KR20180012278A - 노린재목 해충에 대한 저항성을 부여하는 스레드(thread) 핵산 분자 - Google Patents

노린재목 해충에 대한 저항성을 부여하는 스레드(thread) 핵산 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 노린재목 해충에서 타겟 코딩 및 전사된 비-코딩 서열의 RNA 간섭-매개 억제를 통해 노린재목 해충을 방제하기 위한 핵산 분자 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 노린재목 해충의 방제에 유용한 핵산 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물을 제조하는 방법, 및 이에 의해 수득된 식물 세포 및 식물에 관한 것이다.

Description

노린재목 해충에 대한 저항성을 부여하는 스레드(THREAD) 핵산 분자
관련 특허 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 5월 27일 출원된 미국 가출원 제62/166,985호의 우선권 및 이의 이익을 주장한다. 상기 확인된 출원들 전부의 전체 개시내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록의 참조
서열 목록의 공식 사본은 EFS-Web 을 통해 ASCII 형식의 서열 목록으로, 2016년 5월 13일에 생성되었으며 그 크기는 28 킬로바이트인, 파일 명칭이 "75883-WO-PCT_20160523_Priority_Sequence_Listing_as_filed_20150527”이라는 파일 명칭으로 전자 방식으로 제출되며 명세서와 동시에 제출된다. 이 ASCII 형식의 문서에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이며, 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 일반적으로 노린재목(hemipteran) 해충에 의해 야기되는 식물 피해의 유전적 방제에 관한 것이다. 특정한 구현예에서, 본 발명은 타겟 코딩 및 비-코딩 서열의 식별, 및 노린재목 해충의 세포에서의 타겟 코딩 및 비-코딩 서열의 발현을 전사후 저해하거나 발현을 억제하여 식물 보호 효과를 제공하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용에 관한 것이다.
노린재(stink bug) 및 다른 노린재목: 노린재목 곤충은 중요한 농업상 해충 복합체를 포함한다. 전세계적으로 50 종이 넘는 밀접하게 관련된 노린재 종이 작물 피해를 유발하는 것으로 알려져 있다. McPherson & McPherson, R.M. (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico CRC Press. 이러한 곤충은 메이즈 (maize), 대두, 목화, 과일, 채소 및 곡류를 포함한 수많은 중요한 작물에 존재한다. 신열대 갈색 노린재인 유쉬스투스 헤로스, 적색-줄무늬 노린재인 피에조도루스 구일디니이, 썩덩나무 노린재인 할리오모르파 할리스, 및 남부 녹색 노린재인 네자라 비리둘라가 특히 관심사이다. 이러한 해충은 미국에서만 매년 수 백만 달러의 농작물 피해를 야기한다.
노린재는 성충 단계에 도달하기 전에 다수의 약충기(nymph stage)를 거친다. 알에서 성충으로의 발달 기간은 약 30-40일이다. 다수의 세대는 유의한 곤충 압력을 야기하는 온난 기후에서 일어난다.
약충 및 성충 둘 다 이들이 구강외 조직 소화 및 괴사를 유발하는 소화 효소를 또한 주사하는 연부 조직으로부터 수액을 섭식한다. 이어서, 소화된 식물 물질 및 영양분이 섭취된다. 식물 관다발계로부터의 물 및 영양분의 고갈은 식물 조직 피해를 야기한다. 발달 중인 곡식 및 종자에 대한 피해는 수확량 및 발아가 유의하게 감소되므로 가장 유의하다.
노린재목 곤충의 현행 관리는 개별 재배지 기준으로 살곤충제 처리에 의존한다. 따라서, 진행 중인 작물 손실을 최소화하는 대안적인 관리 전략이 긴급히 필요하다.
RNA 간섭 (RNAi)은 내인성 세포 경로를 이용하는 과정이며, 이에 의해 타겟 유전자의 전부, 또는 적절한 크기의 임의의 부분에 특이적인 간섭 RNA (iRNA) 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)는 그에 의해 코딩되는 mRNA의 분해를 야기한다. 최근 수년간, RNAi는 수많은 종 및 실험 시스템; 예를 들어 카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 식물, 곤충 배아 및 조직 배양의 세포에서 유전자 "녹다운(knockdown)"을 수행하는데 사용되었다. 예를 들어, Fire 등 (1998) Nature 391:806-811; Martinez 등 (2002) Cell 110:563-574; McManus 및 Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747을 참조한다.
RNAi는 다이서(DICER) 단백질 복합체를 포함한 내인성 경로를 통해 mRNA의 분해를 달성한다. DICER는 긴 dsRNA 분자를, 소형 간섭 RNA (siRNA)로 불리는, 대략 20개의 뉴클레오티드의 짧은 단편으로 절단한다. siRNA는 2개의 단일-가닥 RNA: 운반자 가닥(passenger strand) 및 가이드 가닥(guide strand)으로 풀린다. 운반자 가닥은 분해되고, 가이드 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 혼입된다. 마이크로 저해 리보핵산 (miRNA) 분자가 RISC에 유사하게 혼입될 수 있다. 가이드 가닥이 mRNA 분자의 상보적 서열에 특이적으로 결합하고, RISC 복합체의 촉매 성분인 아르고노트(Argonaute)에 의한 절단을 유도할 때, 전사후 유전자 침묵이 일어난다. 이 과정은, 예컨대 식물, 선충류 및 일부 곤충 같은 일부 진핵생물에서는 초기에 siRNA 및/또는 miRNA의 농도가 제한됨에도 불구하고, 유기체 전반에 걸쳐 전신 확산되는 것으로 공지되어 있다.
siRNA 및/또는 miRNA에 상보적인 전사물 만 절단되고 분해되며, 따라서 mRNA 발현의 녹다운은 서열 특이적이다. 식물에는, DICER 유전자의 여러 가지 작용기가 존재한다. RNAi의 유전자 침묵 효과는 수일 동안 지속되며, 실험 조건 하에서, 타겟화된 전사물의 90% 이상이 감소할 수 있고, 결과적으로 대응하는 단백질의 수준이 감소할 수 있다.
예컨대, 유쉬스투스 헤로스 (파브르) (신열대 갈색 노린재, “BSB”), 네자라 비리둘라 (L.) (남부 녹색 노린재), 피에조도루스 구일디니이 (웨스트우드) (적색-줄무늬 노린재), 할리오모르파 할리스 (Stal) (썩덩나무노린재), 키나비아 힐라레 (세이) (녹색 노린재), 유쉬스투스 세르부스 (세이) (갈색 노린재), 디켈롭스 멜라칸투스 (달라스), 디켈롭스 푸르카투스 (F.), 에데사 메디타분다 (F.), 티안타 페르디토르 (F.) (신열대 적색 어깨 노린재), 키나비아 마르기나툼 (팔리소 드 보부아), 호르시아스 노빌렐루스 (베르그) (목화 벌레), 타에디아 스티그모사 (베르그), 디스데르쿠스 페루비아누스 (구에린-메네빌), 네오메갈로토무스 파르부스 (웨스트우드), 렙토글로수스 조나투스 (달라스), 니에스트레아 시다에 (F.), 리구스 헤르페루스 (나이트) (서부 변색 장님노린재), 및 리구스 리네올라리스 (팔리소 드 보부아)를 포함하여, 노린재목 해충의 방제를 위한, 핵산 분자(예컨대, 타겟 유전자, DNA, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA), 및 이의 사용 방법이 본원에 개시된다. 특정한 예에서, 노린재목 해충에서의 하나 이상의 천연(native) 핵산 중 적어도 일부에 대해 상동일 수 있는 예시적인 핵산 분자가 개시된다.
이들 및 추가의 예에서, 천연 핵산은 타겟 유전자일 수 있고, 그의 산물은 예를 들어, 제한하지 않고: 대사 과정에 수반되거나; 생식 과정에 수반되거나 약충 발생에 수반될 수 있다. 일부 예에서, 타겟 유전자의 발현을 그에 상동인 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 번역후 억제하는 것은 노린재목 해충에서 치명적일 수 있거나, 그의 성장 및/또는 생식을 감소시킬 수 있다. 특정한 예에서, 세포 사멸 계열의 단백질 억제제(IAP)(본원에서 스레드(thread)로 지칭됨)로 이루어진 유전자는 전사후 침묵을 위한 타겟 유전자로서 선택될 수 있다. 특정한 예에서, 전사 후 억제에 유용한 타겟 유전자는 본원에서 스레드로 지칭되는 신규한 유전자이다. 스레드 (서열번호 1)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 스레드 (서열번호 1)의 상보체; 및 전술된 임의의 단편이 따라서 본원에 개시된다.
또한, 타겟 유전자 산물 (예를 들어, 스레드로 지칭되는 유전자의 산물) 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 개시된다. 예컨대, 핵산 분자는 서열번호 2의 아미노산 서열(스레드 단백질)에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특정한 예에서, 핵산 분자는 스레드 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가로, 타겟 유전자 산물 내의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 역 상보체인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 개시된다.
또한, 노린재목 해충 타겟 유전자, 예를 들어 스레드 유전자의 전부 또는 일부에 상보적인 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA 서열이 개시된다. 특정한 구현예에서, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA는 유전자-변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관 내 또는 생체 내에서 생산될 수 있다. 특정한 예시에서, 스레드 (서열번호 1)의 전부 또는 일부에 상보적인 iRNA 분자를 생산하는데 사용될 수 있는 cDNA 분자가 개시된다.
또한 노린재목 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단, 및 노린재목 해충 저항성을 식물에게 제공하기 위한 수단이 개시된다. 노린재목 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단은 서열번호 3 (유쉬스투스 헤로스 스레드 영역 1, 본원에서 종종 BSB_스레드-1로 지칭됨), 또는 서열번호 4 (유쉬스투스 헤로스 스레드 영역 2, 본원에서 종종 BSB_스레드-2로 지칭됨), 또는 이의 상보체 중 적어도 하나로 이루어진 단일- 또는 이중 가닥 RNA 분자이다. 노린재목 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단의 기능적 등가물은 서열번호1을 포함하는 BSB 유전자의 전부 또는 일부에 실질적으로 상동인 단일- 또는 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다. 노린재목 해충 저항성을 식물에게 제공하기 위한 수단은 프로모터에 작동가능하게 연결된 노린재목 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하기 위한 수단을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA 분자이며, 여기서 DNA 분자는 메이즈 식물의 게놈 내로 편입될 수 있다.
노린재목 해충 내에서 생물학적 기능을 저해하기 위해 노린재목 해충에 의해 섭취될 때 기능하는 iRNA(예컨대, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자를 노린재목 해충에 제공하는 것을 포함하여, 노린재목 해충 집단의 방제 방법이 개시되어 있으며, 이때, 상기 iRNA 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 전체 또는 일부분을 포함한다: 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 4; 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 상보체; 임의의 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 전체 또는 이의 부분을 포함하는 노린재목 유기체(예컨대)의 천연 코딩 서열; 임의의 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 전체 또는 이의 부분을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 임의의 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 전체 또는 이의 부분을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사된 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열; 및 임의의 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 전체 또는 이의 부분을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사된 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체.
또한, 먹이-기반 검정에서 또는 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA를 발현하는 유전자-변형된 식물 세포에서, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA가 노린재목 해충에게 제공될 수 있는 방법이 본원에 개시된다. 이들 및 추가의 예에서, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA는 노린재목 해충의 약충에 의해 섭취될 수 있다. 이어서, 본 발명의 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA의 섭취는 약충에서 RNAi를 발생시킬 수 있고, 그 결과 노린재목 해충의 생존력에 필수적인 유전자의 침묵을 초래할 수 있고, 궁극적으로는 약충이 치사에 이르게 할 수 있다. 따라서, 노린재목 해충 방제에 유용한 예시적인 핵산 서열(들)을 포함하는 핵산 분자가 노린재목 해충에게 제공되는 방법이 개시된다. 특정 예시에서, 본 발명의 핵산 분자의 사용에 의해 방제된 노린재목 해충은 유쉬스투스 헤로스, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 네자라 비리둘라, 키나비아 힐라레, 유쉬스투스 세르부스, 디켈롭스 멜라칸투스, 디켈롭스 푸르카투스, 에데사 메디타분다, 티안타 페르디토르, 키나비아 마르기나툼, 호르시아스 노빌렐루스, 타에디아 스티그모사, 디스데르쿠스 페루비아누스, 네오메갈로토무스 파르부스, 렙토글로수스 조나투스, 니에스트레아 시다에, 및 리구스 리네올라리스일 수 있다. 상기 특색 및 다른 특색이 여러 구현예에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이고, 이는 첨부된 도 1 및 도 2를 참조로 진행된다.
도 1은 단일 전사 주형으로부터 dsRNA를 생산하는 전략을 그림으로 나타낸 것이다.
도 2는 2개의 전사 주형으로부터 dRNA를 생산하는 전략을 그림으로 나타낸 것이다.
서열 목록
첨부된 서열 목록에 열거된 핵산 서열은 37 C.F.R. §1.822에서 규정된 바와 같은, 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다. 각 핵산 서열의 단지 한 가닥만이 제시되지만, 제시된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 상보적 가닥이 포함되는 것으로 이해된다. 첨부된 서열 목록에서:
서열번호 1은 신열대 갈색 노린재 (유쉬스투스 헤로스)로부터의 BSB 스레드 전사물의 예시적인 DNA 서열을 나타낸다.
서열번호 2는 유쉬스투스 헤로스 스레드 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 3은 시험관 내 dsRNA 합성에 사용되는 유쉬스투스 헤로스로부터의 BSB_스레드-1의 DNA 서열을 나타낸다 (5’및 3’말단에서의 T7 프로모터 서열은 도시되지 않음).
서열번호 4는 시험관 내 dsRNA 합성에 사용되는 유쉬스투스 헤로스로부터의 BSB_스레드-2의 DNA 서열을 나타낸다 (5’및 3’말단에서의 T7 프로모터 서열은 도시되지 않음).
서열번호 5는 T7 파지 프로모터의 DNA 서열을 나타낸다.
서열번호 6 내지 9는 BSB_스레드-1 및 BSB_스레드-2를 포함하는 유쉬스투스 헤로스 스레드 서열로부터 일부를 증폭하기 위해 사용된 프라이머를 나타낸다.
서열번호 10은 pDAB119611에서 발견되는 것과 같은 BSB 스레드 헤어핀 v1-RNA-형성 서열을 나타낸다. 대문자 염기는 스레드 센스 가닥이고, 밑줄친 소문자 염기는 ST-LS1 인트론을 포함하고, 밑줄치지 않은 소문자 염기는 스레드 안티센스 가닥이다.
GGAGACCTGGAGATGATCCAATGAATGACCATGTTCGTTGGTCTGGTGGATGTCCATTTGTAAATAAAGAACCCGTTGGCAACATTCCTCTAGAAAATGATGATGATGACCACTCTTCTGATAGAGACTCTGGTTTTGATACTTGTGGGCCTTTTAGTCTACAAATCCAGAGTTGTGGAGATAAGACGGCTCTTGCAGAAGATCCCAAAATATTGGAAAGCCCTAATTTTTTGAAGgactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatgagctcacttcaaaaaattagggctttccaatattttgggatcttctgcaagagccgtcttatctccacaactctggatttgtagactaaaaggcccacaagtatcaaaaccagagtctctatcagaagagtggtcatcatcatcattttctagaggaatgttgccaacgggttctttatttacaaatggacatccaccagaccaacgaacatggtcattcattggatcatctccaggtctcc
서열번호 11은 pDAB119612에서 발견되는 BSB 스레드 헤어핀 v4-RNA-형성 서열을 나타낸다. 대문자 염기는 스레드 센스 가닥이고, 밑줄친 소문자 염기는 ST-LS1 인트론을 포함하고, 밑줄치지 않은 소문자 염기는 스레드 안티센스 가닥이다.
TTCGTCTCCTGAGAACCAGTTGAGAAATATTCAATCTCTAGTCAAAAGAGAGTTAACACAAGAAAGTGTGCACGAGAAAAACATCCTTAAAGGCTACAGGATCTATGGCTGGATTATTTCTATACCTTTATTATTTTAAGAATATAATTTCCAATGCCgactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatgagctcaggcattggaaattatattcttaaaataataaaggtatagaaataatccagccatagatcctgtagcctttaaggatgtttttctcgtgcacactttcttgtgttaactctcttttgactagagattgaatatttctcaactggttctcaggagacgaa
서열번호 12는 YFP-타겟화된 dsRNA의 센스 가닥이다: YFPv2
서열번호 13 내지 14는 YFP-타겟화된 dsRNA의 일부를 증폭하기 위해 사용된 프라이머를 나타낸다: YFPv2
서열번호 15는 YFP 헤어핀 서열 (YFP v2-1)을 나타낸다. 대문자 염기는 YFP 센스 가닥이고, 밑줄친 소문자 염기는 RTM1 인트론을 포함하고, 밑줄치지 않은 소문자 염기는 YFP 안티센스 가닥이다.
ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGtccggcaacatgtttgacgtttgtttgacgttgtaagtctgatttttgactcttcttttttctccgtcacaatttctacttccaactaaaatgctaagaacatggttataactttttttttataacttaatatgtgatttggacccagcagatagagctcattactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat
서열번호 16은 ST-LS1 인트론을 포함하는 서열을 나타낸다.
서열번호 17 내지 20은 dsRNA 합성을 위한 유전자 영역을 증폭시키는데 사용된 프라이머를 나타낸다.
서열번호 21은 TIP41-유사 단백질을 코딩하는 메이즈 DNA 서열을 나타낸다.
서열번호 22는 올리고뉴클레오티드 T20NV의 DNA 서열을 나타낸다.
서열번호 23 내지 27은 메이즈 전사물 수준을 측정하기 위해 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 나타낸다.
서열번호 28은 이원 벡터 백본 검출에 사용된 SpecR 코딩 영역의 부분의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 29는 게놈 카피수 분석에 사용된 AAD1 코딩 영역의 부분의 DNA 서열을 제시한다.
서열번호 30은 메이즈 인버타제 유전자의 DNA 서열을 제시한다.
서열번호 31 내지 39는 유전자 카피 수 분석을 위해 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 나타낸다.
서열번호 40 내지 42는 메이즈 발현 분석에 사용된 프라이머 및 프로브를 제시한다.
서열번호 43은 pDAB101992에서 발견되는 YFP 단백질 코딩 서열을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
I. 몇몇 구현예의 개관
노린재목 해충 침입의 유전적 방제를 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 노린재목 해충 집단의 RNAi-매개 방제를 위한 타겟 유전자로서 사용하기 위한, 노린재목 해충의 생활주기에 필수적인 하나 이상의 유전자(들)를 식별하는 방법이 또한 제공된다. 하나 이상의 dsRNA 분자를 코딩하는 DNA 플라스미드 벡터는 성장, 생존, 발생 및/또는 생식에 필수적인 하나 이상의 타겟 유전자(들)를 억제하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 노린재목 해충에서의 타겟 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자를 통해 타겟 유전자의 발현을 전사후 저해하거나 또는 타겟 유전자를 억제하는 방법이 제공된다. 이들 및 추가 구현예에서, 노린재목 해충은 타겟 유전자의 코딩 또는 비-코딩 서열에 상보적인 핵산 분자의 전부 또는 일부로부터 전사되는 하나 이상의 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA 분자를 섭취할 수 있고, 이에 의해 식물-보호 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 일부 구현예는 타겟 유전자(들)의 코딩 및/또는 비-코딩 서열에 상보적인 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및/또는 hpRNA를 사용하여, 타겟 유전자 산물의 발현을 서열 특이적으로 억제해서 노린재목 해충의 적어도 부분적인 방제를 달성하는 것을 수반한다. 예를 들어, 서열번호 1, 3, 4 및 그의 단편 중 하나에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 일련의 단리 및 정제된 핵산 분자가 개시된다. 일부 구현예에서, 안정화된 dsRNA 분자는 타겟 유전자의 전사후 침묵 또는 억제를 위해, 이러한 서열, 그의 단편 또는 이러한 서열 중 하나를 포함하는 유전자로부터 발현될 수 있다. 소정의 구현예에서, 단리 및 정제된 핵산 분자는 서열번호 1의 전부 또는 일부를 포함한다. 다른 구현예에서, 단리 및 정제된 핵산 분자는 서열번호 3의 전부 또는 일부를 포함한다. 추가의 구현예에서, 단리 및 정제된 핵산 분자는 서열번호 4의 전부 또는 일부를 포함한다.
일부 구현예는 적어도 하나의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자(들)를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 DNA 서열을 그의 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포)를 수반한다. 특정한 구현예에서, dsRNA 분자(들)는 노린재목 해충에 의해 섭취되었을 때 생산되어 노린재목 해충에서의 타겟 유전자를 전사후 침묵시키거나 또는 그의 발현을 억제할 수 있다. 재조합 DNA 서열은, 예컨대 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 4 중 임의의 하나 이상; 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 4 중 임의의 단편; 또는 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 4 중 하나 이상을 포함하는 유전자의 부분 서열; 또는 이의 상보체를 포함할 수 있다.
특정 구현예는 서열번호 1 전부 또는 부분을 포함하는 적어도 하나의 iRNA(예컨대, dsRNA) 분자를 코딩하는 재조합 DNA 서열을 그의 게놈에 갖는 재조합 숙주 세포를 포함한다. 노린재목 해충에 의해 섭취되었을 경우, iRNA 분자는 노린재목 해충에서 서열번호 1을 포함하는 타겟 유전자의 발현을 침묵화하거나 억제할 수 있고, 따라서 노린재목 해충에서 성장, 발생, 생식, 및/또는 섭식의 중지를 야기한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 dsRNA 분자를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 DNA를 그의 게놈 내에 갖는 재조합 숙주 세포는 형질전환된 식물 세포일 수 있다. 일부 구현예는 이러한 형질전환된 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물을 수반한다. 이러한 트랜스제닉 식물에 더하여, 각각의 것이 재조합 DNA(들)를 포함하는 것인, 임의의 트랜스제닉 식물 세대의 자손 식물, 트랜스제닉 종자 및 트랜스제닉 식물 산물이 모두 제공된다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 이들 및 다른 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 트랜스제닉 식물 세포로부터 단리될 수 있다. 특정한 구현예에서, 트랜스제닉 식물은 옥수수 (제아 메이스), 대두 (글리신 맥스), 목화 (고시피움 속), 및 포아세아에 과의 식물을 포함하는 군으로부터 선택되는 식물이다.
일부 구현예는 노린재목 해충 세포에서의 타겟 유전자의 발현을 조정하는 방법을 수반한다. 이들 및 다른 구현예에서, dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공될 수 있다. 특정한 구현예에서, dsRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 이는 또한 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정한 구현예에서, 노린재목 해충 세포에서의 타겟 유전자의 발현을 조정하는 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다: (a) dsRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계; (b) 복수의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물이 발생하도록 하는데 충분한 조건 하에 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계; (c) 벡터가 게놈 내로 편입된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계; 및 (d) 선택된 형질전환된 식물 세포가, 벡터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는지 여부를 결정하는 단계. 식물은, 그의 게놈 내에 벡터가 편입되어 있고 벡터의 뉴클레오티드에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함하는 식물 세포로부터 재생될 수 있다.
따라서, dsRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터가 그으 게놈 내에 편입되어 있는 트랜스제닉 식물이 또한 개시되며, 여기서, 트랜스제닉 식물은 벡터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 dsRNA 분자를 포함한다. 특정한 구현예에서, 식물에서 dsRNA 분자의 발현은, 예를 들어, 식물의 부분 (예컨대, 뿌리) 또는 형질전환된 식물 세포 상에서 섭식에 의해 형질전환된 식물 또는 식물 세포와 접촉하는 노린재목 해충의 세포에서 타겟 유전자의 발현을 조정하는데 충분하다. 본원에 개시된 트랜스제닉 식물은 노린재목 해충 침입에 대한 저상성 및/또는 증진된 내성을 나타낼 수 있다. 특정한 트랜스제닉 식물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 딱정벌레류 및/또는 노린재목 해충(들)에 대한 저항성 및/또는 증진된 내성을 나타낼할 수 있다: 유쉬스투스 헤로스, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 네자라 비리둘라, 키나비아 힐라레, 유쉬스투스 세르부스, 디켈롭스 멜라칸투스, 디켈롭스 푸르카투스, 에데사 메디타분다, 티안타 페르디토르, 키나비아 마르기나툼, 호르시아스 노빌렐루스, 타에디아 스티그모사, 디스데르쿠스 페루비아누스, 네오메갈로토무스 파르부스, 렙토글로수스 조나투스, 니에스트레아 시다에, 리구스 헤르페루스, 및 리구스 리네올라리스.
또한 방제제, 예컨대 iRNA 분자를 노린재목 해충에게 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 이러한 방제제는 직접 또는 간접적으로, 노린재목 해충이 섭식, 성장할 수 있는 능력에 장애를 유발할 수 있거나 또는 다르게는 숙주에 피해를 유발할 수 있다. 일부 구현예에서, 안정화된 dsRNA 분자를 노린재목 해충에게 전달해서 노린재목 해충에서의 적어도 하나의 타겟 유전자를 억제함으로써, 노린재목 해충에 의한 식물 피해를 감소 또는 제거하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 노린재목 해충에서의 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법은 노린재목 해충에서의 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 중지시키도록 야기할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 결국 노린재목 해충의 사멸을 초래한다.
일부 구현예에서, 노린재목 해충 침입을 제거 또는 감소시키는 것을 달성하기 위해 식물, 동물, 및/또는 식물 또는 동물의 환경에서 사용하기 위한 본 발명의 iRNA (예를 들어, dsRNA) 분자를 포함하는 조성물 (예를 들어, 국소 조성물)이 제공된다. 특정한 구현예에서, 조성물은 노린재목 해충에게 섭식될 영양 조성물 또는 먹이원일 수 있다. 일부 구현예는 노린재목 해충에게 이용가능한 영양 조성물 또는 먹이원을 제조하는 것을 포함한다. iRNA 분자를 포함하는 조성물을 섭취하게 되면 노린재목 해충의 하나 이상의 세포에 의해 흡수될 수 있고, 차례로 해충의 세포(들)에서 적어도 하나의 타겟 유전자의 발현이 억제될 수 있다. 본 발명의 iRNA 분자를 포함하는 하나 이상의 조성물을 해충의 숙주에 제공함으로써 노린재목 해충 침입에 의한 식물 또는 식물 세포의 섭취 또는 그에 대한 피해는 노린재목 해충이 존재하는 임의의 숙주 조직 또는 환경 내 또는 그 상에서 제한되거나 제거될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 노린재목 해충에 의한 피해를 방제하기 위한 다른 방법 및 조성물과 함께 조합되어 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 노린재목 해충으로부터 식물을 보호하기 위한 것으로 본원에 기재된 바와 같은 iRNA 분자는 노린재목 해충에 대해 효과적인 하나 이상의 화학적 작용제, 노린재목 해충에 대해 효과적인 생물살충제, 윤작, RNAi-매개 방법 및 본 발명의 RNAi 조성물의 특징들과 상이한 특징을 나타내는 재조합 유전자 기술 (예를 들어, 노린재목 해충에게 유해한 단백질 (예컨대, 노린재목 해충에 유해한 단백질 (예컨대, Bt 독소 또는 PIP-1 폴리펩티드)의 재조합적 생산)의 추가적인 사용을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
II. 약어
dsRNA 이중-가닥 리보핵산
GI 성장 억제
NCBI 국립 생물 정보 센터
gDNA 게놈 DNA
iRNA 억제 리보핵산
ORF 오픈 리딩 프레임
RNAi 리보핵산 간섭
miRNA 마이크로 억제 리보핵산
shRNA 짧은 헤어핀 리보핵산
siRNA 소형 억제 리보핵산
hpRNA 헤어핀 리보핵산
UTR 비번역 영역
PCR 중합효소 연쇄 반응
RISC RNA-유도 침묵 복합체
BSB 신열대 갈색 노린재 (유쉬스투스 헤로스)
III. 용어
이어지는 설명 및 표들에서, 수많은 용어가 사용된다. 주어진 이러한 용어의 범주를 포함하여, 본 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다:
노린재목 해충(Hemipteran pest): 본원에 사용된 용어 "노린재목 해충"은 예를 들어, 제한하지 않고, 광범위한 숙주 식물을 섭식하며 구멍내고 빨아먹는 구강 부분을 갖는 노린재과(Pentatomidae), 장님노린재과(Miridae), 별노린재과(Pyrrhocoridae), 허리노린재과(Coreidae), 호리허리노린재과(Alydidae) 및 잡초노린재과(Rhopalidae)의 곤충을 포함한, 노린재목의 해충 곤충을 지칭한다. 특정한 예에서, 노린재목 해충은 유쉬스투스 헤로스 (파브르.) (신열대 갈색 노린재), 네자라 비리둘라 (L.) (남부 녹색 노린재), 피에조도루스 구일디니이 (웨스트우드) (적색-줄무늬 노린재), 할리오모르파 할리스 (Stal) (썩덩나무노린재), 키나비아 힐라레 (세이) (녹색 노린재), 유쉬스투스 세르부스 (세이) (갈색 노린재), 디켈롭스 멜라칸투스 (달라스), 디켈롭스 푸르카투스 (F.), 에데사 메디타분다 (F.), 티안타 페르디토르 (F.) (신열대 적색 어깨 노린재), 키나비아 마르기나툼 (팔리소 드 보부아), 호르시아스 노빌렐루스 (베르그) (목화 벌레), 타에디아 스티그모사 (베르그), 디스데르쿠스 페루비아누스 (구에린-메네빌), 네오메갈로토무스 파르부스 (웨스트우드), 렙토글로수스 조나투스 (달라스), 니에스트레아 시다에 (F.), 리구스 헤르페루스 (나이트) (서부 변색 장님노린재), 및 리구스 리네올라리스 (팔리소 드 보부아)를 포함하는 목록으로부터 선택된다.
