP
(HEX-프로브) 		TTTTTGGCTTAGAGTTGATGGTGTACTGATGA (서열번호:60)
*TIP41-유사 단백질.
전사물 검출을 위한 PCR 반응 레시피.
rpII33 TIP-유사 유전자
성분 최종 농도
로슈 완충제 1 X 1X
rpII33 (F) 0.4 μM 0
rpII33 (R) 0.4 μM 0
rpII33 (FAM) 0.2 μM 0
HEXtipZM F 0 0.4 μM
HEXtipZM R 0 0.4 μM
HEXtipZMP (HEX) 0 0.2 μM
cDNA (2.0 μL) NA NA
물 10 μL로 10 μL로
RNA qPCR을 위한 써모사이클러 조건.
타겟 유전자 및 TIP41-유사 유전자 검출
공정 온도 시간 주기 수
타겟 활성화 95 ℃ 10 분 1
변성 95 ℃ 10 초 40
연장 60 ℃ 40 초
FAM 또는 HEX 획득 72 ℃ 1 초
냉각 40 ℃ 10 초 1
LightCycler™ 소프트웨어 v1.5를 사용하여, 공급업체의 추천에 따라 Cq 값 계산을 위한 2차 도함수 최대 알고리즘을 사용하여 상대 정량화에 의해 데이터를 분석한다. 발현 분석을 위해, ΔΔCt 방법 (즉, 2-(Cq 타겟- Cq 참조))을 사용하여 발현 값을 계산하며, 이는 2개의 타겟 간의 Cq 값 차이 비교에 의존하고, 최적화된 PCR 반응의 경우, 산물은 주기마다 배가된다는 가정하에서 기준 값을 2로 선택한다.
전사물 크기 및 완전성: 노던 블롯 검정. 일부 경우에, rpII33 헤어핀 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 식물에서 rpII33 헤어핀 dsRNA의 분자 크기를 결정하기 위해 노던 블롯 (RNA 블롯) 분석을 사용하여 트랜스제닉 식물의 추가의 분자 특징화를 얻는다.
모든 재료 및 장비를 사용 전에 RNaseZAP (AMBION/INVITROGEN)으로 처리한다. 조직 샘플 (100 mg 내지 500 mg)을 2 mL 세이프록 에펜도르프 튜브에 수집하고, 5분 동안 1 mL TRIzol (INVITROGEN) 중 3개의 텅스텐 비드를 갖는 Klecko™ 조직 미분쇄기 (Garcia Manufacturing, 캘리포니아주 비살리아)로 분쇄하고, 이어서 10분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션한다. 임의적으로, 샘플을 4℃에서 10분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 신선한 2 mL 세이프록 에펜도르프 튜브 내로 옮긴다. 200 μL 클로로포름을 균질물에 첨가한 후에, 튜브를 2 내지 5분 동안 반전에 의해 혼합하고, 10분 동안 RT에서 인큐베이션하고, 4℃에서 15분 동안 12,000 x g로 원심분리한다. 최상부 상을 멸균 1.5 mL 에펜도르프 튜브 내로 옮기고, 100% 이소프로판올 600 μL를 첨가한 후, 10분 내지 2시간 동안 RT에서 인큐베이션하고 나서, 4℃ 내지 25℃에서 10분 동안 12,000 x g로 원심분리한다. 상청액을 폐기하고, RNA 펠릿을 70% 에탄올 1 mL로 2회 세척하고, 세척 사이에 4℃ 내지 25℃에서 10분 동안 7,500 x g로 원심분리한다. 에탄올을 폐기하고, 펠릿을 3 내지 5분 동안 간단히 공기 건조시킨 후에, 뉴클레아제-무함유 물 50 μL 중에 재현탁시킨다.
총 RNA를 Nanodrop 8000® (Thermo-Fisher)를 사용하여 정량화하고, 샘플을 5 μg/10 μL로 정규화한다. 이어서, 10 μL 글리옥살 (AMBION/INVITROGEN)을 각 샘플에 첨가한다. DIG RNA 표준 마커 믹스 (Roche Applied Science, 인디애나주 인디애나폴리스) 5 내지 14 ng를 분배하고, 동등 부피의 글리옥살에 첨가한다. 샘플 및 마커 RNA를 45분 동안 50℃에서 변성시키고, NorthernMax 10 X 글리옥살 전개 완충제 (AMBION/INVITROGEN) 중 1.25% SeaKem 골드 아가로스 (Lonza, 뉴저지주 앨런데일) 겔 상에 로딩할 때까지 얼음 상에 보관한다. RNA를 2시간 15분 동안 65 볼트/30 mA로 전기영동에 의해 분리한다.
전기영동 후에, 겔을 5분 동안 2X SSC 중에서 헹구고, 겔 독 스테이션 (BioRad, 캘리포니아주 허큘레스) 상에서 영상화하고 나서, RNA를 전달 완충제로서 10X SSC를 사용하여 (20X SSC는 3 M 염화나트륨 및 300 mM 시트르산삼나트륨으로 이루어짐, pH 7.0), RT에서 밤새 나일론 막 (Millipore)에 수동으로 전달한다. 전달 후에, 막을 5분 동안 2X SSC 중에서 헹구고, RNA를 막(Agilent/Stratagene)에 UV-가교시키고, 막을 최대 2일 동안 실온에서 건조되도록 한다.
막을 1 내지 2시간 동안 UltraHyb™ 완충제 (AMBION/INVITROGEN)에서 사전-혼성화시킨다. 프로브는 로슈 어플라이드 사이언스 DIG 절차에 의해 디곡시게닌(digoxigenin)으로 표지된 관심 서열 (예를 들어, 적절한 경우에 서열번호:5-8 또는 103-104의 안티센스 서열 부분)을 함유하는 PCR 증폭된 산물로 구성된다. 추천된 완충제 중에서의 혼성화는 혼성화 튜브에서 60℃의 온도에서 밤새 이루어진다. 혼성화 후에, 모두 DIG 키트의 공급업체에 의해 추천된 방법에 의해, 블롯을 DIG 세척에 적용하고, 랩핑하고, 1 내지 30분 동안 필름에 노출시키고, 이어서 필름을 현상한다.
트랜스젠 카피수 결정. 대략 2개 잎 펀치와 동등한 메이즈 잎 조각들을 96-웰 집합 플레이트 (Qiagen™)에 수집한다. 1개의 스테인레스 스틸 비드를 갖는 Biosprint96 AP1 용해 완충제 (Biosprint96 플랜트 키트로 공급됨; 퀴아젠) 중에서 Klecko™ 조직 미분쇄기 (Garcia Manufacturing, 캘리포니아주, 비살리아)를 사용하여 조직 파괴를 수행한다. 조직 온침 후에, gDNA를 Biosprint96 PLANT KIT 및 Biosprint96 추출 로봇을 사용하여 고처리량 포맷으로 단리한다. qPCR 반응을 설정하기 전에 gDNA를 1:3 DNA:물로 희석시킨다.
qPCR 분석. 가수분해 프로브 검정에 의한 트랜스젠 검출은 LightCycler®480 시스템을 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행한다. 타겟 유전자 (예를 들어, rpII33), 링커 서열을 검출하거나, 그리고/또는 SpecR 유전자 (즉, 이원 벡터 플라스미드 상에 보유된 스펙티노마이신 저항성 유전자; 서열번호:61; 표 9에서의 SPC1 올리고뉴클레오티드)의 부분을 검출하기 위한 가수분해 프로브 검정에 사용할 올리고뉴클레오티드는, LightCycler® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 사용하여 설계한다. 추가로, AAD-1 제초제 내성 유전자 의 절편(서열번호:62; 표 9에서의 GAAD1 올리고뉴클레오티드)을 검출하기 위한 가수분해 프로브 검정에 사용할 올리고뉴클레오티드는 프라이머 익스프레스 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 사용하여 설계한다. 표 9는 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다. gDNA가 각 검정에 존재한다는 것을 확실하게 하기 위해 내부 참조 서열로서의 역할을 하는, 내인성 메이즈 염색체 유전자에 대한 시약 (인버타제 (서열번호:63; GENBANK 수탁번호 U16123; 본원에서 IVR1로 지칭됨))을 사용하여 검정을 멀티플렉스화한다. 증폭을 위해, LightCycler®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스)를 0.4 μM의 각 프라이머 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1x 최종 농도로 제조한다 (표 10). 2 단계 증폭 반응을 표 11에 요약된 바와 같이 수행한다. FAM- 및 HEX-표지된 프로브에 대한 형광단 활성화 및 방출은 상기 기재된 바와 같으며; CY5 접합체는 650 nm에서 최대로 여기하고, 670 nm에서 최대로 형광을 낸다.
피트 포인트 알고리즘 (LightCycler® 소프트웨어 출시 1.5) 및 (ΔΔCt 방법에 기초한) 상대 정량적 모듈을 사용하여 실시간 PCR 데이터로부터 Cp 스코어 (형광 신호가 배경 역치와 교차하는 지점)를 결정한다. 데이터를 이전에 기재된 바와 같이 취급한다 (상기에서; RNA qPCR).
유전자 카피수 결정 및 이원 벡터 플라스미드 백본 검출에 사용된 프라이머 및 프로브 (형광 접합체 포함)의 서열.
명칭 서열
GAAD1-F TGTTCGGTTCCCTCTACCAA (서열번호:64)
GAAD1-R CAACATCCATCACCTTGACTGA (서열번호:65)
GAAD1-P (FAM) CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA (서열번호:66)
IVR1-F TGGCGGACGACGACTTGT (서열번호:67)
IVR1-R AAAGTTTGGAGGCTGCCGT (서열번호:68)
IVR1-P (HEX) CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC (서열번호:69)
SPC1A CTTAGCTGGATAACGCCAC (서열번호:70)
SPC1S GACCGTAAGGCTTGATGAA (서열번호:71)
TQSPEC (CY5*) CGAGATTCTCCGCGCTGTAGA (서열번호:72)
Loop_F GGAACGAGCTGCTTGCGTAT (서열번호:73)
Loop_R CACGGTGCAGCTGATTGATG (서열번호:74)
Loop-P (FAM) TCCCTTCCGTAGTCAGAG (서열번호:75)
CY5 = 시아닌-5
유전자 카피수 분석 및 플라스미드 백본 검출을 위한 반응 성분.
성분 양 (μL) 스톡 최종 농도
2x 완충제 5.0 2x 1x
적절한 정방향 프라이머 0.4 10 μM 0.4
적절한 역방향 프라이머 0.4 10 μM 0.4
적절한 프로브 0.4 5 μM 0.2
IVR1-정방향 프라이머 0.4 10 μM 0.4
IVR1-역방향 프라이머 0.4 10 μM 0.4
IVR1-프로브 0.4 5 μM 0.2
H2O 0.6 NA* NA
gDNA 2.0 ND** ND
합계 10.0
*NA = 적용가능하지 않음
**ND = 결정되지 않음
DNA qPCR을 위한 써모사이클러 조건.
게놈 카피수 분석
공정 온도 시간 주기 수
타겟 활성화 95 ℃ 10 분 1
변성 95 ℃ 10 초 40
연장 & 획득
FAM, HEX, 또는 CY5		 60 ℃ 40 초
냉각 40 ℃ 10 초 1
실시예 8: 트랜스제닉 메이즈의 생물검정
곤충 생물검정. 식물 세포에서 생산된 본 발명의 dsRNA의 생물활성을 생물검정 방법에 의해 입증한다. 예를 들어, Baum 등 (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326을 참조한다. 예를 들어, 살곤충 dsRNA를 생산하는 식물로부터 유래된 다양한 식물 조직 또는 조직 조각을 제어된 섭식 환경에서 타겟 곤충에게 섭식시킴으로써, 효능을 입증할 수 있다. 대안적으로, 살곤충 dsRNA를 생산하는 식물로부터 유래된 다양한 식물 조직으로부터 추출물을 제조하고, 추출된 핵산을 본원에서 이전에 기재된 바와 같은 생물검정을 위한 인공 먹이의 상단에 분배한다. 이러한 섭식 검정의 결과를, 살곤충 dsRNA를 생산하지 않는 숙주 식물로부터의 적절한 대조군 조직을 사용하여 유사하게 수행된 생물검정과, 또는 다른 대조군 샘플과 비교한다. 시험 먹이 상에서의 타겟 곤충의 성장 및 생존은 대조군의 그것에 비해 감소된다.
트랜스제닉 메이즈 사건을 사용한 곤충 생물검정. 세척한 알로부터 부화한 2마리의 서부 옥수수 뿌리벌레 유충(1 내지 3일령)을 선택하고, 생물검정 트레이의 각 웰 내에 넣는다. 이어서, 웰을 "풀 엔' 필(PULL N' PEEL)" 탭 덮개 (BIO-CV-16, BIO-SERV)로 덮고, 18시간/6시간 명기/암기 주기로 28℃ 인큐베이터에 넣는다. 초기 침입 9일 후에, 유충을 사멸률에 대해 평가하며, 이는 각 처리에서 곤충의 총 수 중에서 죽은 곤충의 백분율로 계산한다. 곤충 샘플을 2일 동안 -20℃에서 동결시킨 다음, 각 처리로부터의 곤충 유충을 풀링하고 칭량한다. 성장 억제의 퍼센트는 실험 처리의 평균 중량을 2개 대조군 웰 처리의 평균 중량의 평균으로 나눔으로써 계산한다. 데이터는 (음성 대조군의) 퍼센트 성장 억제로 표현한다. 대조군 평균 중량을 초과하는 평균 중량은 0으로 정규화한다.
