BR112015021651B1

BR112015021651B1 - Molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira de bactéria, polipeptídeo recombinante, composição e métodos para aplicação dos mesmos

Info

Publication number: BR112015021651B1
Application number: BR112015021651-0A
Authority: BR
Inventors: Cheryl Peters; Rebecca Thayer; Kira Roberts; Kimberly Sampson; Duane Lehtinen; Leonardo Magalhaes; Ethan Dunn
Original assignee: Bayer Cropscience Lp; Athenix Corp.
Priority date: 2013-03-07
Filing date: 2014-03-06
Publication date: 2021-12-28
Also published as: JP2020058357A; DK2964767T3; MX2019013438A; CA2902464C; WO2014138339A3; RU2723717C2; RU2020105862A; UA122046C2; AU2020204036A1; EP3626828A3; AU2014225732B2; CA2902464A1; EP3626828A2; AU2014225732A1; WO2014138339A2; BR112015021651A2; MX369500B; RU2015142582A; CN105247054A; US10221429B2

Abstract

genes de toxina e métodos para o uso dos mesmos a presente invenção se refere a composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. as composições que compreendem uma sequência codificante para um polipeptídeo de toxina são fornecidas. as sequências codificantes podem ser usadas em constructos de dna ou cassetes de expressão para transformação e expressão em plantas e bactérias. as composições também compreendem bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes transformados. em particular, moléculas de ácido nucleico de toxina isoladas são fornecidas. adicionalmente, sequências de aminoácidos correspondentes aos polinucleotídeos são englobadas e anticorpos especificamente aglutinados àquelas sequências de aminoácidos. em particular, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico isoladas que compreendem a sequências de nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácidos mostrada em seq id no: 21 a 74 ou a sequência de nucleotídeos estabelecida em seq id no: 1 a 20, assim como variações e fragmentos das mesmas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de PatenteProvisório no U.S. 61/774.110 depositado em 7 de março de 2013 e Pedidos de Patente Provisórios nos U.S. 61/774.627; 61/774.629; 61/774.635; 61/774.638; 61/774.642; 61/774.645; 61/774.647; 61/774.650; 61/774.655 e 61/774.659, cada um dos quais foi depositado em 8 de março de 2013 e cujos conteúdos são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA ENVIADA ELETRONICAMENTE

[0002] A cópia oficial da listagem de sequência é enviadaeletronicamente através de da EFS-Web como uma listagem de sequência formatada em ASCII com um arquivo nomeado "APA13- 6008US01_SEQLIST.txt" criado em 5 de março de 2014 e que tem um tamanho de 411 quilobytes e está depositado juntamente com o relatório descritivo. A listagem de sequência contida nesse documento formatado em ASCII é parte do relatório descritivo e é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] Essa invenção refere-se ao campo da biologiamolecular. São fornecidos genes inovadores que codificam proteínas pesticidas. Essas proteínas e as sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas são úteis no preparo de formulações pesticidas e na produção de plantas transgênicas resistentes a pragas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Bacillus thuringiensis é uma bactéria do solo formadorade esporos gram-positiva caracterizada por sua habilidade de produzir inclusões cristalinas que são especificamente tóxicas para certas ordens e espécies de inseto, mas são inócuas para plantas e outros organismos não alvos. Por esse motivo, composições que incluem cepas do Bacillus thuringiensis ou suas proteínas inseticidas podem ser usadas como inseticidas aceitáveis ecologicamente para controlar pragas de insetos da agricultura ou vetores de inseto para uma variedade de doenças humanas e animais.

[0005] Proteínas (delta-endotoxinas) cristal (cry) de Bacillusthuringiensis têm atividade inseticida potente predominantemente contra larvas de Lepidóptero, Hemíptero, Díptero e Coleóptero. Essas proteínas têm também mostrado atividade contra ordens de praga de Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga e Acari, assim como outras ordens de invertebrados tais como Nemathelminthes, Platyhelminthes e Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. Em Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., EUA), essas proteínas foram originalmente classificadas como CryI a CryV com base primeiramente na atividade pesticida das mesmas. As principais classes foram Lepidoptera específica (I), Lepidoptera e Díptera específica (II), Coleoptera específica (III), Díptera específica (IV) e Nematoda específica (V) e (VI). As proteínas foram ainda classificadas em subfamílias; proteínas mais amplamente relacionadas dentro de cada família foram designadas com letras divisionais tais como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. Proteínas com relação ainda mais próxima dentro de cada divisão foram nomeadas como Cry1C1, Cry1C2, etc.

[0006] Uma nomenclatura foi descrita para os genes Cry combase na homologia de sequência de aminoácidos em vez de especificidade de alvo de inseto (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807 a 813). Nessa classificação, a cada toxina é atribuído um nome exclusivo que incorpora uma graduação primária (um algarismo arábico), uma graduação secundária (uma letra em caixa alta), uma graduação terciária (uma letra em caixa baixa) e uma graduação quaternária (outro algarismo arábico). Numerais romanos foram trocados por algarismos arábicos na graduação primária. Proteínas com menos do que 45% da identidade de sequência têm diferentes graduações primárias e os critérios para as graduações secundária e terciária são 78% e 95%, respectivamente.

[0007] A proteína cristal não exibe atividade inseticida até queseja ingerida e solubilizada no intestino intermediário do inseto. A protoxina ingerida é hidrolisada por proteases no trato digestivo do inseto para uma molécula tóxica ativa. (Hofte e Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242 a 255). Essa toxina se liga a receptores da borda escovada apical no intestino intermediário das larvas alvo e se insere na membrana apical para criar poros ou canais de íon, resultando na morte larval.

[0008] Delta-endotoxinas geralmente têm cinco domínios desequência conservados e três domínios estruturais conservados (consultar, por exemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17: 193 a 199) O primeiro domínio estrutural conservado consiste em sete hélices-alfa e é envolvido em inserção de membrana e formação de poro. O domínio II consiste em três lâminas-beta dispostas em uma configuração de chave grega e o domínio III consiste em duas lâminas-beta antiparalelas em formação do tipo "jelly-roll" (de Maagd et al., 2001, supra). Os domínios II e III são envolvidos emreconhecimento e ligação de receptor e são, portanto, considerados determinantes de especificidade de toxina.

[0009] Além das delta-endotoxinas, há diversas outras classesconhecidas de toxinas de proteína pesticida. As toxinas VIP1/VIP2 (consultar, por exemplo, o Documento de Patente no U.S. 5.770.696) são toxinas pesticidas binárias que exibem forte atividade em insetos por um mecanismo que se acredita envolver endocitose mediada por receptor seguida de toxificação celular, similar ao modo de ação de outras toxinas ("A/B") binárias. As toxinas A/B tais como VIP, C2, CDT, CST ou as toxinas letais e de edema de B. anthracis inicialmente interagem com células-alvo através de uma ligação específica mediada por receptor de componentes "B" como monômeros. Esses monômeros depois formam homoheptâmeros. O complexo de receptor de metâmero "B" então age como uma plataforma de encaixe que subsequentemente liga e permite a translocação de um componente(s) "A" enzimático para o citosol através de endocitose mediada por receptor. Uma vez dentro do citosol celular, componentes "A" inibem a função celular normal por, por exemplo, ribosilação ADP de actina G ou ao aumentar níveis intracelulares de AMP cíclico (cAMP). Consultar, Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373 a 402.

[0010] O uso intensivo de inseticidas com base em B.thuringiensis já aumentou a resistência em populações do campo das traças das crucíferas, Plutella xylostella (Ferre e Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501 a 533). O mecanismo mais comum de resistência é a redução da ligação da toxina ao(s) seu(s) receptor(es) de intestino intermediário específicos. Isso pode conferir também resistência cruzada a outras toxinas que compartilham o mesmo receptor (Ferre e Van Rie (2002)).

[0011] Por causa da devastação que insetos podem causar edo aprimoramento no rendimento pelo controle de pragas de insetos, há uma necessidade contínua de descobrir novas formas de toxinas pesticidas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] São fornecidos composições e métodos para conferiratividade pesticida a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. Composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam sequências para polipeptídeos pesticidas e inseticidas, vetores que compreendem aquelas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreende os vetores. Composições incluem também as sequências de polipeptídeos pesticidas e anticorpos para aqueles polipeptídeos. As sequências de nucleotídeos podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, o que inclui micro-organismos e plantas. O nucleotídeo ou sequências de aminoácidos podem ser sequências sintéticas que foram projetadas para expressão em um organismo o que inclui, sem se limitar aos mesmos, um micro-organismo ou uma planta. Composições compreendem também bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes que compreendem a sequência de nucleotídeos da invenção.

[0013] Em particular, moléculas de ácido nucleicorecombinantes ou isoladas são fornecidas que codificam uma proteína pesticida. Adicionalmente, sequências de aminoácidos correspondentes à proteína pesticida são englobadas. Em particular, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico recombinante ou isolada que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 21 a 74 ou uma sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO: 1 a 20, assim como variantes e fragmentos biologicamente ativos da mesma. Sequências de nucleotídeos que são complementares a uma sequência de nucleotídeos da invenção ou que hibridizam a uma sequência da invenção ou um complemento da mesma são também englobados. São adicionalmente fornecidos vetores, células hospedeiras, plantas e sementes que compreendem as sequências de nucleotídeos da invenção ou sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos da invenção, assim como variantes e fragmentos biologicamente ativos da mesma.

[0014] Métodos são fornecidos para produzir os polipeptídeosda invenção e para usar aqueles polipeptídeos para controlar ou matar uma praga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, nemátodos ou dípteros. Métodos e kits para detectar os ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção em uma amostra também estão incluídos.

[0015] As composições e métodos da invenção são úteis paraa produção de organismos com tolerância ou resistência à praga aprimorada. Esses organismos e composições que compreendem os organismos são desejáveis para propósitos agrícolas. As composições da invenção são úteis também para gerar proteínas alteradas ou aprimoradas que têm atividade pesticida ou para detectar a presença de proteínas pesticidas ou ácidos nucleicos em produtos ou organismos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0016] A presente invenção se refere a composições emétodos para regular tolerância ou resistência à praga em organismos, particularmente plantas ou células vegetais. Por "resistência" entende-se que a praga (por exemplo, inseto) é morta na ingestão ou outro contato com os polipeptídeos da invenção. Por "tolerância" entende-se um enfraquecimento ou redução no movimento, alimentação, reprodução ou outras funções da praga. Os métodos envolvem formar organismos com uma sequência de nucleotídeos que codificam uma proteína pesticida da invenção. Em particular, as sequências de nucleotídeos da invenção são usadas para preparar plantas e micro-organismos que possuem atividade pesticida. Portanto, bactérias, plantas, células vegetais, tecidos vegetais e sementes transformadas são fornecidos. Composições são ácidos nucleicos pesticidas e proteínas de Bacillus ou outras espécies. As sequências podem ser utilizadas na construção de vetores de expressão para subsequente transformação em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos) e para a geração de proteínas pesticidas alteradas por métodos conhecidos na técnica, tais como troca de domínio ou embaralhamento de DNA, por exemplo, com membros das famílias de endotoxinas Cry1, Cry2 e Cry9. As proteínas podem ser utilizadas para controlar ou matar populações de pragas de lepidópteros, aminoácidos hemípteros, coleópteros, dípteros e nemátodos e para produzir composições com atividade pesticida.

[0017] Por "toxina pesticida" ou "proteína pesticida" entende-seuma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, o que inclui, sem se limitar aos mesmos, membros das ordens de Lepidoptera, Díptera e Coleoptera ou o filo Nematoda ou uma proteína que tem homologia a tal proteína. Proteínas pesticidas foram isoladas dos organismos o que inclui, por exemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popilliae. Proteínas pesticidas incluem sequências de aminoácidos deduzidas das sequências de nucleotídeos completas reveladas no presente documento e sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências completas, tanto devido ao uso de um local de partida a jusante alternativo ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta que tem atividade pesticida. O processamento pode ocorrer no organismo no qual a proteína é expressa ou na praga após a ingestão da proteína.

[0018] Proteínas pesticidas englobam delta-endotoxinas.Delta-endotoxinas incluem proteínas identificadas como cry1 até cry72, cyt1 e cyt2 e toxinas do tipo Cyt. Há atualmente mais de 250 espécies conhecidas de delta-endotoxinas com uma ampla gama de especificidades e toxicidades. Para uma lista expansiva, consultar Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807 a 813 e para atualizações regulares, consultar Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature", emwww.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/ index.

[0019] Portanto, são fornecidas no presente documentosequências de nucleotídeos recombinantes ou isoladas inovadoras que apresentam atividade pesticida. Essas sequências de nucleotídeos codificam polipeptídeos com homologia para delta-endotoxinas ou toxinas binárias conhecidas. Também são fornecidas as sequências de aminoácidos das proteínas pesticidas. A proteína que resulta da translação desse gene permite que células controlem ou matem pragas que ingerem a mesma.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO E VARIAÇÕES E FRAGMENTOS DAS MESMAS

[0020] Um aspecto da invenção está relacionado a moléculas de ácido nucleico recombinantes ou isoladas que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam proteínas pesticidas e polipeptídeos ou porções biologicamente ativas dos mesmos, assim como moléculas de ácido nucleico suficientes para o uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas com regiões de homologia de sequência. Estão englobadas também no presente documento sequências de nucleotídeos que têm capacidade de hibridização das sequências de nucleotídeos da invenção sob condições rigorosas conforme definido em outra parte do presente documento. Conforme usado no presente documento, o termo "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mPvNA) e análogos do DNA ou RNA gerados pelo uso de análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucleico pode ser de filamento único ou de filamento duplo, mas preferencialmente é DNA de filamento duplo. O termo "recombinante" engloba polinucleotídeos ou polipeptídeos que foram manipulados com relação ao polinucleotídeo ou polipeptídeo nativo, de modo que o polinucleotídeo ou polipeptídeo difere (por exemplo, em estrutura ou composição química) do que está ocorrendo na natureza. Em outra modalidade, um polinucleotídeo "recombinante" é livre de sequências internas (isto é, íntrons) que ocorrem naturalmente no DNA genômico do organismo do qual o polinucleotídeo é derivado. Um exemplo típico de tal polinucleotídeo é chamado de DNA complementar (cDNA).

[0021] Um ácido nucleico recombinante ou isolado (ou DNA) éusado no presente documento para se referir a um ácido nucleico (ou DNA) que não está mais no ambiente natural do mesmo, por exemplo, em um in vitro ou em uma célula hospedeira bacteriana ou vegetal recombinante. Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante ou isolado é livre de sequências (preferencialmente sequências codificadoras de proteína) que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado. Para os propósitos da invenção, "isolada" quando usado para se referir a moléculas de ácido nucleico exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias modalidades, a delta-endotoxina isolada que codifica molécula de ácido nucleico pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeos que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula da qual o ácido nucleico é derivado. Em várias modalidades, uma proteína delta-endotoxina que é substancialmente isenta de material celular inclui preparações de proteína que tem menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (por peso seco) de proteína não delta-endotoxina (também chamada no presente documento de uma "proteína de contaminação").

[0022] Sequências de nucleotídeos que codificam as proteínasda presente invenção incluem a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 1 a 20 e variações, fragmentos e complementos da mesma. Por "complemento" entende-se uma sequência de nucleotídeos que é suficientemente complementar a uma dada sequência de nucleotídeos de modo que a mesma possa hibridizar à dada sequência de nucleotídeos para, assim, formar um dúplex estável. As sequências de aminoácidos correspondentes para as proteínas pesticidas codificadas por essas sequências de nucleotídeos são estabelecidas em SEQ ID NO: 21 a 74.