(유기체와) 접촉: 핵산 분자에 관하여, 본원에 사용된 용어 유기체 (예를 들어, 노린재목 해충) "와 접촉하다" 또는 "에 의해 흡수되다"는 것은, 유기체 내로의 핵산 분자의 내재화, 예를 들어, 제한하지 않고: 유기체에 의한 분자의 섭취 (예를 들어, 섭식에 의함); 핵산 분자를 포함하는 조성물과 유기체를 접촉시키는 것; 및 핵산 분자를 포함하는 용액으로 유기체를 담그는 것을 포함한다.
콘티그(contig): 본원에 사용된 용어 "콘티그"는 단일 유전자 소스로부터 유래된 중첩 DNA 절편의 세트로부터 재구성되는 DNA 서열을 지칭한다.
옥수수 식물(corn plant): 본원에 사용된 용어 "옥수수 식물"은 제아 메이스 (Zea mays) (메이즈) 종의 식물을 지칭한다.
dsRNA를 코딩하는: 본원에 사용된 용어 “를 코딩하는”은 RNA 전사 산물이 분자내 dsRNA 구조 (예컨대, 헤어핀) 또는 분자간 dsRNA 구조 (예컨대, 타겟 RNA 분자와 혼성화에 의해)를 형성할 수 있는 유전자를 포함한다.
발현: 본원에 사용된, 코딩 서열 (예를 들어, 유전자 또는 트랜스젠)의 "발현"은 핵산 전사 단위(예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA 포함)의 코딩된 정보가 세포의 작동적, 비-작동적 또는 구조적 일부로 전환되는 과정을 지칭하며, 종종 단백질의 합성을 포함한다. 유전자 발현은 예컨대 유전자 발현을 증가시키거나 감소시키는 제제에 세포, 조직 또는 유기체를 노출시키는 것과 같은 외부 신호에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자 발현은 또한 DNA에서 RNA, 단백질에 이르는 임의의 경로에서 조절될 수 있다. 유전자 발현 조절은, 예컨대 전사, 번역, RNA 수송 및 가공, mRNA와 같은 중간 분자의 분해, 또는 이들이 만들어진 후에 특이적 단백질 분자의 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해, 또는 이들의 조합을 통해 작용하는 제어를 통해 발생한다. 유전자 발현은 비제한적으로, 노던(RNA) 블롯, RT-PCR, 웨스턴 (면역-) 블롯, 또는 시험관 내, 계 내 또는 생체 내 단백질 활성 검정(들)을 포함한, 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
유전 물질: 본원에 사용된 용어 "유전 물질"은 모든 유전자 및 핵산 분자, 예컨대 DNA 및 RNA를 포함한다.
억제: 본원에 사용된 용어 "억제"는 코딩 서열 (예를 들어, 유전자)에 대한 효과를 기재하는데 사용되는 경우에, 코딩 서열로부터 전사된 mRNA, 및/또는 코딩 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 산물의 세포 수준에서의 측정가능한 감소를 지칭한다. 일부 예에서, 코딩 서열의 발현은 발현이 대략적으로 제거되도록 억제될 수 있다. "특이적 억제"는 특이적 억제가 달성되는 세포에서 결과적으로 다른 코딩 서열 (예를 들어, 유전자)의 발현에는 영향을 미치지 않으면서 타겟 코딩 서열을 억제하는 것을 지칭한다.
단리하였다: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대, 핵산 또는 단백질)은 자연 발생하는 성분에 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질)으로부터, 성분이 실질적으로 분리되거나, 그를 제외하고 생산되거나 또는 그로부터 정제된 것이다. "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 또한, 상기 용어는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질 및 펩티드를 포함한다.
핵산 분자: 본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 RNA, cDNA, 게놈 DNA 및 상기한 것의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있는, 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 둘 중 하나의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 본원에서 사용된 “핵산 분자”는 “핵산”및 “폴리뉴클레오티드”와 동의어이다. 핵산 분자는 달리 명시되지 않는 한, 통상적으로 길이가 적어도 10 염기이다. 관례상, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 분자의 5' 말단에서 3' 말단으로 판독된다. 뉴클레오티드 서열의 “상보성”은 5’에서 3’으로 뉴클레오티드 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성하는 (즉, A-T/U, 및 G-C) 핵염기의 서열을 지칭한다. 핵산 서열의 “역 상보성”은 3’에서 5’으로 뉴클레오티드 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성하는 핵염기의 서열을 지칭한다.
"핵산 분자"는 예를 들어: 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA; 단일-가닥 형태의 RNA; 및 이중-가닥 형태의 RNA (dsRNA)를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 개별 단일-가닥으로서 또는 듀플렉스로 핵산의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 지칭한다. 용어 "리보핵산" (RNA)은 iRNA (억제 RNA), dsRNA (이중-가닥 RNA), siRNA (소형 간섭 RNA), mRNA (메신저 RNA), shRNA (소형 헤어핀 RNA), miRNA (마이크로-RNA), hpRNA (헤어핀 RNA), tRNA (상응하는 아실화된 아미노산이 적재된 또는 적재되지 않은 운반 RNA), 및 cRNA (상보적 RNA)를 포함한다. 용어 "데옥시리보핵산" (DNA)은 cDNA, 게놈 DNA, 및 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다. 용어 “핵산 절편”및 “뉴클레오티드 서열 절편”또는 보다 일반적으로 “절편”은 당업자에 의해 게놈 서열, 리보솜 RNA 서열, 전달 RNA 서열, 메신저 RNA 서열, 오페론 서열, 및 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 코딩하거나 코딩하기에 적합할 수 있는 보다 작은 조작된 뉴클레오티드 서열 둘 모두를 포함하는 기능적인 용어로 당업자에 의해 이해될 것이다.
올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 짧은 핵산 중합체이다. 올리고뉴클레오티드는 더 긴 핵산 절편의 절단에 의해, 또는 개별 뉴클레오티드 전구체의 중합에 의해 형성될 수 있다. 자동화된 합성기로 인해 최대 수백 개의 염기 길이의 올리고뉴클레오티드의 합성이 가능하다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있기 때문에, 이는 DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA (올리고디옥시리보뉴클레오티드)로 구성된 올리고뉴클레오티드가, DNA 및 RNA(cDNA로 역전사된) 서열의 증폭을 위한 기법인 PCR에서 사용될 수 있다. PCR에서, DNA 중합효소가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고 상보적 가닥을 복제하도록 하는 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 "프라이머"로서 지칭된다.
핵산 분자는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-자연적 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 표지, 메틸화, 유사체에 의한 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 미적재된 연결: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등; 적재된 연결: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제(intercalator): 예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등; 킬레이트제; 알킬화제; 및 변형된 연결기: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 듀플렉스, 트리플렉스, 헤어핀, 원형 및 패드록 입체형태를 포함한, 임의의 위상 입체형태를 또한 포함한다.
DNA와 관련하여 본원에 사용된 용어 "코딩 서열", "구조적 뉴클레오티드 서열" 또는 "구조적 핵산 분자"는 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓였을 때, 전사 및 mRNA를 통해, 궁극적으로는 폴리펩티드로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. RNA와 관련하여, 용어 "코딩 서열"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단의 번역 개시 코돈 및 3'-말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은, 비제한적으로 게놈 DNA; cDNA; EST; 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
게놈: 본원에 사용된 용어 "게놈"은 세포의 핵 내에서 발견되는 염색체 DNA를 지칭하고, 또한 세포의 준세포 성분 내에서 발견되는 소기관 DNA를 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, DNA 분자는 DNA 분자가 식물 세포의 게놈 내로 편입되도록 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, DNA 분자는 식물 세포의 핵 DNA 내로 편입될 수 있거나, 또는 식물 세포의 엽록체 또는 미토콘드리아의 DNA 내로 편입될 수 있다. 용어 "게놈"은, 그것이 박테리아에 적용되는 경우에는, 박테리아 세포 내의 염색체 및 플라스미드 둘 다를 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, DNA 분자는 DNA 분자가 박테리아의 게놈 내로 편입되도록 박테리아 내로 도입될 수도 있다. 이들 및 추가 구현예에서, DNA 분자는 안정적인 플라스미드로서 또는 거기에 염색체-통합될 수 있거나 또는 위치할 수 있다.
서열 동일성: 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 최대로 상응하도록 정렬하였을 때 동일한, 두 서열에서의 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 분자의 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있으며, 여기서 비교 윈도우에서의 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여, 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에서 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 윈도우에서의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 참조 서열과의 비교시 모든 위치에서 동일한 서열은 참조 서열에 대해 100% 동일하다고 말할 수 있으며, 그 반대의 경우도 그러하다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 예컨대 다음에 다양한 프로그램 또는 정렬 알고리즘이 기술되어 있다: Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman 및 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson 및 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins 및 Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins 및 Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet 등 (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang 등 (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-165; Pearson 등 (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331; Tatiana 등 (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고찰을, 예를 들어, Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410에서 확인할 수 있다.
국립 생물 정보 센터 (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul 등 (1990))은 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다)를 포함한 여러 소스로부터와 인터넷 상에서 이용가능하다. 이 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 설명은 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션 하에 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 변수로 설정된 디폴트 BLOSUM62 행렬을 사용하는 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능이 사용될 수 있다. 기준 서열에 대한 유사성이 더 큰 핵산 서열은 이러한 방법에 의해 평가되었을 때 증가하는 백분율 동일성을 나타낼 것이다
특이적으로 혼성화가능한/특이적으로 상보적인: 본원에 사용된 용어 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 핵산 분자와 타겟 핵산 분자 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 이루어지도록 하는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화는 2개의 핵산 분자의 핵산 서열 사이의 역평행 정렬의 형성을 수반한다. 이어서, 2개의 분자는 대향 가닥 상의 상응하는 염기와 수소 결합을 형성하여 듀플렉스 분자를 형성할 수 있으며, 이것이 충분히 안정적인 경우에 본 기술분야에 주지된 방법을 사용하여 검출가능하다. 핵산 분자는 특이적으로 혼성화가능하도록 그의 타겟 서열에 대해 100% 상보적이어야 할 필요는 없다. 그러나, 특이적인 혼성화를 위해 존재해야 하는 서열 상보성의 양은 사용되는 혼성화 조건의 함수이다.
특정한 정도의 엄중도를 발생시키는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 이온 강도 (특히 Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄중도를 결정할 것이다. 세척 완충액의 이온 강도 및 세척 온도가 또한 엄중도에 영향을 미친다. 특정한 엄중도를 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 Sambrook 등 (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 및 11 업데이트; 및 Hames 및 Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985에 논의되어 있다. 핵산의 혼성화에 관한 추가의 상세한 지침 및 안내는, 예를 들어, Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; 및 Ausubel 등, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing 및 Wiley-Interscience, NY, 1995 및 업데이트에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 "엄중 조건"은 혼성화 분자와, 타겟 핵산 분자 내의 상동 서열 사이에 80% 초과의 서열 미스매치가 존재하는 경우에만 혼성화가 일어나게 되는 조건을 포괄한다. "엄중 조건"은 추가로 특정한 수준의 엄중도를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "중간 정도의 엄중도" 조건은 80% 초과의 서열 미스매치(즉, 20% 미만의 미스매치를 가짐)를 갖는 분자들이 혼성화될 조건이고; "고 엄중도" 조건은 90% 초과의 미스매치(즉, 10% 미만의 미스매치를 가짐)를 갖는 서열들이 혼성화될 조건이고; "매우 고도의 엄중도" 조건은 95% 초과의 미스매치(즉, 5% 미만의 미스매치를 가짐)를 갖는 서열들이 혼성화될 조건이다.
하기는 대표적인 비제한적 혼성화 조건이다.
고 엄중도 조건 (적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출함): 16시간 동안 65℃에서 5x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 15분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 20분 동안 65℃에서 0.5x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
중간 정도의 엄중도 조건 (적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출함): 16-20시간 동안 65-70℃에서 5x-6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 5-20분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 30분 동안 55-70℃에서 1x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
비-엄중 대조군 조건 (적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 서열이 혼성화될 것임): 16-20시간 동안 실온 내지 55℃에서 6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 20-30분 동안 실온 내지 55℃에서의 2x-3x SSC 완충제 중에서의 적어도 2회 세척.
인접한 핵산 서열과 관련하여, 본원에 사용된 용어 "실질적으로 상동인" 또는 "실질적 상동성"은 엄중 조건 하에서 참조 핵산을 갖는 핵산 분자를 혼성화하는 핵산 분자에 의해 생서왼 인접 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예컨대, 서열번호 1의 참조 핵산 서열에 대해 실질적으로 상동인 서열을 갖는 핵산 분자는 엄중 조건 (예컨대, 상기 중간 정도의 엄중도 조건에 기술되어 있음) 하에 서열번호 1의 참조 핵산 서열을 갖는 핵산 분자를 혼성화하는 핵산 분자이다. 실질적으로 상동인 서열은 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 상동인 서열은 약 80% 내지 100% 서열 동일성, 예컨대 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94%; 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 및 약 100%를 가질 수 있다. 실질적 상동성의 특성은 특이적 혼성화와 밀접한 관련이 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 특이적 결합을 요망하는 조건 하에서, 예를 들어 엄중한 혼성화 조건 하에서 핵산의 비-타겟 서열에 대한 비-특이적 결합을 피하는데 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에 특이적으로 혼성화가능하다.
본원에 사용된 용어 "오르토로그(ortholog)"는 공통 조상 뉴클레오티드 서열로부터 진화하였고, 2 이상의 종에서 동일한 기능을 보유할 수 있는 2 이상의 종에서의 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 2개의 핵산 분자는 5'에서 3' 방향으로 판독된 서열의 모든 뉴클레오티드가 3'에서 5' 방향으로 판독했을 때 다른 서열의 모든 뉴클레오티드와 상보적인 경우에 "완전한 상보성"을 나타낸다고 언급된다. 참조 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은 참조 뉴클레오티드 서열의 역 상보체와 동일한 서열을 나타낼 것이다. 이들 용어 및 설명은 본 기술분야에 잘 정의되어 있으며, 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해된다.
작동가능하게 연결된(operably linked): 제1핵산 서열이 제2핵산 서열과 기능적인 관계에 있는 경우 제1뉴클레오티드 서열은 제2뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 재조합적으로 생산되었을 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 일반적으로 인접해 있고, 동일한 리딩 프레임 내에서 (예를 들어, 번역 융합된 ORF 내에서) 2개의 단백질-코딩 영역은 필요할 경우 연결될 수 있다. 그러나, 핵산은 작동가능하게 연결되기 위해 인접해 있을 필요는 없다.
조절 서열 및 코딩 서열을 참조하여 사용되는 경우에, 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열" 또는 "제어 요소"는 전사의 시기 및 수준/양, RNA 가공 또는 안정성, 또는 회합된 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 인핸서; 스템-루프 구조; 리프레서 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화 인식 서열 등을 포함할 수 있다. 특정한 조절 서열은 거기에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 특정한 조절 서열은 이중-가닥 핵산 분자의 회합된 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다.
프로모터: 본원에 사용된 용어 "프로모터"는 전사 시작점으로부터 상류에 위치할 수 있고, RNA 중합효소, 및 전사를 개시하는 다른 단백질의 인식 및 결합에 수반될 수 있는 DNA 영역을 지칭한다. 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터일 수 있다. 발생 제어 하에 있는 프로모터의 예는 소정의 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 헛물관 또는 후막조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 "조직-선호"인 것으로 지칭된다. 소정의 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적"인 것으로 지칭된다. "세포 유형-특이적" 프로모터는 주로 하나 이상 기관의 소정의 세포 유형, 예를 들어 뿌리 또는 잎의 도관 세포에서의 발현을 구동한다. "유도성" 프로모터는 환경 제어 하에 있을 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시할 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건 및 광의 존재를 포함한다. 조직-특이적, 조직-선호, 세포 유형 특이적 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에서, 또는 대부분의 세포 또는 조직 유형에서 활성일 수 있는 프로모터이다.
임의의 유도성 프로모터가 본 발명의 일부 구현예에서 사용될 수 있다. Ward 등 (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366 참조. 유도성 프로모터의 경우에, 유도제에 대한 반응으로 전사 속도가 증가한다. 예시적인 유도성 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 구리에 반응하는 ACEI 시스템 유래 프로모터; 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 대해 반응하는, 메이즈 유래 In2 유전자; Tn10 유래 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도될 수 있는, 스테로이드 호르몬 유전자 유래 유도성 프로모터 (Schena 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425).
예시적인 구성적 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 식물 바이러스 유래 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 유래 35S 프로모터; 벼 액틴 유전자 유래 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 메이즈 H3 히스톤 프로모터; 및 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조적 유전자에 대해 5'의 Xba1/NcoI 단편인, ALS 프로모터 (또는 상기 Xba1/NcoI 단편과 유사한 뉴클레오티드 서열) (미국특허 제5,659,026호).
추가로, 임의의 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터가 본 발명의 일부 구현예에서 이용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 식물은 특이적 조직에서 배타적으로 또는 우선적으로 코딩 서열의 산물을 생산할 수 있다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 종자-선호 프로모터, 예컨대 파세올린(phaseolin) 유전자 유래의 것; 잎-특이적 및 광-유도성 프로모터, 예컨대 캡(cab) 또는 루비스코(rubisco) 유래의 것; 꽃밥-특이적 프로모터, 예컨대 LAT52 유래의 것; 화분-특이적 프로모터, 예컨대 Zm13 유래의 것; 및 소포자-선호 프로모터, 예컨대 apg 유래의 것.
대두 식물: 본원에 사용된 용어 "대두 식물"은 글리신 맥스를 포함한, 종 글리신(Glycine) 종의 식물을 지칭한다.
목화 식물: 본원에 사용된 용어 "목화 식물"은 고시피움 종의 식물을 지칭한다.
형질전환: 본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질도입"은 하나 이상의 핵산 분자(들)를 세포 내로 전달하는 것을 지칭한다. 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 편입에 의해 또는 에피솜 복제에 의해, 세포에 의해 안정적으로 복제될 때 세포는 상기 세포 내로 형질도입된 핵산 분자에 의해 "형질전환된다". 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 분자가 이러한 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm 등 (1986) Nature 319:791-793); 리포펙션 (Felgner 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417); 미세주사 (Mueller 등 (1978) Cell 15:579-585); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 전달 (Fraley 등 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807); 직접 DNA 흡수; 및 미세발사체 충격 (Klein 등 (1987) Nature 327:70).
트랜스젠(transgene): 외인성 핵산 서열. 일부 예에서, 트랜스젠은 노린재목 해충에서 발견되는 핵산 분자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 dsRNA 분자의 하나 또는 둘 다의 가닥(들)을 코딩하는 서열일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 트랜스젠은 안티센스 핵산 서열일 수 있으며, 여기서 안티센스 핵산 서열의 발현은 타겟 핵산 서열의 발현을 저해한다. 일 실시예에서, 트랜스젠은 유전자 서열 (예컨대, 제초제-저항성 유전자), 산업적으로 또는 약학적으로 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업적 형질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 이들 및 다른 예에서, 트랜스젠은 트랜스젠의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)을 함유할 수 있다.
벡터: 예를 들어 형질전환된 세포를 생산하기 위해 세포 내로 도입되는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제가 가능한 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터의 예는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터는 또한 RNA 분자일 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티센스 서열, 및/또는 선택성 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환, 또는 감염시켜 세포가 벡터에 의해 암호화된 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현할 수 있도록 할 수 있다. 벡터는 선택적으로 핵산 분자를 세포 내로 진입시키는데 도움을 주는 물질(예를 들어, 리포솜, 단백질 코팅 등)을 포함한다.
수확량(yield): 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장하는 동일한 성장 지역에 있는 확인(check) 품종의 수확량에 비해 약 100% 이상의 안정화된 수확량. 특정한 구현예에서, "개선된 수확량" 또는 "수확량 개선"은 재배품종이, 동일한 시기에 동일한 조건 하에서 성장하는 작물에게 유해한 노린재목 해충을 유의한 밀도로 함유하는 동일한 성장 위치에 있는 확인 품종의 수확량에 비해 105% 내지 115% 또는 그 이상의 안정화된 수확량을 가짐을 의미한다.
구체적으로 명시 또는 암시되지 않는 한, 용어 단수 형태는 본원에 사용된 "적어도 하나"를 의미한다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 통상의 용어에 관한 정의는, 예를 들어 Lewin's Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs 등. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 확인할 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 백분율은 중량 기준이고 모든 용매 혼합물 비율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨 온도이다.
IV. 노린재목 해충 서열을 포함하는 핵산 분자
A. 개관
노린재목 해충의 방제에 유용한 핵산 분자가 본원에 기재된다. 기재된 핵산 분자는 타겟 서열 (예를 들어, 천연 유전자 및 비-코딩 서열), dsRNA, siRNA, hpRNA, shRNA, 및 miRNA를 포함한다. 예를 들어, 노린재목 해충에서의 하나 이상의 천연 핵산 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적일 수 있는 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA 분자가 일부 구현예에서 기재된다. 이들 및 추가 구현예에서, 천연 핵산(들)은 하나 이상의 타겟 유전자(들)일 수 있고, 그의 산물은 예를 들어, 제한하지 않고, 대사공정에 수반되거나; 생식 공정에 수반되거나 약충 발생에 수반될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는, 핵산 분자가 특이적으로 상보적인 적어도 하나의 천연 핵산 서열(들)을 포함하는 세포 내로 도입되었을 때, 세포에서 RNAi를 개시할 수 있고, 그 결과 천연 핵산(들)의 발현을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 예에서, 그에 특이적으로 상보적인 서열을 포함하는 핵산 분자에 의한 타겟 유전자의 발현의 감소 또는 제거는 노린재목 해충에 치명적일 수 있거나 성장 및/또는 생식의 감소를 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 노린재목 해충에서 적어도 하나의 타겟 유전자가 선택될 수 있으며, 이때, 상기 타겟 유전자는 스레드 (서열번호 1)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 구현예에서, 노린재목 해충에서 타겟 유전자가 선택되며, 이때, 상기 타겟 유전자는 스레드 (서열번호 1)를 포함하는 신규한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 타겟 유전자는 스레드(서열번호 1) 의 단백질 산물의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한 (예를 들어, 적어도 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 100% 동일한) 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자일 수 있다. 타겟 유전자는 노린재목 해충의 임의의 핵산 서열일 수 있으며, 이의 전사 후 억제는 노린재목 해충에 유해한 영향을 미치거나, 식물에 노린재목 해충에 대한 보효 효과를 제공한다. 특정한 예에서, 타겟 유전자는 서열번호 1의 신규한 뉴클레오티드 서열의 단백질 산물의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 동일한, 약 90% 동일한, 약 95% 동일한, 약 96% 동일한, 약 97% 동일한, 약 98% 동일한, 약 99% 동일한, 약 100% 동일한, 또는 100% 동일한 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자이다.
그의 발현이 노린재목 해충에서 코딩 서열에 의해 코딩되는 천연 RNA 분자의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자를 발생시키는, 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 따라 제공된다. 일부 구현예에서, 발현된 RNA 분자가 노린재목 해충에 의해 섭취된 후, 노린재목 해충의 세포에서 코딩 서열의 하향-조절이 수득될 수 있다. 특정한 구현예에서, 노린재목 해충의 세포에서 코딩 서열의 하향-조절은 노린재목 해충의 성장, 생존력, 증식, 및/또는 생식에 대한 유해한 영향을 야기할 수 있다.
일부 구현예에서, 타겟 서열은 전사된 비-코딩 RNA 서열, 예컨대 5'UTR; 3'UTR; 스플라이싱된 리더 서열; 인트론 서열; 아우트론 서열 (예를 들어, 트랜스 스플라이싱에서 후속 변형되는 5'UTR RNA); 도나트론 서열(예를 들어, 트랜스 스플라이싱을 위한 공여자 서열을 제공하는데 요구되는 비-코딩 RNA); 및 타겟 노린재목 해충 유전자의 다른 비-코딩 전사된 RNA를 포함한다. 이러한 서열은 모노-시스트론 및 폴리-시스토론 유전자 둘 다로부터 유래될 수 있다.
따라서, 또한 본원에서는 일부 구현예와 관련하여 노린재목 해충에서의 타겟 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 iRNA 분자(예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA)가 기재된다. 일부 구현예에서, iRNA 분자는 복수의 타겟 핵산; 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 타겟 핵산의 전부 또는 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열(들)을 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, iRNA 분자는 유전자-변형된 유기체, 예컨대 식물 또는 박테리아에 의해 시험관 내 또는 생체 내에서 생산될 수 있다. 또한, 노린재목 해충에서의 타겟 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, shRNA 분자, miRNA 분자, 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA 서열이 개시된다. 특정한 숙주 타겟을 안정적으로 형질전환시키는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물이 추가로 기재된다. 형질전환된 숙주 타겟은 재조합 DNA 구축물로부터 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및/또는 hpRNA 분자를 유효 수준으로 발현할 수 있다. 따라서, 또한 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질전환 벡터가 기재되며, 여기서 뉴클레오티드 서열(들)의 발현은 노린재목 해충에서 타겟 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자를 초래한다.
일부 구현예에서, 노린재목 해충의 방제에 유용한 핵산 분자는 다음을 포함할 수 있다: 스레드 (서열번호 1)를 포함하는 유쉬스투스 헤로스로부터 단리된 천연 핵산 서열 전체 또는 일부분; RNA 분자로 발현될 때 스레드 (서열번호 1)에 의해 코딩된 천연 RNA 분자의 전체 또는 일부에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열; 스레드 (서열번호 1)의 전체 또는 일부에 특이적으로 상보적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 iRNA 분자 (예컨대, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA 및 hpRNA); 스레드 (서열번호 1)의 전체 또는 일부에 특이적으로 상보적인 dsRNA 분자, siRNA 분자, shRNA 분자, miRNA 및/또는 hpRNA 분자의 생산에 사용될 수 있는 cDNA 서열; 및 상기 형질전환된 숙주 타겟이 하나 이상의 전술된 핵산 분자를 포함하는, 특정 숙주 타겟의 안정한 형질전환을 달성하는데 사용하기 위한 재조합 DNA 구축물.
