ES2353603T3 - Proteína insecticida secretada y composiciones de genes de bacillus thuringiensis y sus usos. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica una proteína toxina insecticida de Bacillus thuringiensis activa frente a una plaga de insectos lepidópteros, comprendiendo dicha proteína toxina insecticida una secuencia polipeptídica seleccionada de ID. SEC. Nº 4, (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966), o una porción de las mismas que tenga actividad insecticida contra lepidópteros, con la condición de que la proteína toxina no tenga la secuencia de ID. SEC. Nº 6 con la siguiente secuencia N terminal adicional: Met Ser Glu Leu Lys Gly Lys Phe Lys Lys Ser Thr Asn Arg Thr Cys Cys Leu Leu Lys Ile Ile Asn Ile Gly Gly Arg Gly.

Description

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una nueva familia de genes que codifican proteínas tóxicas para insectos lepidópteros y fragmentos insecticidas de las mismas. En particular, la presente invención está dirigida a proteínas de ejemplo denominadas en el presente documento TIC900, TIC402, TIC403, TIC404, TIC961, TIC962, TIC963, TIC965 y TIC966, y fragmentos insecticidas de las mismas, cada una codificada por secuencias que codifican nucleótidos de ejemplo denominadas en el presente documento respectivamente tic900, tic402, tic403, tic404, tic434, tic961, tic962, tic963, tic965, y tic966, así como los homólogos de secuencia de nucleótidos que (1) codifican proteínas insecticidas y (2) hibridan con las secuencias codificadoras tic900, tic402, tic403, tic404, tic434, tic961, tic962, tic963, tic965 y tic966 bajo condiciones de hibridación rigurosas. La presente invención también se refiere a células huésped transformadas con una o más secuencias de nucleótidos de la presente invención o transformadas con variantes de las secuencias de nucleótidos expuestas en el presente documento, genes relacionados por identidad y/o similitud con las secuencias expuestas en el presente documento, y/o sus homólogos, en particular las secuencias que se han modificado para una expresión mejorada en plantas. En una forma de realización de preferencia, las células huésped transformadas son células vegetales.

Casi todos los cultivos de campo, plantas y zonas agrícolas comerciales, son susceptibles al ataque de una o más plagas de insectos. Particularmente problemáticas son las plagas de Coleópteros y Lepidópteros. Por ejemplo, cultivos vegetales y coles, tales como alcachofas, colinabo, arúgula, puerros, espárragos, lentejas, judías, lechuga (por ejemplo, cogollo, hojas, lechuga romana), remolacha, bok choy, malanga, brécol, melones (melón bordado, melón, melón de invierno, melazo, cantalupo), coles de Bruselas, col, cardo, zanahorias, nabo, coliflor, okra, cebollas, apio, perejil, garbanzos, pastinaca, achicoria, guisantes, col china, pimientos, col común, patatas, calabacín, calabaza pupkin, cucurbitáceas, rábanos, bulbos secos de cebolla, rutabaga, berenjena, salsifí, escarola, chalota, endivias, soja, ajo, espinacas, cebolla verde, calabaza, emilaz, remolacha azucarera, batatas, nabo, acelgas, rábano picante, tomates, col crespa, nabo y una diversidad de especias son sensibles a la infestación por una o más de las siguientes plagas de insectos: gusano medidor de la alfalfa, orugas militares, escarabajo soldado, polilla de los penachos de la alcachofa, gusano perforador de la col, falso medidor de la col, gusano de la telaraña de la col, gusano del fruto del maíz, comedor de hojas de apio, gusano veteado de la col, barrenador europeo del maíz, palomilla dorso de diamante, gusano verde del trébol, gusano importado de la col, gusano del melón, rosquilla omnívora, barrenador del fruto de las cucurbitáceas, gusano de la cáscara de las cucurbitáceas, gusano peludo, oruga desfoliadora de la soja, gusano del tabaco, gusano del fruto del tomate, gusano del cuerno del tomate, gusano alfiler, oruga de las leguminosas y gusano soldado veteado. Igualmente, los pastos y cultivos de forraje tales como alfalfa, hierbas de pasto y forraje ensilado se ven atacados a menudo por plagas de insectos tales como la oruga militar, gusano soldado de la vaca, mariposita amarilla de la alfalfa, adopaea, diferentes gusanos medidores y mosquitas de telaraña así como por gusano soldado veteado.

Los cultivos frutículas y vinícolas tales como manzanas, albaricoques, cerezas, nectarinas, albaricoques, peras, ciruelas, prunas, membrillos, castaña, avellanas napolitanas, nuez pecana, pistachos, nueces, cítricos, zarzamora, arándanos, frambuesa, arándano rojo, grosellas, moras, frambuesa, fresas, uvas, aguacates, bananas, kiwi, caquis, granada, piña y frutas tropicales son a menudo susceptibles de ataque y defoliación debido a gusano del cuerno, amorbia, gusano soldado, gusano cortador de los cítricos, mosca del banano, gusano ropobota, Sparganothis sulfureana, oruga agrimensora americana, gusano del fruto de la cereza, gusano cortador de cítricos, horadador del arándano americano, gusano telarañoso oriental, gusano de bolsa, oruga cigarrera, cidya latiferreanus, gusano arrollador de la hoja del frutal, endopiza, gusano arrollador de la uva, esqueletizador de la hoja de parra, gusano del fruto verde, gummosos-batrachedra commosae, lagarta peluda, gusano barrenador de la nuez, gusanos del cuerno, gusanos grises, gusano de la naranja navelina, arrollador de las hojas de bandas oblicuas, rosquilla omnívora, gusano medidor omnívoro, gusano arrollador de bandas, larva de la mariposa cola de golondrina gigante, gusano oriental del ciruelo, arrollador de hojas pandemis, gusano perforador del ciruelo, barrenador de la nuez pecana, gusano arrollador de bandas rojas, gusano tórix, gusano cortador de la fresa, gusano peludo, desfoliador del olmo, oruga de la tienda, polilla tecla, oruga del tabaco, tórtrix de la naranja, gusano arrollador del manzano, gusano arrollador variegato, oruga de la nuez, oruga de la tienda occidental y gusano soldado veteado.

Los cultivos campestres tales como semillas de canola / colza, onagra, berenjena

escalfada de Douglas, maíz (de campo, dulce, para palomitas), algodón, lúpulo, jojoba, cacahuetes, cártamo, granos pequeños (cebada, salvado, centeno, trigo), sorgo, soja, girasoles y tabaco son a menudo dianas para la infestación por plagas de insectos entre los que se incluyen orugas militares, perforadores asiáticos y otros perforadores del maíz, polilla de bandas de girasol, gusano soldado de la remolacha, falso medidor, gusano de la raíz del maíz (que incluye las variedades meridionales y occidentales), perforador de las hojas de algodón, palomilla dorso de diamante, perforador europeo del maíz, gusano verde del trébol, polilla del girasol, gusano del girasol, gusano importado de la col, orugas (incluida Anacamptodes spp.), arrollador de hojas de bandas oblicuas, gusano arrollador omnívoro, gusano del grano, gusano peludo, horadador del maíz suroccidental, oruga de la soja, xestia, polilla del girasol, oruga del tabaco, gusano del cuerno del tabaco y oruga de las leguminosas.

Las plantas de invernadero, flores, plantas ornamentales y sus contenedores son con frecuencia alimentados con un huésped de plagas de insectos tales como gusano soldado, polilla de la azalea, gusano soldado de la remolacha, palomilla dorso de diamante, gusano cachón (gusano del cuerno), oruga de florida, polilla Ío, gusanos grises, polilla de oleander, arrollador omnívoro y oruga del tabaco.

Los árboles del bosque, frutales, ornamentales y productores de nueces, así como otros arbustos y plantas de vivero son a menudo susceptibles de ataque por diferentes insectos tales como gusano tejedor, Acleris gloverana, polilla de cola marrón, Phryganidia californica, polilla de los montecillos de abetos de Douglas, spanworm del olmo, gusano telarañero tardío, arrollador del frutal, Dryocampa rubicunda, lagarta peluda, gusano del pino banksiano, gusano telarañero de la mimosa, mariposa del pino, gusano tórax, oruga de silla de montar, oruga de silla prominente, desfoliador de primavera y otoño, gusano de las yemas del abeto, oruga de la tienda, gusano tórtrix, y Orgyia vetusta. Igualmente, las hierbas de césped son atacadas a menudo por plagas de insectos tales como orugas militares, gusano peludo del césped y gusano peludo del césped tropical.

Debido a que los cultivos de interés comercial son a menudo la diana del ataque de los insectos, son deseables en muchos casos procedimientos ambientalmente sensibles para combatir o erradicar la infestación de insectos. Esto es particularmente cierto para granjeros, horticultores, cultivadores y en zonas comerciales y residenciales, en las que se pretende combatir las poblaciones de insectos usando composiciones respetuosas con el medioambiente.

Bacillus thuringiensis es una bacteria gram positiva que produce inclusiones cristalinas proteicas durante la esporulación. Estas proteínas cristalinas de B. thuringiensis son a menudo altamente tóxicas para insectos específicos. Se han identificado actividades insecticidas para las proteínas cristalinas de diversas cepas de B. thuringiensis contra larvas de insectos de los órdenes Lepidoptera (orugas), Coleoptera (escarabajos) y Diptera (mosquitos, moscas).

Las proteínas cristalinas individuales de B. thuringiensis, también llamadas delta endotoxinas o proteínas cristalinas parasporales o proteína tóxica, pueden diferir mucho en sus estructuras y actividades insecticidas. Estas proteínas insecticidas están codificadas por genes localizados típicamente en grandes plásmidos, con tamaño mayor a 30 mega Dalton (mDa), que se encuentran en las cepas de B. thuringiensis. Se ha clonado una serie de estos genes de toxinas de B. thuringiensis y se han caracterizado los productos de proteínas cristalinas insecticidas según sus propiedades insecticidas específicas. Hofte y col. (1989) y Schnepf y col. (1998) proporcionan revisiones de genes de toxinas y proteínas cristalinas de B. thuringiensis.

Las propiedades insecticidas de B. thuringiensis se han reconocido desde hace mucho tiempo, y las cepas de B. thuringiensis se han incorporado en productos insecticidas biológicos comerciales durante más de cuarenta años. Las formulaciones insecticidas comerciales de B. thuringiensis típicamente contienen cultivos de fermentación de B. thuringiensis esporulada seca cuyas proteínas cristalinas son tóxicas para diversas especies de insectos.

Los productos insecticidas biológicos comerciales de B. thuringiensis tradicionales se obtienen de las cepas de “tipo natural” de B. thuringiensis, es decir, de cultivos purificados de cepas de B. thuringiensis aisladas de fuentes naturales. Los nuevos productos insecticidas biológicos comerciales de B. thuringiensis se elaboran a base de cepas de B. thuringiensis alteradas genéticamente, tales como las cepas de B. thuringiensis transconjugantes descritas en las Patentes de EEUU Nº 5.080.897 y

4.935.353.

Una característica de las proteínas cristalinas es su capacidad de fusionarse formando

cristales en el interior de la célula madre de B. thuringiensis. Tras la lisis de la célula madre, las proteínas se liberan como cristales al entorno exterior. Además, B. thuringiensis también produce proteínas no cristalinas que, a diferencia de las proteínas cristalinas, son secretadas por las células de B. thuringiensis como proteínas solubles en el medio de cultivo. Las proteínas no cristalinas secretadas de B. thuringiensis incluyen fosfolipasas, proteasas y β-lactamasas que tienen poca, o ninguna, actividad insecticida. Sin embargo, se ha informado que tres proteínas no cristalinas secretadas por B. thuringiensis, denominadas Vip1, Vip2 y Vip3, son tóxicas para los insectos coleópteros y lepidópteros (Estruch y col., 1996; Patente de EEUU Nº 5.866.326; documento WO 94/21795; documento WO 96/10083). Se informó que una proteína no cristalina de B. thuringiensis, denominada CryV, es tóxica para los insectos lepidópteros (Kostichka y col., 1996). Diferentes investigadores han identificado una gran cantidad de aislamientos de Bacillus thuringiensis que producen proteínas de toxinas insecticidas secretadas de manera extracelular. Se ha mostrado que tales aislamientos producen una o más de estas proteínas de toxinas VIP o CryV u homólogos estrechamente relacionados. Las proteínas BT secretadas que inhiben los coleópteros, tales como TIC901, TIC1201, TIC407 y TIC417, se han dado a conocer anteriormente pero no parecen estar relacionadas con las proteínas de la presente invención (documentos WO 05/019414 y WO 01/87940).

Los inventores dan a conocer en el presente documento una nueva clase de proteínas de toxinas insecticidas secretadas extracelulares que no muestran homología con las clases de proteínas VIP o CryV conocidas. Ninguna de las ciento treinta y siete proteínas tóxicas para los insectos de B. thuringiensis conocidas (Crickmore y col., 1998), más o menos, están relacionadas de manera sustancial con las proteínas de la presente invención. De hecho, no se encontró ninguna homología significativa entre las secuencias de las proteínas de la presente invención y alguna de las miles de secuencias de proteínas contenidas en el Centro nacional de recursos genómicos (GenBank), Santa Fe, NM.

