BR112013025834B1 - Molécula de ácido nucleico recombinante codificadora de proteína pesticida, composição inibidora de insetos, e método para controlar uma praga de espécies de lepidóptero e/ou hemíptero - Google Patents

Abstract

família de toxina inibidora de inseto ativa contra insetos hemípteros e/ou lepidópteros". a presente invenção divulga um gênero de proteínas inibidoras de inseto que exibem propriedades dirigidas para controlar pragas de colheitas de lepidóptero e/ou hemíptero, a métodos para usar tais proteínas, sequências de nucleotídeos codificando essas proteínas, métodos para detectar e isolar essas proteínas e sua utilização em sistemas agrícolas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório US 61/472.865 depositado em 7 de Abril de 2011, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O arquivo chamado "38-21_58195_A_PCT_SEQUENCE-_LISTING_ST25.txt" contém a Listagem de Sequência que foi criada em 6 de Abril de 2012. Este arquivo é de 136 kb (medido em MS Windows), é simultaneamente depositado por apresentação eletrônica (usando o sistema de depósito EFS Web do Escritório de Patentes dos Estados Unidos), e é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se geralmente ao campo das proteínas inibidoras de insetos. Em particular, a presente invenção se refere a proteínas que exibem atividade inibidora de insetos contra pragas agriculturamente relevantes de plantas e sementes de colheita, particularmente espécies de pragas de insetos Lepidópteros e/ou Hemípteros.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] As proteínas inibidoras de insetos derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt) são conhecidas na técnica. Estas proteínas são usadas para controlar as pragas agriculturamente relevantes de plantas de colheita por pulverização de formulações contendo estas proteínas sobre as plantas/sementes ou expressando estas proteínas em plantas e sementes.

[0005] Apenas algumas proteínas de Bt foram desenvolvidas para uso em formulações ou como traços transgênicos para uso comercial pelos agricultores para controlar espécies de pragas de coleópteros e lepidópteros, e nenhuma proteína de Bt tem sido usada para o controle comercial de espécies de pragas de Hemíptero. Certas espécies de Hemíptero, particularmente insetos Lygus, são pragas do algodão e alfafa, e normalmente só são controladas usando produtos químicos de amplo espectro, por exemplo, endossulfam, acefato e oxamil, que pode persistir e prejudicar o meio ambiente. No entanto, a dependência de um número limitado destas proteínas de Bt estas pode resultar na ocorrência de novas pragas resistentes a estas proteínas, e a dependência de químicos de amplo espectro pode prejudicar o meio ambiente.

[0006] Assim, existe uma necessidade contínua para a descoberta e desenvolvimento comercial de novas proteínas ativas contra pragas de plantas de colheita.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] A presente invenção fornece um novo grupo, isto é, um novo gênero, de polipeptídeos inibidores de insetos (toxinas de proteínas), que são mostrados para exibir atividade inibidora contra uma ou mais pragas de plantas de colheita. Cada uma das proteínas pode ser usada sozinha ou em combinação umas com as outras e com outras proteínas de Bt e agentes tóxicos nas formulações e em planta, fornecendo alternativas às proteínas de Bt e inseticidas químicos atualmente usados em sistemas agrícolas.

[0008] Polipeptídeos recombinantes que exibem atividade inibidora de insetos contra espécies de pragas de Hemípteros e/ou Lepidópteros são fornecidos, que opcionalmente: (a) exibem pelo menos cerca de 47% a cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos, ou qualquer ponto de porcentagem entre 47% e 100%, a uma ou mais das proteínas tendo a sequência de aminoácidos como estabelecida em qualquer uma de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, ou SEQ ID NO: 24; (b) exibem pelo menos cerca de 56% a cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos, ou qualquer ponto de porcentagem entre 56% e 100%, a uma ou mais das proteínas tendo a sequência de aminoácidos como estabelecida em qualquer uma de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 136, ou SEQ ID NO: 138; (c) contêm na posição operável dentro do polipeptídeo, pelo menos um de cada um dos seis diferentes segmentos de peptídeo de motivo diferentes em ordem consecutiva M0, M1, M2, M3, M4 e M5, cada segmento de peptídeo de motivo exibindo pelo menos cerca de 80% de identidade para uma sequência de consenso especificada para o respectivo segmento de peptídeo de motivo, em que a sequência de consenso para o segmento de peptídeo de motivo M0 é estabelecida na SEQ ID NO: 31, a sequência de consenso para o segmento de peptídeo de motivo M1 é estabelecida na SEQ ID NO: 48, a sequência de consenso para o segmento de peptídeo de motivo M2 é estabelecida na SEQ ID NO: 53, a sequência de consenso para o motivo do segmento de peptídeo M3 é estabelecida na SEQ ID NO: 62, a sequência de consenso para o segmento de peptídeo de motivo M4 é estabelecida na SEQ ID NO: 65, e a sequência de consenso para o segmento de peptídeo de motivo M5 é estabelecida na SEQ ID NO: 139; (d) contêm em ligação operável dentro do polipeptídeo pelo menos um de cada um dos três segmentos de peptídeo de motivo diferentes M1t, M2t e M4t, em ordem consecutiva, em que cada segmento de peptídeo de motivo exibe pelo menos cerca de 80% de identidade com uma sequência de consenso especificada para o respectivo segmento de peptídeo de motivo, e em que a sequência de consenso para o segmento de peptídeo de motivo M1t é estabelecida na SEQ ID NO: 70, a sequência de consenso para o segmento de peptídeo de motivo M2t é estabelecida na SEQ ID NO: 87, e a sequência de consenso para o segmento de peptídeo de motivo M4t é estabelecida na SEQ ID NO: 120; (e) contêm uma sequência de aminoácidos que exibe de cerca de 195 a cerca de 386 identidades de aminoácidos com a sequência de aminoácidos exibida em qualquer uma de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 136, ou SEQ ID NO: 138; (f) contêm uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, de cerca de 56 a cerca de 100% de identidade com a sequência de aminoácidos exibida em qualquer uma de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, ou SEQ ID NO: 24; (g) contêm uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, de cerca de 56% a cerca de 100% de identidade, ou qualquer ponto de porcentagem entre 56% a 100% com a sequência de aminoácidos exibida em qualquer uma de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 136 e SEQ ID NO: 138, ou (h) são codificadas por um segmento de polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas de hibridação a uma ou mais das sequências de nucleotídeos estabelecidas em qualquer uma de SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: ll, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 135, ou SEQ ID NO: 137, ou o complemento das mesmas.

[0009] As composições inibidoras de insetos são fornecidas compreendendo os polipeptídeos recombinantes acima mencionados juntamente com os métodos para o controle de espécies de Lepidóptero e/ou Hemíptero usando tais polipeptídeos recombinantes.

[00010] Os polinucleotídeos recombinantes sao fornecidos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica os polipeptídeos recombinantes acima. As células de plantas transgênicas, plantas ou partes de plantas que compreendem tais polinucleotídeos e métodos de controle de uma praga de espécies de Lepidópteros e/ou Hemípteros usando estas células recombinantes de plantas transgênicas, plantas ou partes de plantas são também fornecidas.

[00011] Os produtos de plantas processadas que compreendem uma quantidade detectável de polinucleotídeo recombinante são fornecidos. Tais produtos processados incluem, mas não estão limitados a, biomassa vegetal, óleo, sêmola, ração animal, farinha, flocos, farelo, fibra, cascas e sementes processadas.

[00012] Métodos de preparar plantas transgênicas também são fornecidos. Tais métodos incluem a introdução do polinucleotídeo recombinante em uma célula de planta e seleção de uma planta transgênica que expressa uma quantidade inibidora de insetos do polipeptídeo recombinante codificado pelo polinucleotídeo recombinante.

[00013] Outras modalidades, características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, exemplos e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00014] A Figura 1 ilustra a estrutura primária de proteínas exemplificadas neste pedido de patente, mostrando as características de motivos e aspectos para cada uma das proteínas neste gênero. Cada proteína é descrita pelo nome, SEQ ID NO, esquema estrutural, e comprimento de aminoácido (isto é, o número de aminoácidos), e organizada em grupos ou clusters com base na identidade de aminoácidos entre as diferentes proteínas. As proteínas dentro de um grupo geralmente exibem pelo menos cerca de 90% de identidade de aminoácidos. Geralmente, a maioria das proteínas no gênero de novas proteínas aqui divulgada contém, em ligação operável dentro do polipeptídeo, pelo menos um de cada um dos seis motivos de assinatura diferentes (M) ou segmentos de peptídeos de motivo, cada motivo sendo único para este gênero de proteínas. Os motivos são referenciados aqui e numerados consecutivamente como M0, M1, M2, M3, M4 e M5. O motivo M0 é proximal ao terminal amino de cada toxina de proteína, e o motivo M5 é posicionado mais próximo do terminal carbóxi de cada toxina de proteína. O motivo M5 também pode estar presente em mais do que uma cópia de cada proteína. Cada motivo contém um segmento de aminoácidos de núcleo único para aquele motivo particular. A presença de qualquer um dos segmentos de peptídeos de motivo referenciados em uma proteína derivada de Bacillus thuringiensis ou de espécies relacionadas de bacilos, e a observação de tal proteína de atividade tóxica dirigida a uma ou mais espécies de Hemípteros e/ou Lepidópteros, é suficiente para fornecer a classificação de tal proteína, como estando dentro do escopo da presente invenção, particularmente, se o comprimento total da sequência de aminoácidos da proteína exibe pelo menos cerca de 47% ou mais identidade com qualquer uma das proteínas aqui incorporadas, incluindo as proteínas conforme estabelecidas na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, ou SEQ ID NO: 24. Os motivos secundários observados dentro de cada um dos principais motivos M0-M5 em algumas das proteínas da presente invenção são mencionados neste documento como M1t, M2t e M4t. Algumas das proteínas também contêm sítios de clivagem proteolítica KK, EH, TF, e FG, as posições relativas de cada um sendo marcadas em proteínas aplicáveis representadas na Figura 1 como [1], [2], [3] e [4], respectivamente (as duas letras representam os dois resíduos de aminoácidos escalonando o sítio de clivagem), são aspectos de proteínas dentro do escopo da presente invenção.

[00015] A Figura 2 é um diagrama de Venn que representa o perfil de atividade das proteínas da presente invenção. O Círculo [A] representa proteínas ativas de Lepidópteros, enquanto o Círculo [B] representa proteínas ativas de Hemípteros. A Área ['c'] é uma interseção dos Círculos [A] e [B], que representa proteínas que tiveram teste positivo para a atividade contra os insetos Lepidópteros e Hemípteros. A Área ['a'] é [A] menos ['c'], que representa proteínas que tiveram teste positivo para a atividade contra insetos Lepidópteros, mas não é positivo para qualquer atividade contra espécies Hemípteros indicado na dose em que a atividade de lepidópteros foi observada. A Área ['b'] é [B] menos ['c'], que representa proteínas que tiveram teste positivo para a atividade contra insetos Hemípteros, mas não positivo para a atividade contra as espécies de Lepidópteros indicadas na dose em que a atividade de espécies de Hemípteros foi observada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[00016] A SEQ ID NO: l é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bacillus thuringiensis (Bt) tendo uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1107 que codificam uma proteína TIC1498.

[00017] A SEQ ID NO: 2 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1498.

[00018] A SEQ ID NO: 3 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1158 que codificam uma proteína TIC1415.

[00019] A SEQ ID NO: 4 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1415.

[00020] A SEQ ID NO:5 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1158 que codificam uma proteína TIC1497.

[00021] A SEQ ID NO: 6 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1497.

[00022] A SEQ ID NO: 7 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1056 que codificam uma proteína TIC1886.

[00023] A SEQ ID NO: 8 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1886.

[00024] A SEQ ID NO: 9 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1158 que codificam uma proteína TIC 1925.

[00025] A SEQ ID NO: 10 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC 1925.

[00026] A SEQ ID NO: 11 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt tendo uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1053 codificam uma proteína TIC1414.

[00027] A SEQ ID NO: 12 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1414.

[00028] A SEQ ID NO: 13 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1104 que codificam uma proteína 1885 TIC.

[00029] A SEQ ID NO: 14 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1885.

[00030] A SEQ ID NO: 15 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1155 que codificam uma proteína TIC1922.

[00031] A SEQ ID NO: 16 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1922.

[00032] A SEQ ID NO: 17 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1056 que codificam uma proteína TIC1422.

[00033] A SEQ ID NO: 18 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1422.

[00034] A SEQ ID NO: 19 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1056 que codificam uma proteína TIC1974.

[00035] A SEQ ID NO: 20 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1974.

[00036] A SEQ ID NO: 21 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1155 que codificam uma proteína TIC2032.

[00037] A SEQ ID NO: 22 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC2032.

[00038] A SEQ ID NO: 23 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1104 que codificam uma proteína TIC2120.

[00039] A SEQ ID NO: 24 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC2120.

[00040] A SEQ ID NO: 25 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bt com uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1053 codificam uma proteína TIC1362.

[00041] A SEQ ID NO: 26 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC1362.

[00042] A SEQ ID NO: 27 é uma sequência de nucleotídeos artificial que codifica uma proteína TIC1415.

[00043] A SEQ ID NO: 28 é uma sequência de nucleotídeos artificial que codifica uma proteína TC1414.

[00044] A SEQ ID NO: 29 é uma sequência de nucleotídeos artificial que codifica uma proteína TIC1422.

[00045] A SEQ ID NO: 30 é uma sequência de nucleotídeos artificial que codifica uma proteína TIC1362.

[00046] A SEQ ID NO: 31 é uma sequência de aminoácidos de consenso para o segmento de motivo M0.

[00047] As SEQ ID NOs: 32-47 são, cada uma, sequências de aminoácidos individuais de cada uma das várias proteínas de toxinas aqui descritas que foram usadas na formulação da sequência de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 31.

[00048] A SEQ ID NO: 48 é uma sequência de aminoácidos de consenso para o segmento de motivo M1.

[00049] A SEQ ID NOs: 49-52 são, cada uma, sequências de aminoácidos individuais de cada uma das várias proteínas de toxinas aqui descritas que foram usadas na formulação da sequência de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 48.

[00050] A SEQ ID NO: 53 é uma sequência de aminoácidos de consenso para o segmento de motivo M2.

[00051] As SEQ ID NOs: 54-61 são, cada uma, sequências de aminoácidos individuais de cada uma das várias proteínas de toxinas aqui descritas que foram usadas na formulação da sequência de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 53.

[00052] A SEQ ID NO: 62 é uma sequência de aminoácidos de consenso para o segmento de motivo M3.

[00053] A SEQ ID NOs: 63-64 são, cada uma, sequências de aminoácidos individuais de cada uma das várias proteínas de toxinas aqui descritas que foram usadas na formulação da sequência de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 62.

[00054] A SEQ ID NO: 65 é uma sequência de aminoácidos de consenso para o segmento de motivo M4.

[00055] A SEQ ID NOs: 66-69 são, cada uma, sequências de aminoácidos individuais de cada uma das várias proteínas de toxinas aqui descritas que foram usadas na formulação da sequência de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 65.

[00056] A SEQ ID NO: 70 é uma sequência de aminoácidos de consenso para o segmento de motivo M1t.

[00057] As SEQ ID NOs: 71-86 são, cada uma, sequências de aminoácidos individuais de cada uma das várias proteínas de toxinas aqui descritas que foram usadas na formulação da sequência de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 70.