온실에서의 곤충 생물검정. CROP CHARACTERISTICS (미네소타주 파밍톤)로부터의 토양에서 서부 옥수수 뿌리벌레 (WCR, 디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트) 알을 받는다. WCR 알을 10 내지 11일 동안 28℃에서 인큐베이션한다. 토양으로부터의 알을 세척하고, 0.15% 한천 용액 내에 넣고, 0.25 mL 분취물 당 대략 75 내지 100개 알이 있도록 농도를 조정한다. 부화율을 모니터링하기 위해 알 현탁액의 분취물을 갖는 페트리 접시에 부화 플레이트를 설정한다.
ROOTRANERS®에서 성장 중인 메이즈 식물 주위의 토양에 150 내지 200개 WCR 알을 침입시킨다. 2주 동안 곤충이 섭식하도록 하고, 이 시간 후에 각 식물에 대해 "뿌리 등급화(Root Rating)"가 주어진다. 등급화를 위해, 본질적으로 Oleson 등 (2005) J. Econ. Entomol. 98:1-8에 따른, 마디-손상 척도(Node-Injury Scale)를 이용한다. 감소된 손상을 보여주는, 이러한 생물검정을 통과한 식물은 종자 생산을 위해 5 갤론 화분(pot)에 이식한다. 온실에서 추가의 뿌리벌레 피해 및 곤충 방출을 방지하기 위해 이식물을 살곤충제로 처리하였다. 식물은 종자 생산을 위해 수동 수분시킨다. 이들 식물에 의해 생산된 종자를 식물의 T1 및 후속 세대에서 평가하기 위해 보관한다.
트랜스제닉 음성 대조군 식물을 황색 형광 단백질 (YFP)을 생산하도록 설계된 유전자를 보유하는 벡터에 의한 형질전환에 의해 생성한다. 비-형질전환 음성 대조군 식물을 트랜스제닉 음성 대조군 식물이 생산된 모 옥수수 품종의 종자로부터 성장시킨다. 생물검정을 각각의 식물 재료 세트에 포함된 음성 대조군으로 수행한다.
실시예 9: 딱정벌레류 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
10-20종의 트랜스제닉 T0 제아 메이스 식물을 실시예 6에 기재된 바와 같이 생성한다. 옥수수 뿌리벌레 챌린지를 위해, RNAi 구축물에 대해 헤어핀 dsRNA를 발현하는 추가의 10-20종의 T1 제아 메이스 독립 계통을 수득한다. 헤어핀 dsRNA는 서열번호:1 또는 서열번호:3의 부분을 포함한다 (예를 들어, 서열번호:103 및 서열번호:104에서 전사된 헤어핀 dsRNA). 추가의 헤어핀 dsRNA는, 예를 들어 딱정벌레류 해충 서열, 예컨대 예를 들어 Caf1-180 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174258), VatpaseC (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174259), Rho1 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174260), VatpaseH (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0198586), PPI-87B (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091600), RPA70 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091601), RPS6 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0097730), ROP (미국 특허 출원 공개 번호 14/577811), RNAPII (미국 특허 출원 공개 번호 14/577854), Dre4 (미국 특허 출원 번호 14/705,807), ncm (미국 특허 출원 번호 62/095487), COPI 알파 (미국 특허 출원 번호 62/063,199), COPI 베타 (미국 특허 출원 번호 62/063,203), COPI 감마 (미국 특허 출원 번호 62/063,192), 또는 COPI 델타 (미국 특허 출원 번호 62/063,216)으로부터 유래된다. 이들을 RT-PCR 또는 다른 분자 분석 방법을 통해 확증한다.
각각의 RNAi 구축물 중 헤어핀 발현 카세트의 링커에서 결합하도록 설계된 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 위해, 선택된 독립 T1 계통으로부터의 총 RNA 제제를 임의로 사용한다. 추가로, RNAi 구축물 중 각 타겟 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 임의적으로 사용하여 식물내에서 siRNA 생산에 요구되는 사전-가공된 mRNA를 증폭시키고 그의 생산을 확증한다. 각 타겟 유전자에 대해 원하는 밴드의 증폭은 각 트랜스제닉 제아 메이스 식물에서의 헤어핀 RNA의 발현을 확증시킨다. 이후, 타겟 유전자의 dsRNA 헤어핀의 siRNA로의 가공은 임의적으로 RNA 블롯 혼성화를 사용하여 독립 트랜스제닉 계통에서 확증한다.
또한, 타겟 유전자에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 미스매치 서열을 갖는 RNAi 분자는 타겟 유전자에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 RNAi 분자에 의해 관찰되는 것과 유사한 방식으로 옥수수 뿌리벌레에게 영향을 미친다. 동일한 RNAi 구축물에서 헤어핀 dsRNA를 형성하기 위한 미스매치 서열과 천연 서열의 쌍형성은 섭식 중인 딱정벌레류 해충의 성장, 발생 및 생존율에 영향을 미칠 수 있는 식물-가공된 siRNA를 전달한다.
타겟 유전자에 상응하는 dsRNA, siRNA 또는 miRNA의 식물내 전달 및 딱정벌레류 해충에 의한 섭식을 통한 후속 흡수는 딱정벌레류 해충에서 RNA-매개 유전자 침묵을 통한 타겟 유전자의 하향-조절을 야기한다. 타겟 유전자의 기능이 하나 이상의 발생 단계에서 중요한 경우에, 딱정벌레류 해충의 성장 및/또는 발생은 영향을 받으며, WCR, NCR, SCR, MCR, D. 발테아타 르콩트, D. u. 테넬라, D. 스페시오사 게르마, 및 D. u. 운데심푼크타타 만네르헤임 중 적어도 하나의 경우에서, 성공적 침입, 섭식, 발생의 실패로 이어지거나 그리고/또는 딱정벌레류 해충의 사멸로 이어진다. 이어서, 타겟 유전자의 선택 및 RNAi의 성공적 적용을 딱정벌레류 해충을 방제하는 데에 사용한다.
트랜스제닉 RNAi 계통 및 비형질전환 제아 메이스 의 표현형 비교. 헤어핀 dsRNA를 생성하기 위해 선택된 타겟 딱정벌레류 해충 유전자 또는 서열은 어떠한 공지된 식물 유전자 서열에 대해 전혀 유사성을 갖지 않는다. 따라서, 이들 딱정벌레류 해충 유전자 또는 서열을 타겟화하는 구축물에 의한 (침투성(systemic)) RNAi의 생산 또는 활성화가 트랜스제닉 식물에 임의의 유해 효과를 가질 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 트랜스제닉 계통의 발생 및 형태학적 특징을 비형질전환 식물, 뿐만 아니라 헤어핀-발현 유전자를 갖지 않는 "빈" 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 계통의 그것과 비교한다. 식물 뿌리, 싹, 잎 및 생식 특징을 비교한다. 식물 싹 특징, 예컨대 높이, 잎의 수 및 크기, 개화 시기, 꽃의 크기 및 외관을 기록한다. 일반적으로, 시험관 내 및 온실 내 토양에서 배양할 때, 트랜스제닉 계통과 타겟 iRNA 분자가 발현되지 않은 것 사이에는 어떠한 관찰가능한 형태학적 차이도 없다.
실시예 10: 딱정벌레류 해충 서열 및 추가의 RNAi 구축물을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
딱정벌레류 해충 이외의 유기체를 타겟화하는 iRNA 분자로 전사되는 게놈 내의 이종 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스 식물을 아그로박테리움 또는 WHISKERS™ 방법론을 통해 2차로 형질전환시켜 (Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67 참조) 하나 이상의 살곤충 dsRNA 분자 (예를 들어, 서열번호:1, 및/또는 서열번호:3를 포함하는 유전자를 타겟화하는 dsRNA 분자를 포함한 적어도 하나의 dsRNA 분자)를 생산한다. 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된 식물 형질전환 플라스미드 벡터를 아그로박테리움 또는 WHISKERS™-매개 형질전환 방법을 통해, 딱정벌레류 해충 이외의 유기체를 타겟화하는 iRNA 분자로 전사되는 게놈 내의 이종 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 Hi II 또는 B104 제아 메이스 식물로부터 수득된 미성숙 메이즈 배아 또는 메이즈 현탁 세포 내로 전달한다.
실시예 11: RNAi 구축물 및 추가의 딱정벌레류 해충 방제 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
딱정벌레류 해충 유기체를 타겟화하는 iRNA 분자 (예를 들어, 서열번호:1 또는 서열번호:3를 포함하는 유전자를 타겟화하는 dsRNA 분자를 포함한 적어도 하나의 dsRNA 분자)로 전사되는 게놈 내의 이종 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스 식물을 아그로박테리움 또는 WHISKERS™ 방법론을 통해 2차로 형질전환시켜 (Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67 참조) 하나 이상의 살곤충 단백질 분자, 예를 들어 Cry3, Cry6, Cry34 및 Cry35 살곤충 단백질을 생산한다. 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된 식물 형질전환 플라스미드 벡터를 아그로박테리움 또는 WHISKERS™-매개 형질전환 방법을 통해, 딱정벌레류 해충 유기체를 타겟화하는 iRNA 분자로 전사되는 게놈 내의 이종 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 B104 제아 메이스 식물로부터 수득된 미성숙 메이즈 배아 또는 메이즈 현탁 세포 내로 전달한다. 딱정벌레류 해충의 방제를 위한 iRNA 분자 및 살곤충 단백질을 생산하는 이중으로 형질전환된 식물을 수득한다.
실시예 12: 신열대 갈색 노린재 (유쉬스투스 헤로스) 내 후보 타겟 유전자의 스크리닝
신열대 갈색 노린재 (BSB; 유쉬스투스 헤로스 ) 콜로니. BSB를 65% 상대 습도의 27℃ 인큐베이터에서 16: 8시간 명기:암기 주기로 사육시켰다. 2-3일에 걸쳐 수집한 1 그램의 알을 바닥에 여과지 디스크를 깐 5L 용기 내에 시딩하고, 환기를 위해 #18 메쉬로 용기를 덮었다. 각각의 사육 용기는 대략 300-400마리의 성충 BSB를 생성하였다. 모든 단계에서, 곤충에게 1주에 3회 신선한 녹색 콩을 섭식시키고, 해바라기 종자, 대두 및 땅콩 (중량 비 3:1:1)을 함유하는 종자 혼합물 주머니(sachet)를 1주에 1회 교체했다. 심지로서 코튼 플러그를 갖는 바이알에 물을 보충하였다. 초기 2주 후에, 곤충을 1주에 1회 새로운 용기로 옮겼다.
BSB 인공 먹이. BSB 인공 먹이를 다음과 같이 제조하였다. 동결건조된 그린 빈(green bean)을 MAGIC BULLET® 블렌더에서 미세 분말로 블렌딩하면서, 미가공 (유기) 땅콩을 별개의 MAGIC BULLET® 블렌더에서 블렌딩하였다. 블렌딩된 건조 성분을 대형 MAGIC BULLET® 블렌더에 조합하고 (중량 백분율: 그린 빈, 35%; 땅콩, 35%; 수크로스, 5%; 비타민 복합체 (예를 들어, 곤충용 반더잔트(Vanderzant) 비타민 혼합물, SIGMA-ALDRICH, 카탈로그 번호 V1007), 0.9%); 이를 마개를 닫고 성분들이 혼합되도록 잘 진탕하였다. 이어서, 혼합된 건조 성분들을 믹싱 볼에 첨가하였다. 별개의 용기에서, 물 및 베노밀 항진균제 (50 ppm; 25 μL의 20,000 ppm 용액/50 mL 먹이 용액)를 잘 혼합한 다음, 건조 성분 혼합물에 첨가하였다. 용액이 완전히 블렌딩될 때까지 모든 성분을 수동으로 혼합하였다. 먹이를 원하는 크기로 형상화하고, 알루미늄 호일로 느슨하게 랩핑하고, 60℃에서 4시간 동안 가열한 다음, 냉각시키고, 4℃에서 저장하였다. 인공 먹이는 제조 2주 내에 사용하였다.
BSB 전사체 조립. 6개의 BSB 발생 단계를 mRNA 라이브러리 제조를 위해 선택하였다. -70℃에서 동결시킨 곤충으로부터 총 RNA를 추출하고, FastPrep®-24 기기 (MP BIOMEDICALS, 캘리포니아주 산타 아나) 상에서 용해 매트릭스 A 2 mL 튜브 (MP BIOMEDICALS) 내의 10 부피의 용해/결합 완충제(Lysis/Binding buffer) 중에서 균질화하였다. 총 mRNA를 mirVana™ miRNA 단리 키트 (AMBION; INVITROGEN)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 추출하였다. illumina® HiSeq™ 시스템 (캘리포니아주 샌디에고)을 사용한 RNA 서열분석은 RNAi 곤충 방제 기술에 사용하기 위한 후보 타겟 유전자 서열을 제공하였다. HiSeq™은 6개의 샘플에 대해 총 약 378백만개의 판독물을 생성하였다. 판독물은 TRINITY™ 어셈블러 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에 대해 개별적으로 조립하였다 (Grabherr 등 (2011) Nature Biotech. 29:644-652). 조립된 전사물을 조합하여 풀링된 전사체를 생성하였다. 이러한 BSB 풀링된 전사체는 378,457개의 서열을 함유하였다.
BSB rpII33 오르토로그 식별. 질의 서열로 드로소필라 rpII-33 (단백질 서열 GENBANK 수탁 번호 ABI30983)을 사용하여 BSB 풀링된 전사체의 tBLASTn 검색을 수행하였다. BSB rpII33-1 (서열번호:76) 및 BSB rpII33-2 (서열번호:78)를 유쉬스투스 헤로스 후보 타겟 유전자로서 식별하였으며, 그 산물은 각각, 서열번호:77 및 서열번호:79로 예측된 펩티드 서열을 갖는다.