Resumen de la invención

En una forma de realización, la presente invención se refiere a una proteína insecticida aislada y purificada, activa contra la plaga de insectos lepidópteros, es decir, contra los insectos lepidópteros que incluyen el barrenador europeo del maíz (ECB European Corn Borer), la oruga del tabaco (TBW, Tobacco Bud Worm) y la palomilla dorso de diamante (DBM, Diamond Back Moth), que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente según se presenta en ID. SEC. Nº 4, (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966), o una porción de las mismas que tenga actividad insecticida contra lepidópteros, con la condición de que la proteína toxina no tenga la secuencia de ID. SEC. Nº 6 con la siguiente secuencia N terminal adicional: Met Ser Glu Leu Lys Gly Lys Phe Lys Lys Ser Thr Asn Arg Thr Cys Cys Leu Leu Lys Ile Ile Asn Ile Gly Gly Arg Gly.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada y purificada, es decir una secuencia codificadora, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína insecticida según se definió anteriormente, es decir según se presenta en ID. SEC. Nº 3 (tic900), ID. SEC. Nº 5 (tic402), ID. SEC. Nº 7 (tic403), ID. SEC. Nº 9 (tic404), ID. SEC. Nº 29 (tic434), ID. SEC. Nº 11 (tic961), ID. SEC. Nº 13 (tic962), ID. SEC. Nº 15 (tic963), ID. SEC. Nº 17 (tic965) o ID. SEC. Nº 19 (tic966). La secuencia codificadora tic900 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 3 codifica la proteína TIC900 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 4. Los organismos que producen TIC900 o proteínas relacionadas muestran actividades insecticidas y/o propiedades de resistencia a los insectos. La secuencia codificadora tic402 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 5 codifica la proteína TIC402 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 6. La secuencia codificadora tic403 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 7 codifica la proteína TIC403 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 8. La secuencia codificadora tic404 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 9 codifica la proteína TIC404 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta o en ID. SEC. Nº 10. La secuencia codificadora tic434 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 29 codifica la proteína TIC434 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 30. La secuencia codificadora tic961 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 11 codifica la proteína TIC961 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 12. La secuencia codificadora tic962 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 13 codifica la proteína TIC962 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 14. La secuencia codificadora tic963 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 15 codifica la proteína TIC963 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 16. La secuencia codificadora tic965 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 17 codifica la proteína TIC965 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 18. La secuencia codificadora tic966 nativa según se presenta en ID. SEC. Nº 19 codifica la proteína TIC966 que muestra la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 20. La proteína TIC900 o las proteínas relacionadas y las secuencias de nucleótidos derivadas de las cepas de Bt que codifican estas proteínas se describen en el presente documento como homólogas entre sí, es decir, proteínas insecticidas o sus fragmentos insecticidas codificados por secuencias de nucleótidos que hibridan con cada una o con alguna de las secuencias dadas a conocer en el presente documento bajo condiciones de hibridación específicas o bajo condiciones rigurosas de hibridación, y se pretende específicamente que estén incluidas dentro del alcance de la presente invención.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de una bacteria de Bacillus thuringiensis transformada con un vector plasmídico que contiene una secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 3 (tic900), ID. SEC. Nº 5 (tic402), ID. SEC. Nº 7 (tic403), ID. SEC. Nº 9 (tic404), ID. SEC. Nº 29 (tic434), ID. SEC. Nº 11 (tic961), ID. SEC. Nº 13 (tic962), ID. SEC. Nº 15 (tic963), ID. SEC. Nº 17 (tic965) o ID. SEC. Nº 19 (tic966). Se ha depositado una cepa de ejemplo SIC9002 en la Northern Regional Research Laboratory of Agricultural Research Service Center Collection (NRRL), USDA, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, bajo los términos del Tratado de Budapest en el International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purposes of Patent Procedure el 25 de abril de 2000 y se le ha asignado el número de referencia NRRL B-30582. En el presente documento se presenta un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos tic900 como pBD1.

En otra forma de realización, la invención también se refiere a un cultivo biológicamente puro de una bacteria de B. thuringiensis denominada cepa EG5438 que muestra actividad insecticida contra insectos lepidópteros. La cepa de B. thuringiensis EG5438 representa un cepa de B. thuringiensis de tipo natural de la que se aisló una secuencia codificadora tic900. La cepa se ha depositado en el NRRL, USDA, bajo los términos del Tratado de Budapest el 3 de mayo de 2000 y se le ha asignado el número del acceso NRRL B30584.

En otra forma de realización, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 3 que codifica una secuencia de aminoácidos TIC900 (ID. SEC. Nº 4), y una porción de oligonucleótido que puede marcarse y utilizarse como una sonda de hibridación para identificar otros genes relacionados que codifican las proteínas insecticidas relacionadas o sus homólogos. Otras secuencias de nucleótidos relacionadas específicamente que se dan como ejemplo en el presente documento comprenden secuencias según se presentan en ID. SEC. Nº 5, ID. SEC. Nº 7, ID. SEC. Nº 9, ID. SEC. Nº 29, ID. SEC. Nº 11, ID. SEC. Nº 13, ID. SEC. Nº 15, ID. SEC. Nº 17 y ID. SEC. Nº 19, cada una de las cuales codifican las toxinas proteicas insecticidas según se presentan en ID. SEC. Nº 6, ID. SEC. Nº 8, ID. SEC. Nº 10, ID. SEC. Nº 30, ID. SEC. Nº 12, ID. SEC. Nº 14, ID. SEC. Nº 16, ID. SEC. Nº 18 e ID. SEC. Nº 20, respectivamente.

En aún otra forma de realización, la invención proporciona células vegetales y plantas que se han transformado con una secuencia de nucleótidos según se presentó anteriormente, es decir con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC900 o una proteína relacionada según se presenta en ID. SEC. Nº 4 o uno de sus fragmentos insecticidas, o una de sus proteínas TIC900 homólogas, seleccionadas del grupo constituido por ID. SEC. Nº 6, ID. SEC. Nº 8, ID. SEC. Nº 10, ID. SEC. Nº 30, ID. SEC. Nº 12, ID. SEC. Nº 14, ID. SEC. Nº 16, ID. SEC. Nº 18 e ID. SEC. Nº 20. La secuencia de nucleótidos puede ser traducida y expresada por células vegetales y tejidos vegetales en niveles suficientes para inhibir o para matar las plagas de insectos lepidópteros que entran en contacto con la planta transgénica que expresa dicha proteína, en particular cuando dichas plagas ingieren partes de dicha planta transgénica. Tanto las plantas monocotiledóneas como las dicotiledóneas están dentro del alcance de la invención. Puede ser necesaria la modificación de la secuencia para que tenga efecto el máximo nivel de expresión y para mejorar la capacidad de la planta que contiene la secuencia para producir niveles insecticidas de la proteína TIC900 o proteína relacionada. La transformación de plantas con las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en el presente documento puede dar como resultado una frecuencia aumentada de transformantes que expresan el transgén, es decir, tic900 o su homólogo, así como la generación de un porcentaje mayor de eventos de transformación que muestran fisiología morfológicamente normal.

En aún otra forma de realización, la presente invención también proporciona un procedimiento para producir una planta transgénica que muestra niveles de expresión aumentados de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC900 o uno de sus fragmentos insecticidas o su homólogo y a partir de entonces niveles aumentados de la proteína insecticida TIC900 o su homólogo. Por consiguiente, las plantas transformadas con las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en el presente documento muestran niveles mejorados y aumentados de capacidad de resistencia a la plaga de lepidópteros en comparación con una planta que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC900, un fragmento insecticida de una proteína TIC900, o uno de sus homólogos.

Para la realización de lo anterior, se proporciona un procedimiento para expresar en una planta una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC900 o su homólogo, que comprende las etapas de a) insertar en el genoma de una célula vegetal una secuencia de ácido nucleico que comprende en la dirección 5’ a 3’, un promotor funcional de planta unido de manera operativa a una secuencia de ADN estructural optimizada para la expresión en plantas que causa la producción de una secuencia de ARN que codifica toda o un fragmento insecticida de una secuencia del polipéptido TIC900 según se presenta en ID. SEC. Nº 4, o sus homólogo seleccionado del grupo constituido por ID. SEC. Nº 6, ID. SEC. Nº 8, ID. SEC. Nº 10, ID. SEC. Nº 30, ID. SEC. Nº 12, ID. SEC. Nº 14, ID. SEC. Nº 16, ID. SEC. Nº 18 e ID. SEC. Nº 20, o una secuencia que tiene al menos desde aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 4, o una secuencia que codifica una proteína insecticida que hibrida con alguna de estas secuencias bajo condiciones de hibridación específicas o rigurosas, y una secuencia de ADN 3’ no traducida que funciona en las células de la planta para provocar la terminación de la transcripción y poliadenilación; b) obtener células vegetales transformadas que contienen la secuencia del ácido nucleico; y c) generar, a partir de las células vegetales transformadas, plantas genéticamente transformadas que expresen la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína TIC900

o una proteína relacionada, en el que las plantas transformadas son morfológicamente normales y exhiben niveles elevados o mejorados de resistencia a la plaga de lepidópteros comparadas con una planta no transformada para expresar dicha proteína.

o sus homólogos. Los anticuerpos se pueden utilizar para identificar la presencia de una

Otra forma de realización de la presente invención es la provisión de los anticuerpos que se unen específicamente a los epítopos presentados únicamente por la proteína TIC900 proteína TIC900 o de un homólogo, para purificar la proteína o el homólogo, para identificar una secuencia de nucleótidos a partir de la que se está expresando una proteína TIC900 o un homólogo y para el uso en kits diseñados para permitir la detección de una proteína TIC900 o de un homólogo o la detección de una secuencia de nucleótidos que expresa la proteína o el homólogo.

Los inventores vislumbran que las composiciones de proteínas dadas a conocer en el presente documento tendrán una utilidad concreta como insecticidas para aplicación tópica y/o sistémica a cultivos, hierbas, frutas y verduras y a plantas ornamentales. En una forma de realización de preferencia, la composición de insecticida biológico comprende una suspensión fluida de aceite de células bacterianas que expresan una proteína insecticida nueva dada a conocer en el presente documento. De preferencia, las células son células EG5438 o SIC9002 de B. thuringiensis, sin embargo, se considera que resultará útil cualquier célula huésped bacteriana que exprese los segmentos de ácido nucleico nuevos dados a conocer en el presente documento y que produzca una proteína cristalina, tales como B. megaterium, B. subtilis, E. coli o Pseudomona spp.

Una ventaja particular de la presente invención radica en una mejora en la gestión de la resistencia a los insectos (IRM). La capacidad pare combinar dos o más agentes insecticidas, cada uno tóxico para las mismas especies de plagas de insectos, en una composición única, y exhibiendo cada agente un modo de acción diferente de los otros agentes insecticidas con los que se combina, presenta un medio mucho más eficaz para combatir una especie concreta de plaga de insecto al reducir de manera sustancial la probabilidad de que se desarrolle resistencia a la composición insecticida en una población. La proteína TIC900 o un fragmento insecticida de la misma, o cualquiera de sus homólogos, de la presente invención puede combinarse con cualquier cantidad de agentes insecticidas conocidos para conseguir el nivel de gestión de la resistencia en una composición particular, de preferencia por la expresión de la combinación de agentes insecticidas en plantas. En particular, TIC900 o las composiciones de proteínas insecticida relacionadas pueden combinarse con una secuencia de aminoácidos Cry1 o Cry2 o una de sus variantes para conseguir la eliminación de diferentes especies de plagas de insectos lepidópteros en plantas, o con otras proteínas Cry apropiadas, y con diversas composiciones insecticidas derivadas de las especies bacterianas Xenorhabdus y Photorhabdus, que se ha mostrado que muestran actividad biológica insecticida dirigida a las especies de plagas de lepidópteros en plantas. De preferencia, el uso in planta de estas composiciones estaría dirigido a la expresión mejorada de las proteínas en las partes de la planta que muestran mayor vulnerabilidad a la depredación por insectos lepidópteros. Para la protección de las especies del maíz contra el barrenador europeo del maíz (ECB), resultaría preferible lograr los niveles de expresión más altos en las hojas y los tallos de la planta. Para la especie del tabaco susceptible a la oruga del tabaco, resultaría preferible lograr los niveles de expresión más altos en las partes de la planta con brotes, es decir, dentro de los sistemas de yemas de la planta. Para la protección de las especies vegetales crucíferas contra a la palomilla dorso de diamante (DBM), resultaría preferible lograr los niveles de expresión más altos en las hojas y en los tallos de la planta.

Las proteínas insecticidas de la presente invención también pueden combinarse con toxinas insecticidas y/o fungicidas expresadas in planta para conseguir una planta recombinante que exhiba múltiples niveles de resistencia a la infestación por las plagas que no son beneficiosas para las plantas. Por ejemplo, una proteína de la presente invención puede expresarse junto con una proteína que muestre control de los insectos coleópteros, y/o junto con una proteína u otro agente que muestre actividad antifúngica, para conseguir una planta transgénica recombinante que exhiba resistencia mejorada a las plagas de insectos lepidópteros, a las plagas de insectos coleópteros y a las plagas fúngicas. Otras permutaciones de los niveles de resistencia son conocidas por los expertos en la técnica, tales como los medios para la resistencia a la perforación y a la infestación de insectos chupadores y la infestación por nematodos, etc. Las proteínas insecticidas de la presente invención también pueden combinarse con una o más secuencias de nucleótidos expresadas como uno o más ARNdh para uso en la supresión de uno o más genes (1) en la plaga diana como un medio para conseguir una planta que exhiba múltiples capas de resistencia a la infestación por una plaga concreta, (2) en la planta como un medio para conseguir características deseadas de la planta, o (3) en diversas combinaciones para conseguir las propiedades deseadas de (1) o (2) de manera combinada.

En el presente documento, se contemplan las proteínas quiméricas constituidas por toda

o una parte de una o más proteínas de la presente invención, fusionadas con otras proteínas que son útiles en la protección de las plantas contra la infestación o similar. Por ejemplo, se ha encontrado que los dominios de las proteínas de la presente invención exhiben un bajo nivel de similitud con otras toxinas Bt, tales como el dominio I de la toxina Cry3Aa, el dominio II de la toxina Cry1Ca y el dominio III de toxina Cry1Ja (en particular, los dominios I, II, y III de la porción tóxica de la proteína TIC900, respectivamente). Las proteínas de la presente invención pueden fusionarse a los dominios de protoxinas de cualquiera de las proteínas Cry1 conocidas en la técnica, dando como resultado la formación de proteínas cristalinas tóxicas cuando se expresan en Bt o en otras cepas bacterianas de Bacillus. Además, los dominios identificados en el presente documento dentro de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de la presente invención pueden intercambiarse con otros dominios similares de proteínas toxinas insecticidas de Bt para lograr actividad insecticida mejorada y/o variedades de huéspedes que no han sido observados previamente con intercambios de dominios de toxinas Cry1 (Malvar y col. Patente de EEUU Nº 6.017.534; Galizzi y col., publicación del PCT/EP90/0114, documento WO 91/01087).