[00058] A SEQ ID NO: 87 é uma sequência de aminoácidos de consenso para o segmento de motivo M2t.

[00059] As SEQ ID NOs: 88-119 são, cada uma, sequências de aminoácidos individuais de cada uma das várias proteínas de toxinas aqui descritas que foram usadas na formulação da sequência de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 87.

[00060] A SEQ ID NO: 120 é uma sequência de aminoácidos de consenso para o segmento de motivo M4t.

[00061] As SEQ ID NOs: 121-122 são, cada uma, sequências de aminoácidos individuais de cada uma das várias proteínas de toxinas aqui descritas que foram usadas na formulação da sequência de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 120.

[00062] A SEQ ID NO: 123 é uma sequência de aminoácidos representando um fragmento inibidor de inseto TIC1497 e corresponde a uma tradução de aminoácidos das posições de nucleotídeos de 1 a 933 da SEQ ID NO: 5.

[00063] A SEQ ID NO: 124 é uma sequência de aminoácidos representando um fragmento inibidor de inseto TIC1497 e corresponde a uma tradução de aminoácidos das posições de nucleotídeos 1 a 885 da SEQ ID NO: 5.

[00064] A SEQ ID NO: 125 é uma sequência de aminoácidos representando um fragmento inibidor de inseto TIC1497 e corresponde a uma tradução de aminoácidos das posições de nucleotídeos 1 a 939 da SEQ ID NO: 5.

[00065] A SEQ ID NO: 126 é uma sequência de aminoácidos representando um fragmento inibidor de inseto TIC1497 e corresponde a uma tradução de aminoácidos das posições de nucleotídeos 1 a 882 da SEQ ID NO: 5.

[00066] A SEQ ID NO: 127 é uma sequência de oligonucleotídeos em um iniciador para hibridizar com a cadeia (+) da extremidade 5' do DNA que codifica uma proteína da presente invenção e corresponde às posições 1..29 de SEQ ID NO: 3 (iniciador direto tic1415).

[00067] A SEQ ID NO: 128 é uma sequência de oligonucleotídeos em um iniciador para hibridizar com a cadeia (-) da extremidade 3' do DNA que codifica uma proteína da presente invenção e corresponde às posições 1131..1161 da SEQ ID NO: 3 (iniciador reverso tic1415).

[00068] A SEQ ID NO: 129 é uma sequência de oligonucleotídeos em um iniciador para hibridizar com a cadeia (+) da extremidade 5' do DNA que codifica uma proteína da presente invenção e corresponde às posições 1..40 da SEQ ID NO: l1 (iniciador direto tic1414).

[00069] A SEQ ID NO: 130 é uma sequência de oligonucleotídeos em um iniciador para hibridizar com a cadeia (-) da extremidade 3' do DNA que codifica uma proteína da presente invenção e corresponde às posições 1015..1056 da SEQ ID NO: l1 (iniciador reverso tic1414).

[00070] A SEQ ID NO: 131 é uma sequência de oligonucleotídeos em um iniciador para hibridizar com a cadeia (+) da extremidade 5' do DNA que codifica uma proteína da presente invenção e corresponde às posições 1..35 de SEQ ID NO: 17 (iniciador direto tic1422).

[00071] A SEQ ID NO: 132 é uma sequência de oligonucleotídeos em um iniciador para hibridizar com a cadeia (-) da extremidade 3' do DNA que codifica uma proteína da presente invenção e corresponde às posições 1021-1059 da SEQ ID NO: 17 (iniciador reverso tic1422).

[00072] A SEQ ID NO: 133 é uma sequência de oligonucleotídeos em um iniciador para hibridizar com a cadeia (+) da extremidade 5' do DNA que codifica uma proteína da presente invenção e corresponde às posições 1..28 de SEQ ID NO: 25 (iniciador direto tic1362).

[00073] A SEQ ID NO: 134 é uma sequência de oligonucleotídeos em um iniciador para hibridizar com a cadeia (-) da extremidade 3' do DNA que codifica uma proteína da presente invenção e corresponde às posições 1025-1056 da SEQ ID NO: 25 (iniciador reverso tic1362).

[00074] A SEQ ID NO: 135 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo recombinante derivado de uma espécie de Bacillus thuringiensis (Bt), tendo uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1008 que codificam uma proteína TIC2335.

[00075] A SEQ ID NO: 136 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC2335.

[00076] A SEQ ID NO: 137 é uma sequência de nucleotídeos que representa um polinucleotídeo derivado de uma espécie de Bacillus thuringiensis (Bt) tendo uma estrutura de leitura aberta nas posições de nucleotídeos 1-1014 que codificam uma proteína TIC2334.

[00077] A SEQ ID NO: 138 é uma sequência de aminoácidos de uma toxina de proteína TIC2334.

[00078] A SEQ ID NO: 139 é uma sequência de aminoácidos de consenso para o segmento de motivo M5.

[00079] As SEQ ID NOs: 140-141 são, cada uma, sequências de aminoácidos individuais de cada uma das várias proteínas de toxinas aqui descritas que foram usadas na formulação da sequência de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 139.

[00080] A SEQ ID NO: 142 é uma sequência de consenso de N- terminal compartilhada por proteínas da presente invenção.

[00081] A SEQ ID NO: 143 é uma sequência de consenso de C-terminal compartilhada por proteínas da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00082] As proteínas de Bacillus thuringiensis (Bt) são uma fonte rica de proteínas de toxinas diferentes; no entanto, existem muitos problemas no processo de identificação de novas toxinas de Bt. Métodos de triagem que envolvem a tipagem morfológica de cepas de Bt, (por exemplo, análise estrutural dos corpos de inclusão parasporais, morfologia do revestimento celular, cor visível e morfologia sob diferentes condições de crescimento), não fornecem uma boa correlação com a presença de novas proteínas tóxicas. Adicionalmente, os métodos de triagem que envolvem processos de bioensaios altamente matriciados para a identificação de proteínas com propriedades tóxicas produzem resultados inconsistentes. Tais processos incluem, mas não se limitam a, teste de proteínas expressas em vários estágios de crescimento e desenvolvimento de Bt, teste de diferentes preparações da proteína de Bt, teste de proteínas de Bt ativadas por vários tratamentos proteolíticos, teste de proteínas de Bt com outras proteínas acessórias, e teste de proteínas de Bt em várias condições de indução. Alguns métodos de triagem dependem de projeto estrutural e funcional, que requerem procedimentos intensivos de muito trabalho e habilidade para elucidar as relações de estrutura/função e, muitas vezes, esses protocolos só podem ser eficazes quando realizados em toxinas completamente elucidadas. Tendo em vista os problemas inerentes em encontrar novas proteínas de toxina de Bt, a triagem para genes que codificam proteínas de toxina de Bt mudou devido a recentes melhorias na bioinformática e capacidades de sequências de genoma.

[00083] Os inventores aqui tiram vantagem de alto sequenciamento e melhorias de produtividade nas capacidades bioinformáticas para rastrear genomas de Bt para novos genes de toxina de Bt codificadores de proteína, que são depois clonados e expressos em cepas acrystalliferous Bt para produzir amostras de proteínas para a triagem de atividade inibidora de inseto. Tal como aqui descrito e usando este método, um novo gênero de proteína foi descoberto e as proteínas exemplificativas exibindo atividade inseticida contra Hemípteros e/ou Lepidópteros. Os versados na técnica apreciarão que os ensinamentos da presente invenção permitem que os membros de genes/proteínas relacionados sejam identificados ou modificados os quais exibem as propriedades e os aspectos das proteínas da presente invenção.

[00084] Os polipeptídeos/proteínas da presente invenção estão relacionados pela fonte ou origem (a partir de cepas de B.t. de bactérias), pela atividade de toxina biológica contra pragas de insetos dentro das ordens de Hemípteros e/ou Lepidópteros, por estrutura primária (sequências de aminoácidos conservados), e pelo comprimento (de cerca de 300 a cerca de 400 aminoácidos).

[00085] As proteínas da presente invenção, e as proteínas que se assemelham às proteínas da presente invenção, podem ser identificadas por comparação umas com as outras usando vários algoritmos baseados em computador conhecidos na técnica. As identidades de aminoácidos aqui relatados são o resultado de um alinhamento de Clustal W usando estes parâmetros padrões: Matrix de peso: blosum, penalidade de abertura de Gap: 10,0, penalidade de extensão de Gap: 0,05, gaps hidrofílicos: Lig, Resíduos hidrofílicos: GPSNDQERK, Penalidades gap específicas de resíduo: Lig(Thompsonet al (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680).

[00086] Pretende-se que um polipeptídeo recombinante que exibe atividade inibidora de insetos contra espécies de insetos Lepidópteros e/ou Hemípteros esteja dentro do escopo da presente invenção, se um alinhamento do polipeptídeo com qualquer uma das SEQ ID NO: 2 (TIC1498), SEQ ID NO: 4 (TIC1415), SEQ ID NO: 6 (TIC1497), SEQ ID NO: 8 (TIC1886), SEQ ID NO: 10 (TIC1925), SEQ ID NO: 12 (TIC1414), SEQ ID NO: 14 (TIC1885), SEQ ID NO: 16 (TIC1922), SEQ ID NO: 18 (TIC1422), SEQ ID NO: 20 (TIC1974), SEQ ID NO: 22 (TIC2032), SEQ ID NO: 24 (TIC2120), SEQ ID NO: 26 (TIC1362), SEQ ID NO: 136 (TIC2335), e SEQ ID NO: 138 (TIC2334) resulta em, pelo menos, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, ou 386 identidades de aminoácidos. Ver Tabela 1. Isto é, em certas modalidades, o polipeptídeo recombinante da presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos que exibe 195-386 identidades de aminoácidos quando comparada com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 136 e SEQ ID NO: 138. Tabela 1. Exibição de matriz de pares de proteínas de toxina da presente invenção.

(M) é SEQ ID NO e nome da proteína (TIC#) (N) é SEQ ID NO.

[00087] A porcentagem de identidade de aminoácidos entre todos os pares é calculada em relação a (M) e é representada pelos números superiores.

[00088] Os números inferiores em cada caixa na matriz representam os números de aminoácidos idênticos entre o par.

[00089] As caixas sombreadas cinzentas representam proteínas de toxina estreitamente relacionadas que são mais distantemente relacionadas com as outras proteínas na tabela.

[00090] Também se pretende que uma primeira proteína que exibe atividade inibidora de insetos esteja dentro do escopo da presente invenção se um alinhamento de Clustal W de tal proteína com qualquer uma das seguintes segundas proteínas estabelecidas em qualquer uma das SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, resulta em pelo menos cerca de 47% de identidade de sequência de aminoácidos entre a primeira e a segunda proteínas; ou especificamente, pelo menos 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,2, 99,5, 99,8, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos entre a primeira e a segunda proteínas; ou, opcionalmente, uma primeira proteína que exibe atividade inibidora de insetos está dentro do escopo da presente invenção se um alinhamento de Clustal W de tal proteína com qualquer uma das seguintes segunda proteínas estabelecidas em qualquer uma das SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 136, ou SEQ ID NO: 138, resulta em pelo menos cerca de 56% de identidade de sequência de aminoácidos entre a primeira e a segunda proteínas, ou especificamente, pelo menos 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,2, 99,5, 99,8, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos entre a primeira e a segunda proteínas.

[00091] Os polipeptídeos/proteínas da presente invenção são observados como sendo relacionados com a presença de seis segmentos de motivo de sequência de aminoácidos de assinatura conhecidos por existirem apenas em membros desta família de proteína inibidora de inseto em particular. A posição relativa de cada um dos segmentos do motivo de assinatura é ilustrada na Figura 1 como "M0", "M1", "M2", "M3", "M4", e "M5". A SEQ ID NO: 31 representa a sequência de consenso de motivo M0, em que X1 é N ou T, X2 é D ou A, X3 é I ou T, e X4 é R ou S. Cada segmento de motivo M0 é representado pelas sequências de aminoácidos correspondentes estabelecidas nas SEQ ID NOs: 32-47. O segmento de motivo M0 corresponde às posições de sequência de aminoácidos 48 a 70 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, e SEQ ID NO: 20, às posições 47 a 69 da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NO: 24. Uma sequência de aminoácido do núcleo QX2FQTX3PX4L está incorporada no segmento de motivo M0. A presença desta sequência de núcleo (ou o segmento de motivo M0), ou de um segmento de peptídeo que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com esta sequência de núcleo (ou o segmento de motivo M0), em uma proteína de toxina de particular derivada de Bt, sozinha ou em combinação com outros segmentos do motivo aqui descritos e operacionalmente posicionados dentro da sequência primária de qualquer uma de tais proteínas de toxina, é determinante para que a proteína de toxina seja um membro do gênero de proteínas aqui descritas, particularmente quando a proteína também mostra exibir propriedades inibidoras de inseto.

[00092] A SEQ ID NO: 48 representa a sequência de consenso de motivo M1, em que X1 é V ou I, e X2 é R ou K. Cada motivo M1 é representado pelas sequências de aminoácidos correspondentes estabelecidas nas SEQ ID NOs: 49-52. O motivo M1 corresponde às posições de sequência de aminoácidos de 76 a 118 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, e SEQ ID NO: 20, e as posições de 75 a 117 da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NO: 24, ou qualquer segmento mais curto compreendendo à sequência de aminoiácido de núcleo QTX1SFNEX2TT deste motivo M1. A presença desta sequência de núcleo (ou o motivo M1), ou de um segmento de peptídeo que exibe pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com esta sequência de núcleo (ou o motivo M1), em uma proteína particular derivada de Bt, sozinha ou em combinação com outros motivos aqui descritos, é determinante que a proteína seja um membro do gênero de proteínas aqui descritas, particularmente quando a proteína também mostra exibir propriedades inibidoras de insetos. Certas proteínas dentro do gênero de proteínas aqui exemplificadas incluem o motivo M1, bem como um segmento de motivo de núcleo secundário Mt1 representado pela sequência de aminoácidos de consenso conforme estabelecida na SEQ ID NO: 70, em que X1 é V ou F, X2 é S ou T, X3 é H ou T, e o X4 é V ou T. Cada segmento de motivo de núcleo secundário M1t é representado pelas sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs:71-86. M1t corresponde às posições de aminoácidos de 94 a 112 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, e SEQ ID NO: 20, 93, posiciona a 111 da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NO: 24, e as posições de 83 a 101 da SEQ ID NO: 26. A presença do motivo de núcleo secundário M1t, ou de um segmento de peptídeo exibindo pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido a este motivo de núcleo secundário, em uma proteína particular derivada de Bt, sozinha ou em combinação com outros motivos aqui descritos, é determinante que a proteína seja um membro do gênero de proteínas aqui descritas, particularmente quando a proteína também mostra exibir propriedades inibidoras de insetos.