주형 제조 및 dsRNA 합성. TRIzol® 시약 (LIFE TECHNOLOGIES)을 사용하여 단일 초기 성충 곤충 (약 90 mg)으로부터 추출된 총 BSB RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 펠릿 페슬 (FISHERBRAND 카탈로그 번호 12-141-363) 및 페슬 모터 믹서 (COLE-PARMER, 일리노이주 베르논 힐스)를 사용하여 200 μL의 TRIzol®이 담긴 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내에서 실온에서 곤충을 균질화하였다. 균질화 후에, 추가의 TRIzol® 800 μL을 첨가하고, 균질물을 볼텍싱한 다음, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 제조업체에서 추천한 TRIzol® 1 mL의 경우의 TRIzol® 추출 프로토콜에 따라, RNA 펠릿을 실온에서 건조시키고, 용리 완충제 유형 4 (즉, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0)를 사용하여 GFX PCR DNA 및 겔 추출 키트 (Illustra™; GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES)로부터의 트리스 완충제 200 μL 중에 재현탁시켰다. NanoDrop™ 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽, 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 RNA 농도를 결정하였다.
cDNA 증폭. 공급업체의 권고 프로토콜에 따라 RT-PCR용 SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM™ (INVITROGEN)을 사용하여, 5 μg의 BSB 총 RNA 주형 및 올리고 dT 프라이머로부터 cDNA를 역전사시켰다. 전사 반응의 최종 부피는 뉴클레아제-무함유 물에 의해 100 μL로 하였다.
표 12에 제시된 프라이머들을 사용하여 BSB_rpII33-1, BSB_rpII33-2, BSB_rpII33-3을 증폭시켰다. DNA 주형을 주형으로서 1 μL의 cDNA (상기)를 사용하는 터치-다운 PCR (어닐링 온도를 60℃에서 50℃로 1℃/주기 감소로 낮춤)에 의해 증폭시켰다. 255 bp 절편의 BSB_rpII33-1 (서열번호:80), 111 bp 절편의 BSB_rpII33-1 v1 (서열번호:81), 및 398 bp 절편의 BSB_rpII33-2 (서열번호:82)을 포함하는 단편이 35주기의 PCR 동안 생성되었다. 또한 상기 절차를 사용하여 YFPv2-F (서열번호:90) 및 YFPv2-R (서열번호:91) 프라이머를 사용하여 301 bp 음성 대조군 주형 YFPv2 (서열번호:89)를 증폭시켰다. BSB_ rpII33-1,BSB_ rpII33-1 v1, BSB_ rpII33-2, 및 YFPv2 프라이머는 그의 5' 말단에 T7 파지 프로모터 서열 (서열번호:9)을 함유하였고, 이에 따라 dsRNA 전사를 위한 YFPv2 및 BSB_rpII33 DNA 단편의 사용이 가능하였다.
예시적인 rpII33 타겟 유전자 및 YFP 음성 대조군 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머 및 프라이머 쌍.
유전자 ID 프라이머 ID 서열
쌍 20 rpII33-1 BSB_rpII33-1_For TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGTGAATCAGATGATATTTTGATTG (서열번호:83)
BSB_rpII33-1_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTAGGTTTGGCTTCCCAATTAAATG (서열번호:84)
쌍 21 rpII33-1 v1 BSB_rpII33-1 v1_For TTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGTTTTGAGTATGACCCTGACAAC (서열번호:85)
BSB_rpII33-1 v1_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGCTTCATACTGATCCTCATCTAATTC (서열번호:86)
쌍 22 rpII33-2 BSB_rpII33-2_For TTAATACGACTCACTATAGGGAGACGTCGAAATCATCAAAAACAACACG (서열번호:87)
BSB_rpII33-2_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTCCAGTAGTTTGTGGACCTAG (서열번호:88)
쌍 23 YFP YFPv2-F TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCATCTGGAGCACTTCTCTTTCA (서열번호:90)
YFPv2-R TTAATACGACTCACTATAGGGAGACCATCTCCTTCAAAGGTGATTG (서열번호:91)
dsRNA 합성. 제조업체의 지침에 따라 사용된 MEGAscript™ T7 RNAi 키트 (AMBION)에 의해 주형으로서 2 μL PCR 산물 (상기)을 사용하여 dsRNA를 합성하였다. 도 1을 참조한다. dsRNA를 NANODROP™ 8000 분광광도계 상에서 정량화하고, 뉴클레아제-무함유 0.1X TE 완충제 (1 mM 트리스 HCL, 0.1 mM EDTA, pH 7.4) 중에서 500 ng/μL로 희석하였다.
BSB 혈체강 내로의 dsRNA의 주사. BSB를 65% 상대 습도 및 16:8시간 명기:암기 광주기의 27℃ 인큐베이터에서 그린 빈 및 종자 먹이 상에 콜로니로서 사육시켰다. 제2령 약충 (각각 1 내지 1.5 mg으로 칭량됨)을 소형 브러시로 온화하게 다루어 손상을 방지하고, 빙상의 페트리 접시에 두어 곤충을 냉각 및 고정시켰다. 각각의 곤충에게 55.2 nL 500 ng/μL dsRNA 용액 (즉, 27.6 ng dsRNA; 18.4 내지 27.6 μg/체중 g의 투여량)을 주사하였다. 주사는 드루몬드 3.5 인치 #3-000-203-G/X 유리 모세관으로부터 당겨지는 주사 바늘이 장착된, NANOJECT™ II 주사기 (DRUMMOND SCIENTIFIC, 펜실베니아주 브룸홀)를 사용하여 수행하였다. 바늘 팁을 파괴하고, 모세관을 경질 미네랄 오일로 다시 채운 다음, 2 내지 3 μL의 dsRNA를 채웠다. dsRNA를 약충의 복부 내로 주사하고 (시험당 dsRNA당 10마리의 곤충에게 주사함), 시험을 다른 3일에 반복하였다. 주사된 곤충 (웰당 5마리)을 인공 BSB 먹이의 펠릿을 함유하는 32-웰 트레이 (Bio-RT-32 사육 트레이; BIO-SERV, 뉴저지주 프렌치타운) 내로 옮기고, Pull-N- Peel™ 탭 (BIO-CV-4; BIO-SERV)으로 덮었다. 코튼 심지를 갖는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내 1.25 mL의 물에 의해 수분을 공급하였다. 트레이를 26.5℃, 60% 습도, 및 16: 8시간 명기:암기 광주기에서 인큐베이션하였다. 생존율 카운트 및 중량을 주사 후 7일째에 취하였다.
BSB rpII33 는 치사 dsRNA 타겟이다. 표 13 및 표 14에 요약된 바와 같이, 각 반복에서, 대략 18.4 - 27.6 μg dsRNA/g 곤충의 최종 농도에 대해, 적어도 10 마리의 제2령 BSB 약충(각각 1 내지 1.5 mg)에게 55.2 nL의 BSB_rpII33-1, BSB_ rpII33-2, and BSB_ rpII33-1 v1 dsRNA (500 ng/μL)를 혈체강 내로 주사하였다. 이들 dsRNA에 대해 결정된 사멸률은 동일한 양으로 주사된 YFP v2 dsRNA (음성 대조군)에 의해 관찰된 것과 유의하게 상이하였다, p <0.05 (스튜던트 t-검정).
제2령 신열대 갈색 노린재 약충의 혈체강 내로의 BSB_rpII33 dsRNA 주사의 주사 7일 후의 결과
처리* N 시험 평균 사멸률%
± SEM** 		p 값
t -검정
rpII33-1 3 66.7 ± 8.82 5.78E-03***
rpII33-2 3 6.67 ± 6.67 7.25E-01
주사되지 않음 3 0.00 ± 0.00 1.58E-01
YFP v2 dsRNA 3 10.0 ± 5.77
*각각의 dsRNA의 경우에 시험당 10마리의 곤충에게 주사함.
**평균의 표준 오차
*** 스튜던트 t-검정을 사용한 YFP v2 dsRNA 대조군으로부터의 유의차. (p<0.05).
제2령 신열대 갈색 노린재 약충의 혈체강 내로의 BSB_rpII33-1 v1 dsRNA 주사의 주사 7일 후의 결과
처리 * N 시험 사멸률 %
± SEM** 		p 값
t -검정
BSB_ rpII33-1 v1 3 51 ± 24.7 1.98E-01
주사되지 않음 3 3 ± 3.3 5.61E-01
YFP v2 dsRNA 3 10 ± 10
*각각의 dsRNA의 경우에 시험당 10마리의 곤충에게 주사함.
**평균의 표준 오차
실시예 13: 노린재류 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
서열번호:76 및/또는 서열번호:78 중 임의의 부분을 포함하는 핵산(예를 들어, 서열번호:80-82)에 대한 발현 벡터를 보유하는 10 내지 20종의 트랜스제닉 T0 제아 메이스 식물을 실시예 4에 기재된 바와 같이 생성한다. BSB 챌린지를 위해, RNAi 구축물에 대해 헤어핀 dsRNA를 발현하는 추가의 10-20종의 T1 제아 메이스 독립 계통을 수득한다. 서열번호:76 및/또는 서열번호:78의 부분 또는 그 절편(예를 들어, 서열번호:80-82)을 포함하는 헤어핀 dsRNA가 유래된다. 이들을 RT-PCR 또는 다른 분자 분석 방법을 통해 확증한다. 각각의 RNAi 구축물 중 헤어핀 발현 카세트의 링커에서 결합하도록 설계된 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 위해, 선택된 독립 T1 계통으로부터의 총 RNA 제제를 임의적으로 사용한다. 추가로, RNAi 구축물 중 각 타겟 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 임의적으로 사용하여 식물내에서 siRNA 생산에 요구되는 사전-가공된 mRNA를 증폭시키고 그의 생산을 확증한다. 각 타겟 유전자에 대해 원하는 밴드의 증폭은 각 트랜스제닉 제아 메이스 식물에서의 헤어핀 RNA의 발현을 확증시킨다. 이후, 타겟 유전자의 dsRNA 헤어핀의 siRNA로의 가공은 임의적으로 RNA 블롯 혼성화를 사용하여 독립 트랜스제닉 계통에서 확증한다.
또한, 타겟 유전자에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 미스매치 서열을 갖는 RNAi 분자는 타겟 유전자에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 RNAi 분자에 의해 관찰되는 것과 유사한 방식으로 노린재류에게 영향을 미친다. 동일한 RNAi 구축물에서 헤어핀 dsRNA를 형성하기 위한 미스매치 서열과 천연 서열의 쌍형성은 섭식중인 노린재류 해충의 성장, 발생 및 생존율에 영향을 미칠 수 있는 식물-가공된 siRNA를 전달한다.
타겟 유전자에 상응하는 dsRNA, siRNA, shRNA, hpRNA, 또는 miRNA의 식물내 전달 및 노린재류 해충에 의한 섭식을 통한 후속 흡수는 노린재류 해충에서 RNA-매개 유전자 침묵을 통한 타겟 유전자의 하향-조절을 초래한다. 타겟 유전자의 기능이 하나 이상의 발생 단계에서 중요한 경우에, 노린재류 해충의 성장, 발생, 및/또는 생존은 영향을 받으며, 유쉬스투스 헤로스, E. 세르부스, 네자라 비리둘라, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 키나비아 힐라레, C. 마르기나툼, 디켈롭스 멜라칸투스, D. 푸르카투스; 에데사 메디타분다, 티안타 페르디토르, 호르시아스 노빌렐루스, 타에디아 스티그모사, 디스데르쿠스 페루비아누스, 네오메갈로토무스 파르부스, 렙토글로수스 조나투스, 니에스트레아 시다에, 리구스 헤르페루스, 및 L. 리네올라리스 중 적어도 하나의 경우에서, 성공적 침입, 섭식, 발생의 실패로 이어지고 그리고/또는 노린재류 해충의 사멸로 이어진다. 이어서, 타겟 유전자의 선택 및 RNAi의 성공적 적용을 노린재류 해충의 방제를 위해 사용한다.
트랜스제닉 RNAi 계통 및 비-형질전환 제아 메이스 의 표현형 비교. 헤어핀 dsRNA를 생성하기 위해 선택된 타겟 노린재류 해충 유전자 또는 서열은 어떠한 공지된 식물 유전자 서열에 대해 아무런 유사성을 갖지 않는다. 따라서, 이들 노린재류 해충 유전자 또는 서열을 타겟화하는 구축물에 의한 (침투성) RNAi의 생산 또는 활성화가 트랜스제닉 식물에 임의의 유해 효과를 가질 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 트랜스제닉 계통의 발생 및 형태학적 특징을 비형질전환 식물, 뿐만 아니라 헤어핀-발현 유전자를 갖지 않는 "빈" 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 계통의 그것과 비교한다. 식물 뿌리, 싹, 잎 및 생식 특징을 비교한다. 식물 싹 특징, 예컨대 높이, 잎의 수 및 크기, 개화 시기, 꽃의 크기 및 외관을 기록한다. 일반적으로, 시험관 내 및 온실 내 토양에서 배양할 때, 트랜스제닉 계통과 타겟 iRNA 분자가 발현되지 않은 것 사이에는 어떠한 관찰가능한 형태학적 차이도 없다.
실시예 14: 노린재류 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 글리신 맥스
서열번호:76 및/또는 서열번호:78, 또는 그의 절편(예를 들어, 서열번호:80-82)을 포함하는 핵산에 대한 발현 벡터를 보유하는 10 내지 20종의 트랜스제닉 T0 글리신 맥스 식물을, 예를 들어 하기와 같은 아그로박테리움-매개 형질전환에 의하는 것을 포함하는, 본 기술분야에 공지된 바와 같이 생성한다. 성숙 대두 (글리신 맥스) 종자를 16시간 동안 염소 기체로 밤새 멸균한다. 염소 기체로 멸균시킨 후, 종자를 Laminar™ 유동 후드 내의 개방 용기에 두어 염소 기체를 없앤다. 다음에, 멸균 종자에 24℃에서 흑색 상자를 사용한 암실에서 16시간 동안 멸균 H2O를 흡수시킨다.