[0023] As moléculas de ácido nucleico que são fragmentosdessas sequências de nucleotídeos que codificam proteínas pesticidas também são englobadas pela presente invenção. Por "fragmento" entende-se uma porção da sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida. Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos pode englobar uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador PCR que usa métodos revelados abaixo. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida compreendem pelo menos cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.350, 1.400 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos completa que codifica uma proteína pesticida revelada no presente documento, dependendo do uso pretendido. Por nucleotídeos "contíguos" entende-se resíduos de nucleotídeo que são imediatamente adjacentes um ao outro. Fragmentos das sequências de nucleotídeos da presente invenção irão codificar fragmentos de proteína que retém a atividade biológica da proteína pesticida e, portanto, retém atividade pesticida. Assim, fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos revelados no presente documento também são englobados. Por "retém atividade" entende-se que o fragmento terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade pesticida da proteína pesticida. Em uma modalidade, a atividade pesticida é atividade coleoptericida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é atividade lepidoptericida. Em outramodalidade, a atividade pesticida é atividade nematodocida. Em outramodalidade, a atividade pesticida é atividade dipterocida. Em outra modalidade, a atividade pesticida é hemiptericida. Métodos para medir a atividade pesticida são bastante conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2.480 a 2.485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252: 199 a 206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293 e Documento de Patente no U.S. 5.743.477, todos os quais estão aqui incorporados, por referência, em sua totalidade.

[0024] Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos quecodifica uma proteína pesticida que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção irão codificar pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.050, 1.100, 1.150, 1.200 aminoácidoscontíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína pesticida completa da invenção. Em algumas modalidades, o fragmento é um fragmento de clivagem proteolítica. Por exemplo, o fragmento de clivagem proteolítica pode ter um truncamento de terminação N ou terminação C de pelo menos cerca de 100 aminoácidos, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150 ou cerca de 160 aminoácidos relativos à SEQ ID NO: 21a 74. Em algumas modalidades, os fragmentos englobados no presente documento resultam da remoção do domínio de cristalização de terminação C, por exemplo, por proteólise ou por inserção de um códon de parada na sequência codificante. Consultar, por exemplo, as sequências de aminoácidos truncadas estabelecidas em SEQ ID NO: 25, 26, 39 a 45, 49 a 51, 58, 63 a 64, 66, 68 e 72 a 74. Será compreendido que o local de truncamento pode variar por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos em qualquer um dos lados do local de truncamento representado pelas terminações de SEQ ID NO: 25, 26, 39 a 45, 49 a 51, 58, 63 a 64, 66, 68 ou 72 a 74 (comparadas à sequência completa correspondente).

[0025] Proteínas pesticidas preferenciais da presente invençãosão codificadas por uma sequência de nucleotídeos suficientemente idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 a 20 ou as proteínas pesticidas são suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 21 a 74. Por "suficientemente idêntica" entende-se um aminoácido ou sequência de nucleotídeos que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência em comparação a uma sequência de referência que usa um dos programas de alinhamento descritos no presente documento que usam parâmetros padrão. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar identidade correspondente das proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos levando em consideração degeneração de códon, similaridade de aminoácido, posicionamento de quadro de leitura e similares.

[0026] Para determinar a identidade percentual das duassequências de aminoácidos ou dos dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para os propósitos de comparação ideal. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade percentual = número de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em outra modalidade, a identidade percentual é calculada ao longo de toda a sequência de referência (isto é, a sequência revelada no presente documento como qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 74). A identidade percentual entre duas sequências pode ser determinada pelo uso de técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem permitir vãos. Ao calcular a identidade percentual, combinações tipicamente exatas são contadas. Um vão, isto é, uma posição em um alinhamento onde um resíduo está presente em uma sequência, mas não na outra, é considerado como uma posição com resíduos não idênticos.

[0027] A determinação de identidade percentual entre duas sequências pode ser realizada pelo uso de um algoritmo matemático. Um exemplo não limitador de um algoritmo matemático utilizado para a comparação entre as duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2.264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5.873 a 5.877. Tal algoritmo é incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 Buscas por nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a moléculas de ácido nucleico do tipo pesticida da invenção. Buscas por proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a moléculas de proteína pesticida da invenção. Para obter alinhamentos com vãos para propósitos de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma busca iterativa que detecta relações distantes entre moléculas. Consultar, Barth et al. (1997), acima. Ao utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrões dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados. Alinhamento pode ser realizado também manualmente por inspeção.

[0028] Outro exemplo não limitador de um algoritmomatemático utilizado para a comparação entre sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4.673 a 4.680. ClustalW compara sequências e alinha toda a sequência de aminoácido ou DNA e, portanto, pode fornecer dados acerca da conservação de sequência da sequência de aminoácidos inteira. O algoritmo ClustalW é usado em diversos pacotes de software de análise de aminoácido/DNA comercialmente disponíveis, tais como o módulo ALIGNX do Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA). Após o alinhamento das sequências de aminoácidos com ClustalW, a identidade de aminoácido percentual pode ser avaliada. Um exemplo não limitante de um programa de software útil para análise de alinhamentos ClustalW é o GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite a avaliação de similaridade e de identidade de aminoácido (ou DNA) entre múltiplas proteínas. Outro exemplo não limitador de um algoritmo matemático utilizado para a comparação entre sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4: 11 a 17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que é parte do GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível junto à Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EUA). Ao utilizar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduos ponderada PAM120, uma penalidade por comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usados.

[0029] A menos que declarado de outra forma, GAP Versão10, que usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443 a 453, será usado para determinar identidade de sequência ou similaridade pelo uso dos seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos que usa Peso de GAP de 50 e Comprimento de Palavra de 3 e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos que usa Peso de GAP de 8 e peso de comprimento de 2 e o programa de pontuação BLOSUM62. Programas equivalentes podem também ser usados. Por "programa equivalente" entende-se qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem combinações de resíduo de nucleotídeo idênticas e uma identidade de sequência percentual idêntica quando comparada ao alinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10.

[0030] A invenção engloba também moléculas de ácidonucleico variantes. "Variantes" da proteína pesticida que codificam sequências de nucleotídeos incluem aquelas sequências que codificam as proteínas pesticidas reveladas no presente documento, mas que diferem de modo conservativo por causa da degeneração do código genético assim como aquelas que são suficientemente idênticas conforme discutido acima. Naturalmente, variantes alélicas que ocorram podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bastante conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização como indicado abaixo. Sequências de nucleotídeos variantes incluem também sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, pelo uso de mutagênese sítio-dirigida, mas que ainda codifica as proteínas pesticidas reveladas em na presente invenção conforme discutido abaixo. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, as mesmas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, atividade pesticida. Por "retém atividade" entende- se que a variante terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% da atividade pesticida da proteína nativa. Métodos para medir a atividade pesticida são bastante conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480 a 2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252: 199 a 206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293 e Documento de Patente no U.S. 5.743.477, todos os quais estão aqui incorporados, por referência, em sua totalidade.

[0031] A pessoa versada na técnica irá apreciar também quemudanças podem ser introduzidas por mutação das sequências de nucleotídeos da invenção, o que leva, desse modo, a mudanças na sequência de aminoácidos das proteínas pesticidas codificadas, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Assim, moléculas de ácido nucleico isoladas variantes podem ser criadas pela introdução de umas ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo, na sequência de nucleotídeos correspondente revelada no presente documento, de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de um ou mais aminoácido são introduzidas na proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tais como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de nucleotídeos variantes são também englobadas pela presente invenção.

[0032] Por exemplo, substituições de aminoácidoconservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos previstos e não essenciais. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado da sequência do tipo selvagem de uma proteína pesticida sem alterar a atividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido "essencial" é exigido para atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido que tem cadeia laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[0033] Delta-endotoxinas geralmente têm cinco domínios desequência conservados e três domínios estruturais conservados (consultar, por exemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17: 193 a 199) O primeiro domínio estrutural conservado consiste em sete hélices-alfa e é envolvido em inserção de membrana e formação de poro. Domínio II consiste em três lâminas-beta dispostas em uma configuração de chave grega e domínio III consiste em duas lâminas-beta antiparalelas em formação do tipo "jelly-roll" (de Maagd et al., 2001, supra). Domínios II e III são envolvidos em reconhecimento e ligação de receptor e são, portanto, considerados determinantes de especificidade de toxina.

[0034] Substituições de aminoácidos podem ser feitas emregiões não conservadas que retém função. Em geral, tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácido conservados ou para resíduos de aminoácido que residem em um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para atividade de proteína. Exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para atividade de proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas relacionadas ou similares às sequências da invenção (por exemplo, resíduos que são idênticos em um alinhamento de proteínas homólogas). Exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácido conservativas e ainda retém atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm somente substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas relacionadas ou similares às sequências da invenção (por exemplo, resíduos que têm somente substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento de proteínas homólogas). Contudo, uma pessoa versada na técnica entenderia que variantes funcionais podem ter pequenas alterações conservadas ou não nos resíduos conservados.

[0035] Alternativamente, as sequências de nucleotídeosvariantes podem ser feitas pela introdução de mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência codificante, tais como pela mutagênese de saturação e os mutantes que resultam podem ser examinados em relação à habilidade de apresentar atividade pesticida para identificar mutantes que retém atividade. Em seguida da mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de modo recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada pelo uso de técnicas de ensaio padrão.

[0036] Ao usar métodos tais como PCR, hibridização esimilares, sequências de pesticida correspondentes podem ser identificadas, tais sequências que tem substancial identidade com as sequências da invenção (por exemplo, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais identidade de sequência ao longo de toda a sequência de referência) e que tem ou apresenta atividade pesticida. Consultar, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY, EUA).

[0037] Em um método de hibridização, toda ou parte dasequência de nucleotídeos pesticida pode ser usada para examinar cDNA ou livrarias genômicas. Métodos para construir tal cDNA e livrarias genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, 2001, supracitado. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser rotulados com um grupo detectável tais como 32 P ou qualquer outro marcador detectável, tais como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator de enzima. Sondas para hibridização podem ser feitas pela rotulação de oligonucleotídeos sintéticos com base na proteína pesticida que codifica sequência de nucleotídeos conhecida que é revelada no presente documento. Iniciadores de degenerescência com base em nucleotídeos conservados ou resíduos de aminoácido na sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos codificada pode adicionalmente serem usados. A sonda compreende tipicamente uma região de sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições estringentes para pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos de sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína pesticida da invenção ou um fragmento ou variante dos mesmos. Métodos para o preparo de sondas para hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, 2001, supracitados e incorporados no presente documento por referência.

[0038] Por exemplo, uma sequência de pesticida inteirarevelada no presente documento, ou uma ou mais porções da mesma, pode ser usada como uma sonda que tem capacidade de especificamente hibridizar às sequências do tipo proteína pesticida correspondentes e RNAsmensageiros. Para alcançar hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e sãopreferencialmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em comprimento, ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências de pesticida correspondentes de um organismo escolhido ou amostra por PCR. Essa técnica pode ser usado para isolar sequências codificantes adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de sequências codificantes em um organismo. Técnicas de hibridização incluem exame de hibridização de livrarias de DNA laminadas (tanto placas quanto colônias; consultar, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, EUA).

[0039] Assim, a presente invenção engloba sondas parahibridização, assim como sequências de nucleotídeos que têm capacidade de hibridização a todas ou uma porção de uma sequência de nucleotídeos da invenção (por exemplo, pelo menos cerca de 300 nucleotídeos, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, 1.000, 1.200, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500 ou até todo o comprimento de uma sequência de nucleotídeos revelada no presente documento). Hibridização de tais sequências pode ser realizada sob condições estringentes. Por "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringente" entende-se condições sobre as quais uma sonda irá hibridizar à sua sequência alvo até um grau detectável maior que o de outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). Condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Ao controlar a estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algumas incompatibilidades nas sequências de modo que graus mais baixos de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Em geral, uma sonda é menos do que cerca de 1.000 nucleotídeos em comprimento, preferencialmente menos do que 500 nucleotídeos em comprimento.

[0040] Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nasquais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M íon de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M Na em concentração iônica (ou outros sais) com pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes podem também ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores tais como formamida. Condições de baixa estringentes exemplificativas incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% formamida, 1 M NaCl, 1% SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37 °C e uma lavagem em IX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M citrato trissódico) de 50 a 55 °C. Condições de estringência moderadas exemplificativas incluem hibridização em 40 a 45% formamida, 1,0 M NaCl, 1% SDS a 37 °C e uma lavagem em 0,5X a IX SSC de 55 a 60 °C. Condições de estringência altas exemplificativas incluem hibridização em 50% formamida, 1 M NaCl, 1% SDS a 37 °C e uma lavagem em 0. IX SSC de 60 a 65 °C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreendem cerca de 0,1% a cerca de 1% SDS. A duração da hibridização é geralmente menos do que cerca de 24 horas, em geral cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[0041] Especificidade é tipicamente a função de pós-lavagensde hibridização, sendo que os fatores críticos são a força iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, o Tm pode ser aproximado da equação de Meinkoth a Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267 a 284. Tm= 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. O Tm é a temperatura (sobre força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza para uma sonda perfeitamente compatível. Tm é reduzida para cerca de 1 °C para cada 1% de incompatibilidade; portanto, condições de Tm, hibridização e/ou lavagem podem ser ajustadas para sequências da identidade desejada. Por exemplo, se sequências com 90% de identidade são desejadas, a Tm pode ser diminuída 10 °C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para estar cerca de 5 °C abaixo do ponto de fusão (Tm) para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. Contudo, condições estringentes severas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C abaixo do ponto de fusão (Tm); condições estringentes moderadas podem utilizas uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 °C abaixo do ponto de fusão (Tm); condições de estringência baixa podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C abaixo do ponto de fusão (Tm). Ao usar a equação, as composições de hibridização e lavagem e Tm desejada, aqueles com conhecimento comum irão entender que as variações na estringência de soluções de hibridização e/ou lavagem estão inerentemente descritas. Se o grau desejado de incompatibilidade resulta em uma Tm de menos do que 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais elevada possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte 1, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nova Iorque, EUA). Consultar Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, EUA).

PROTEÍNAS ISOLADAS E VARIANTES E FRAGMENTOS DA MESMA

[0042] Proteínas pesticidas também são englobadas napresente invenção. Por "proteína pesticida" entende-se uma proteína que tem a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 21 a 74. Fragmentos, porções biologicamente ativas e variantes da mesma também são fornecidos e podem ser usados para praticar os métodos da presente invenção. Uma "proteína recombinante" ou "polipeptídeo recombinante" é usado para se referir a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural e foi manipulada com relação à proteína nativa, de modo que a proteína recombinante ou polipeptídeo recombinante difere (por exemplo, em estrutura ou composição química) daquela que ocorre na natureza.

[0043] "Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas"incluem fragmentos de polipeptídeos que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 21 a 74 e que exibem atividade pesticida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida pode ser um polipeptídeo, isto é, por exemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.050, 1.100, 1.150, 1.200 ou mais aminoácidos em comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas de recombinação e avaliadas por atividade pesticida. Métodos para medir a atividade pesticida são bastante conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480 a 2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252: 199 a 206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293 e Documento de Patente no U.S. 5.743.477, todos os quais estão aqui incorporados, por referência, em sua totalidade. Conforme usado no presente documento, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 21 a 74. A invenção engloba outros fragmentos, contudo, tais como qualquer fragmento na proteína maior que cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.050, 1.100, 1.150, 1.200 ou mais aminoácidos em comprimento.

[0044] Por "variantes" entende-se proteínas ou polipeptídeosque têm uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 21 a 74. Variantes incluem também polipeptídeos codificados por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza à molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 20 ou um complemento da mesma, sobre condições estringentes. Variantes incluem polipeptídeos que diferem em sequência de aminoácidos devido a mutagêneses. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, as mesmas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, isto é, retém atividade pesticida. Em algumas modalidades, as variantes aprimoraram atividade em relação à proteína nativa. Métodos para medir a atividade pesticida são bastante conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480 a 2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252: 199 a 206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293 e Documento de Patente no U.S. 5.743.477, todos os quais estão aqui incorporados, por referência, em sua totalidade.

[0045] Genes bacterianos, tais como os genes axmi dessainvenção, muitas vezes possuem múltiplos códons de iniciação de metionina em proximidade ao início do quadro de leitura aberto. Frequentemente, a iniciação de translação em um ou mais desses códons iniciais irão levar à geração de uma proteína funcional. Esses códons iniciais podem incluir códons ATG. Contudo, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como um códon inicial e proteínas que iniciam a translação em códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Em raras ocasiões, a translação em sistemas bacterianos pode iniciar em um códon TTG, apesar de que nesse evento o códon TTG codifica uma metionina. Além disso, não é frequentemente determinado de maneira antecedente quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Assim, entende-se que o uso dos códons de metionina alternativos pode também levar à geração de proteínas pesticidas. Essas proteínas pesticidas são englobadas em uma presente invenção e podem ser usadas nos métodos da presente invenção. Será compreendido que quando expressas em plantas, será necessário alterara o códon inicial alternativo para ATG para translação apropriada.