[00093] A SEQ ID NO: 53 representa a sequência de consenso de motivo M2, em que o símbolo X1 é S ou A, X2 é V ou T, e X3 é T ou S. Cada motivo M2 é representado pelas sequências de aminoácidos correspondentes estabelecidas nas SEQ ID NOs:54-61. O motivo M2 corresponde às posições de aminoácidos 134 a 170 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20, e as posições de 133 a 169 da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NO: 24. A presença deste motivo M2, ou de um segmento de peptídeo que exibe pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos para este motivo M2, em uma proteína particular derivada de Bt, sozinha ou em combinação com outros motivos aqui descritos, é determinante que a proteína seja um membro do gênero de proteínas aqui descritas, particularmente quando a proteína também mostra exibir propriedades inibidoras de insetos. Certas proteínas dentro do gênero de proteínas como aqui exemplificadas incluem uma parte do motivo M2 de um motivo secundário M2t tal como estabelecido na SEQ ID NO: 87, em que X1 é E ou A, X2 é G ou S, X3 é V ou T, X4 é T ou S, X5 é L ou I. Cada motivo M2t é representado por sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs: 88-119. M2t corresponde às posições de aminoácidos 153 a 168 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, e SEQ ID NO: 20, posições de 152 a 167 da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID N0: 16, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NO: 24, e as posições de 139 a 154 da SEQ ID NO: 26. A presença deste motivo M2t ou de um segmento de peptídeo exibindo pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos para este motivo M2t em uma proteína particular derivada de Bt, sozinha ou em combinação com outros motivos aqui descritos, é determinante que a proteína seja um membro do gênero de proteínas aqui descritas, particularmente quando a proteína também mostra exibir propriedades inibidoras de insetos.

[00094] A SEQ ID NO: 62 representa a sequência de consenso de motivo M3, na qual X1 é D ou N. Cada motivo M3 é representado por sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs:63-64. M3 corresponde às posições de aminoácidos 172 a 200 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, e SEQ ID NO: 20, e as posições 171 a 199 da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NO: 24, ou qualquer segmento mais curto compreendendo à sequência de aminoácidos de núcleo AGSVX1VPID deste motivo M3. A presença deste motivo M3 ou de seu núcleo, ou de um segmento de peptídeo que exibe pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos para este motivo M3 ou a sua sequência de núcleo, sozinha ou em combinação com outros motivos aqui descritos, em uma proteína particular derivada de Bt é determinante que a proteína seja um membro do gênero de proteínas aqui descritas, particularmente quando a proteína também mostra exibir propriedades inibidoras de insetos.

[00095] A SEQ ID NO: 65 representa a sequência de consenso de motivo M4, em que X1 é P ou T, e X2 é D ou N. Cada motivo M4 é representado por sequências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID NOs:66-69. M4 corresponde às posições de aminoácidos 267 a 294 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, e SEQ ID NO: 20, e posições de 266 a 293 da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, e SEQ ID NO: 22, ou qualquer segmento mais curto compreendendo à sequência de aminoácidos de núcleo SLATX1X2QILS deste motivo M4. A presença deste motivo M4 ou o seu núcleo, ou de um segmento de peptídeo que exibe pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos para este motivo M4 ou com a sua sequência de núcleo, sozinha ou em combinação com outros motivos aqui descritos, em uma proteína particular derivada de Bt, é determinante que a proteína seja um membro do gênero de proteínas aqui descritas, particularmente quando a proteína também mostra exibir propriedades inibidoras de insetos. Certas proteínas dentro do gênero de proteínas como exemplificadas aqui, incluem uma parte de um motivo M4 de um motivo secundário M4t conforme estabelecido na SEQ ID NO: 120, em que X1 é A ou T. Cada motivo M4t é representado pelas sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122. O motivo M4t corresponde às posições de aminoácidos de 267 a 281 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20, posicições de 266 a 280 da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, e SEQ ID NO: 22, e posições de 254 a 268 da SEQ ID NO: 26, ou qualquer segmento mais curto que compreende a sequência de aminoácido do núcleo PGFTGETR. A presença deste motivo M4t, ou de um segmento de peptídeo que exibe pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos para este motivo M4t sozinho ou em combinação com outros motivos aqui descritos, em uma proteína particular derivada de Bt, é determinante que a proteína seja um membro do gênero de proteínas aqui descritas, particularmente quando a proteína também mostra exibir propriedades inibidoras de insetos.

[00096] A SEQ ID NO: 139 representa o segmento de sequência de consenso de motivo M5, em que X1 é C, Y ou R, X2 é H ou R, X3 é N, D ou H, X4 é Y ou H, X5 é R ou G, e X6 é D ou N. As SEQ ID NOs: 142143 são dois motivos M5 exemplares. M5 corresponde às posições de aminoácidos 327 a 343 das SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 22 e 24, as posições de 328 a 344 das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 18 e 20, as posições de 344 a 360 das SEQ ID NOs: 14, 16, 22 e 24, as posições de 345 a 361 das SEQ ID NOs: 2, 4, 6 e 10, as posições de 361 a 377 das SEQ ID NOs: 12, 16, e 22, posições de 362 a 378 das SEQ ID NOs: 4, 6 e 10, ou qualquer segmento mais curto compreendendo à sequência de aminoácidos de núcleo (C/Y)EHNYDE deste motivo M5. A sequência de aminoácidos de núcleo (C/Y)EHNYDE deste motivo M5 corresponde a sete dos últimos 8 resíduos de aminoácidos N-terminais nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e 24. A presença deste motivo M5 ou seu núcleo, ou de um segmento de peptídeo que exibe pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos para este motivo M5, sozinha ou em combinação com outros motivos aqui descritos, em uma proteína particular derivada de Bt é determinante que a proteína seja um membro do gênero de proteínas aqui descritas, particularmente quando a proteína também mostra exibir propriedades inibidoras de insetos. Os polipeptídeos/proteínas da presente invenção estão relacionados por este motivo M5 o que pode ocorrer uma vez que como exemplificado pelas SEQ ID NOs: 8, 12, 18, e 20; como uma repetição dupla, como exemplificado pelas SEQ ID NOs: 2, 14, e 24; e como uma repetição tripla, como exemplificado pelas SEQ ID NOs: 4, 6, 10, 12, 16 e 22. Curiosamente, TIC1414 e TIC1922 podem ser alinhados com a identidade de 100% com referência a TIC1414 (Tabela 1), que é possível por causa da diferença entre TIC1414 e TIC1922 são duas repetições do motivo M5 (gaps permitidos no alinhamento de pares).

[00097] A presente invenção fornece um polipeptídeo recombinante que compreende um segmento de peptídeo que exibe pelo menos 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 31 (motivo M0), SEQ ID NO: 48 (motivo M1), SEQ ID NO: 53 (motivo M2), SEQ ID NO: 62 (motivo M3), SEQ ID NO: 65 (motivo M4), SEQ ID NO: 141 (motivo M5), SEQ ID NO: 70 (motivo M1t), SEQ ID NO: 87 (motivo M2t), SEQ ID NO: 120 (motivo M4t), e qualquer combinação dos mesmos. Tais polipeptídeos exibem atividade inibidora de insetos contra espécies de Lepidópteros e/ou Hemípteros. Tal como usado aqui, o termo "atividade inibidora de insetos" refere-se à atividade de uma proteína, ou um fragmento da mesma, eficaz na inibição de uma praga, preferencialmente, uma praga de uma ou mais plantas de colheita, quando fornecidas na dieta da praga e ingeridas por pragas alvos (pretendidas). As pragas de plantas de colheita incluem nematóides e artrópodes, incluindo insetos. As proteínas da presente invenção são eficazes na inibição do crescimento, no desenvolvimento, na viabilidade ou na fecundidade de uma praga alvo particular, particularmente uma praga de insetos incluindo, mas não limitados a, insetos da ordem de Lepidóptero e Hemíptero.

[00098] Em certas modalidades, as proteínas/polipeptídeos inibidoras de inseto contêm segmentos de aminoácidos que exibem pelo menos 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% de identidade com qualquer um ou mais dos motivos de assinatura (SEQ ID NOs: 31-122, 142 e 143) das proteínas da presente invenção.

[00099] Em certas modalidades, o polipeptídeo recombinante compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 136, ou SEQ ID NO: 138, ou um fragmento inibidor de inseto das mesmas. Exemplos de fragmentos inibidores de inseto incluem, mas não se limitando a, aqueles que compreendem a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126.

[000100] Os motivos de assinaturas adicionais incluem sítios de clivagem proteolítica "KK", "EH", "TF", e "FG", as posições relativas de cada uma mostradas como [1], [2], [3] e [4], respectivamente, na Figura 1.

[000101] Um motivo de assinatura adicional inclui uma sequência de consenso N-terminal conforme estabelecido na SEQ ID NO: 142, onde X1 é A ou E, X2 é N ou D, X3 é Q ou E, e X4 é S ou L, compartilhada por proteínas que são membros do gênero de proteínas exemplificados aqui, com a exceção da proteína tendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 26. Os iniciadores de oligonucleotídeos diretos, por exemplo, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131 e SEQ ID NO: 133 podem ser projetados para hibridizar com a cadeia positiva da sequência de DNA que codifica a sequência de consenso N-terminal de proteínas da presente invenção. A sequência de consenso C-terminal conforme estabelecida na SEQ ID NO: 143, onde X1 é H ou E, e X2 é N ou Y, é um motivo de assinatura compartilhada por proteínas da presente invenção. Os iniciadores de oligonucleotídeos reversos, por exemplo, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 134, podem ser projetados para hibridizar com a cadeia negativa da sequência de DNA que codifica para a sequência de consenso do C-terminal de proteínas da presente invenção. Iniciadores de oligonucleotídeos podem ser projetados para hibridizar com cadeias positivas ou negativas, de qualquer um ou mais dos motivos de assinatura (SEQ ID NOs:31-122, 140 e 141) das proteínas da presente invenção.

[000102] Quando combinados, os iniciadores diretos e reservos podem ser usados para amplificar as sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas (ou fragmentos das mesmas) da presente invenção.

[000103] Usando um diagrama de Venn (Figura 2), juntamente com a evidência de bioensaio que demonstra a atividade de toxina, as relações das proteínas da presente invenção são ilustradas por uma função comum e atividade inseticida para as espécies de insetos Hemípteros e/ou Lepidópteros. A Tabela 2 correlaciona as proteínas ilustradas no diagrama de Venn da Figura 2 para a atividade inibidora de insetos por espécies de insetos. Os resultados a partir dos quais a Tabela 2 foi montada são descritos em mais detalhe nos exemplos. Tabela 2. Perfis de Atividade de proteínas exemplares da presente invenção

M = mortalidade observada (em comparação com o tampão de controle) S = atrofismo observado de sobreviventes (em comparação com o tampão de controle) * = Segmento N-terminal que foi truncado no seu C-terminal também demonstrou uma atividade inibidora de inseto 1. ['a'], ['b'] e ['c'] são as regiões do diagrama de Venn representadas na Figura 2.

[000104] Em certas modalidades, a praga é especificamente uma praga de insetos. Pragas de insetos incluem insetos selecionados a partir da ordem Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Blattodea, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, e Trichoptera. Os insetos podem incluir larvas da ordem Lepidoptera, tais como, mas não limitadas a, lagartas de cereais (armyworms), gramiolas (cutworms), larva das Geometrídeas (loopers), e heliothines da família de Noctuidae (por exemplo, lagartas de cereais de outono (Spodoptera frugiperd), lagarta da beterraba (Spodoptera exígua), lagarta do bertha (Mamestra configuratd), gramiola preta (Agrotis ipsilori), larva de repolho (Trichoplusia ni), larva de soja (Pseudoplusia includens), lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis), lagarta verde (Hypena scabrd), lagarta do fumo (Heliothis virescens), lagarta granulada (Agrotis subterranea), lagarta do cartucho (Pseudaletia unipuncta), lagarta ocidental (Agrotis orthogonid); brocas, lagartas casebearers, lagartas que tecem teias (webworms), lagarta coneworms, lagarta do repolho ou da couve (cabbageworms) e skeletonizers da família de Pyralidae (por exemplo, brocas de milho Europeias (Ostrinia nubilalis), lagarta de laranja de umbigo (Amyelois transitella), lagarta de raiz de milho (Crambus caliginosellus), lagarta de gramado (Herpetogramma licarsisalis), traça de girassol (Homoeosoma electellum), broca de pé de milho menor (Elasmopalpus lignosellus); lagartas enroladeiras (leafrollers), larvas budworms, larvas de sementes e larvas de frutas na Família de Tortricidae (por exemplo, traça de maçã verde (Cydia pomonella), traça de semente de uva (Endopiza vitean), traça de fruto oriental (Grapholita molesta), traça de semente de girassol (Suleima helianthana), e muitos outros insetos lepidópteros economicamente importantes (por exemplo, traça de costas de diamantes (Plutella xylostella), lagarta-rosada (Pectinophora gossypiella), traça cigana (Lymantria dispar). Outras pragas de insetos da ordem Lepidoptera incluem, por exemplo, Alabama argillacea (roladores da folha de algodão), Archips argyrospila (roladores de folha de árvores de fruto), A. rosana (roladores da folha Europeia) e outras espécies de Archips, Chilo suppressalis (broca de arroz asiático, ou broca do caule de arroz), Cnaphalocrocis medinalis (rolador de folha de arroz), Crambus caliginosellus (lagarta de raiz de milho), C. teterrellus (lagarta de gramíneas), Diatraea grandiosella (broca do milho do sudoeste), D. saccharalis (broca de cana-de-açúcar), Earias insulana (lagarta espinhosa), E. vittella (lagarta manchada), Helicoverpa armigera (lagarta Americana), H. zea (lagarta da espiga de milho ou lagarta do algodão), Heliothis virescens (lagarta do tabaco), Herpetogramma licarsisalis (lagarta do gramado), Lobesia botrana (traça de videira Europeia), Pectinophora gossypiella (lagarta-rosada), Phyllocnistis citrella (citros de lagarta mineira), Pieris brassicae (borboleta branca grande), P. rapae (lagarta do repolho ou da couve importada ou borboleta branca pequena), Plutella xylostella (traça das costas prestas), Spodoptera exigua (lagarta da beterraba), S. litura (gramiola do tabaco, conjunto de lagartas), S. frugiperda (lagartas de cereais de outono) e Tuta absoluta (lagarta mineira do tomateiro).

[000105] Os insetos podem incluir adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homoptera, tais como, mas não limitados a, erros de plantas da família Miridae, cigarras da Família Cicadidae, cigarrinhas (por exemplo, Empoasca spp.) da família Cicadellidae, percevejos das famílias Fulgoroidea e Delphacidae, lagarta treehoppers da família Membracidae, psílidas da família Psyllidae, mosca branca da família Aleyrodidae, pulgões da família Aphididae, filoxera da Família Phylloxeridae, cochonilhas da família Pseudococcidae, balanças das famílias Coccidae, Diaspididae e Margarodidae, inseto de renda da família Tingidae, percevejos da família Pentatomidae, inseto da cilha (por exemplo, Bliss s spp.) e outros insetos de sementes da Família Lygaeidae, cigarrinha da família Cercopídeos e insetos de aboboreiras da Família Coreidae, e os insetos vermelhos e corantes de algodão da Família Pyrrhocoridae. Outras pragas da ordem Hemíptero incluem Acrosternum hilare (percevejo verde), Anasa tristis (insetos de aboboreiras), Blissus leucopterus leucopterus (percevejo comum), Corythuca gossypii (pulgão de ácer de algodão), Cyrtopeltis modesta (inseto de tomate), Dysdercus suturellus (corante de algodão), Euschistus servus (percevejo marrom), Euschistus variolarius (percevejo com uma manch), Graptostethus spp. (complexo de percevejos da semente), Leptoglossus corculus (insetos de semente de pinheiro do pé da folha), Lygus lineolaris (inseto de planta manchada), Lygus hesperus (inseto de planta de mancha do Ocidente), Nezara viridula (percevejo verde do sul), Oebalus pugnax (percevejo do arroz), Oncopeltus fasciatus (inseto de plantas milkweed grande) e Pseudatomoscelis seriatus (lagarta fleahopper de algodão).