Otra forma de realización comprende un polinucleótido aislado que codifica una toxina insecticida de Bacillus thuringiensis o uno de sus fragmentos insecticidas, activo contra una plaga de insecto, en la que la toxina o el fragmento insecticida tiene un peso molecular entre aproximadamente 65.000 dalton y aproximadamente 70.000 dalton. Además, la secuencia de nucleótidos que codifica la toxina, o su complemento, hibrida bajo condiciones de hibridación específicas o rigurosas con ID. SEC. Nº 3. La toxina exhibe de preferencia actividad biológica para combatir o matar una plaga de insectos lepidópteros, de preferencia el barrenador europeo del maíz (ECB), la oruga del tabaco (TBW) y/o la palomilla dorso de diamante (DBM). En una forma de realización la secuencia de nucleótidos que codifica la toxina está optimiza para la expresión en plantas, además codifica sustancialmente la toxina o uno de sus fragmentos insecticidas, es decir, codifica la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que está presente en la secuencia de aminoácidos nativa.

Otra forma de realización de la presente invención proporciona células huésped transformadas para contener un polinucleótido que codifica una proteína insecticida de la presente invención o uno de sus fragmentos insecticidas. De preferencia, las secuencias de nucleótidos de la presente invención están modificadas para mejorar la expresión de las proteínas de la presente invención en una célula huésped preferida. La célula huésped de la presente invención se selecciona del grupo constituido por una célula bacteriana, una célula fúngica y una célula vegetal. La expresión en una célula vegetal puede comprender la expresión para lograr la acumulación de la proteína insecticida en el citoplasma, o puede dar como resultado la acumulación de la proteína insecticida en un orgánulo subcelular tal como un plastidio, un cloroplasto, o una mitocondria. Como alternativa, la proteína insecticida de la presente invención o sus fragmentos insecticidas podrían localizarse en la maquinaria de secreción de proteínas de la célula huésped particular y dar como resultado una acumulación del producto proteico en el exterior de la célula y en los espacios extracelulares que rodean la célula.

Otra forma de realización de la presente invención proporciona un procedimiento para combatir la infestación de una planta por una especie de insecto lepidóptero. De preferencia, se proporciona una cantidad plaguicida de una proteína insecticida de la presente invención o su fragmento insecticida para el consumo por la plaga de insectos en la dieta del insecto. La dieta puede estar constituida por una parte de la planta con la que normalmente se alimenta el insecto, tal como un tejido de la planta o una célula de la planta. La proteína insecticida o su fragmento insecticida puede proporcionarse en una composición que se aplica a la superficie del tejido de la planta, una parte de la planta, o célula de la planta o, de más preferencia puede ser producida por la maquinaria de síntesis de proteínas de la célula y, según se describió anteriormente, acumularse dentro de la célula vegetal o secretarse fuera de la célula vegetal, siempre y cuando la cantidad de la toxina proteica proporcionada sea una cantidad insecticida suficiente para inhibir la alimentación adicional de la plaga de insectos, o para inhibir el posterior crecimiento y desarrollo de la plaga de insectos, o para causar la muerte de la plaga de insectos. La toxina insecticida o su fragmento se obtiene a partir de una secuencia de nucleótidos que está codificada en Bacillus thuringiensis por una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a ID. SEC. Nº 3.

La presente invención también proporciona un procedimiento para detectar una primera secuencia de nucleótidos que hibrida con una segunda secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 3, en el que la primera secuencia de nucleótidos codifica una proteína insecticida o uno de sus fragmentos insecticidas e hibrida bajo condiciones de hibridación específicas o rigurosas con la segunda secuencia de nucleótidos. Otras segundas secuencias de nucleótidos de ejemplo son ID. SEC. Nº 5, ID. SEC. Nº 7, ID. SEC. Nº 9, ID. SEC. Nº 29, ID. SEC. Nº 11, ID. SEC. Nº 13, ID. SEC. Nº 15, ID. SEC. Nº 17 e ID. SEC. Nº 19.

También está contemplado que las proteínas de la presente invención sean útiles cuando se expresan en plantas para proporcionar un mejor nivel de protección de la infestación de insectos a plantas que expresan las proteínas o sus fragmentos insecticidas. Por consiguiente se prevé que una o más secuencias de nucleótidos que codifican una proteína insecticida TIC900 o su fragmento insecticida o su homólogo, o sus combinaciones, ya sea expresadas individualmente o como quimeras o como fusiones, podrían introducirse en la célula vegetal, ya sea en el genoma, en el cloroplasto o el ADN mitocondrial, o en un orgánulo como un elemento extra-cromosómico estable y con replicación autónoma, para la expresión de dicha proteína TIC900 o su fragmento insecticida o su homólogo. De preferencia, la secuencia es una secuencia de nucleótidos que no se presenta en la naturaleza, que codifica la proteína insecticida o su fragmento insecticida. Las células vegetales transformadas con tales secuencias se proporcionan en el presente documento. Las plantas crecidas a partir de las células vegetales transformadas son proporcionadas por las presentes invenciones. También se proporcionan las semillas y la progenie de las semillas de las plantas transformadas de la presente invención siempre y cuando las semillas contengan al menos las secuencias que codifican las proteínas insecticidas o sus fragmentos proteicos insecticidas. Las secuencias de nucleótidos previstas son al menos desde aproximadamente 60 hasta aproximadamente 85% idénticas a las secuencias de nucleótidos de la presente invención aisladas de B. thuringiensis.

Las secuencias de ejemplo de la presente invención incluyen al menos, además de las relacionadas con ID. SEC. Nº 5 e ID. SEC. Nº 4: (1) la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 5, y la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. Nº 5 según se presenta en ID. SEC. Nº 6, también denominada en el presente documento proteína insecticida TIC402; (2) la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 7, y la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. Nº 7 según se presenta en ID. SEC. Nº 8, también denominada en el presente documento proteína insecticida TIC403; (3) la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 9, y la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. Nº 9 según se presenta en ID. SEC. Nº 10, también denominada en el presente documento proteína insecticida TIC404; (4) la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 29, y la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. Nº 29 según se presenta en ID. SEC. Nº 30, también denominada en el presente documento proteína insecticida TIC434; (5) la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 11, y la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. Nº 11 según se presenta en ID. SEC. Nº 12, también denominada en el presente documento proteína insecticida TIC961; (6) la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 13, y la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. Nº 13 según se presenta en ID. SEC. Nº 14, también denominada en el presente documento la proteína insecticida TIC962; (7) la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 15, y la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. Nº 15 según se presenta en ID. SEC. Nº 16, también denominada en el presente documento proteína insecticida TIC963; (8) la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 17, y la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. Nº 17 según se presenta en ID. SEC. Nº 18, también denominada en el presente documento proteína insecticida TIC965; y (9) la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 19, y la secuencia de aminoácidos codificada por ID. SEC. Nº 19 según se presenta en ID. SEC. Nº 20, también denominada en el presente documento proteína insecticida TIC966. Cada una de estas proteínas y las secuencias de nucleótidos nativas de B.t. que codifican estas proteínas están relacionadas con TIC900 según se define en el presente documento. Por ejemplo, y respectivamente, ID. SEC. Nº 5 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida TIC402 según se presenta en ID. SEC. Nº 6. ID. SEC. Nº 5 según se muestra en el presente documento es identificable por la hibridación con ID. SEC. Nº 3 bajo condiciones rigurosas. ID. SEC. Nº 5 codifica una proteína que exhibe actividad biológica tóxica para lepidópteros, exhibiendo toxicidad para el barrenador europeo del maíz (ECB), la oruga del tabaco (TBW) y/o la palomilla dorso de diamante (DBM). ID. SEC. Nº 7, ID. SEC. Nº 9, ID. SEC. Nº 29, ID. SEC. Nº 11, ID. SEC. Nº 13, ID. SEC. Nº 15, ID. SEC. Nº 17 e ID. SEC. Nº 19 son capaces de hibridar entre sí bajo condiciones rigurosas, y cada secuencia puede identificarse por hibridación con ID. SEC. Nº 3 bajo condiciones rigurosas, y cada secuencia puede identificarse por amplificación usando los cebadores de oligonucleótidos según se presentan en ID. SEC. Nº 21 e ID. SEC. Nº 22. Los cebadores según se presenta en ID. SEC. Nº 21 e ID. SEC. Nº 22 son de diagnóstico para identificar la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC900 o una proteína insecticida relacionada en una muestra. Estos oligonucleótidos, cuando se utilizan juntos bajo condiciones de amplificación definidas y en presencia de una secuencia de nucleótidos sustrato adecuada, producen un amplicón que es de diagnóstico para la presencia de una secuencia codificadora de TIC900 o uno de sus homólogos. Esta reacción particular es útil para la detección de la presencia de un gen de B.t. que codifica una proteína insecticida que corresponde a una proteína TIC900 o a una proteína relacionada en una muestra, y simplifica en gran medida la búsqueda y la identificación de tales secuencias relacionadas.

También están contemplados kits para detectar la presencia de las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Tales kits contienen unas o más secuencias de nucleótidos, cada una para usar como sonda para la detección de la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida de la presente invención o su fragmento. Tales kits podrían contener también o como alternativa el anticuerpo específico para unirse a uno o más péptidos de las proteínas de la presente invención, así como los reactivos para usar con la sonda o el anticuerpo, y los kits podrían contener también muestras de control para usar en la verificación del funcionamiento de los nucleótidos o los péptidos identificados con la sonda y/o el anticuerpo y los reactivos según las instrucciones de los fabricantes. Todos los reactivos necesarios para llevar a cabo los procedimientos de identificación de secuencias de nucleótidos o péptidos estarán empaquetados juntos en un kit junto con las instrucciones de uso. Un kit de ejemplo podrá contener una proteína TIC900 o una secuencia de nucleótidos relacionada que codifique una proteína insecticida junto con una muestra de los cebadores de amplificación de la secuencia de nucleótidos de ejemplo según se presenta en ID. SEC. Nº 21 e ID. SEC. Nº 22, junto con los reactivos necesarios para realizar una reacción de amplificación, empaquetado todo junto en el kit.

Una planta o tejido de planta transformado para contener (a) una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las proteínas de la presente invención, (2) toda o una parte activa desde el punto de vista insecticida de una o más de las proteínas de la presente invención, o (3) una quimera que contiene toda o alguna porción de una o más proteínas de la presente invención, puede detectarse usando cualquier serie de medios bien conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, los procedimientos de detección basados en secuencias de nucleótidos y/o los procedimientos de detección basados en proteínas. Se pretende que los productos importantes desde el punto de vista agronómico y comercial y/o las composiciones relacionadas derivados de tales tejidos de plantas o plantas transformadas incluyan, pero no se limiten a, productos de alimentación animal, materias primas, y productos y subproductos de maíz, soja, algodón, canola, trigo, avena, arroz, caña de azúcar, garbanzo y guisante pinto que están destinados al uso como alimentos para el consumo humano o para el uso en composiciones que están destinadas al consumo humano que incluyen, pero no se limitan a, féculas, harinas, jarabes, aceite, almidón, palomitas de maíz, tartas, cereales que contienen las frutas y las semillas de estos cultivos y subproductos, y similares estén incluidos dentro del alcance de la presente invención si estos productos y composiciones relacionadas contienen cantidades detectables de las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas o derivados de las proteínas según se presentan en el presente documento.

Las plantas o partes de plantas que se sospecha que contienen una proteína o nucleótidos que codifican una proteína de la presente invención en una muestra biológica pueden detectarse usando el procedimiento que comprende las etapas de: poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene dicho nucleótido con una sonda de polinucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con dicho nucleótido y que no hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con un nucleótido de una planta de control, someter dicha muestra y dicha sonda a dichas condiciones de hibridación rigurosas, y detectar la hibridación de dicha sonda al nucleótido.

Una forma de realización de la presente invención comprende una muestra biológica derivada de una planta transgénica, tejido o semilla, comprendiendo la muestra una secuencia de nucleótidos que es o es complementaria a una secuencia que codifica una proteína de la presente invención, y siendo dicha secuencia detectable en dicha muestra usando un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos o un procedimiento de hibridación de ácidos nucleicos.

La muestra puede estar constituida por una muestra seleccionada del grupo constituido por un extracto que puede obtenerse de la planta transgénica que contiene la secuencia de nucleótidos, y el extracto que contiene cualquier secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las proteínas de la presente invención, o sus complementos. La muestra biológica se selecciona de preferencia del grupo constituido por una fécula tal como fécula de maíz, una harina tal como harina de maíz, un jarabe tal como jarabe de maíz, un aceite tal como aceite de maíz, aceite de algodón, aceite de linaza, aceite de soja o de canola, aceite de cártamo, aceite de girasol, aceite de cacahuete, y similares, un almidón tal como almidón de maíz, y cualquier cereal que pueda elaborarse en parte o en su totalidad para contener granos o subproductos de granos. La secuencia de nucleótidos es detectable en el extracto usando un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos o un procedimiento de hibridación de ácidos nucleicos.

Breve descripción de las secuencias ID. SEC. Nº 1 representa una secuencia de aminoácidos deducida por la degradación de Edmund de un fragmento de 14 kDa de una proteína TIC900 obtenida con bromuro de cianógeno y corresponde a las posiciones de los aminoácidos 397-414 según se presentan en ID. SEC. Nº 4.