분할-종자 대두의 제조. 배축 프로토콜의 부분을 포함하는 분할 대두 종자는, 종피를 분리 및 제거하고 종자를 2개의 자엽 절편으로 분할하기 위해 스칼펠에 고정된 #10 블레이드를 사용하여 종자의 꼭지를 따라 종축으로 절단되는 대두 종자 물질의 제조를 요구한다. 배축을 부분적으로 제거하는데 세심한 주의를 기울여야 하며, 여기서 배축의 약 1/2 - 1/3이 자엽의 마디 끝에 부착된 채로 남아있다.
접종. 이어서, 배축의 부분적인 부분을 포함하는 분할 대두 종자를 서열번호:76 및/또는 서열번호:78, 또는 그의 절편(예를 들어, 서열번호:80-82)을 포함하는 이원 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 (예를 들어, 균주 EHA 101 또는 EHA 105)의 용액에서 약 30분 동안 침지시킨다. 배축을 포함하는 자엽을 침지시키기 전에, A. 투메파시엔스 용액을 λ=0.6 OD650의 최종 농도로 희석시킨다.
공동-배양. 접종 후, 분할 대두 종자를 한 장의 여과지로 덮인 페트리 접시 내의 공동-배양 배지 상에서 아그로박테리움 투메파시엔스 균주와 5일 동안 공동-배양되게 한다 ( Agrobacterium Protocols, vol. 2, 2nd Ed., Wang, K. (Ed.) Humana Press, New Jersey, 2006).
싹 유도. 공동-배양 5일 후, 분할 대두 종자를 B5 염, B5 비타민, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 수크로스, 0.6 g/L MES, 1.11 mg/L BAP, 100 mg/L Timentin™, 200 mg/L 세포탁심 및 50 mg/L 반코마이신 (pH 5.7)으로 이루어진 액체 싹 유도 (SI) 배지에서 세척한다. 이어서, 분할 대두 종자를 B5 염, B5 비타민, 7 g/L 노블 한천, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 수크로스, 0.6 g/L MES, 1.11 mg/L BAP, 50 mg/L Timentin™, 200 mg/L 세포탁심, 50 mg/L 반코마이신 (pH 5.7)으로 이루어진 싹 유도 I (SI I) 배지 상에서 배양하고, 자엽의 편평한 면은 위를 향하고 자엽의 마디 끝은 배지 내로 박혀있다. 배양 2주 후, 형질전환된 분할 대두 종자로부터의 외식편을 6 mg/L 글루포시네이트 (Liberty®)가 보충된 SI I 배지를 함유하는 싹 유도 II (SI II) 배지로 옮긴다.
싹 신장. SI II 배지 상에서의 배양 2주 후에, 외식편으로부터 자엽을 제거하고, 자엽의 기저에서 절단을 수행함으로써, 배축을 함유하는 돋아난 싹 패드를 절제한다. 자엽으로부터 단리된 싹 패드를 싹 신장 (SE) 배지로 옮긴다. SE 배지는 MS 염, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 수크로스 및 0.6 g/L MES, 50 mg/L 아스파라긴, 100 mg/L L-피로글루탐산, 0.1 mg/L IAA, 0.5 mg/L GA3, 1 mg/L 제아틴 리보시드, 50 mg/L Timentin™, 200 mg/L 세포탁심, 50 mg/L 반코마이신, 6 mg/L 글루포시네이트, 7 g/L 노블 한천 (pH 5.7)으로 이루어진다. 배양물을 2주마다 신선한 SE 배지로 옮긴다. 배양물을 80-90 μmol/m2sec의 광 강도에서 18시간 광주기를 사용하여 24℃에서 Conviron™ 성장 챔버 내에서 성장시킨다.
발근. 발근을 촉진시키기 위해, 자엽 싹 패드의 기저에서 신장된 싹을 절단하고, 신장된 싹을 1-3분 동안 1 mg/L IBA (인돌 3-부티르산)에 침지시킴으로써 자엽 싹 패드로부터 발생된 신장된 싹을 단리한다. 다음에, 신장된 싹을 피타 트레이 내 발근 배지 (MS 염, B5 비타민, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 20 g/L 수크로스 및 0.59 g/L MES, 50 mg/L 아스파라긴, 100 mg/L L-피로글루탐산 7 g/L 노블 한천, pH 5.6)로 옮긴다.
배양. 24℃, 18시간 광주기에서 1-2주 동안 Conviron™ 성장 챔버 내에서 배양한 후, 덮인 선데 컵 내의 토양 혼합물로 뿌리가 발생된 싹을 옮기고, 소식물체의 순응을 위해 일정한 온도 (22℃) 및 습도 (40-50%) 하에 120-150 μmol/m2sec의 광 강도에서 긴 낮 조건 (16시간 명기/8시간 암기) 하에 Conviron™ 성장 챔버 (모델 CMP4030 및 CMP3244, Controlled Environments Limited, 캐나다 마니토바주 위니펙)에 둔다. 발근 소식물체를 선데 컵(sundae cup)에서 수주 동안 순응시킨 후에, 강건한 트랜스제닉 대두 식물의 향후 순응 및 정착을 위해 온실로 옮긴다.
BSB 챌린지를 위해, RNAi 구축물에 대해 헤어핀 dsRNA를 발현하는 추가의 10-20종의 T1 글리신 맥스 독립 계통을 수득한다. 서열번호:76 및/또는 서열번호:78, 또는 그의 절편 (예를 들어, 서열번호:80-82)을 포함하는 헤어핀 dsRNA가 유래될 수 있다. 이들은 RT-PCR 또는 본 기술분야에 공지된 바와 같은 다른 분자 분석 방법을 통해 확증된다. 각각의 RNAi 구축물 중 헤어핀 발현 카세트의 링커에서 결합하도록 설계된 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 위해, 선택된 독립 T1 계통으로부터의 총 RNA 제제를 임의적으로 사용한다. 추가로, RNAi 구축물 중 각 타겟 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 임의적으로 사용하여 식물내에서 siRNA 생산에 요구되는 사전-가공된 mRNA를 증폭시키고 그의 생산을 확증한다. 각 타겟 유전자에 대한 원하는 밴드의 증폭은 각 트랜스제닉 글리신 맥스 식물에서의 헤어핀 RNA의 발현을 확증시킨다. 이후, 타겟 유전자의 dsRNA 헤어핀의 siRNA로의 가공은 임의적으로 RNA 블롯 혼성화를 사용하여 독립 트랜스제닉 계통에서 확증한다.
타겟 유전자에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 미스매치 서열을 갖는 RNAi 분자는 타겟 유전자에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 RNAi 분자에서 보인 것과 유사한 방식으로 BSB에게 영향을 미친다. 동일한 RNAi 구축물에서 헤어핀 dsRNA를 형성하기 위한 미스매치 서열과 천연 서열의 쌍형성은 섭식중인 노린재류 해충의 성장, 발생 및 생존율에 영향을 미칠 수 있는 식물-가공된 siRNA를 전달한다.
타겟 유전자에 상응하는 dsRNA, siRNA, shRNA 또는 miRNA의 식물내 전달 및 노린재류 해충에 의한 섭식을 통한 후속 흡수는 노린재류 해충에서 RNA-매개 유전자 침묵을 통한 타겟 유전자의 하향-조절을 초래한다. 타겟 유전자의 기능이 하나 이상의 발생 단계에서 중요한 경우에, 노린재류 해충의 성장, 발생, 및/또는 생존율은 영향을 받으며, 유쉬스투스 헤로스, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 네자라 비리둘라, 키나비아 힐라레, 유쉬스투스 세르부스, 디켈롭스 멜라칸투스, 디켈롭스 푸르카투스, 에데사 메디타분다, 티안타 페르디토르, 키나비아 마르기나툼, 호르시아스 노빌렐루스, 타에디아 스티그모사, 디스데르쿠스 페루비아누스, 네오메갈로토무스 파르부스, 렙토글로수스 조나투스, 니에스트레아 시다에, 및 리구스 리네올라리스 중 적어도 하나의 경우에서, 성공적 침입, 섭식, 발생의 실패로 이어지거나 그리고/또는 노린재류 해충의 사멸로 이어진다. 이어서, 타겟 유전자의 선택 및 RNAi의 성공적 적용을 노린재류 해충의 방제를 위해 사용한다.
트랜스제닉 RNAi 계통 및 비형질전환 글리신 맥스 의 표현형 비교. 헤어핀 dsRNA를 생성하기 위해 선택된 타겟 노린재류 해충 유전자 또는 서열은 어떠한 공지된 식물 유전자 서열에 대해 아무런 유사성을 갖지 않는다. 따라서, 이들 노린재류 해충 유전자 또는 서열을 타겟화하는 구축물에 의한 (침투성) RNAi의 생산 또는 활성화가 트랜스제닉 식물에 임의의 유해 효과를 가질 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 트랜스제닉 계통의 발생 및 형태학적 특징을 비형질전환 식물, 뿐만 아니라 헤어핀-발현 유전자를 갖지 않는 "빈" 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 계통의 그것과 비교한다. 식물 뿌리, 싹, 잎 및 생식 특징을 비교한다. 식물 싹 특징, 예컨대 높이, 잎의 수 및 크기, 개화 시기, 꽃의 크기 및 외관을 기록한다. 일반적으로, 시험관 내 및 온실 내 토양에서 배양할 때, 트랜스제닉 계통과 타겟 iRNA 분자가 발현되지 않은 것 사이에는 어떠한 관찰가능한 형태학적 차이도 없다.
실시예 15: 인공 먹이에 대한 E. 헤로스 생물검정.
인공 먹이에 대한 dsRNA 섭식 검정에서, 주사 실험 (실시예 12 참조)에서와 같이 32-웰 트레이에 ~18 mg 펠릿의 인공 먹이 및 물을 설치한다. 200 ng/μL의 농도의 dsRNA를 먹이 펠릿 및 물 샘플에; 2개 웰 각각에 100 μL로 첨가한다. 5마리의 제2령 E. 헤로스 약충을 각 웰 내로 도입한다. 물 샘플 및 YFP 전사물을 타겟화하는 dsRNA를 음성 대조군으로서 사용한다. 실험을 서로 다른 3일에 반복한다. 처리 8일 후에, 생존하는 곤충을 칭량하고, 사멸률을 결정한다. 대조군 웰과 비교하여, rpII33 dsRNA가 제공된 웰에서 유의한 사멸률 및/또는 성장 억제가 관찰된다.
실시예 16: 노린재류 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나
rpII33의 절편 (서열번호:76 또는 서열번호:78)을 포함하는 헤어핀 형성을 위한 타겟 유전자 구축물을 함유하는 아라비돕시스 형질전환 벡터를 실시예 4와 유사한 표준 분자 방법을 사용하여 생성한다. 아라비돕시스 형질전환은 표준 아그로박테리움-기반 절차를 사용하여 수행한다. T1 종자에 대해 글루포시네이트 내성 선택성 마커를 선택한다. 트랜스제닉 T1 아라비돕시스 식물을 생성하고, 동형접합 단순-카피 T2 트랜스제닉 식물을 곤충 연구를 위해 생성한다. 화서가 있는 성장 중인 아라비돕시스 식물에 대해 생물검정을 수행한다. 5 내지 10마리 곤충을 각 식물 위에 두고, 14일 내에 생존에 대해 모니터링한다.
아라비돕시스 형질전환 벡터의 구축. 화학적으로 합성된 단편 (DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크) 및 표준 분자 클로닝 방법의 조합을 사용하여, rpII33의 절편 (서열번호:76 또는 서열번호:78)을 포함하는 헤어핀 형성을 위한 타겟 유전자 구축물을 보유하는 진입 벡터에 기초한 진입 클론을 조립한다. (단일 전사 단위 내에서) 타겟 유전자 절편의 2개의 카피를 대향 배향으로 배열하고, 2개의 절편을 링커 서열 (서열번호:107)에 의해 분리시킴으로써 RNA 일차 전사물에 의한 분자내 헤어핀 형성을 용이하게 한다. 따라서, 일차 mRNA 전사물은 링커 서열에 의해 분리된, 서로의 큰 역위 반복부로서 2개의 rpII33 유전자 절편 서열을 함유한다. 프로모터의 카피 (예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (Callis 등 (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493))를 사용해서 일차 mRNA 헤어핀 전사물의 생산을 구동하고, 아그로박테리움 투메파시엔스의 오픈 리딩 프레임 23으로부터의 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR v1; 미국 특허 제5,428,147호)을 포함하는 단편을 사용하여 헤어핀-RNA-발현 유전자의 전사를 종결시킨다.
진입 벡터 내의 헤어핀 클론을 통상적인 이원 목표 벡터에 의한 표준 GATEWAY® 재조합 반응에 사용하여, 아그로박테리움-매개 아라비돕시스 형질전환을 위한 헤어핀 RNA 발현 형질전환 벡터를 생산한다.
이원 목표 벡터는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터 v2, 미국 특허 제7,601,885호; Verdaguer 등 (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-39)의 조절 하에, 제초제 내성 유전자, DSM-2v2 (미국 특허 출원공개 번호 2011/0107455)를 포함한다. 아그로박테리움 투메파시엔스의 오픈 리딩 프레임 1로부터의 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR v6; Huang 등 (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22)을 포함하는 단편을 사용해서 DSM2v2 mRNA의 전사를 종결시킨다.