[000106] Em certas modalidades, o polipeptídeo recombinante da presente invenção exibe uma atividade inibidora contra insetos Lepidópteros selecionados doo grupo consistindo em H. Zea, O. nubilalis, D. saccharalis, D. grandiosella, A. gemmatalis, S. Frugiperda, S. exigua, A. ipsilon, T. ni, P. includens, H. virescens, P. xylostella, P. gossypiella, H. armigera, E. lignosellus, e P. citrella, e/ou contra espécies Hemíptero selecionadas do grupo consistindo em L. hesperus, L. lineolaris, A. hilare, E. servus, N. viridula, M. persicae, A. glycines, e A. gossypii.

[000107] As proteínas da presente invenção representam uma nova categoria e classe da proteína Cry, exibindo não mais do que 56% de identidade de aminoácidos a qualquer outra proteína de Bt conhecida na técnica. A proteína que exibe a identidade mais próxima com qualquer uma das proteínas da presente invenção é Cry15Aa1 (GI: 142726, ACESSÃO: AAA22333) (Brown e Whiteley, Journal of Bacteriology, Jan. de 1992, p 549-557, Vol. 174, N.° 2). Cry15Aa1 foi alinhada usando Clustal W para cada proteína exemplificada na presente invenção e os resultados estão apresentados na Tabela 3. Tabela 3. Alinhamento de proteínas para Cry15Aa1.

* Em um alinhamento de Clustal W

[000108] Cry15Aa1 não contém qualquer um dos motivos de assinatura (SEQ ID NOs:31 -122, 140 e 141) compartilhados pelas proteínas da presente invenção. Cry15Aa1 não apresenta os sítios de clivagem proteolítica [2], [3] e [4] compartilhados pelas proteínas da presente invenção, como mostrado na Figura 1. Cry15Aa1 exibe um ponto isoelétrico calculado de cerca de 7,3 pI, em contraste com as proteínas da presente invenção em que cada uma apresenta um ponto isoelétrico calculado de cerca de 5 a 6 pI. Cry15Aa1 apresenta apenas 3 cargas positivas a um pH neutro, ao passo que as proteínas da presente invenção apresentam o calculado de 3 a 10 cargas negativas a pH neutro.

[000109] As proteínas da presente invenção podem ser usadas para produzir anticorpos que se ligam especificamente a este gênero de proteínas e podem ser usadas para pesquisar e encontrar outros membros do gênero.

[000110] As sequências de nucleotídeos que codificam estas proteínas podem ser usadas como sondas e iniciadores para a triagem para identificar os outros membros do gênero usando a amplificação térmica ou isotérmica e/ou métodos de hibridização, por exemplo, oligonucleotídeos como estabelecidos nas SEQ ID NOS:127 - 134, e oligonucleotídeos que hibridizam para a sequência que codifica os motivos de assinatura da presente invenção. Os homólogos de sequências de nucleotídeos, isto é, proteínas inseticidas codificadas por sequências de nucleotídeos que hibridizam para cada um ou qualquer uma das sequências aqui descritas, sob condições de hibridação rigorosas, são especificamente destinados a serem incluídos dentro do escopo da presente invenção. A presente invenção também fornece um método para a detecção de uma primeira sequência de nucleotídeos que hibridiza com uma segunda sequência de nucleotídeos, em que a primeira sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína inseticida ou fragmento inseticida da mesma e que hibridiza sob condições rigorosas de hibridação para a segunda sequência de nucleotídeos. Em tal caso, a segunda sequência de nucleotídeos pode ser qualquer uma das sequências aqui divulgadas sob condições rigorosas de hibridação. As sequências de codificação de nucleotídeos hibridizam para uma outra sob condições de hibridação adequadas e as proteínas codificadas por estas sequências de nucleotídeos que reage de forma cruzada com antissoros criados contra qualquer uma das outras proteínas. As condições de hibridação rigorosas, tal como aqui definidas, compreendem, pelo menos, a hibridação a 42°C, seguido de duas lavagens de cinco minutos cada, à temperatura ambiente com 2X SSC, DS a 0,1%., seguido de duas lavagens de 30 minutos cada, a 65°C em SSC 0,5 X, SDS a 0,1%. Naturalmente, um versado na técnica irá reconhecer que, devido à redundância do código genético, muitas outras sequências são capazes de codificar estas proteínas relacionadas, e aquelas sequências, na medida em que elas funcionam de modo a expressar proteínas inseticidas quer em cepas de Bacillus ou em células de plantas, destinam-se a ser englobadas pela presente invenção, reconhecendo evidentemente que muitas destas sequências codificadoras redundantes não irá hibridizar sob estas condições para as sequências de Bt nativa que codificam TIC1498, TIC1415, TIC1497, TIC1886, TIC1925, TIC1414, TIC1885, TIC1922, TIC1422, TIC1974, TIC2032, TIC2120, TIC1362, TIC2335 e TIC2334.

[000111] Em certas modalidades, um polipeptídeo recombinante exibindo uma atividade inibidora de insetos contra uma espécie de insetos Lepidópteros e/ou Hemípteros está dentro do escopo da presente invenção, cujo polipeptídeo é codificado por um segmento de polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas de hibridação a uma ou mais das sequências de nucleotídeos estabelecidas em qualquer uma de SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: l 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 135, ou SEQ ID NO: 137, ou o complemento das mesmas.

[000112] Um aspecto da presente invenção fornece métodos para a descoberta de proteínas relacionadas, e tais métodos incluem a sequenciação de genomas de Bt, conjunto de dados de sequências, identificação e clonagem de genes de Bt que codificam tais proteínas inibidoras de insetos, e a expressão e teste de novas proteínas de Bt para ensaio de atividade inibidora de inseto. Outro aspecto da presente invenção emprega métodos moleculares para manipular e clonar proteínas comercialmente úteis compreendendo quimeras de proteínas e variantes melhoradas a partir do gênero de proteínas inibidoras de insetos, por ecxemplo, as quimeras podem ser montadas a partir de segmentos em cada uma das várias proteínas que se encontram dentro dos espaços entre os motivos de assinatura para derivar modalidades melhoradas. As proteínas da presente invenção podem ser submetidas ao alinhamento umas com as outras e a outras proteínas inibidoras de insetos Bt, e os segmentos de cada uma de tais proteínas podem ser identificados os quais podem ser úteis para a substituição entre as proteínas alinhadas, resultando na construção de proteínas quiméricas. Tais proteínas quiméricas podem ser sujeitas à análise de bioensaio de pragas e caracterizadas pela presença de bioatividade aumentada ou expandida do espectro de pragas alvos em comparação com as proteínas de origem das quais cada um destes segmentos na quimera foi derivado. A atividade inibidora de insetos dos polipeptídeos pode ser ainda manipulada para melhorar a atividade de uma determinada praga ou para um espectro mais amplo de pragas através da troca de domínios ou segmentos com outras proteínas.

[000113] Um versado na técnica entende o conceito de substituição de aminoácidos, e reconhece que isto exige a experimentação que não é de rotina, pois há posições de aminoácidos que podem aceitar substituição sem afetar aparentemente a estrutura ou a função da proteína; contudo, em circunstâncias surpreendentes, mesmo uma substituição conservadora pode ser determinada para alterar significativamente a estrutura ou a função da proteína, e é muitas vezes desconhecida com precisão das posições dos segmentos de aminoácidos que aceitam tais alterações. Assim, as substituições de aminoácidos nas posições ao longo do comprimento da sequência da proteína que afetam a função podem ser identificadas por mutagênese de varrimento de alanina, e tais posições podem frequentemente ser úteis para os pontos de inserções e/ou deleções de aminoácidos, ou deleções N- ou C-terminais. Assim, as proteínas da presente invenção incluem fragmentos funcionalmente equivalentes (deleções N- ou C- terminal) de proteínas representadas pelas sequências de aminoácidos da presente invenção. Os fragmentos de proteína N-terminal (SEQ ID NOs: 123-126, 16) de TIC1497 e TIC 1922 demonstraram atividade inibidora de insetos (tabela 2 e os Exemplos 6, 10 e 11, respectivamente). Os fragmentos da proteína N-terminal correspondentes para quaisquer dos membros do gênero são contemplados.

[000114] As proteínas funcionalmente equivalentes (tendo atividade inibidora de insetos substancialmente equivalente) para as proteínas da presente invenção incluem proteínas com substituições conservativas de aminoácidos nas sequências de proteína da presente invenção. Em tais sequências de aminoácidos, um ou mais aminoácidos na sequência de partida é (são) substituídos com outro aminoácido(s), a carga e a polaridade dos quais é similar à do aminoácido nativo, ou seja, como exemplificado aqui uma substituição conservativa de aminoácidos, resultando em uma alteração conservadora a partir da perspectiva da carga e polaridade, mas que pode resultar em uma mudança na bioatividade da proteína, preferencialmente, o aumento da atividade da proteína em comparação com a proteína partindo o aminoácido original em tais posições, ou que resulte em uma alteração na proteína variante com referência ao espectro de atividade biológica e sem qualquer perda de atividade inibidora de insetos. Exemplos de proteínas que podem entreter aminoácidos substituídos ou deleções terminais para obter equivalentes biológicos incluem, mas não estão limitados a, sequência de proteína como estabelecida em qualquer uma de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, e SEQ ID NOs: 123126.

[000115] O enriquecimento das proteínas da presente invenção, quer em plantas, ou por um processo que inclui a cultura de células Bt recombinantes sob condições que expressam/produzem polipeptídeos/proteínas recombinantes da presente invenção é contemplado. Tal processo pode incluir a preparação por dessecação, liofilização, homogenização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação, ou concentração de uma cultura de células de Bacillus thuringiensis recombinantes expressando/produzindo o referido polipeptídeo recombinante. Um tal processo pode resultar em um extrato de células de Bt, suspensão celular, homogenato celular, lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular, ou pélete celular. Ao obter os polipeptídeos/proteínas recombinantes assim produzidos, uma composição que inclui os polipeptídeos/proteínas recombinantes pode incluir células bacterianas, esporos bacterianos, e corpos de inclusão parasporais e pode ser formulada para vários usos, incluindo insetos produtos de pulverização inibidores de insetos agrícolas ou como formulações inibidoras em bioensaios de dieta.

[000116] Pretende-se que uma composição/formulação inibidora de insetos compreendendo o dito polipeptídeo/proteína recombinante está dentro do escopo da presente invenção. Em certas modalidades, tal composição pode ainda compreender pelo menos um agente pesticida, que exibe atividade inibidora de insetos contra as mesmas espécies de insetos Lepidópteros e/ou Hemíptero, mas é diferente do polipeptídeo recombinante. Este agente é selecionado do grupo consistindo em uma proteína inibidora de inseto, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto, e uma proteína acessória. Exemplos de tais agentes incluem, mas não estão limitados a, uma proteína TIC807, uma proteína TIC853, uma proteína AXMI-171, e uma proteína Cry51Aa1. Outras composições são contempladas para combinação com as proteínas da presente invenção e com as combinações de proteínas fornecidas acima. Por exemplo, os produtos químicos pesticidas aplicados topicamente, que são projetados para o controle de pragas, que também são controladas pelas proteínas da presente invenção, podem ser usados com as proteínas da presente invenção nos tratamentos de sementes, pulverização/gotejamento/ ou limpeza em formulações que podem ser aplicadas diretamente ao solo (uma rega do solo), aplicados a plantas em crescimento que expressam as proteínas da presente invenção, ou formulados para serem aplicados às sementes contendo um ou mais transgenes que codificam uma ou mais das proteínas da presente invenção. Tais formulações para uso em tratamentos de sementes podem ser aplicadas com os vários adesivos e espessantes conhecidos na técnica. Tais formulações podem conter os pesticidas que são sinérgicos em modo de ação com as proteínas da presente invenção, o que significa que os pesticidas da formulação atuam através de um modo de ação diferente para controlar as pragas idênticas ou semelhantes que são controladas pelas proteínas da presente invenção, ou que esses pesticidas atuem para controlar as pragas dentro de uma faixa mais ampla de hospedeiros, como espécies de Lepidópteros ou Hemípteros ou de outras espécies de pragas de plantas tais como espécies de coleópteros que não são eficazmente controladas pelas proteínas da presente invenção.

[000117] A dita composição/formulação pode ainda compreender um carreador agricolamente aceitável, tal como uma isca, um pó, poeira, pélete, grânulo, pulverização, emulsão, uma suspensão coloidal de uma solução aquosa, uma preparação de esporo/cristal de Bacillus, um tratamento de semente, uma célula de planta recombinante/tecidos de planta/sementes/planta transformada para expressar uma ou mais das proteínas, ou uma bactéria transformada para expressar uma ou mais das proteínas da planta. Dependendo do nível de inibição de inseto ou inibição inseticida inerente ao polipeptídeo recombinante e ao nível de formulação a ser aplicada a uma planta ou ensaio de dieta, a composição/formulação pode incluir várias quantidades em peso do polipeptídeo recombinante, por exemplo, 0,0001% a 0,001% e 0,01% a 1% a 99%, em peso, do polipeptídeo recombinante.

[000118] As proteínas da invenção podem ser combinadas em formulações para aplicação tópica à superfície das plantas, ao solo, em formulações para tratamento de sementes, em formulações com outros agentes tóxicos para as pragas alvos de espécies de Hemípteros e lepidópteros. Tais agentes incluem, mas não estão limitados a, uma proteína TIC807, uma proteína TIC853, uma proteína AXMI-171, e uma proteína Cry51Aa1 em que cada é eficaz no controle das mesmas pragas de Hemípteros que são controlados pelas proteínas inibidoras de insetos da presente invenção.

[000119] Pretende-se também que um método para controlar uma praga de espécies de Lepidópteros e/ou Hemípteros está dentro do escopo da presente invenção. Tal método compreende as etapas de colocar em contato as pragas com uma quantidade inibidora de insetos do polipeptídeo/proteína recombinante. Em certas modalidades, as pragas de espécie de Lepidópteros e Hemípteros estão em um campo de colheita.

[000120] Uma modalidade da invenção inclui polinucleotídeos recombinantes que codificam os membros de proteínas inibidoras de insetos do gênero. Com referência a um polinucleotídeo "recombinante", pretende-se que uma molécula de polinucleotídeo seja feita por meio humano ou por meio de intervenção de técnicas de engenharia de biologia molecular, as quais podem incluir a amplificação ou a replicação de tais moléculas após a introdução em uma célula hospedeira, e a subsequente extração e/ou purificação do polinucleotídeo a partir da célula hospedeira representativa. As modalidades de polinucleotídeos da presente invenção incluem ácidos ribonucleicos (RNA) e ácidos desoxirribonucleicos (DNA). As proteínas da presente invenção podem ser expressas a partir de construtos de DNA em que a estrutura de leitura aberta que codifica a proteína está operacionalmente ligada a elementos tais como um promotor e quaisquer outros elementos reguladores funcionais para a expressão no sistema paticular para o qual o construto é destinado. Por exemplo, os promotores expressáveis em plantas podem ser operacionalmente ligados a sequências de codificação da proteína para a expressão de proteínas em plantas, e os promotores inexpressáveis podem ser operacionalmente ligados com as sequências de codificação da proteína para a expressão da proteína em Bt. Outros elementos úteis que podem ser operacionalmente ligados às sequências de codificação de proteínas incluem, mas não estão limitados a, potenciadores, introns, marcadores de imobilização de proteínas (HIS-tag), sítios alvos para as enzimas de modificação pós- tradução, segmentos que codificam dsRNA, siRNAs, miRNAs, sítio de ligação ribossomal, elementos líderes e sítios alvos de miRNA.