[0046] Em várias modalidades da presente invenção, proteínaspesticidas incluem sequências de aminoácidos deduzidas das sequências de nucleotídeos completas reveladas no presente documento e sequências de aminoácidos que são mais curtas do que as sequências completas devido ao uso de um local de início a jusante alternativo. Assim, a sequência de nucleotídeos da invenção e/ou vetores, células hospedeiras e plantas que compreende a sequência de nucleotídeos da invenção (e métodos de fazer e usar a sequência de nucleotídeos da invenção) pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos correspondente às sequências de aminoácidos referenciadas na Tabela 1.

[0047] Anticorpos para os polipeptídeos da presente invençãoou para variantes ou fragmentos dos mesmos, são também englobados. Métodos para produzir anticorpos são bastante conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Documento de Patente no U.S. 4.196.265).

[0048] Assim, um aspecto da invenção se refere a anticorpos,moléculas de captura de antígenos de cadeia única ou outras proteínas que capturam especificamente uma ou mais moléculas de proteína ou peptídeo da invenção e outros homólogos, fusões ou fragmentos. Em uma modalidade particularmente preferencial, o anticorpo especificamente capta uma proteína que tem a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 21 a 74 ou um fragmento da mesma. Em outra modalidade, o anticorpo especificamente capta uma proteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 21 a 74 ou um fragmento da mesma.

[0049] Os anticorpos da invenção podem ser usados paradetectar quantitativamente ou qualitativamente as moléculas de proteína ou peptídeo da invenção ou para detectar modificações pós translação das proteínas. Conforme usado no presente documento, um anticorpo ou peptídeo é dito como se "captasse especificamente" uma molécula de proteína ou peptídeo da invenção se tal captação não é competitivamente inibida pela presença de moléculas não relacionadas.

[0050] Os anticorpos da invenção podem estar contidos em umkit útil para detecção das moléculas de proteína ou peptídeo da invenção. A invenção compreende adicionalmente um método para detectar a molécula de proteína ou peptídeo da invenção (particularmente uma proteína codificada pela sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 21 a 74, o que inclui variantes ou fragmentos da mesma que tem capacidade de especificamente captar o anticorpo da invenção) que compreende colocar em contato uma amostra com o anticorpo da invenção e determinar se amostra contém a molécula de proteína ou peptídeo da invenção. Métodos para utilizar anticorpos para a detecção de uma proteína ou peptídeo de interesse são conhecidos na técnica.

VARIANTES APRIMORADAS OU ALTERADAS

[0051] É reconhecido que sequências de DNA de uma proteínapesticida podem ser alteradas por vários métodos e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA que codificam proteínas com sequências de aminoácidos diferentes daquelas codificadas por uma proteína pesticida da presente invenção. Essa proteína pode ser alterada de várias maneiras o que inclui substituições, deleções, truncamentos e inserções de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 21 a 74, que incluem até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de100, cerca de 105, cerca de 110, cerca de 115, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 150, cerca de 155 ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido. Métodos para tais manipulações são conhecidos de modo geral na técnica. Por exemplo, variantes de sequência de aminoácido de uma proteína pesticida podem ser preparados por mutações no DNA. Isso podem também ser alcançado por uma das diversas formar de mutagênese e/ou em evolução dirigida. Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácidos não irão afetar substancialmente a função da proteína. Tais variantes possuirão a atividade pesticida desejada. Contudo, entende-se que a capacidade de uma proteína pesticida de apresentar atividade pesticida pode ser aprimorada pelo uso de tais técnicas nas composições dessa invenção. Por exemplo, pode ser expressa uma proteína pesticida em células hospedeiras que exibem altas taxas de incorporações errôneas de base durante replicação de DNA, tais como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA, EUA). Após a propagação em tais cepas, pode ser feito o isolamento do DNA (por exemplo ao preparar DNA plasmídeo ou ao amplificar por PCR e clonagem o fragmento de PCR resultante em um vetor), cultivo das mutações da proteína pesticida em uma cepa não mutagênica e a identificação de genes mutagênicos com atividade pesticida, por exemplo ao realizar um ensaio para testar a atividade pesticida. Em geral, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Consultar, por exemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 a 293. Tais ensaios podem incluir colocar plantas em contato com um ou mais pragas e determinar a capacidade da planta de sobreviver e/ou causar a morte das pragas. Exemplos de mutações que resultam em toxicidade aumentada são encontrados em Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775 a 806.

[0052] Alternativamente, alterações podem ser feitas nasequência de proteína de muitas proteínas de terminação carbóxi ou amino sem substancialmente afetar a atividade. Isso pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tais como PCR, o que inclui amplificações de PCR que alteram ou estendem a sequência codificante de proteína em virtude da inserção de aminoácido que codifica sequências nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação de PCR. Alternativamente, as sequências de proteínas adicionadas podem incluir sequências codificantes de proteínas inteiras, tais como aquelas usadas comumente na técnica para gerar fusões de proteína. Tais proteínas de fusão são frequentemente usadas para (1) aumentar expressão de uma proteína de interesse (2) introduzir um domínio de captação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar purificação de proteína, detecção de proteína ou outros usos experimentais na técnica (3) secreção ou translação alvo de uma proteína para uma organela subcelular, tais como o espaço periplásmico de bactérias gram-negativas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, o último frequentemente resulta em glicosilação da proteína.

[0053] Nucleotídeo variante e sequências de aminoácidos dapresente invenção também englobam sequências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos tais como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, um ou mais regiões de codificação de proteínas pesticidas diferentes podem ser usadas para criar uma nova proteína pesticida que possui as propriedades desejadas. Dessa maneira, livrarias de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequências relacionadas que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser relacionadas homologamente in vitro ou in vivo. Por exemplo, ao usar essa abordagem, motivos de sequência que codificam um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene pesticida da invenção e outros genes pesticidas conhecidos para obter um novo gene que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse aprimorada, tais como uma atividade inseticida aumentada. Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747 a 10751; Stemmer (1994) Nature 370:389 a 391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436 a 438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336 a 347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504 a 4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288 a 291 e Documento de Patente no U.S. 5.605.793 e 5.837.458.

[0054] Troca de domínio ou embaralhamento é outromecanismo para gerar proteínas pesticidas alteradas. Domínios podem ser trocados entre proteína pesticidas, o que resulta em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade pesticida ou espectro alvo aprimorados. Métodos para gerar proteínas recombinantes e testar as mesmas para atividade pesticida são bastante conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328 a 5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 1537 a 1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 17954 a 17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923 a 20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918 a 2925).

[0055] Em ainda outra modalidade, nucleotídeo variante e/ousequências de aminoácidos podem ser obtidas pelo uso de um ou mais de PCR propenso a erro, mutagênese dirigida a oligonucleotídeo, conjunto de PCR, mutagênese de PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de montagem recursiva, mutagênese de montagem exponencial, mutagênese específica de local, remontagem de gene, mutagênese de saturação de local de gene, mutagênese permutacional, remontagem de ligação sintética (SLR), recombinação, recombinação de sequência recursiva, mutagênese de DNA modificada com fosfotioato, mutagênese de modelo que contém uracila, mutagênese dúplex com lacuna, mutagênese de reparo de incompatibilidade de ponto, mutagênese de cepa de hospedeiro sem reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese de deleção, mutagênese de seleção restrita, mutagênese de purificação de restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de montagem, criação de multímero de ácido nucleico quimérico e similares.

VETORES

[0056] Uma sequência de pesticida da invenção pode serfornecida em um cassete de expressão para expressão em uma planta de interesse. Por "cassete de expressão de plante" entende-se um construto de DNA, isto é, que tem capacidade de resultar na expressão de uma proteína a partir de um quadro de leitura aberto em uma célula vegetal. Esses tipicamente contêm um promotor e uma sequência codificante. Frequentemente, tais construtos irão conter também uma região não traduzida 3'. Tais construtos podem conter uma "sequência de sinal" ou "sequência líder" para facilitar transporte cotraducional ou pós-traducional do peptídeo para certas estruturas intracelulares tais como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplásmico ou aparelho de Golgi.

[0057] Por "sequência de sinal" entende-se uma sequência,isto é, conhecido ou que se suspeita resultar em transporte de peptídeo cotraducional ou pós-traducional ao longo da membrana da célula. Em eucariotas, isso tipicamente envolve a secreção no aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Toxinas inseticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como protoxinas, que são protoliticamente ativadas no intestino da praga alvo (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507 a 516). Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência de sinal é localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência da invenção. Por "sequência líder" entende-se qualquer sequência que quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para acionar transporte cotraducional da cadeia de peptídeo para uma organela subcelular. Assim, isso inclui sequências líderes visando como alvo o transporte e/ou glicosilação por passagem para o retículo endoplásmico, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastoa, mitocôndria e similares.

[0058] Por "vetor de transformação de planta" entende-se uma molécula de DNA, isto é, necessária para transformação eficiente de uma célula vegetal. Tal molécula pode consistir em um ou mais cassetes de expressões de planta e pode ser organizada em mais de uma molécula de DNA "vetor". Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação de planta que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificar todas as funções de atuação cis e trans exigidas para a transformação de células vegetais (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446 a 451). "Vetor" se refere a um construto de ácido nucléico projetado para transferência entre diferentes células hospedeiras. "Vetor de expressão" se refere a um vetor que tem a capacidade de incorporar, integrar e expressar sequências de DNA heterólogas ou fragmentos em uma célula estranha. O cassete incluirá 5' e/ou 3' sequências regulatórias ligadas de modo operável a uma sequência da invenção. Por "operacionalmente ligada" entende-se uma ligada de maneira funcional entre um promotor e uma segunda sequência, sendo que a sequência promotora inicia e media transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Geralmente, ligada de modo operável significa que as sequências de ácidos nucleicos que são ligadas são contíguas e, onde é necessário juntar duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no mesmo quadro de leitura. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos é ligada de modo operável a um promotor heterólogo que tem capacidade de direcionar expressão da dita sequência de nucleotídeos em uma célula hospedeira, tais como uma célula hospedeira microbiana ou uma célula hospedeira de planta. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional para ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicionais podem ser fornecidos em múltiplos cassetes de expressões.

[0059] Em várias modalidades, a sequência de nucleotídeosda invenção é ligada de modo operável a um promotor, por exemplo, um promotor de planta. "Promotor" se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que funciona para direcionar a transcrição de uma sequência codificante a jusante. O promotor junto com as outras sequências de ácidos nucleicos regulatórias traducionais e transcricionais (também chamadas "sequências de controle") são necessários para a expressão de uma sequência de DNA de interesse.

[0060] Tal cassete de expressão é dotado de uma pluralidade de locais de restrição para inserção da sequência de pesticida a sofrer regulação transcricional das regiões reguladoras.

[0061] O cassete de expressão incluirá na direção detranscrição 5 '-3', uma região de iniciação transcricional e translacional (isto é, um promotor), uma sequência de DNA da invenção e uma região de terminação translacional e transcricional (isto é, região de terminação) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou estranho ou heterólogo ao hospedeiro da planta e/ou à sequência de DNA da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. Onde o promotor é "nativo" ou "homólogo" ao hospedeiro da planta, entende-se que o promotor é encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Onde o promotor é "estranho" ou "heterólogo" à sequência de DNA da invenção, pretende-se que o promotor não seja nativo ou ocorra naturalmente para a sequência de DNA ligada de maneira operacional da invenção.

[0062] A região de terminação pode ser nativa com a região deiniciação transcricional, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operável, pode ser nativa com o hospedeiro da planta ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, a sequência de DNA de interesse, o hospedeiro da planta ou qualquer combinação dos mesmos). Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consultar também Guerineau et al. (1991) J. Mol. Gen Genet. 262: 141 a 144; Proudfoot (1991) Cell 64:671 a 674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141 a 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1.261 a 1.272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151 a 158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7.891 a 7.903; and Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 9.627 a 9.639.

[0063] Conforme apropriado, o(s) gene(s) podem serotimizados para aumentar a expressão na célula hospedeira transformada. Isto é, os genes podem ser sintetizados pelo uso dos códons preferidos da célula hospedeira para expressão aprimorada ou podem ser sintetizados pelo uso de códons em uma frequência de uso de códon preferencial de hospedeiro. Em geral, o teor de GC do gene será aumentado. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1 a 11 para uma discussão sobre o uso de códon preferencial de hospedeiro. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferidos de planta. Consultar, por exemplo, Documento de Patente no U.S. 5.380.831 e 5.436.391, Documento de Patente no U.S. 20090137409 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477 a 498,incorporados ao presente documento a título de referência.

[0064] Em uma modalidade, a proteína pesticida é direcionadapara o cloroplasto para expressão. Dessa maneira, quando a proteína pesticida não é diretamente inserida no cloroplasto, o cassete de expressão irá adicionalmente conter um ácido nucleico que codifica um peptídeo de transição para direcionar a proteína pesticida para os cloroplastos. Tais peptídeos de transição são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104 a 126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17.544 a 17.550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965 a 968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1.414 a 1.421 e Shah et al. (1986) Science 233: 478 a 481.

[0065] O gene pesticida a ser direcionado para o cloroplastopode ser otimizado para a expressão no cloroplasto para considerar as diferenças no uso de códon entre o núcleo da planta e essa organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados pelo uso de códons preferenciais de cloroplasto. Consultar, por exemplo, Documento de Patente no U.S. 5.380.831 incorporado ao presente documento a título de referência.

TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA

[0066] Os métodos da invenção envolvem introduzir umconstruto de nucleotídeo em uma planta. Pela "introdução" pretende-se apresentar à planta o construto de nucleotídeo de modo que o construto ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não exigem que um método particular para introduzir um construto de nucleotídeo a uma planta seja usado, somente se o construto de nucleotídeo ganhar acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir construtos de nucleotídeo em plantas são conhecidos na técnica inclui, sem se limitar aos mesmos, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.

[0067] Por "planta" entende-se a planta inteira, órgãos deplanta (por exemplo, folhas, caule, raízes, etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e progênie da mesma. Células vegetais podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura de suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células floema, pólen).

[0068] "Plantas transgênicas" ou "plantas transformadas" ouplantas ou células ou tecidos "transformadas de modo estável" se referem a plantas que incorporaram ou integraram sequências de ácidos nucleicos exógenas ou fragmentos de DNA na célula vegetal. Essas sequências de ácidos nucleicos incluem aquelas que são exógenas, ou não presentes na célula vegetal não transformada, assim como aquelas que podem ser endógenas, ou presentes na célula vegetal não transformada. "Heterólogo" geralmente se refere às sequências de ácidos nucleicos que não são endógenas à célula ou parte do genoma nativo no qual as mesmas estão presentes e foram adicionadas à célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção ou similares.