ID. SEC. Nº 2 representa la secuencia de nucleótidos de una sonda de hibridación denominada WD470 diseñada basándose en la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 1, para uso en la detección de secuencias de nucleótidos que codifican TIC900 y proteínas relacionadas.

ID. SEC. Nº 3 representa una secuencia de nucleótidos nativa de Bacillus thuringiensis constituida por 1803 nucleótidos consecutivos que codifican una proteína insecticida TIC900 constituida por 601 aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 4.

ID. SEC. Nº 4 representa la secuencia de aminoácidos de TIC900 deducida a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 3.

ID. SEC. Nº 5 representa una secuencia de nucleótidos homóloga a tic900 que codifica una proteína nativa relacionada con TIC900 de Bacillus thuringiensis, denominada en el presente documento TIC402.

ID. SEC. Nº 6 representa la secuencia de aminoácidos de TIC402 deducida a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 5.

ID. SEC. Nº 7 representa una secuencia de nucleótidos homóloga tic900 que codifica una proteína nativa relacionada con TIC900 de Bacillus thuringiensis, denominada en el presente documento TIC403.

ID. SEC. Nº 8 representa la secuencia de aminoácidos de TIC403 deducida a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 7.

ID. SEC. Nº 9 representa una secuencia de nucleótidos homóloga tic900 que codifica una proteína nativa relacionada con TIC900 de Bacillus thuringiensis, denominada en el presente documento TIC404.

ID. SEC. Nº 10 representa la secuencia de aminoácidos de TIC404 deducida a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 9.

ID. SEC. Nº 11 representa una secuencia de nucleótidos homóloga tic900 que codifica una proteína nativa relacionada con TIC900 de Bacillus thuringiensis, denominada en el presente documento TIC961.

ID. SEC. Nº 12 representa la secuencia de aminoácidos de TIC961 deducida a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 11.

ID. SEC. Nº 13 representa una secuencia de nucleótidos homóloga tic900 que codifica una proteína nativa relacionada con TIC900 de Bacillus thuringiensis, denominada en el presente documento TIC962.

ID. SEC. Nº 14 representa la secuencia de aminoácidos de TIC962 deducida a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 13.

ID. SEC. Nº 15 representa una secuencia de nucleótidos homóloga tic900 que codifica una proteína nativa relacionada con TIC900 de Bacillus thuringiensis, denominada en el presente documento TIC963.

ID. SEC. Nº 16 representa la secuencia de aminoácidos de TIC963 deducida a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 15.

ID. SEC. Nº 17 representa una secuencia de nucleótidos homóloga tic900 que codifica una proteína nativa relacionada con TIC900 de Bacillus thuringiensis, denominada en el presente documento TIC965.

ID. SEC. Nº 18 representa la secuencia de aminoácidos de TIC965 deducida a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 17.

ID. SEC. Nº 19 representa una secuencia de nucleótidos homóloga tic900 que codifica una proteína nativa relacionada con TIC900 de Bacillus thuringiensis, denominada en el presente documento TIC966.

ID. SEC. Nº 20 representa la secuencia de aminoácidos de TIC966 deducida a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 19.

ID. SEC. Nº 21 representa un cebador de la secuencia del extremo 5’ utilizado como sonda que se une específicamente a las secuencias homólogas de TIC900.

ID. SEC. Nº 22 representa un cebador de la secuencia del extremo 3’ utilizado como sonda que se une específicamente a las secuencias homólogas de TIC900.

ID. SEC. Nº 23 representa una secuencia de nucleótidos tic109 que codifica una proteína quimérica TIC109 constituida por una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de la proteína insecticida TIC900 unido en fase a una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento del dominio de protoxina Cry1Ac.

ID. SEC. Nº 24 representa una secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica TIC109 constituida por una secuencia de aminoácidos insecticidas de TIC900 (1-603) unida a una secuencia de aminoácidos de un fragmento del dominio de protoxina Cry1Ac (606-1168).

ID. SEC. Nº 25 representa una secuencia de nucleótidos tic110 que codifica una proteína quimérica TIC110 constituida por una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento del dominio l de la toxina Cry1F (nucleótidos 1 -723) unida en fase a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio II-III del fragmento de la toxina TIC900 (nucleótidos 724-1809) unida en fase a una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento del dominio de protoxina Cry1Ac (nucleótidos 1810-3510).

ID. SEC. Nº 26 representa una secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica TIC110 constituida por un fragmento del dominio I de la toxina Cry1F (aminoácidos 1233) unido a un fragmento del dominio II-III de la toxina TIC900 (aminoácidos 234-603) unido a un fragmento del dominio de protoxina Cry1Ac (aminoácidos 604-1170).

ID. SEC. Nº 27 representa una secuencia de nucleótidos tic111 que codifica una proteína quimérica TIC111 constituida por una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento del dominio I de la toxina Cry1Ac (nucleótidos 1-705) unida en fase a una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento del dominio II-III de la toxina TIC900 (nucleótidos 706-1815) unida en fase a una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento del dominio de protoxina Cry1Ac (nucleótidos 1822-3516).

ID. SEC. Nº 28 representa una secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica TIC111 constituida por un fragmento del dominio I de la toxina Cry1Ac (aminoácidos 1235) unido a un fragmento del dominio II-III de la toxina TIC900 (aminoácidos 236-605) unido a un fragmento del dominio de protoxina Cry1Ac (aminoácidos 608-1172).

ID. SEC. Nº 29 representa una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 7,5 kb de la cepa EG4611 de Bacillus thuringiensis que contiene una secuencia codificadora de TIC434, siendo dicha secuencia codificadora desde aproximadamente la posición del nucleótido 425 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 2238.

ID. SEC. Nº 30 representa una secuencia de aminoácidos de TIC434.

ID. SEC. Nº 31 representa una secuencia quimérica que codifica una secuencia de aminoácidos de TIC435 que corresponde a una secuencia de aminoácidos de TIC434 fusionada en marco a una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos de la protoxina Cry1; correspondiendo dicha región codificadora de la secuencia de aminoácidos de TIC434aproximadamente a la posición del nucleótido 1 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 1825, y correspondiendo dicha región codificadora de la secuencia de aminoácidos de protoxina de Cry1 aproximadamente la posición del nucleótido 1826 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 3525.

ID. SEC. Nº 32 representa una secuencia de aminoácidos de TIC435quimérica.

Descripción detallada La siguiente descripción detallada de la invención se proporciona para ayudar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. Sin embargo, la descripción detallada no debe interpretarse indebidamente como limitante de la presente invención ya que los expertos en la técnica pueden realizar modificaciones y variaciones en las formas de realización discutidas en el presente documento sin apartarse del espíritu o del alcance del presente descubrimiento inventivo.

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto un nuevo género de secuencias

de nucleótidos que codifican proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis y de cepas de Bacillus relacionadas. Según se define en otra parte en el presente documento, estas secuencias de nucleótidos hibridan unas con otras bajo condiciones rigurosas. Cada una de las proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos puede exhibir actividad biológica inhibidora de las especies de lepidóptero, y por lo tanto se considera que son proteínas insecticidas. Cada una de las proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos pueden expresarse en plantas solas o en combinaciones entre ellas o con otros agentes insecticidas inhibidores de los lepidópteros tales como proteínas, proteínas cristalinas, toxinas, y/o ARN de doble hebra específicos para las plagas diseñados para suprimir genes dentro de una o más plagas diana, y similares, para lograr un medio de gestión de la resistencia a los insectos en el campo que no era factible antes usando simplemente las proteínas insecticidas para lepidópteros conocidas derivadas de cepas de Bacillus thuringiensis, tales como las proteínas de Cry1 y diversas proteínas insecticidas inhibidoras de lepidópteros derivadas de las especies Bacillus laterosporous y Bacillus sphaericus. Las proteínas de la presente invención pueden usarse también en plantas conjuntamente con otros tipos de toxinas insecticidas para conseguir plantas transformadas para contener al menos un medio para combatir una o más de las plagas comunes de las plantas seleccionadas de los grupos constituidos por plagas de insectos lepidópteros, plagas de insectos coleópteros, plagas de insectos perforadores y chupadores, y similares. Las proteínas de la presente invención también se contemplan para el uso en formulaciones, solas o en combinación con otros agentes insecticidas, como insecticidas para aplicación tópica y/o sistémica a cultivos de campo, hierbas, frutas y verduras y a plantas ornamentales. En una forma de realización de preferencia, la composición de insecticida biológico comprende una suspensión fluida de aceite de células bacterianas que expresan una o más proteínas insecticidas nuevas dadas a conocer en el presente documento. De preferencia, las células son células EG5438 o SIC9002 de B. thuringiensis, sin embargo, se contempla que resultará útil cualquier célula huésped bacteriana que exprese los segmentos de ácido nucleico nuevos dados a conocer en el presente documento y que produzca una proteína cristalina.

Las proteínas insecticidas de la presente invención también pueden utilizarse en composiciones para combatir la infestación de plantas por insectos, solas o en combinación con otras proteínas insecticidas o agentes insecticidas, y también pueden utilizarse solas o en combinación con procedimiento de supresión de genes. Según se utiliza en el presente documento “supresión de genes” significa cualquiera de los procedimientos bien conocidos para suprimir la expresión de una proteína a partir de un gen, incluidas la supresión transcripcional y la supresión postranscripcional del gen.

Según se utiliza en el presente documento un rasgo de “resistencia a las plagas” es una característica de una planta transgénica que es resistente al ataque de una plaga de las plantas tal como un virus, un nematodo, un insecto larvario o un insecto adulto que sea típicamente capaz de provocar pérdida de la cosecha en una planta progenitora. Tal resistencia a las plagas puede surgir de una mutación natural o, más típicamente de la incorporación de ADN recombinante que confiere resistencia a la plaga. Para impartir resistencia a los insectos a una planta transgénica tal ADN recombinante puede, por ejemplo, codificar una proteína letal para el insecto tal como una delta endotoxina de bacterias Bacillus thuringiensis, por ejemplo, como se utiliza en variedades de algodón y maíz disponibles en comercialmente, codificar una proteína toxina insecticida dada a conocer en el presente documento tal como una proteína TIC900 o una proteína relacionada o un fragmento insecticida de la misma, o puede ser transcrito a un ARN de doble hebra dirigido a la supresión de un gen esencial en el insecto, o cualquier combinación de estos agentes insecticidas. Para ilustrar que la producción de plantas transgénicas con resistencia a las plagas es una capacidad de los expertos en la técnica se hace referencia a las Patentes de EEUU Nº 5.250.515; 5.880.275 y 6.555.655 que dan a conocer plantas que expresan una endotoxina de bacterias Bacillus thuringiensis. Véase también, Patente de EEUU 6.506.599 (Fire y col.) y Publicación de Solicitud de Patente de EEUU 2003/0061626 A1 (Plaetinck y col.) y Publicación de Solicitud de Patente de EEUU 2003/0150017 A1 (Mesa y col.) que dan a conocer el combate de invertebrados permitiendo que la plaga se alimente de plantas transgénicas que producen ARN de doble hebra para suprimir un gen diana en la plaga. Véase también, Patente de EEUU Nº 5.986.175 (Jilka y col.) que da a conocer el combate de plagas virales por medio de plantas transgénicas que expresan replicasa viral. Todas las patentes y solicitudes descritas anteriormente que dan a conocer materiales y procedimientos para el control de plagas en plantas se incorporan en el presente documento por referencia.

Sorprendentemente, las proteínas de la presente invención parecen no estar relacionadas con ninguna de las proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis descubiertas hasta el momento en la técnica. En el presente documento se muestra que las proteínas de la presente invención se excretan en el espacio extracelular que rodea la especie de Bacillus de las que derivan. En el presente documento se muestra que estas proteínas son significativamente más pequeñas que las proteínas Cry conocidas previamente en la técnica, y que se expresan durante el estadio vegetativo de crecimiento de los cultivos celulares bacterianos aislados y purificados. Esto es diferente de la expresión de las proteínas Cry que por lo general se expresan en la fase de de crecimiento de esporulación y que forman diversos cuerpos cristalinos dentro de la forespora de la célula.

Como resultará evidente para los expertos en la técnica, los inventores dan a conocer en el presente documento el aislamiento y la purificación de una secuencia de nucleótidos, tic900, que codifica una proteína precursora de TIC900 (TIC900p) que se procesa posteriormente para liberar una proteína TIC900 madura (TIC900m) que muestra actividad biológica inhibidora de las especies de lepidópteros. Los inventores dan a conocer en el presente documento el uso de la secuencia tic900 como un medio para identificar una multitud de otros homólogos y secuencias relacionadas, que codifican cada uno también proteínas insecticidas relacionadas con TIC900.

Las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en el presente documento y que codifican TIC900 y proteínas relacionadas se obtuvieron de diversas cepas de Bacillus thuringiensis, es decir la cepa EG5438 contenía al menos un gen denominado en el presente documento tic900. La cepa EG5438 se depositó bajo los términos del Tratado de Budapest con la colección permanente del NRRL el 3 de mayo de 2002 y se le proporcionó el número de referencia NRRL B-30584. Otra cepa identificada en el presente documento que contiene una secuencia que codifica TIC900, una secuencia de nucleótidos idéntica al alelo tic900 de EG5438, fue la cepa EG5526 de B. thuringiensis.

Las secuencias de nucleótidos relacionadas con tic900, y las secuencias de aminoácidos relacionadas con TIC900 (incluyendo las especies precursora y madura de TIC900) que se dan a conocer en el presente documento incluyen, pero no se limitan a tic402 y la proteína insecticida codificada TIC402 aislada de y producida al menos por las cepas EG3879 de B.t., tic403 y la proteína insecticida codificada TIC403 aislada de y producida al menos por la cepa EG4332 de B.t., tic404 y la proteína insecticida codificada TIC404 aislada de y producida al menos por la cepa EG4971 de B.t., tic434 y la proteína insecticida codificada TIC434 aislada de y producida al menos por la cepa EG4611 de B.t., tic961 y la proteína insecticida codificada TIC961 aislada de y producida al menos por la cepa EG4090 de B.t., tic962 y la proteína insecticida codificada TIC962 aislada de y producida al menos por la cepa EG4293 de B.t., tic963 y la proteína insecticida codificada TIC963 aislada de y producida al menos por la cepa EG4611 de B.t., tic965 y la proteína insecticida codificada TIC965 aislada de y producida al menos por la cepa EG5023 de B.t. y tic966 y la proteína insecticida codificada TIC966 aislada de y producida al menos por la cepa EG4092 de B.t..