YFP 헤어핀 RNA를 발현하는 유전자를 포함하는 음성 대조군 이원 구축물은 전형적인 이원 목표 벡터 및 진입 벡터에 의한 표준 GATEWAY® 재조합 반응에 의해 구축한다. 진입 구축물은 아라비돕시스 유비퀴틴 10 프로모터 (상기와 같음)의 발현 제어 하에 YFP 헤어핀 서열 및 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 ORF23 3' 비번역 영역 (상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
살곤충 헤어핀 RNA를 포함하는 트랜스제닉 아라비돕시스 의 생산: 아그로박테리움 -매개 형질전환. 헤어핀 dsRNA 서열을 함유하는 이원 플라스미드를 아그로박테리움 균주 GV3101 (pMP90RK) 내로 전기천공한다. 재조합 아그로박테리움 클론을 재조합 아그로박테리움 콜로니의 플라스미드 제제의 제한 분석에 의해 확증한다. 퀴아젠 플라스미드 맥스 키트 (Qiagen, Cat# 12162)를 사용해서 제조업체 권고 프로토콜에 따라 아그로박테리움 배양물로부터 플라스미드를 추출한다.
아라비돕시스 형질전환 및 T 1 선택. 12 내지 15그루의 아라비돕시스 식물 (c.v. 콜럼비아)을 250 μmol/m2의 광 강도, 25℃ 및 18:6시간의 명기:암기 조건을 갖는 온실에서 4" 용기에서 성장시킨다. 형질전환 1주 전에 일차 꽃 줄기를 트리밍한다. 10 μL 재조합 아그로박테리움 글리세롤 스톡을 100 mL LB 브로쓰 (시그마 L3022) +100 mg/L 스펙티노마이신 + 50 mg/L 카나마이신 중 28℃에서 인큐베이션하고, 72시간 동안 225 rpm에서 진탕시킴으로써 아그로박테리움 접종물을 제조한다. 꽃을 침지시키기 전에 아그로박테리움 세포를 수거하고, 5% 수크로스 + 0.04% 실웨트(Silwet)-L77 (렐레 시즈(Lehle Seeds) Cat # VIS-02) + 10 μg/L 벤즈아미노 퓨린 (BA) 용액 중에 OD600 0.8~1.0으로 현탁시킨다. 식물의 지상 부분을 아그로박테리움 용액 중에 5-10분 동안 온화하게 교반하면서 침지시킨다. 이어서 식물을 종자가 세팅될 때까지 규칙적으로 급수 및 시비하면서 정상 성장을 위해 온실로 옮긴다.
실시예 17: 트랜스제닉 아라비돕시스의 성장 및 생물검정
dsRNA 구축물로 형질전환된 T 1 아라비돕시스 의 선택. 각 형질전환으로부터의 T1 종자 최대 200 mg을 0.1% 아가로스 용액 중에서 층화(stratify)시킨다. 종자를 #5 햇빛 배지를 갖는 발아 트레이 (10.5" x 21" x 1"; T.O. Plastics Inc., 미네소타주 클리어워터)에 식재한다. 식재 6 및 9일 후 형질전환체를 280 g/ha의 Ignite® (글루포시네이트)에의 내성에 대해 선택한다. 선택된 사건을 4" 직경 용기 내로 이식한다. 로슈 LightCycler480™을 사용하여 가수분해 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 통해 식재 1주일 내에 삽입 카피 분석을 수행한다. PCR 프라이머 및 가수분해 프로브를 LightCycler™ 프로브 디자인 소프트웨어 2.0 (로슈)을 사용하여 DSM2v2 선택성 마커에 대해 설계한다. 식물을 100-150 mE/m2s 강도의 형광 및 백열광 하에 16:8시간 명기:암기 광주기로 24℃에서 유지시킨다.
E. 헤로스 식물 섭식 생물검정. 적어도 4개의 낮은 카피 (1-2개 삽입), 4개의 중간 카피 (2-3개 삽입) 및 4개의 높은 카피 (≥4개 삽입) 사건을 각각의 구축물에 대해 선택한다. 식물을 생식 단계 (꽃 및 장각과를 함유하는 식물)까지 성장시킨다. 용이한 곤충 식별을 위해 토양의 표면을 ~ 50 mL 부피의 백색 모래로 덮는다. 5 내지 10마리의 제2령 E. 헤로스 약충을 각각의 식물 상에 도입한다. 식물을 3" 직경, 16" 높이 및 0.03" 벽 두께를 갖는 플라스틱 튜브 (항목 번호 484485, Visipack Fenton 미주리주)로 덮고; 곤충 단리를 위해 튜브를 나일론 메쉬로 덮는다. 식물을 콘비론에서 정상 온도, 광 및 급수 조건 하에 놔둔다. 14일 만에, 곤충을 수집하고, 칭량하고; 퍼센트 사멸률 뿐만 아니라 성장 억제 (1 -처리군 중량/대조군 중량)를 계산한다. YFP 헤어핀-발현 식물을 대조군으로서 사용한다. 대조군 식물에서의 약충 섭식과 비교하여, 트랜스제닉 BSB_rpII33 dsRNA 식물에서의 약충 섭식에서 유의한 사멸률 및/또는 성장 억제가 관찰된다.
T 2 아라비돕시스 종자 생성 및 T 2 생물검정. T2 종자를 각각의 구축물에 대해 선택된 낮은 카피 (1-2개 삽입) 사건으로부터 생산한다. 식물 (동형접합 및/또는 이형접합)을 상기 기재된 바와 같은 E. 헤로스 섭식 생물검정에 적용한다. T3 종자를 동형접합체로부터 수거하고, 향후 분석을 위해 보관한다.
실시예 18: 추가의 작물 종의 형질전환
본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예를 들어 이전에 미국 특허 제7,838,733호의 실시예 14, 또는 PCT 국제 특허 공개 번호 WO 2007/053482의 실시예 12에 기재된 것과 실질적으로 동일한 기술을 사용하여, 목화를 rpII33 dsRNA 트랜스젠으로 형질전환시켜 노린재류 곤충의 방제를 제공한다.
실시예 19: 곤충 관리에서의 rpII33 dsRNA
과잉 RNAi 타겟화 및 상승작용적 RNAi 효과를 제공하기 위해, rpII33 dsRNA 트랜스젠을 트랜스제닉 식물에서 다른 dsRNA 분자와 조합한다. rpII33을 타겟화하는 dsRNA를 발현하는, 예를 들어, 제한하지 않고 옥수수, 대두 및 목화를 포함하는 트랜스제닉 식물은 딱정벌레류 및 노린재류 곤충에 의한 섭식 피해를 방지하는데 유용하다. 또한 곤충 저항성 관리(Insect Resistance Management) 유전자 피라미드에서 새로운 작용 방식을 나타내도록, 바실루스 투린기엔시스 살곤충 단백질 기술, 및 또는 PIP-1 살곤충 폴리펩티드를 사용해서 rpII33 dsRNA 트랜스젠을 식물에서 조합한다. 트랜스제닉 식물에서 곤충 해충을 타겟화하는 다른 dsRNA 분자 및/또는 살곤충 단백질과 조합한 경우에, 저항성 곤충 집단의 발생을 또한 완화시키는 상승작용적 살곤충 효과가 관찰된다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences, LLC FIME Narva, Ken E. Worden, Sarah E. Frey, Meghan Rangasamy, Murugesan Veeramani, Balaji Gandra, Premchand Lo, Wendy Fishilevich, Elane Vilcinskas, Andreas Knorr, Eileen <120> RNA POLYMERASE 33 NUCLEIC ACID MOLECULES TO CONTROL INSECT PESTS <130> 2971-P12623.1US (76745) <150> 62/133,210 <151> 2015-03-13 <160> 111 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 961 <212> DNA <213> Diabrotica virgifera <400> 1 gccgatgcca tacatacgct taaaacatcg tatctgctca gttctttaat taacactgaa 60 gaaaatcgaa ttataaaatg ccctacgcta acacaccgtc agtacaaatt tctgaactaa 120 ccgatgaaaa tgttaagttc gtcgttgagg acacagacct tagcttggca aacagtctac 180 gtcgtgtttt catcgctgaa actccaaccc tagcaatcga ttgggttcaa ttcgaagcca 240 actccactgt actggcagat gaattccttg cccatcgaat tggcttgatt ccattgattt 300 ccgatgaggt agtggacaga atccaaaaca ctcgtgaatg ttcatgcttg gacttttgca 360 ccgagtgcag tgtggaattt acattggatg tcaaatgcag cgacgaacat acgcgccacg 420 ttaccacggc cgatttaaag tccagtgacg cacgagtgct accagttacg tccagacatc 480 gcgatgacga ggacaacgaa tatggagaga cgaacgatga aattctgatc atcaaactgc 540 gcaaaggtca agagctgaag ttgcgagcat acgcgaaaaa gggtttcggc aaggaacatg 600 ccaaatggaa tccaacggct ggcgttagct ttgaatacga tccagtcaat tcgatgagac 660 ataccctgta cccgaagccg gacgaatggc cgaaaagtga gcacaccgaa cttgacgatg 720 atcaatacga agctgaatat aactgggagg ctaagccgaa caagtttttc ttcaacgttg 780 agtcgagtgg tgcacttcga ccggaaaaca ttgtgctgat gggagtcaaa gttttgaaaa 840 acaaattgtc caatctacag acgcagttaa gtcacgaatt gactacaaac gatgcgctcg 900 tgattcagta aaagcagcga tcccattgaa tttcttcaaa atcttgtttt tttcctctaa 960 g 961 <210> 2 <211> 277 <212> PRT <213> Diabrotica virgifera <400> 2 Met Pro Tyr Ala Asn Thr Pro Ser Val Gln Ile Ser Glu Leu Thr Asp 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Phe Val Val Glu Asp Thr Asp Leu Ser Leu Ala Asn 20 25 30 Ser Leu Arg Arg Val Phe Ile Ala Glu Thr Pro Thr Leu Ala Ile Asp 35 40 45 Trp Val Gln Phe Glu Ala Asn Ser Thr Val Leu Ala Asp Glu Phe Leu 50 55 60 Ala His Arg Ile Gly Leu Ile Pro Leu Ile Ser Asp Glu Val Val Asp 65 70 75 80 Arg Ile Gln Asn Thr Arg Glu Cys Ser Cys Leu Asp Phe Cys Thr Glu 85 90 95 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catcctgatg tttttgctac taatccaaga 240 atagatatta tacatcaaaa tgttagatgg caaagtttat atagatatgt aagctatgct 300 catacaaagt caagatttga agtgagaggt 330 <210> 25 <211> 320 <212> DNA <213> Diabrotica virgifera <400> 25 caaagtcaag atttgaagtg agaggtggag gtcgaaaacc gtggccgcaa aagggattgg 60 gacgtgctcg acatggttca attagaagtc cactttggag aggtggagga gttgttcatg 120 gaccaaaatc tccaacccct catttttaca tgattccatt ctacacccgt ttgctgggtt 180 tgactagcgc actttcagta aaatttgccc aagatgactt gcacgttgtg gatagtctag 240 atctgccaac tgacgaacaa agttatatag aagagctggt caaaagccgc ttttgggggt 300 ccttcttgtt ttatttgtag 320 <210> 26 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 26 ttaatacgac tcactatagg gagacaccat gggctccagc ggcgccc 47 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 27 agatcttgaa ggcgctcttc agg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 28 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Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 48 agtgaaatgt tagcaaatat aacatcc 27 <210> 49 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 49 ttaatacgac tcactatagg gagaacctct cacttcaaat cttgactttg 50 <210> 50 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 50 ttaatacgac tcactatagg gagacaaagt caagatttga agtgagaggt 50 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 51 ctacaaataa aacaagaagg acccc 25 <210> 52 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 52 caaagtcaag atttgaagtg agaggt 26 <210> 53 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 53 ttaatacgac tcactatagg gagactacaa ataaaacaag aaggacccc 49 <210> 54 <211> 1150 <212> DNA <213> Zea mays <400> 54 caacggggca gcactgcact gcactgcaac tgcgaatttc 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oligonucleotide <400> 59 gcaatgtaac cgagtgtctc tcaa 24 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized probe oligonucleotide <400> 60 tttttggctt agagttgatg gtgtactgat ga 32 <210> 61 <211> 151 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 61 gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 60 ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga 120 cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa g 151 <210> 62 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized partial coding region <400> 62 tgttcggttc cctctaccaa gcacagaacc gtcgcttcag caacacctca gtcaaggtga 60 tggatgttg 69 <210> 63 <211> 4233 <212> DNA <213> Zea mays <400> 63 agcctggtgt ttccggagga gacagacatg atccctgccg ttgctgatcc gacgacgctg 60 gacggcgggg gcgcgcgcag gccgttgctc ccggagacgg accctcgggg gcgtgctgcc 120 gccggcgccg agcagaagcg gccgccggct acgccgaccg ttctcaccgc cgtcgtctcc 180 gccgtgctcc tgctcgtcct cgtggcggtc acagtcctcg cgtcgcagca cgtcgacggg 240 caggctgggg gcgttcccgc gggcgaagat gccgtcgtcg tcgaggtggc cgcctcccgt 300 ggcgtggctg agggcgtgtc ggagaagtcc acggccccgc tcctcggctc cggcgcgctc 360 caggacttct cctggaccaa cgcgatgctg gcgtggcagc gcacggcgtt ccacttccag 420 ccccccaaga actggatgaa cggttagttg gacccgtcgc catcggtgac gacgcgcgga 480 tcgttttttt cttttttcct ctcgttctgg ctctaacttg gttccgcgtt tctgtcacgg 540 acgcctcgtg cacatggcga tacccgatcc gccggccgcg tatatctatc tacctcgacc 600 ggcttctcca gatccgaacg gtaagttgtt ggctccgata cgatcgatca catgtgagct 660 cggcatgctg cttttctgcg cgtgcatgcg gctcctagca ttccacgtcc acgggtcgtg 720 acatcaatgc acgatataat cgtatcggta cagagatatt gtcccatcag ctgctagctt 780 tcgcgtattg atgtcgtgac attttgcacg caggtccgct gtatcacaag ggctggtacc 840 acctcttcta ccagtggaac ccggactccg cggtatgggg caacatcacc tggggccacg 900 ccgtctcgcg cgacctcctc cactggctgc acctaccgct ggccatggtg cccgatcacc 960 cgtacgacgc caacggcgtc tggtccgggt cggcgacgcg cctgcccgac ggccggatcg 1020 tcatgctcta cacgggctcc acggcggagt cgtcggcgca ggtgcagaac ctcgcggagc 1080 cggccgacgc gtccgacccg ctgctgcggg agtgggtcaa 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gccttttctt ttttcctttg 1980 ttttgttgtg gatcgtccaa cacaaggaaa ataggatcat ccaacaaaca tggaagtaat 2040 cccgtaaaac atttctcaag gaaccatcta gctagacgag cgtggcatga tccatgcatg 2100 cacaaacact agataggtct ctgcagctgt gatgttcctt tacatatacc accgtccaaa 2160 ctgaatccgg tctgaaaatt gttcaagcag agaggccccg atcctcacac ctgtacacgt 2220 ccctgtacgc gccgtcgtgg tctcccgtga tcctgccccg tcccctccac gcggccacgc 2280 ctgctgcagc gctctgtaca agcgtgcacc acgtgagaat ttccgtctac tcgagcctag 2340 tagttagacg ggaaaacgag aggaagcgca cggtccaagc acaacacttt gcgcgggccc 2400 gtgacttgtc tccggttggc tgagggcgcg cgacagagat gtatggcgcc gcggcgtgtc 2460 ttgtgtcttg tcttgcctat acaccgtagt cagagactgt gtcaaagccg tccaacgaca 2520 atgagctagg aaacgggttg gagagctggg ttcttgcctt gcctcctgtg atgtctttgc 2580 cttgcatagg gggcgcagta tgtagctttg cgttttactt cacgccaaag gatactgctg 2640 atcgtgaatt attattatta tatatatatc gaatatcgat ttcgtcgctc tcgtggggtt 2700 ttattttcca gactcaaact