스레드는 유기체에서 세포 사멸을 억제하는 단백질의 세포 사멸 계열의 억제제 (IAP)에 속한다. IAP는 세포 사멸 케스케이드 (cascade)에 주요 단절을 제공하고 따라서 세포 사멸의 주요 분자 스위치이다. IAP에 의한 세포 사멸의 억제는 프로그램화된 세포 사멸의 실행자인 카스파제의 직접적인 결합에 의해 발생한다. 세포의 세포 자멸 해체는 아스파테이트 잔여물에서 이의 기질을 절단하는 시스테인 프로테아제 계열인 카스파제에 의해 수행된다. 건강한 세포에서, 카스파제 활성은 IAP의 직접적인 결합 또는 간접적인 활성에 의해 지속적으로 확인된다. 포유류에서 8가지 IAP가 있다: NAIP, c-IAP1, c-IAP2, XIAP, 서바이빈, 아폴론/브루스, ML-IAP/리빈, 및 ILP-2. 이러한 단백질 중에서, c-IAP1, c-IAP2, ML-IAP 및 XIAP는 세포 사멸의 조절과 직접적으로 연관되어 있으며; 이러한 계열의 다른 구성원은 세포 주기 및 염증 반응과 같은 과정을 조절한다. 서바이빈은 암 치료에 중요한 타겟이 된 IAP이다. 초파리(Drosophila)에서는 오직 4개의 IAP가 있다: DAIP1/스레드, DAIP2, 드브루스, 및 디테린. 스레드는 세포 및 유기체 생존력을 위한 가장 중요한 IAP이다. 초파리 스레드 돌연변이는 대량의 세포 사멸로 인해 초기 배아발생에서 죽는다 (Wang 등 (1999) Cell 98 (4):453-63 ; Lisi 등 (2000) Genetics 154 (2):669-78 ; Goyal 등 (2000) EMBO J 19 (4):589-97). 또한, 세포 배양에서 이중 가닥 RNA (dsRNA) 스크린은 초파리 게놈에서 가장 치명적인 RNAi 유전자 타겟 중 하나인 스레드인 것으로 밝혀졌다 (Boutros 등 (2004) Science 303 (5659):832-5 ; Chew 등 (2009) Nature 460 (7251):123-7). 노린재목 해충인 리구스 리네올라리스에서 스레드를 타겟화하는 dsRNA의 주입은 사멸을 초래하지만 (Walker Iii 및 Allen (2011) Entomologia Experimentalis et Applicata 138 (2):83-92), 스레드 dsRNA의 경구 공급은 이러한 곤충에서 성공적이지 않았다 (Allen 및 Walker (2012) J Insect Physiol 58 (3):391-6). 스레드는 세포 사멸성 세포 사멸 카스파제의 억제에 연관된 E3 유비퀴틴 리가제이다. IAP 단백질은 1 내지 3개의 배큘로바이러스 IAP 반복 (BIR) 도메인의 존재를 특징으로 한다. 초파리 IAP1은 2개의 BIR 도메인 및 1개의 E3 유비퀴틴 리가제 RING (실제로 관심있는 새로운 유전자, Really Interesting New Gene) 핑거 도메인을 함유한다. IAP는 카스파제 기능을 억제하기 위해 이들의 BIR 도메인을 통해 카스파제에 직접적으로 결합할 수 있다. IAP는 또한 이들의 RING 도메인을 사용하여 유비퀴티닐화를 통해 단백질 분해를 타겟화할 수 있다. IAP의 BIR 도메인은 또한 프로(pro)-세포 사멸 단백질(예컨대, 히드 리퍼 (hid reaper), 및 그림 (grim))과 상호작용한다.
B. 핵산 분자
본 발명은 특히, 노린재목 해충의 세포, 조직 또는 기관에서의 타겟 유전자 발현을 억제하는 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자; 및 세포 또는 미생물에서 iRNA 분자로서 발현되어 노린재목 해충의 세포, 조직 또는 기관에서 타겟 유전자 발현을 억제할 수 있는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명의 일부 구현예는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 초과) 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다: 서열번호 1; 서열번호 1의 상보체; 서열번호 1의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체. 특정한 구현예에서, 단리된 핵산 서열의 노린재목 해충과의 접촉 또는 그에 의한 흡수는 노린재목 해충의 성장, 발생, 생식 및/또는 섭식을 억제한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 노린재목 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서 타겟 유전자의 발현을 저해하기 위해 세포 또는 미생물에서 iRNA 분자로서 발현될 수 있는 적어도 하나 (예컨대, 1, 2, 3개 또는 그 초과)의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이러한 DNA 서열은 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 코딩된 RNA의 전사를 개시하거나 향상시키기 위해 DNA 분자를 포함하는 세포에서 기능하는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 적어도 하나의(예컨대, 1, 2, 3 또는 그 이상) DNA 서열은 서열번호 1을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 유도될 수 있다. 서열번호 1의 유도체는 서열번호 1의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 단편은, 예컨대 서열번호 1의 적어도 약 15개 인접한 뉴클레오티드 또는 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 단편은, 예컨대 서열번호 1의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200개 또는 그 이상의 인접한 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 이들 및 추가의 구현예에서, 이러한 단편은, 예컨대 서열번호 1의 약 15개 초과의 인접한 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다. 따라서, 서열번호 1은, 예컨대, 서열번호 1의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개, 약 25개, (예컨대, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 및 29개), 약 30개, 약 40개, (예컨대, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 및 45개), 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개, 약 100개, 약 110개, 약 120개, 약 130개, 약 140개, 약 150개, 약 160개, 약 170개, 약 180개, 약 190개, 약 200개 이상의 인접한 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함할 수 있다.
이러한 구현예는 노린재목 해충의 세포, 조직, 또는 기관에서 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위해 부분적으로 또는 완전히 안정화된 dsRNA 분자를 노린재목 해충에 도입하는 것을 포함한다. iRNA 분자(예컨대, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA)로서 발현되어 노린재목 해충에 의해 섭취되는 경우, 서열번호 1의 하나 이상의 단편을 포함하는 핵산 서열은 노린재목 해충에 의한 사멸, 성장 억제, 성비의 변화, 무리 크기의 감소, 감염의 중지 및/또는 섭식 중단 중 하나 이상을 야기할 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 노린재목 해충 타겟 유전자 서열과 실질적으로 상동성인 약 15내지 약 300개 또는 약 19 내지 약 300개 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 서열번호 1을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 단편을 포함하는 dsRNA 분자가 제공된다. 이러한 dsRNA 분자의 발현은, 예컨대 dsRNA 분자를 섭취하는 노린재목 해충의 사멸 및/또는 성장 억제를 야기할 수 있다.
특정한 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 dsRNA 분자는 서열번호 1을 포함하는 타겟 유전자에 대해 상보성인 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열번호 1의 단편에 대해 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 노린재목 해충에서 타겟 유전자의 억제는 노린재목 해충의 성장, 발생, 또는 다른 생물학적 기능에 필수적인 단백질 또는 뉴클레오티드 서열 제제의 감소 또는 제거를 야기한다. 선택된 뉴클레오티드 서열은 서열은 서열번호 1, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열의 인접한 단편, 또는 전술된 것들 중 하나의 상보체에 대해 약 80%내지 약 100% 서열 동일성을 보일 수 있다. 예컨대, 선택된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열의 인접한 단편, 또는 전술된 것들 중 하나의 상보체에 대해 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94% 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 또는 약 100% 서열 동일성을 보일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 또는 미생물에서 iRNA 분자로서 발현되어 타겟 유전자 발현을 억제할 수 있는 DNA 분자는 하나 이상의 타겟 노린재목 해충 종에서 발견되는 천연 핵산 서열의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 단일 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나, 또는 DNA 분자는 복수의 이러한 특이적으로 상보적인 서열로부터의 키메라로서 구축될 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 "스페이서 서열"에 의해 분리된 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 스페이서는, 이것이 요망되는 경우, 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열 사이의 이차 구조 형성을 용이하게 하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역일 수 있다. 한 구현예에서, 스페이서 서열은 mRNA에 대한 센스 또는 안티센스 코딩 서열의 일부이다. 스페이서는 대안적으로 핵산 분자에 공유 연결될 수 있는 뉴클레오티드 또는 그의 상동체의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, DNA 분자는 하나 이상의 상이한 RNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 RNA 분자 각각은 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열은 서로 상보적이다. 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열은 RNA 분자 내에서 스페이서 서열에 의해 연결될 수 있다. 스페이서 서열은 제1뉴클레오티드 서열 또는 제2뉴클레오티드 서열의 일부를 구성할 수 있다. 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자의 발현은 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열의 특이적 염기-쌍형성에 의해 본 발명의 dsRNA 분자의 형성으로 이어질 수 있다. 제1뉴클레오티드 서열 또는 제2뉴클레오티드 서열은 노린재목 해충에 대한 천연 핵산 서열 (예컨대, 타겟 유전자, 또는 전사된 비-코딩 서열), 이의 유도체, 또는 이에 대해 상보적인 서열과 실질적으로 동일할 수 있다.
dsRNA 핵산 분자는 중합된 리보뉴클레오티드 서열의 이중 가닥을 포함하고, 포스페이트-당 백본 또는 뉴클레오시드로의 변형을 포함할 수 있다. RNA 구조에서의 변형은 특이적인 억제가 이루어질 수 있도록 조절(tailor)될 수 있다. 한 구현예에서, dsRNA 분자는 편재하는 효소 공정을 통해 변형될 수 있으며, 이에 의해 siRNA 분자가 생성될 수 있다. 이러한 효소 공정은 시험관 내 또는 생체 내에서 RNase III 효소, 예컨대 진핵생물에서는 DICER를 이용할 수 있다. Elbashir 등 (2001) Nature 411:494-498; 및 Hamilton 및 Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-952을 참조한다. DICER 또는 기능상 등가인 RNAse III 효소는 보다 큰 dsRNA 가닥 및/또는 hpRNA 분자를, 각각의 길이가 약 19-25개의 뉴클레오티드인 보다 작은 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)로 절단한다. 이들 효소에 의해 생산된 siRNA 분자는 2 내지 3개의 뉴클레오티드 3' 오버행, 및 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는다. RNAse III 효소에 의해 생성된 siRNA 분자는 풀린 상태이고, 세포에서 단일-가닥 RNA로 분리된다. 이어서, siRNA 분자는 타겟 유전자로부터 전사된 RNA와 특이적으로 혼성화되고, 이후 양쪽 RNA 분자 모두는 고유한 세포 RNA-분해 메카니즘에 의해 실질적으로 분해된다. 이러한 공정을 통해 타겟 유기체에서의 타겟 유전자에 의해 코딩된 RNA가 효과적으로 분해 또는 제거될 수 있다. 그 결과는 타겟화된 유전자의 전사후 침묵이다. 일부 구현예에서, 내인성 RNAse III 효소에 의해 이종 핵산 분자로부터 생산된 siRNA 분자는 노린재목 해충에서의 타겟 유전자의 하향-조절을 효율적으로 매개할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 생체 내 분자간 혼성화를 통해 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 단일-가닥 RNA 분자로 전사될 수 있는 적어도 하나의 비-자연 발생 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 dsRNA는 통상적으로 자기-조립되고, 타겟 유전자의 전사후 억제를 달성하기 위해 노린재목 해충의 영양 공급원으로 제공될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 각각 노린재목 해충에서 상이한 타겟 유전자에 특이적으로 상보적인 2개의 상이한 비-자연 발생 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 핵산 분자가 dsRNA 분자로서 노린재목 해충에게 제공되었을 때, dsRNA 분자는 노린재목 해충에서 적어도 2개의 상이한 타겟 유전자의 발현을 억제한다.
C. 핵산 분자 수득
노린재목 해충에서의 다양한 천연 서열이 본 발명의 핵산 분자, 예컨대 iRNA 및 iRNA를 코딩하는 DNA 분자를 설계하기 위한 타겟 서열로서 사용될 수 있다. 그러나, 천연 서열을 선택하는 것은 간단한 과정이 아니다. 노린재목 해충에서 소수의 천연 서열만이 효율적인 타겟이 될 것이다. 예컨대, 특정한 천연 서열이 본 발명의 핵산 분자에 의해 효과적으로 하향-조절될 수 있는지 여부, 또는 특정한 천연 서열의 하향-조절이 노린재목 해충의 성장, 생존력, 증식 및/또는 생식에 유해한 효과를 가질 것인지 여부를 확신을 가지고 예측할 수 없다. 천연 노린재목 해충 서열의 대부분, 예컨대 이로부터 단리된 EST (예컨대, 미국특허 제7,612,194호 및 미국특허 제7,943,819호에 열거된 것)는 노린재목 해충, 예컨대 BSB, 네자라 비리둘라, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 키나비아 힐라레, 유쉬스투스 세르부스, 디켈롭스 멜라칸투스, 디켈롭스 푸르카투스, 에데사 메디타분다, 티안타 페르디토르, 키나비아 마르기나툼, 호르시아스 노빌렐루스, 타에디아 스티그모사, 디스데르쿠스 페루비아누스, 네오메갈로토무스 파르부스, 렙토글로수스 조나투스, 니에스트레아 시다에, 리구스 헤르페루스, 및 리구스 리네올라리스의 성장, 생존력, 증식, 및/또는 생식에 해로운 영향을 미치지 않는다.
또한 노린재목 해충에 유해한 효과를 가질 수 있는 천연 서열 중 어느 것이 숙주 식물에서 이러한 천연 서열에 상보적인 핵산 분자를 발현시키고 숙주 식물에는 해를 끼치지 않으면서 노린재목 해충이 섭식하였을 때 그에 대해 유해한 효과를 제공하도록 하기 위한 재조합 기술에 사용될 수 있는지를 예측하는 것은 불가능하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자(예컨대, 노린재목 해충의 숙주 식물에 제공되는)는, 예컨대 대사 또는 이화 생화학적 경로, 세포 분열, 생식 에너지 대사, 소화, 숙주 식물 인식 등에 관여하는 아미노산 서열과 같이, 노린재목 해충의 생존에 필수적인 단백질 또는 단백질의 일부를 코딩하는 cDNA 서열을 타겟화하도록 선택된다. 본원에 기재된 바와 같이, 적어도 하나의 절편이 타겟 해충 유기체의 세포에서 생산되는 RNA의 적어도 실질적으로 동일한 절편에 특이적으로 상보적인, 하나 이상의 dsRNA를 함유하는 조성물이 타겟 유기체 의해 섭취되면 타겟은 사멸되거나 또는 다르게 억제될 수 있다. 노린재목 해충에서 유래한 DNA 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열은 노린재목 해충에 의한 침입에 저항성인 식물 세포를 만드는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 노린재목 해충의 숙주 식물 (예를 들어, Z. 메이스 또는 G. 맥스)은 본원에 제공된 바와 같은 노린재목 해충으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 형질전환될 수 있다. 숙주 내로 형질전환되는 뉴클레오티드 서열은 형질전환된 숙주 내의 세포에서 또는 생물학적 유체에서 dsRNA 서열로 형성되는 하나 이상의 RNA를 코딩할 수 있고, 이에 따라 노린재목 해충이 트랜스제닉 숙주와 영양면에서 관계를 맺게 되면/그러한 때에 dsRNA는 이용가능하게 된다. 이는 노린재목 해충의 세포에서 하나 이상의 유전자의 발현의 억제를 야기할 수 있고, 궁극적으로 사멸 또는 그의 성장 또는 발생의 억제를 야기할 수 있다.
일부 구현예에서, 노린재목 해충의 성장, 발생 및 생식에 필수적으로 수반되는 유전자가 타겟화된다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 타겟 유전자는, 예를 들어 노린재목 해충 생존력, 운동, 이동, 성장, 발생, 감염성, 및 섭식 장소 확립 및 생식에서 중요한 역할을 하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 타겟 유전자는 하우스키핑 유전자 또는 전사 인자일 수 있다. 추가로, 본 발명에서 사용하기 위한 천연 노린재목 해충 뉴클레오티드 서열은 또한 식물, 바이러스, 박테리아 또는 곤충 유전자의 상동체 (예를 들어, 오르토로그)로부터 유래될 수 있으며, 그의 기능은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 그의 뉴클레오티 서열은 타겟 노린재목 해충의 게놈 중 타겟 유전자와 특이적으로 혼성화가능하다. 혼성화에 의해 공지된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 상동체를 식별하는 방법은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자를 생산하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 수득하는 방법을 제공한다. 이러한 한 구현예 중 하나는 다음의 단계를 포함한다: (a) 노린재목 해충에서 dsRNA-매개 유전자 억제시 하나 이상의 타겟 유전자(들)를 그의 발현, 기능 및 표현형에 대해 분석하는 단계; (b) dsRNA-매개 억제 분석에서 변경된 (예를 들어, 감소된) 성장 또는 발생 표현형을 나타내는 타겟화된 노린재목 해충으로부터의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상동체의 전부 또는 일부를 포함하는 프로브로 cDNA 또는 gDNA 라이브러리를 프로빙하는 단계; (c) 프로브와 특이적으로 혼성화되는 DNA 클론을 식별하는 단계; (d) 단계 (b)에서 식별된 DNA 클론을 단리하는 단계; (e) 단계 (d)에서 단리된 클론을 포함하는 cDNA 또는 gDNA 단편을 서열분석하고, 여기서 서열분석된 핵산 분자는 RNA 서열 또는 그의 상동체의 전부 또는 실질적인 부분을 포함하는 것인, 단계; 및 (f) 유전자 서열, 또는 siRNA 또는 miRNA 또는 shRNA 또는 hpRNA 또는 mRNA 또는 dsRNA의 전부 또는 실질적인 부분을 화학적으로 합성하는 단계.
추가 구현예에서, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자의 실질적인 부분을 생산하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편을 수득하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 타겟화된 노린재목 해충으로부터의 천연 뉴클레오티드 서열의 부분에 특이적으로 상보적인 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 클로닝 벡터에 존재하는 cDNA 또는 gDNA 삽입물을 증폭시키고, 여기서 증폭된 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 또는 miRNA 또는 hpRNA 또는 mRNA 또는 dsRNA 분자의 실질적인 부분을 포함하는 것인 단계.
핵산은 수많은 접근법에 의해 단리, 증폭 또는 생산될 수 있다. 예를 들어, iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, 및 hpRNA) 분자는 gDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 유래된 타겟 핵산 서열 (예를 들어, 타겟 유전자 또는 타겟 전사된 비-코딩 서열) 또는 그의 부분의 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. DNA 또는 RNA는 타겟 유기체로부터 추출될 수 있고, 핵산 라이브러리는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 그로부터 제조될 수 있다. 타겟 유기체로부터 생성된 gDNA 또는 cDNA 라이브러리는 PCR 증폭 및 타겟 유전자의 서열분석에 사용될 수 있다. 확인된 PCR 산물은 시험관 내 전사를 위한 주형으로서 사용될 수 있고, 이에 의해 최소 프로모터와 함께 센스 및 안티센스 RNA가 생성될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 자동화된 DNA 합성기 (예를 들어, P.E. Biosystems, Inc. (캘리포니아주 포스터시티) 모델 392 또는 394 DNA/RNA 합성기)를 사용하는 것, 표준 화학, 예컨대 포스포라미다이트 화학을 사용하는 것을 포함한 수많은 기술 중 어느 하나에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, Ozaki 등 (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; 및 Agrawal 등 (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423 참조). 예를 들어, Beaucage 등 (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; 미국 특허 제4,415,732호, 제4,458,066호, 제4,725,677호, 제4,973,679호, 및 제4,980,460호를 참조한다. 비-천연 백본 기, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포라미다이트 등을 생성하는 대안적 화학이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자는 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수동 또는 자동화된 반응을 통해, 또는 생체 내에서 RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포 내에서 화학적으로 또는 효소적으로 생산될 수 있다. RNA는 또한 부분 또는 총 유기 합성에 의해 생산될 수 있고, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드가 시험관 내 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다. RNA 분자는 세포 RNA 중합효소 또는 박테리오파지 RNA 중합효소 (예를 들어, T3 RNA 중합효소, T7 RNA 중합효소 및 SP6 RNA 중합효소)에 의해 합성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 클로닝 및 발현에 유용한 발현 구축물은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예컨대, 미국특허 제5,593,874호, 제5,693,512호, 제5,698,425호, 제5,712,135호, 제5,789,214호, 및 제5,804,693호를 참조한다. 화학적으로 또는 시험관 내 효소적 합성에 의해 합성된 RNA 분자는 세포 내로 도입되기 전에 정제될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 용매 또는 수지를 사용한 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의해 혼합물로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 화학적으로 또는 시험관 내 효소적 합성에 의해 합성된 RNA 분자는, 예를 들어 샘플 가공에 기인한 손실을 피하기 위해, 정제하지 않거나 최소의 정제를 수행한 후에 사용될 수 있다. RNA 분자는 보관을 위해 건조될 수 있거나 또는 수용액 중에 용해될 수 있다. 용액은 dsRNA 분자 듀플렉스 가닥의 어닐링 및/또는 안정화를 촉진시키기 위해 완충제 또는 염을 함유할 수 있다.
구현예들에서, dsRNA 분자는 단일 자기-상보적 RNA 가닥에 의해 또는 2개의 상보적 RNA 가닥으로부터 형성될 수 있다. dsRNA 분자는 생체 내 또는 시험관 내에서 합성될 수 있다. 세포의 내인성 RNA 중합효소는 생체 내에서 1 또는 2개의 RNA 가닥의 전사를 매개할 수 있거나, 또는 클로닝된 RNA 중합효소는 생체 내 또는 시험관 내에서 전사를 매개하는데 사용될 수 있다. 노린재목 해충에서의 타겟 유전자의 전사후 억제는 (예를 들어, 조직-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 기관, 조직 또는 세포 유형에서의 특이적인 전사에 의해; (예를 들어, 감염, 스트레스, 온도 및/또는 화학적 유도제에 대해 반응성인 유도성 프로모터의 사용에 의해) 숙주에서의 환경 조건의 자극에 의해; 및/또는 (예를 들어, 발생 단계-특이적 프로모터의 사용에 의해) 숙주의 발생 단계 또는 연령에서의 조작적 전사에 의해 숙주-타겟화될 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내에서 전사되었든지 간에, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 가닥은 폴리아데닐화될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있고, 세포의 번역 기구에 의해 폴리펩티드로 번역될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다.
D. 재조합 벡터 및 숙주 세포 형질전환
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물 세포) 내로 도입시키기 위한 DNA 분자를 제공하며, 여기서 DNA 분자는, RNA로 발현되어 노린재목 해충에 의해 섭취되었을 때, 노린재목 해충의 세포, 조직 또는 기관에서 타겟 유전자의 억제를 달성하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 식물 세포에서 iRNA (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA) 분자로서 발현되어 노린재목 해충에서 타겟 유전자 발현을 억제할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 발현을 개시 또는 증진시키기 위해, 이러한 재조합 핵산 분자는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 조절 서열은 iRNA로서 발현될 수 있는 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 식물에서 유전자 억제 분자를 발현시키는 방법은 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 국제 PCT 공개 번호 제WO06/073727호; 및 미국 특허 공개 제2006/0200878 Al호)를 참조한다.
구체적 구현예에서, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 재조합 DNA 분자는 섭취시 노린재목 해충 세포에서 내인성 타겟 유전자(들)의 발현을 억제할 수 있는 dsRNA 분자를 코딩할 수 있다. 많은 구현예에서, 전사된 RNA는 안정화된 형태; 예를 들어 헤어핀 및 스템 및 루프 구조로 제공될 수 있는 dsRNA 분자를 형성할 수 있다.
이들 및 추가의 구현예에서, dsRNA 분자의 하나의 가닥은 서열번호 1; 서열번호 1의 상보체; 서열번호 1의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동인 뉴클레오티드 서열로부터 전사에 의해 형성될 수 있다.
특정한 구현예에서, dsRNA 분자를 코딩하는 재조합 DNA 분자는 전사된 서열 내에 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열 절편을 포함할 수 있으며, 이러한 서열은 적어도 하나의 프로모터에 대해, 전사된 서열이 센스 배향으로 제1 뉴클레오티드 서열 절편 및 안티센스 배향으로 제2 뉴클레오티드 서열 절편 (제1 뉴클레오티드 서열 절편의 상보체를 포함함)을 포함하도록 배열되고, 이때, 상기 센스 뉴클레오티드 서열 절편 및 상기 안티센스 뉴클레오티드 서열 절편은 약 5개 (~ 5) 내지 약 천개 (~ 1000) 뉴클레오티드의 스페이서 서열 절편에 의해 연결되거나 이어진다. 스페이서 서열 절편은 센스와 안티센스 서열 절편 사이에 루프를 형성할 수 있다. 센스 뉴클레오티드 서열 절편 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열 절편은 타겟 유전자 (예컨대, 서열번호 1을 포함하는 유전자) 또는 이의 단편과 실질적으로 상동일 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서, 재조합 DNA 분자는 스페이서 서열 없이 dsRNA 분자를 코딩할 수 있다. 구현예들에서, 센스 코딩 서열 및 안티센스 코딩 서열은 상이한 길이일 수 있다.
노린재목 해충에 유해 효과를 갖거나 또는 노리재목 해충과 관련하여 식물 보호 효과를 갖는 것으로 확인된 서열은 본 발명의 재조합 핵산 분자에서 적절한 발현 카세트의 생성을 통해 발현된 dsRNA 분자 내로 용이하게 편입될 수 있다. 예를 들어, 이러한 서열은 타겟 유전자 서열 (예를 들어, 서열번호 1 및 이의 단편)에 상응하는 제1 절편을 취하고; 이러한 서열을, 제1 절편에 상동 또는 상보적이지 않은 제2 절편 스페이서 영역에 연결시키고; 이를 제3 절편에 연결시키는 것에 의해 스템 및 루프 구조를 갖는 헤어핀으로서 발현될 수 있으며, 여기서 제3 절편의 적어도 일부분은 제1 절편에 실질적으로 상보적이다. 이러한 구축물은 제1 절편과 제3 절편과의 분자내 염기-쌍형성에 의해 스템 및 루프 구조를 형성하며, 여기서 루프 구조는 제2 절편을 포함하고 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0048814 및 2003/0018993; 및 국제 PCT 공개 번호 WO94/01550 및 WO98/05770을 참조한다. dsRNA 분자는, 예를 들어 이중-가닥 구조의 형태로, 예컨대 스템-루프 구조 (예를 들어, 헤어핀)로 생성될 수 있고, 이에 의해 천연 노린재목 해충 서열에 대해 타겟화된 siRNA의 생산은 타겟화된 유전자의 단편의 공동-발현에 의해 증진되고, 예를 들어 추가의 식물 발현가능한 카세트 상에서 siRNA의 생산이 증진되거나 또는 메틸화가 감소됨으로써 dsRNA 헤어핀 프로모터의 전사 유전자 침묵이 방지된다.
본 발명의 소정의 구현예는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 식물 내로 도입 (즉, 형질전환)하여 하나 이상의 iRNA 분자가 노린재목 해충-억제성 수준으로 발현되도록 하는 것을 포함한다. 재조합 DNA 분자는, 예를 들어 벡터, 예컨대 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주의 게놈 내로 도입하고자 하는 총 DNA를 함께 함유하는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. 추가로, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 연결된 코딩 서열 또는 다른 DNA 서열의 발현을 구동하도록 하나 이상의 숙주에서 기능하는 적합한 프로모터의 제어 하의 벡터 내로 적절하게 삽입될 수 있다. 이러한 목적을 위해 많은 벡터가 이용가능하고, 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정한 숙주 세포에 주로 좌우될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (예를 들어, DNA의 증폭 또는 DNA의 발현), 및 그와 상용성인 특정한 숙주 세포에 따라 각종 성분을 함유한다.