[0069] As plantas transgênicas da invenção expressam umaou mais das novas sequências de toxina reveladas no presente documento. Em algumas modalidades, a proteína ou sequência de nucleotídeos da invenção é vantajosamente combinada nas plantas com outros genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades genômicas úteis a tais plantas. Dentre os genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades genômicas úteis nas plantas transformadas, pode ser feita menção às sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a um ou mais herbicidas e outras que conferem tolerância a certos insetos, aquelas que conferem tolerância a certas doenças, DNAs que codificam RNAs que fornecem controle de nemátodos ou inseto e similares. Tais genes são descritos em particular no Pedido de Patente PCT publicado no WO91/02071 e WO95/06128 e Patentes no U.S. 7.923.602 e Publicação de Pedido de Pedido no 20100166723, cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0070] Dentre as sequências de DNA que codificam proteínasque conferem tolerância a certos herbicidas nas células vegetais e plantas transformadas, pode ser feita menção a uma barra ou gene PAT ou ao gene Streptomyces coelicolor descrito no Documento de Patente WO2009/152359 que confere tolerância a herbicidas glufosinato, um gene que codifica um EPSPS adequado que confere tolerância a herbicidas que têm EPSPS como um alvo, tais como glifosato e os sais do mesmo (Documentos de Patente no U.S. 535.060, U.S. 4.769.061, U.S. 5.094.945, U.S. 4.940.835, U.S. 5.188.642, U.S. 4.971.908, U.S. 5.145.783, U.S. 5.310.667, U.S. 5.312.910, U.S. 5.627.061, U.S. 5.633.435) um gene que codifica glifosato-n-acetiltransferase (por exemplo, Documento de Patente no U.S. 8.222.489, U.S. 8.088.972, U.S. 8.044.261, U.S. 8.021.857, U.S. 8.008.547, U.S. 7.999.152, U.S. 7.998.703, U.S. 7.863.503, U.S. 7.714.188, U.S. 7.709.702, U.S. 7.666.644, U.S. 7.666.643, U.S. 7.531.339, U.S. 7.527.955 e U.S. 7.405.074) um gene que codifica glifosato oxidorredutase (por exemplo, Documento de Patente no U.S. 5.463.175) ou um gene que codifica uma proteína tolerante a inibidor de HPPD (por exemplo, os genes com tolerância ao inibidor de HPPD descritos no Documento de Patente no WO 2004/055191, WO 199638567, U.S. 6791014, WO2011/068567, WO2011/076345, WO2011/085221, WO2011/094205, WO2011/068567, WO2011/094199, WO2011/094205, WO2011/145015, WO2012056401 e PCT/US2013/59598).

[0071] Dentre as sequências de DNA que codificam umEPSPS adequado que confere tolerância aos herbicidas que têm EPSPS como um alvo, menção será feita mais particularmente ao gene que codifica um EPSPS de plante, em particular EPSPS de milho, particularmente um EPSPS de milho que compreende duas mutações, particularmente uma mutação na posição 102 do aminoácido e uma mutação na posição 106 do aminoácido (Documento de Patente WO2004/074443) e que é descrito no Pedido de Patente no U.S. 6566587, doravante no presente documento nomeado EPSPS de milho com mutação dupla ou 2mEPSPS, ou o gene que codifica um EPSPS isolado de Agrobacterium e que é descrito pela sequência ID No. 2 e sequência ID No. 3 do Documento de Patente no U.S. 5.633.435, também nomeado CP4.

[0072] Dentre as sequências de DNA que codificam umEPSPS adequado que conferem tolerância aos herbicidas que têm EPSPS como um alvo, menção será feita mais particularmente ao gene que codifica um EPSPS GRG23 de Arthrobacter globiformis, mas também os mutantes GRG23 ACE1, GRG23 ACE2, ou GRG23 ACE3, particularmente os mutantes ou variantes de GRG23 conforme descrito no Documento de Patente WO2008/100353, tais como GRG23(ace3)R173K de SEQ ID No. 29 no Documento de Patente WO2008/100353.

[0073] No caso das sequências de DNA que codificam EPSPS,e mais particularmente que codificam os genes acima, a sequência que codifica essas enzimas é vantajosamente precedida por uma sequência que codifica um peptídeo de transição, em particular o "peptídeo de transição otimizado" descrito no Documento de Patente no U.S. 5.510.471 ou 5.633.448.

[0074] Traços de tolerância a herbicida exemplificativos quepodem ser combinados com a sequência de ácidos nucleicos da invenção incluem adicionalmente pelo menos um inibidor de ALS (acetolactato sintase) (WO2007/024782); um gene Arabidopsis ALS/AHAS mutante (Documento de Patente no U.S. 6.855.533); genes que codificam 2,4-D-monooxigenases e conferem tolerância a 2,4-D (2,4-ácido diclorofenoxiacético) pela metabolização (Documento de Patente no U.S. 6.153.401) e genes que codificam Dicamba monooxigenases conferem tolerância a dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-ácido metoxibenzoico) pela metabolização (Documento de Patente no U.S. 2008/0119361 e U.S. 2008/0120739).

[0075] Em várias modalidades, o ácido nucleico da invençãofica preso com um ou mais genes tolerantes a herbicida, que incluem uma ou mais genes tolerantes a herbicida inibidores de HPPD e/ou um ou mais genes tolerantes a glifosato e/ou glufosinato.

[0076] Dentre as sequências de DNA que codificam proteínasrelacionadas com as propriedades de tolerância a insetos, menção será feita mais particularmente às proteínas Bt amplamente descritas na literatura e bastante conhecidas para aqueles versados na técnica. Menção será feita também a proteínas extraídas de bactérias tais como Photorhabdus (Documento de Patente W097/17432 & WO98/08932).

[0077] Dentre tais sequências de DNA que codificam proteínasde interesse que conferem novas propriedades de tolerância a insetos, menção será feita mais particularmente às proteínas Bt Cry ou VIP amplamente descritas na literatura e bastante conhecidas para aqueles versados na técnica. Isso inclui a proteína Cry1F ou híbridos derivados da proteína Cry1F (por exemplo, as proteínas Cry1A-Cry1F híbridas descritas no Documento de Patente no U.S. 6.326.169; U.S. 6.281.016; U.S. 6.218.188 ou fragmentos tóxicos das mesmas), as proteínas do tipo Cry1 A ou fragmentos tóxicos das mesmas, preferencialmente a proteína Cry1 Ac ou híbridos derivados da proteína Cry1 Ac (por exemplo, a proteína Cry1 Ab-Cry1 Ac híbrida descrita no documento no U.S. 5.880.275) ou a proteína Cry1Ab ou Bt2 ou fragmentos inseticidas da mesma descritos no documento no EP451878, as proteínas Cry2Ae, Cry2Af ou Cry2Ag conforme descrito no documento no WO2002/057664 ou fragmentos tóxicos da mesma, a proteína Cry1 A.105 descrita no documento no WO 2007/140256 (SEQ ID No. 7) ou um fragmento tóxico da mesma, a proteína VIP3Aal9 de NCBI número de acesso ABG20428, a proteína VIP3Aa20 de NCBI número de acesso ABG20429 (SEQ ID No. 2 no Documento de Patente WO 2007/142840), as proteínas VIP3A produzidas nos eventos de algodão COT202 ou COT203 (documentos no WO2005/054479 e WO2005/054480, respectivamente), as proteínas Cry conforme descritas no documento no WO2001/47952, a proteína VIP3Aa ou um fragmento tóxico da mesma conforme descrito em Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sci U S A. 28; 93(11): 5389 a 5394 e documento no U.S. 6.291.156, as proteínasinseticidas de Xenorhabdus (conforme descrito no documento no WO98/50427), Serratia (particularmente de S. entomophila) ou cepas da espécie Photorhabdus, tais como proteínas Tc de Photorhabdus conforme descrito no Documento de Patente WO98/08932 (por exemplo, Watercampo et al, 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017 a 24; Ffrench-Constant e Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828 a 33). Também quaisquer variantes ou mutantes de quaisquer dessas proteínas diferentes em alguns aminoácidos (1 a 10, preferencialmente 1 a 5) de quaisquer sequências acima, particularmente a sequência do fragmento tóxico da mesma, ou que foram fundidos a um peptídeo de transição, tais como um peptídeo de transição plastídeo, ou outra proteína ou peptídeo, é incluído no presente documento.

[0078] Em várias modalidades, o ácido nucleico da invençãopode ser combinado com plantas com um ou mais genes que conferem um traço desejável, tais como tolerância a herbicida, tolerância a inseto, tolerância seca, controle de nemátodos, eficiência no uso da água, eficiência de uso de nitrogênio, valor nutricional aprimorado, resistência a doenças, fotossíntese aprimorada, qualidade de fibra aprimorada, tolerância a tensão, reprodução aprimorada e similares.

[0079] Eventos transgênicos particularmente úteis que podemser combinados com os genes da presente invenção em plantas da mesma espécie (por exemplo, ao cruzar ou ao reformar uma planta que contém outro evento transgênico com um gene quimérico da invenção), incluem Evento 531/ PV-GHBK04 (algodão, controle de inseto, descrito no Documento de Patente WO2002/040677), Evento 1143-14A (algodão, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no WO2006/128569); Evento 1143-5 IB (algodão, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no WO2006/128570); Evento 1445 (algodão, tolerância a herbicida, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2002-120964 ou WO2002/034946Evento 17053 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como PTA-9843, descrito no documento no WO2010/117737); Evento 17314 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como PTA-9844, descrito no documento no WO2010/117735); Evento 281-24-236 (algodão, tolerância a herbicida - controle de inseto, depositado como PTA-6233, descrito no documento no WO2005/103266 ou U.S.-A 2005-216969); Evento 3006-210-23 (algodão, tolerância a herbicida - controle de inseto, depositado como PTA-6233, descrito no documento no U.S.-A 2007-143876 ou WO2005/103266); Evento 3272 (milho, traço de qualidade, depositado como PTA-9972, descrito no documento no WO2006/098952 ou U.S.-A 2006-230473); Evento 33391 (trigo, tolerância a herbicida, depositado como PTA-2347, descrito no documento no WO2002/027004), Evento 40416 (milho, tolerância a herbicida - controle de inseto, depositado como ATCC PTA-11508, descrito no documento no WO 11/075593); Evento 43A47 (milho, tolerância a herbicida - controle de inseto, depositado como ATCC PTA-11509, descrito no documento no WO2011/075595); Evento 5307 (milho, controle de inseto, depositado como ATCC PTA-9561, descrito no documento no WO2010/077816); Evento ASR- 368 (agrostis, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-4816, descrito no documento no U.S.-A 2006-162007 ou WO2004/053062); Evento B16 (milho, tolerância a herbicida, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2003-126634); Evento BPS-CV127-9 (soja, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB No. 41603, descrito no documento no WO2010/080829); Evento BLR1 (colza, restauração de esterilidade de macho, depositado como NCIMB 41193, descrito no documento no WO2005/074671), Evento CE43-67B (algodão, controle de inseto, depositado como DSM ACC2724, descrito no documento no U.S.-A 2009-217423 ouWO2006/128573); Evento CE44-69D (algodão, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2010-0024077); Evento CE44- 69D (algodão, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no WO2006/128571); Evento CE46-02A (algodão, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no WO2006/128572); Evento COT102 (algodão, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2006-130175 ou WO2004/039986); Evento COT202 (algodão, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2007-067868 ou WO2005/054479); Evento COT203 (algodão, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no WO2005/054480); Evento DAS21606-3 / 1606 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11028, descrito no documento no WO2012/033794), Evento DAS40278 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-10244, descrito no documento no WO2011/022469); Evento DAS-44406-6 / pDAB8264.44.06.1 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11336, descrito no documento noWO2012/075426), Evento DAS-14536-7 /pDAB8291.45.36.2 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11335, descrito no documento noWO2012/075429), Evento DAS-59122-7 (com, tolerância a herbicida - controle de inseto, depositado como ATCC PTA 11384, descrito no documento no U.S.A 2006-070139); Evento DAS-59132 (milho, tolerância a herbicida - controle de inseto, não depositado, descrito no documento no WO2009/100188); Evento DAS68416 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-10442, descrito no documento no WO201 1/066384 ou WO2011/066360); Evento DP- 098140-6 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-8296, descrito no documento no U.S.-A 2009-137395 ou WO 08/112019); Evento DP- 305423-1 (soja, traço de qualidade, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2008-312082 ou WO2008/054747); Evento DP-32138-1 (milho, sistema de hibridização, depositado como ATCC PTA-9158, descrito no documento no U.S.-A 2009-0210970 ou WO2009/103049); Evento DP-356043-5 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-8287, descrito no documento no U.S.-A 2010-0184079 ou WO2008/002872); Evento EE-1 (berinjela, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no WO 07/091277); Evento FI117 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 209031, descrito no documento no U.S.-A 2006-059581 ou WO 98/044140); Evento FG72 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA- 11041, descrito no documento no WO2011/063413), Evento GA21 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 209033, descrito no documento no U.S.-A 2005-086719 ou WO 98/044140); Evento GG25 (com, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 209032, descrito no documento no U.S.-A 2005-188434 ou WO 98/044140); Evento GHB119 (algodão, tolerância a herbicida - controle de inseto, depositado como ATCC PTA-8398, descrito no documento no WO2008/151780); Evento GHB614 (algodão, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-6878, descrito no documento no U.S.-A 2010-050282 ou WO2007/017186); Evento GJ11 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 209030, descrito no documento no U.S.-A 2005188434 ou WO98/044140); Evento GM RZ13 (beterraba, resistência a vírus, depositado como NCIMB-41601, descrito no documento no WO2010/076212); Evento H7-1 (beterraba, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB 41158 ou NCIMB 41159, descrito no documento no U.S.-A 2004-172669 ou WO 2004/074492); Evento JOPLIN1 (trigo, tolerância à doença, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2008-064032); Evento LL27 (soja, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB41658, descrito no documento no WO2006/108674 ou U.S.-A 2008-320616); Evento LL55 (soja, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB 41660, descrito no documento no WO 2006/108675 ou U.S.-A 2008-196127); Evento LLalgodão25 (algodão, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-3343, descrito no documento no WO2003/013224 ou U.S.-A 2003-097687); Evento LLRICE06 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 203353, descrito no documento no U.S. 6.468.747 ou WO2000/026345); Evento LLRice62 ( arroz, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 203352, descrito no documento no WO2000/026345), Evento LLRICE601 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-2600, descrito no documento no U.S.-A 20082289060 ou WO2000/026356); Evento LY038 (milho, traço de qualidade, depositado como ATCC PTA-5623, descrito no documento no U.S.-A 2007- 028322 ou WO2005/061720); Evento MIR162 (milho, controle de inseto, depositado como PTA-8166, descrito no documento no U.S.-A 2009-300784 ou WO2007/142840); Evento MIR604 (milho, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2008-167456 ou WO2005/103301); Evento MON15985 (algodão, controle de inseto, depositado como ATCC PTA-2516, descrito no documento no U.S.-A 2004-250317 ou WO2002/100163); Evento MON810 (milho, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2002-102582); Evento MON863 (milho, controle de inseto, depositado como ATCC PTA-2605, descrito no documento no WO2004/011601 ou U.S.-A 2006-095986); Evento MON87427 (milho, controle de polinização, depositado como ATCC PTA-7899, descrito no documento no WO2011/062904); Evento MON87460 (milho, tolerância à tensão, depositado como ATCC PTA-8910, descrito no documento no WO2009/111263 ou U.S.-A 201 1-0138504); Evento MON87701 (soja, controle de inseto, depositado como ATCC PTA-8194, descrito no documento no U.S.-A 2009-130071 ou WO2009/064652); Evento MON87705 (soja, traço de qualidade - tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-9241, descrito no documento no U.S.-A 2010-0080887 ou WO2010/037016); Evento MON87708 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-9670, descrito no documento no WO2011/034704); Evento MON87712 (soja, rendimento, depositado como PTA-10296, descrito no documento no WO2012/051199), Evento MON87754 (soja, traço de qualidade, depositado como ATCC PTA-9385, descrito no documento no WO2010/024976); Evento MON87769 (soja, traço de qualidade, depositado como ATCC PTA-8911, descrito no documento no U.S.-A 2011-0067141 ou WO2009/102873); Evento MON88017 (milho, tolerância a herbicida - controle de inseto, depositado como ATCC PTA-5582, descrito no documento no U.S.-A 2008-028482 ou WO2005/059103); Evento MON88913 (algodão, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-4854, descrito no documento no WO2004/072235 ou U.S.-A 2006-059590); Evento MON88302 (colza, tolerância a herbicida, depositado como PTA-10955, descrito no documento no WO2011/153186), Evento MON88701 (algodão, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11754, descrito no documento no WO2012/134808), Evento MON89034 (milho, controle de inseto, depositado como ATCC PTA- 7455, descrito no documento no WO 07/140256 ou U.S.-A 2008-260932); Evento MON89788 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA- 6708, descrito no documento no U.S.-A 2006-282915 ou WO2006/130436); Evento MSI 1 (colza, controle de polinização - tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-850 ou PTA-2485, descrito no documento no WO2001/031042); Evento MS8 (colza, controle de polinização - tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-730, descrito no documento no WO2001/041558 ou U.S.-A 2003-188347); Evento NK603 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-2478, descrito no documento no U.S.-A 2007-292854); Evento PE-7 (arroz, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no WO2008/114282); Evento RF3 (colza, controle de polinização - tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-730, descrito no documento no WO2001/041558 ou U.S.-A 2003-188347); Evento RT73 (colza, tolerância a herbicida, não depositado, descrito no documento no WO2002/036831 ou U.S.-A 2008-070260); Evento SYHT0H2 / SYN-000H2-5 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11226, descrito no documento no WO2012/082548), Evento T227-1 (beterraba, tolerância a herbicida, não depositado, descrito no documento no WO2002/44407 ou U.S.-A 2009-265817); Evento T25 (milho, tolerância a herbicida, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2001-029014 ou WO2001/051654); Evento T304-40 (algodão, tolerância a herbicida - controle de inseto, depositado como ATCC PTA-8171, descrito no documento no U.S.-A 2010-077501 ou WO2008/122406); Evento T342-142 (algodão, controle de inseto, não depositado, descrito no documento no WO2006/128568); Evento TC1507 (milho, tolerância a herbicida - controle de inseto, não depositado, descrito no documento no U.S.-A 2005-039226 ou WO2004/099447); Evento VIP 1034 (milho, tolerância a herbicida - controle de inseto, depositado como ATCC PTA- 3925., descrito no documento no WO2003/052073), Evento 32316 (milho, controle de inseto-tolerância a herbicida, depositado como PTA- 11507, descrito no documento no WO2011/084632), Evento 4114 (milho, controle de inseto-tolerância a herbicida, depositado como PTA-11506, descrito no documento no WO2011/084621), evento EE-GM3 / FG72 (soja, tolerância a herbicida, ATCC Número de Acesso PTA-11041) opcionalmente sobreposto com o evento EE-GM1/LL27 ou evento EE-GM2/LL55 (WO2011/063413 A2), evento DAS-68416-4 (soja, tolerância a herbicida, ATCC Número de Acesso PTA-10442, WO2011/066360A1), evento DAS-68416-4 (soja, tolerância aherbicida, ATCC Número de Acesso PTA-10442, WO2011/066384A1), evento DP-040416-8 (milho, controle de inseto, ATCC Número de Acesso PTA- 11508, WO2011/075593A1), evento DP-043A47-3 (milho, controle de inseto, ATCC Número de Acesso PTA-11509, WO2011/075595A1), evento DP-004114-3 (milho, controle de inseto, ATCC Número de Acesso PTA-11506, WO2011/084621 Al), evento DP-032316-8 (milho, controle de inseto, ATCC Número de Acesso PTA-11507, WO2011/084632A1), evento MON-88302-9 (colza, tolerância a herbicida, ATCC Número de Acesso PTA-10955, WO2011/153186A1), evento DAS-21606-3 (soja, tolerância a herbicida, ATCC Número de Acesso PTA-11028, WO2012/033794A2), evento MON-87712-4 (soja, traço de qualidade, ATCC Número de Acesso PTA-10296, WO2012/051199A2), evento DAS-44406-6 (soja, tolerância a herbicida sobreposto, ATCC Número de Acesso PTA-11336, WO2012/075426A1),evento DAS-14536-7 (soja, tolerância a herbicida, ATCC Número de Acesso PTA-11335, WO2012/075429A1), evento SYN-000H2-5 (soja, tolerância aherbicida, ATCC Número de Acesso PTA-11226, WO2012/082548 A2), evento DP-061061-7 (colza, tolerância a herbicida, sem número de depósito disponível, WO2012071039A1), evento DP-073496-4 (colza, tolerância a herbicida, sem número de depósito disponível, US2012131692), evento 8264.44.06.1 (soja, tolerância a herbicida sobreposto, Número de Acesso PTA- 1 1336, WO2012075426A2), evento 8291.45.36.2 (soja, tolerância a herbicida sobreposto, Número de Acesso PTA-11335, WO2012075429A2), eventoSYHT0H2 (soja, ATCC Número de Acesso PTA-11226, WO2012/082548 A2), evento MON88701 (algodão, ATCC Número de Acesso PTA-11754, WO2012/134808A1), evento K 179-2 (alfalfa, ATCC Número de Acesso PTA-1 1833, WO2013/003558A1), evento pDAB8264.42.32.1 (soja, tolerância aherbicida sobreposto, ATCC Número de Acesso PTA-11993, WO2013/010094A1), evento MZDT09Y (milho, ATCC Número de Acesso PTA- 13025, WO2013/012775A1).