[000121] Exemplos de moléculas de polinucleotídeos recombinantes fornecidas descritas aqui incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, e SEQ ID NO: 135.

[000122] Um aspecto da presente invenção fornece um construto de DNA recombinante que inclui um ou mais polinucleotídeos acima mencionados, os quais podem adicionalmente ser manipulados com as regiões transcrevíveis ou não transcrevíveis ou ambas. Tais regiões estão operacionalmente montadas para promover a expressão do DNA para o RNA através de sistemas in vivo, ou in vitro, produzindo, assim, as novas modalidades de transcrito de RNA da presente invenção. A presente invenção caracteriza os transcritos de RNA que incluem, mas não estão limitados a, o RNA que codifica proteína e as regiões de RNA adicionais que são complementares traduzíveis, não traduzíveis, ou ambas. Estas regiões de RNA adicionais incluem as regiões traduzíveis modificadas para traduzir para as regiões terminais ou intrapeptídeo, e as regiões não traduzíveis modificadas para promover a transcrição, translação, ou ambas.

[000123] Em certas modalidades, o construto de DNA recombinante acima mencionado está em um cassete de expressão para uso em um sistema de expressão de E. coli ou de Bt. Os cassetes de expressão são tipicamente projetados com um promotor na extremidade 5' do cassete, a montante de um segmento de polinucleotídeo que codifica uma proteína desejada da presente invenção. Um promotor pode ser constituído por vários elementos de diferentes promotores operacionalmente ligados para fornecer a iniciação da transcrição das sequências que codificam uma proteína da invenção. A sequência de DNA que consiste no DNA que codifica o promotor - proteína pode ser operacionalmente ligado na sua extremidade 3' para uma sequência sinal de terminação da transcrição funcional em célula E. coli e/ou Bt para produzir o construto de DNA recombinante.

[000124] Em certas modalidades, o construto de DNA recombinante acima mencionado está em um cassete de expressão para a expressão em plantas. Os cassetes de expressão são projetados com um promotor na extremidade 5' do cassete, a montante de um segmento de polinucleotídeo que codifica uma proteína desejada da presente invenção. O DNA não transcrito 5' pode compreender um promotor que pode consitir em vários promotores e elementos pontenciadors diferentes operacionalmente ligados para fornecer para a iniciação da transcrição de sequências a jusante, incluindo as sequências que codificam os polipeptídeos da invenção. Uma ou mais sequência de DNA transcritas, mas não traduzidas (s) podem ser operacionalmente ligadas a 3' para o promotor no cassete de expressão, incluindo a(s) sequência(s) líder(es) e/ou de intron (ões). Uma sequência de intron é opcionalmente fornecida de 3' para a sequência líder ou, em alguns casos, na estrutura de leitura aberta que codifica a proteína desejada. Um segmento de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de translocação opcional (um peptídeo sinal ou um peptídeo de trânsito do cloroplasto, por exemplo) pode ser inserido a 5' da sequência de codificação da proteína da presente invenção para localizar a proteína da invenção para uma posição subcelular particular. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína da presente invenção é facultativamente operacionalmente posicionada dentro do cassete de expressão acima mencionado, juntamente com qualquer requisito de poliadenilação ligado operacionalmente (poliA) e/ou uma sequência de terminação transcricional funcional em células de plantas. Os elementos acima mencionados são dispostos de forma contígua e podem ser usados em várias combinações, dependendo do resultado de expressão desejado.

[000125] A presente invenção apresenta os promotores funcionais em plantas, incluindo, mas não limitados a, promotores constitutivos, não constitutivos, espacialmente específicos, temporalmente específicos, tecido específica, desenvolvementalmente específicos, indutiveis, e virais. Exemplos de promotores funcionais em plantas incluem sacarose sintetase 1 de milho, álcool desidrogenase 1 de milho, complexo de colheita de luz de milho, proteína de choque térmico de milho, subunidade RuBP carboxilase de ervilha pequena, sintase manopina de plasmídeo Ti, nopalina sintase de plasmídeo Ti, petúnia calcona isomerase, glicina de feijão rica em proteína 1, Batata patatina, lectina, CaMV 35S, a subunidade RuBP carboxilase de S E9 pequena, vírus de anel gravado no cravo, e promotor do vírus do mosaico de dália.

[000126] Um construto de DNA recombinante que compreende as sequências de codificação da proteína pode também compreender ainda uma região de DNA que codifica um ou mais agentes inibidores de insetos que podem ser configurados para expressar ou coexpressar concomitante com a sequência de DNA que codifica a proteína da presente invenção, uma proteína diferente da proteína acima mencionada, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto ou uma proteína acessória. As proteínas auxiliares incluem cofatores, enzimas, parceiros de ligação ou outros agentes inibidores de insetos que funcionam sinergicamente para auxiliar a eficácia de um agente inibidor de insetos, por exemplo, auxiliando a sua expressão, influenciando a sua estabilidade nas plantas, otimizando a energia livre para oligomerização, aumentando a sua toxicidade, aumentando o seu espectro de atividade.

[000127] Um polinucleotídeo recombinante ou construto de DNA recombinante compreendendo a sequência de codificação de proteína pode ser distribuído às células hospedeiras por vetores. Os métodos para a transferência de construtos de DNA recombinante a partir de células hospedeiras, incluindo E. coli, B. thuringiensis, e espécies de Agrobacterium, são conhecidos na técnica. Tais vetores são projetados para promover a absorção de vetor de DNA e fornecer uma maior expressão do DNA para RNA para a proteína in vitro e em sistemas in vivo, seja transientemente ou estavelmente. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, um vetor de plasmídeo, de baculovírus, cromossoma artificial, virião, cosmídeos, fagomídeos, fagos, ou um vetor viral. Tais vetores podem ser usados para alcançar uma expressão estável ou transiente da sequência que codifica a proteína em uma célula hospedeira; e, se for o caso, a posterior expressão pra polipeptídeo. Um polinucleotídeo recombinante exógeno ou construto de DNA recombinante que compreende a sequência que codifica a proteína e que é introduzido em uma célula hospedeira também é aqui referido como um "transgene".

[000128] Os plasmídeos podem ser projetados para se replicarem em E. coli ou B. thuringiensis, ou ambos. Tais plasmídeos contêm elementos genéticos que permitem a replicação e a manutenção de tais plasmídeos e a expressão dos transgenes, por exemplo, os construtos de DNA recombinante mencionados acima, em ambas as espécies.

[000129] Os vetores de transformação de plantas podem ser projetados para permitir a transferência mediada por Agrobacterium de um TDNA, ou seja, DNA transferidos compreendendo construtos de DNA recombinante acima mencionados. Estes vetores de transformação de plantas contêm os elementos genéticos que permitem a replicação e a manutenção de tais vetores de plasmídeo em E. coli e/ou Agrobacterium e são essenciais para a transferência do T-DNA no genoma de uma planta.

[000130] As células hospedeiras transgênicas compreendendo construtos de DNA recombinante que codificam proteínas de toxinas da presente invenção estão também contempladas. Uma célula hospedeira transgênica pode ser ainda definida como uma célula hospedeira procariota, ou seja, uma célula bacteriana, por exemplo, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus laterosperous, ou celula de Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Agrobacterium, ou Rhizobium, ou uma célula hospedeira eucariótica, por exemplo, uma célula de planta, e cada um destes tipos de células é também aqui referido como uma célula microbiana, um micróbio, ou um micro-organismo.

[000131] Tal como usado aqui uma "célula hospedeira" significa uma célula que é transformada ou transfectada com o DNA recombinante exógeno, por exemplo, através de eletroporação ou através de transformação mediada por Agrobacterium ou por bombardeamento com micropartículas revestidas com DNA recombinante, ou através de transdução, ou por transferência de plasmídeo, ou por outros meios. Uma célula hospedeira da presente invenção pode ser uma bactéria transformada, por exemplo, célula hospedeira de E. coli ou uma célula hospedeira de Bt ou célula hospedeira de Agrobacterium, ou uma célula hospedeira de planta.

[000132] Assim, uma célula hospedeira pode ser uma célula de planta transformada originalmente que existe como um micro-organismo ou como uma célula de planta de progênie que é regenerada no tecido diferenciado, por exemplo, em uma planta transgênica com o DNA recombinante não natural estavelmente integrado, ou as sementes ou pólens derivados de uma planta transgênica da progênie. Tal como usado aqui uma "planta transgênica" inclui uma planta, parte de planta, células ou sementes de plantas, cujo genoma foi alterado pela integração estável de DNA recombinante. A planta transgênica inclui uma planta regenerada a partir de uma célula da planta originalmente transformada e plantas transgênicas de progênie de gerações posteriores ou cruzamentos de uma planta transformada. Deste modo, os exemplos de partes de plantas são folha, um galho, uma casca, uma lâmina, um grão de pólen, um talo, uma célula, um caule, uma flor, uma sépalas, um fruto, uma raiz, ou uma semente.

[000133] As plantas transgênicas que expressam a(s) proteína(s) da invenção apresentam tolerância às pragas. Tais plantas e suas células incluem plantas e células de planta de alfafa, banana, cevada, feijão, baga, brassica, brócolis, repolho, cactus, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, couve chinesa, citros, trevo, coco, café, milho, algodão, pepino, abóbora, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, frutas, alho, uva, lúpulo, paina, alho-poró, legume, alface, pinheiro Loblolly, melão, painço, castanha, aveia, oliva, cebola, ornamental, palma, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, ervilha de pombo, pinheiro, choupo, batata, abóbora, pinheiro Radiata, rabanete, colza, arroz, rizoma, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinheiro do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, suculenta, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, painço amarelo, chá, tabaco, tomate, árvore, triticale, grama de turfe, vegetal, melancia, e trigo.

[000134] As sequências de nucleotídeos podem ser construídas as quais são úteis para a expressão destas proteínas em células de plantas, e tais células de plantas podem ser regeneradas em plantas transgênicas que podem produzir sementes que contenham tais sequências de nucleotídeos que podem ser comercializadas, produzidas em conjunto com outras plantas transgênicas que expressam diferentes proteínas inibidoras de insetos Bt ou outros agentes tóxicos para pragas de colheita.

[000135] As células de plantas podem ser transformadas por múltiplos mecanismos que estão dentro da capacidade da técnica, incluindo, mas não limitados a, sistemas de transformação de bactérias tais como Agrobacterium ou Rizobactéria, eletroporação, sistemas mediados balísticos e semlehantes. Métodos de bombardeamento de microprojéteis estão ilustrados nas Patentes US 5.015.580 (soja); 5.550.318 (milho); 5.538.880 (milho), 5.914.451 (soja); 6.160.208 (milho); 6.399.861 (milho), 6.153.812 (trigo) e 6.365.807 (arroz) e a transformação mediada por Agrobacterium é descrita nas Patentes US 5.159.135 (algodão), 5.824.877 (soja); 5.463.174 (canola), 5.591.616 (milho); 5.846.797 (algodão), 6.384.301 (soja), 7.026.528 (trigo) e 6.329.571 (arroz), Publicação de Pedido de Patente US 2004/0087030 Al (algodão), e Publicação de Pedido de Patente US 2001/ 0042257 Al (açúcar de beterraba) e, em Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:213-222 (cana-de-açúcar) e outros métodos mais recentes descritos nas Publicações de Pedido de Patente US 2009/0138985A1 (soja), 2008/0280361A1 (soja), 2009/0142837A1 (milho), 2008/0282432 (algodão), 2008/0256667 (algodão), 2003/0110531 (trigo), Patentes US 5.750.871 (canola), 7.026.528 (trigo), e 6.365.807 (arroz). A transformação do material de planta pode ser praticada na cultura de tecidos em um meio nutriente, por exemplo, uma mistura de nutrientes que irá permitir que as células cresçam in vitro. Alvos de células receptoras incluem, mas não estão limitados a, células do meristema, hipocotilos, calos, embriões imaturos e células gaméticas como micrósporos, pólens, óvulos e espermatozóides. Calos podem ser iniciados a partir de fontes de tecidos, incluindo, mas não limitadas a, embriões imaturos, hipocotilos, meristemas apicais de mudas, microsporos e semelhantes. As células que contêm um núcleo transgênico são cultivadas em plantas transgênicas.

[000136] Além disso, a transformação direta de um material de planta com um DNA recombinante, um núcleo de células de plantas transgênicas pode ser preparado por passagem de uma primeira planta tendo as células com um núcleo transgênico com DNA recombinante com uma segunda planta sem o núcleo transgênico. Por exemplo, o DNA recombinante pode ser introduzido em um núcleo a partir de uma primeira linhagem de planta que é suscetível à transformação de núcleo transgênico em células que são cultivadas em uma planta transgênica que pode ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para introduzir o DNA recombinante na segunda linhagem de planta. A planta transgênica com DNA recombinante fornecendo um traço potencializado, por exemplo, rendimento potencializado, pode ser cruzada com a linhagem de planta transgênica com outro DNA recombinante que confere outro traço, por exemplo, resistência a herbicidas ou resistência a pragas, para produzir plantas de progênie com DNA recombinante que confere ambos os traços. Normalmente, em tais cruzamentos para combinar traços da planta transgênica a doação do traço adicional é uma linhagem masculina e a planta transgênica que transporta os traços de base é a linham feminina. A progênie desse cruzamento irá segregar tal que algumas das plantas vão transportar o DNA para ambos os traços parentais e alguns vão transportar o DNA para um traço parental; tais plantas podem ser identificadas por meio de marcadores associados com o DNA recombinante parental, por exemplo, identificação do marcador por análise de DNA recombinante, ou, no caso de um marcador selecionável estar ligado ao DNA recombinante, por aplicação do agente de seleção, como um herbicida para uso com um marcador de tolerância ao herbicida, ou por seleção para o traço inibidor do inseto. As plantas da progênie que transportam o DNA para ambas as características parentais podem ser cruzadas novamente na linhagem de origem feminina várias vezes, por exemplo, geralmente de 6 a 8 gerações, para produzir uma planta de progênie com substancialmente o mesmo genótipo como uma linhagem parental transgênica original, mas para o DNA recombinante de outra linhagem parental transgênica.