트랜스제닉 식물에게 노린재목 해충으로부터의 보호를 부여하기 위해, 재조합 DNA는, 예를 들어 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자를 형성하는 RNA 분자)로 전사될 수 있다. iRNA 분자는 숙주 식물 종에게 피해를 야기할 수 있는 노린재목 해충 내의 대응하는 전사된 뉴클레오티드 서열에 대해 실질적으로 상동이고 특이적으로 혼성화가능한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 노린재목 해충은, 예를 들어 iRNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 숙주 식물의 세포 또는 유체를 섭취함으로써, 트랜스제닉 숙주 식물의 세포에서 전사되는 iRNA 분자와 접촉할 수 있다. 따라서, 타겟 유전자의 발현은 트랜스제닉 숙주 식물에 침입하는 노린재목 해충 내에서 iRNA 분자에 의해 억제된다. 일부 구현예에서, 타겟 노린재목 해충에서의 타겟 유전자의 발현 억제로 인해 식물은 해충에 의한 공격에 대해 내성일 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 식물 세포와 영양면에서 관계를 맺고 있는 노린재목 해충에게 iRNA 분자를 전달할 수 있도록 하기 위해서는, 식물 세포에서 iRNA 분자가 발현 (즉, 전사)되어야 한다. 따라서, 재조합 핵산 분자는 숙주 세포, 예컨대 핵산 분자가 증폭되어야 하는 박테리아 세포, 및 핵산 분자가 발현되어야 하는 식물 세포에서 기능하는 하나 이상의 조절 서열, 예컨대 이종 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 유도성, 바이러스성, 합성 또는 구성적 프로모터를 포함하며, 이들 모두 본 기술분야에 주지되어 있다. 이러한 프로모터를 기재하는 비-제한적인 예는 미국 특허 제6,437,217호 (메이즈 RS81 프로모터); 제5,641,876호 (벼 액틴 프로모터); 제6,426,446호 (메이즈 RS324 프로모터); 제6,429,362호 (메이즈 PR-1 프로모터); 제6,232,526호 (메이즈 A3 프로모터); 제6,177,611호 (구성적 메이즈 프로모터); 제5,322,938호, 제5,352,605호, 제5,359,142호, 및 제5,530,196호 (CaMV 35S 프로모터); 제6,433,252호 (메이즈 L3 올레오신 프로모터); 제6,429,357호 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 제6,294,714호 (광-유도성 프로모터); 제6,140,078호 (염-유도성 프로모터); 제6,252,138호 (병원성-유도성 프로모터); 제6,175,060호 (인 결핍-유도성 프로모터); 제6,388,170호 (양방향성 프로모터); 제6,635,806호 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 공개 번호 제2009/757,089호 (메이즈 엽록체 알돌라제 프로모터)를 포함한다. 추가의 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-5749) 및 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (이는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도성 플라스미드 상에 운반됨); 콜리모바이러스 프로모터(caulimovirus promoter), 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus, CaMV) 19S 프로모터 (Lawton 등 (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324); CaMV 35S 프로모터 (Odell 등 (1985) Nature 313:810-812); 피그워트 모자이크 바이러스(figwort mosaic virus) 35S-프로모터 (Walker 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-6628); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang 및 Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148); R 유전자 복합체 프로모터 (Chandler 등 (1989) Plant Cell 1:1175-1183); 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV 35S (미국 특허 제5,322,938호, 제5,352,605호, 제5,359,142호 및 제5,530,196호); FMV 35S (미국 특허 제6,051,753호, 및 제5,378,619호); PC1SV 프로모터 (미국 특허 제5,850,019호); SCP1 프로모터 (미국 특허 제6,677,503호); 및 AGRtu.nos 프로모터 (GenBank™ 수탁 번호 V00087; Depicker 등 (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573; Bevan 등 (1983) Nature 304:184-187)을 포함한다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 조직-특이적 프로모터, 예컨대 뿌리-특이적 프로모터를 포함한다. 뿌리-특이적 프로모터는 배타적으로 또는 우선적으로 뿌리 조직에서의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 구동한다. 뿌리-특이적 프로모터의 예는 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,110,732호; 제5,459,252호 및 제5,837,848호; 및 Opperman 등 (1994) Science 263:221-3; 및 Hirel 등 (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18을 참조한다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 노린재목 해충 방제를 위한 뉴클레오티드 서열 또는 단편은, 그 뉴클레오티드 서열 또는 단편에 대해 반대쪽 전사 방향으로 배향되어 있으며 트랜스제닉 식물 세포에서 작동가능한, 2개의 뿌리-특이적 프로모터 사이에 클로닝될 수 있고, 여기서 발현됨으로써 트랜스제닉 식물 세포에서 RNA 분자를 생산할 수 있고, 이후 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 식물 조직에서 발현된 iRNA 분자는 노린재목 해충에 의해 섭취될 수 있고, 이에 의해 타겟 유전자 발현 억제가 달성될 수 있다.
임의적으로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열은 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 번역 리덜 서열로서 기능하는 5'UTR을 포함한다. 번역 리더 서열은 완전히 가공된 mRNA에 존재하며, 그것은 일차 전사물의 가공 및/또는 RNA 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 번역 리더 서열의 예는 메이즈 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 제5,362,865호), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, Turner 및 Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36을 참조한다. 5'UTR의 비제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 제5,659,122호); PhDnaK (미국 특허 제5,362,865호); AtAnt1; TEV (Carrington 및 Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (GenBank™ 수탁 번호 V00087; 및 문헌 Bevan 등 (1983) Nature 304:184-7)를 포함한다.
임의적으로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열은 또한 3' 비-번역 서열, 3' 전사 종결 영역 또는 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치한 유전 요소이며, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 가공에 영향을 미칠 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 mRNA 전구체의 3' 말단에의 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드 첨가를 초래하도록 기능한다. 폴리아데닐화 요소는 다양한 식물 유전자로부터 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비-제한적인 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; Fraley 등 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)이다. 상이한 3' 비-번역 영역의 사용에 관한 예는 Ingelbrecht 등, (1989) Plant Cell 1:671-80에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비-제한적인 예는 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi 등 (1984) EMBO J. 3:1671-9) 및 AGRtu.nos (GenBank™ 수탁 번호 E01312)로부터의 하나를 포함한다.
일부 구현예는 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 상기 기재된 조절 서열 중 적어도 하나를 포함하는 단리되고 정제된 DNA 분자를 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있다. 발현되었을 때, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은 노린재목 해충에서의 천연 RNA 분자의 전부 또는 일부에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 RNA 분자(들)를 생성한다. 따라서, 뉴클레오티드 서열(들)은 타겟화된 노린재목 해충 RNA 전사물 내에 존재하는 리보뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 코딩하는 절편을 포함할 수 있고, 타겟화된 노린재목 해충 전사물의 전부 또는 일부의 역위 반복부를 포함할 수 있다. 식물 형질전환 벡터는 하나 초과의 타겟 서열에 특이적으로 상보적인 서열을 함유할 수 있으며, 이에 의해 타겟 노린재목 해충의 하나 이상의 집단 또는 종의 세포에서 둘 이상의 유전자의 발현을 억제하기 위한 하나 초과의 dsRNA의 생산이 가능하다. 상이한 유전자에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열의 절편은 트랜스제닉 식물에서의 발현을 위해 단일 조성 핵산 분자로 조합될 수 있다. 이러한 절편은 인접해 있을 수 있거나 또는 스페이서 서열에 의해 분리되어 있을 수 있다.
다른 구현예들에서, 이미 본 발명의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열(들)을 함유하고 있는 본 발명의 플라스미드는 동일한 플라스미드에서 추가의 뉴클레오티드 서열(들)의 순차적인 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 여기서 추가의 뉴클레오티드 서열(들)은 원래의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열(들)과 동일한 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 다수 타겟 유전자의 억제를 위한 것으로 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제하고자 하는 다수 유전자는 동일한 노린재목 해충 종으로부터 수득할 수 있으며, 이는 핵산 분자의 유효성을 증진시킬 수 있다. 다른 구현예들에서, 유전자는 상이한 노린재목 해충으로부터 유래될 수 있으며, 이는 작용제(들)가 유효한 노린재목 해충의 범위를 확장시킬 수 있다. 억제를 위해 또는 발현 및 억제의 조합을 위해 다수 유전자가 타겟화되는 경우에, 폴리시스트론 DNA 요소가 조작될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 식물 세포와 같은 형질전환된 세포 상에 선택성 표현형을 부여하는 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택성 마커는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 세포의 선택에 또한 사용될 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, 제네티신(Geneticin) (G418), 블레오마이신, 히그로마이신 등), 또는 제초제 내성 (예를 들어, 글리포세이트 등)을 코딩할 수 있다. 선택성 마커의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 카나마이신 저항성을 코딩하고 카나마이신, G418 등의 사용의 경우에 선택될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 코딩하는 bar 유전자; 글리포세이트 내성을 코딩하는 돌연변이체 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제(nitrilase) 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 내성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (ALS) 유전자; 및 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린 등에 대한 저항성을 부여하는 다수 선택성 마커가 이용가능하다. 이러한 선택성 마커의 예는, 예를 들어 미국 특허 제5,550,318호; 제5,633,435호; 제5,780,708호 및 제6,118,047호에 예시되어 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 또한 스크리닝 마커를 포함할 수 있다. 스크리닝 마커는 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝 마커는 다양한 발색원성 기질이 공지된 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자 (GUS) (Jefferson 등 (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); 식물 조직에서 안토시아닌 안료 (적색)의 생산을 조절하는 산물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta 등 (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18 th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); β-락타마제 유전자 (Sutcliffe 등 (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); 다양한 발색원성 기질이 공지된 효소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PADAC, 발색원성 세팔로스포린); 루시페라제 유전자 (Ow 등 (1986) Science 234:856-9); 발색원성 카테콜을 전환시키는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowski 등 (1983) Gene 46(2-3):247-55); 아밀라제 유전자 (Ikatu 등 (1990) Bio/Technol. 8:241-2); 티로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이들은 차례로 멜라닌으로 축합됨)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz 등 (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); 및 α-갈락토시다제를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산 분자는 트랜스제닉 식물을 생성하고, 노린재목 해충에 대해 감수성이 감소된 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해 상기 식물에서 이종 핵산을 발현시키는 방법에서 사용될 수 있다. 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 iRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자를 식물 형질전환 벡터 내로 삽입하고, 이들을 식물 내로 도입함으로써 제조될 수 있다.
숙주 세포를 형질전환시키는 적합한 방법은, 예컨대 원형질체의 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,508,184호 참조), 건조/억제-매개 DNA 흡수에 의해 (예를 들어, Potrykus 등 (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8 참조), 전기천공에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,384,253호 참조), 탄화규소 섬유와의 교반에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호 참조), 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제5,563,055호; 제5,591,616호; 제5,693,512호; 제5,824,877호; 제5,981,840호; 및 제6,384,301호 참조) 및 DNA-코팅된 입자의 가속화 (예를 들어, 미국 특허 제5,015,580호; 제5,550,318호; 제5,538,880호; 제6,160,208호; 제6,399,861호; 및 제6,403,865호 참조) 등에 의해 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 특히 옥수수를 형질전환시키는데 유용한 기술은, 예를 들어 미국 특허 제5,591,616호, 제7,060,876호 및 제7,939,3281호에 기재되어 있다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 실질적으로 임의의 종의 세포는 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 편입된다. 다세포 종의 경우에, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체로 재생될 수 있다. 이들 기술 중 어느 하나를 사용함으로써, 예를 들어 트랜스제닉 식물의 게놈 중에 1 종 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있다.
발현 벡터를 식물 내로 도입하는데 가장 널리 사용되는 방법은 다양한 아그로박테리움 종의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. A. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 A. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. A. 투메파시엔스 및 A. 리조게네스의 각각 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전 형질전환을 담당하는 유전자를 운반한다. Ti (종양-유도)-플라스미드는 형질전환된 식물로 전달되는, T-DNA로서 공지된 큰 절편을 함유한다. Ti 플라스미드의 또 다른 절편인 Vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역은 말단 반복물에 의해 경계지어진다. 변형된 이원 벡터에서, 종양-유도성 유전자는 결실되었고, Vir 영역의 기능을 이용하여 T-DNA 보더 서열에 의해 경계지어진 외래 DNA를 전달한다. T-영역은 또한 트랜스제닉 세포 및 식물의 효율적인 회수를 위한 선택성 마커, 및 dsRNA 코딩 핵산과 같은 전달을 위한 서열의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다.
따라서, 일부 구현예들에서, 식물 형질전환 벡터는 A. 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 (예를 들어, 미국특허 제4,536,475호, 제4,693,977호, 제4,886,937호, 및 제5,501,967호; 및 유럽특허 제EP 0 122 791호 참조) 또는 A. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래된다. 추가의 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어, 제한하지 않고 Herrera-Estrella 등 (1983) Nature 303:209-13; Bevan 등 (1983) Nature 304:184-7; Klee 등 (1985) Bio/Technol. 3:637-42에 의해; 및 유럽 특허 번호 EP 0 120 516에 기재된 것, 및 상기 중 어느 하나로부터 유래된 것을 포함한다. 식물과 상호작용하는 다른 박테리아, 예컨대 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium) 및 메소리조비움(Mesorhizobium)은 자연적으로 변형되어 수많은 다양한 식물로의 유전자 전달을 매개할 수 있다. 이들 식물-연관 공생 박테리아는 결손된(disarmed) Ti 플라스미드 및 적합한 이원 벡터 둘 다의 획득에 의해 유전자 전달에 적격으로 만들 수 있다.
외인성 DNA를 수용자 세포에 제공한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가 배양 및 식물 재생을 위해 식별된다. 형질전환된 세포를 식별할 수 있는 능력을 개선시키기 위해, 형질전환체를 생성하는데 사용된 형질전환 벡터와 함께, 상기 기재된 바와 같은 선택성 또는 스크리닝 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선택성 마커가 사용되는 경우, 세포를 선택적 작용제 또는 작용제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 형질전환된 세포가 식별된다. 스크리닝 마커가 사용되는 경우에, 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택적 작용제에 대한 노출에서 생존하는 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 스코어링된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함시킴으로써 변형될 수 있다. 식물 재생 노력을 시작하는 데 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 수동 선택을 수회에 걸쳐 반복 수행한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 상태가 될 때까지 (예를 들어, 전형적으로 약 2주) 성장 조절제를 포함하는 기초 배지 상에서 조직을 유지시킬 수 있고, 이어서 이를 싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 배양은 충분한 싹 형성이 발생할 때까지 주기적으로 옮겨진다. 싹이 형성되면, 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨진다. 일단 뿌리가 형성되고 나면, 추가의 성장 및 성숙을 위해 식물을 토양으로 옮길 수 있다.
재생 식물에 관심 핵산 분자 (예를 들어, 노린재목 해충에서의 타겟 유전자 발현을 억제하는 하나 이상의 iRNA 분자를 코딩하는 DNA 서열)가 존재하는지 여부를 확인하기 위해, 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR 및 핵산 서열분석; 생화학적 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해, 또는 효소 기능에 의해 단백질 산물의 존재를 검출하는 것; 식물 일부 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 전체 재생 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
통합 사건은, 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 분석될 수 있다. PCR 유전자형결정은 게놈 내로 편입된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서 PCR 증폭 산물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형결정 방법은 널리 기재되어 있고 (예를 들어, Rios, G. 등 (2002) Plant J. 32:243-53), 세포 배양물을 포함한 임의의 식물 종 (예를 들어, Z. 메이스, 또는 G. 맥스) 또는 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다.
아그로박테리움-의존성 형질전환 방법을 이용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로는 하나의 염색체 내로 삽입된 단일 재조합 DNA 서열을 함유한다. 단일 재조합 DNA 서열은 "트랜스제닉 사건" 또는 "통합 사건"으로서 언급된다. 이러한 트랜스제닉 식물은 삽입된 외인성 서열에 대한 반접합성이다. 일부 구현예에서, 트랜스젠과 관련하여 동형접합인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자 서열을 함유하는 독립 분리개체 트랜스제닉 식물을, 예를 들어 T0 식물과 유성 생식으로 성적 교배 (자가수분)시켜 T1 종자를 생산함으로써 수득할 수 있다. 생산된 T1 종자의 4분의 1은 트랜스젠에 대해 동형접합일 것이다. T1 종자의 발아는, 전형적으로 이형접합체와 동형접합체 사이의 구별을 가능하게 하는 SNP 검정 또는 열 증폭 검정 (즉, 접합성 검정)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 생성한다.
특정한 구현예에서, 노린재목 해충-억제성 효과를 갖는, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종 또는 그 초과의 상이한 iRNA 분자가 식물 세포에서 생산된다. iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)는 상이한 형질전환 사건에서 도입된 다수 핵산 서열로부터, 또는 단일 형질전환 사건에서 도입된 단일 핵산 서열로부터 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 iRNA 분자는 단일 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 다른 구현예에서, 복수의 iRNA 분자는 다수 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 하나 이상의 노린재목 해충 내의 상이한 유전자좌 (예를 들어, 서열번호 1에 의해 규정된 유전자좌)에 각각 상동인 다수 핵산 서열을 포함하는 단일 iRNA 분자는, 동일한 종의 노린재목 해충으로 이루어진 상이한 집단, 또는 상이한 종의 노린재목 해충 둘 다에서 발현될 수 있다.
재조합 핵산 분자를 사용한 식물의 직접적인 형질전환에 더하여, 트랜스제닉 식물은 적어도 하나의 트랜스제닉 사건을 갖는 제1 식물을 이러한 사건이 결여된 제2 식물과 교배시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를, 형질전환에 용이한 제1 식물 계통 내로 도입해서 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있고, 트랜스제닉 식물을 제2 식물 계통과 교배시켜서 iRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제2 식물 계통 내로 유전자이입시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 서열을 함유하는 범용 제품을 포함한다. 특정한 구현예는 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 식물 또는 종자로부터 생산된 범용 제품을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 범용 제품은, 제한하지 않고 다음을 포함한다: 식사, 오일, 식물의 분쇄 또는 통 곡물 또는 종자, 또는 본 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 임의의 식사, 오일, 재조합 식물 또는 종자의 분쇄 또는 통 곡물 중 임의의 것을 포함하는 임의의 먹이 제품. 본원에서 고려되는 하나 이상의 상품 또는 범용 제품에서 본 발명의 하나 이상의 서열을 검출하는 것은 사실상, 상품 또는 범용 제품이 dsRNA-매개된 유전자 억제 방법을 사용하여 노린재목 식물 해충을 방제하기 위한 목적을 위해 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위해 설계된 트랜스제닉 식물로부터 생산됨을 증명한다.
일부 측면에서, 형질전환된 식물 세포로부터 유래된 트랜스제닉 식물에 의해 생산되는 종자 및 범용 제품이 포함되며, 여기서 상기 종자 및 범용 제품은 검출가능한 양의 본 발명의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 범용 제품은, 예를 들어 트랜스제닉 식물을 수득하고, 그로부터 먹이 또는 사료를 제조함으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 범용 제품은, 예를 들어, 제한하지 않고 다음을 포함한다: 식사, 오일, 식물의 분쇄 또는 통 곡물 또는 종자, 및 본 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 임의의 식사, 오일, 재조합 식물 또는 종자의 분쇄 또는 통 곡물 중 임의의 것을 포함하는 임의의 먹이 제품. 하나 이상의 범용품 또는 범용 제품에서의 본 발명의 서열 중 하나 이상의 검출은, 사실상 범용품 또는 범용 제품이 노린재목 해충을 방제하기 위한 목적으로 본 발명의 iRNA 분자 중 하나 이상을 발현하도록 설계된 트랜스제닉 식물로부터 생산되었다는 것의 증거가 된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 형질전환된 식물 또는 종자는 또한 이의 게놈에, 비제한적으로 다음을 포함하여, 하나 이상의 다른 트랜스제닉 사건을 포함할 수 있다: 서열번호 1에 의해 정의된 것 이외에 노린재목 해충의 유전자좌, 예컨대 Caf1-180 (미국 특허 출원 공개 제2012/0174258호), VatpaseC (미국 특허 출원 공개 제2012/0174259호), Rho1 (미국 특허 출원 공개 제2012/0174260호), VatpaseH (미국 특허 출원 공개 제2012/0198586호), PPI-87B (미국 특허 출원 공개 제2013/0091600호), RPA70 (미국 특허 출원 공개 제2013/0091601호), 및 RPS6 (미국 특허 출원 공개 제2013/0097730호)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자좌를 타겟화하는 전사된 iRNA 분자로부터의 트랜스제닉 사건; PIP-1 폴리펩티드 (미국 특허 공개 제US2014/0007292A1호)가 전사되는 트랜스제닉 사건; 노린재목 해충 이외의 유기체 (예컨대, 식물 기생 선충)의 유전자를 타겟화하는 iRNA 분자가 전사되는 트랜스제닉 사건; 살충성 단백질 (예컨대, 바실러스 투린지엔시스 살충성 단백질, 예컨대 Cry34Ab1 (미국 특허 제6,127,180호, 제6,340,593호, 및 제6,624,145호), Cry35Ab1 (미국 특허 제6,083,499호, 제6,340,593호, 및 제6,548,291호), 단일 사건과 조합된 "Cry34/35Ab1" (예컨대, 메이즈 사건 DAS-59122-7; 미국 특허 제7,323,556호), Cry3A (예컨대, 미국 특허 제7,230,167호), Cry3B (예컨대, 미국 특허 제8,101,826호), Cry6A (예컨대, 미국 특허 제6,831,062호), 및 이들의 조합 (예컨대, 미국 특허 출원 제2013/0167268호, 제2013/0167269호, 및 제2013/0180016호)을 코딩하는 유전자; 제초제 내성 유전자 (예컨대, 글리포세이트, 글루포시네이트, 디캄바 또는 2,4-D (예컨대, 미국 특허 제7,838,733호)에 대한 내성을 제공하는 유전자); 및 형질전환된 식물에서 원하는 표현형, 예컨대 증가된 수율, 변경된 지방산 대사, 또는 세포질 웅성 불임의 회복에 기여하는 유전자. 특정한 구현예에서, 본 발명의 iRNA 분자를 코딩하는 서열은 식물에서 다른 곤충 방제 및 질병 저항성 형질과 조합되어서 곤충 피해 및 식물 질병의 증진된 방제를 위한 목적하는 형질을 달성할 수 있다. 별개의 작용 방식을 사용하는 곤충 방제 형질을 조합하면, 예를 들어 재배지에서 형질(들)에 대한 저항성이 발생될 확률은 감소할 것이기 때문에, 단일 방제 형질을 보유하는 식물에 비해 내구성이 더 우수한 보호된 트랜스제닉 식물을 제공할 수 있다.
V. 노린재목 해충에서의 타겟 유전자 억제
A. 개관
본 발명의 일부 구현예에서, 노린재목 해충 방제에 유용한 적어도 하나의 핵산 분자를 노린재목 해충에게 제공할 수 있으며, 여기서 핵산 분자는 노린재목 해충에서 RNAi-매개 유전자 침묵을 일으킨다. 특정한 구현예에서, iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)는 노린재목 해충에게 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 노린재목 해충 방제에 유용한 핵산 분자는 핵산 분자를 노린재목 해충과 접촉시킴으로써 노린재목 해충에게 제공될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 노린재목 해충 방제에 유용한 핵산 분자는 노린재목 해충의 섭식 기질로, 예를 들어 영양 조성물로 제공될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 노린재목 해충 방제에 유용한 핵산 분자는 노린재목 해충이 섭취하는 핵산 분자를 포함하는 식물 물질의 섭취를 통해 제공될 수 있다. 소정의 구현예에서, 핵산 분자는, 예를 들어 식물 세포를 재조합 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 것에 의해 및 형질전환된 식물 세포로부터의 식물 물질 또는 전체 식물의 재생에 의해 식물 물질 내로 도입된 재조합 핵산 서열의 발현을 통해 식물 물질에 존재한다.
B. RNAi-매개 타겟 유전자 억제
구현예에서, 본 발명은, 예컨대 타겟 서열에 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가닥을 포함하는 iRNA 분자를 설계함으로써, 노린재목 해충 (예컨대, BSB, 네자라 비리둘라, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 아크로스터넘 힐라레, 및 유쉬스투스 세르부스)의 전사체에서 필수 천연 뉴클레오티드 서열 (예컨대, 필수 유전자)을 타겟화하기 위해 설계될 수 있는 iRNA 분자 (예컨대, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, 및 hpRNA)를 제공한다. 이렇게 설계된 iRNA 분자의 서열은 타겟 서열의 그것과 동일할 수 있거나, 또는 iRNA 분자와 그의 타겟 서열 사이의 특이적인 혼성화를 방지하지 못하는 미스매치를 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 iRNA 분자는 노린재목 해충에서의 유전자 억제 방법에서 사용될 수 있고, 이에 의해 식물 (예를 들어, iRNA 분자를 포함하는 보호되는 형질전환된 식물) 상의 해충에 의해 유발되는 피해 수준 또는 발생률이 감소될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유전자 억제"는 발현의 전사후 억제 및 전사 억제를 포함하는 유전자 또는 코딩 서열로부터의 단백질 발현의 감소를 포함하는, mRNA로의 유전자 전사 및 후속하는 mRNA의 번역의 결과로서 생산된 단백질의 수준을 감소시키기 위한 주지의 방법 중 어느 하나를 지칭한다. 전사후 억제는 억제를 위해 타겟화된 유전자로부터 전사된 mRNA의 전부 또는 일부와, 억제를 위해 사용된 상응하는 iRNA 분자 사이의 특이적 상동성에 의해 매개된다. 추가로, 전사후 억제는 리보솜에 의한 결합을 위해 세포에서 이용가능한 mRNA 양의 실질적인 측정가능한 감소를 지칭한다.
iRNA 분자가 dsRNA 분자인 일부 구현예에서, dsRNA 분자는 효소 DICER에 의해 짧은 siRNA 분자 (대략 20개의 뉴클레오티드 길이)로 절단될 수 있다. dsRNA 분자에 대한 DICER 활성에 의해 생성된 이중-가닥 siRNA 분자는 2개의 단일-가닥 siRNA: "운반자 가닥" 및 "가이드 가닥"으로 분리될 수 있다. 운반자 가닥은 분해될 수 있고, 가이드 가닥은 RISC 내로 편입될 수 있다. 가이드 가닥과, mRNA 분자의 특이적으로 상보적인 서열과의 특이적인 혼성화에 이어서, 효소 아르고노트(Argonaute) (RISC 복합체의 촉매 성분)에 의한 절단에 의해 전사후 억제가 일어난다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 임의의 형태의 iRNA 분자가 사용될 수 있다. dsRNA 분자는 전형적으로 제조 동안, 및 iRNA 분자를 세포에 제공하는 단계 동안, 단일-가닥 RNA 분자보다 더 안정적이고, 이는 또한 전형적으로 세포에서 보다 안정적이라는 것을 본 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어 siRNA 및 miRNA 분자는 일부 구현예에서 동일하게 유효할 수 있지만, dsRNA 분자는 그의 안정성에 기인하여 선택될 수 있다.