tttcaaaagg cctgtgtttt agttcttttc ttccaattga 2760 gtaggcaagg cgtgtgagtg tgaccaacgc atgcatggat atcgtggtag actggtagag 2820 ctgtcgttac cagcgcgatg cttgtatatg tttgcagtat tttcaaatga atgtctcagc 2880 tagcgtacag ttgaccaagt cgacgtggag ggcgcacaac agacctctga cattattcac 2940 ttttttttta ccatgccgtg cacgtgcagt caatccccag gacggtcctc ctggacacga 3000 agacgggcag caacctgctc cagtggccgg tggtggaggt ggagaacctc cggatgagcg 3060 gcaagagctt cgacggcgtc gcgctggacc gcggatccgt cgtgcccctc gacgtcggca 3120 aggcgacgca ggtgacgccg cacgcagcct gctgcagcga acgaactcgc gcgttgccgg 3180 cccgcggcca gctgacttag tttctctggc tgatcgaccg tgtgcctgcg tgcgtgcagt 3240 tggacatcga ggctgtgttc gaggtggacg cgtcggacgc ggcgggcgtc acggaggccg 3300 acgtgacgtt caactgcagc accagcgcag gcgcggcggg ccggggcctg ctcggcccgt 3360 tcggccttct cgtgctggcg gacgacgact tgtccgagca gaccgccgtg tacttctacc 3420 tgctcaaggg cacggacggc agcctccaaa ctttcttctg ccaagacgag ctcaggtatg 3480 tatgttatga cttatgacca tgcatgcatg cgcatttctt agctaggctg tgaagcttct 3540 tgttgagttg tttcacagat gcttaccgtc tgctttgttt cgtatttcga ctaggcatcc 3600 aaggcgaacg atctggttaa gagagtatac gggagcttgg tccctgtgct agatggggag 3660 aatctctcgg tcagaatact ggtaagtttt tacagcgcca gccatgcatg tgttggccag 3720 ccagctgctg gtactttgga cactcgttct tctcgcactg ctcattattg cttctgatct 3780 ggatgcacta caaattgaag gttgaccact ccatcgtgga gagctttgct caaggcggga 3840 ggacgtgcat cacgtcgcga gtgtacccca cacgagccat ctacgactcc gcccgcgtct 3900 tcctcttcaa caacgccaca catgctcacg tcaaagcaaa atccgtcaag atctggcagc 3960 tcaactccgc ctacatccgg ccatatccgg caacgacgac ttctctatga ctaaattaag 4020 tgacggacag ataggcgata ttgcatactt gcatcatgaa ctcatttgta caacagtgat 4080 tgtttaattt atttgctgcc ttccttatcc ttcttgtgaa actatatggt acacacatgt 4140 atcattaggt ctagtagtgt tgttgcaaag acacttagac accagaggtt ccaggagtat 4200 cagagataag gtataagagg gagcagggag cag 4233 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 64 tgttcggttc cctctaccaa 20 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 65 caacatccat caccttgact ga 22 <210> 66 <211> 24 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agtttacttt agatgtcaaa tgtgtagatg 600 atcaaactag acatgtgaca actgcagatt taaagactgc tgatccatgt gtagttcctg 660 ctacatctaa aaatagagat gctgatgcca atgaatatgg tgaatcagat gatattttga 720 ttgttaaatt aagaaaagga caagagctta aattgagggc ctttgctaag aaaggttttg 780 gtaaggaaca tgctaagtgg aatcctactg ctggggtttg ttttgagtat gaccctgaca 840 actcaatgag gcatacactg tttccaaaac cagatgagtg gccaaaaagt gaatatactg 900 aattagatga ggatcagtat gaagctccat ttaattggga agccaaacct aacaaatttt 960 tcttcaatgt tgaaagttgt ggatctttgc gccccgaaaa catagtatta aaaggagtag 1020 aagttctaaa atataaactt tctgatttat taattcaatt gagtcatgaa tcagctggcc 1080 aagttgatca tatgcctgtt taaccagttt ttgtgataaa ttattatctg aaataattca 1140 attattatat ttatattaat gtaaaataaa aagaaatttg ataactgaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaatctatt gaaagaatac attcattaat acctttctaa agaaaaatta ttcaatttaa 1260 aattgttgcc aaaaagtatt cagcattttt ttaaaattca atctaggcat atactactgt 1320 aaataaatac aaacaatact ttcatttttg tactgttcta aaaattgt 1368 <210> 77 <211> 276 <212> PRT <213> Euschistus heros <400> 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tgtttttgat gatttcgacg agatctattg cgatagtagg tacttcagat aagaggattc 600 tccttagagc attagcatag gagactgtaa tcccagtgag agtgaatttg atgtgttcgt 660 cgttttgttc gtgaattgta attttcatga gaaagctgga gggcaaaaga aatgaagtaa 720 atttagaagg gaacacctgt gaagtatgat cgactacg 758 <210> 79 <211> 229 <212> PRT <213> Euschistus heros <400> 79 Met Lys Ile Thr Ile His Glu Gln Asn Asp Glu His Ile Lys Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Gly Ile Thr Val Ser Tyr Ala Asn Ala Leu Arg Arg Ile Leu 20 25 30 Leu Ser Glu Val Pro Thr Ile Ala Ile Asp Leu Val Glu Ile Ile Lys 35 40 45 Asn Asn Thr Val Leu Pro Asp Glu Val Leu Ala Gln Ser Leu Gly Leu 50 55 60 Ile Pro Met Tyr Ser Lys Lys Glu Leu Val Tyr Lys Glu Glu Cys Asp 65 70 75 80 Cys Asp Glu Leu Cys Ser Arg Cys Ser Val Glu Met Glu Leu Asp Val 85 90 95 Ser Asn Thr Ser Glu Thr Pro Leu Asn Val Thr Cys Lys Asp Ile Lys 100 105 110 Phe Asp Ser Asp Glu Thr Phe Ile Lys Ser Thr Pro Val Ile Ala Lys 115 120 125 Leu Gly Lys Asn Gln Ser Leu Lys Ile Arg Cys Ile Ala Arg Lys Gly 130 135 140 Ile Gly Arg Met His Ala Lys Trp Ser Pro Val Ser Val Val Gly Phe 145 150 155 160 Glu Tyr Asp Arg Thr Asn Lys Thr Arg Ser Thr Asn Tyr Trp Thr Glu 165 170 175 Asp Thr Leu Lys Lys Asp Trp Pro Met Val Glu Glu Glu Glu Pro Asp 180 185 190 Leu Leu Cys Glu Ile Asp Thr Val His Met Asp Val Glu Val Val Glu 195 200 205 Gly Ser Leu Lys Pro Val Asp Val Leu Ile Lys Gly Leu Glu Ile Leu 210 215 220 Lys Asn Lys Phe Tyr 225 <210> 80 <211> 255 <212> DNA <213> Euschistus heros <400> 80 ggtgaatcag atgatatttt gattgttaaa ttaagaaaag gacaagagct taaattgagg 60 gcctttgcta agaaaggttt tggtaaggaa catgctaagt ggaatcctac tgctggggtt 120 tgttttgagt atgaccctga caactcaatg aggcatacac tgtttccaaa accagatgag 180 tggccaaaaa gtgaatatac tgaattagat gaggatcagt atgaagctcc atttaattgg 240 gaagccaaac ctaac 255 <210> 81 <211> 111 <212> DNA <213> Euschistus heros <400> 81 ttgttttgag tatgaccctg acaactcaat gaggcataca ctgtttccaa aaccagatga 60 gtggccaaaa agtgaatata ctgaattaga tgaggatcag tatgaagctc c 111 <210> 82 <211> 398 <212> DNA <213> Euschistus heros <400> 82 cgtcgaaatc atcaaaaaca acacggtcct ccccgatgaa gtattggcac agtcccttgg 60 gcttatccca atgtactcaa agaaagagct tgtgtataaa gaagagtgtg actgtgatga 120 gctttgctct cgttgttccg tagagatgga acttgatgtt agcaacacct cagagacccc 180 ccttaacgtg acttgtaaag acataaaatt tgacagtgac gagactttta taaaaagcac 240 accggtaatt gcaaaacttg ggaagaatca aagcctgaaa attaggtgta ttgctaggaa 300 ggggataggg aggatgcatg ccaagtggtc tcctgtctct gttgtcgggt tcgagtatga 360 tagaaccaat aagactaggt ccacaaacta ctggacag 398 <210> 83 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 83 ttaatacgac tcactatagg gagaggtgaa tcagatgata ttttgattg 49 <210> 84 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 84 ttaatacgac tcactatagg gagagttagg tttggcttcc caattaaatg 50 <210> 85 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 85 ttaatacgac tcactatagg gagattgttt tgagtatgac cctgacaac 49 <210> 86 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 86 ttaatacgac tcactatagg gagaggagct tcatactgat cctcatctaa ttc 53 <210> 87 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 87 ttaatacgac tcactatagg gagacgtcga aatcatcaaa aacaacacg 49 <210> 88 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 88 ttaatacgac tcactatagg gagactgtcc agtagtttgt ggacctag 48 <210> 89 <211> 301 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized artificial sequence <400> 89 catctggagc acttctcttt catgggaaga ttccttacgt tgtggagatg gaagggaatg 60 ttgatggcca cacctttagc atacgtggga aaggctacgg agatgcctca gtgggaaagg 120 ttgatgcaca gttcatctgc acaactggtg atgttcctgt gccttggagc acacttgtca 180 ccactctcac ctatggagca cagtgctttg ccaagtatgg tccagagttg aaggacttct 240 acaagtcctg tatgccagat ggctatgtgc aagagcgcac aatcaccttt gaaggagatg 300 g 301 <210> 90 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 90 ttaatacgac tcactatagg gagagcatct ggagcacttc tctttca 47 <210> 91 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 91 ttaatacgac tcactatagg gagaccatct ccttcaaagg tgattg 46 <210> 92 <211> 961 <212> RNA <213> Diabrotica virgifera <400> 92 gccgaugcca uacauacgcu uaaaacaucg uaucugcuca guucuuuaau uaacacugaa 60 gaaaaucgaa uuauaaaaug cccuacgcua acacaccguc aguacaaauu ucugaacuaa 120 ccgaugaaaa uguuaaguuc gucguugagg acacagaccu uagcuuggca aacagucuac 180 gucguguuuu caucgcugaa acuccaaccc uagcaaucga uuggguucaa uucgaagcca 240 acuccacugu acuggcagau gaauuccuug cccaucgaau uggcuugauu ccauugauuu 300 ccgaugaggu aguggacaga auccaaaaca cucgugaaug uucaugcuug gacuuuugca 360 ccgagugcag uguggaauuu acauuggaug ucaaaugcag cgacgaacau acgcgccacg 420 uuaccacggc cgauuuaaag uccagugacg cacgagugcu accaguuacg uccagacauc 480 gcgaugacga ggacaacgaa uauggagaga cgaacgauga aauucugauc aucaaacugc 540 gcaaagguca agagcugaag uugcgagcau acgcgaaaaa ggguuucggc aaggaacaug 600 ccaaauggaa uccaacggcu ggcguuagcu uugaauacga uccagucaau ucgaugagac 660 auacccugua cccgaagccg gacgaauggc cgaaaaguga gcacaccgaa cuugacgaug 720 aucaauacga agcugaauau aacugggagg cuaagccgaa caaguuuuuc uucaacguug 780 agucgagugg ugcacuucga ccggaaaaca uugugcugau gggagucaaa guuuugaaaa 840 acaaauuguc caaucuacag acgcaguuaa gucacgaauu gacuacaaac gaugcgcucg 900 ugauucagua aaagcagcga ucccauugaa uuucuucaaa aucuuguuuu uuuccucuaa 960 g 961 <210> 93 <211> 1110 <212> RNA <213> Diabrotica virgifera <400> 93 cguugacacu guugacagug acaguugaaa uugaaaaccg gauuagagaa guuuucuugg 60 aaaguuguuu uuuuaaauaa cuaacauuaa auagaaguua uuuguuuaag gguuuaauau 120 gccauaugca aaucagccau caguucauau aacagauuua acagaugaua auugcaaauu 180 uuauauagaa gacacugauu uaaguguugc gaauagcauu cgccgcgucc uuauugcaga 240 aacuccuacu cuagcuauag acuggguaaa auuagaagcu aacucaacug uucucaguga 300 ugaauuuuua gcacaccgaa uuggauugau accauuaguu uccgaugaag uuguacaaag 360 auuacaauau ccuagggacu gcguaugucu cgauuuuugu caagaaugca guguugaauu 420 uacuuuagau guaaaaugua cagaugauca aacucgacau guaacaacug ccgauuuuaa 480 aucuagugau ccacgaguca uaccagcuac uuccaaacau cgugaugaug aauccucaga 540 guauggugaa acagaugaaa uucuuauuau uaaacugcga aagggucaag agcuuaaagu 600 uaaagcguau gccaaaaaag gcuuuggaaa agagcaugcc aaauggaauc cuacaugugg 660 uguugccuuu gaauaugauc cugauaacgc uaugagacau acauuauuuc cuaaaccaga 720 cgaauggccu aaaagugaau acagcgaauu agaagaugau caguaugaag cuccauauaa 780 cugggaauua aaaccuaaua aauucuucua caauguggag gcugcuggau uguugaaacc 840 agaaaauauu gucaucaugg guguagcuau guuaaaagaa aaacugucaa auuugcaaac 900 acaacucagc cacgaacuaa caccugaugu uuuggccauu ccaauuuaag aaguuaauua 960 caaucauagg uagaguucau ucaaccacag uuauacauuu uuuuuauaau agauaaguaa 1020 guuuuacacu auaggaacaa uuuuugacau guugacuaaa gaucuuguuc aaauagacua 1080 gaaauaaaau uuugaaucca aaaaaaaaaa 1110 <210> 94 <211> 483 <212> RNA <213> Diabrotica virgifera <400> 94 gaauuccuug cccaucgaau uggcuugauu ccauugauuu ccgaugaggu aguggacaga 60 auccaaaaca cucgugaaug uucaugcuug gacuuuugca ccgagugcag uguggaauuu 120 acauuggaug ucaaaugcag cgacgaacau acgcgccacg uuaccacggc cgauuuaaag 180 uccagugacg cacgagugcu accaguuacg uccagacauc gcgaugacga ggacaacgaa 