[0080] A transformação de células vegetais pode seralcançada por diversas técnicas conhecidas na área de biologia molecular. O gene pesticida da invenção pode ser modificado para obter ou aprimorar expressão em células vegetais. Tipicamente um construto que expressa tal proteína conteria um promotor para acionar a transcrição do gene, assim como uma região não traduzida 3' para permitir terminação de transcrição e poliadenilação. A organização de tais construtos é bastante conhecida na técnica. Em algumas instâncias, pode ser útil arquitetar o gene de modo que o peptídeo resultante é secretado, ou de outro modo, visado dentro da célula vegetal. Por exemplo, o gene pode ser arquitetado para conter um peptídeo de sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplásmico. Pode ser também preferível arquitetar o cassete de expressão de planta para conter um íntron, de modo que o processamento de mRNA do íntron seja requerido para a expressão.

[0081] Tipicamente esse "cassete de expressão de planta"será inserido em um "vetor de transformação de planta". Esse vetor de transformação de planta pode ser composto por um ou mais vetores de DNA necessários para alcançar a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de planta que são compreendidos de mais de um segmento de DNA contíguo. Esses vetores são frequentemente referidos na técnica como "vetores binários". Vetores binários assim como vetores com plasmídios auxiliadores são mais frequentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, onde o tamanho e a complexidade dos segmentos de DNA necessários para atingir suficiente transformação são bem grandes e é vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas. Vetores binários contém, tipicamente, um vetor plasmidial que contém as sequências que atuam em cis exigidas para transferência de T- DNA (tais como borda direita e borda esquerda), um marcador selecionável, isto é, arquitetado para ter capacidade de expressão em uma célula vegetal e um "gene de interesse" (um gene arquitetado para ter capacidade de expressão em uma célula vegetal para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também presente nesse vetor plasmidial estão sequências exigidas para replicação bacteriana. As sequências de atuação cis são dispostas de uma maneira que permite eficiente transferência para células vegetais e expressão na mesma. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida são localizados entre as bordas direita e esquerda. Frequentemente, em vetor plasmidial contém os fatores que atuam em trans que mediam transferências de T-DNA de Agrobacterium para células vegetais. O plasmídeo frequentemente contém as funções de virulência (genes Vir) que permitem infecção de células vegetais por Agrobacterium e transferência de DNA por clivagem nas sequências de borda e transferência de DNA mediada por vir, como é compreendido da técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446 a 451). Diversos tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usadas para transformação de planta. O segundo vetor plasmidial não é necessário para as plantas por outros métodos tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.

[0082] Em geral, métodos de transformação de plantaenvolvem transferir DNA heterólogo para células vegetais alvo (por exemplo, embriões maduros ou imaturos, culturas de suspensão, calo indiferenciados, protoplastos, etc.), seguida aplicar um nível limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células vegetais transformadas a partir de um grupo de massa celular não transformada. Os explantes são tipicamente transferidos para um novo suprimento do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em mudas após serem colocadas em meio de regeneração suplementado com um nível limiar máximo de agente seletor. As mudas são, então, transferidas para um meio de enraizamento seletivo para recuperar a plântula ou muda enraizada. A planta transgênica, então, cresce até se tornar uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271 a 282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750). Os explantes são tipicamente transferidos para um novo suprimento do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas são encontrados em Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219 a 239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42: 107 a 120. Visto que o material transformado contém muitas células; tanto transformadas quanto não transformadas estão presentes em qualquer pedaço de calo alvo submetido ou tecido ou grupo de células. A habilidade de matar células não transformadas e permitir que células transformadas se proliferem resulta em cultura de planta transformada. Frequentemente, a habilidade de remover células não transformadas é uma limitação para rápida recuperação de células vegetais transformadas e geração bem-sucedida de plantas transgênicas.

[0083] Os protocolos de transformação assim como protocolospara introdução de sequências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo da planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, marcadas para transformação. A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um dentre diversos métodos, o que inclui, sem se limitar aos mesmo, microinjeção, eletroporação, transferência de gene direta, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células vegetais (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeio de células vegetais com DNA estranho heterólogo aderido a partículas, aceleração de partícula balística, transformação de feixe de aerosol (Pedido Publicado no U.S. 20010026941; Patente no U.S. 4.945.050; Publicação Internacional no WO 91/00915; Pedido Publicado no U.S. 2002015066), transformação de Lecl e vários outros métodos diretamente mediados sem partícula para transferir DNA.

[0084] Métodos para a transformação de cloroplastos sãoconhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526 a 8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913 a917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601 a 606. O método se baseia em entrega por pistola de partículas de DNA que contém um marcador selecionável e alvo do DNA para o genoma plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente, transformação de plastídeo pode ser alcançada pela transativação de um transgene com origem de plastídeo silencioso por expressão de tecido preferencial de uma polimerase de RNS direcionada para plastídeo ou codificada de modo nuclear. Tal sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7.301 a 7.305.

[0085] Após a integração de DNA estranho heterólogo nascélulas vegetais, aplica-se um nível limiar máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células transformadas putativas que sobrevieram desse tratamento seletivo pela transferência regularmente para um meio fresco. Pela passagem contínua e desafio com seleção adequada, identificam-se e proliferam-se as células que são transformadas com o vetor plasmidial. Métodos moleculares e bioquímicos podem ser usados para confirmar a presença do gene heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.

[0086] As células que foram transformadas podem crescer emplantas de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81 a 84. Essas plantas podem depois crescer e serem polinizadas com a mesma cepa transformada ou diferentes cepas e o híbrido resultante que tem expressão constitutiva da identificada característica fenotípica desejada. Duas ou mais gerações podem crescer para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja estável e depois as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Dessa maneira, a presente invenção fornece semente transformada (também chamada de "consultada por transgênico") que tem um construto de nucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de modo estável nos genomas da mesma.

AVALIAÇÃO DA TRANSFORMAÇÃO DA PLANTA

[0087] Após a introdução de DNA estranho heterólogo nascélulas vegetais, a transformação ou integração de gene heterólogo no genoma de planta é confirmado por vários métodos tais como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados com o gene integrado.

[0088] Análise PCR é um método rápido para examinar célulastransformadas, tecidos ou mudas para a presença de gene incorporado no estágio anterior ao transplante para o solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. PCR é realizado pelo uso de iniciadores oligonucleotídeo específicos para o gene de interesse ou fundo de vetor Agrobacterium, etc.

[0089] A transformação de planta pode ser confirmada poranálise Southern blot de DNA genômico (Sambrook e Russell, 2001, supracitado). Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição adequadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma nitrocelulose ou membrana de náilon. A membrana ou "blot" é então sondada com, por exemplo, fragmentos de DNA alvo radiomarcados 32P para confirmar a integração de gene introduzido no genoma de planta de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, 2001, supracitado).

[0090] Na análise Northern blot, RNA é isolado de tecidosespecíficos de transformante, fracionado em um gel agarose de formaldeído e amostrado em um filtro de náilon de acordo com procedimentos-padrão que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supracitado). A expressão de RNA codificada pelo gene pesticida é, então, testada pela hibridização do filtro para uma sonda radioativa derivada contra um gene pesticida, através de métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supracitado).

[0091] Western blot, ensaios bioquímicos e similares podemser realizados nas plantas transgênicas para confirmar a presença de proteína codificada pelo gene pesticida por procedimentos-padrão (Sambrook e Russell, 2001, supracitado) pelo uso de anticorpos que captam um ou mais epítopos presentes na proteína pesticida.ATIVIDADE PESTICIDA EM PLANTAS

[0092] Em um outro aspecto da invenção, podem ser geradasplantas transgênicas que expressam uma proteína pesticida que tem atividade pesticida. Métodos descritos acima por meio de exemplo podem ser utilizados para gerar plantas transgênicas, mas a maneira na qual as células vegetais transgênicas são geradas não é de importante para essa invenção. Métodos conhecidos ou descritos na técnica tais como transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística e métodos mediados por não partícula podem ser usados a critério do experimentador. Plantas que expressam uma proteína pesticida podem ser isoladas por métodos comuns descritos na técnica, por exemplo pela transformação de caule, seleção de calo transformado e regeneração de plantas férteis de tais calos transgênicos. Em tal processo, pode ser usado qualquer gene como um marcador selecionável contato que a expressão do mesmo em células vegetais apresentem habilidade para identificar ou selecionar células transformadas.

[0093] Vários marcadores foram desenvolvidos para o uso comcélulas vegetais, tais como resistência a cloramfenicol, o aminoglicosido G418, higromicina ou similares. Outros genes que codificam um produto envolvido em metabolismo de cloroplasto podem também ser usado como marcadores selecionáveis. Por exemplo, genes que fornecem resistência a herbicidas de planta tais como glifosato, bromoxinil ou imidazolinona podem encontrar uso específico. Tais genes foram relatados (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263: 6.310 a 6.314 (gene nitrilase com resistência a bromoxinil); e Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 2.188 (gene resistente a AHAS imidazolinona). Adicionalmente, os genes revelados no presente documento são úteis como marcadores para examinar a transformação de células vegetais ou bacterianas. Métodos para detectar a presença de um transgene em uma planta, órgão de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), semente, célula vegetal, propágulo, embrião ou progênie da mesma são bastante conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presença do transgene é detectada pelo teste de atividade pesticida.

[0094] Plantas férteis que expressam uma proteína pesticidapodem ser testadas pela atividade pesticida e as plantas que mostram atividade ideal selecionadas para criação adicional. Métodos estão disponíveis na técnica para ensaio de atividade de praga. Em geral, a proteína é misturada e usadas em ensaios de alimentação. Consultar, por exemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290 a 293.

[0095] A presente invenção pode ser usada paratransformação de qualquer espécie de planta, o que inclui, sem se limitar aos mesmos, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não se limitam às mesmas, milho verde (maís), sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferos, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e colza, Brassica sp., alfalfa, centeio, milheto, cártamo, amendoins, batata doce, cassava, café, côco, abacaxi, árvores de citrus, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, vegetais, plantas ornamentais e coníferas.

[0096] Vegetais incluem, mas não se limitam aos mesmos,tomates, alface, vagem, feijão-de-lima, ervilha e membros do gênero Curcumis tais como pepino, cantalupo e melão. Ornamentais incluem, mas não se limitam às mesmas, azálea, hortênsia, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, craveiro, poinsétia e crisântemo. Preferencialmente, as plantas da presente invenção são plantas de safra (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferos, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, colza., etc.).

USO EM CONTROLE PESTICIDA

[0097] Métodos em geral para empregar cepas quecompreendem uma sequência de nucleotídeos da presente invenção, ou um variante das mesmas, no controle de praga ou na engenharia de outros organismos como agentes pesticidas são bastante conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 5.039.523 e EP 0480762A2.

[0098] As cepas de Bacillus que contêm uma sequência denucleotídeos da presente invenção, ou uma variante da mesma, ou os micro-organismos que foram geneticamente alterados para conter um gene pesticida da invenção e proteína podem ser usados para proteger safras agrícolas e produtos contra pragas. Em um aspecto da invenção, células inteiras, isto é, não dissolvidas, de um organismo produtor de toxina (pesticida) são tratadas com reagentes que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente de praga(s) alvo(s).

[0099] Alternativamente, o pesticida é produzido pelaintrodução de um gene pesticida em um hospedeiro celular. Expressão dos resultados dos genes pesticidas, diretamente ou indiretamente, na produção intracelular e manutenção do pesticida. Em um aspecto dessa invenção, essas células são então tratadas sobre condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente das praga(s) alvo(s). O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Esses pesticidas naturalmente encapsulados podem, então, ser formulados de acordo com técnicas convencionais para aplicação ao ambiente que hospeda uma praga alvo, por exemplo, solo, água e folhagem de plantas. Consultar, por exemplo, o documento no EPA 0192319 e as referências citadas no mesmo. Alternativamente, uma pessoa pode formular as células ao expressar um gene dessa invenção de modo a permitir a aplicação do material resultante como um pesticida.