특정한 구현예에서, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공되며, 뉴클레오티드 서열은 시험관 내에서 발현되어 노린재목 해충의 게놈 내의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 핵산 분자에 실질적으로 상동인 iRNA 분자를 생산할 수 있다. 소정의 구현예에서, 시험관 내 전사된 iRNA 분자는 스템-루프 구조를 포함하는 안정화된 dsRNA 분자일 수 있다. 노린재목 해충이 시험관 내 전사된 iRNA 분자와 접촉한 후에, 노린재목 해충에서의 타겟 유전자 (예를 들어, 필수 유전자)의 전사후 억제가 일어날 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자의 발현은 노린재목 해충에서의 타겟 유전자의 전사후 억제 방법에 사용되며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열번호 1; 서열번호 1의 상보체; 서열번호 1의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호 1의 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체. 소정의 구현예에서, 상기 중 어느 하나와 적어도 80% (예를 들어, 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 및 100%) 동일한 핵산 분자의 발현이 사용될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 노린재목 해충의 적어도 1개의 세포에 존재하는 RNA 분자에 특이적으로 혼성화되는 핵산 분자가 발현될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자의 발현은 노린재목 해충에서의 타겟 유전자의 전사후 억제 방법에 사용되며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열번호 1; 서열번호 1의 상보체; 서열번호 1의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호 1의 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편; 및 서열번호 1을 포함하는 천연 RNA 분자로 전사되는 노린재목 유기체의 천연 비-코딩 서열의 적어도 15개 인접한 뉴클레오티드의 단편의 상보체. 소정의 구현예에서, 상기 중 어느 하나와 적어도 80% (예를 들어, 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 및 100%) 동일한 핵산 분자의 발현이 사용될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 노린재목 해충의 적어도 1개의 세포에 존재하는 RNA 분자에 특이적으로 혼성화되는 핵산 분자가 발현될 수 있다. 특정한 실시예에서, 이러한 핵산 분자는 서열번호 1을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 RNAi 전사후 억제 시스템이 유전자 돌연변이, 균주 다형성, 또는 진화적 분기에 기인하여 예측될 수 있는 타겟 유전자 중의 서열 변이를 견딜 수 있다는 것은 본 발명의 발일부 구현예의 중요한 특징이다. 도입된 핵산 분자가 타겟 유전자의 일차 전사 산물 또는 완전 가공된 mRNA에 특이적으로 혼성화가능하다면, 도입된 핵산 분자는 타겟 유전자의 일차 전사 산물 또는 완전 가공된 mRNA에 절대적으로 상동일 필요는 없을 수 있다. 더욱이, 도입된 핵산 분자는 타겟 유전자의 일차 전사 산물 또는 완전 가공된 mRNA에 비해, 전장일 필요는 없을 수 있다.
본 발명의 iRNA 기술을 사용한 타겟 유전자 억제는 서열-특이적이며; 즉, iRNA 분자(들)에 실질적으로 상동인 뉴클레오티드 서열이 유전적 억제를 위해 타겟화된다. 일부 구현예에서, 타겟 유전자 서열의 부분과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자가 억제에 사용될 수 있다. 이들 및 추가 구현예에서, 타겟 유전자 서열에 비해 1개 이상의 삽입, 결실 및/또는 점 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자가 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, iRNA 분자 및 타겟 유전자의 부분은, 예를 들어 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100%, 및 100% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 대안적으로, dsRNA 분자의 듀플렉스 영역은 타겟 유전자 전사물의 부분과 특이적으로 혼성화가능할 수 있다. 특이적으로 혼성화가능한 분자에서, 보다 큰 상동성을 나타내는 전장 서열보다 짧은 서열은 보다 긴, 덜 상동인 서열을 보완한다. 타겟 유전자 전사물의 부분과 동일한 dsRNA 분자의 듀플렉스 영역의 뉴클레오티드 서열의 길이는 적어도 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500개, 또는 적어도 약 1000개 염기일 수 있다. 일부 구현예에서, 15-100개 초과의 뉴클레오티드의 서열이 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, 약 200-300개 초과의 뉴클레오티드의 서열이 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, 타겟 유전자의 크기에 따라, 약 500-1000개 초과의 뉴클레오티드의 서열이 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 노린재목 해충에서 타겟 유전자의 발현은 노린재목 해충의 세포 내에서 적어도 10%; 적어도 33%; 적어도 50%; 또는 적어도 80%만큼 억제될 수 있고, 이에 의해 유의한 억제가 일어난다. 유의한 억제는 역치를 초과하여 억제됨으로써 검출가능한 표현형 (예를 들어, 성장 중지, 섭식 중지, 발생 중지, 유도된 사멸률 등)이 나타나거나, 또는 억제되는 타겟 유전자에 상응하는 RNA 및/또는 유전자 산물이 검출가능하게 감소하게 되는 것을 지칭한다. 비록 본 발명의 소정의 구현예에서 억제는 실질적으로 노린재목 해충의 모든 세포에서 일어나지만, 다른 구현예에서는 억제가 오직 타겟 유전자를 발현하는 하위세트의 세포에서만 일어난다.
일부 구현예에서, 세포에서의 전사 억제는 프로모터 DNA 서열 또는 그의 상보체에 대해 실질적 서열 동일성을 나타내는 dsRNA 분자의 세포내 존재에 의해 매개되어, "프로모터 트랜스 억제"로 지칭되는 효과가 발휘된다. 유전자 억제는, 예를 들어 dsRNA 분자를 함유하는 식물 물질을 섭취하거나 또는 그와 접촉함으로써 이러한 dsRNA 분자를 섭취하거나 또는 그와 접촉할 수 있는 노린재목 해충에서의 타겟 유전자에 대해 효과적일 수 있다. 프로모터 트랜스 억제에 사용하기 위한 dsRNA 분자는 노린재목 해충의 세포에서의 하나 이상의 상동인 또는 상보적인 서열의 발현을 억제 또는 저해할 수 있도록 특이적으로 설계될 수 있다. 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위한 안티센스 또는 센스 배향의 RNA에 의한 전사후 유전자 억제는 미국 특허 제5,107,065호, 제5,231,020호, 제5,283,184호, 및 제5,759,829호에 개시되어 있다.
C. 노린재목 해충에 제공된 iRNA 분자의 발현
노린재목 해충에서의 RNAi-매개 유전자 억제를 위한 iRNA 분자의 발현은 많은 시험관 내 또는 생체 내 포맷 중 어느 하나로 수행될 수 있다. 이어서, iRNA 분자는, 예를 들어 iRNA 분자를 해충과 접촉시킴으로써, 또는 해충이 iRNA 분자를 섭취하도록 하거나 또는 다르게는 내재화하도록 함으로써 노린재목 해충에게 제공될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예는 노린재목 해충의 형질전환된 숙주 식물, 형질전환된 식물 세포 및 형질전환된 식물의 자손을 포함한다. 형질전환된 식물 세포 및 형질전환된 식물은, 예를 들어 이종 프로모터의 제어 하에 iRNA 분자 중 하나 이상을 발현하여 해충 보호 효과를 제공하도록 조작될 수 있다. 따라서, 섭식 동안 노린재목 해충이 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 소비하였을 때, 해충은 트랜스제닉 식물 또는 세포에서 발현된 iRNA 분자를 섭취할 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 또한 iRNA 분자 생산을 위해 매우 다양한 원핵 및 진핵 미생물 숙주 내로 도입될 수 있다. 용어 "미생물"은 원핵 및 진핵 종, 예컨대 박테리아 및 진균류를 포함한다.
유전자 발현의 조정은 이러한 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 노린재목 해충에서 유전자 발현을 억제하는 방법은 해충의 숙주의 조직에, 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 전사 후에 형성된 적어도 하나의 dsRNA 분자를 유전자 억제량으로 제공하는 것을 포함하며, 이의 적어도 하나의 절편은 노린재목 해충의 세포 내의 mRNA 서열에 상보적이다. 본 발명에 따라 노린재목 해충에 의해 섭취되는, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 hpRNA 분자와 같은 변형된 형태를 포함하는 dsRNA 분자는 서열번호 1을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로부터 전사된 RNA 분자와 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 100% 동일할 수 있다. 따라서, 노린재목 해충 내로 도입되었을 때, 거기에서 내인성 코딩 서열 또는 타겟 코딩 서열의 발현을 저해 또는 억제하는 것인, 본 발명의 dsRNA 분자를 제공하기 위한 비-자연 발생 뉴클레오티드 서열 및 재조합 DNA 구축물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단리된 및 실질적으로 정제된 핵산 분자가 제공된다.
특정한 구현예는 노린재목 식물 해충에서의 하나 이상의 타겟 유전자(들)의 전사후 억제를 위해, 및 노린재목 식물 해충 집단의 방제를 위해 iRNA 분자를 전달하기 위한 전달 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 전달 시스템은 숙주 트랜스제닉 식물 세포, 또는 숙주 세포에서 전사된 RNA 분자를 포함하는 숙주 세포의 내용물의 섭취를 포함한다. 이들 및 추가 구현예에서, 본 발명의 안정화된 dsRNA 분자를 제공하는 재조합 DNA 구축물을 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물이 생성된다. 특정한 iRNA 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포 및 트랜스제닉 식물은 본 발명의 iRNA 분자 (예를 들어, 안정화된 dsRNA 분자)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질전환 벡터를 구축하고; 식물 세포 또는 식물을 형질전환시키고; 전사된 iRNA 분자를 함유하는 트랜스제닉 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물을 생성하는 재조합 DNA 기술 (그의 기본 기술은 본 기술분야에 주지되어 있음)을 사용함으로써 생산될 수 있다.
트랜스제닉 식물에게 노린재목 해충으로부터의 저항성을 부여하기 위해, 재조합 DNA 분자를, 예를 들어 iRNA 분자, 예컨대 dsRNA 분자, siRNA 분자, miRNA 분자, shRNA 분자 또는 hpRNA 분자로 전사시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자는 재조합 식물의 조직 또는 유체 내에서 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 이러한 dsRNA 분자는 숙주 식물에 침입할 수 있는 유형인 노린재목 해충 내 DNA 서열로부터 전사된 상응하는 뉴클레오티드와 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열의 일부로 구성될 수 있다. 노린재목 해충 내에서 타겟 유전자의 발현은 섭취된 dsRNA 분자에 의해 억제되고, 노린재목 해충에서 타겟 유전자 발현의 억제는, 예컨대 노린재목 해충에 의한 섭식 중단을 야기하며, 궁극적인 결과는, 예컨대, 형질전환된 식물이 노린재목 해충에 의한 추가의 피해로부터 보호된다는 것이다. dsRNA 분자의 조정 효과는, 예를 들어 하우스키핑 유전자를 포함한, 세포 대사 또는 세포 형질전환을 담당하는 내인성 유전자; 전사 인자; 탈피-관련 유전자; 및 세포 대사 또는 정상적인 성장 및 발생에 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 다른 유전자를 포함한, 해충에서 발현되는 다양한 유전자에 적용될 수 있는 것으로 나타났다.
생체 내 트랜스젠 또는 발현 구축물로부터의 전사를 위해, 일부 구현예에서는 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일렌서 및 폴리아데닐화 신호)을 사용하여 RNA 가닥 (또는 가닥들)을 전사시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같이, iRNA 분자를 생산하는데 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열은 식물 숙주 세포에서 기능적인 하나 이상의 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 통상적으로 숙주 게놈 내에 상주하는 내인성 프로모터일 수 있다. 작동가능하게 연결된 프로모터 서열의 제어 하에, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 추가로 그의 전사 및/또는 생성된 전사물의 안정성에 유리한 영향을 미치는 추가의 서열에 플랭킹될 수 있다. 이러한 서열은 작동가능하게 연결된 프로모터의 상류, 발현 구축물의 3' 말단의 하류에 위치할 수 있고, 프로모터의 상류 및 발현 구축물의 3' 말단의 하류 둘 다에서 발생할 수 있다.
일부 구현예는 식물을 섭식하는 노린재목 해충에 의해 유발되는 숙주 식물(예를 들어, 옥수수 식물)에 대한 피해를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포를 숙주 식물에 제공하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자(들)는 노린재목 해충(들)에 의한 섭취 시 해충(들) 내에서의 타겟 서열의 발현을 억제하도록 기능하고, 발현 억제는 노린재목 해충(들)의 사멸, 감소된 성장 및/또는 감소된 생식을 야기하고, 이에 의해 노린재목 해충(들)에 의해 유발되는 숙주 식물에 대한 피해가 감소된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자(들)는 dsRNA 분자를 포함한다. 이들 및 추가 구현예에서, 핵산 분자(들)는 노린재목 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나 초과의 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자(들)는 노린재목 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
다른 구현예들에서, 옥수수 작물의 수확량을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자를 옥수수 식물 내로 도입하는 단계; 옥수수 식물을 재배하여 상기 핵산 서열을 포함하는 iRNA 분자가 발현되도록 하는 단계를 포함함하며, 여기서 상기 핵산 서열을 포함하는 iRNA 분자의 발현은 노린재목 해충 성장 및/또는 노린재목 해충 피해를 억제함으로써, 노린재목 해충 침입에 기인한 수확량 손실을 감소시키거나 또는 제거하는 것인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 구현예에서, 핵산 분자(들)는 노린재목 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나 초과의 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자(들)는 노린재목 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일부 구현예들에서, 노린재목 해충에서 타겟 유전자의 발현을 조정하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결된 것인 단계; 복수의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물이 발생하도록 하는데 충분한 조건 하에서 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계; 핵산 분자가 그의 게놈 내로 편입된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계; 형질전환된 식물 세포를 편입된 핵산 분자에 의해 코딩된 iRNA 분자의 발현에 대해 스크리닝하는 단계; iRNA 분자를 발현하는 트랜스제닉 식물 세포를 선택하는 단계; 및 선택된 트랜스제닉 식물 세포를 노린재목 해충에게 섭식시키는 단계를 포함한다. 식물은 또한 편입된 핵산 분자에 의해 코딩된 iRNA 분자를 발현하는 형질전환된 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 일부 구현예에서, iRNA 분자는 dsRNA 분자이다. 이들 및 추가 구현예에서, 핵산 분자(들)는 노린재목 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나 초과의 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 dsRNA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자(들)는 노린재목 해충 세포에서 발현되는 핵산 분자에 특이적으로 혼성화가능한 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
본 발명의 iRNA 분자는 식물 세포의 게놈 내로 편입된 재조합 유전자로부터의 발현 산물로서, 또는 식재하기 전 종자에 적용되는 코팅제 또는 종자 처리제 내로 혼입되는 것으로, 식물 종 (예를 들어, 옥수수)의 종자 내에 혼입될 수 있다. 재조합 유전자를 포함하는 식물 세포는 트랜스제닉 사건인 것으로 간주된다. 노린재목 해충으로의 iRNA 분자의 전달을 위한 전달 시스템이 또한 본 발명의 구현예에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 iRNA 분자는 노린재목 해충(들)의 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 도입 방법은 노린재목 해충(들)에 대한 숙주로부터의 식물 조직과 iRNA를 직접 혼합하는 것, 뿐만 아니라 본 발명의 iRNA 분자를 포함하는 조성물을 숙주 식물 조직에 적용시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, iRNA 분자는 식물 표면 상에 분무될 수 있다. 대안적으로, iRNA 분자는 미생물에 의해 발현될 수 있고, 미생물은 식물 표면 상에 적용될 수 있거나 또는 물리적인 수단, 예컨대 주사에 의해 뿌리 또는 줄기 내로 도입될 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 트랜스제닉 식물은 또한 식물에 침입하는 것으로 공지된 노린재목 해충을 사멸시키는데 충분한 양으로 적어도 1 종의 iRNA 분자를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생산된 iRNA 분자는 또한 농업상의 일반적인 관행과 일치하는 방식으로 제제화될 수 있고, 노린재목 해충에 의한 식물 피해를 방제하기 위한 분무식 제품으로서 사용될 수 있다. 제제는 효율적으로 잎을 피복시키는데 요구되는 적절한 스티커 및 습윤제, 뿐만 아니라 UV 피해로부터 iRNA 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)를 보호하기 위한 UV 보호제를 포함할 수 있다. 이러한 첨가제는 생물살곤충제 산업에서 통상적으로 사용되며, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 주지되어 있다. 이러한 적용예들은 다른 분무식 살곤충제 적용예 (생물학적 기반 또는 다른 것)과 함께 조합되어서 해충으로부터의 식물 보호를 증진시킬 수 있다.
본원에 인용된 공개, 특허 및 특허출원을 포함한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명시적 세부사항과 불일치하지 않는 정도로 본원에 참조로 포함되고, 마치 각각의 참고문헌이 개별적이면서 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어지며 그 전문이 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 그렇게 포함된다. 본원에 논의된 참고문헌들은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서의 아무 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 그러한 개시내용을 앞서는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기 실시예는 소정의 특정한 특징 및/또는 측면을 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 개시내용을 기재된 특정한 특색 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1
신열대 갈색 노린재 (BSB; 유쉬스투스 헤로스 ) 콜로니.
BSB를 65% 상대 습도의 27℃ 인큐베이터에서 16: 8시간 명기:암기 주기로 사육시켰다. 2-3일에 걸쳐 수집한 1 그램의 알을 바닥에 여과지 디스크를 깐 5L 용기 내에 시딩하고, 환기를 위해 #18 메쉬로 용기를 덮었다. 각각의 사육 용기는 대략 300-400마리의 성충 BSB를 생성하였다. 모든 단계에서, 곤충에게 1주에 3회 신선한 녹색 콩을 섭식시키고, 해바라기 종자, 대두 및 땅콩 (중량 비 3:1:1)을 함유하는 종자 혼합물 주머니(sachet)를 1주에 1회 교체했다. 심지로서 코튼 플러그를 갖는 바이알에 물을 보충하였다. 초기 2주 후에, 곤충을 1주에 1회 새로운 용기로 옮겼다.
BSB 인공 먹이. BSB 인공 먹이를 다음과 같이 제조하였다 (제조 2주 이내에 사용함). 동결건조된 그린 빈(green bean)을 MAGIC BULLET®블렌더에서 미세 분말로 블렌딩하면서, 미가공 (유기) 땅콩을 별개의 MAGIC BULLET®블렌더에서 블렌딩하였다. 블렌딩된 건조 성분을 대형 MAGIC BULLET®블렌더에 조합하고 (중량 백분율: 그린 빈, 35%; 땅콩, 35%; 수크로스, 5%; 비타민 복합체 (예를 들어, 곤충용 반더잔트(Vanderzant) 비타민 혼합물, SIGMA-ALDRICH, 카탈로그 번호 V1007), 0.9%); 이를 마개를 닫고 성분들이 혼합되도록 잘 진탕하였다. 이어서, 혼합된 건조 성분들을 믹싱 볼에 첨가하였다. 별개의 용기에서, 물 및 베노밀 항진균제 (50 ppm; 25 μL의 20,000 ppm 용액/50 mL 먹이 용액)를 잘 혼합한 다음, 건조 성분 혼합물에 첨가하였다. 용액이 완전히 블렌딩될 때까지 모든 성분을 수동으로 혼합하였다. 먹이를 원하는 크기로 형상화하고, 알루미늄 호일로 느슨하게 랩핑하고, 60℃에서 4시간 동안 가열한 다음, 냉각시키고, 4℃에서 저장하였다.
실시예 2
dsRNA 생산 목적 타겟 유전자의 식별 및 증폭
BSB 전사체 조립. 6개의 BSB 발생 단계를 mRNA 라이브러리 제조를 위해 선택하였다. -70℃에서 동결시킨 곤충으로부터 총 RNA를 추출하고, FastPrep®-24 기기 (MP BIOMEDICALS, 캘리포니아주 산타 아나) 상에서 용해 매트릭스 A 2 mL 튜브 (MP BIOMEDICALS) 내의 10 부피의 용해/결합 완충제(Lysis/Binding buffer) 중에서 균질화하였다. 총 mRNA를 mirVana™ miRNA 단리 키트 (AMBION; INVITROGEN)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 추출하였다. illumina®HiSeq™ 시스템 (캘리포니아주 샌디에고)을 사용한 RNA 서열분석은 RNAi 곤충 방제 기술에 사용하기 위한 후보 타겟 유전자 서열을 제공하였다. HiSeq™은 6개의 샘플에 대해 총 약 378백만개의 판독물을 생성하였다. 판독물은 TRINITY 어셈블러 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에 대해 개별적으로 조립하였다 (Grabherr 등 (2011) Nature Biotech. 29:644-652). 조립된 전사물을 조합하여 풀링된 전사체를 생성하였다. 이러한 BSB 풀링된 전사체는 378,457개의 서열을 함유하였다.
BSB 스레드 오르토로그 식별. 질의 서열로 드로소필라 스레드, th-PA, 단백질 서열 GENBANK 수탁 번호 NP_524101을 사용하여 BSB 풀링된 전사체의 tBLASTn 검색을 수행하였다. BSB 스레드 (서열번호 1)는 예측된 펩티드 서열인 서열번호 2를 갖는 유쉬스투스 헤로스 후보 타겟 유전자 산물로 확인되었다.
서열번호 1의 서열은 신규하다. BSB 스레드 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)의 가장 근접한 상동체는 GENBANK 수탁번호 AK417560을 가진 톱다리 개미허리 노린재 mRNA이다 (79% 유사성). BSB스레드 아미노산 서열 (서열번호 2)의 가장 근접한 상동체는 GENBANK 수탁 번호 BAN20775.1을 갖는 톱다리 개미허리 노린재 단백질이다 (80% 유사; 상동성 영역에 걸쳐 66% 동일).
주형 제조 및 dsRNA 합성. TRIzol®시약 (LIFE TECHNOLOGIES)을 사용하여 단일 초기 성충 곤충 (약 90 mg)으로부터 추출된 총 BSB RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 펠릿 페슬 (FISHERBRAND 카탈로그 번호 12-141-363) 및 페슬 모터 믹서 (COLE-PARMER, 일리노이주 베르논 힐스)를 사용하여 200 μL의 TRIzol®이 담긴 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내에서 실온에서 곤충을 균질화하였다. 균질화 후에, 추가의 TRIzol®800 μL을 첨가하고, 균질물을 볼텍싱한 다음, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 제조업체에서 추천한 TRIzol®1 mL의 경우의 TRIzol®추출 프로토콜에 따라, RNA 펠릿을 실온에서 건조시키고, 용리 완충제 유형 4 (즉, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0)를 사용하여 GFX PCR DNA 및 겔 추출 키트 (illustra™; GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES)로부터의 트리스 완충제 200 μL 중에 재현탁시켰다. NanoDrop™ 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽, 델라웨어주 윌밍톤)를 사용하여 RNA 농도를 결정하였다.
cDNA 증폭. 공급업체의 권고 프로토콜에 따라 RT-PCR용 SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM™ (INVITROGEN)을 사용하여, 5 μg의 BSB 총 RNA 주형 및 올리고 dT 프라이머로부터 cDNA를 역전사시켰다. 전사 반응의 최종 부피는 뉴클레아제-무함유 물에 의해 100 μL로 하였다.
BSB_스레드-1, 주형으로도 언급되는 BSB_스레드 영역 1을 증폭하기 위해 프라이머 BSB_th-dsRNA1_For (서열번호 6) 및 BSB_th-dsRNA1_Rev (서열번호 7)를 사용하였다. BSB_스레드-2, 주형으로도 언급되는 BSB_스레드 영역 2를 증폭하기 위해 프라이머 BSB_th-dsRNA2_For (서열번호 8) 및 BSB_th-dsRNA2_Rev (서열번호 9)를 사용하였다 (표 1). DNA 주형을 주형으로서 1 μL의 cDNA (상기)를 사용하는 터치-다운 PCR (어닐링 온도를 60℃에서 50℃로 1℃/주기 감소로 낮춤)에 의해 증폭시켰다. BSB_스레드-1 (서열번호 3)의 652 bp 절편 또는 BSB_스레드-2 (서열번호 4)의 608 bp 절편을 포함하는 단편을 35회의 PCR 사이클 동안 생산하였다. 또한 상기 절차를 사용하여 YFPv2-F (서열번호 13) 및 YFPv2-R (서열번호 14) 프라이머를 사용하여 301 bp 음성 대조군 주형 YFPv2 (서열번호 12)를 증폭시켰다. BSB_ 스레드 및 YFPv2 프라이머는 그의 5' 말단에 T7 파지 프로모터 서열 (서열번호 5)을 함유하였고, 이에 따라 dsRNA 전사를 위한 YFPv2 및 BSB_스레드 DNA 단편의 사용이 가능하였다.
예시적인 스레드 타겟 유전자 및 YFP 음성 대조군 유전자의 코딩 영역의 부분을 증폭시키는데 사용된 프라이머 및 프라이머 쌍.
유전자 ID 프라이머 ID 서열 ID
번호: 		서열
쌍 1 스레드-1 BSB_th-1_For 6 TAATACGACTCACTATAGGGTCAGAACGACTCAAAACATT
BSB_th-1_Rev 7 TAATACGACTCACTATAGGGTGCCACATACTTCTTCAACAAAT
쌍 2 스레드-2 BSB_th-2_For 8 TAATACGACTCACTATAGGGCTTAAGCAGCAGTACAGGAGAAC
BSB_th-2_Rev 9 TAATACGACTCACTATAGGGCTTTGCAACAGGTTAACAGGGAAT
쌍 3 YFP YFP-F_T7 17 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACACCATGGGCTCCAGCGGCGCCC
YFP-R_T7 20 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGATCTTGAAGGCGCTCTTCAGG
dsRNA 합성. 제조업체의 지침에 따라 사용된 MEGAscript™ RNAi 키트 (AMBION)에 의해 주형으로서 2 μL PCR 산물 (상기)을 사용하여 dsRNA를 합성하였다. 도 1을 참조한다. dsRNA를 NANODROP™ 8000 분광광도계 상에서 정량화하고, 뉴클레아제-무함유 0.1X TE 완충제 (1 mM 트리스 HCL, 0.1 mM EDTA, pH 7.4) 중에서 500 ng/μL로 희석하였다.
실시예 3
스레드 RNAi 주입 후 신열대 갈색 노린재 ( 유쉬스투스 헤로스 )의 사멸율.
BSB를 65% 상대 습도 및 16:8시간 명기:암기 광주기의 27℃ 인큐베이터에서 그린 빈 및 종자 먹이 상에 콜로니로서 사육시켰다. 제2령 약충 (각각 1 내지 1.5 mg으로 칭량됨)을 소형 브러시로 온화하게 다루어 손상을 방지하고, 빙상의 페트리 접시에 두어 곤충을 냉각 및 고정시켰다. 각각의 곤충에게 55.2 nL 500 ng/μL dsRNA 용액 (즉, 27.6 ng dsRNA; 18.4 내지 27.6 μg/체중 g의 투여량)을 주사하였다. 주사는 드루몬드 3.5 인치 #3-000-203-G/X 유리 모세관으로부터 당겨지는 주사 바늘이 장착된, NANOJECT™ II 주사기 (DRUMMOND SCIENTIFIC, 펜실베니아주 브룸홀)를 사용하여 수행하였다. 바늘 팁을 파괴하고, 모세관을 경질 미네랄 오일로 다시 채운 다음, 2 내지 3 μL의 dsRNA를 채웠다. dsRNA를 약충의 복부 내로 주사하고 (시험당 dsRNA당 10마리의 곤충에게 주사함), 시험을 다른 3일에 반복하였다. 주사된 곤충 (웰당 5마리)을 인공 BSB 먹이의 펠릿을 함유하는 32-웰 트레이 (Bio-RT-32 사육 트레이; BIO-SERV, 뉴저지주 프렌치타운) 내로 옮기고, Pull-N- Peel™ 탭 (BIO-CV-4; BIO-SERV)으로 덮었다. 코튼 심지를 갖는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내 1.25 mL의 물에 의해 수분을 공급하였다. 트레이를 26.5℃, 60% 습도, 및 16: 8시간 명기:암기 광주기에서 인큐베이션하였다. 생존율 카운트 및 중량을 주사 후 7일째에 취하였다.
주입은 BSB 스레드 가 치명적인 dsRNA 타겟임을 확인하였다. YFP 코딩 영역인 YFPv2의 절편을 타겟화하는 dsRNA를 BSB 주입 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다. 표 2에 요약된 바와 같이, 적어도 10마리의 제2 령(instar) BSB 약충 (각각 1 내지 1.5mg)에 약 18.4 내지 27.6 μdsRNA/ 곤충 g의 최종 농도를 위해 500 ng/μ인 BSB_스레드-1 또는 BSB_스레드-2 dsRNA 55.2 nl를 혈체강에 주입하였다. 상기한 바와 같이 각각의 곤충에 주사된 희석된 시리즈에서 27.6 ng, 6.9 ng, 0.69 ng, 및 0.069 ng 농도의 dsRNA를 사용하였다. dsRNA 주입 후 7일에 사멸율 백분율을 기록하였다. BSB_thread-1 및 BSB_thread-2 dsRNA에 대해 결정된 사멸률은 동일한 양으로 주사된 YFP v2 dsRNA (음성 대조군)에 의해 관찰된 것과 유의하게 상이하였다, 각각 p = 0.000196 및 0.000101을 가짐 (스튜던트 t-검정). YFP가 주입된 것과 주입 처리가 되지 않은 것 사이에서 유의한 차이가 없었다. RNAi 반응은 높은 사멸율을 제공하는 모든 시험된 투여량에서 농도에 둔감하였다 (표 3). 반복된 생물검정은 특정한 샘플 섭취가 BSB 약충의 놀라운 예상외의 사멸을 야기한다는 것을 입증하였다.