Se pretende que las proteínas de la presente invención sean utilizadas para fines agrícolas, es decir, para proteger las plantas de la infestación por plagas de insectos, y más particularmente para proteger las plantas de la infestación por plagas de insectos lepidópteros. Según se ejemplifica en el presente documento, las proteínas de la presente invención son útiles para proteger las plantas al menos del barrenador europeo del maíz (ECB), al menos dla oruga del tabaco (TBW) y al menos de la palomilla dorso de diamante (DBM). La protección de las plantas puede conseguirse por medio de la aplicación tópica a una planta o a partes de la planta tal como por la aplicación a la superficie de la planta, es decir, las hojas, flores, tallos, pedúnculos y raíces, de una composición que contiene una cantidad eficaz como insecticida de una o más de las proteínas de la presente invención. Como alternativa, y de preferencia, la planta misma será transformada para que contenga una secuencia de nucleótidos modificada para la mejor expresión de la proteína de la presente invención in planta o la expresión de una de sus porciones insecticidas.

La proteína TIC900 es un compuesto insecticida activo contra insectos lepidópteros tales como ECB, TBW y DBM. La proteína TIC900 según se presenta en ID. SEC. Nº 4 y las proteínas insecticidas relacionadas pueden utilizarse como ingrediente activo en formulaciones insecticidas útiles para combatir los insectos lepidópteros. Según se utiliza en el presente documento y con referencia a las proteínas insecticidas que están relacionadas con TIC900, se pretende que las proteínas insecticidas relacionadas sean las que se identifican como homólogos de TIC900 o las que se identifican como codificadas por una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones rigurosas con toda o parte de la secuencia nativa de Bacillus thuringiensis que codificaba la proteína TIC900 o una de sus porciones insecticidas. Por supuesto, un experto en la técnica reconocerá que, debido a la redundancia del código genético, muchas otras secuencias son capaces de codificar tales proteínas relacionadas, y se pretende que tales secuencias, siempre que funcionen expresando las proteínas insecticidas en cepas de Bacillus o en células vegetales, estén abarcadas por la presente invención, reconociendo por supuesto que muchas de tales secuencias codificadoras redundantes no hibridarán bajo condiciones rigurosas con la secuencia nativa que codifica TIC900. Se concibe que las secuencias codificadoras funcionen para codificar toda o una porción insecticida de una proteína TIC900 o de una proteína relacionada que no hibride bajo condiciones rigurosas. Sin embargo, tales secuencias se obtienen de la secuencia de nucleótidos nativa en base a que la secuencia de nucleótidos nativa es capaz ser modificada para exhibir una secuencia no nativa que todavía codifique la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos nativa, o que la secuencia de aminoácidos nativa es capaz de ser utilizada junto con una tabla de codones para la retrotraducción, permitiendo que el experto en la técnica llegue a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción insecticida de una proteína TIC900 o una proteína relacionada. Se pretende que todas estas secuencias estén incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Las cepas de B. thuringiensis que contienen una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína TIC900 o una proteína relacionada y sus equivalentes sustanciales, pueden cultivarse usando medios y técnicas de fermentación convencionales conocidos. Tras completar el ciclo terminación de fermentación, las bacterias que expresan TIC900 o uno de sus homólogos pueden recogerse separando en primer lugar las esporas de B. thuringiensis y los cristales del caldo de fermentación agotado por medios bien conocidos en la técnica. Las esporas de B. thuringiensis y los cristales recuperados pueden formularse en un polvo humectable, un concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones por medio de la adición de tensioactivos, dispersantes, vehículos inertes y otros componentes para facilitar la manipulación y la aplicación para plagas diana concretas. Los procedimientos de formulación y aplicación son muy conocidos en la técnica. Las proteínas en el caldo de fermentación agotado que incluyen la proteína TIC900 o proteínas relacionadas de la presente invención pueden concentrarse y formularse en un polvo humectable, un concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones por medio de la adición de tensioactivos, dispersantes, vehículos inertes y otros componentes para facilitar la manipulación y la aplicación para plagas diana concretas.

En el entorno de la plaga pueden aplicarse gránulos de cebo formulados que contienen un atractor y esporas y cristales de los aislamientos de los B. thuringiensis o medio de fermentación agotado concentrado o proteínas insecticidas purificadas de las esporas o del medio de fermentación agotado, o microbios recombinantes que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifica una proteína TIC900 o proteínas insecticidas relacionadas que pueden obtenerse de los aislamientos de B. thuringiensis dados a conocer en el presente documento. El cebo puede aplicarse generosamente puesto que la toxina no afecta a los animales ni a los seres humanos. El producto puede también formularse como una pulverización o un polvo. Las plagas recogen el producto en sus patas o abdomen y lo llevan de vuelta al nido donde otras plagas quedarán expuestas a la toxina. El aislamiento de B. thuringiensis o el huésped recombinante que expresa una secuencia de nucleótidos o el gen que codifica una proteína TIC900 o una proteína relacionada de la presente invención pueden también incorporarse al cebo o a la fuente de los alimentos para la plaga.

Como apreciará un experto en la técnica, la concentración de plaguicida variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación concreta, en particular si se trata de un concentrado o de una formulación para uso directo. El plaguicida estará presente al menos al 1% en peso y puede estar al 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán desde aproximadamente 1 hasta 95% en peso del plaguicida, mientras que las formulaciones líquidas tendrán por lo general desde aproximadamente 1 hasta 60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones tendrán por lo general desde aproximadamente 102 hasta aproximadamente 104 células/mg o desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 partes por millón del componente activo, la proteína insecticida, es decir, la proteína TIC900, su variante de secuencia de aminoácidos, su porción o fragmento insecticida, o su homólogo. Estas formulaciones se administrarán a razón de aproximadamente 50 mg (líquido o seco) hasta 1 kg o más por hectárea. Las formulaciones pueden aplicarse al entorno de las plagas de lepidópteros, por ejemplo, plantas, tierra, o el agua rociando, pulverizando, por medio de aspersión, o similar, y también pueden aplicarse a las superficies de las semillas como tratamiento de las semillas o recubrimiento de las semillas y pueden hacerse penetrar en el revestimiento de la semilla y/o en los cotiledones.

Un experto en la técnica sabrá que para lograr una mejor expresión de una proteína insecticida de Bt en una planta, será necesario preparar en primer lugar una secuencia de nucleótidos que codifique la proteína de Bt, o una variante o un fragmento activo de la proteína. A continuación se colocará la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína

o su fragmento en una casete de expresión que funcione en las plantas para provocar la transcripción de la secuencia codificadora en un ARN mensajero que posteriormente se traduce en las células de la planta de manera tal que se produce una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida de la proteína insecticida dentro de los tejidos de la planta. Un experto en la técnica también sabrá transformar una célula vegetal, de preferencia una célula de maíz, algodón, soja, canola, arroz, trigo, avena, hierba, planta de forraje, planta crucífera, árbol frutal, flor ornamental, tomate, patata, zanahoria, col rizada, y planta de tabaco y similares con una secuencia de nucleótidos incluida dentro de la casete de expresión funcional de la planta, y sabrá seleccionar las células que contengan la secuencia y que estén expresando cantidades eficaces desde el punto de vista insecticida de la proteína insecticida, de preferencia una proteína TIC900 o una proteína relacionada o uno de sus fragmentos insecticidas, y sabrá producir plantas a partir de tales células transformadas. Un experto en la técnica sabrá usar los procedimientos de electroporación, infusión, balística, o procedimientos mediados por Agrobacterium tumefaciens y similares para introducir las secuencias de nucleótidos de la presente invención o sus modificaciones en una célula vegetal.

El término “variante o modificada”, con referencia a las secuencias de nucleótidos, pretende referirse a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad insecticida similar, la frase “toxina equivalente” hace referencia a una toxina que muestra la misma, esencialmente la misma, o actividad biológica mejorada contra las plagas diana que la toxina nativa o de referencia reivindicada. Una secuencia de nucleótidos variante o modificada destinada al uso en plantas dicotiledóneas codificará sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia codificadora nativa, es decir, la secuencia codificadora que se encuentra en la naturaleza, pero comprenderá una composición GC combinada total de desde aproximadamente 49 hasta aproximadamente 58 por ciento, y utilizará sustancialmente la preferencia de codones y la frecuencia de utilización de codones determinada recopilando tal preferencia y frecuencias de utilización de una combinación de secuencias codificadoras derivadas de una o más especies de plantas dicotiledóneas individuales destinadas a ser transformadas con la secuencia de nucleótidos variante o modificada. Una secuencia de nucleótidos variante o modificada destinada al uso en una planta monocotiledónea también codificará sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia codificadora nativa, pero comprenderá, una composición GC combinada total de desde aproximadamente 52 hasta aproximadamente 59 por ciento, y también utilizará sustancialmente la preferencia de codones y la frecuencia de utilización de codones determinada recopilando tal preferencia y frecuencias de utilización de una combinación de secuencias codificadoras derivadas de una o más especies de plantas monocotiledóneas individuales destinadas a ser transformadas con la secuencia de nucleótidos variante o modificada. Frecuencia de utilización de codones pretende referirse al número de veces, en promedio, que un codón particular se usa en una secuencia codificadora. Para una especie de planta particular, un codón destinado a causar la incorporación de un aminoácido particular en una secuencia de aminoácidos naciente se utilizará en promedio con cierta frecuencia relativa fija. Para los aminoácidos que utilizan solo dos codones, esta frecuencia es por lo general es de aproximadamente 50-50, es decir, cada codón se utiliza aproximadamente la mitad de las veces, a menos que uno de los codones utilice una cantidad sustancialmente mayor de purinas o de pirimidinas que no sean típicamente representativas del contenido de GC de la especie de planta particular. Para la especie Bacillus, por ejemplo, las secuencias codificadoras tienen por lo general desde aproximadamente 60 hasta aproximadamente 70 por ciento de AT. La utilización de codones en la especie Bacillus tiende hacia el uso de codones que están enriquecidos por la presencia de A o T en un codón particular. Por consiguiente, los codones que utilizan principalmente G o C se utilizan en una secuencia codificadora nativa y/o natural de Bacillus con mucha menor frecuencia que los codones que contienen A o T. Por consiguiente, cuando se produce una secuencia de nucleótidos variante o modificada destinada al uso en una planta particular, monocotiledónea o un dicotiledónea, es importante asegurarse de que se presta atención adecuada al uso de codones que no están particularmente enriquecidos con A y T en lo posible, y evitar la incorporación de secuencias de poliadenilación sospechosas (véase por ejemplo, Patente de EEUU Nº 5.500.365).

Según se utiliza en el presente documento, “secuencias codificadoras sintéticas” o “secuencias codificadoras que no se presentan en la naturaleza” que codifican las proteínas TIC900 de B. thuringiensis o sus homólogos o derivados como toxinas insecticidas de la presente invención son las preparadas de una forma que incluye la participación de cualquier tipo de manipulación o aislamiento genético. Esto incluye el aislamiento de la secuencia codificadora desde su estado natural, la manipulación de la secuencia codificadora por medio de la modificación de la secuencia de nucleótidos codificadora (según se describe en el presente documento), la síntesis química de toda o parte de una secuencia codificadora usando química de fosforamidita y similar, o mutagénesis dirigida a sitios (según se describe en el presente documento), el truncamiento de la secuencia codificadora o cualquier otro procedimiento de manipulación o aislamiento de modo que la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificadora que no se presenta en la naturaleza codifique sustancialmente la misma proteína insecticida que la secuencia codificadora nativa y además exhiba sustancialmente el mismo o un nivel mejorado de bioactividad insecticida como la proteína de toxina insecticida nativa.

Según se utiliza en el presente documento, la frase “porcentaje de identidad de secuencia” se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en la que la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios de separación) con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se presenta el residuo de aminoácido o la base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Una secuencia que es idéntica en cada posición en comparación con una secuencia de referencia se dice que es idéntica a la secuencia de la referencia y viceversa. Una primera secuencia de nucleótidos, cuando se observa en la dirección a 5’ a 3’, se dice que es un “complemento” de una segunda secuencia de nucleótidos o secuencia de referencia observada en la dirección 3’ a 5’, si la primera secuencia de nucleótidos muestra complementariedad completa con la segunda secuencia o secuencia de referencia. Según se utiliza en el presente documento, se dice que las moléculas de la secuencia de ácido nucleico muestran “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las secuencias leída en dirección 5’ a 3’ es complementario a cada nucleótido de la otra secuencia leída en dirección 3’ a 5’. Una secuencia de nucleótidos que es idéntica en cada posición cuando se lee en dirección 5’ a 3’ en comparación con una secuencia de nucleótidos de referencia leída en dirección 5’ a 3’ se dice que es idéntica a la secuencia de la referencia y viceversa. Una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de referencia mostrará una secuencia idéntica a la secuencia complemento inversa de la secuencia de nucleótidos de referencia. Estos términos y descripciones están bien definidos en la técnica y son comprendidos fácilmente por los expertos en la técnica.