[00100] Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados à área de safra ou planta a serem tratadas, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, herbicidas, crioprotetores, surfactantes, detergentes, sabões pesticidas, óleos dormentes, polímeros e/ou formulações carreadoras biodegradáveis ou com liberação temporizada que permitem dosagem a longo prazo de uma área alvo seguindo uma única aplicação da formulação. Elas podem também ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbicidas, amoebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de diversas dessas preparações, se desejado, junto com carreadores agriculturalmente aceitáveis adicionais, surfactantes ou adjuvantes promotores de aplicação empregados costumeiramente na técnica de formulação. Carreadores adequados e adjuvantes podem ser sólidos ou líquidos e corresponder às substâncias empregadas comumente em tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais regeneradas ou naturais, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuador de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. Do mesmo modo, as formulações podem ser preparadas em "iscas" comestíveis ou preparadas em "armadilhas" de praga para permitir a alimentação ou ingestão por uma praga alvo da formulação pesticida.

[00101] Métodos para aplicar um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição agroquímica da presente invenção que contém pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas cepas bacterianas da presente invenção incluem aplicação em folha, revestimento de semente e aplicação no solo. O número de aplicações e taxa de aplicação dependem da intensidade de infestação pela praga correspondente.

[00102] A composição pode ser formulada como um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide, solução ou similares, e pode ser preparada por tais meios convencionais como dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células que compreendem o polipeptídeo. Em tais composições que contêm pelo menos um tal polipeptídeo pesticida, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

[00103] Pragas de lepidóptero, hemípteros, dípteros ou coleópteros podem ser mortas ou reduzidas em número em uma dada área pelos métodos da invenção, ou podem ser profilaticamente aplicadas a um ambiente para prevenir a infestação por uma praga suscetível. Preferencialmente, a praga ingere ou entra em contato com uma quantidade eficaz de pesticida do polipeptídeo. Por "quantidade eficaz de pesticida" entende-se uma quantidade do pesticida que tem capacidade de trazer quase a morte de pelo menos uma praga ou de notadamente reduzir o crescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal da praga. Essa quantidade irá variar dependendo de tais fatores como, por exemplo, as pragas alvo específicas a serem controladas, o ambiente específico, local, planta, safra ou localidade agrícola a ser tratada, as condições do ambiente e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação da composição de polipeptídeo eficaz como pesticida. As formulações podem variar também com relação às condições climáticas, considerações ambientais e/ou frequência de aplicação e/ou severidade da infestação da praga.

[00104] As composições pesticidas descritas podem ser feitas através da formulação da célula bacteriana, suspensão de esporo e/ou cristal ou componente de proteína isolada com o carreador agriculturalmente aceitável desejado. As composições podem ser formuladas antes da administração em um meio apropriado tais como liofilização, desidratação por congelamento, dessecação ou um carreador, meio ou diluente adequado aquoso, tais como salina ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral), ou água ou emulsões de água/óleo ou como um pó umedecível ou em combinação com qualquer outro material carreador adequado para aplicação agrícola. Carreadores agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são bastante conhecidos na técnica. O termo "carreador agriculturalmente aceitável" cobre todos os adjuvantes, compostos inertes, dispersantes, surfactantes, acentuadores de pegajosidade, aglutinantes, etc. que são comumente usados na tecnologia de formulação de pesticida; esses são bem conhecidos por aqueles versados na formulação de pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes líquidos ou sólidos e preparados por vários meios, por exemplo, pelo mistura, mescla e/ou moagem homogênea da composição pesticida com adjuvantes adequados que usam técnicas convencionais de formulação. Formulações adequadas e métodos de aplicação são descritos no Documento de Patente no U.S. 6.468.523, incorporado no presente documento a título de referência.

[00105] "Praga" inclui, mas sem limitação, insetos, fungos, bactérias, nemátodos, ácaros, ixodidas e similares. Pragas de inseto incluem insetos selecionados dentre as ordens Coleóptero, Díptero, Himenóptero, Lepidóptero, Malófago, Homóptero, Hemíptero, Ortóptero, Tisanóptero, Dermáptero, Isóptero, Anóplura, Sifonáptero, Tricóptero, etc., particularmente Coleóptero, Lepidóptero e Díptero.

[00106] A ordem Coleóptero inclui as subordens Adefaga e Polifaga. A subordem Adefaga inclui as superfamílias Caraboidea e Gyrinoidea, enquato a subordem Polifaga inclui as superfamílias Hidrofilidea, Stafilinidea, Cantaroidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascillidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordellidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycidea, Chrysomeloidea e Curculionoidea. A superfamília Caraboidea inclui as famílias Cicindelidae, Carabidae e Dytiscidae. A superfamília Gyrinoidea inclui a família Gyrinidae. A superfamília Hydrophiloidea inclui a família Hydrophilidae. A superfamília Staphylinoidea inclui as famílias Silphidae e Staphylinidae. A superfamília Cantharoidea inclui as famílias Cantharidae e Lampyridae. A superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae. A superfamília Elateroidea inclui as famílias Elateridae e Buprestidae. A superfamília Cucujoidea inclui a família Coccinellidae. A superfamília Meloidea inclui a família Meloidae. A superfamília Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae. A superfamília Scarabaeoidea inclui as famílias Passalidae e Scarabaeidae. A superfamília Cerambycoidea inclui a família Cerambycidae. A superfamília Chrysomeloidea inclui a família Chrysomelidae. A superfamília Curculionoidea inclui as famílias Curculionidae e Scolytidae.

[00107] A ordem Díptero inclui as subordens Nematocera, Brachycera e Cyclorrhapha. A subordem Nematocera inclui as famílias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae e Cecidomyiidae. A subordem Brachycera inclui as famílias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae e Dolichopodidae. A subordem Cyclorrhapha inclui as divisões Aschiza e Aschiza. A divisão Aschiza inclui as famílias Phoridae, Syrphidae e Conopidae. A divisão Aschiza inclui as seções Acalyptratae e Calyptratae. A seção Acalyptratae inclui as famílias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae e Drosophilidae. A seção Calyptratae inclui as famílias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae e Sarcophagidae.

[00108] A ordem Lepidóptero inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae e Tineidae.

[00109] Nemátodos incluem nemátodos parasíticos tais como nematoide de root-knot, nematoide de cisto e nematoide de lesão, que incluem Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nematoides de cisto, o que inclui, sem se limitar aos mesmos, Heterodera glicínia (nemátodos de cisto da soja); Heterodera schachtii (nemátodos de cisto da beterraba); Heterodera avenae (nemátodo de cisto do cereal) e Globodera rostochiensis e Globodera pallida (nemátodo do cisto da batata). Nemátodos de lesão incluem Pratylenchus spp.

[00110] Pragas hemíptero (as quais incluem espécies que são projetadas como Hemíptero, Homóptero, ou Heteróptero) incluem, mas não se limitam aos mesmos, Lygus spp., tais como algodoeiro (Lygus hesperus), o inseto manchado de planta (Lygus lineolaris) e inseto verde planta (Lygus elisus); afídios, tais como o afídeo a pulgão-do-pessegueiro (Myzus persicae), afídio de algodão (Aphis gossypii), afídio de cereja ou afídio de cerejeira-negra (Myzus cerasi), afídio de soja (Aphis glycines Matsumura); gafanhoto marrom de planta (Nilaparvata lugens) e gafanhoto verde de arroz (Nephotettix spp.) e percevejo, tais como percevejo verde bug (Acrosternum hilare), percevejo- marrom-marmorizado (Halyomorpha halys), maria-fedida (Nezara viridula), percevejo de arroz (Oebalus pugnax), rufipes de pentatoma (Pentatoma rufipes), percevejo europeu (Rhaphigaster nebulosa) e o inseto escudo Troilus luridus.

[00111] Pragas de inseto da invenção para as maioria das safras incluem: Maís: Ostrinia nubilalis, broca-do-milho; Agrotis ipsilon, traça lagarta-rosca; Helicoverpa zea, lagarta da espiga; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho; Diatraea grandiosella, broca grande da cana-de-açúcar; Elasmopalpus lignosellus, lagarta elasmo; Diatraea saccharalis, broca da cana; Diabrotica virgifera, broca do milho; Diabrotica longimilhois barberi, barbeiro; Diabrotica undecimpunctata howardi, besouro de pepino manchado; Melanotus spp., larvas de besourou do clique; Cyclocephala borealis, joaninha mascarada do norte (coró-do-milho); Cyclocephala immaculata, joaninha mascarada do sul (coró-do-milho); escaravelho japonês, besouro japonês; Chaetocnema pulicaria, besouro saltador do milho; Sphenophorus maidis, caruncho de milho; Rhopalosiphum maidis, afídio da folha do milho; Anuraphis maidiradicis, afídio da raiz do milho; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das-gramineas; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de patas encarnadas; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya platura, larva da semente do milho; Agromyza parvimilhois, larva mancha milho; Anaphothrips obscrurus, tripes; Solenopsis milesta, forgmigas ladras; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Sorgo: Chilo partellus, broca de sorgo; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Helicoverpa zea, lagarta de espiga; Elasmopalpus lignosellus, elasmo; Feltia subterranea, lagarta-rosca; Phyllophaga crinita, coró-do-milho; Eleodes, Conoderus e Aeolus spp., larvas de besouro de clique; Oulema melanopus, besouro de folha de cereal; Chaetocnema pulicaria, besouro saltador do milho; Sphenophorus maidis, caruncho de milho; Rhopalosiphum maidis; afídio de folha de milho; Sipha flava, afídio de cana-de-açucar amarelo; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das-gamineas; Contarinia sorghicola, mosquito do sorgo;Tetranychus cinnabarinus, ácaro carmim; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Trigo: Pseudaletia unipunctata, lagarta de pastagem; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho; Elasmopalpus lignosellus, elasmo; Agrotis orthogonia, traça cutworm; Elasmopalpus lignosellus, elasmo; Oulema melanopus, besouro de folha do cereal; Hypera punctata, gorgulho de folha de trevo; Diabrotica undecimpunctata howardi, besouro de pepino manchado; afídio de trigo russo; Schizaphis graminum, pulgão-verde; Macrosiphum avenae, afídio de grão inglês; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de pernas encarnadas; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Mayetiola destructor, mosca Hessian; Sitodiplosis mosellana, mosquito de trigo; Meromyza americana, verme de caule de trigo; Hylemya coarctata, mosca de bulbo de trigo; FranklinieUa fusca, tripes tabaco; Cephus cinctus, mosca desfolhadora de caule de trigo; Aceria tulipae, ácaro do enrolamento do trigo; Girassol: Suleima helianthana, traça de broto de girassol bud moth; Homoeosoma electellum, traça de girassol moth; zygogramma exclamationis, besouro de girassol; Bothyrus gibbosus, besouro de cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de semente de girassol; Algodão: Heliothis virescens, lagarta do algodão; Helicoverpa zea, larva de lagarta de algodão; Spodoptera exigua, lagarta de pastagem de beterraba; Pectinophora gossypiella, larva de lagarta rosa; Anthonomus grandis, gorgulho de cápsula; Aphis gossypii, afídio de algodão; Pseudatomoscelis seriatus, gafanhoto de algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca de asa listrada; Lygus lineolaris, inseto manchado de planta; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de pernas encarnadas; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Thrips tabaci, tripes de cebola; Franklinkiella fusca, tripes de tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro carmim; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Arroz: Diatraea saccharalis, broca de cana-de-açucar; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Helicoverpa zea, lagarta da espiga; Colaspis brunnea, grape colaspis; Lissorhoptrus oryzophilus, bicheira-da-raiz; Sitophilus oryzae, caruncho de arroz; Nephotettix nigropictus, cicadellidae de arroz; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das- gamineas; Acrosternum hilare, percevejo verde; Chilu suppressalis, broca de arroz assiática; Soja: Pseudoplusia includens, lagarta-medideira; Anticarsia gemmatalis, lagarta da soja; Plathypena scabra, cloverworm verde; Ostrinia nubilalis, broca europeia do milho; Agrotis ipsilon, lagarta-rosca preta;besouro- saltadoroptera exigua, lagarta de pastagem de beterraba; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Heliothis virescens, larva de lagarta de algodão; Helicoverpa zea, lagarta de algodão; Epilachna varivestis, besouro de feijão mexicano; Myzus persicae, afídio de pêssego verda; Empoasca fabae, gafanhoto de batata; Acrosternum hilare, percevejo verde; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de pernas encarnadas; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura, verme de semente de milho; Sericothrips variabilis, tripes de soja thrips; Thrips tabaci, tripes de cebola; Tetranychus turkestani, ácaro de morango; Tetranychus urticae, ácaro rajado; Cevada: Ostrinia nubilalis, broca europeia do milho; Agrotis ipsilon, lagarta- rosca; Schizaphis graminum, pulgão-verde; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo-das-gamineas; Acrosternum hilare, percevejo verde; Euschistus servus, percevejo marrom; Euschistus heros, percevejo marrom neotropical; Delia platura, verme de semente de milho; Mayetiola destructor, mosca Hessian; Petrobia latens, mosquito de trigo marrom; Canola: Brevicoryne brassicae, afídio de repolho; Phyllotreta cruciferae, besouro-saltador; Mamestra configurata, lagarta Mamestra configurata; Plutella xylostella, traça das crucíferas; Delia ssp., vermes de raiz.

MÉTODOS PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DA PLANTA

[00112] Métodos para aumentar o rendimento da planta são fornecidos. Os métodos compreendem fornecer uma planta ou célula vegetal que expressa um polinucleotídeo que codifica a sequência de polipeptídeo pesticida revelada no presente documento e cultivar a planta ou uma semente da mesma em um campo infestado com (ou suscetível à infestação por) uma praga contra a qual o dito polipeptídeo tem atividade pesticida. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem atividade pesticida contra uma praga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros ou nemátodos e o dito campo é infestado com praga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros ou nemátodos. Conforme definido no presente documento, o "rendimento" da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por "biomassa" entende-se qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer aprimoramento no rendimento do produto de planta medido. Aumentar o rendimento de planta tem diversas aplicações comerciais. Por exemplo, aumentar biomassa de folha de planta pode aumentar o rendimento de vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Adicionalmente, aumentar biomassa de folha pode ser usado para aumentar a produção de farmacêuticos derivados de planta ou produtos industriais. Um aumento no rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo o que inclui, sem se limitar aos mesmos, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos um aumento de 30%, pelo menos um aumento de 50%, pelo menos um aumento de 70%, pelo menos um aumento de 100% ou um aumento mairo em rendimento comparado a uma planta que não expressa a sequência de pesticida. Em métodos específicos, o rendimento de planta é aumentado como um revelado de resistência à praga aprimorada de uma planta que expressa uma proteína pesticida revelada no presente documento. A expressão da proteína pesticida resulta em uma habilidade reduzida de uma praga para infestar ou se alimentar.