[000137] Na prática de transformação de plantas, o DNA exógeno é tipicamente introduzido em apenas uma pequena porcentagem de células de planta alvo em qualquer um dos experimentos de transformação. As células da presente invenção podem ser testadas diretamente para confirmar a integração estável do DNA exógeno por uma variedade de métodos de detecção de DNA bem conhecidos ou por uma variedade de ensaios de bioatividade bem conhecidos que testam a atividade inibidora de insetos (descrito na seção de exemplos). Os genes marcadores podem ser usados para fornecer um sistema eficiente para a identificação das células que são transformadas de forma estável por receber e integrar uma molécula de DNA recombinante em seus genomas. Os genes marcadores preferidos fornecem marcadores seletivos que conferem resistência a um agente seletivo, tal como um antibiótico ou um herbicida. Qualquer um dos herbicidas a que as plantas desta invenção podem ser feitas resistentes pode ser usado como agentes para os marcadores seletivos. As células potencialmente transformadas são expostas ao agente seletivo. Na população as células sobreviventes serão aquelas células, onde, geralmente, o gene que confere resistência é integrado e expresso em níveis suficientes para permitir a sobrevivência das células. As células podem ser ainda testadas para confirmar a integração estável do DNA exógeno. Os genes marcadores seletivos comumente usados incluem os que conferem resistência a antibióticos tais como canamicina e paromomicina (nptII), higromicina B (aph IV), espectinomicina (aadA) e gentamicina (aac3 e aacC4) ou resistência a herbicidas, tais como glufosinato (bar ou pat), dicamba (DMO) e glifosato (aroA ou EPSPS). Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados nas Patentes US 5.550.318, 5.633.435, 5.780.708, e 6.118.047. Os marcadores que fornecem uma capacidade para visualmente rastrear transformantes podem também ser empregados, por exemplo, um gene que expressa uma proteína fluorescente ou colorida tal como uma proteína fluorescente verde (GFP) ou luciferase.

[000138] As células de plantas que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células de plantas que tenham sido pontuadas positivas em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas em um meio de regeneração e deixadas amadurecer em plantas. Desenvolvimento de plantas regeneradas a partir de células de plantas transformadas pode ser transferido para a mistura do crescimento de plantas, e endurecido fora, por exemplo, em uma câmara de ambiente controlado a cerca de 85% de umidade relativa, 600 ppm de CO2, e de 25 a 250 microeinsteins m 2 s-1 de luz, antes de serem transferidos para uma câmara de estufa ou de crescimento para a maturação. Estas condições de crescimento variam entre as espécies de plantas e são conhecidas pelos versados na técnica. As plantas são regeneradas a partir de cerca de 6 semanas a 10 meses após um transformante ser identificado, dependendo do tecido inicial, e das espécies de plantas. As plantas podem ser polinizadas usando métodos de cruzamento de plantas convencionais conhecidos dos versados na técnica e sementes produzidas, por exemplo, a autopolinização é comumente usada com o milho transgênico. A planta transformada regenerada ou sua semente progênie ou plantas pode ser testada para a expressão do DNA recombinante e selecionada para a presença de atividade inibidora de insetos.

[000139] As plantas transgênicas que codificam e expressam uma ou mais das proteínas da presente invenção são cultivadas para (i) gerar plantas transgênicas tendo um traço melhorado em comparação com uma planta de controle e (ii) produzir semente transgênica e pólen haplóide da presente invenção. Tais plantas com traços melhorados são identificadas por seleção de sementes de progênie ou de plantas transformadas para o traço melhorado. Para a eficiência, um método de seleção é projetado para avaliar várias plantas transgênicas (eventos) que compreendem o DNA recombinante, por exemplo, várias plantas de 2 a 20 ou mais eventos transgênicos. As plantas transgênicas crescidas a partir de sementes transgênicas fornecidas aqui demonstram a melhora dos traços agronômicos que contribuem para a tolerância inibidora de inseto aumentada ou rendimento da colheita aumentado ou outros traços que fornecem o aumento do valor da planta, incluindo, por exemplo, qualidade de sementes ou casulo melhorada. De particular interesse são as plantas de algodão, alfafa, milho, soja, ou cana-de- açúcar com resistência inibidora de insetos melhorada contra uma ou mais insetos das ordens Lepidoptera e/ou Hemiptera. De particular interesse são as plantas de algodão que têm resistência inibidora a insetos melhorada contra um inseto da ordem Hemiptera.

[000140] A invenção fornece métodos para produzir uma planta e colher uma colheita da semente que compreende uma molécula de polinucleotídeo recombinante que codifica os polipeptídeos inibidores de insetos da presente invenção. De particular interesse são as plantas de algodão, alfafa, milho, soja, ou cana-de-açúcar com resistência inibidora a insetos melhorada contra um inseto(s) da ordem Lepidóptero e/ou Hemíptero. O método inclui as etapas de cruzar uma planta resistente a insetos expressando os polipeptídeos recombinantes da presente invenção com uma outra planta, obter pelo menos uma planta progénie derivada deste cruzamento, e selecionar os progênies que expressam polipeptídeos recombinantes da presente invenção em que é dito progênie é resistente contra um inseto. Isto inclui as etapas de plantar a semente, produzir uma colheita de crescimento de plantas a partir de sementes, e a colher a colheita, em que pelo menos 50% da colheita compreende semente compreendendo a molécula de polinucleotídeo recombinante.

[000141] Em um aspecto da invenção, uma célula de planta transgênica, uma planta transgênica, e partes das plantas transgênicas que compreendem um polinucleotídeo recombinante (ou seja, transgene) que expressa qualquer uma ou mais das sequências de codificação de proteínas são aqui fornecidas. Pretende-se que a "célula bacteriana" ou "bactéria" possa incluir, mas não esteja limitada a, um Agrobacterium, um Bacillus, uma Escherichia, uma Salmonella, um Pseudomonas, ou uma célula de Rhizobium. Pretende-se que a "célula de planta" ou "planta" inclua uma célula de planta ou planta de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, Brassica, cenoura, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, grão de bico, couve chinesa, citros, coco, café, milho, trevo, algodão, abóbora, pepino, abeto de Douglas, berinjela, eucalipto, linho, frutas, alho, uva, lúpulo, paina, alho-poró, legume, alface, pinheiro Loblolly, melão, painço, castanha, aveia, oliva, cebola, ornamental, palma, grama de pasto, ervilha, amendoim, pimenta, ervilha de pombo, pinheiro, choupo, batata, abóbora, pinheiro Radiata, rabanete, colza, arroz, rizoma, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinheiro do Sul, soja, espinafre, abóbora, morango, suculenta, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, painço amarelo, chá, tabaco, tomate, árvore, triticale, grama de turfe, vegetal, melancia, e trigo. Em certas modalidades, as plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas regeneradas a partir de uma célula de planta transgênica, são fornecidas. Em certas modalidades, as plantas transgênicas podem ser obtidas a partir de uma semente transgênica. Em certas modalidades, as partes de plantas transgênicas podem ser obtidas através do corte, rotura, moagem ou, de outro modo, dissociando a parte da planta. Em certas modalidades, a parte da planta pode ser uma semente, um casulo, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz, ou qualquer porção dos mesmos. Em certas modalidades, uma parte de planta transgênica fornecida aqui é uma porção não regenerável de uma parte planta transgênica. Conforme usado neste contexto, uma porção "não regenerável" de uma parte planta transgênica é uma porção que não pode ser induzida a formar uma planta inteira, ou que não pode ser induzida a formar uma planta inteira que é capaz de reprodução sexuada e/ou assexuada. Em certas modalidades, uma porção não regenerável, de uma parte da planta é uma porção de semente, um casulo, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz.

[000142] Também são aqui fornecidos métodos de preparação de plantas transgênicas que compreendem quantidades inibidoras de insetos da proteína(s) da presente invenção. Essas plantas podem ser feitas através da introdução de um polinucleotídeo recombinante que codifica qualquer das proteínas aqui fornecidas em uma célula de planta, e selecionando uma planta derivada da dita célula da planta que expressa uma quantidade inibidora de insetos das proteínas. As plantas podem ser derivadas das células de plantas por técnicas de transformação de regeneração, sementes, pólen, ou meristema.

[000143] Também é aqui fornecido o uso de uma planta transgênica que expressa uma quantidade inibidora de insetos de uma ou mais das proteínas da presente invenção para controlar uma praga das espécies de Lepidópteros e/ou Hemípteros. Qualquer uma das plantas transgênicas referidas acima pode ser usada em métodos para proteção de uma planta contra a infestação de insetos aqui fornecidos.

[000144] Também é aqui fornecido o uso de qualquer uma das células hospedeiras transgênicas mencionadas acima para produzir as proteínas da presente invenção.

[000145] Os aspectos adicionais da invenção incluem métodos e/ou kits para a detecção de DNA, RNA ou proteína da presente invenção, métodos para identificar os membros do gênero das proteínas aqui descritas, métodos para identificar novas proteínas relacionadas com os membros da família do gênero, métodos para testar e controlar o crescimento e/ou infestação de insetos, e métodos para fornecer tal controle de plantas e outros hospedeiros receptores. Estas proteínas podem ser usadas para produzir anticorpos que se ligam especificamente a esta classe/gênero de proteínas e estes anticorpos podem ser usados para rastrear e encontrar outros membros do gênero. Um anticorpo, por si só, ou em uma mistura de anticorpos, que se liga especificamente a um alvo dos polipeptídeos recombinantes da presente invenção é contemplado, e o método de uso desse anticorpo, por si só, ou em uma mistura de anticorpos, para detectar ou quantificar proteínas compartilham epítopos das proteínas da presente invenção é também contemplado. Um tal método para detectar ou quantificar pode incluir as etapas de contatar uma amostra com o anticorpo e usar meios de detecção bem conhecidos na técnica para detectar a ligação do anticorpo ao polipeptídeo alvo na amostra. Quando um ou mais epítopos são contemplados e sua combinação é usada em tal processo, a ligação de um anticorpo ou mistura de anticorpos que reconhecem diferentes epítopos pode identificar um polipeptídeo que exibe homologia com os polipeptídeos recombinantes da presente invenção.

[000146] Os kits para detectar a presença de um polipeptídeo alvo em uma amostra que se suspeita conter o alvo de polipeptídeo são fornecidos. Tais kits podem incluir um reagente(s) usado para a detecção de epítopo e controle de reagente(s) para mostrar que a detecção estava operando dentro de desvios estatísticos. O armazenamento do reagente, instruções para os meios de detecção e o uso de reagentes, e partes e ferramentas adicionais que podem ser incluídas em tais kits adicionais, são contemplados.

[000147] Os segmentos de polinucleotídeos que codificam as proteínas da presente invenção, isto é, as proteínas do gênero descrito, particularmente, os segmentos derivados de cepas de Bt do tipo selvagem, podem ser usados como sondas e iniciadores para a triagem e para identificar outros membros dentro do gênero usando métodos de amplificação térmica e/ou de hibridização. As sondas ou iniciadores de nucleotídeos podem variar em comprimento, sequência, concentração, esqueleto, e formulação, dependendo do método de detecção da amostra usado. A presente invenção apresenta os iniciadores e as sondas que podem ser usados para detectar e isolar os genes homólogos que codificam membros da proteína inibidora de insetos do gênero. Um kit para a detecção de DNA é contemplado proporcionando que um versado na técnica efetue mais facilmente a detecção e/ou isolamento de genes homólogos da presente invenção. A invenção fornece o uso de tais kits e métodos e novos genes e os polipeptídeos inibidores de insetos codificados por tais genes que são detectados e isolados pelos meios de detecção acima mencionados.

[000148] A invenção fornece ainda métodos para testar os polipeptídeos da presente invenção para a atividade inibidora de insetos, aqui designada "bioensaio". São aqui descritos bioensaios de insetos qualitativos que medem a inibição de crescimento, a mortalidade, ou uma combinação de ambos. As ordens de insetos testadas nos exemplos que seguem incluem Coleoptera, Diptera, Lepidoptera, e Hemiptera. A receita e preparação da dieta, a preparação de testes e amostras de controle, a preparação de insetos, e os procedimentos para a realização de ensaios são geralmente dependentes do tipo e do tamanho do inseto e/ou praga a ser submetida a qualquer avaliação particular. Tais métodos são ilustrados e descritos em detalhe nos exemplos seguintes.

[000149] Em certas modalidades, o produto de planta pode compreender a mercadoria ou outros produtos de comércio derivados de uma planta transgênica ou parte de planta transgênica, onde a mercadoria ou outros produtos podem ser rastreados através do comércio pela detecção de segmentos de nucleotídeos ou RNA expresso ou proteínas que codificam ou compreendem porções distintas das proteínas da presente invenção. Tais mercadorias ou outros produtos do comércio incluem, mas não estão limitados a, partes de plantas, biomassa, óleo, sêmola, açúcar, ração animal, farinha, flocos, farelo, fibras, sementes processadas e sementes.

[000150] Também são fornecidos aqui produtos de plantas processados compreendendo uma quantidade detectável de um nucleotídeo recombinante que codifica qualquer uma das proteínas da presente invenção, um fragmento inibidor de insetos do mesmo, ou qualquer porção distintiva do mesmo. Em certas modalidades, o produto processado é selecionado do grupo consistindo em biomassa vegetal, óleo, sêmola, ração animal, farinha, flocos, farelo, fibra, cascas e sementes processadas. Em certas modalidades, o produto processado é não regenerável. Em certas modalidades, uma porção distintiva do mesmo pode compreender qualquer polinucleotídeo que codifica pelo menos 20, 30, 50 ou 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 136 ou 138.

[000151] Também são fornecidos aqui métodos de controle de insetos. Tais métodos podem compreender o crescimento de uma planta compreendendo uma quantidade inibidora de insetos da proteína da presente invenção. Em certas modalidades, tais métodos podem ainda compreender qualquer um ou mais dos seguintes: (i) aplicação de qualquer composição compreendendo ou codificando as proteínas da presente invenção para a planta ou uma semente, que dá origem à planta; e/ou (ii) transformação da planta ou uma célula de planta que dá origem à planta com um polinucleotídeo que codifica as proteínas da presente invenção. Em certas modalidades, a planta é uma planta transgênica transitoriamente ou estavelmente transformada compreendendo um transgene que expressa uma quantidade inibidora de insetos da proteína da presente invenção. Em certas modalidades, a planta é uma planta não transgênica para a qual uma composição que compreende a proteína da presente invenção foi aplicada.

[000152] Outros aspectos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, exemplos e reivindicações.

EXEMPLOS

[000153] Tendo em conta o que precede, os versados na técnica devem reconhecer que podem ser feitas alterações nos aspectos específicos que estão divulgados e ainda se obter um resultado parecido ou similar sem distanciamento do espírito e do escopo da invenção. Deste modo, detalhes específicos aqui divulgados não devem ser interpretados como limitativos.

Exemplo 1: Descoberta de proteínas inibidoras de insetos

[000154] Várias cepas de Bt que exibem atributos distintivos, por exemplo, toxicidade inferida, diversidade proteômica, e variações morfológicas quando comparadas entre si foram identificadas e o DNA foi obtido a partir de cada cepa e preparado para a sequenciação de DNA. A informação da sequência de DNA foi gerada para cada tal cepa, as sequências brutas lidas foram processadas, os revestimentos foram montados a partir das leituras processadas, estruturas de leitura aberta foram identificadas, e as sequências de aminoácidos deduzidas foram analisadas.

Exemplo 2: Clonagem e expressão de proteínas inibidoras de inseto

[000155] Este exemplo ilustra a clonagem de segmentos de polinucleotídeos que codificam proteínas inibidoras de insetos, e inserção e expressão em células hospedeiras recombinantes.

[000156] Os segmentos de nucleotídeos foram obtidos por amplificação a partir de amostras genômicas correspondentes a partir das quais cada estrutura de leitura aberta foi identificada no Exemplo 1. Os segmentos de nucleotídeos amplificados foram inseridos num plasmídeo recombinante e transformados numa célula hospedeira acrystalliferous Bt, ou numa cepa de expressão em E. coli, e a(s) cepa(s) recombinante(s) resultante(s) foi observada expressar uma proteína recombinante.