제2령 갈색 노린재 약충의 혈체강 내로의 BSB_스레드 dsRNA 주사의 주사 7일 후의 결과.
처리* N 시험 평균 사멸률%
±SEM 		p 값
t -검정
BSB 스레드 -1 3 97% ±3 1.96E-04**
BSB 스레드 -2 3 100% ±0 1.01E-04**
YFP v2 dsRNA 3 10% ±6
주입하지 않음 3 20% ±12 3.45E-01
*각각의 dsRNA의 경우에 시험당 10마리의 곤충에게 주사함.
** 은 통계하적 유의성을 나타냄 (p<0.05).
BSB_스레드 dsRNA의 연속 희석. 27.6 ng 내지 0.069 ng 범위의 투여량. dsRNA 주입 후 7일에 사멸률 백분율을 기록하였다.
곤충 당 dsRNA 양에서의 사멸률
dsRNA 27.6 ng 6.9 ng 0.69 ng 0.069 ng
BSB_스레드-1 100% 100% 100% 100%
BSB_스레드-2 100% 100% 100% 50%
YFP 0% 20% NT NT
NT=시험되지 않음
실시예 4
식물 형질전환 벡터의 구축
화학적으로 합성된 단편 (DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크) 및 표준 분자 클로닝 방법의 조합을 사용하여, 스레드(서열번호 1)의 절편을 포함하는 헤어핀 형성을 위한 타겟 유전자 구축물을 보유하는 진입 벡터(pDAB119602 및 pDAB119603). (단일 전사 단위 내에서) 타겟 유전자 절편의 2개의 카피를 대향 배향으로 배열하고, 2개의 절편을 ST-LS1 인트론 서열 (서열번호 16; Vancanneyt 등 (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)에 의해 분리시킴으로써 RNA 일차 전사물에 의한 분자내 헤어핀 형성을 용이하게 한다. 따라서, 일차 mRNA 전사물은 인트론 서열에 의해 분리된, 서로의 큰 역위 반복부로서 2개의 스레드 유전자 절편 서열을 함유한다. 1차 mRNA 헤어핀 전사체의 생산을 유도하기 위해 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (미국 특허 제5,510,474호)의 카피를 사용하였고, 헤어핀-RNA-발현 유전자의 전사를 종결하기 위해 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자 (ZmPer5 3'UTR v2; 미국 특허 제6,699,984호)의 3’비번역 영역을 포함하는 단편을 사용하였다.
진입 벡터 pDAB119602는 스레드의 절편(서열번호 1)을 포함하는 스레드 헤어핀 v1-RNA 구축물 (서열번호: 10)을 포함한다.
진입 벡터 pDAB119603은 pDAB119602에서 발견되는 것과 구분되는 스레드의 절편(서열번호 1)을 포함하는 스레드 헤어핀 v4-RNA 구축물 (서열번호 11)을 포함한다.
상술한 진입 벡터 pDAB119602 및 pDAB119603를 통상적인 이원 목표 벡터 (pDAB101836)와의 표준 GATEWAY®재조합 반응에 사용하여 아그로박테리움-매개 메이즈 배아 형질전환을 위한 스레드 헤어핀 RNA 발현 형질전환 벡터를 생산한다 (각각 pDAB119611 및 pDAB119612).
YFP 헤어핀 dsRNA를 발현하는 유전자를 포함하는, 음성 대조군 이원 벡터인 pDAB110853dmf 전형적인 이원 목표 벡터(pDAB109805) 및 진입 벡터 pDAB101670과의 표준 GATEWAY®재조합 반응에 의해 구축한다. 진입 벡터 pDAB101670은 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 제어 하의 YFP 헤어핀 서열 (서열번호 15) 및 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
이원 목표 벡터 pDAB109805는 사탕수수 간균형 바드나바이러스 (ScBV) 프로모터(Schenk 등 (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30)의 조절 하의 제초제 내성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (미국 특허 제7838733호(B2), 및 Wright 등 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5)를 포함한다. 옥수수 줄무늬 바이러스 (MSV) 외피 단백질 유전자 5'UTR의 서열 및 옥수수 알코올 디히드로게나제 1 (ADH1) 유전자의 인트론 6으로 구성된 합성 5’서열을 SCBV 프로모터 절편의 3’말단과 AAD-1 코딩 영역의 개시 코돈 사이에 위치시켰다. 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 제7,179,902호)을 포함하는 단편을 사용하여 AAD-1 mRNA의 전사를 종결시킨다.
YFP 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는, 추가의 음성 대조군 이원 벡터 pDAB110556를 전형적인 이원 목표 벡터 (pDAB9989) 및 진입 벡터 pDAB100287과의 표준 GATEWAY® 재조합 반응에 의해 구축한다. 이원 목표 벡터 pDAB9989는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 조절 하의 제초제 내성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; AAD-1 v3) (상기와 같음) 및 메이즈 리파제 유전자로부터의 3' 비번역 영역(ZmLip 3'UTR; 상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다. 진입 벡터 pDAB9379는 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (상기와 같음)의 발현 제어 하의 YFP 코딩 영역 (서열번호: 43) 및 메이즈 퍼옥시다제 5 유전자로부터의 3' 비번역 영역 (상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
서열번호 10은 pDAB119611에서 발견되는 스레드 헤어핀 v1-RNA-형성 서열을 나타낸다.
서열번호 11은 pDAB119612에서 발견되는 스레드 헤어핀 v4-RNA-형성 서열을 나타낸다.
실시예 5
살충성 헤어핀 dsRNA를 포함하는 트랜스제닉 메이즈 조직의 생산
아그로박테리움 -매개 형질전환 아그로박테리움-매개 형질전환 후 식물 게놈 내로 안정적으로 편입된 키메라 유전자의 발현을 통해 하나 이상의 살곤충 dsRNA 분자 (예를 들어, 스레드 서열번호 1)를 포함하는 유전자를 타겟화하는 dsRNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 dsRNA 분자)를 생산하는 트랜스제닉 메이즈 세포, 조직 및 식물을 생산하였다. 초이원 또는 이원 형질전환 벡터를 사용하는 메이즈 형질전환 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제8,304,604호에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 형질전환된 조직을 할록시포프(Haloxyfop)-함유 배지에서 성장하는 능력에 의해 선택하고, 적절한 경우에 dsRNA 생산에 대해 스크리닝하였다. 이와 같이 형질전환된 조직 배양물의 일부가 생물학적 분석을 위한 BSB에 제시될 수 있다.
아그로박테리움 배양 개시 상기 (실시예 2)에 기재된 이원 형질전환 벡터 pDAB114515, pDAB115770, pDAB110853 또는 pDAB110556를 보유하는 아그로박테리움 균주 DAt13192 세포 (PCT 국제 특허 공개 번호 WO 2012/016222A2)의 글리세롤 스톡을 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 상에 스트리킹하고 (Watson, 등. (1975) J. Bacteriol. 123:255-264), 3일 동안 20℃에서 성장시킨다. 이어서, 배양물을 동일한 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 (gm/L: 효모 추출물, 10; 펩톤, 10; NaCl, 5) 상에 스트리킹하고, 1일 동안 20℃에서 인큐베이션한다.
아그로박테리움 배양 실험 당일에, 접종 배지의 원액 및 아세토시린곤을 실험에서의 구축물 수에 적절한 부피로 준비하고, 멸균 일회용 250 mL 플라스크 내로 피펫팅한다. 접종 배지 (Frame 등 (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341)는 다음을 함유하고 있다: 2.2 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민 (Frame 등, 상기 문헌); 68.4 gm/L 수크로스; 36 gm/L 글루코스; 115 mg/L L-프롤린; 및 100 mg/L 미오-이노시톨; pH 5.4). 아세토시린곤을 접종 배지를 함유하는 플라스크에 100% 디메틸 술폭시드 중 1 M 원액으로부터 200 μM의 최종 농도로 첨가하고, 용액을 철저히 혼합한다.
각각의 구축물에 대해, YEP 플레이트로부터의 아그로박테리움의 1 또는 2 접종 루프-풀을 멸균 일회용 50 mL 원심분리 튜브 내의 15 mL의 접종 배지/아세토시린곤 원액에 현탁시키고, 550 nm에서의 용액의 광학 밀도 (OD550)를 분광광도계에서 측정한다. 이어서, 현탁액을 추가의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물을 사용하여 0.3 내지 0.4의 OD550으로 희석시킨다. 이어서, 아그로박테리움 현탁액의 튜브를 실온에서 약 75 rpm으로 설정된 플랫폼 진탕기 상에 수평으로 놓고, 배아 절개를 수행하면서 1 내지 4시간 동안 진탕시킨다.
이삭 멸균 및 배아 단리 메이즈 미성숙 배아를 온실에서 성장시킨 제아 메이스 근교계 B104의 식물 (Hallauer 등 (1997) Crop Science 37:1405-1406)로부터 수득하고, 자기- 또는 형매-수분시켜 이삭을 생산한다. 수분후(post-pollination) 대략 10 내지 12일에 이삭을 수확한다. 실험 당일에, 도정된 이삭을 상업용 표백제 (Ultra Clorox® Germicidal Bleach(살균 표백제), 6.15% 차아염소산나트륨; 트윈(TWEEN) 20 2 방울 포함)의 20% 용액 중에 침지시키고, 20 내지 30분 동안 진탕시키고, 이어서 층류 후드 내부의 멸균 탈이온수 중에서 3회 헹구어 표면-멸균한다. 미성숙 접합 배아 (1.8 내지 2.2 mm 길이)를 각 이삭으로부터 무균 절개하고, 2 μL의 10% BREAK-THRU® S233 계면활성제 (Evonik Industries; 독일 에센)가 첨가되는, 200 μM 아세토시린곤을 갖는 액체 접종 배지에 적절한 아그로박테리움 세포의 현탁액 2.0 mL를 함유하는 마이크로원심분리 튜브 내로 무작위로 분배한다. 주어진 실험 세트를 위해, 풀링된 이삭으로부터의 배아를 각 형질전환에 사용한다.
아그로박테리움 공동-배양 단리 후에, 배아를 5분 동안 로커 플랫폼 상에 놓는다. 이어서, 튜브의 내용물을 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바 (3,6-디클로로-o-아니스산 또는 3,6-디클로로-2-메톡시벤조산); 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO3; DMSO 중 200 μM 아세토시린곤; 및 3 gm/L GELZAN™, pH 5.8을 함유하는, 공동-배양 배지(Co-cultivation Medium)의 플레이트 상에 붓는다. 액체 아그로박테리움 현탁액을 멸균 일회용 전달 피펫으로 제거한다. 이어서, 배아를 현미경의 보조 하에 멸균 겸자를 사용하여 배반이 상부를 향하도록 배향시킨다. 플레이트를 닫고, 3M™ MICROPORE™ 의료 테이프로 밀봉하고, 광합성 유효 방사선 (Photosynthetically Active Radiation, PAR)의 대략 60 μmol m-2s-1 에서의 연속광이 있는 25℃의 인큐베이터에 놓는다.
트랜스제닉 사건의 캘러스 선택 및 재생 공동-배양 기간 후에, 배아를 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH 중 3.3 mg/L 디캄바; 100 mg/L 미오-이노시톨; 100 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO3; 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 1수화물; PhytoTechnologies Labr.; 캔자스주 레넥사); 250 mg/L 카르베니실린; 및 2.3 gm/L Gelzan™; pH 5.8으로 구성된, 휴지 배지(Resting Medium)로 옮겼다. 36개 이하의 배아를 각 플레이트로 이동시킨다. 플레이트를 투명 플라스틱 상자에 넣고, 7 내지 10일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광이 있는 27℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 100 nM R-할록시포프 산 (0.0362 mg/L; AAD-1 유전자를 보유하는 캘러스의 선택을 위함)을 갖는 휴지 배지 (상기)로 구성된, 선택 배지 I(Selection Medium I) 상에 캘러스화 배아를 옮긴다 (<18/플레이트). 플레이트를 투명한 상자로 복귀시키고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광이 있는 27℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 500 nM R-할록시포프 산 (0.181 mg/L)을 갖는 휴지 배지 (상기)로 구성된, 선택 배지 II에 캘러스화 배아를 옮긴다 (<12/플레이트). 플레이트를 투명한 상자로 복귀시키고, 14일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광이 있는 27℃에서 인큐베이션한다. 이러한 선택 단계는 트랜스제닉 캘러스가 추가로 증식하고 분화될 수 있게 한다.
증식 중인 배아발생 캘러스를 사전-재생(Pre-Regeneration) 배지에 옮긴다 (<9/플레이트). 사전-재생 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 45 gm/L 수크로스; 350 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 미오-이노시톨; 50 mg/L 카세인 효소 가수분해물; 1.0 mg/L AgNO3; 0.25 gm/L MES; NaOH 중 0.5 mg/L 나프탈렌아세트산; 에탄올 중 2.5 mg/L 아브시스산; 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린; 250 mg/L 카르베니실린; 2.5 gm/L Gelzan™; 및 0.181 mg/L 할록시포프 산; pH 5.8을 함유한다. 플레이트를 투명한 상자에 보관하고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2s-1 PAR에서의 연속광이 있는 27℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 재생 캘러스를 Phytatrays™ (sigma-aldrich) 내의 재생 배지에 옮기고 (<6/플레이트), 14일 동안 또는 싹 및 뿌리가 발생할 때까지 (대략 160 μmol m-2s-1 PAR에서) 일당 16시간 명기/8시간 암기 하에 28℃에서 인큐베이션한다. 재생 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 60 gm/L 수크로스; 100 mg/L 미오-이노시톨; 125 mg/L 카르베니실린; 3 gm/L Gellan™ 검; 및 0.181 mg/L R-할록시포프 산; pH 5.8을 함유한다. 이어서, 일차 뿌리를 갖는 작은 싹을 단리하고, 선택 없이 신장 배지(Elongation Medium)로 옮긴다. 신장 배지는 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형된 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 및 3.5 gm/L Gelrite™: pH 5.8를 함유한다.
할록시포프를 함유하는 배지 상에서 성장하는 능력에 의해 선택된 형질전환된 식물 싹을 Phytatrays™로부터 성장 배지 (ProMix BX; Premier Tech Horticulture)로 채워진 작은 용기로 이식하고, 컵 또는 HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS)로 덮고, 이어서 Conviron 성장 챔버 (27℃ 낮/24℃ 밤, 16-시간 광주기, 50-70% RH, 200 μmol m-2s-1 PAR)에서 강화시킨다. 일부 경우에, 추정 트랜스제닉 소식물체를 메이즈 게놈 내로 편입된 AAD1 제초제 내성 유전자를 검출하도록 설계된 프라이머를 사용하는 정량적 실시간 PCR 검정에 의해 트랜스젠 상대 카피수에 대해 분석한다. 또한, 추정상의 형질전환체의 발현된 dsRNA에서 ST-LS1 인트론 서열의 존재를 검출하기 위해 RNA qPCR 분석법을 사용할 수 있다. 선택된 형질전환된 소식물체를 추가의 성장 및 시험을 위해 온실 내로 이동시킨다.
생물검정 및 종자 생산을 위해 온실로 T 0 의 이동 및 확립 식물이 V3-V4 단계에 도달했을 때, 이를 IE Custom Blend (PROFILE/METRO MIX 160) 토양 혼합물로 이식하고, 성장시켜 온실 (광 노출 유형: 광 또는 동화; 높은 광 한계: 1200 PAR; 16-시간 낮 길이; 27℃ 낮/24℃ 밤)에서 개화시킨다.
곤충 생물검정에 사용할 식물을 작은 용기로부터 Tinus™ 350-4 Rootrainers® (Spencer-Lemaire Industries, 캐나다 앨버타주 애치슨)로 이식한다 (Rootrainer® 당 사건당 1그루의 식물). Rootrainers®로 이식한지 대략 4일 후에, 생물검정을 위해 식물을 침입시킨다.
T1 세대의 식물은 비-트랜스제닉 우량 근교계 B104의 식물로부터 수집한 화분 또는 다른 적절한 화분 공여자를 사용하여 T0 트랜스제닉 식물의 수염을 수분시키고 생성된 종자를 식재함으로써 수득한다. 가능할 때 상반 교배를 수행한다.
실시예 6
트랜스제닉 메이즈 조직의 분자 분석
섭식 피해를 평가하는 당일에 온실에서 성장한 식물로부터 수집한 잎 및 뿌리로부터의 샘플에 대해 메이즈 조직의 분자 분석 (예를 들어 RT-qPCR)을 수행한다.
Per5 3'UTR 유전자에 대한 RNA qPCR 검정의 결과를 사용하여 헤어핀 트랜스젠의 발현을 검증한다. (메이즈 조직에서 내인성 Per5 유전자의 발현이 보통 있기 때문에, 형질전환되지 않은 메이즈 식물에서 낮은 수준의 Per5 3’검출이 예상된다.) 발현된 RNA에서 ST-LS1 인트론 서열 (dsRNA 헤어핀 분자의 형성에 필수적임)에 대한 RNA qPCR 분석법의 결과를 헤어핀 전사체의 존재를 평가하는데 사용하였다. 트랜스젠 RNA 발현 수준을 내인성 메이즈 유전자의 RNA 수준에 대해 측정한다.
게놈 DNA에서 AAD1 코딩 영역의 부분을 검출하기 위한 DNA qPCR 분석을 사용하여 트랜스젠 삽입 카피수를 예측한다. 이들 분석을 위한 샘플을 환경 챔버에서 성장시킨 식물로부터 수집한다. 결과를 단일-카피 천연 유전자의 부분을 검출하도록 설계된 검정의 DNA qPCR 결과와 비교하고, 단순 사건 (1 또는 2 카피의 스레드 트랜스젠을 가짐)을 온실에서 추가의 연구를 위해 진행시킨다.
추가로, 스펙티노마이신-저항성 유전자 (SpecR; T-DNA 밖의 이원 벡터 플라스미드 상에 보유됨)의 부분을 검출하도록 설계된 qPCR 검정을 사용하여 트랜스제닉 식물이 이질 통합된 플라스미드 백본 서열을 함유하는지 여부를 결정한다.
헤어핀 RNA 전사체 발현 수준: Per 5 3'UTR qPCR 캘러스 세포 사건 또는 트랜스제닉 식물을 Per 5 3'UTR 서열의 실시간 정량적 PCR (qPCR)에 의해 분석하여, TIP41-유사 단백질 (즉, GENBANK 수탁 번호 AT4G34270의 메이즈 상동체; 74% 동일성의 tBLASTX 스코어를 가짐)을 코딩하는, 내부 메이즈 유전자 (서열번호 21; GENBANK 수탁 번호 BT069734)의 전사물 수준에 비교하여 전장 헤어핀 전사물의 상대 발현 수준을 결정한다. RNAeasy™ 96 키트 (Qiagen, 캘리포니아주, 발렌시아 소재)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 총 RNA를 키트의 제안된 프로토콜에 따라 DNAse1 처리에 적용한다. 이어서, RNA를 NanoDrop 8000 분광광도계(Thermo Scientific) 상에서 정량화하고, 농도를 25 ng/μL로 정규화한다. 실질적으로 제조업체의 권고된 프로토콜에 따라, 5 μL의 변성된 RNA와 함께 10 μL 반응 부피로 고용량 cDNA 합성 키트 (INVITROGEN)를 사용하여 제1 가닥 cDNA를 제조한다. 조합된 무작위 프라이머 및 올리고 dT의 작업 스톡을 제조하기 위해, 무작위 프라이머 스톡 혼합물의 1 mL 튜브 내로 100 μM T20VN 올리고뉴클레오티드 (IDT) (서열번호 22; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, 이때 V는 A, C 또는 G이고, N은 A, C, G 또는 T/U임)의 10 μL 첨가를 포함하도록 프로토콜을 약간 변형한다.
cDNA 합성 후에, 뉴클레아제-무함유 물을 사용하여 샘플을 1:3으로 희석하고, 검정할 때까지 -20℃에서 보관한다.
Per5 3' UTR 유전자 및 TIP41-유사 전사물에 대한 별개의 실시간 PCR 검정을 10 μL 반응 부피로 LightCycler™ 480 (Roche diagnostics, 인디애나주 인디애나폴리스) 상에서 수행한다. Per5 3'UTR 분석을 위해, 프라이머 P5U76S (F) (서열 번호 23) 및 P5U76A (R) (서열 번호 24), 및 Roche Universal Probe™ (UPL76; 카탈로그 번호 4889960001; FAM으로 표지되어 있음)로 반응을 수행하였다. TIP41-유사 참조 유전자 검정을 위해, 프라이머 TIPmxF (서열번호 25) 및 TIPmxR (서열번호 26), 및 HEX (헥사클로로플루오레신)로 표지된 프로브 HXTIP (서열번호 27)를 사용한다.
모든 검정은 주형을 함유하지 않는 음성 대조군을 포함한다 (혼합물 단독). 표준 곡선을 위해, 샘플의 교차-오염을 체크하기 위해 소스 플레이트에 블랭크 (소스 웰 중 물)를 또한 포함시킨다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 4에 기재된다. 다양한 전사물의 검출을 위한 반응 성분 레시피는 표 5에 개시되고, PCR 반응 조건은 표 6에 요약된다. FAM (6-카르복시 플루오레세인 아미다이트) 형광 모이어티를 465 nm에서 여기시키고, 형광을 510 nm에서 측정하며; HEX (헥사클로로플루오레세인) 형광 모이어티에 대한 상응하는 값은 533 nm 및 580 nm이다.
트랜스제닉 메이즈에서 전사물 수준의 분자 분석을 위한 올리고뉴클레오티드 서열.
타겟 올리고뉴클레오티드 서열 ID
번호 		서열
Per5 3'UTR P5U76S (F) 23 TTGTGATGTTGGTGGCGTAT
Per5 3'UTR P5U76A (R) 24 TGTTAAATAAAACCCCAAAGATCG
Per5 3'UTR Roche UPL76
(FAM-Probe)		 NAv** Roche Diagnostics 카탈로그 번호 488996001
TIP41 TIPmxF 25 TGAGGGTAATGCCAACTGGTT
TIP41 TIPmxR 26 GCAATGTAACCGAGTGTCTCTCAA
TIP41 HXTIP
(HEX-Probe) 		27 TTTTTGGCTTAGAGTTGATGGTGTACTGATGA
*TIP41-유사 단백질.
**NAv 서열 공급업체로부터 이용불가능함
전사물 검출을 위한 PCR 반응 레시피.
Per5 3'UTR TIP-유사 유전자
성분 최종 농도
로슈 완충제 1 X 1X
P5U76S (F) 0.4 μ 0
P5U76A (R) 0.4 μ 0
Roche UPL76 (FAM) 0.2 μ 0
HEXtipZM F 0 0.4 μ
HEXtipZM R 0 0.4 μ
HEXtipZMP (HEX) 0 0.2 μ
cDNA (2.0 μ NA NA
물 10 μ로 10 μ로
RNA qPCR을 위한 써모사이클러 조건.
Per5 3'UTR 및 TIP41-유사 유전자 검출
공정 온도 시간 주기 수
타겟 활성화 95 ℃ 10 분 1
변성 95 ℃ 10 초 40
연장 60 ℃ 40 초
FAM 또는 HEX 획득 72 ℃ 1 초
냉각 40 ℃ 10 초 1
LightCycler™ 소프트웨어 v1.5를 사용하여, 공급업체의 추천에 따라 Cq 값 계산을 위한 2차 도함수 최대 알고리즘을 사용하여 상대 정량화에 의해 데이터를 분석한다. 발현 분석을 위해, ΔΔCt 방법 (즉, 2-(Cq 타겟- Cq 참조))을 사용하여 발현 값을 계산하며, 이는 2개의 타겟 간의 Cq 값 차이 비교에 의존하고, 최적화된 PCR 반응의 경우, 산물은 주기마다 배가된다는 가정하에서 기준 값을 2로 선택한다.
전사물 크기 및 완전성: 노던 블롯 검정 일부 경우에, 스레드 헤어핀 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 식물에서 스레드 헤어핀 RNA의 분자 크기를 결정하기 위해 노던 블롯 (RNA 블롯) 분석을 사용하여 트랜스제닉 식물의 추가의 분자 특징화를 얻는다.
모든 재료 및 장비를 사용 전에 RNAzap (AMBION/INVITROGEN)으로 처리한다. 조직 샘플 (100 mg 내지 500 mg)을 2 mL 세이프록 에펜도르프 튜브에 수집하고, 5분 동안 1 mL TRIzol (INVITROGEN) 중 3개의 텅스텐 비드를 갖는 Klecko™ 조직 미분쇄기 (Garcia Manufacturing, 캘리포니아주 비살리아)로 분쇄하고, 이어서 10분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션한다. 임의적으로, 샘플을 4℃에서 10분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 신선한 2 mL 세이프록 에펜도르프 튜브 내로 옮긴다. 200 μL 클로로포름을 균질물에 첨가한 후에, 튜브를 2 내지 5분 동안 반전에 의해 혼합하고, 10분 동안 RT에서 인큐베이션하고, 4℃에서 15분 동안 12,000 x g로 원심분리한다. 최상부 상을 멸균 1.5 mL 에펜도르프 튜브 내로 옮기고, 100% 이소프로판올 600 μL를 첨가한 후, 10분 내지 2시간 동안 RT에서 인큐베이션하고 나서, 4℃ 내지 25℃에서 10분 동안 12,000 x g로 원심분리한다. 상청액을 폐기하고, RNA 펠릿을 70% 에탄올 1 mL로 2회 세척하고, 세척 사이에 4℃ 내지 25℃에서 10분 동안 7,500 x g로 원심분리한다. 에탄올을 폐기하고, 펠릿을 3 내지 5분 동안 간단히 공기 건조시킨 후에, 뉴클레아제-무함유 물 50 μL 중에 재현탁시킨다.
총 RNA를 Nanodrop 8000® (Thermo-Fisher)를 사용하여 정량화하고, 샘플을 5 μg/10 μL로 정규화한다. 이어서, 10 μL 글리옥살 (AMBION/INVITROGEN)을 각 샘플에 첨가한다. DIG RNA 표준 마커 믹스 (Roche Applied Science, 인디애나주 인디애나폴리스) 5 내지 14 ng를 분배하고, 동등 부피의 글리옥살에 첨가한다. 샘플 및 마커 RNA를 45분 동안 50℃에서 변성시키고, NorthernMax 10 X 글리옥살 전개 완충제 (AMBION/INVITROGEN) RNA 중 1.25% SeaKem 골드 아가로스 (Lonza, 뉴저지주 앨런데일) 겔 상 로딩이 2시간 15분 동안 65 volts/30 mA에서 전기영동에 의해 분리될 때까지 얼음 상에 보관한다.
전기영동 후에, 겔을 5분 동안 2X SSC 중에서 헹구고, 겔 독 스테이션 (BioRad, 캘리포니아주 허큘레스) 상에서 영상화하고 나서, RNA를 전달 완충제로서 10X SSC를 사용하여 (20X SSC는 3 M 염화나트륨 및 300 mM 시트르산삼나트륨으로 이루어짐, pH 7.0), RT에서 밤새 나일론 막 (Millipore)에 수동으로 전달한다. 전달 후에, 막을 5분 동안 2X SSC 중에서 헹구고, RNA를 막(Agilent/Stratagene)에 UV-가교시키고, 막을 최대 2일 동안 실온에서 건조되도록 한다.