Según se utiliza en el presente documento, “homología sustancial”, con referencia a secuencias de ácido nucleico, se refiere a secuencias de nucleótidos que hibridan bajo condiciones rigurosas con la secuencia codificadora de TIC900 según se presenta en ID. SEC. Nº 3 o sus complementos. Las secuencias que hibridan bajo condiciones rigurosas con ID. SEC. Nº 3 o sus complementos, en particular de la secuencia de nucleótidos desde aproximadamente la posición del nucleótido 1 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 1806, y más particularmente desde aproximadamente la posición del nucleótido 121 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 1806, contienen una o más secuencias lineales que son suficientemente idénticas a una o más secuencias lineales de ID. SEC. Nº 3 de modo que puede tener lugar una alineación y las dos secuencias son capaces a continuación, bajo condiciones rigurosas, de formar enlaces de hidrógeno con las bases correspondientes en la hebra opuesta para formar una molécula dúplex suficientemente estable bajo las condiciones rigurosas durante un periodo de tiempo suficientemente prolongado para ser detectable por medio de procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales secuencias homólogas son desde aproximadamente 67% idénticas, hasta aproximadamente 70% idénticas, hasta aproximadamente 80% idénticas, hasta aproximadamente 85% idénticas, hasta aproximadamente 90% idénticas, hasta aproximadamente 95% idénticas, hasta aproximadamente 99% idénticas o más a la secuencia de nucleótidos de referencia según se presenta en ID. SEC. Nº 3 o su complemento. Además, las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas insecticidas que pueden aislarse de las cepas de Bacillus thuringiensis y similares, que hibridan bajo condiciones rigurosas con ID. SEC. Nº 3 también se prevé que exhiban homología sustancial con las secuencias de nucleótidos de referencia que hibridan bajo condiciones rigurosas con la secuencia codificadora tic900 según se presenta en ID. SEC. Nº 3 o sus complementos. En el presente documento se hace referencia a tales secuencias de nucleótidos como homólogos de ID. SEC. Nº 3 y similares y comprenden ID. SEC. Nº 5, ID. SEC. Nº 7, ID. SEC. Nº 9, ID. SEC. Nº 29, ID. SEC. Nº 11, ID. SEC. Nº 13, ID. SEC. Nº 15, ID. SEC. Nº 17 e ID. SEC. Nº 19, y secuencias relacionadas y sus homólogos.

Con referencia a las secuencias de polipéptidos, la frase “homología sustancial” se refiere a polipéptidos que son aproximadamente 70% homólogos a, aproximadamente 80% homólogos a, aproximadamente 86% homólogos a, aproximadamente 90% homólogos a, aproximadamente 95% homólogos a, aproximadamente 99% homólogos a, una secuencia de polipéptidos de referencia. Más específicamente, los inventores prevén que los homólogos sustanciales tengan aproximadamente 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de homología con la secuencia de polipéptidos de referencia según se presenta en el presente documento en ID. SEC. Nº 4, ID. SEC. Nº 6, ID. SEC. Nº 8, ID. SEC. Nº 10, ID. SEC. Nº 30, ID. SEC. Nº 12, ID. SEC. Nº 14, ID. SEC. Nº 16, ID. SEC. Nº 18 e ID. SEC. Nº 20.

Con referencia a las proteínas de la presente solicitud, las frases “secuencia de aminoácidos variante”, o “variante de secuencia de aminoácidos”, o “variante de secuencia de aminoácidos modificada” pretenden referirse a secuencias de aminoácidos que son sustancialmente equivalentes a las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Por ejemplo, una proteína producida por la introducción de un sitio de restricción para la conveniencia de las manipulaciones moleculares en una secuencia codificadora de la presente invención que da como resultado la adición o sustracción de uno o más codones sin de otro modo (1) romper la secuencia codificadora nativa, (2) romper el marco de lectura abierto nativo, y (3) interrumpir la actividad biológica insecticida de la proteína, constituiría (a) una secuencia de aminoácidos variante comparada con la toxina insecticida nativa, (b) una variante de secuencia de aminoácidos comparada con la toxina insecticida nativa, o (c) una variante de secuencia de aminoácidos modificada comparada con la toxina insecticida nativa. Un experto en la técnica reconocerá que existen otros tipos de modificaciones que pueden realizarse a la secuencia de aminoácidos de la presente invención sin interrumpir la actividad biológica de la proteína. Las inserciones, deleciones, y sustituciones están dentro del alcance de la presente descripción hasta el punto en que la variante de secuencia de aminoácidos resultante exhiba actividad insecticida no inferior a la de la proteína insecticida nativa. Están específicamente contempladas las quimeras de las proteínas dadas a conocer en el presente documento, las fusiones de proteínas o partes de las proteínas dadas a conocer en el presente documento, y permuteínas de las proteínas dadas a conocer en el presente documento.

Los inventores consideran que las composiciones de proteínas dadas a conocer en el presente documento encontrarán particular utilidad como insecticidas para aplicación tópica y/o sistémica a cultivos de campo, hierbas, frutas y verduras, y plantas ornamentales. En una forma de realización de preferencia, la composición de bioinsecticida comprende una suspensión fluida de aceite de células bacterianas que expresan una proteína insecticida nueva dada a conocer en el presente documento. De preferencia, las células son células EG5438 o SIC9002 de B. thuringiensis, sin embargo, se contempla que resultará útil cualquier célula huésped bacteriana que exprese los segmentos de ácido nucleico nuevos dados a conocer en el presente documento y que produzca una proteína cristalina, tales como B. megaterium, B. subtilis, E. coli o Pseudomona spp.

En otra realización, la composición del bioinsecticida comprende un gránulo dispersable del agua. Este gránulo comprende células bacterianas que expresan una proteína insecticida nueva dada a conocer en el presente documento. Las células bacterianas de preferencia son células EG5438 o SIC9002 de B. thuringiensis, sin embargo, se contempla que resultarán útiles las bacterias tales como las células de B. megaterium, B. subtilis, E. coli o Pseudomona spp. transformadas con un segmento de ADN dado a conocer en el presente documento y que expresa la proteína insecticida.

En una tercera forma de realización, la composición del bioinsecticida comprende un polvo humectable, polvo, pellas, o concentrado coloidal. Este polvo comprende células bacterianas que expresan una proteína insecticida nueva dada a conocer en el presente documento. Las células bacterianas de preferencia son células EG5438 o SIC9002 de B. thuringiensis, sin embargo, se contempla que resultarán útiles las bacterias tales como las células de B. megaterium, B. subtilis, E. coli o Pseudomona spp. transformadas con un segmento de ADN dado a conocer en el presente documento y que expresa la proteína insecticida. Tales formas secas de las composiciones insecticidas pueden formularse para disolverse inmediatamente tras la humectación, o como alternativa, disolverse de una manera de liberación controlada, liberación sostenida u otra manera dependiente del tiempo.

En una cuarta realización, la composición del bioinsecticida comprende una suspensión acuosa de células bacterianas tales como las descritas anteriormente que expresan la proteína insecticida. Tales suspensiones acuosas pueden proporcionarse como una disolución madre concentrada que se diluye antes de la aplicación, o como alternativa, como una disolución diluida lista para aplicar.

Para estos procedimientos que implican la aplicación de células bacterianas, la célula huésped que contiene el(los) gen(es) de la proteína insecticida puede cultivarse en cualquier medio nutritivo conveniente, en el que la construcción de ADN proporcione una ventaja selectiva, proporcionando un medio selectivo de modo que sustancialmente todas

o todas las células retengan el gen de B. thuringiensis. Estas células pueden recogerse a continuación según las formas convencionales. Como alternativa, las células pueden tratarse antes de la recogida.

Cuando las composiciones insecticidas comprenden células de B. thuringiensis intactas que expresan la proteína de interés, tales bacterias pueden formularse en una diversidad de formas. Pueden utilizarse como polvos humectables, gránulos o polvos, mezclándolos con diversos materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o materiales de tipo botánico (mazorcas de maíz pulverizadas, cáscaras de arroz, cáscaras de nuez y similares). Las formulaciones pueden incluir coadyuvantes de dispersión/adhesión, agentes estabilizadores, otros aditivos plaguicidas o tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden tener base acuosa o no acuosa y pueden utilizarse como espumas, suspensiones, concentrados emulsionables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, tensioactivos, emulsivos, dispersantes, o polímeros.

Como alternativa, la proteína TIC900 nueva o la proteína relacionada o derivada de TIC900 o su homólogo puede prepararse por medio de sistemas de expresión bacteriana nativos o recombinantes in vitro y aislarse para la posterior aplicación en el campo. Tal proteína puede estar en lisados celulares brutos, suspensiones, coloides, etc., o como alternativa puede purificarse, refinarse, tamponarse, y/o puede ser procesada adicionalmente, antes de ser formulada en una formulación biocida activa. Asimismo, en determinadas circunstancias, puede ser deseable aislar la proteína en alguna forma cristalina y/o como esporas de los cultivos bacterianos que expresan la proteína insecticida y aplicar disoluciones, suspensiones, o preparaciones coloidales de tales cristales y/o esporas como la composición bioinsecticida activa.

Independientemente del procedimiento de aplicación, la cantidad del (los) componente(s) activo(s) se aplica en una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida, que variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, los insectos lepidópteros específicos a combatir, el cultivo o la planta específica a tratar, las condiciones ambientales, y el procedimiento, velocidad y cantidad de aplicación de la composición activa desde el punto de vista insecticida.

Las composiciones insecticidas descritas pueden elaborarse formulando la célula bacteriana, la suspensión de cristales y/o esporas, o el componente proteico aislado con el vehículo deseado aceptable desde el punto de vista agrícola. Las composiciones pueden formularse antes de la administración en un medio adecuado tal como un liofilizado, desecado o en un vehículo acuoso, un medio o diluyente adecuado, tal como disolución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de polvo o material granulado o en una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o como emulsiones de agua en aceite/agua, o como un polvo humectable, o en combinación con cualquier otro material vehículo adecuado para la aplicación agrícola. Los vehículos agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. La frase “vehículo aceptable desde el punto de vista agrícola” cubre todos los coadyuvantes, por ejemplo, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, agentes adhesivos, aglutinantes, etc. que se usan habitualmente en la tecnología de formulación de insecticidas; estos son muy conocidos por los expertos en la formulación de insecticidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más coadyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, por medio de la mezcla o combinación homogénea, y/o moliendo la composición del insecticida con coadyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales.

Las composiciones insecticidas de la presente invención se aplican al entorno del insecto de lepidóptero diana, típicamente sobre el follaje de la planta o cultivo a proteger, mediante procedimientos convencionales, de preferencia por pulverización. La potencia y la duración de la aplicación del insecticida se establecerá con respecto a condiciones específicas para el(los) cultivo(s), plaga(s) concreto(s) a tratar y las condiciones ambientales concretas. La relación proporcional del ingrediente activo al vehículo dependerá naturalmente de la naturaleza química, la solubilidad y la estabilidad de la composición insecticida, así como de la formulación contemplada en particular.

También son factibles otras técnicas de aplicación, por ejemplo, la pulverización, la aspersión, el empapado, la inyección de la tierra, el recubrimiento de las semillas, el recubrimiento de las plántulas, la vaporización, la aireación, la vaporización fina, la atomización, y similares, y pueden ser necesarias en determinadas circunstancias tales como por ejemplo, insectos que causan infestación de las raíces o los pedúnculos, o para la aplicación a vegetación delicada o plantas ornamentales. Estos procedimientos de aplicación también son muy conocidos por los expertos en la técnica.

La composición insecticida de la invención puede utilizarse en el procedimiento de la invención sola o en combinación con otros compuestos, incluidos pero no limitados a otros plaguicidas. El procedimiento de la invención puede también usarse conjuntamente con otros tratamientos tales como formulaciones de tensioactivos, detergentes, polímeros

o formulación de liberación lenta. Las composiciones insecticidas de la presente invención pueden formularse para uso sistémico o tópico.

La concentración de la composición insecticida que se usa para aplicación ambiental, sistémica, o foliar variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, el medio de aplicación, las condiciones ambientales, y el grado de actividad biocida. Típicamente, la composición bioinsecticida estará presente en la formulación aplicada en una concentración de al menos aproximadamente 1% en el peso y puede estar en concentraciones mayores incluido aproximadamente 99% en peso. Las formulaciones secas de las composiciones pueden estar en concentraciones desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 99% en peso de la composición o más, mientras que las formulaciones líquidas pueden comprender por lo general desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 99% en peso o más del ingrediente activo. Las formulaciones que comprenden células bacterianas intactas contendrán generalmente desde aproximadamente 104 hasta aproximadamente 1012 células/mg.

Las formulaciones insecticidas pueden administrarse a una planta particular o área diana en una o más aplicaciones según sea necesario, con una típica tasa de aplicación en campo por hectárea que varía en el orden de desde aproximadamente 50 g hasta aproximadamente 500 g de ingrediente activo, o desde aproximadamente 500 g hasta aproximadamente 1000 g, o desde aproximadamente 1000 g hasta aproximadamente 5000 g o más del ingrediente activo.

Pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de los péptidos de la presente invención y en los segmentos de ADN que los codifican y aún obtener una molécula funcional que codifica una proteína o péptido con las características deseables. En formas de realización particulares de la invención, se considera que las variantes de secuencia de aminoácidos de las proteínas de la presente invención son útiles para aumentar la actividad insecticida de la proteína, y por consiguiente para aumentar la actividad insecticida y/o la expresión del transgén recombinante en una célula vegetal. Los cambios de aminoácidos pueden alcanzarse por medio de cambios de codones de la secuencia de ADN.

Se pretende que las proteínas que son sustancialmente equivalentes a las proteínas de la presente solicitud sean equivalentes desde el punto de vista biológico y funcional. Según se utiliza en el presente documento, la frase “equivalentes desde el punto de vista biológico y funcional”, con respecto a las proteínas insecticidas de la presente invención, son, péptidos, polipéptidos y proteínas que contienen una secuencia o resto que muestra similitud de secuencia con los péptidos nuevos de la presente invención, tales como una proteína TIC900 o una proteína relacionada o un fragmento insecticida de las mismas, y que muestra las mismas propiedades funcionales o similares a las de los polipéptidos dados a conocer en el presente documento, incluida la actividad insecticida. Los equivalentes biológicos también incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas que reaccionan con, es decir, se unen específicamente a los anticuerpos surgidos contra epítopos presentes en o dentro de la proteína TIC900 o una proteína relacionada y que muestran la misma actividad reactiva o de unión o similar, incluidos los anticuerpos monoclonales y policlonales.