[000157] As proteínas recombinantes aqui exemplificadas foram observadas para exibir propriedades inibidoras de insetos a uma variedade de espécies de pragas, tal como descrito nos Exemplos 3-13 abaixo. As sequências de nucleotídeos como estabelecidas na SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: ll, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 135 e SEQ ID NO: 137 foram confirmadas para codificar proteínas tendo sequências de aminoácidos conforme estabelecidas na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 136 e SEQ ID NO: 138 (respectivamente, TIC1498, TIC1415, TIC1497, TIC1886, TIC1414, TIC1922, TIC1422, TIC1974, TIC1362, TIC2335 e TIC2334).

[000158] Os plasmídeos e as cepas recombinantes também foram construídos para conter segmentos de polinucleotídeos tendo as sequências conforme estabelecidas na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, e SEQ ID NO: 23, e foram confirmadas para codificar proteínas tendo sequências de aminoácidos conforme estabelecidas na SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NO: 24 (respectivamente, TIC1925, TIC1885, TIC2032 e TIC2120).

Exemplo 3: atividade de leptidópteros do TIC1886

[000159] Este exemplo ilustra a atividade de Helicoverpa zea (Hz) exibida por uma amostra a partir de uma cepa recombinante expressando a proteína recombinante TIC1886 tendo a sequência de aminoácidos deduzida de SEQ ID NO: 8.

[000160] A dieta de 16,5% (p/v) de dieta de "Espécies Múltiplas" (Southland Products, 201 Stuart Island Road, Lake Village, Arkansas 71653) foi preparada em uma base de ágar 14% (p/v) (Serva # 11393). A base de ágar foi fundida e misturada com uma dieta e água purificada para o volume (1,4% (p/v) de ágar). A suspensão da dieta foi dispensada em compartimentos individuais de bioensaios.

[000161] Uma amostra de ensaio de proteína recombinante TIC 1886 foi preparado como descrito no exemplo 2, e coberto com mais de 24 superfícies de dieta em compartimentos de aproximação sobre 2,890 ug/ml por compartimento. A amostra de controle de tampão foi colocada sobre 96 superfícies de dieta compartimentalizadas. Em conjunto, as 120 superfícies de dieta compartimentalizadas compreendem o conjunto de teste deste exemplo preparado para bioensaio de Helicoverpa zea.

[000162] Uma única larva foi transferida para a superfície da dieta de cada compartimento individual do conjunto de teste deste exemplo (120 neonatos no total) e cada compartimento selado com uma tampa ventilada. O conjunto de teste foi colocado num ambiente controlado a 27°C e 60% de RH, sem luz, durante 5-7 dias e pontuadas para mortalidade e atrofismo. O atrofismo foi estimado visualmente em comparação com os insetos não tratados e foi pontuado como atrofiado significativamente (> 67% atrofismo), atrofiado moderadamente (3367% atrofiado), ou atrofiado (<33%).

[000163] Nenhum atrofismo ou mortalidade foi observado com amostras de controle de tampão. A mortalidade foi observada contra larvas de 24 Hz a 2890 ug/mL de TIC1886. Concluiu-se que a proteína TIC1886 demonstrou atividade de Helicoverpa zea (lagarta da espiga de milho) (ver Figura 2 e Tabela 2).

[000164] O procedimento de bioensaio de lepidóptero descrito neste exemplo também foi aplicado a uma combinação de larvas de espécies de Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Diatraea grandiosella, e Anticarsia gemmatalis usando as proteínas da presente invenção (a partir do Exemplo 2, TIC1498, TIC1415, TIC1497, TIC1414, TIC1422 e TIC1362), e os resultados estão descritos nos exemplos 4-7.

Exemplo 4: Atividade de leptidópteros do TIC1498, TIC1497 e TIC1422

[000165] Usando os métodos e as técnicas de bioensaio descritos no Exemplo 3, as proteínas recombinantes TIC1498 (SEQ ID NO: 2), TIC1497 (SEQ ID NO: 6), e TIC1422 (SEQ ID NO: 18) foram testadas contra neonatos de espécies de insetos Ostrinia nubilalis (On), Diatraea saccharalis (Ds), Diatraea grandiosella (GD), e Anticarsia gemmatalis (Ag).

[000166] TIC1498 exibiu mortalidade contra Ostrinia nubilalis, e os sobreviventes foram significativamente atrofiados, mais de 24 larvas em 2500 ug/mL. TIC1497 exibiu mortalidade contra Ostrinia nubilalis, e os sobreviventes foram significativamente atrofiados, mais de 24 larvas em 3700 ug/mL. TIC1422 exibiu mortalidade contra Ostrinia nubilalis, e os sobreviventes foram significativamente atrofiados, mais de 24 larvas em 1300 ug/mL. Concluiu-se que TIC1498, TIC1497, e TIC1422demonstrou atividade (ver Figura 2 e Tabela 2) contra Ostrinia nubilalis (broca do milho Europeia).

[000167] TIC1498 exibiu mortalidade contra Diatraea saccharalis, e os sobreviventes foram significativamente atrofiados, mais de 24 larvas em 3000 ug/mL. TIC1497 exibiu mortalidade contra Diatraea saccharalis, e os sobreviventes foram significativamente atrofiados, mais de 24 larvas em 2000 ug/mL. TIC1422 exibiu 100% de mortalidade, Diatraea saccharalis, mais de 24 larvas em 300 ug/mL. Concluiu-se que as proteínas recombinantes TIC1498, TIC1497, e TIC1422 demonstraram atividade (ver Figura 2 e Tabela 2) contra Diatraea saccharalis (broca de cana-de-açúcar).

[000168] TIC1498 exibiu mortalidade contra Diatraea grandiosella, e os sobreviventes foram moderadamente atrofiados, mais de 24 larvas em 3000 ug/mL. TIC1497 exibiu taxa de mortalidade contra Diatraea grandiosella, e os sobreviventes foram significativamente atrofiados, mais de 24 larvas em 2000 ug/mL. TIC1422 exibiu mortalidade contra Diatraea grandiosella, mais de 24 larvas em 300 ug/mL. Concluiu-se que TIC1498, TIC1497 e TIC1422 demonstraram atividade (ver Figura 2 e Tabela 2) contra Diatraea grandiosella (broca do milho do sudoeste).

[000169] TIC1498 exibiu mortalidade contra Anticarsia gemmatalis, e os sobreviventes foram significativamente atrofiados, mais de 48 larvas em 2500-3000 ug/mL. TIC1497 exibiu mortalidade contra Anticarsia gemmatalis, e os sobreviventes foram de moderadamente para significativamente atrofiados, mais de 48 larvas em 2000-3700 ug/mL. TIC1422 exibiu mortalidade contra Anticarsia gemmatalis, e os sobreviventes foram significativamente atrofiados, mais de 48 larvas em 300-1300 ug/mL. Concluiu-se que TIC1498, TIC1497, e TIC1422 demonstraram a atividade (ver Figura 2 e Tabela 2) contra Anticarsia gemmatalis (lagarta).

Exemplo 5: Atividade de leptidópteros de TIC1415

[000170] TIC1415 (SEQ ID NO: 4) foi testada contra neonatos de espécies de insetos Ostrinia nubilalis (On) e Anticarsia gemmatalis (Ag). TIC1415 exibiu mortalidade contra Ostrinia nubilalis, e os sobreviventes foram moderadamente atrofiados, mais de 24 larvas em 1500 ug/mL.Concluiu-se que TIC1415 demonstrou atividade (ver Figura 2 e Tabela 2) contra Ostrinia nubilalis (broca do milho europeu).

[000171] TIC1415 exibiu mortalidade contra Anticarsia gemmatalis, eos sobreviventes foram moderadamente atrofiados, mais de 24 larvas em 1500 ug/mL. Concluiu-se que TIC1415 demonstrou atividade (ver Figura 2 e Tabela 2) contra Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja).

Exemplo 6: Atividade de lepidópteros de TIC1414

[000172] TIC1414 (SEQ ID NO: 12) foi testada contra neonatos deespécies de insetos Anticarsia gemmatalis (Ag). TIC1414 exibiumortalidade contra Anticarsia gemmatalis, e os sobreviventes foram atrofiados, mais de 24 larvas em 870 ug/mL. Concluiu-se que a atividade de TIC1414 demonstrou (ver Figura 2 e Tabela 2) contra Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja).

Exemplo 7: Atividade de lepidópteros de TIC1362

[000173] TIC1362 (SEQ ID NO: 26) foi testada contra neonatos deespécies de insetos Diatraea saccharalis (Ds) e Diatraea grandiosella (Dg). TIC1362 exibiu mortalidade contra Diatraea saccharalis, e os sobreviventes foram significativamente atrofiados, mais de 24 larvas em 400 ug/mL. TIC1362 demonstrou atividade contra Diatraea saccharalis (lagarta da soja) (ver Figura 2 e Tabela 2).

[000174] TIC1362 exibiu 100% de mortalidade contra Diatraeagrandiosella mais de 24 larvas em 400 ug/mL. TIC1362 demonstrou atividade contra Diatraea grandiosella (broca do milho do sudoeste) (ver Figura 2 e Tabela 2).

Exemplo 8: Atividade de Hemíptero de TIC1498

[000175] Este exemplo ilustra a atividade inibidora de insetos TIC1498 (SEQ ID NO: 2), quando fornecida na dieta dos insetos hemípteros, incluindo mas não se limitando a membros da Heteroptera Miridae, incluindo o gênero Lygus, por exemplo, Lygus hesperus e Lygus lineolaris. Este exemplo ilustra mais especificamente a atividade de Lygus hesperus (Lh) e a Lygus lineolaris (Ll) exibida por uma amostra a partir de uma cepa recombinante que expressa a proteína recombinante TIC1498.

[000176] A dieta de 7,81% (p/v) da dieta de "Diet Lygus" (Bio-Serv #F9644B, One 8th Street, Suite One, Frenchtown, NJ 08825) e os conteúdos de líquido de dois conjuntos de ovos frescos inteiros foram preparados. A dieta foi resfriada e armazenada sob condições controladas de umidade, a 4°C até que esteja pronto para uso. Esta preparação da dieta foi usada dentro de 2 dias após a preparação.

[000177] As amostras de teste contendo a proteína TIC1498 foram preparadas encapsuladas (~40 uL) entre folhas Parafilm e Mylar esticadas foram seladas a quente (sachês).

[000178] Os ovos de Lygus hesperus e Lygus lineolaris foram incubados a 24°C, até atingirem entre 0 a cerca de 12 horas do estágio de pré-eclosão. Os ovos de pré-eclosão foram embebidos e enxaguados em água esterilizada, em seguida, colocados na proximidade confinada às saquetas preparadas num ambiente controlado a 24°C e 60% RH, sem luz para os dias 4-7 e pontuados para a mortalidade e atrofismo percentual de quaisquer sobreviventes. O atrofismo foi estimado visualmente em comparação com os insetos não tratados e foi pontuado como atrofiado significativamente (> 67% atrofismo), atrofiado moderadamente (33-67% atrofiado), ou atrofiado (<33%).

[000179] A 10 ug/mL de TIC1498, a mortalidade foi observada contra Lygus lineolaris e sobreviventes atrofiados, em mais de 24 ninfas neonatas. A 50 ug/mL de TIC1498, a mortalidade foi observada contra Lygus lineolaris e sobreviventes atrofiados, mais de 24 ninfas neonatas. TIC1498 exibiu mortalidade contra Lygus lineolaris a 100 ug/mL, e os sobreviventes foram moderadamente atrofiados, mais de 24 ninfas neonatas.

[000180] A 10 ug/mL de TIC1498, a mortalidade foi observada contra Lygus hesperus, e os sobreviventes atrofiados, mais de 24 ninfas neonatas. A 50 ug/mL TIC1498, a mortalidade foi observada contra Lygus hesperus, e os sobreviventes atrofiados, mais de 24 ninfas neonatas. TIC1498 exibiu mortalidade contra Lygus hesperus a 100 ug/mL, e os sobreviventes foram moderadamente atrofiados, mais de 24 ninfas neonatas. Em 2300 ug/mL de TIC 1498, 100% de mortalidade foi observada contra Lygus hesperus, mais de 24 ninfas neonatas.

[000181] TIC 1498 demonstrou atividade tanto para Lygus lineolaris (inseto de planta manchada) quanto Lygus hesperus (inseto de planta manchada do Ocidente) (ver Figura 2 e Tabela 2). O procedimento do bioensaio de hemípteros descrito neste exemplo também foi realizado usando TIC1415, TIC1497, TIC1886, TIC1414, TIC1922, TIC1974 e TIC1362.

Exemplo 9: Atividade de Hemíptero de TIC1922 e TIC1974

[000182] TIC1922 (SEQ ID NO: 16) e TIC1974 (SEQ ID NO: 20) foram testadas contra Lygus lineolaris (Ll). TIC1922 foi testada em três grupos de 24 sachês e exibiram mortalidade contra Lygus lineolaris, e os sobreviventes exibiram atrofismo a 3000 ug/mL. TIC1974 não exibiu mortalidade contra Lygus lineolaris, mas os sobreviventes foram atrofiados, na avaliação de 24 ninfas neonatas a 3000 ug/ml. TIC1922 e TIC1974 demonstraram atividade contra Lygus lineolaris (inseto de planta manchada) (ver Figura 2 e Tabela 2).

Exemplo 10: Atividade de Hemíptero de TIC1497

[000183] TIC1497 (SEQ ID NO: 6) foi testada contra Lygus hesperus (Lh). TIC1497 exibiu mortalidade contra Lygus hesperus, e os sobreviventes foram moderadamente atrofiados, em um experimento avaliando 48 ninfas neonatas a 2000 ug/mL.

[000184] As preparações de fragmentos de TIC1497 foram feitas por tratamento de TIC1497 com termolisina, quimotripsina, tripsina, ou Glu- C, resultando em fragmentos de TIC1497 exibindo massas de 32411 Da (SEQ ID NO: 64), 32557 Da (SEQ ID NO: 62), 34225 Da (SEQ ID NO: 61) e 34485 Da (SEQ ID NO: 63). O eluato de proteína da preparação tratada com termolisina foi isolado (TIC1497.32411) numa coluna de troca iônica e usado em bioensaios contra espécies de Hemípteros.

[000185] TIC1497.32411 exibiu mortalidade contra Lygus lineolaris, e os sobreviventes foram moderadamente atrofiados, em um experimento usando 24 ninfas neonatas a 100 ug/mL. TIC 1497.32411 exibiu 100% de mortalidade com uma dose de 1000 ug/ml.

[000186] TIC 1497.32411 exibiu mortalidade para Lygus lineolaris, e os sobreviventes foram moderadamente atrofiados, em um experimento com 24 ninfas neonatas, na dose de 2300 ug/mL.

[000187] TIC 1497 demonstrou atividade para Lygus hesperus (inseto de planta manchada do Ocidente) (ver Figura 2 e Tabela 2). O fragmento de TIC1497.32411 demonstrou atividade tanto para Lygus lineolaris (inseto de planta manchada) quanto para Lygus hesperus (inseto de planta manchada do Ocidente) (ver Figura 2 e Tabela 2).