240 uauggagaga cgaacgauga aauucugauc aucaaacugc gcaaagguca agagcugaag 300 uugcgagcau acgcgaaaaa ggguuucggc aaggaacaug ccaaauggaa uccaacggcu 360 ggcguuagcu uugaauacga uccagucaau ucgaugagac auacccugua cccgaagccg 420 gacgaauggc cgaaaaguga gcacaccgaa cuugacgaug aucaauacga agcugaauau 480 aac 483 <210> 95 <211> 496 <212> RNA <213> Diabrotica virgifera <400> 95 guucucagug augaauuuuu agcacaccga auuggauuga uaccauuagu uuccgaugaa 60 guuguacaaa gauuacaaua uccuagggac ugcguauguc ucgauuuuug ucaagaaugc 120 aguguugaau uuacuuuaga uguaaaaugu acagaugauc aaacucgaca uguaacaacu 180 gccgauuuua aaucuaguga uccacgaguc auaccagcua cuuccaaaca ucgugaugau 240 gaauccucag aguaugguga aacagaugaa auucuuauua uuaaacugcg aaagggucaa 300 gagcuuaaag uuaaagcgua ugccaaaaaa ggcuuuggaa aagagcaugc caaauggaau 360 ccuacaugug guguugccuu ugaauaugau ccugauaacg cuaugagaca uacauuauuu 420 ccuaaaccag acgaauggcc uaaaagugaa uacagcgaau uagaagauga ucaguaugaa 480 gcuccauaua acuggg 496 <210> 96 <211> 132 <212> RNA <213> Diabrotica virgifera <400> 96 cuuuagaugu aaaauguaca gaugaucaaa cucgacaugu aacaacugcc gauuuuaaau 60 cuagugaucc acgagucaua ccagcuacuu ccaaacaucg ugaugaugaa uccucagagu 120 auggugaaac ag 132 <210> 97 <211> 125 <212> RNA <213> Diabrotica virgifera <400> 97 gcguaugcca aaaaaggcuu uggaaaagag caugccaaau ggaauccuac augugguguu 60 gccuuugaau augauccuga uaacgcuaug agacauacau uauuuccuaa accagacgaa 120 uggcc 125 <210> 98 <211> 1368 <212> RNA <213> Euschistus heros <400> 98 guucggcucg ggugaguguu uaaaccaacu acgcaucuug uucucgaacc uuugcgaaca 60 guguucacaa auaaugcucg guugguguaa agguaccuuu agagcgugac cccaacuucu 120 uuugacucac cuugcagaaa cucgaucacu aacaauuacg uguauauaau cgauucacua 180 cacgaacgau acaugguugu uuagguuaca uucauguuau cuuuaguaau gaaguuauug 240 aguuggccua auuguugaau guaguuaaca gaaugccuua ugccaaucaa ccuucuguuc 300 auguuucaga uuuaaccgac gacaauguua aauuccaaau agaagauaca gaauuaagug 360 ucgcuaacag ccucagaaga gucuucauag cugaaacccc aacuuuagcu auugauuggg 420 ugcaauuguc ugcaaauucu acuguuuuaa gugaugaauu uauugcuucu agaaucggac 480 uuauuccuuu aacuucugau gcugcagucg aaaaauuaau cuauucuagg gacuguaauu 540 guacugauuu cugcccaucc uguaguguug aguuuacuuu agaugucaaa uguguagaug 600 aucaaacuag acaugugaca acugcagauu uaaagacugc ugauccaugu guaguuccug 660 cuacaucuaa aaauagagau gcugaugcca augaauaugg ugaaucagau gauauuuuga 720 uuguuaaauu aagaaaagga caagagcuua aauugagggc cuuugcuaag aaagguuuug 780 guaaggaaca ugcuaagugg aauccuacug cugggguuug uuuugaguau gacccugaca 840 acucaaugag gcauacacug uuuccaaaac cagaugagug gccaaaaagu gaauauacug 900 aauuagauga ggaucaguau gaagcuccau uuaauuggga agccaaaccu aacaaauuuu 960 ucuucaaugu ugaaaguugu ggaucuuugc gccccgaaaa cauaguauua aaaggaguag 1020 aaguucuaaa auauaaacuu ucugauuuau uaauucaauu gagucaugaa ucagcuggcc 1080 aaguugauca uaugccuguu uaaccaguuu uugugauaaa uuauuaucug aaauaauuca 1140 auuauuauau uuauauuaau guaaaauaaa aagaaauuug auaacugaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaucuauu gaaagaauac auucauuaau accuuucuaa agaaaaauua uucaauuuaa 1260 aauuguugcc aaaaaguauu cagcauuuuu uuaaaauuca aucuaggcau auacuacugu 1320 aaauaaauac aaacaauacu uucauuuuug uacuguucua aaaauugu 1368 <210> 99 <211> 758 <212> RNA <213> Euschistus heros <400> 99 uguaaaacuu guucuuuaag aucucaagac cuuuuauuag aacaucuaca ggcuuaagag 60 agcccucuac aacuucuacg uccaugugca ccgugucuau uucacaaagg agaucugguu 120 cuuccuccuc aaccaucggc caguccuucu uaagcguauc uucuguccag uaguuugugg 180 accuagucuu auugguucua ucauacucga acccgacaac agagacagga gaccacuugg 240 caugcauccu cccuaucccc uuccuagcaa uacaccuaau uuucaggcuu ugauucuucc 300 caaguuuugc aauuaccggu gugcuuuuua uaaaagucuc gucacuguca aauuuuaugu 360 cuuuacaagu cacguuaagg ggggucucug agguguugcu aacaucaagu uccaucucua 420 cggaacaacg agagcaaagc ucaucacagu cacacucuuc uuuauacaca agcucuuucu 480 uugaguacau ugggauaagc ccaagggacu gugccaauac uucaucgggg aggaccgugu 540 uguuuuugau gauuucgacg agaucuauug cgauaguagg uacuucagau aagaggauuc 600 uccuuagagc auuagcauag gagacuguaa ucccagugag agugaauuug auguguucgu 660 cguuuuguuc gugaauugua auuuucauga gaaagcugga gggcaaaaga aaugaaguaa 720 auuuagaagg gaacaccugu gaaguaugau cgacuacg 758 <210> 100 <211> 255 <212> RNA <213> Euschistus heros <400> 100 ggugaaucag augauauuuu gauuguuaaa uuaagaaaag gacaagagcu uaaauugagg 60 gccuuugcua agaaagguuu ugguaaggaa caugcuaagu ggaauccuac ugcugggguu 120 uguuuugagu augacccuga caacucaaug aggcauacac uguuuccaaa accagaugag 180 uggccaaaaa gugaauauac ugaauuagau gaggaucagu augaagcucc auuuaauugg 240 gaagccaaac cuaac 255 <210> 101 <211> 111 <212> RNA <213> Euschistus heros <400> 101 uuguuuugag uaugacccug acaacucaau gaggcauaca cuguuuccaa aaccagauga 60 guggccaaaa agugaauaua cugaauuaga ugaggaucag uaugaagcuc c 111 <210> 102 <211> 398 <212> RNA <213> Euschistus heros <400> 102 cgucgaaauc aucaaaaaca acacgguccu ccccgaugaa guauuggcac agucccuugg 60 gcuuauccca auguacucaa agaaagagcu uguguauaaa gaagagugug acugugauga 120 gcuuugcucu cguuguuccg uagagaugga acuugauguu agcaacaccu cagagacccc 180 ccuuaacgug acuuguaaag acauaaaauu ugacagugac gagacuuuua uaaaaagcac 240 accgguaauu gcaaaacuug ggaagaauca aagccugaaa auuaggugua uugcuaggaa 300 ggggauaggg aggaugcaug ccaagugguc uccugucucu guugucgggu ucgaguauga 360 uagaaccaau aagacuaggu ccacaaacua cuggacag 398 <210> 103 <211> 437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding Diabrotica rpII33-2 v1 dsRNA <400> 103 ctttagatgt aaaatgtaca gatgatcaaa ctcgacatgt aacaactgcc gattttaaat 60 ctagtgatcc acgagtcata ccagctactt ccaaacatcg tgatgatgaa tcctcagagt 120 atggtgaaac aggaagctag taccagtcat cacgctggag cgcacatata ggccctccat 180 cagaaagtca ttgtgtatat ctctcatagg gaacgagctg cttgcgtatt tcccttccgt 240 agtcagagtc atcaatcagc tgcaccgtgt cgtaaagcgg gacgttcgca agctcgtccg 300 cggtactgtt tcaccatact ctgaggattc atcatcacga tgtttggaag tagctggtat 360 gactcgtgga tcactagatt taaaatcggc agttgttaca tgtcgagttt gatcatctgt 420 acattttaca tctaaag 437 <210> 104 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding Diabrotica rpII33-2 v2 dsRNA <400> 104 gcgtatgcca aaaaaggctt tggaaaagag catgccaaat ggaatcctac atgtggtgtt 60 gcctttgaat atgatcctga taacgctatg agacatacat tatttcctaa accagacgaa 120 tggccgaagc tagtaccagt catcacgctg gagcgcacat ataggccctc catcagaaag 180 tcattgtgta tatctctcat agggaacgag ctgcttgcgt atttcccttc cgtagtcaga 240 gtcatcaatc agctgcaccg tgtcgtaaag cgggacgttc gcaagctcgt ccgcggtagg 300 ccattcgtct ggtttaggaa ataatgtatg tctcatagcg ttatcaggat catattcaaa 360 ggcaacacca catgtaggat tccatttggc atgctctttt ccaaagcctt ttttggcata 420 cgc 423 <210> 105 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe RPII33-2 v1 PRB Set 2 <400> 105 agtgatccac gagtcatacc agctact 27 <210> 106 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe RpII33-2 v2 PRB Set 2 <400> 106 tgtggtgttg cctttgaata tgatcctga 29 <210> 107 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA loop polynucleotide <400> 107 gaagctagta ccagtcatca cgctggagcg cacatatagg ccctccatca gaaagtcatt 60 gtgtatatct ctcataggga acgagctgct tgcgtatttc ccttccgtag tcagagtcat 120 caatcagctg caccgtgtcg taaagcggga cgttcgcaag ctcgtccgcg gta 173 <210> 108 <211> 437 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpII33-2 v1 dsRNA <400> 108 cuuuagaugu aaaauguaca gaugaucaaa cucgacaugu aacaacugcc gauuuuaaau 60 cuagugaucc acgagucaua ccagcuacuu ccaaacaucg ugaugaugaa uccucagagu 120 auggugaaac aggaagcuag uaccagucau cacgcuggag cgcacauaua ggcccuccau 180 cagaaaguca uuguguauau cucucauagg gaacgagcug cuugcguauu ucccuuccgu 240 agucagaguc aucaaucagc ugcaccgugu cguaaagcgg gacguucgca agcucguccg 300 cgguacuguu ucaccauacu cugaggauuc aucaucacga uguuuggaag uagcugguau 360 gacucgugga ucacuagauu uaaaaucggc aguuguuaca ugucgaguuu gaucaucugu 420 acauuuuaca ucuaaag 437 <210> 109 <211> 423 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpII33 v2 dsRNA <400> 109 gcguaugcca aaaaaggcuu uggaaaagag caugccaaau ggaauccuac augugguguu 60 gccuuugaau augauccuga uaacgcuaug agacauacau uauuuccuaa accagacgaa 120 uggccgaagc uaguaccagu caucacgcug gagcgcacau auaggcccuc caucagaaag 180 ucauugugua uaucucucau agggaacgag cugcuugcgu auuucccuuc cguagucaga 240 gucaucaauc agcugcaccg ugucguaaag cgggacguuc gcaagcucgu ccgcgguagg 300 ccauucgucu gguuuaggaa auaauguaug ucucauagcg uuaucaggau cauauucaaa 360 ggcaacacca cauguaggau uccauuuggc augcucuuuu ccaaagccuu uuuuggcaua 420 cgc 423 <210> 110 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RpII33-2 v2 FWD Set 2 <400> 110 aaagagcatg ccaaatgga 19 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RpII33-2 v2 REV Set 2 <400> 111 ggccattcgt ctggtttag 19

Claims (61)

  1. 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산으로, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는
    서열번호:1; 서열번호:1의 상보체; 서열번호:1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:5을 포함하는 디아브로티카(Diabrotica) 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호:5을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호:5을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:5을 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체;
    서열번호:3; 서열번호:3의 상보체; 서열번호:3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:6-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호:6-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호:6-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:6-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체;
    서열번호:76; 서열번호:76의 상보체; 서열번호:76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:80 또는 서열번호:81을 포함하는 유쉬스투스 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호:80 또는 서열번호:81을 포함하는 유쉬스투스 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호:80 또는 서열번호:81을 포함하는 유쉬스투스 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:80 또는 서열번호:81을 포함하는 유쉬스투스 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체;
    서열번호:78; 서열번호:78의 상보체; 서열번호:78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:82를 포함하는 유쉬스투스 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호:82를 포함하는 유쉬스투스 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호:82를 포함하는 유쉬스투스 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:82를 포함하는 유쉬스투스 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체,로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 단리된 핵산.