También está contemplado que las proteínas de la presente invención puedan resultar útiles para proteger las plantas dicotiledóneas de la infestación por insectos. Tales infestaciones podrían ser el resultado de lepidópteros, coleópteros, dípteros, o incluso la infestación por ácaros, gorgojos, larvas o una gran diversidad de insectos que dañan la planta perforando los tejidos vegetales y extrayendo los nutrientes destinados al crecimiento y desarrollo de la planta. Las modificaciones a la secuencia de aminoácidos primaria de las proteínas de la presente invención podría dar como resultado una proteína que muestra una variedad de huéspedes diferente de la de la proteína nativa.

Las proteínas de la presente invención, por su localización en el espacio extracelular cuando son expresadas por cepas de Bacillus, pueden ser útiles para dirigir otras proteínas para su localización en el espacio extracelular. Por ejemplo, el experto en la técnica sabrá unir una primera proteína que no se secreta normalmente en el espacio extracelular a una segunda proteína que normalmente se secreta en el espacio extracelular para conseguir la localización de la primera proteína en el espacio extracelular. Las proteínas de la presente invención podrían fusionarse por cualquier serie de medios bien conocidos en la técnica a una o más toxinas insecticidas tales como las delta endotoxinas cristalinas para formar una proteína quimérica dirigida para la secreción en el espacio extracelular que rodea una célula huésped concreta. Incluso se prevé que el evento de secreción en sí mismo podría dar lugar a la separación de las dos partes de la proteína de modo que se liberen dos proteínas insecticidas separadas y diferentes en el espacio extracelular que rodea una célula huésped concreta. Las dos proteínas podrían (1) ser ambas tóxicas para la misma especie de insecto pero efectuar su actividad insecticida usando modos de acción diferentes, o (2) ser cada una tóxica para diferentes especies de insecto. Es razonable pensar que numerosas proteínas insecticidas podrían unirse por los extremos a las proteínas de la presente invención para formar quimeras multiméricas dirigidas al espacio extracelular que rodea una célula huésped concreta. Resulta de preferencia, en las situaciones en las que se contempla el uso de otras proteínas insecticidas de Bt, que las proteínas insecticidas fusionadas a las proteínas de la presente invención sean más pequeñas que las proteínas Cry1 de longitud total, de más preferencia simplemente fragmentos fundamentales de la toxina insecticida de las proteínas Cry1, de las proteínas Cry2A, de las proteínas Cry3, de las proteínas Cry9, etc. Tales “otras” proteínas podían ser razonablemente la proteína fluorescente verde y proteínas relacionadas y variantes, cinasas y fosfatasas para modular los procesos de señalización celular, nucleasas, lipasas, proteínas de tolerancia a herbicidas expresadas a partir de genes tales como gox, diversos homólogos de epsps, barr y homólogos y similares, PhnO, NptII, Aad, y similares. Todas estas proteínas podrían usarse también como marcadores seleccionables, en particular cuando están unidas a un gen que codifica una o más de las proteínas de la presente invención, para seguir la pista de la presencia de los genes que codifican una o más de las proteínas de la presente invención en una planta u otra célula huésped.

Las proteínas de la presente invención podrán dirigirse para su importación en un orgánulo subcelular. Por ejemplo, una primera secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de dirección a cloroplastos o plastidios podrá unirse de manera operativa o fusionarse a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida de la presente invención para producir una proteína precursora quimérica que está dirigida para su inserción en el cloroplasto o plastidio dentro de una célula vegetal. La expresión de tales proteínas quiméricas podrá dar como resultado la importación de las proteínas de la presente invención en el cloroplasto o plastidio de la planta, dando lugar a la localización de la toxina insecticida o su fragmento insecticida en el cloroplasto o el plastidio. Además, una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas de la presente invención podrá localizarse en el cloroplasto o plastidio para su expresión. La localización de las secuencias de nucleótidos en los cloroplastos o plastidios podrá dar lugar a la incorporación de las secuencias de nucleótidos en el genoma del cloroplasto o plastidio, o podrá dar como resultado la presencia de una secuencia de ácido nucleico de replicación autónoma que codifica la proteína de la presente invención. En cualquier caso, las proteínas de la presente invención estarán localizadas en el cloroplasto o plastidio. Según se utiliza a continuación en el presente documento, la frase “localizado en el cloroplasto o plastidio” se refiere a una molécula biológica, polinucleótido o polipéptido, que está situada dentro del cloroplasto o del plastidio de modo que la molécula está aislada del medio citoplásmico celular, y funciona dentro del citoplasma del cloroplasto o plastidio para proporcionar los efectos insecticidas beneficiosos reivindicados en la presente invención. La localización de una molécula biológica en el cloroplasto o plastidio puede tener lugar, con referencia a polinucleótidos, por medios mecánicos artificiales tales como la electroporación, la microinyección mecánica, o por medio del bombardeo de microproyectiles recubiertos de polinucleótidos, o con referencia a polipéptidos, por medio de secreción o de importación en los que se usa una secuencia peptídica natural, sintética o heteróloga dirigida al cloroplasto o plastidio que funciona para dirigir, insertar, asistir o localizar un polipéptido unido a un cloroplasto o plastidio. En cualquier caso, la localización de una o más proteínas insecticidas al cloroplasto o plastidio implica necesariamente que la planta resultante, que contiene las células que contienen los plastidios que contienen tal proteína o proteínas insecticidas localizadas dentro, debe también exhibir características morfológicas normales. No se sabe cuál de las proteínas insecticidas, si acaso alguna, cuando se localiza en el cloroplasto o plastidio, dará como resultado la obtención de una planta recombinante que muestre las características morfológicas normales ejemplificadas sin limitación por una ausencia de clorosis, una ausencia de atrofia o detenimiento de la fisiología de la planta que incluye pero no se limita a los pedúnculos promedio más gruesos, tallos o internodos acortados, floración inadecuada, infertilidad, rendimiento disminuido, etc.

Según se utiliza en el presente documento, la frase “unido de manera operativa” o “unido operativamente” se refiere a segmentos codificadores de ácidos nucleicos conectados en marco de manera tal que las propiedades de uno influyen en la expresión del otro. Estas frases y grupos de palabras pueden usarse también para referirse a secuencias de aminoácidos que muestran alguna función cuando están unidas a otra secuencia de aminoácidos, por ejemplo, se dice que un péptido señal, cuando está unido a una proteína de interés, está unido de manera operativa a la proteína de interés con el fin de dirigir la proteína de interés al aparato secretor de la célula huésped en la que se produce la proteína.

Para los fines de la presente invención, la palabra “gen” se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína TIC900, o uno de sus fragmentos insecticidas, o una de sus variantes de secuencia de aminoácidos, o uno de sus homólogo proteicos relacionados o fragmentos insecticidas o sus variantes de secuencia de aminoácidos que está al menos unida de manera operativa a una secuencia promotora y a una secuencia de terminación de la transcripción, en la que las secuencias promotora y de terminación de la transcripción son funcionales en la célula huésped en la que se produce la proteína. Según se utiliza en el presente documento, “gen estructural” se refiere a un gen que se expresa para producir un polipéptido. Un gen estructural de la presente invención puede contener, además de las secuencias promotora y de terminación de la transcripción, secuencias no traducidas en posición cinco prima, secuencias intrónicas y elementos potenciadores que funcionan en plantas en particular, y de preferencia en las derivadas de plantas monocotiledóneas tales como las plantas de maíz o de plantas dicotiledóneas tales las plantas de tabaco o las plantas de crucíferas que, cuando están unidas juntas en una secuencia adecuada con una o más secuencias codificadoras de la presente invención dan lugar a niveles de expresión mejorados en tejidos particulares de la planta, y de preferencia dan como resultado la expresión mejorada en hojas y tejidos del tallo de esas plantas.

La información de secuencias de nucleótidos proporcionada por la presente invención permite la preparación de secuencias de ADN relativamente cortas, denominadas en el presente documento sondas o cebadores, que tienen la capacidad de hibridar específicamente con secuencias de los polinucleótidos seleccionados dados a conocer en el presente documento. Tales sondas de ácido nucleico de longitud adecuada se preparan basándose en una consideración de las secuencias de polipéptidos seleccionadas que codifican los polipéptidos insecticidas de la presente invención, por ejemplo, una secuencia tal como la mostrada en toda o en una parte específica de la sonda de ID. SEC. Nº 3, toda o en una parte específica de la sonda ID. SEC. Nº 5, toda o en una parte específica de la sonda ID. SEC. Nº 7, toda o en una parte específica de la sonda ID. SEC. Nº 9, toda o en una parte específica de la sonda ID. SEC. Nº 29, toda o en una parte específica de la sonda ID. SEC. Nº 11, toda o en una parte específica de la sonda ID. SEC. Nº 13, toda o en una parte específica de la sonda ID. SEC. Nº 15, toda o en una parte específica de la sonda ID. SEC. Nº 17, toda o en una parte específica de la sonda ID. SEC. Nº 19, y similares. La referencia a la frase “toda o en una parte específica de la sonda” pretende referirse a una sonda de secuencia de nucleótidos que comprende al menos desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 50, más o menos, nucleótidos contiguos seleccionados del grupo de nucleótidos que se presenta en una secuencia de referencia particular tal como ID. SEC. Nº 3, ID. SEC. Nº 5, ID. SEC. Nº 7, ID. SEC. Nº 9, ID. SEC. Nº 29, ID. SEC. Nº 11, ID. SEC. Nº 13, ID. SEC. Nº 15, ID. SEC. Nº 17, e ID. SEC. Nº 19. La capacidad de tales sondas de ácido nucleico para hibridar específicamente con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia del polipéptido insecticida les da particular utilidad en una diversidad de formas de realización. Lo que es más importante, las sondas pueden usarse en una diversidad de ensayos para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra biológica dada. Por referencia al término “muestra biológica”, se pretende que cualquier muestra que contenga una secuencia de nucleótidos de referencia que pueda detectarse por una secuencia de sonda según se presenta en el presente documento sea una muestra que contiene una molécula biológica seleccionada del grupo constituido por las secuencias de nucleótidos contiguos presentadas en el presente documento, y por consiguiente se hace referencia a la muestra como una “muestra biológica”.

En determinadas formas de realización, es ventajoso usar cebadores de oligonucleótidos. La secuencia de tales cebadores se diseña usando un polinucleótido de la presente invención para usar en la detección, amplificación o modificación de un segmento definido de una secuencia codificadora de la proteína insecticida de B. thuringiensis o de Bacillus sphaericus y similares usando tecnología de amplificación térmica. Los segmentos de secuencias de nucleótidos relacionados con los polinucleótidos que codifican los polipéptidos insecticidas de la presente invención pueden también aislarse y caracterizarse usando la tecnología de amplificación térmica y tales cebadores.

Para proporcionar algunas de las ventajas según la presente invención, una secuencia de ácido nucleico de preferencia utilizada para los estudios o ensayos de hibridación o como un cebador incluye secuencias que son complementarias a al menos extensiones de 14 a 30 nucleótidos contiguos o más de una secuencia de polinucleótidos que codifica toda o una parte de una proteína insecticida de la presente invención, tales como las mostradas en ID. SEC. Nº 2, ID. SEC. Nº 3, ID. SEC. Nº 5, ID. SEC. Nº 7, ID. SEC. Nº 9, ID. SEC. Nº 29, ID. SEC. Nº 11, ID. SEC. Nº 13, ID. SEC. Nº 15, ID. SEC. Nº 17, ID. SEC. Nº 19, ID.

SEC. Nº 21, e ID. SEC. Nº 22.

Un tamaño de cebador o sonda de al menos 14 nucleótidos de longitud ayuda a asegurar que el fragmento tendrá longitud suficiente para formar una molécula dúplex estable y selectiva. Las moléculas que tienen secuencias complementarias sobre segmentos mayores a 14 bases de longitud resultan en general de preferencia. Para aumentar la estabilidad y la selectividad del híbrido, y por consiguiente mejorar la calidad y el grado de las moléculas híbridas específicas obtenidas, se preferirá por lo general diseñar moléculas de ácido nucleico que tengan secuencias complementarias a tic900 y similares de 14 a 20 nucleótidos, o incluso mayores cuando se desee. Tales fragmentos pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente los fragmentos por medios químicos, por medio de aplicación de tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, o por escisión de fragmentos de ADN seleccionados de secuencias recombinantes localizadas en plásmidos u otros vectores que contienen insertos apropiados y sitios de restricción adecuados.

La presente invención también contempla un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. Por consiguiente, en una forma de realización un vector de expresión es una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor unido de manera operativa a una región codificadora que codifica un polipéptido de la presente invención, cuya región codificadora está unida de manera operativa a una región de terminación de la transcripción, por la que el promotor dirige la transcripción de la región codificadora. La región codificadora puede incluir un segmento que codifica una toxina insecticida de B. thuringiensis de la presente invención y un segmento que codifica un péptido de dirección a cloroplastos o plastidios. La molécula de ADN que comprende el vector de expresión puede también contener una secuencia de intrón funcional situada secuencia arriba de la secuencia codificadora o incluso dentro de la secuencia codificadora, y puede también contener una secuencia líder no traducida cinco prima (5’) (es decir, un UTR o 5’-UTR) situados entre el promotor y el punto de la iniciación de la traducción.