Exemplo 11: Atividade de Hemíptero de TIC1886, TIC1415, TIC1414 e TIC1362

[000188] TIC1886 (SEQ ID NO: 8), TIC1415 (SEQ ID NO: 4), TIC1414 (SEQ ID NO: 12), e TIC1362 (SEQ ID NO: 24) foram testadas contra Lygus lineolaris e Lygus hesperus. TIC1886 exibiu mortalidade tanto contra Lygus lineolaris quanto para Lygus hesperus, a uma dose equivalente a 124 ug/ml. TIC 1415 exibiu mortalidade contra Lygus lineolaris e Lygus hesperus na dose equivalente a 150 ug/mL e os sobreviventes foram atrofiados. TIC1414 exibiram mortalidade contra Lygus lineolaris, numa dose equivalente a 95 ug/ml. TIC1362 exibiu mortalidade contra Lygus lineolaris, numa dose equivalente a 370 ug/ml.

[000189] TIC1886, TIC1415 e TIC1362 demonstraram atividade tanto para Lygus lineolaris (inseto de planta manchada) quanto para Lygus hesperus (Inseto de planta manchada do Ocidente). TIC1414 demonstrou atividade para Lygus lineolaris (inseto de planta manchada) (ver Figura 2 e Tabela 2).

Exemplo 12: Atividades inibidoras de insetos de outros membros da proteína

[000190] Outros membros de proteínas do gênero da presente invenção, tal como, mas não limitados a TIC1925 (SEQ ID NO: 10), TIC1885 (SEQ ID NO: 14), TIC2032 (SEQ ID NO: 22), e TIC2120 (SEQ ID NO: 24), são preparados para bioensaios contra pragas de plantas, incluindo uma praga a partir do filo Nematoda, uma praga de Lepidóptero, e uma praga de Hemíptero.

Exemplo 13: Expressão de proteínas em plantas

[000191] Este exemplo ilustra a expressão de proteínas da presente invenção em plantas. Segmentos de polinucleotídeos para uso na expressão das proteínas da presente invenção em plantas podem ser produzidos de acordo com os métodos descritos na Patente US 7.741.118. Por exemplo, as proteínas de toxina tendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, e SEQ ID NO: 26 podem ser produzidas em plantas de segmentos de polinucleotídeos com a sequência como estabelecida, respectivamente, em SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, e SEQ ID NO: 30. Os segmentos de polinucleotídeos projetados para uso em plantas e que codifica as proteínas da presente invenção, incluindo as sequências conforme estabelecidas na SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, e SEQ ID NO: 30 são operacionalmente ligadas aos elementos de expressão necessários para expressão em plantas, e transformadas no genoma das células de plantas, preferencialmente, células de algodão alfafa, milho e soja.

[000192] Pretende-se que os segmentos de polinucleotídeos (ou moléculas de polinucleotídeos) que codificam cada uma das seguintes proteínas enumeradas, fragmentos inibidores de insetos dos mesmos, e as proteínas que exibem o grau de identidade aqui especificado acima, para uma ou mais destas proteínas enumeradas, são usados isoladamente ou em combinações uns com os outros, ou em combinação com outras proteínas de toxinas ou agentes tóxicos, tais como moléculas de supressão do gene mediadas por dsRNA, projetadas para funcionar de forma sinérgica ou sinônima com as proteínas da presente invenção, para atingir plantas e células de plantas protegidas contra a infestação de pragas, particularmente, infestação de pragas de insetos. As proteínas enumeradas específicas dentro do escopo da invenção incluem TIC1498 (SEQ ID NO: 2), TIC1415 (SEQ ID NO: 4), TIC1497 (SEQ ID NO: 6), TIC1886 (SEQ ID NO: 8), TIC1925 (SEQ ID NO: 10), TIC1414 (SEQ ID NO: 12), TIC1885 (SEQ ID NO: 14), TIC1922 (SEQ ID NO: 16), TIC1422 (SEQ ID NO: 18), TIC1974 (SEQ ID NO: 20), TIC2032 (SEQ ID NO: 22), TIC2120 (SEQ ID NO: 24), TIC1362 (SEQ ID NO: 26), TIC2335 (SEQ ID NO: 136), TIC2334 (SEQ ID NO: 138) e fragmentos inibidores de insetos dos mesmos, tais como, mas não limitados a, TIC1497.34225 (SEQ ID NO: 61), TIC1497.32557 (SEQ ID NO: 62), TIC1497.34485 (SEQ ID NO: 63), e TIC1497.32411 (SEQ ID NO: 64).

[000193] Por exemplo, as proteínas do gênero TIC1415 da presente invenção podem ser combinadas com outros agentes pesticidas, incluindo agentes pesticidas alvos de pragas que se sobrepõem com as pragas alvos de proteínas TIC1415. Além disso, outros agentes pesticidas podem incluir agentes que direcionam as pragas que não se sobrepõem com as pragas alvos por TIC1415 proteínas. Em qualquer um dos casos, pretende-se que as proteínas de TIC1415 são usadas sozinhas ou combinadas com outros agentes pesticidas. Nos exemplos descritos abaixo, TIC1415 foi coexpressa com uma proteína de toxina TIC807 em plantas de algodão e bioensaios in planta foram realizados. Além das proteínas de toxinas TIC807, outros agentes pesticidas que podem ser usados em combinação com proteínas TIC1415 incluem (1) agentes centrados de hemípteros, por exemplo, dsRNA direcionados para ortólogos hemípteros de Nilaparvata lugens V-ATPase-E, 21E01 (Li, Jie et al., 2011, Pest Manag Sci.); dsRNA direcionadas para ortólogos hemípteros de cinco genes diferentes - ortólogo de actina, ADP/ATP translocase, α-tubulina, proteína ribossomal L9 (RPL9) e uma subunidade V -ATPase A (Upadhyay, SK, et al., 2011, J. Biosci 36(1), p.153-161.); AXMI-171 (US20100298207A1); endotoxinas Bt, como Cry3A, Cry4Aa, Cry11Aa, e CytlAa, que foram encontrados como exibindo toxicidade de baixa a moderada no pulgão da ervilha, Acyrthosiphon pisum, tanto em termos de mortalidade quanto de taxa de crescimento (Porcar, M. et al., Applied and Environmental Microbiology, julho de 2009, p.4897 -4900, Vol. 75, N.° 14);. (2) outros agentes pesticidas de coleópteros, por exemplo, toxinas DIG11 e DIG5; Cry7; eCry3.1 Ab; mCry3A; Cry8; Cry34/Cry35; e Cry3 em geral; e (3) outros agentes pesticidas dos Lepidópteros, por exemplo, DIG2; toxinas Cry1; Cry1A.105; toxinas Cry2, particularmente, toxinas Cry2A; toxinas Cry1F; toxinas VIP3 e toxinas Cry9. Eventos de colheitas transgênicas que expressam outros agentes pesticidas podem também ser usados em combinação com os eventos de colheitas que expressam proteínas TIC1415, exemplos dos quais incluem MON88017, MON89034, MON863, MON15985, MON531, MON757, COT102, TC1507, DAS59122-7, 3006-210-23, 281-24-236, T304-40, GHB119, COT67B, MIR162; evento de milho 5307 e semelhantes. Tais combinações com eventos que expressam uma ou mais proteínas das proteínas do gênero TIC1415 fornecem uma proteção mais durável das pragas, fornecem uma estratégia de gestão da resistência para o controle de pragas alvos, e reduzem as entradas de agricultores, poupando despesas consideráveis em tempo e valor monetário.

[000194] As plantas recombinantes são geradas a partir de células de plantas transformadas do presente exemplo, e as plantas recombinantes, ou sua progênie são avaliadas quanto à resistência à infestação das pragas, tais como tolerância a Hemiptera e/ou Lepidoptera. As plantas e sementes transgênicas que fornecem resistência a pragas, como Hemíptero e Lepidóptero, são selecionadas, e essas plantas e sementes são avançadas para o desenvolvimento adicional.

Exemplo 14: Bioensaio in planta de TIC1415

[000195] No presente estudo, a proteína da toxina TIC1415 tendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4 foi produzida em plantas de segmentos de polinucleotídeos com a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 27. DNA tendo a sequência de SEQ ID NO: 27, que codifica TIC1415 foi clonado num vetor de transformação de plantas mediado por Agrobacterium, juntamente com o promotor necessário e os elementos de regulação para a transformação e expressão em células de algodão. As plantas de algodão transgênicas (plantas de algodão recombinantes) foram produzidas e testadas quanto à eficácia. As plantas transgênicas regeneradas (R0) foram transferidas para o solo e amostras de tecido selecionadas a partir de eventos de transformação que estavam em baixo número de cópias e expressando a proteína TIC1415. Amostras de tecido liofilizadas de plantas R0 a partir de três eventos foram pesadas e combinadas 1:50 e 1:100 (peso:tampão) de carb/bicarb de sódio 25 mM tamponado a pH 10,5 para extrair a proteína solúvel a partir do tecido. As amostras foram confirmadas por Western blot quanto à presença de proteína TIC1415. Os extratos de amostras foram alimentados para Lygus lineolaris usando o ensaio de bioatividade descrito no Exemplo 8. O extrato de tecido de algodão DP393 ausente da proteína TIC1415 também foi preparado como controle negativo. Os extratos de amostras de todos os três eventos exibiram mortalidade contra Lygus lineolaris e os sobreviventes foram atrofiados. As pontuações de mortalidade e atrofismo foram significativas em relação às pontuações de bioatividade de insetos alimentados com extratos de amostras do controle negativo DP393.

[000196] As plantas R0 foram crescidas e autopolinizadas para obter sementes homozigotas para o DNA transgênico introduzido. Plantas homozigóticas de três diferentes eventos de cópia única foram selecionadas e cinco sementes por evento plantadas e avaliadas em um ensaio de aprisionamento de planta inteira. As plantas foram crescidas para o estágio de floração e cada planta de algodão inteira foi aprisionada em uma gaiola de malha feita a partir de plástico perfurado. Dois pares de Lygus hesperus machos e fêmeas adultos foram colocados em cada gaiola e deixados reproduzir. As progênies de inseto resultantes foram deixadas infestar nas plantas de algodão aprisionadas por 3 semanas. No final do período de 21 dias, os insetos Lygus em vários estágios de desenvolvimento foram contados e meios médios calculados em uma base por planta. As plantas de todos os três eventos tinham significativamente menos insetos em comparação com o controle negativo DP393. Ver Tabela 4.Tabela 4. Bioensaio em planta de TIC1415

[000197] Média da 2° geração de Lygus recuperada a partir de cinco plantas de algodão por evento em um Ensaio de Planta Inteira Aprisionada. Eventos com a mesma letra não têm números de Lygus de 2° geração estatisticamente diferentes (p < 0,05, t de Student).

Exemplo 15: Bioensaio de proteínas de proteína tóxica de Hemíptero TIC1415 e TIC807

[000198] As amostras de proteínas foram preparadas contendo várias misturas de proteína tóxica de Hemíptero TIC1415 e TIC807 e testadas em bioensaios. A proteína TIC1415 sozinha e a proteína TIC807 sozinha foram também preparadas como controles positivos. Tampão foi usado como controle negativo. Amostras de misturas foram alimentadas a Lygus lineolaris usando o ensaio de bioatividade. Todas as três preparações contendo proteína de toxina exibiu mortalidade contra Lygus lineolaris e os sobreviventes foram atrofiados. As pontuações de mortalidade e atrofismo foram significativas em relação às pontuações de bioatividade de insetos alimentados com tampão (ver Tabela 5). Os dados sugerem que não existem efeitos antagonísticos. Os testes de bioensaios adicionais são realizados em misturas para demonstrar os efeitos sinergéticos e/ou aditivos. Tabela 5. Dados de bioensaio para mistura de proteína: TIC1415 combinada com uma proteína de toxina TIC807

t Média (média) de 5 populações de 8 ninfas por população í Pontuações de atrofismo correspondem às classificações de massa visuais onde 0 = nenhuma diferença para o controle negativo, 1 = cerca de 25% menos de massa, 2 = cerca de 50% menos de massa, e 3 = cerca de 75% menos de massa. A média das pontuações de atrofismo para cada população de oito ninfas é relatada.* No intervalo de confiança de 95%.

Exemplo 16: Bioensaio em planta de TIC1415 e TIC807

[000199] Eventos de algodão transgênicos foram desenhados para coexpressar proteínas respectivas TIC1415 (SEQ ID NO: 4) e uma proteína TIC807. Tais plantas foram avaliadas em um ensaio de planta inteira aprisionada infestada com Lygus lineolaris. Cinco plantas de cada dez eventos foram confinadas e infestadas com 2 pares de L. lineolaris macho e fêmea por planta. O ensaio foi incubado em uma câmara de crescimento, sob condições ambientes normais para o desenvolvimento de plantas de algodão, durante 21 dias. As plantas de controle negativo DP393 foram cultivadas de forma semelhante. No final do período de três semanas, Lygus de vários estágios de desenvolvimento foram contados. O número médio por plantas de insetos Lygus hesperus em cada estágio de desenvolvimento foi calculado e os resultados são mostrados na Tabela 6. Aí, diferentes promotores expressáveis em plantas foram usados para dirigir a expressão do transcrito codificando TIC1415 nos respectivos construtos 12 e 13. Tabela 6. Dados em planta para mistura de proteínas: TIC1415 combinada com uma toxina de proteína TIC807

Média da 2° geração de Lygus recuperada a partir de cinco plantas de algodão por evento em um Ensaio de Planta Inteira Aprisionada. Eventos com a mesma letra não têm números de Lygus de 2° geração estatisticamente diferentes (p < 0,05, t de Student).

Claims (9)

1. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um segmento polinucleotídico como estabelecida em SEQ ID NO: 27 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácidos.

2. Molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico: (a) consiste em uma sequência que funciona para expressar a proteína pesticida em uma planta; ou (b) é expresso em uma célula vegetal para produzir uma quantidade inibidora de inseto da proteína pesticida.

3. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína pesticida exibe atividade inibidora de insetos contra uma espécie de praga de Hemíptero ou uma espécie de praga de Lepidóptero.

4. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as referidas espécies de lepidópteros são selecionadas do grupo que consiste em H. zea, O. nubilalis, D. saccharalis, D. grandiosella, A. gemmatalis, S. frugiperda, S. exigua, A. ipsilon, T. ni, P. includens, H. virescens, P. xylostella, P. gossypiella, H. armigera, E. lignosellus, and P. citrella, e as referidas espécies de Hemíptero são selecionadas do grupo que consiste em L. hesperus, L. lineolaris, A. hilare, E. servus, N. viridula, M. persicae, A. glycines, e A. gossypii.

5. Composição inibidora de inseto, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1.

6. Composição inibidora de inseto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um agente pesticida, em que o referido agente pesticida é diferente da referida proteína pesticida, em que o referido agente pesticida é selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína inibidora de inseto, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto e uma proteína auxiliar.

7. Composição inibidora de insetos, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o referido agente pesticida exibe atividade inibidora de insetos contra as mesmas espécies de hemípteros ou espécies de lepidópteros, e em que o referido agente pesticida é selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína TIC807, uma proteína TIC853, uma proteína Cry51Aa1 e uma proteína AXMI-171.

8. Método de controle de uma espécie de praga de lepidóptero ou hemíptero, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da referida praga com uma quantidade inibidora de inseto da proteína pesticida como definida na reivindicação 1.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida praga de espécies de lepidóptero ou hemíptero está em um campo de cultivo.

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