[00113] As plantas podem também ser tratadas com uma ou mais composições químicas, que incluem um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas. Composições químicas exemplificativas incluem: Herbicidas de Frutas/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzin, Simazina, Trifluralina, Fluazifop, Glufosinato, Halosulfuron Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halosulfuron, Indaziflam; Inseticidas de Frutas/Vegetais: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbaril, Carbofurano,Clorpirifós, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cihalotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprido, Dinotefurano, Fluacripirim,Spirodiclofen, Gamma-cialotrina, Spiromesifen, Spinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Triflumuron, Espirotetramato, Imidacloprid, Flubendiamida, Tiodicarbe,Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirafen, Clotianidina, Tiametoxame, Spinotoram, Tiodicarbe, Flonicamid, Metiocarbe, Emamectina- benzoato, Indoxacarb, Fenamifos, Piriproxifen, Fenbutatin-óxido; Fungicidas de Frutas/Vegetais: Ametoctradin, Azoxistrobin, Bentiavalicarbe, Boscalide,Captan, Carbendazim, Clorotalonil, Cobre, Ciazofamida Ciflufenamida, Cimoxanil, Ciproconazol, Ciprodinil, Difenoconazol, Dimetomorfe, Ditianona, Fenamidona, Fenehexamida, Fluazinam, Fludioxonil, Fluopicolida, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Folpet, Fosetil, Iprodiona, Iprovalicarbe, Isopirasame, Cresoxime-metila, Mancozeb, Mandipropamida,Metalaxil/mefenoxam, Metirame, Metrafenona, Miclobutanil, Penconazol, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propamocarb, Propiconazol, Propineb, Proquinazido, Protioconazol, Piraclostrobina, Pirimetanil, Quinoxifena, Espiroxamina, Enxofre, Tebuconazol, Tiofanato-metila, Trifloxistrobina; Herbicidas de Cereais:

[00114] 2.4-D, Amidosulfuron, Bromoxinil, Carfentrazona-E,Clortolurão, Clorsulfurão, Clodinafope-P, Clopiralid, Dicamba, Diclofope-M, Diflufenicão, Fenoxaprop, Florasulame, Flucarbazona-NA, Flufenaceto, Flupirosulfuron-M, Fluroxipir, Flurtamona, Glifosato, Iodossulfurão, Ioxinil, Isoproturon, MCPA, Mesossulfurão, Metsulfuron, Pendimetalin, Pinoxaden, Propoxicarbazona, Prosulfocarbe, Piroxsulame, Sulfossulfurão, Tifenssulfurão, Tralcoxidim, Triasulfuron, Tribenurão, Trifluralina, Tritosulfurão; Fungicidas de Cereais: Azoxistrobin, Bixafeno, Boscalide, Carbendazim, Clorotalonil,Ciflufenamida, Ciproconazol, Ciprodinil, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenpropidina, Fenpropimorfe, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluquinconazol, Fluxapiroxade, Isopirasame, Cresoxime-metila, Metconazol, Metrafenona, Pentiopirad, Picoxistrobina, Procloraz, Propiconazol, Proquinazide, Protioconazol, Piraclostrobina, Quinoxifena, Espiroxamina, Tebuconazol, Tiofanato-metila, Trifloxistrobin; Inseticidas de Cereais: Dimetoate, Lambda- cihaltrin, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamiprid, Dinetofurano, Clorfirifos, Pirimicarb, Metiocarbe, Sulfoxaflor; Herbicidas de Milho: Atrazina, Alacloro, Bromoxinil, Acetochlor, Dicamba, Clopiralid, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfurão, Sulcotriona, Foramsulfurão, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacete, Piroxasulfon; Inseticidas de milho: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprid, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifena, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarbe, B-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Tebupirimfos, Etiprole, Ciazipir, Tiaclopride, Acetamiprid, Dinetofurano, Avermectin; Fungicidas de milho: Azoxistrobin, Bixafene, Boscalide, Ciproconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenitropan, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Isopirasame, Metconazol, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propiconazol, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas de arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfurão,Bensulfurão, Cialofope, Daimuron, Fentrazamida, Imazossulfurão, Mefenaceto, Oxaziclomefona, Pirazosulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofan, Flufenaceto, Fentrazamida, Halosulfurão, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalid, Penoxsulame, Bispiribaque, Oxadiargil, Etoxisulfurão, Pretilaclor, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfan; Inseticidas de arroz: Diazinon, Fenobucarb, Benfuracarb, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronil, Imidacloprid, Isoprocarb, Tiaclopride, Cromafenozida, Clotianidina, Etiprole, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprid, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, Emamectina-Benzoato, Cipermetrina, Clorpirifos, Etofenprox, Carbofurano, Benfuracarb, Sulfoxaflor; Fungicidas de arroz: Azoxistrobina, Carbendazim, Carpropamida, Diclocimet, Difenoconazol, Edifenfos, Ferimzona, Gentamicina, Hexaconazol, Himexazol, Iprobenfos (IBP), Isoprotiolano, Isotianil, Casugamicina, Mancozeb, Metominostrobina, Orisastrobina, Pencicuron, Probenazol, Propiconazol, Propineb, Piroquilona, Tebuconazol, Tiofanato-metil, Tiadinil, Triciclazol, Trifloxistrobina, Validamicina; Herbicidas de Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrin, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop- butil, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalin, Piritiobac de sódio, Trifloxisulfuron, Tepraloxidima, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazuron; Inseticidas de algodão: Acefato, Aldicarbe, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Acetamiprid, Emamectina Benzoato, Imidacloprid, Indoxacarb, Lambda- Cialotrina, Spinosad, Tiodicarbe, Gamma-Cialotrina, Espiromesifena, Piridalil, Flonicamid Flubendiamida, Triflumuron,Rinaxipir,Beta-Ciflutrina,Espirotetramato, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Spinotoram, gamma Cialotrina, 4- [ [(6- Clorpiridin-3 -il)metil] (2,2-difluoretil)amino] furan-2(5H)-on, Tiodicarb, Avermectin, Flonicamid, Piridalil, Espiromesifena, Sulfoxaflor; Fungicidas de algodão: Azoxistrobin, Bixafena, Boscalide, Carbendazim, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenamidona, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapiroxade, Iprodiona, Isopirasame, Isotianil, Mancozeb, Maneb, Metominostrobina, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propineb, Protioconazol, Piraclostrobina, Quintozene, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metila, Trifloxistrobina; Herbicidas de soja: Alachlor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron-Etil, Cloransulam-metil, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S- )Metolacloro, Metribuzin, Pendimetalin, Tepraloxidima, Glufosinato; Inseticidas de soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamiprid, Dinetofurano, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Spinosad, Spinotoram, Emamectina-Benzoato, Fipronil, Etiprole, Deltametrina, β-Ciflutrina, gamma e lambda Ciialotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, espirotetramato, Spinodiclofen, Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarbe, beta-Ciflutrina; Fungicidas de soja: Azoxistrobin, Bixafene, Boscalide, Carbendazim, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Flutriafol, Fluxapiroxade, Isopirasame, Iprodiona, Isotianil, Mancozeb, Maneb, Metconazol, Metominostrobina, Miclobutanil, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propiconazol, Propineb, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metila, Trifloxistrobina; Herbicidas de beterrada: Cloridazon, Desmedifame, Etofumesato, Fenemedifame, Trialato, Clopiralid, Fluazifop, Lenacil, Metamitrão, Quinmeraque, Cicloxidime, Triflusulfurão, Tepraloxidima, Quizalofope; Insesticidas de beterraba: Imidaclopride, Clotianidina, Tiametoxame, Tiaclopride, Acetamipride, Dinetofurano, Deltametrina, β-Ciflutrina, gamma/lambda Cialotrina, 4-[[(6- Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofurano; Herbicidas de canola: Clopiralide, Diclofope, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazacloro, Trifluralina Etametsulfurão, Quinmeraque, Quizalofope, Cletodim, Tepraloxidima; Fungicidas de canola: Azoxistrobin, Bixafene, Boscalide, Carbendazim, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Flusilazol, Fluxapiroxade, Iprodiona, Isopirasame, Mepiquat-cloreto, Metconazol, Metominostrobina, Paclobutrazol, Pentiopirad, Picoxistrobina, Procloraz, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Tiofanato-metila, Trifloxistrobina, Vinclozolina; Inseticidas de canola: Carbofurano, Tiaclopride, Deltametrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxame, Acetamiprid, Dinetofurano, β-Cflutrina, gamma and lambda Cialotrina, tau-Fluvaleriate, Etiprole, Spinosad, Spinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on.

MÉTODO PARA INTRODUZIR O GENE DA INVENÇÃO EM OUTRA PLANTA

[00115] Também fornecido no presente documento estão métodos para introdução do ácido nucleico da invenção em outra planta. O ácido nucleico da invenção, ou um fragmento do mesmo, pode ser introduzido em uma segunda planta por seleção recorrente, retrocruzamento, cultivo selecionado, seleção de linhagem, seleção de massa, seleção aprimorada de cultivo de mutação e/ou marcador genético.

[00116] Assim, em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem cruzas uma primeira planta que compreende um ácido nucleico da invenção com uma segunda planta para produzir planta progênie F1 e selecionar plantas progênie F1 que compreendem o ácido nucleico da invenção. Os métodos podem compreender adicionalmente cruzar as plantas progênia selecionadas com a primeira planta que compreende o ácido nucleico da invenção para produzir plantas progênie por retrocruzamento e selecionar plantas progênie por retrocruzamento que compreendem o ácido nucleico da invenção. Métodos para avaliar a atividade pesticida são fornecidos em outra parte do presente documento. Os métodos podem compreender adicionalmente repetir essas etapas uma ou mais vezes em sucessão para produzir segundas ou mais plantas progênie por retrocruzamento selecionadas que compreendem o ácido nucleico da invenção.

[00117] Qualquer método de cruzamento que envolva seleção de plantas para o fenótipo desejado pode ser usado no método da presente invenção. Em algumas modalidades, as plantas F1 podem ser autopolinizadas para produzir uma geração F2 de segregação. Plantas individuais podem então ser selecionadas que representam o fenótipo desejado (por exemplo, atividade pesticida) em cada geração (F3, F4, F5, etc.) até que os traços sejamhomozigotos ou fixos dentro de uma população de cruzamento.

[00118] A segunda planta pode ser uma planta que tem um traço desejado, tal como tolerância a herbicida, tolerância a inseto, tolerância a seca, controle de nemátodos, eficiência de uso de água, eficiência de uso de nitrogênio, valor nutricional aprimorado, resistência a doenças, fotossíntese aprimorada, qu de fibra aprimorada, tolerância a tensões, reprodução aprimorada e similares. A segunda planta pode ser um evento elite conforme descrito em outra parte do presente documento.

[00119] Em várias modalidades, partes de planta (plantas inteiras, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e similares) podem ser colhidas do cruzamento resultante e propagadas ou coletadas para uso a jusante (tais como comida, alimentação, biocombustível, óleo, farinha, refeição, etc).

MÉTODOS DE OBTER UM PRODUTO DE PLANTA

[00120] A presente invenção também se refere a um processo para obter um produto, que compreende colheita e/ou moagem dos grãos de uma colheita que compreende um ácido nucleico da invenção para obter o produto. Produtos e/ou composições de matéria importantes agronomicamente e comercialmente que incluem sem se limitar aos mesmos alimentício de animal, mercadorias e produtos de planta e subprodutos que pretendem ser usados como comida para consumo humano ou para uso em composições e mercadorias que pretendem ser usadas para consumo humano, particularmente semente sem vitalidade/produtos de grãos, que incluem um produto (semi-)processado de tais grãos/sementes, nos quais o dito produto é ou compreende sementes ou grãos inteiros ou processados, alimentos de animal, milho ou soja, milho ou farinha de soja, milho, amido de milho, refeição de soja, farinha de soja, flocos, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizada, cosméticos, produtos para tratamento de cabelo, manteiga de amendoim de soja, natto, tempé, proteína de soja hidrolisada, chantilli, gordura vegetal, lecitina, soja integral comestível (crua, assada ou como edamame), iogurte de soja, queijo de soja, tofu, yuba, assim como grão parabolizado, assado, cozinhado a vapor, polido, cozido e similares pretendem estar dentro do escopo da presente invenção se esses produtos e composições de matéria contêm quantidades detectáveis do nucleotídeo e/ou sequências de aminoácidos estabelecidas no presente documento como diagnóstico para qualquer planta que contêm tais sequências de nucleotídeos.

[00121] Os exemplos a seguir são oferecidos por meio de ilustração e não de limitação.

EXEMPLOS EXPERIMENTAISEXEMPLO 1. DESCOBERTA DE NOVOS GENES PESTICIDAS DO Bacillus thurinsiensis

[00122] Novos genes pesticidas foram identificados a partir das cepas bacterianas listadas na Tabela 1 pelo uso das seguintes etapas:

[00123] • Preparação do DNA total da cepa. DNA total contémtanto DNA genômico e DNA extracromossômico. DNA extracromossômico contém uma mistura de alguns ou todos dentre os seguintes: plasmídios de vários tamanhos; cromossomos de fago; outras moléculas extracromossômicas não caracterizadas.

[00124] • Sequenciar o DNA. O DNA total é sequenciadoatravés de métodos Next-Generation Sequencing.

[00125] • Identificar genes de toxina putativa através dehomologia e/ou outras análises computacionais.

[00126] • Quando exigido, finalizar a sequência do gene deinteresse por uma das diversas estratégias de clonagem ou PCR (por exemplo, TAIL-PCR).TABELA 1. NOVOS GENES IDENTIFICADOS DE CEPASBACTERIANAS

* Representa uma proteína isto é codificada de um início a jusante e "(trun)" indica que a proteína tem um truncamento com terminação-C.EXEMPLO 2. EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO

[00127] Um gene que codifica cada uma das sequências deaminoácidos estabelecida na Tabela 2 foi amplificado por PCR a partir da cepa correspondente listada na Tabela 1 pelo uso do HERCULASE® II Fusion Polimerade de DNA com iniciadores que incorporam um aglutinante Ascl na extremidade 3'. O produto de PCR amplificado foi digerido com Ascl e ligado ao vetor pMalC4X. O clone foi confirmado pelo sequenciamento e o plasmídeo foi transformado em células competentes B121. Uma única colônia foi inoculada em meio LB media e cultivada a 37 °C até a fase logarítmica e induzida com 0,5 mM IPTG a 20 °C por 18 horas. A proteína purificada foi digerida com Factor Xa a uma razão 1:50 em temperatura ambiente durante uma noite. A proteína purificada foi submetida a bioensaio versos pragas de insetos selecionadas de acordo com um protocolo padrão. Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo. As pragas são listadas na Tabela 3 e o sistema de pontuação segue a Tabela 3.TABELA 2. RESULTADOS DO BIOENSAIO (PONTUAÇÕES DE DIFICULDADE DE CRESCIMENTO, MORTALIDADE)

TABELA 3. PAINEL DE BIOENSAIO DE INSETOS

[00128] Pontuação de dificuldade de crescimento:

[00129] 0 = Nenhuma atividade

[00130] 1 = Dificuldade de crescimento não uniforme

[00131] 2 = Dificuldade de crescimento ligeiramente uniforme(75% o tamanho dos controles)

[00132] 3 = Dificuldade de crescimento fortemente uniforme(entre 74 e 26% do tamanho dos controles)

[00133] 4 = Dificuldade de crescimento severamente uniforme(menos do que 25% do tamanho dos controles)

[00134] Pontuações de mortalidade:

[00135] 0 = Nenhuma atividade

[00136] 1 = até 25% de mortalidade

[00137] 2 = até 50% de mortalidade

[00138] 3 = até 75% de mortalidade

[00139] 4 = maior do que 75% de mortalidade

EXEMPLO 3. ENSAIOS ADICIONAIS PARA ATIVIDADE PESTICIDA

[00140] As sequências de nucleotídeos da invenção podem ser testadas por sua capacidade de produzir proteínas de pesticida. A capacidade de uma proteína pesticida de atuar como um pesticida contra uma praga é frequentemente examinada diversas formas. Uma forma bastante conhecida na técnica é realizar um ensaio de alimentação. Em tal ensaio de alimentação, se expõe a praga a uma amostra que contêm tanto compostos a serem testados como amostras controle. Frequentemente isso é realizado ao colocar o material a ser testado, ou uma diluição adequada de tal material, em um material que a praga irá ingerir, tal como uma dieta artificial. O material a ser testado pode ser composto de um líquido, sólido ou pasta fluida. O material a ser testado pode ser colocado sobre a superfície e depois deixado para secagem. Alternativamente, o material a ser testado pode ser misturado com uma dieta artificial derretida e depois dispensada na câmara de ensaio. A câmara de ensaio pode ser, por exemplo, um copo, pato ou uma placa de microtitulação ou cavidade.

[00141] Ensaio para sugar pragas (por exemplo, afídios) pode envolver separar o material de teste do inseto por uma divisão, idealmente uma porção que pode ser cravada pelas partes de boca de sucção do inseto sugador, para permitir a ingestão do material de teste. Frequentemente, o material de teste é misturado com uma estimulante de alimentação, tais como sacarose, para promover a ingestão do composto teste.

[00142] Outros tipos de ensaios podem incluir a microinjeção do material de teste na boca, ou estômago da praga, assim como o desenvolvimento de plantas transgênicas, seguido de teste de habilidade da praga para se alimentar na planta transgênica. Teste de planta pode envolver o isolamento das partes da planta normalmente consumidos, por exemplo, pequenas gaiolas fixadas a uma folha, ou isolamento das plantas inteiras em gaiolas que contêm insetos.