막을 1 내지 2시간 동안 UltraHyb 완충제 (AMBION/INVITROGEN)에서 사전-혼성화시킨다. 프로브는 로슈 어플라이드 사이언스 DIG 절차에 의해 디곡시게닌(digoxigenin)으로 표지된 관심 서열 (예를 들어, 적절한 경우에 서열번호 10 또는 11의 안티센스 서열 부분)을 함유하는 PCR 증폭된 산물로 구성된다. 추천된 완충제 중에서의 혼성화는 혼성화 튜브에서 60℃의 온도에서 밤새 이루어진다. 혼성화 후에, 모두 DIG 키트의 공급업체에 의해 추천된 방법에 의해, 블롯을 DIG 세척에 적용하고, 랩핑하고, 1 내지 30분 동안 필름에 노출시키고, 이어서 필름을 현상한다.
트랜스젠 카피수 결정.
대략 2개 잎 펀치와 동등한 메이즈 잎 조각들을 96-웰 집합 플레이트 (퀴아젠)에 수집한다. 1개의 스테인레스 스틸 비드를 갖는 Biosprint96 AP1 용해 완충제 (Biosprint96 플랜트 키트로 공급됨; 퀴아젠) 중에서 Klecko™ 조직 미분쇄기 (Garcia Manufacturing, 캘리포니아주, 비살리아)를 사용하여 조직 파괴를 수행한다. 조직 온침 후에, 게놈 DNA (gDNA)를 Biosprint96 PLANT KIT 및 Biosprint96 추출 로봇을 사용하여 고처리량 포맷으로 단리한다. qPCR 반응을 설정하기 전에 게놈 DNA를 2:3 DNA:물로 희석하였다.
qPCR 분석 가수분해 프로브 검정에 의한 트랜스젠 검출은 LightCycler®480 시스템을 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행한다. ST-LS1 인트론 서열 (서열번호 16)을 검출하거나, SpecR 유전자 (즉, 이원 벡터 플라스미드 상에 보유된 스펙티노마이신 저항성 유전자; 서열번호 28; 표 7에서의 SPC1 올리고뉴클레오티드)의 부분을 검출하기 위한 가수분해 프로브 검정에 사용할 올리고뉴클레오티드는, LightCycler® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 사용하여 설계한다. 추가로, AAD-1 제초제 내성 유전자 의 절편(서열번호 29; 표 7에서의 GAAD1 올리고뉴클레오티드)을 검출하기 위한 가수분해 프로브 검정에 사용할 올리고뉴클레오티드는 프라이머 익스프레스 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 사용하여 설계한다. 표 7은 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다. gDNA가 각 검정에 존재한다는 것을 확실하게 하기 위해 내부 참조 서열로서의 역할을 하는, 내인성 메이즈 염색체 유전자에 대한 시약 (인버타제 (서열번호 30; GENBANK 수탁번호 U16123; 본원에서 IVR1로 지칭됨))을 사용하여 검정을 멀티플렉스화한다. 증폭을 위해, LightCycler®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스)를 0.4 μM의 각 프라이머 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1x 최종 농도로 제조한다 (표 8). 2 단계 증폭 반응을 표 9에 요약된 바와 같이 수행한다. FAM- 및 HEX-표지된 프로브에 대한 형광단 활성화 및 방출은 상기 기재된 바와 같으며; CY5 접합체는 650 nm에서 최대로 여기하고, 670 nm에서 최대로 형광을 낸다.
피트 포인트 알고리즘 (LightCycler® 소프트웨어 출시 1.5) 및 (ΔΔCt 방법에 기초한) 상대 정량적 모듈을 사용하여 실시간 PCR 데이터로부터 Cp 스코어 (형광 신호가 배경 역치와 교차하는 지점)를 결정한다. 데이터를 이전에 기재된 바와 같이 취급한다 (상기에서; RNA qPCR).
유전자 카피수 결정 및 이원 벡터 플라스미드 백본 검출에 사용된 프라이머 및 프로브 (형광 접합체 포함)의 서열.
명칭 서열 ID
번호: 		서열
ST-LS1- F 40 GTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGAT
ST-LS1- R 41 CCATGTTTTGGTCATATATTAGAAAAGTT
ST-LS1-P (FAM) 42 AGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAAT
GAAD1-F 31 TGTTCGGTTCCCTCTACCAA
GAAD1-R 32 CAACATCCATCACCTTGACTGA
GAAD1-P (FAM) 33 CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA
IVR1-F 34 TGGCGGACGACGACTTGT
IVR1-R 35 AAAGTTTGGAGGCTGCCGT
IVR1-P (HEX) 36 CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC
SPC1A 37 CTTAGCTGGATAACGCCAC
SPC1S 38 GACCGTAAGGCTTGATGAA
TQSPEC (CY5*) 39 CGAGATTCTCCGCGCTGTAGA
CY5 = 시아닌-5
유전자 카피수 분석 및 플라스미드 백본 검출을 위한 반응 성분.
성분 양 (μL) 스톡 최종 농도
2x 완충제 5.0 2x 1x
적절한 정방향 프라이머 0.4 10 μ 0.4
적절한 역방향 프라이머 0.4 10 μ 0.4
적절한 프로브 0.4 5 μ 0.2
IVR1-정방향 프라이머 0.4 10 μ 0.4
IVR1-역방향 프라이머 0.4 10 μ 0.4
IVR1-프로브 0.4 5 μ 0.2
H2O 0.6 NA* NA
gDNA 2.0 ND** ND
합계 10.0
*NA = 적용가능하지 않음
**ND = 결정되지 않음
DNA qPCR을 위한 써모사이클러 조건
게놈 카피수 분석
공정 온도 시간 주기 수
타겟 활성화 95 ℃ 10 분 1
변성 95 ℃ 10 초 40
연장 & 획득
FAM, HEX, 또는 CY5		 60 ℃ 40 초
냉각 40 ℃ 10 초 1
실시예 7
노린재목 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 제아 메이스
실시예 4에 기술된 바와 같이 서열번호 1, 서열번호 3, 및/또는 서열번호 4를 포함하는 핵산에 대한 발현 벡터를 포함하는 1 내지 20개의 트랜스제닉 T0 제아 메이스 식물을 생산하였다. BSB 챌린지를 위해, RNAi 구축물에 대해 헤어핀 dsRNA를 발현하는 추가의 10-20종의 T1 제아 메이스 독립 계통을 수득한다. 헤어핀 dsRNA는 서열번호 10 또는 서열번호 11과 같이 또는 다르게는 서열번호 1을 추가로 포함하는 것과 같이 유도될 수 있다. 이들을 RT-PCR 또는 다른 분자 분석 방법을 통해 확증한다. 각각의 RNAi 구축물 중 헤어핀 발현 카세트의 ST-LS1 인트론에서 결합하도록 설계된 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 위해, 선택된 독립 T1 계통으로부터의 총 RNA 제제를 임의적으로 사용한다. 추가로, RNAi 구축물 중 각 타겟 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 임의적으로 사용하여 식물내에서 siRNA 생산에 요구되는 사전-가공된 mRNA를 증폭시키고 그의 생산을 확증한다. 각 타겟 유전자에 대해 원하는 밴드의 증폭은 각 트랜스제닉 제아 메이스 식물에서의 헤어핀 RNA의 발현을 확증시킨다. 이후, 타겟 유전자의 dsRNA 헤어핀의 siRNA로의 가공은 임의적으로 RNA 블롯 혼성화를 사용하여 독립 트랜스제닉 계통에서 확증한다.
또한, 타겟 유전자에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 미스매치 서열을 갖는 RNAi 분자는 타겟 유전자에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 RNAi 분자에 의해 관찰되는 것과 유사한 방식으로 옥수수 뿌리벌레에게 영향을 미친다. 동일한 RNAi 구축물에서 헤어핀 dsRNA를 형성하기 위한 미스매치 서열과 천연 서열의 쌍형성은 섭식중인 노린재목 해충의 성장, 발생 및 생존율에 영향을 미칠 수 있는 식물-가공된 siRNA를 전달한다.
타겟 유전자에 상응하는 dsRNA, siRNA, shRNA 또는 miRNA의 식물내 전달 및 노린재목 해충에 의한 섭식을 통한 후속 흡수는 노린재목 해충에서 RNA-매개 유전자 침묵을 통한 타겟 유전자의 하향-조절을 초래한다. 하나 이상의 발생 단계에서 타겟 유전자의 기능이 중요한 경우, 노린재목 해충의 성장, 발생, 및 생식은 영향을 받으며, 유쉬스투스 헤로스, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 네자라 비리둘라, 아크로스터넘 힐라레, 및 유쉬스투스 세르부스 중 적어도 하나의 경우에 성공적인 감염, 섭식, 발생, 및/또는 생식의 실패를 야기하거나, 노린재목 해충의 사멸을 야기한다. 이어서, 타겟 유전자의 선택 및 RNAi의 성공적 적용을 노린재목 해충의 방제를 위해 사용한다.
트랜스제닉 RNAi 계통 및 비형질전환 제아메이스 의 표현형 비교 헤어핀 dsRNA를 생성하기 위해 선택된 타겟 노린재목 해충 유전자 또는 서열은 어떠한 공지된 식물 유전자 서열에 대해 아무런 유사성을 갖지 않는다. 따라서, 이들 노린재목 해충 유전자 또는 서열을 타겟화하는 구축물에 의한 (침투성) RNAi의 생산 또는 활성화가 트랜스제닉 식물에 임의의 유해 효과를 가질 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 트랜스제닉 계통의 발생 및 형태학적 특징을 비형질전환된 식물, 뿐만 아니라 헤어핀-발현 유전자를 갖지 않는 "빈" 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 계통의 그것과 비교한다. 식물 뿌리, 싹, 잎 및 생식 특징을 비교한다. 트랜스제닉 및 비형질전환된 식물의 뿌리 길이 및 성장 패턴에 있어서는 어떠한 관찰가능한 차이도 없다. 식물 싹 특징, 예컨대 높이, 잎의 수 및 크기, 개화 시기, 꽃의 크기 및 외관은 유사하다. 일반적으로, 시험관 내 및 온실 내 토양에서 배양할 때, 트랜스제닉 계통과 타겟 iRNA 분자가 발현되지 않은 것 사이에는 어떠한 관찰가능한 형태학적 차이도 없다.
실시예 8
노린재목 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 글리신 맥스
다음과 같이 예컨대 아그로박테리움-매개된 형질전환에 의한 것을 포함하여, 당업계에 공지된 바에 따라 서열번호 1, 서열번호 3, 및/또는 서열번호 4를 포함하는 핵산에 대한 발현 벡터를 포함하는 1 내지 20개의 트랜스제닉 T0 글리신 맥스 식물을 생산하였다. 성숙 대두 (글리신 맥스) 종자를 16시간 동안 염소 기체로 밤새 멸균한다. 염소 기체로 멸균시킨 후, 종자를 Laminar™ 유동 후드 내의 개방 용기에 두어 염소 기체를 없앤다. 다음에, 멸균 종자에 24℃에서 흑색 상자를 사용한 암실에서 16시간 동안 멸균 H2O를 흡수시킨다.
분할-종자 대두의 제조. 배축 프로토콜의 부분을 포함하는 분할 대두 종자는, 종피를 분리 및 제거하고 종자를 2개의 자엽 절편으로 분할하기 위해 스칼펠에 고정된 #10 블레이드를 사용하여 종자의 꼭지를 따라 종축으로 절단되는 대두 종자 물질의 제조를 요구한다. 배축을 부분적으로 제거하는데 세심한 주의를 기울여야 하며, 여기서 배축의 약 1/2 - 1/3이 자엽의 마디 끝에 부착된 채로 남아있다.
접종. 이어서, 배축의 부분적인 부분을 포함하는 분할 대두 종자를 서열번호 1, 서열번호 3 및/또는 서열번호 4를 포함하는 이원 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 (예를 들어, 균주 EHA 101 또는 EHA 105)의 용액에서 약 30분 동안 침지시킨다. 배축을 포함하는 자엽을 침지시키기 전에, 아그로박테리움 투메파시엔스 용액을 λ=0.6 OD650의 최종 농도로 희석시킨다.
공동-배양. 접종 후, 분할 대두 종자를 한 장의 여과지로 덮인 페트리 접시 내의 공동-배양 배지 상에서 아그로박테리움 투메파시엔스 균주와 5일 동안 공동-배양되게 한다 (Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.).
싹 유도. 공동-배양 5일 후, 분할 대두 종자를 B5 염, B5 비타민, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 수크로스, 0.6 g/L MES, 1.11 mg/L BAP, 100 mg/L Timentin™, 200 mg/L 세포탁심 및 50 mg/L 반코마이신 (pH 5.7)으로 이루어진 액체 싹 유도 (SI) 배지에서 세척한다. 이어서, 분할 대두 종자를 B5 염, B5 비타민, 7 g/L 노블 한천, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 수크로스, 0.6 g/L MES, 1.11 mg/L BAP, 50 mg/L Timentin™, 200 mg/L 세포탁심, 50 mg/L 반코마이신 (pH 5.7)으로 이루어진 싹 유도 I (SI I) 배지 상에서 배양하고, 자엽의 편평한 면은 위를 향하고 자엽의 마디 끝은 배지 내로 박혀있다. 배양 2주 후, 형질전환된 분할 대두 종자로부터의 외식편을 6 mg/L 글루포시네이트 (Liberty®가 보충된 SI I 배지를 함유하는 싹 유도 II (SI II) 배지로 옮긴다.
싹 신장. SI II 배지 상에서의 배양 2주 후에, 외식편으로부터 자엽을 제거하고, 자엽의 기저에서 절단을 수행함으로써, 배축을 함유하는 돋아난 싹 패드를 절제한다. 자엽으로부터 단리된 싹 패드를 싹 신장 (SE) 배지로 옮긴다. SE 배지는 MS 염, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 수크로스 및 0.6 g/L MES, 50 mg/L 아스파라긴, 100 mg/L L-피로글루탐산, 0.1 mg/L IAA, 0.5 mg/L GA3, 1 mg/L 제아틴 리보시드, 50 mg/L Timentin™, 200 mg/L 세포탁심, 50 mg/L 반코마이신, 6 mg/L 글루포시네이트, 7 g/L 노블 한천 (pH 5.7)으로 이루어진다. 배양물을 2주마다 신선한 SE 배지로 옮긴다. 배양물을 80-90 μmol/m2sec의 광 강도에서 18시간 광주기를 사용하여 24℃에서 Conviron™ 성장 챔버 내에서 성장시킨다.
발근. 발근을 촉진시키기 위해, 자엽 싹 패드의 기저에서 신장된 싹을 절단하고, 신장된 싹을 1-3분 동안 1 mg/L IBA (인돌 3-부티르산)에 침지시킴으로써 자엽 싹 패드로부터 발생된 신장된 싹을 단리한다. 다음에, 신장된 싹을 피타 트레이 내 발근 배지 (MS 염, B5 비타민, 28 mg/L 제1철, 38 mg/L Na2EDTA, 20 g/L 수크로스 및 0.59 g/L MES, 50 mg/L 아스파라긴, 100 mg/L L-피로글루탐산 7 g/L 노블 한천, pH 5.6)로 옮긴다.
배양. 24℃, 18시간 광주기에서 1-2주 동안 Conviron™ 성장 챔버 내에서 배양한 후, 덮인 선데 컵 내의 토양 혼합물로 뿌리가 발생된 싹을 옮기고, 소식물체의 순응을 위해 일정한 온도 (22℃) 및 습도 (40-50%) 하에 120-150 μmol/m2sec의 광 강도에서 긴 낮 조건 (16시간 명기/8시간 암기) 하에 Conviron™ 성장 챔버 (모델 CMP4030 및 CMP3244, Controlled Environments Limited, 캐나다 마니토바주 위니펙)에 둔다. 발근 소식물체를 선데 컵(sundae cup)에서 수주 동안 순응시킨 후에, 강건한 트랜스제닉 대두 식물의 향후 순응 및 정착을 위해 온실로 옮긴다.
BSB 챌린지를 위해, RNAi 구축물에 대해 헤어핀 dsRNA를 발현하는 추가의 10-20종의 T1 글리신 맥스 독립 계통을 수득한다. 헤어핀 dsRNA는 서열번호 10 및/또는 서열번호 11 또는 서열번호 1을 추가로 포함하는 것과 같이 유도될 수 있다. 이들을 RT-PCR 또는 다른 분자 분석 방법을 통해 확증한다. 각각의 RNAi 구축물 중 헤어핀 발현 카세트의 ST-LS1 인트론에서 결합하도록 설계된 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 위해, 선택된 독립 T1 계통으로부터의 총 RNA 제제를 임의적으로 사용한다. 추가로, RNAi 구축물 중 각 타겟 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 임의적으로 사용하여 식물내에서 siRNA 생산에 요구되는 사전-가공된 mRNA를 증폭시키고 그의 생산을 확증한다. 각 타겟 유전자에 대한 원하는 밴드의 증폭은 각 트랜스제닉 글리신 맥스 식물에서의 헤어핀 RNA의 발현을 확증시킨다. 이후, 타겟 유전자의 dsRNA 헤어핀의 siRNA로의 가공은 임의적으로 RNA 블롯 혼성화를 사용하여 독립 트랜스제닉 계통에서 확증한다.
또한, 타겟 유전자에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 미스매치 서열을 갖는 RNAi 분자는 타겟 유전자에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 RNAi 분자에 의해 관찰되는 것과 유사한 방식으로 옥수수 뿌리벌레에게 영향을 미친다. 동일한 RNAi 구축물에서 헤어핀 dsRNA를 형성하기 위한 미스매치 서열과 천연 서열의 쌍형성은 섭식중인 노린재목 해충의 성장, 발생 및 생존율에 영향을 미칠 수 있는 식물-가공된 siRNA를 전달한다.
타겟 유전자에 상응하는 dsRNA, siRNA, shRNA 또는 miRNA의 식물내 전달 및 노린재목 해충에 의한 섭식을 통한 후속 흡수는 노린재목 해충에서 RNA-매개 유전자 침묵을 통한 타겟 유전자의 하향-조절을 초래한다. 하나 이상의 발생 단계에서 타겟 유전자의 기능이 중요한 경우, 노린재목 해충의 성장, 발생, 및 생식은 영향을 받으며, 유쉬스투스 헤로스, 피에조도루스 구일디니이, 할리오모르파 할리스, 네자라 비리둘라, 아크로스터넘 힐라레, 및 유쉬스투스 세르부스 중 적어도 하나의 경우에 성공적인 감염, 섭식, 발생, 및/또는 생식의 실패를 야기하거나, 노린재목 해충의 사멸을 야기한다. 이어서, 타겟 유전자의 선택 및 RNAi의 성공적 적용을 노린재목 해충의 방제를 위해 사용한다.
트랜스제닉 RNAi 계통 및 비형질전환 글리신 맥스의 표현형 비교. 헤어핀 dsRNA를 생성하기 위해 선택된 타겟 노린재목 해충 유전자 또는 서열은 어떠한 공지된 식물 유전자 서열에 대해 아무런 유사성을 갖지 않는다. 따라서, 이들 노린재목 해충 유전자 또는 서열을 타겟화하는 구축물에 의한 (침투성) RNAi의 생산 또는 활성화가 트랜스제닉 식물에 임의의 유해 효과를 가질 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 트랜스제닉 계통의 발생 및 형태학적 특징을 비형질전환된 식물, 뿐만 아니라 헤어핀-발현 유전자를 갖지 않는 "빈" 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 계통의 그것과 비교한다. 식물 뿌리, 싹, 잎 및 생식 특징을 비교한다. 트랜스제닉 및 비형질전환된 식물의 뿌리 길이 및 성장 패턴에 있어서는 어떠한 관찰가능한 차이도 없다. 식물 싹 특징, 예컨대 높이, 잎의 수 및 크기, 개화 시기, 꽃의 크기 및 외관은 유사하다. 일반적으로, 시험관 내 및 온실 내 토양에서 배양할 때, 트랜스제닉 계통과 타겟 iRNA 분자가 발현되지 않은 것 사이에는 어떠한 관찰가능한 형태학적 차이도 없다.
실시예 9
인공 먹이에 대한 E. 헤로스 생물검정.
인공 먹이에 대한 dsRNA 섭식 검정에서, 주사 실험 (실시예 1 참조)에서와 같이 32-웰 트레이에 ~18 mg 펠릿의 인공 먹이 및 물을 설치한다. 200 ng/μL의 농도의 dsRNA를 먹이 펠릿 및 물 샘플에; 2개 웰 각각에 100 μL로 첨가한다. 5마리의 제2령 E. 헤로스 약충을 각 웰 내로 도입한다. 물 샘플 및 YFP 전사물을 타겟화하는 dsRNA를 음성 대조군으로서 사용한다. 실험을 서로 다른 3일에 반복한다. 처리 8일 후에, 생존하는 곤충을 칭량하고, 사멸률을 결정한다.
실시예 10
노린재목 해충 서열을 포함하는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나
실시예 3과 유사한 표준 분자 방법을 사용하여 스레드 (서열번호 1)의 절편을 포함하는 헤어핀 형성을 위한 타겟 유전자 구축물을 함유하는 아라비돕시스 형질전환 벡터를 생산하였다. 표준 아라비돕시스-기반 공정을 사용하여 아라비돕시스 형질전환을 수행하였다. T1 종자에 대해 글루포시네이트 내성 선택성 마커를 선택한다. 트랜스제닉 T1 아라비돕시스 식물을 생성하고, 동형접합 단순-카피 T2 트랜스제닉 식물을 곤충 연구를 위해 생성한다. 화서가 있는 성장 중인 아라비돕시스 식물에 대해 생물검정을 수행한다. 5 내지 10마리 곤충을 각 식물 위에 두고, 14일 내에 생존에 대해 모니터링한다.
아라비돕시스 형질전환 벡터의 구축. 화학적으로 합성된 단편 (DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크) 및 표준 분자 클로닝 방법의 조합을 사용하여, 스레드의 절편 (서열번호 1)을 포함하는 헤어핀 형성을 위한 타겟 유전자 구축물을 보유하는 진입 벡터 pDAB119602 및 pDAB119603에 기초한 진입 클론 (단일 전사 단위 내에서) 타겟 유전자 절편의 2개의 카피를 대향 배향으로 배열하고, 2개의 절편을 ST-LS1 인트론 서열(서열번호 16)에 의해 분리시킴으로써 RNA 일차 전사물에 의한 분자내 헤어핀 형성을 용이하게 한다 (Vancanneyt 등 (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). 따라서, 일차 mRNA 전사물은 인트론 서열에 의해 분리된, 서로의 큰 역위 반복부로서 2개의 스레드 유전자 절편 서열을 함유한다. 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (Callis 등 (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493)의 카피를 사용해서 일차 mRNA 헤어핀 전사물의 생산을 구동하고, 아그로박테리움 투메파시엔스의 오픈 리딩 프레임 23으로부터의 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR v1; 미국 특허 제5,428,147호)을 포함하는 단편을 사용하여 헤어핀-RNA-발현 유전자의 전사를 종결시킨다.
진입 벡터 pDAB119602은 스레드(서열번호 1)의 절편을 포함하는 스레드 헤어핀 v1-RNA 구축물 (서열번호 10)을 포함한다.
진입 벡터 pDAB119603은 pDAB119602에서 발견되는 것과 구분되는 스레드(서열번호 1)의 절편을 포함하는 스레드 헤어핀 v4-RNA 구축물 (서열번호 11)을 포함한다.
상기된 진입 벡터 pDAB119602 및 pDAB119603 내의 헤어핀 클론을 통상적인 이원 목표 벡터 pDAB101836에 의한 표준 GATEWAY® 재조합 반응에 사용하여, 아그로박테리움-매개 아라비돕시스 형질전환을 위한 헤어핀 RNA 발현 형질전환 벡터를 생산한다.
이원 목표 벡터 pDAB101836는, 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터 v2, 미국특허 제7601885호; Verdaguer 등, (1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139)의 조절 하에, 제초제 내성 유전자, DSM-2v2 (미국 특허 출원공개 번호 2011/0107455)를 포함한다. 아그로박테리움 투메파시엔스의 오픈 리딩 프레임 1로부터의 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR v6; Huang 등 (1990) J. Bacteriol. 172:1814-1822)을 포함하는 단편을 사용해서 DSM2v2 mRNA의 전사를 종결시킨다.
YFP 헤어핀 RNA를 발현하는 유전자를 포함하는 음성 대조군 이원 구축물 pDAB114507은 전형적인 이원 목표 벡터(pDAB101836) 및 진입 벡터 pDAB112644에 의한 표준 GATEWAY® 재조합 반응에 의해 구축한다. 진입 구축물 pDAB112644은 아라비돕시스 유비퀴틴 10 프로모터 (상기와 같음)의 발현 제어 하에 YFP 헤어핀 서열 (hpYFP v2-1, 서열번호 15) 및 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 ORF23 3' 비번역 영역 (상기와 같음)을 포함하는 단편을 포함한다.
서열번호 10은 pDAB119611에서 발견되는 스레드 헤어핀 v1-RNA-형성 서열을 나타낸다.
서열번호 11은 pDAB119612에서 발견되는 스레드 헤어핀 v4-RNA-형성 서열을 나타낸다.
살곤충 헤어핀 RNA를 포함하는 트랜스제닉 아라비돕시스 의 생산: 아그로박테리움 -매개 형질전환. 헤어핀 서열을 함유하는 이원 플라스미드를 아그로박테리움 균주 GV3101 (pMP90RK) 내로 전기천공한다. 재조합 아그로박테리움 클론을 재조합 아그로박테리움 콜로니의 플라스미드 제제의 제한 분석에 의해 확증한다. 퀴아젠 플라스미드 맥스 키트 (Qiagen, Cat# 12162)를 사용해서 제조업체 권고 프로토콜에 따라 아그로박테리움 배양물로부터 플라스미드를 추출한다.
아라비돕시스 형질전환 및 T 1 선택. 12 내지 15그루의 아라비돕시스 식물 (c.v. 콜럼비아)을 250 μmol/m2sec의 광 강도, 25℃ 및 18:6시간의 명기:암기 조건을 갖는 온실에서 4" 용기에서 성장시킨다. 형질전환 1주 전에 일차 꽃 줄기를 트리밍한다. 10 μL 재조합 아그로박테리움 글리세롤 스톡을 100 mL LB 브로쓰 (시그마 L3022) +100 mg/L 스펙티노마이신 + 50 mg/L 카나마이신 중 28℃에서 인큐베이션하고, 72시간 동안 225 rpm에서 진탕시킴으로써 아그로박테리움 접종물을 제조한다. 꽃을 침지시키기 전에 아그로박테리움 세포를 수거하고, 5% 수크로스 + 0.04% 실웨트(Silwet)-L77 (렐레 시즈(Lehle Seeds) Cat # VIS-02) + 10 μg/L 벤즈아미노 퓨린 (BA) 용액 중에 OD600 0.8~1.0으로 현탁시킨다. 식물의 지상 부분을 아그로박테리움 용액 중에 5-10분 동안 온화하게 교반하면서 침지시킨다. 이어서 식물을 종자가 세팅될 때까지 규칙적으로 급수 및 시비하면서 정상 성장을 위해 온실로 옮긴다.
실시예 11
트랜스제닉 아라비돕시스 의 성장 및 생물검정.
헤어핀 RNAi 구축물로 형질전환된 T 1 아라비돕시스 의 선택. 각 형질전환으로부터의 T1 종자 최대 200 mg을 0.1% 아가로스 용액 중에서 층화(stratify)시킨다. 종자를 #5 햇빛 배지를 갖는 발아 트레이 (10.5" x 21" x 1"; T.O. Plastics Inc., 미네소타주 클리어워터)에 식재한다. 식재 6 및 9일 후 형질전환체를 280 g/ha의 Ignite® (글루포시네이트)에의 내성에 대해 선택한다. 선택된 사건을 4" 직경 용기 내로 이식한다. 로슈 LightCycler480™을 사용하여 가수분해 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 통해 식재 1주일 내에 삽입 카피 분석을 수행한다. PCR 프라이머 및 가수분해 프로브를 LightCycler 프로브 디자인 소프트웨어 2.0 (로슈)을 사용하여 DSM2v2 선택성 마커에 대해 설계한다. 식물을 100-150 mE/m2xs 강도의 형광 및 백열광 하에 16:8시간 명기:암기 광주기로 24℃에서 유지시킨다.