  2. 제1항의 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호:1; 서열번호:1의 상보체; 서열번호:3; 서열번호:3의 상보체; 서열번호:1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체,로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항의 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호:1, 서열번호:3, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 및 상기 중 어느 하나의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유기체는 D. v. 비르기페라 르콩트; D. 바르베리 스미스 및 로렌스; D. u. 호와르디; D. v. 제아에; D. 발테아타 르콩트; D. u. 테넬라; D. 스페시오사 게르마; 및 D. u. 운데심푼크타타 만네르헤임으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터.
  6. 제1항의 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 리보핵산 (RNA) 분자.
  7. 제1항의 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 생산된 이중-가닥 RNA 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 딱정벌레류 또는 노린재류 곤충과 접촉시키는 것은 상기 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 내인성 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제하는 이중-가닥 리보핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 리보뉴클레오티드 분자를 딱정벌레류 또는 노린재류 곤충과 접촉시키는 것은 상기 곤충을 사멸시키거나 상기 곤충의 성장, 생식 및/또는 섭식을 억제하는 이중-가닥 리보핵산 분자.
  10. 제7항의 이중-가닥 RNA로서, 제1, 제2 및 제3 RNA 절편을 포함하고, 여기서 상기 제1 RNA 절편은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 제3 RNA 절편은 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 상기 제1 RNA 절편에 연결되고, 여기서 상기 제3 RNA 절편은 실질적으로 상기 제1 RNA 절편의 역 상보체이어서, 상기 제1 및 제3 RNA 절편은 리보핵산으로 전사될 때 혼성화되어 상기 이중-가닥 RNA를 형성하는 것인 이중-가닥 RNA.
  11. 제6항의 RNA로서, 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 리보핵산 분자 및 단일-가닥 리보핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA.
  12. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터로, 여기서 상기 이종 프로모터가 식물 세포에서 기능적인 것인 식물 형질전환 벡터.
  13. 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인 세포.
  15. 제13항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포인 세포.
  17. 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물.
  18. 제17항의 식물의 종자로, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 종자.
  19. 제17항의 식물로부터 생산된 범용 제품으로, 여기서 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 범용 제품.
  20. 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 식물에서 이중-가닥 리보핵산 분자로서 발현되는 것인 식물.
  21. 제16항에 있어서, 상기 세포는 옥수수, 대두 또는 목화 세포인 세포.
  22. 제17항에 있어서, 상기 식물은 옥수수, 대두 또는 목화인 식물.
  23. 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 식물에서 리보핵산 분자로서 발현되고, 딱정벌레류 또는 노린재류 곤충이 상기 식물의 일부를 섭취할 때 상기 리보핵산 분자는 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 내인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 것인 식물.
  24. 제1항의 폴리뉴클레오티드로서, 내인성 곤충 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자를 코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  25. 제24항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터로, 여기서 상기 추가의 폴리뉴클레오티드(들)는 각각 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 식물 형질전환 벡터.
  26. 딱정벌레류 또는 노린재류 해충 집단을 방제하기 위한 방법으로, 상기 방법은 상기 해충과의 접촉 시 상기 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 리보핵산 (RNA) 분자를 포함하는 작용제를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 RNA는 서열번호:92-102 중 어느 하나; 서열번호:92-102 중 어느 하나의 상보체; 서열번호:92-102 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:92-102 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 전사물; 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 전사물의 상보체; 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 전사물의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:1, 3, 5-8, 76, 78, 및 80-82 중 어느 하나의 전사물의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체,로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능한 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 작용제의 RNA는 서열번호:92 및 93; 서열번호:92 또는 93의 상보체; 서열번호:92 또는 93의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:92 또는 93의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:1 또는 3의 전사물; 서열번호:1 또는 3의 전사물의 상보체; 서열번호:1 또는 3의 전사물의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호:1 또는 3의 전사물의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체,로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능한 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 작용제는 이중-가닥 RNA 분자인 방법.
  29. 딱정벌레류 해충 집단을 방제하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    상기 딱정벌레류 해충과의 접촉 시 상기 딱정벌레류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 작용제를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호:92-97 중 어느 하나의 약 15 내지 약 30개의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 90% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타내는 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화되는 것인 방법.
  30. 노린재류 해충 집단을 방제하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    상기 노린재류 해충과의 접촉 시 상기 노린재류 해충 내의 생물학적 기능을 억제하도록 기능하는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 작용제를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호:98-102 중 어느 하나의 약 15 내지 약 30개의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 90% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타내는 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화되는 것인 방법.
  31. 딱정벌레류 해충 집단을 방제하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    딱정벌레류 해충의 숙주 식물에서 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 발현되어, 상기 집단에 속하는 딱정벌레류 해충과의 접촉 시 상기 딱정벌레류 해충 내의 타겟 서열의 발현을 억제하도록 기능하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 동일한 숙주 식물 종의 식물에 대한 동일한 해충 종의 생식에 비해, 상기 딱정벌레류 해충 또는 해충 집단의 감소된 성장 및/또는 생존을 야기하는 리보핵산 분자를 생산하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 리보핵산 분자는 이중-가닥 리보핵산 분자인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호:103 또는 서열번호:104를 포함하는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 딱정벌레류 해충 집단은 상기 형질전환된 식물 세포가 결여된 동일한 종의 숙주 식물에 침입하는 딱정벌레류 해충 집단에 비해 감소되는 것인 방법.
  35. 식물에서 딱정벌레류 해충 침입을 방제하는 방법으로, 상기 방법은
    서열번호:92-97;
    서열번호:92-97 중 어느 하나의 상보체;
    서열번호:92-97 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편;
    서열번호:92-97 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체;
    서열번호:1, 3 및 5-8 중 어느 하나의 전사물;
    서열번호:1, 3 및 5-8 중 어느 하나의 전사물의 상보체;
    서열번호:1 또는 서열번호:3의 전사물의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및
    서열번호:1 또는 서열번호:3의 전사물의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체,로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능한 리보핵산 (RNA)을 딱정벌레류 해충의 먹이에서 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 먹이는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 형질전환된 식물 세포를 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 특이적으로 혼성화가능한 RNA는 이중-가닥 RNA 분자로 구성되는 것인 방법.
  38. 식물에서 노린재류 해충 침입을 방제하는 방법으로, 상기 방법은
    서열번호:98-102;
    서열번호:98-102 중 어느 하나의 상보체;
    서열번호:98-102 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편;
    서열번호:98-102 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체;
    서열번호:76, 78 및 80-82 중 어느 하나의 전사물;
    서열번호:76, 78 및 80-82 중 어느 하나의 전사물의 상보체;
    서열번호:76 또는 서열번호:78의 전사물의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 및
    서열번호:76 또는 서열번호:78의 전사물의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체,로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화가능한 리보핵산(RNA)과 노린재류 해충을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 노린재류 해충을 상기 RNA와 접촉시키는 것은 상기 RNA를 포함하는 조성물로 상기 식물을 분무하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 특이적으로 혼성화가능한 RNA는 이중-가닥 RNA 분자로 구성되는 것인 방법.
  41. 작물의 수확량을 개선하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    제1항의 핵산을 작물 식물 내로 도입해서 트랜스제닉 작물 식물을 생산하는 단계; 및
    상기 작물 식물을 재배해서 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 단계를 포함하고; 여기서 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현은 곤충 해충 생식 또는 성장 및 곤충 해충 감염으로 인한 수확량의 손실을 억제하고,
    여기서 상기 작물 식물은 옥수수, 대두 또는 목화인 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현은 상기 작물 식물의 부분을 접촉한 곤충 해충에서 적어도 제1 타겟 유전자를 억제하는 RNA 분자를 생산하는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호:1, 서열번호:3, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 및 상기 중 어느 하나의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현은 상기 옥수수 식물의 부분을 접촉한 딱정벌레류 곤충 해충에서 적어도 제1 타겟 유전자를 억제하는 RNA 분자를 생산하는 것인 방법.
  45. 트랜스제닉 식물 세포를 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    식물 세포를 제1항의 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계;
    복수의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생을 가능하게 하는데 충분한 조건 하에 상기 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계;
    적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 그의 게놈 내로 편입된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계;
    상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 리보핵산(RNA) 분자의 발현에 대해 상기 형질전환된 식물 세포를 스크리닝하는 단계; 및
    상기 RNA를 발현하는 식물 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호:1; 서열번호:1의 상보체; 서열번호:3; 서열번호:3의 상보체; 서열번호:1 또는 서열번호:3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:1 또는 서열번호:3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호:5-8 중 어느 하나를 포함하는 디아브로티카 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체,로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 RNA 분자는 이중-가닥 RNA 분자인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호:103 또는 서열번호:104를 포함하는 것인 방법.
  49. 딱정벌레류 해충에 대해 보호된 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    제46항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계; 및
    상기 트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 리보핵산 분자의 발현은 형질전환된 식물을 접촉하는 딱정벌레류 해충에서 타겟 유전자의 발현을 조정하기에 충분한 것인 방법.
  50. 트랜스제닉 식물 세포를 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    식물에게 딱정벌레류 해충 보호를 제공하는 수단을 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
    복수의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생을 가능하게 하는데 충분한 조건 하에 상기 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계;
    식물에게 딱정벌레류 해충 보호를 제공하는 수단이 그의 게놈 내에 편입된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계;
    딱정벌레류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하는 수단의 발현에 대해 상기 형질전환된 식물 세포를 스크리닝하는 단계; 및
    딱정벌레류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하는 수단을 발현하는 식물 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 딱정벌레류 해충에 대해 보호된 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    제50항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계; 및
    상기 트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 단계를 포함하고, 여기서 딱정벌레류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하는 수단의 발현은 형질전환된 식물을 접촉하는 딱정벌레류 해충에서 타겟 유전자의 발현을 조정하기에 충분한 것인 방법.
  52. 트랜스제닉 식물 세포를 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    식물에게 노린재류 해충 보호를 제공하는 수단을 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
    복수의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생을 가능하게 하는데 충분한 조건 하에 상기 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계;
    식물에게 노린재류 해충 보호를 제공하는 수단이 그의 게놈 내에 편입된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계;
    노린재류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하는 수단의 발현에 대해 상기 형질전환된 식물 세포를 스크리닝하는 단계; 및
    노린재류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하는 수단을 발현하는 식물 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 노린재류 해충에 대해 보호된 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    제52항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계; 및
    상기 트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 단계를 포함하고, 여기서 노린재류 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하는 수단의 발현은 형질전환된 식물을 접촉하는 노린재류 해충에서 타겟 유전자의 발현을 조정하기에 충분한 것인 방법.
  54. 제1항에 있어서, 바실루스 투린기엔시스, 알칼리게네스(Alcaligenes) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종으로부터의 폴리펩티드, 및/또는 PIP-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 핵산.
  55. 제54항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A 및/또는 Cyt2C를 포함하는 군으로부터 선택된 B. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 것인 핵산.
  56. 제16항에 있어서, 상기 세포는 바실루스 투린기엔시스, 알칼리게네스(Alcaligenes) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종으로부터의 폴리펩티드, 및/또는 PIP-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  57. 제56항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A 및/또는 Cyt2C를 포함하는 군으로부터 선택된 B. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 것인 세포.
  58. 제17항에 있어서, 상기 식물은 바실루스 투린기엔시스, 알칼리게네스(Alcaligenes) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종으로부터의 폴리펩티드, 및/또는 PIP-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A 및/또는 Cyt2C를 포함하는 군으로부터 선택된 B. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 것인 식물.
  60. 제45항에 있어서, 상기 형질전환된 식물 세포는 바실루스 투린기엔시스, 알칼리게네스(Alcaligenes) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종으로부터의 폴리펩티드, 및/또는 PIP-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry6, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A 및/또는 Cyt2C를 포함하는 군으로부터 선택된 B. 투린기엔시스로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
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