[00143] Outros métodos e abordagens para ensaio com pragas são conhecidos na técnica, e podem ser encontrados, por exemplo em Robertson e Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, ensaios são comumente descritos nos periódicos Arthropod Management Tests e Journal of Economic Entomology ou pela discussão com membros da Entomological Society of America (ESA).

[00144] Em algumas modalidades, as regiões de DNA que codificam a região de toxina das proteínas pesticidas reveladas no presente documento são clonadas no vetor de expressão E. coli pMAL-C4x atrás do gene malE que codifica proteína de ligação de Maltose (MBP). Esses resultados de fusão em quadro resultam nas expressões de proteínas de fusão MBP-Axmi em E. coli.

[00145] Para a expressão em E. coli, BL21 *DE3 são transformadas com plasmídios individuais. Colônias singulares são inoculadas em suplementado de LB com carbenicilina e glicose e cultivadas durante uma noite a 37 °C. No dia seguinte, novo meio é inoculado com 1% de cultura durante uma noite e cultivada a 37 °C até a fase logarítmica. Subsequentemente, culturas são induzidas com 0,3mM IPTG durante uma noite a 20 °C. Cada pélete de célula é suspenso em 20mM Tris-Cl buffer, pH 7,4 + 200mM NaCl + lmM DTT + inibidores de protease e sonicados. Análise de SDS-PAGE pode ser usada para confirmar a expressão das proteínas de fusão.

[00146] Extratos totalmente livres de célula são então submetidoa a coluna de amilose fixada a rápida cromatografia líquida de proteína (FPLC) para purificação de afinidade de proteínas de fusão MBP-axmi. Proteínas de fusão ligandas são eluidas da resina com solução de maltose lOmM. Proteínas de fusão purificadas são então clivadas com tanto o Fator Xa ou tripsina para remover a etiqueta MBP de terminação amino da proteína Axmi. Clivagem e solubilidade das proteínas pode ser determinada por SDS- PAGEEXEMPLO 4. VETORIZAÇÃO DE GENES PARA EXPRESSÃO DE PLANTA

[00147] As regiões codificantes da invenção são conectadas com sequencias de terminadores e promotores apropriados para expressão em plantas. Tais sequências são bastante conhecidas na técnica e podem incluir o promotor de actina de arroz ou promotor de ubiquitina de milho para expressão em monocotiledôneas, o promotor Arabidopsis UBQ3 ou CaMV 35 S para expressão em dicotiledôneas e os terminadores nos or Pinll. Técnicas para produzir e confirmar os construtos promotor - gene - terminador são também conhecidas no campo em questão.

[00148] Em um aspecto da invenção, sequências de DNA sintéticas são projetadas e geradas. Essas sequências sintéticas têm sequência de nucleotídeos alteradas em relação a sequência parente, mas codificam proteínas que são essencialmente idênticas à sequência parente.

[00149] Em um outro aspecto da invenção, versões modificadas dos genes sintéticos são projetadas de modo que o peptídeo resultante é alvo para uma organela de planta, tais como o retículo endoplásmico ou o apoplasto. Sequências de peptídeos conhecidas na técnica por resultar em alvo de proteínas de fusão para organelas de planta são conhecidas no campo. Por exemplo, a região de terminação-N do gene fosfatase de ácido do White Lupin Lupinus albus (GENBANK® ID GI: 14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) é conhecido na técnica por resultar em retículo endoplásmico com alvo de proteínas heterólogas. Se a proteína de fusão resultante também contém uma sequência de retenção de retículoendoplásmico que compreende o peptídeo N-terminação-lisina-ácido aspártico- ácido glutâmico-leucina (isto é, o motivo "KDEL", SEQ ID NO: 75) naterminação-C, a proteína de fusão será alvo do retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão não tem um retículo endoplásmico com alvo na sequência na terminação-C, a proteína será alvo para o retículo endoplasmático, mas será no fim sequestrada para o apoplasto.

[00150] Assim, esse gene codifica uma proteína de fusão que contém a terminação-N trinta-um aminoácidos do gene fosfatase de ácido do White Lupin Lupinus albus (GENBANK® ID GL 14276838, Miller et ah, 2001, supracitado) fundida à terminaçã-N da sequência de aminoácidos da invenção, assim como a sequência KDEL (SEQ ID NO:75) na terminação-C. Assim, a proteína resultante é previstas para ser alvo do retículo endoplásmico da planta pela expressão em uma célula vegetal.

[00151] Os cassetes de expressão de planta descritos acimasão combinados com um marcador selecionável de planta apropriado para auxiliar na seleção de células e tecidos transformados e ligados a vetores de transformação de planta. Esses podem incluir vetores binários de transformação mediada por Agrobacterium ou vetores plasmídeos simples para transformação biolística ou aerosol.

EXEMPLO 5. TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[00152] Transformação de soja é alcançada pelo uso de métodos bastante conhecidos na técnica, tais como o descrito pelo uso de explantes de meia semente de soja transformados por mediação de Agrobacterium tumefaciens que usa essencialmente o método descrito por Paz et al. (2006), Plant cell Rep. 25:206 Transformantes são identificados pelo uso de tembotriona como marcador de seleção. A aparência de mudas verdes foi observada e documentada como um indicator de tolerância ao herbicida isoxaflutol ou tembotriona. As mudas transgênicas tolerantes mostrarão esverdeamento normal em comparação com mudas de soja do tipo selvagem não tratadas com isoxaflutol ou tembotriona, enquanto mudas de soja do tipo selvagem tratadas com a mesma quantidade de isoxaflutol ou tembotriona serão completamente esbranquiçadas. Isso indica a presença da proteína HPPD permite a tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, como isoxaflutol ou tembotriona.

[00153] As mudas verdes tolerantes são transferidas para o meio de enraizamento ou enxertados. Plântulas com raiz são transferidas para a estufa após o período de aclimatação. Plantas que contêm o transgene são então aspergidas com herbicidas inibidores de HPPD, como por exemplo tembotriona em uma taxa de 100g Al/ha ou mesotrione com uma taxa de 300g Al/ha suplementada com óleo de canola de amônio sulfato metil éster. Dez dias depois da aplicação os sintomas do herbicida são avaliados e comparados aos sintomas observados nas plantas do tipo selvagem sobre as mesmas condições.

EXEMPLO 6: ALGODÃO PARA ESTABELECIMENTO ESELEÇÃO DE PLANTA.

[00154] Transformação de algodão é alcançada com o uso de métodos bastante conhecidos na técnica, especialmente método preferencial descrito do Documento de Patente WO 00/71733. Plantas regeneradas são transferidas para a estufa. Em seguida do período de aclimatação, plantas suficientemente cultivadas são aspergidas com herbicidas inibidores de HPPD como por exemplo tembotriona equivalente a 100 ou 200 gAI/ha suplementado com óleo de canola amônio sulfato e metil ester. Sete dias depois da aplicação da aspersão, os sintomas devido ao tratamento com o herbicida são avaliados e comparados aos sintomas observados em plantas de algodão do tipo selvagem submetidas ao mesmo tratamento sobre as mesmas condições.

EXEMPLO 7. TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS DE MILHO COM OS GENES DE PROTEÍNA DE PESTICIDA DESCRITOS NO PRESENTE DOCUMENTO

[00155] Espigas de milho são mais bem colhidas entre 8 e 12 dias após polinização. Embriões são isolados das espigas e aqueles embriões com 0,8 a 1,5 mm de tamanho são preferenciais para o uso na transformação. Embriões são laminados com a escutelária para cima em um meio de incubação adequado, tal como meio DN62A5S (3,98 g/l N6 sais; 1 ml/l (de 100x de estoque) N6 Vitaminas; 800 mg/l L-Asparagina; 100 mg/l Mio-inositol; 1,4 g/l L-Prolina; 100 mg/l Casaminoácidos; 50 g/l sacarose; 1 ml/l (de 1 mg/mL de estoque) 2,4-D). Contudo, meio e sais em vez de DN62A5S são adequados e são conhecidos na técnica. Embriões são incubados durante uma noite a 25 °C no escuro. Contudo, não é necessário por si encubar os embriões durante uma noite.

[00156] Os explantes resultantes são transferidos para unir quadrados (30 a 40 por placa), transferidos em meio osmótico por cerca de 30 a 45 minutos, depois transferidas para uma placa para irradiação (consultar, por exemplo, Publicação PCT WO/0138514 e a Patente no U.S. 5.240.842).

[00157] Construtos de DNA projetados para os genes da invenção em células vegetais são acelerados para tecido de planta usando um acelerador de feixe de aerosol, usando condições essencialmente conforme descrito na Publicação PCT no WO/0138514. Após a irradiação, os embriões são incubados por cerca de 30 minutos em meio osmótico e colocados em meio de incubação durante uma noite a 25 °C no escuro. Para evitar danos desnecessários em explantes irradiados, os mesmos são incubados por pelo menos 24 horas antes de serem transferidos para meio de recuperação. Embriões são então espalhados em meio de período de recuparação, por cerca de 5 dias, 25 °C no escuro, depois transferidas a um meio de seleção. Os explantes são incubados em meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, caule resultante é transferido para meio de maturação de embrião, até que a formação de embriões somáticos maduros seja observada. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sobre luz baixa e o processo de regeneração é iniciado pelos métodos conhecidos na técnica. Permite-se que as mudas resultantes enraízem em meio de enraizamento e as plantas resultantes são transferidas para potes de brotos e propagadas como plantas transgênicas.

MATERIAIS

[00158] Meio DN62A5S

[00159] O pH da solução é ajustado para pH 5,8 com IN KOH/1N KC1, Gelrite (Sigma) é adicionado em uma concentração de até 3 g/l e o meio é autoclavado. Após resfriamento a 50 °C, 2 ml/L de um estoque de 5 mg/ml de solução de nitrato de prata (Phytotechnology Labs) é adicionado.

EXEMPLO 8. TRANSFORMAÇÃO DE GENES DA INVENÇÃO EM CÉLULAS VEGETAIS POR TRANSFORMAÇÃO MEDIADA POR AGROBACTERIUM

[00160] Espigas de milho são melhor colhidas entre 8 e 12 dias após polinização. Embriões são isolados das espigas e aqueles embriões com 0,8 a 1,5 mm de tamanho são preferenciais para o uso na transformação. Embriões são laminados com escutelária para cima em um meio de incubação adequado e incubado por uma noite a 25 °C no escuro. Contudo, não é necessário por si encubar os embriões durante uma noite. Embriões são colocados em contato com uma cepa de Agrobacterium que contêm os vetores apropriados para transferência mediada por plasmídeo Ti por cerca de 5 a 10 min e depois laminados em meio de cocultivo por cerca de 3 dias (22 °C no escuro). Após o cocultivo, os explantes são transferidos para meio de período de recuparação por 5 a 10 dias (a 25 °C no escuro). Os explantes são incubados em meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, caule resultante é transferido para meio de maturação de embrião, até que a formação de embriões somáticos maduros seja observada. Os embriões somáticos resultantes são então laminados sobre baixa luz e o processo de regeneração é iniciado conforme conhecido na técnica.

EXEMPLO 9. TRANSFORMAÇÃO DE ARROZ

[00161] Sementes de arroz imaturas que contêm embriões no estágio de desenvolvimento certo são colhidas de plantas de doação cultivadas sobre condições de cavidade controladas na estufa. Após a esterilização das sementes, embriões imaturos são extirpados e preinduzidos em um meio sólido por 3 dias. Após a preindução, os embriões são imersos por vários minutos em uma suspensão de Agrobacterium que abriga vetores desejados. Os embriões são cocultivados em um meio sólido que contém acetosiringone e incubados no escuro por 4 dias. Os explantes são então transferidos para um primeiro meio seletivo que contêm fosfofinotricina como agente seletivo. Após aproximadamente 3 semanas, scutella com calli que se desenvolvem são cortadas em diversos pedaços pequenos e transferidas para o mesmo meio seletivo. Subculturas subsequentes são realizadas aproximadamente a cada 2 semanas. Em cada subcultura, calli que cresce ativamente são cortados em pedaços menores e incubados em um segundo meio seletivo. Após diversas semanas calli claramente resistente a fosfofinotricina são transferidos para um meio de regeneração seletivo. Plântulas geradas são cultivadas em meia força MS para completo alongamento. As plantas são eventualmente transferidas para o solo e cultivadas na estufa.

[00162] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível daqueles versados na técnica à qual essa invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente estão aqui incorporados, a título de referência na mesma extensão como se cada publicação individual o pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada a título de referência.

[00163] Apesar da invenção descrita aqui ter sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações.

Claims

1. Molécula de ácido nucleico recombinante caracterizada por compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos que tem atividade pesticida contra uma ou mais pragas, incluindo membros das ordens Lepidoptera e Díptera, em que a referida sequência de nucleotídeos consiste na SEQ ID NO: 18 e é ligada de modo operável a um promotor que tem capacidade de direcionar a expressão da referida sequência de nucleotídeos em uma célula vegetal.

2. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico utiliza códons de células hospedeiras para expressão melhorada.

3. Cassete de expressão caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico recombinante, conforme definida na reivindicação 1.

4. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo.

5. Célula hospedeira de bactéria caracterizada por conter o ácido nucleico recombinante, conforme definido na reivindicação 1.

6. Polipeptídeo recombinante com atividade pesticida contra uma ou mais pragas, incluindo membros das ordens Lepidoptera e Díptera, o polipetídeo caracterizado por consistir na SEQ ID NO: 68, em que o polipeptídeo recombinante ainda compreende sequências de aminoácidos heterólogas.

7. Composição caracterizada por compreender o polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 6, e carreadores, surfactantes ou adjuvantes promotores de aplicação agriculturalmente aceitáveis.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida composição:(a) é selecionada a partir do grupo que consiste em um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide e solução;(b) é preparada por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células bacterianas; ou (c) compreende de 1% a 99% em peso do dito polipeptídeo.

9. Método para controlar uma população de praga de lepidópteros ou dípteros caracterizado por compreender colocar a dita população em contato com uma quantidade eficaz de pesticida do polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 6, em que o referido contato é um dentre aplicação de folha, revestimento de semente e aplicação de solo.

10. Método para matar uma praga de lepidópteros ou dípteros caracterizado por compreender colocar a dita praga em contato com, ou alimentar a dita praga com uma quantidade eficaz de pesticida do polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 6, em que o referido contato é um dentre aplicação de folha, revestimento de semente e aplicação de solo.

11. Método para produzir um polipeptídeo com atividade pesticida contra uma ou mais pragas, incluindo membros das ordens Lepidoptera e Díptera, o método caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira de bactéria, conforme definida na reivindicação 5, sob condições nas quais a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo é expressa, em que as referidas condições compreendem inocular a referida colônia de células hospedeiras bacterianas em meio LB a 37 °C até a fase logarítmica e induzir com IPTG 0,5 mM a 20°C por 18 horas.

12. Método para proteger uma planta contra uma praga caracterizado por compreender as etapas de:a) isolar os genes de bactérias;b) clonar os genes em um vetor para expressão em plantas; ec) transformar as plantas com o referido vetor de expressão;d) expressar em uma planta ou célula da mesma uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo pesticida, em que a dita sequência de nucleotídeos consiste na SEQ ID NO: 18; em que a planta produz um polipeptídeo pesticida que tem atividade pesticida contra uma ou mais pragas, incluindo membros das ordens Lepidoptera e Díptera.

13. Método para aumentar o rendimento em uma planta caracterizado por compreender as etapas de:a) isolar os genes de bactérias;b) clonar os genes em um vetor para expressão em plantas; ec) transformar as plantas com o referido vetor de expressão; d) cultivar em um campo uma planta ou uma semente da mesma que tem incorporado de modo estável no genoma da mesma um constructo de DNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que consiste na SEQ ID NO: 18 que codifica uma proteína que tem atividade pesticida contra uma ou mais pragas, incluindo membros das ordens Lepidoptera e Díptera,em que o dito campo é infestado com uma praga contra a qual o dito polipeptídeo tem atividade pesticida.