E. 헤로스 식물 섭식 생물검정. 적어도 4개의 낮은 카피 (1-2개 삽입), 4개의 중간 카피 (2-3개 삽입) 및 4개의 높은 카피 (≥4개 삽입) 사건을 각각의 구축물에 대해 선택한다. 식물을 생식 단계 (꽃 및 장각과를 함유하는 식물)까지 성장시킨다. 용이한 곤충 식별을 위해 토양의 표면을 ~ 50 mL 부피의 백색 모래로 덮는다. 5 내지 10마리의 제2령 E. 헤로스 약충을 각각의 식물 상에 도입한다. 식물을 3" 직경, 16" 높이 및 0.03" 벽 두께를 갖는 플라스틱 튜브 (항목 번호 484485, Visipack Fenton 미주리주)로 덮고; 곤충 단리를 위해 튜브를 나일론 메쉬로 덮는다. 식물을 콘비론에서 정상 온도, 광 및 급수 조건 하에 놔둔다. 14일 만에, 곤충을 수집하고, 칭량하고; 사멸률 백분율 뿐만 아니라 성장 억제 (1 -처리군 중량/대조군 중량)를 계산한다. YFP 헤어핀-발현 식물을 대조군으로서 사용한다.
T 2 아라비돕시스 종자 생성 및 T 2 생물검정. T2 종자를 각각의 구축물에 대해 선택된 낮은 카피 (1-2개 삽입) 사건으로부터 생산한다. 식물 (동형접합 및/또는 이형접합)을 상기 기재된 바와 같은 E. 헤로스 섭식 생물검정에 적용한다. T3 종자를 동형접합체로부터 수거하고, 향후 분석을 위해 보관한다.
본 발명은 다양한 변형 및 대안적인 형태가 가능할 수 있지만, 구체적인 실시예들은 본원에서 상세히 예시적으로 기재되어 있다. 그러나, 본 발명이 개시된 특정 형태들에 한정되는 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 오히려, 본 발명은 다음과 같이 첨부된 청구범위 및 그 법적 등가물에 의해 정의되는 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있는 모든 변형, 등가물, 및 대안을 포함한다.
실시예 12
추가의 작물 종의 형질전환
본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예를 들어 이전에 미국 특허 제7,838,733호의 실시예 14, 또는 PCT 국제 특허 공개 번호 WO 2007/053482의 실시예 12에 기재된 것과 실질적으로 동일한 기술을 사용하여, 목화를 스레드 헤어핀 RNAi 구축물로 형질전환시켜 노린재목 해충의 방제를 제공한다.
스레드 dsRNA 트랜스젠은 풍부한 RNAi 타겟화 및 상승작용적 RNAi 효과를 제공하기 위해 다른 dsRNA 분자와 조합될 수 있다. 비제한적으로, 옥수수, 대두, 및 목화를 포함하여 스레드를 타겟으로 하는 dsRNA를 발현하는 트랜스제닉 식물은 노린재목 곤충에 의한 섭식 피해를 막는데 유용하다. 스레드 dsRNA 트랜스젠은 이러한 노린재목 제어 기술에 저항성인 집단의 발생을 완화시키기 위해 곤충 저항성 관리 유전자 피라미드에서 바실러스 투린지엔시스 살충성 단백질 기술과 병용하기 위한 새로운 작용 방식을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Narva, Ken E. Fishilevich, Elane Frey, Meghan Rangasamy, Murugesan Worden, Sarah Gandra, Premchand <120> THREAD NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CONFER RESISTANCE TO HEMIPTERAN PESTS <130> 75883 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2403 <212> DNA <213> Euschistus heros <400> 1 tattcatgcg ccaacgctga atgactcagg acccgtctca aggtcccctg gactggttac 60 ccttcacaag gatatttaca ccattctcct ccttcatctt tgccgggcat gtttccttcc 120 cctgcctgta gcagttttga caacccaggc agtaggttca ctctttaaag ttgtaggctc 180 ccctcgtctt tttaataatc ttctatatac taagatgtca actgaacaag aaactgtttc 240 tgttcgagga ggatacaaca caacagatag agtgactgat atgctaaatc atattgaaac 300 ttttgagagg ttacatgaaa atgtggcaag cacttcacaa agagagtgga atgctattga 360 agaatctgtt aatcttagaa aagagtcaga acgactcaaa acatttaaaa actggccagt 420 caacttcctt gaatccaaaa aattggcctc ggccgggttt tattacttaa gacaagacga 480 taaagtgcgt tgtgtatttt gtggtattga aattggtaat tggagacctg gagatgatcc 540 aatgaatgac catgttcgtt ggtctggtgg atgtccattt gtaaataaag aacccgttgg 600 caacattcct ctagaaaatg atgatgatga ccactcttct gatagagact ctggttttga 660 tacttgtggg ccttttagtc tacaaatcca gagttgtgga gataagacgg ctcttgcaga 720 agatcccaaa atattggaaa gccctaattt tttgaagacc aggccacctt catttccaga 780 ctatgctact attgatgcta ggctgcgctc ctatgataca tggccaatat ctctcaaatt 840 aaagcctaaa gtgcttagtg aagctggttt cttctacaca ggaaaaggtg accagacaat 900 atgctatcat tgcggaggag gtctgaaaga ctgggaagag acagatgaac cgtgggttga 960 acatgcaagg tggttctcta aatgtccatt tgttttgaca ttaaaaggga aagcatttgt 1020 tgaagaagta tgtggcaaaa aagctgaaga ggatttaaaa tcagctcatc ttaatggctt 1080 aagcttaagc agcagtacag gagaactgga gaaaattcaa acctttactc caagtgtaga 1140 aagtcaaaaa tcaatcaatg aaagcaatga agaagagagt agtagtatag aaagttcctc 1200 ttctggaatt ggatctcgca gtagttcaag gggcagctca gatgttcttc tttgcaagat 1260 ttgttacact gaagaagtcg gagcagtctt tctgccttgt ggtcatatga tggcatgtgt 1320 caaatgtgct ctgtctctat caacttgcgc agtttgtcgg aaacctgtga cagcattttt 1380 tcgagcattc gtctcctgag aaccagttga gaaatattca atctctagtc aaaagagagt 1440 taacacaaga aagtgtgcac gagaaaaaca 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catagtgtga tatactcctc tcagatcaat 2340 cataaggctg tgtgccagcc ttaataaaaa ttttcttttc tctttttttt tttttttttt 2400 ttt 2403 <210> 2 <211> 394 <212> PRT <213> Euschistus heros <400> 2 Met Ser Thr Glu Gln Glu Thr Val Ser Val Arg Gly Gly Tyr Asn Thr 1 5 10 15 Thr Asp Arg Val Thr Asp Met Leu Asn His Ile Glu Thr Phe Glu Arg 20 25 30 Leu His Glu Asn Val Ala Ser Thr Ser Gln Arg Glu Trp Asn Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Ser Val Asn Leu Arg Lys Glu Ser Glu Arg Leu Lys Thr Phe 50 55 60 Lys Asn Trp Pro Val Asn Phe Leu Glu Ser Lys Lys Leu Ala Ser Ala 65 70 75 80 Gly Phe Tyr Tyr Leu Arg Gln Asp Asp Lys Val Arg Cys Val Phe Cys 85 90 95 Gly Ile Glu Ile Gly Asn Trp Arg Pro Gly Asp Asp Pro Met Asn Asp 100 105 110 His Val Arg Trp Ser Gly Gly Cys Pro Phe Val Asn Lys Glu Pro Val 115 120 125 Gly Asn Ile Pro Leu Glu Asn Asp Asp Asp Asp His Ser Ser Asp Arg 130 135 140 Asp Ser Gly Phe Asp Thr Cys Gly Pro Phe Ser Leu Gln Ile Gln Ser 145 150 155 160 Cys Gly Asp Lys Thr Ala Leu Ala Glu Asp Pro Lys Ile Leu Glu Ser 165 170 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<210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 23 ttgtgatgtt ggtggcgtat 20 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 24 tgttaaataa aaccccaaag atcg 24 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 25 tgagggtaat gccaactggt t 21 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 26 gcaatgtaac cgagtgtctc tcaa 24 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized probe oligonucleotide <400> 27 tttttggctt agagttgatg gtgtactgat ga 32 <210> 28 <211> 151 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 28 gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 60 ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga 120 cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa g 151 <210> 29 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized partial coding region <400> 29 tgttcggttc cctctaccaa gcacagaacc gtcgcttcag caacacctca gtcaaggtga 60 tggatgttg 69 <210> 30 <211> 4233 <212> DNA <213> Zea mays <400> 30 agcctggtgt ttccggagga gacagacatg atccctgccg ttgctgatcc gacgacgctg 60 gacggcgggg gcgcgcgcag gccgttgctc ccggagacgg accctcgggg gcgtgctgcc 120 gccggcgccg agcagaagcg gccgccggct acgccgaccg ttctcaccgc cgtcgtctcc 180 gccgtgctcc tgctcgtcct cgtggcggtc acagtcctcg cgtcgcagca cgtcgacggg 240 caggctgggg gcgttcccgc gggcgaagat gccgtcgtcg tcgaggtggc cgcctcccgt 300 ggcgtggctg agggcgtgtc ggagaagtcc acggccccgc tcctcggctc cggcgcgctc 360 caggacttct cctggaccaa cgcgatgctg gcgtggcagc gcacggcgtt ccacttccag 420 ccccccaaga actggatgaa cggttagttg gacccgtcgc catcggtgac gacgcgcgga 480 tcgttttttt cttttttcct ctcgttctgg ctctaacttg gttccgcgtt tctgtcacgg 540 acgcctcgtg cacatggcga tacccgatcc gccggccgcg tatatctatc tacctcgacc 600 ggcttctcca gatccgaacg gtaagttgtt ggctccgata cgatcgatca catgtgagct 660 cggcatgctg cttttctgcg cgtgcatgcg gctcctagca ttccacgtcc acgggtcgtg 720 acatcaatgc acgatataat cgtatcggta cagagatatt gtcccatcag ctgctagctt 780 tcgcgtattg atgtcgtgac attttgcacg caggtccgct gtatcacaag ggctggtacc 840 acctcttcta ccagtggaac ccggactccg cggtatgggg caacatcacc tggggccacg 900 ccgtctcgcg cgacctcctc cactggctgc acctaccgct ggccatggtg cccgatcacc 960 cgtacgacgc caacggcgtc tggtccgggt cggcgacgcg cctgcccgac ggccggatcg 1020 tcatgctcta cacgggctcc acggcggagt cgtcggcgca ggtgcagaac ctcgcggagc 1080 cggccgacgc gtccgacccg ctgctgcggg agtgggtcaa gtcggacgcc aacccggtgc 1140 tggtgccgcc gccgggcatc gggccgacgg acttccgcga cccgacgacg gcgtgtcgga 1200 cgccggccgg caacgacacg gcgtggcggg tcgccatcgg gtccaaggac cgggaccacg 1260 cggggctggc gctggtgtac cggacggagg acttcgtgcg gtacgacccg gcgccggcgc 1320 tgatgcacgc cgtgccgggc accggcatgt gggagtgcgt ggacttctac ccggtggccg 1380 cgggatcagg cgccgcggcg ggcagcgggg acgggctgga gacgtccgcg gcgccgggac 1440 ccggggtgaa gcacgtgctc aaggctagcc tcgacgacga caagcacgac tactacgcga 1500 tcggcaccta cgacccggcg acggacacct ggacccccga cagcgcggag gacgacgtcg 1560 ggatcggcct ccggtacgac tatggcaagt actacgcgtc gaagaccttc tacgaccccg 1620 tccttcgccg gcgggtgctc tgggggtggg tcggcgagac cgacagcgag cgcgcggaca 1680 tcctcaaggg ctgggcatcc gtgcaggtac gtctcagggt ttgaggctag catggcttca 1740 atcttgctgg catcgaatca ttaatgggca gatattataa cttgataatc tgggttggtt 1800 gtgtgtggtg gggatggtga cacacgcgcg gtaataatgt agctaagctg gttaaggatg 1860 agtaatgggg ttgcgtataa acgacagctc tgctaccatt acttctgaca cccgattgaa 1920 ggagacaaca gtaggggtag ccggtagggt tcgtcgactt gccttttctt ttttcctttg 1980 ttttgttgtg gatcgtccaa cacaaggaaa ataggatcat ccaacaaaca tggaagtaat 2040 cccgtaaaac atttctcaag gaaccatcta gctagacgag cgtggcatga tccatgcatg 2100 cacaaacact agataggtct ctgcagctgt gatgttcctt tacatatacc accgtccaaa 2160 ctgaatccgg tctgaaaatt gttcaagcag agaggccccg atcctcacac ctgtacacgt 2220 ccctgtacgc gccgtcgtgg tctcccgtga tcctgccccg tcccctccac gcggccacgc 2280 ctgctgcagc gctctgtaca agcgtgcacc acgtgagaat ttccgtctac tcgagcctag 2340 tagttagacg ggaaaacgag aggaagcgca cggtccaagc acaacacttt gcgcgggccc 2400 gtgacttgtc tccggttggc tgagggcgcg cgacagagat gtatggcgcc gcggcgtgtc 2460 ttgtgtcttg tcttgcctat acaccgtagt cagagactgt gtcaaagccg tccaacgaca 2520 atgagctagg aaacgggttg gagagctggg ttcttgcctt gcctcctgtg atgtctttgc 2580 cttgcatagg gggcgcagta tgtagctttg cgttttactt cacgccaaag gatactgctg 2640 atcgtgaatt attattatta tatatatatc gaatatcgat ttcgtcgctc tcgtggggtt 2700 ttattttcca gactcaaact tttcaaaagg cctgtgtttt agttcttttc ttccaattga 2760 gtaggcaagg cgtgtgagtg tgaccaacgc atgcatggat atcgtggtag actggtagag 2820 ctgtcgttac cagcgcgatg cttgtatatg tttgcagtat tttcaaatga atgtctcagc 2880 tagcgtacag ttgaccaagt cgacgtggag ggcgcacaac agacctctga cattattcac 2940 ttttttttta ccatgccgtg cacgtgcagt caatccccag gacggtcctc ctggacacga 3000 agacgggcag caacctgctc cagtggccgg tggtggaggt ggagaacctc cggatgagcg 3060 gcaagagctt cgacggcgtc gcgctggacc gcggatccgt cgtgcccctc gacgtcggca 3120 aggcgacgca ggtgacgccg cacgcagcct gctgcagcga acgaactcgc gcgttgccgg 3180 cccgcggcca gctgacttag tttctctggc tgatcgaccg tgtgcctgcg tgcgtgcagt 3240 tggacatcga ggctgtgttc gaggtggacg cgtcggacgc ggcgggcgtc acggaggccg 3300 acgtgacgtt caactgcagc accagcgcag gcgcggcggg ccggggcctg ctcggcccgt 3360 tcggccttct cgtgctggcg gacgacgact tgtccgagca gaccgccgtg tacttctacc 3420 tgctcaaggg cacggacggc agcctccaaa ctttcttctg ccaagacgag ctcaggtatg 3480 tatgttatga cttatgacca tgcatgcatg cgcatttctt agctaggctg tgaagcttct 3540 tgttgagttg tttcacagat gcttaccgtc tgctttgttt cgtatttcga ctaggcatcc 3600 aaggcgaacg atctggttaa gagagtatac gggagcttgg tccctgtgct agatggggag 3660 aatctctcgg tcagaatact ggtaagtttt tacagcgcca gccatgcatg tgttggccag 3720 ccagctgctg gtactttgga cactcgttct tctcgcactg ctcattattg cttctgatct 3780 ggatgcacta caaattgaag gttgaccact ccatcgtgga gagctttgct caaggcggga 3840 ggacgtgcat cacgtcgcga gtgtacccca cacgagccat ctacgactcc gcccgcgtct 3900 tcctcttcaa caacgccaca catgctcacg tcaaagcaaa atccgtcaag atctggcagc 3960 tcaactccgc ctacatccgg ccatatccgg caacgacgac ttctctatga ctaaattaag 4020 tgacggacag ataggcgata ttgcatactt gcatcatgaa ctcatttgta caacagtgat 4080 tgtttaattt atttgctgcc ttccttatcc ttcttgtgaa actatatggt acacacatgt 4140 atcattaggt ctagtagtgt tgttgcaaag acacttagac accagaggtt ccaggagtat 4200 cagagataag gtataagagg gagcagggag cag 4233 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 31 tgttcggttc cctctaccaa 20 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 32 caacatccat caccttgact ga 22 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized probe oligonucleotide <400> 33 cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 34 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 35 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized probe oligonucleotide <400> 36 cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 37 cttagctgga taacgccac 19 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 38 gaccgtaagg cttgatgaa 19 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized probe oligonucleotide <400> 39 cgagattctc cgcgctgtag a 21 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 40 gtatgtttct gcttctacct ttgat 25 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized primer oligonucleotide <400> 41 ccatgttttg gtcatatatt agaaaagtt 29 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized probe oligonucleotide <400> 42 agtaatatag tatttcaagt atttttttca aaat 34 <210> 43 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized artificial sequence <400> 43 atgtcatctg gagcacttct ctttcatggg aagattcctt acgttgtgga gatggaaggg 60 aatgttgatg gccacacctt tagcatacgt gggaaaggct acggagatgc ctcagtggga 120 aaggtatgtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcacta attagtagta 180 atatagtatt tcaagtattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc tattgctttt 240 ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaacat 300 ggtgatgtgc aggttgatgc acaattcatc tgtactaccg gagatgttcc tgtgccttgg 360 agcacacttg tcaccactct cacctatgga gcacagtgct ttgccaagta tggtccagag 420 ttgaaggact tctacaagtc ctgtatgcca gatggctatg tgcaagagcg cacaatcacc 480 tttgaaggag atggcaactt caagactagg gctgaagtca cctttgagaa tgggtctgtc 540 tacaataggg tcaaactcaa tggtcaaggc ttcaagaaag atggtcacgt gttgggaaag 600 aacttggagt tcaacttcac tccccactgc ctctacatct ggggagacca agccaaccac 660 ggtctcaagt cagccttcaa gatatgtcat gagattactg gcagcaaagg cgacttcata 720 gtggctgacc acacccagat gaacactccc attggtggag gtccagttca tgttccagag 780 tatcatcata tgtcttacca tgtgaaactt tccaaagatg tgacagacca cagagacaac 840 atgagcttga aagaaactgt cagagctgtt gactgtcgca agacctacct ttga 894

Claims (47)

  1. 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산으로, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는
    서열번호 1; 서열번호 1의 상보체; 서열번호 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 상보체; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편; 서열번호 1을 포함하는 노린재목 유기체의 천연 코딩 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드의 단편의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 핵산.
  2. 제1항의 폴리뉴클레오티드로, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 10, 서열번호 11, 및 상기 중 어느 하나의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터.
  4. 제1항의 폴리뉴클레오티드로, 상기 유기체는 유쉬스투스 헤로스 (파브르) (신열대 갈색 노린재, “BSB”), 네자라 비리둘라 (L.) (남부 녹색 노린재), 피에조도루스 구일디니이 (웨스트우드) (적색-줄무늬 노린재), 할리오모르파 할리스 (Stal) (썩덩나무노린재), 키나비아 힐라레 (세이) (녹색 노린재), 유쉬스투스 세르부스 (세이) (갈색 노린재), 디켈롭스 멜라칸투스 (달라스), 디켈롭스 푸르카투스 (F.), 에데사 메디타분다 (F.), 티안타 페르디토르 (F.) (신열대 적색 어깨 노린재), 키나비아 마르기나툼 (팔리소 드 보부아), 호르시아스 노빌렐루스 (베르그) (목화 벌레), 타에디아 스티그모사 (베르그), 디스데르쿠스 페루비아누스 (구에린-메네빌), 네오메갈로토무스 파르부스 (웨스트우드), 렙토글로수스 조나투스 (달라스), 니에스트레아 시다에 (F.), 리구스 헤르페루스 (나이트) (서부 변색 장님노린재), 및 리구스 리네올라리스 (팔리소 드 보부아)로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항의 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 리보핵산 (RNA) 분자.
  6. 제1항의 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 생산된 이중-가닥 리보핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 노린재목 해충과 접촉시키는 것은 상기 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 내인성 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제하는 이중-가닥 리보핵산 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 리보뉴클레오티드 분자를 노린재목 해충과 접촉시키는 것은 상기 해충을 사멸시키거나 상기 해충의 성장 및/또는 섭식을 억제하는 이중-가닥 리보핵산 분자.
  9. 제6항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 RNA 절편을 포함하고, 여기서 상기 제1 RNA 절편은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 제3 RNA 절편은 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 상기 제1 RNA 절편에 연결되고, 여기서 상기 제3 RNA 절편은 실질적으로 상기 제1 RNA 절편의 역 상보체이어서, 상기 제1 및 제3 RNA 절편은 리보핵산으로 전사될 때 혼성화되어 상기 이중-가닥 RNA를 형성하는 것인 이중-가닥 RNA.
  10. 제5항의 RNA로, 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 리보핵산 분자 및 단일-가닥 리보핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA.
  11. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터로, 여기서 상기 이종 프로모터가 식물 세포에서 기능적인 것인 식물 형질전환 벡터.
  12. 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포인 세포.
  14. 제12항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인 세포.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포인 세포.
  16. 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 식물.
  17. 제16항의 식물의 종자로, 상기 종자는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 종자.
  18. 제16항의 식물로부터 생산된 범용 제품으로, 여기서 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 범용 제품.
  19. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 식물에서 이중-가닥 리보핵산 분자로서 발현되는 것인 식물.
  20. 제15항에 있어서, 상기 세포는 메이즈, 대두 또는 목화 세포인 세포.
  21. 제16항에 있어서, 상기 식물은 메이즈, 대두 또는 목화인 식물.
  22. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 식물에서 리보핵산 분자로서 발현되고, 노린재목 해충이 상기 식물의 일부를 섭취할 때 상기 리보핵산 분자는 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 상보적인 내인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 것인 식물.
  23. 제1항의 폴리뉴클레오티드로, 내인성 해충 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자를 코딩하는 적어도 하나의 추가의 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환 벡터로, 여기서 상기 추가의 폴리뉴클레오티드(들)는 각각 식물 세포에서 기능적인 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 식물 형질전환 벡터.
  25. 노린재목 해충 집단을 방제하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    노린재목 해충의 숙주 식물에서 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 발현되어, 상기 집단에 속하는 노린재목 해충과의 접촉 시 상기 노린재목 해충 내의 타겟 서열의 발현을 억제하도록 기능하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 동일한 숙주 식물 종의 식물에 대한 동일한 해충 종에 비해, 상기 노린재목 해충 또는 해충 집단의 감소된 성장 및/또는 생존을 야기하는 리보핵산 분자를 생산하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 리보핵산 분자는 이중-가닥 리보핵산 분자인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 노린재목 해충 집단은 상기 형질전환된 식물 세포가 결여된 동일한 숙주 식물 종의 숙주 식물에 침입하는 동일한 해충 종의 집단에 비해 감소되는 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 리보핵산 분자는 이중-가닥 리보핵산 분자인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 노린재목 해충 집단은 상기 형질전환된 식물 세포가 결여된 동일한 종의 숙주 식물에 침입하는 노린재목 해충 집단에 비해 감소되는 것인 방법.
  30. 옥수수 작물의 수확량을 개선하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    제1항의 핵산을 옥수수 식물 내로 도입해서 트랜스제닉 옥수수 식물을 생산하는 단계; 및
    상기 옥수수 식물을 재배해서 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 단계를 포함하고; 여기서 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현은 노린재목 해충의 발생 또는 성장 및 노린재목 해충 감염으로 인한 수확량의 손실을 억제하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현은 상기 옥수수 식물의 부분을 접촉한 노린재목 해충에서 적어도 제1 타겟 유전자를 억제하는 RNA 분자를 생산하는 것인 방법.
  32. 트랜스제닉 식물 세포를 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    식물 세포를 제1항의 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계;
    복수의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생을 가능하게 하는데 충분한 조건 하에 상기 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계;
    적어도 하나의 폴리뉴클레오티드가 그의 게놈 내로 편입된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계;
    상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 리보핵산(RNA) 분자의 발현에 대해 상기 형질전환된 식물 세포를 스크리닝하는 단계; 및
    상기 RNA를 발현하는 식물 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 RNA 분자는 이중-가닥 RNA 분자인 방법.
  34. 노린재목 해충 저항성 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    제32항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계; 및
    상기 트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 리보핵산 분자의 발현은 형질전환된 식물을 접촉하는 노린재목 해충에서 타겟 유전자의 발현을 조정하기에 충분한 것인 방법.
  35. 트랜스제닉 식물 세포를 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    식물에게 노린재목 해충 저항성을 제공하는 수단을 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
    복수의 형질전환된 식물 세포를 포함하는 식물 세포 배양물의 발생을 가능하게 하는데 충분한 조건 하에 상기 형질전환된 식물 세포를 배양하는 단계;
    식물에게 노린재목 해충 저항성을 제공하는 수단이 그의 게놈 내에 편입된 형질전환된 식물 세포를 선택하는 단계;
    노린재목 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하는 수단의 발현에 대해 상기 형질전환된 식물 세포를 스크리닝하는 단계; 및
    노린재목 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하는 수단을 발현하는 식물 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 노린재목 해충 저항성 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    제44항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물 세포를 제공하는 단계; 및
    상기 트랜스제닉 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 단계를 포함하고, 여기서 노린재목 해충에서 필수 유전자의 발현을 억제하는 수단의 발현은 형질전환된 식물을 접촉하는 노린재목 해충에서 타겟 유전자의 발현을 조정하기에 충분한 것인 방법.
  37. 제1항에 있어서, 바실루스 투린지엔시스로부터의 폴리펩티드, 및/또는 PIP-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 핵산.
  38. 제37항에 있어서, 상기 B. 투린지엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry3, Cry34, 및 Cry35를 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산.
  39. 제15항에 있어서, 상기 세포는 바실루스 투린지엔시스로부터의 폴리펩티드, 및/또는 PIP-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  40. 제39항에 있어서, 상기 B. 투린지엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry3, Cry34, 및 Cry35를 포함하는 군으로부터 선택되는 세포.
  41. 제16항에 있어서, 상기 식물은 바실루스 투린지엔시스부터의 폴리펩티드, 및/또는 PIP-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 B. 투린지엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry3, Cry34, 및 Cry35를 포함하는 군으로부터 선택되는 식물.
  43. 제32항에 있어서, 상기 형질전환된 식물 세포는 바실루스 투린지엔시스로부터의 폴리펩티드, 및/또는 PIP-1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 B. 투린지엔시스로부터의 폴리펩티드가 Cry3, Cry34, 및 Cry35를 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
  45. 식물 작물의 수확량을 개선하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    트랜스제닉 식물을 생산하기 위해 핵산을 옥수수 식물에 도입하는 단계로서, 여기서 상기 핵산은
    스레드 유전자를 타겟화하는 적어도 하나의 siRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
    바실러스 투린지엔시스로부터의 살충성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 둘 이상을 포함하는, 단계, 그리고
    상기 식물을 재배해서 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 단계를 포함하고; 여기서 상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현은 노린재목 해충 발생 또는 성장 및 노린재목 해충 감염으로 인한 수확량의 손실을 억제하는, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 식물은 메이즈, 대두 또는 목화인 방법.
  47. 제6항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 RNA 절편을 포함하고, 여기서 상기 제1 RNA 절편은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 제3 RNA 절편은 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 상기 제1 RNA 절편에 연결되고, 여기서 상기 제3 RNA 절편은 실질적으로 상기 제1 RNA 절편의 역 상보체이어서, 상기 제1 및 제3 RNA 절편은 리보핵산으로 전사될 때 혼성화되어 상기 이중-가닥 RNA를 형성하는 것인 이중-가닥 RNA.
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