Según se utiliza en el presente documento y con referencia a los elementos promotores, las frases “unido de manera operativa” o “unido operativamente” pretenden indicar que una secuencia de nucleótidos que contiene un promotor, es decir un elemento genético que funciona en una célula huésped concreta para dirigir la iniciación de la transcripción, está conectada a una región codificadora de manera tal que la transcripción de dicha región codificadora está controlada y sustancialmente regulada por dicho promotor. Los medios para unir de manera operativa un promotor a una región codificadora son muy conocidos en la técnica. Los promotores que funcionan en bacterias son muy conocidos en la técnica. Los promotores de ejemplo y de preferencia para las proteínas cristalinas de B. thuringiensis incluyen los promotores de los genes sigA, sigEy sigK. Como alternativa, pueden usarse promotores nativos, modificados, heterólogos o recombinantes derivados de Bacillus thuringiensis u otra especie de Bacillus para conseguir la expresión de las proteínas de la presente invención en una cepa de especie de Bacillus.

Cuando se use una secuencia de nucleótidos que codifica toda o una parte insecticida de una proteína de la presente invención para transformar una planta, se seleccionará un promotor que tenga la capacidad para dirigir la expresión de la secuencia codificadora en esa especie particular de planta. Los promotores que funcionan en diferentes especies de plantas son también muy conocidos en la técnica. Los promotores útiles para la expresión de polipéptidos en plantas son los que son inducibles, virales, sintéticos o constitutivos según se describen en Odell y col. (Nature 313: 810-812, 1985), y/o los promotores que son regulados temporalmente, regulados espacialmente y regulados espacio temporalmente. Los promotores de preferencia incluyen los promotores de CaMV35S potenciados, el promotor de GBOX10, el promotor de FMV35S, el promotor de actina del arroz, y sus variantes y quimeras. Para el control óptimo de las especies de ECB por medio de la expresión de las proteínas de la presente invención en plantas, por ejemplo, resulta de preferencia alcanzar los niveles más altos de expresión de estas proteínas dentro de las hojas y los tallos de las plantas de maíz. Sustancial regulación temporal o espacial se refiere a la expresión de un gen dentro de una planta o tejido vegetal a partir de un promotor operativo de la planta. Con referencia a la regulación temporal, un promotor puede regularse para la expresión sólo durante tiempos específicos durante el crecimiento y desarrollo de la célula o tejido vegetal o incluso de toda la planta. Un ejemplo de regulación temporal sería un promotor que está expresando de manera activa uno o más genes solamente durante la germinación de la semilla. Otros ejemplos podrían incluir promotores que expresan de manera activa uno o más genes solamente durante los momentos en que la planta, célula vegetal o tejido vegetal están expuestos a determinadas intensidades de luz o durante la oscuridad total. Sustancial regulación temporal se refiere a un promotor que está expresando de manera activa en un determinado momento pero que puede o no estar suprimido en otros momentos, de manera tal que la expresión pueda detectarse aún controlando la presencia de algún indicador tal como una enzima producida a partir de una secuencia codificadora unida a tal promotor, o según se mida por el aumento o disminución de algún producto genético tal como un ARNm producido en diversos momentos a través del crecimiento, diferenciación, y desarrollo de las planta y/o en respuesta a diversos estímulos ambientales. Sustancial regulación espacial se refiere a la expresión de un gen unido a un promotor a partir del que tiene lugar la expresión solamente durante el crecimiento y el desarrollo de determinadas células o tejidos dentro de una planta. Por ejemplo, un promotor tapetal es uno que se expresa sustancialmente de manera espacial durante el crecimiento y el desarrollo de la flor. De manera similar, se espera que un promotor específico de hoja o potenciado de hoja se expresará solamente para la expresión sustancialmente espacial desde dentro de las células de la hoja o tejidos de la hoja. Sustancialmente regulado de manera espacial también se refiere al nivel de expresión a partir de un promotor específico de un tejido concreto en ese tejido concreto y con respecto a los niveles de expresión a partir de ese o de otro promotor similar en otros tejidos, en el que la expresión puede también detectarse en tejidos diferentes del tejido concreto en el que resulta de preferencia la expresión del promotor, pero en niveles de expresión significativamente inferiores según se mide por la producción de una enzima producida a partir de una secuencia codificadora unida al promotor o por la aparición de algún producto genético detectable. Los promotores también pueden estar regulados tanto sustancialmente de manera temporal como sustancialmente de manera espacial juntos y simultáneamente de una manera regulada en forma coordinada. Otros promotores que se pretende específicamente que estén dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero no se limitan al promotor de la ubiquitina, al promotor del virus ADN baciliforme de la caña de azúcar, al promotor de la subunidad grande de la ribulosa bis-fosfato carboxilasa entre otros.

En la construcción de expresión de ADN también pueden incluirse secuencias de intrones de preferencia para conseguir la óptima expresión de las secuencias de nucleótidos que no se presentan en la naturaleza en plantas monocotiledóneas. Tal intrón se coloca típicamente próximo al extremo 5’ del ARNm dentro o inmediatamente secuencia abajo de una secuencia no traducida. El intrón podrá obtenerse de, pero sin limitación, una serie de intrones constituida por el intrón de la proteína del choque térmico (HSP) 70 del maíz (Patente de EEUU Nº 5.424.412; 1995), el intrón de Act1 del arroz (McElroy y col., Plant Cell 2: 163-171, 1990), el intrón 1 de Adh (Callis y col., Genes & Develop. 1:1183 1200, 1987), o el intrón de la sacarosa sintasa (Vasil y col., Plant Phys. 91:1575 -1579, 1989).

Otro elemento que actúa regulando o modulando la expresión genética es la secuencia de ADN entre el sitio de iniciación de la transcripción y el comienzo de la secuencia codificadora, denominada secuencia líder no traducida (UTL). Se han realizado recopilaciones de secuencias líderes para predecir las secuencias óptimas o subóptimas y generar secuencias líderes de “consenso” y de preferencia (Joshi, Nucl. Acids Res. 15: 9627-9640, 1987). Se considera que de las secuencias líderes de preferencia incluyen las que comprenden las secuencias predichas para dirigir la expresión óptima del gen estructural unido, es decir incluyen una secuencia líder de consenso de preferencia que aumenta o mantiene la estabilidad del ARNm y evita la iniciación de la traducción inadecuada. Los expertos en la técnica sabrán cómo elegir tales secuencias a la luz de la presente descripción. Resultarán de mayor preferencia las secuencias de genes que se expresan de manera muy importante en plantas, y en particular en el maíz. Un líder particularmente útil es el líder de HSP70 de la petunia.

Para aumentar la expresión podrán usarse potenciadores de la transcripción o duplicaciones de los potenciadores. Estos potenciadores se encuentran a menudo en posición 5’ al comienzo de la transcripción en un promotor que funciona en células eucariotas, pero a menudo pueden insertarse en orientación 5’ o 3’ directa o inversa a la secuencia codificadora. Los ejemplos de potenciadores incluyen elementos del promotor de CaMV 35S, genes de la octopina sintasa (Ellis y col., EMBO Journal 6: 11-16, 1987), el gen de actina del arroz, y el promotor de eucariotas no vegetales (por ejemplo, levaduras; Ma y col., Nature 334:631 -633, 1988).

La ARN polimerasa transcribe una secuencia codificadora de ADN del genoma nuclear a través de un sitio en donde tiene lugar la poliadenilación. Típicamente, las secuencias de ADN localizadas pocos cientos de pares de bases secuencia abajo del sitio de poliadenilación sirven para terminar la transcripción. Tales secuencias de ADN se denominan en el presente documento regiones de terminación de la transcripción. Dichas regiones son necesarias para la poliadenilación eficaz del ARN mensajero (ARNm) nuclear transcripto. Para las secuencias codificadoras introducidas en un cloroplasto o un plastidio, o en un genoma de cloroplasto o plastidio, la terminación de la transcripción del ARNm es similar a los procedimientos bien conocidos en la técnica de expresión de genes bacterianos. Por ejemplo, ya sea en una secuencia policistrónica o monocistrónica, la transcripción puede terminarse por estructuras de horquilla o estructuras similares a las secuencias bacterianas dependientes de rho.

5 Las construcciones de expresión incluirán típicamente una secuencia codificadora de ejemplo en la presente invención o uno de sus derivados junto con una secuencia de ADN del extremo 3’ que funcione como señal para terminar la transcripción y, en construcciones destinadas a la expresión a partir del genoma nuclear de la planta, permitiendo la poliadenilación del extremo 3’ de la transcripción del ARN resultante. Se

10 considera que los elementos 3’ de más preferencia son los del gen de la nopalina sintasa de A. tumefaciens (extremo 3’ de nos), el terminador para el transcripto T7 del gen de la octopina sintasa de A. tumefaciens y la secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción 3’ no traducida del gen E9 de RUBISCO sintasa del guisante (3’ de E9). Estas y otras secuencias reguladoras del extremo 3’ son muy conocidas en la técnica.

15 Los vectores de transformación de plantas de preferencia incluyen los derivados de un plásmido Ti de agrobacterium tumefaciens, así como los dados a conocer, por ejemplo, por Herrera-Estrella (Nature 303:209 -213, 1983), Bevan (Nature 304: 184-187,1983), Klee (Bio/Technol. 3:637 -642, 1985).

20 La presente invención da a conocer secuencias de nucleótidos aisladas y purificadas que codifican proteínas insecticidas derivadas de especies de Bacillus, y en particular de la especie Bacillus thuringiensis. En el presente documento se muestra que, en particular, las cepas EG5438, EG3879, EG4332, EG4971, EG4090, EG4293, EG4611, EG5526,

25 EG5023 y EG4092 de B. thuringiensis producen una o más proteínas insecticidas solubles que se localizan en los sobrenadantes de los cultivos (véase Tabla 1).

Tabla 1. Proteínas relacionadas con TIC900 y cepas fuente de B. thuringiensis

Cepa fuente de Bt

Proteína relacionada con TIC900

EG3879, EG5526

TIC402, (TIC964)*

EG4332

TIC403

EG4971

TIC404

EG4611

TIC434

(continuación)

Cepa fuente de Bt

Proteína relacionada con TIC900

EG4090

TIC961

EG4293

TIC962

EG4611

TIC963

EG5438#

TIC900

EG5023

TIC965

EG4092

TIC966

* la secuencia de aminoácidos de TIC964, obtenida de la cepa EG5526, se dedujo tras el análisis de la secuencia de nucleótidos de un gen que muestra homología con tic900, y se determinó que era idéntica a tic402 obtenida de la cepa EG3879. # significa que esta cepa se ha depositado bajo los términos que garantizan el acceso al cultivo a las partes autorizadas durante la duración de la presente solicitud de patente o de las patentes presentadas a partir de la misma.

Las cepas de B. thuringiensis y otras cepas bacterianas que se describen en el presente documento pueden cultivarse usando medios de cultivo convencional y técnicas de

5 fermentación convencionales. Las cepas de B. thuringiensis que llevan uno o más genes tic900 o genes relacionados pueden fermentarse como se describe en el presente documento hasta que las células de B. thuringiensis cultivadas alcanzan el estadio de su ciclo de crecimiento en el que se produce TIC900 y/o las proteínas relacionadas.

10 Los cultivos sujeto se han depositado bajo los términos que garantizan que el acceso al cultivo estará disponible para las partes autorizadas durante la duración de la presente solicitud de patente o de las patentes presentadas. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica la presente invención en derogación de los derechos de patente concedida por acción

15 gubernamental.

La proteína TIC900 y las proteínas relacionadas de la presente invención se producen como se muestra en el presente documento y se secretan en el medio de cultivo durante la fase de crecimiento vegetativa. Las fermentaciones usando las cepas de la presente 20 invención pueden continuarse a través del estadio de esporulación cuando se forman proteínas cristalinas, si se forman, junto con las esporas. Las esporas y los residuos

celulares pueden separarse del sobrenadante por centrifugación, y el medio de cultivo agotado puede usarse para aislar las proteínas insecticidas de la presente invención. Los inventores ilustran en el presente documento el procedimiento de precipitación con sulfato de amonio como un medio para concentrar y recoger todas o casi todas las proteínas presentes en el medio de cultivo agotado y clarificado. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que existen muchos otros medios disponibles para purificar y aislar las proteínas de la presente invención. La filtración en gel y de cromatografía de exclusión por tamaños son dos medios fácilmente disponibles para extraer proteínas directamente del medio agotado. El medio agotado también puede desalarse y el filtrado puede usarse para extraer la proteína usando columnas de intercambio iónico. También, pueden usarse columnas de afinidad que contienen anticuerpos que unen específicamente a la proteína TIC900 o a las proteínas relacionadas para purificar las proteínas de la presente invención directamente del medio.

Las secuencias de aminoácidos de la presente invención se han comparado con las secuencias de aminoácidos presentes en bases de datos de secuencias de proteínas disponibles en el comercio, y no se han identificado homologías o similitudes significativas. Basándose en este análisis, la proteína TIC900 y las secuencias relacionadas parecen ser únicas y forman la base para el establecimiento de una clase nueva y separada de proteínas insecticidas de Bacillus, porque las proteínas de la presente invención no muestran ninguna relación con otras proteínas insecticidas conocidas.

Pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de los péptidos de la presente invención y en los segmentos de ADN que los codifican y aún obtener una molécula funcional que codifica una proteína o péptido con las características deseadas. Los péptidos, polipéptidos y proteínas equivalentes funcionales desde el punto de vista biológico considerados en el presente documento deben tener desde aproximadamente 70% o más de similitud de secuencia, o desde aproximadamente 80% o más de similitud de secuencia, o desde aproximadamente 90% o más de similitud de secuencia, con la secuencia de, o el resto correspondiente dentro de, la secuencia de aminoácidos fundamental de TIC900 según se presenta en ID. SEC. Nº 4, o el resto correspondiente dentro de las secuencias de aminoácidos según se presentan en ID. SEC. Nº 6, ID. SEC. Nº 8, ID. SEC. Nº 10, ID. SEC. Nº 30, ID. SEC. Nº 12, ID. SEC. Nº 14, ID. SEC. Nº 16, ID. SEC. Nº 18 e ID. SEC. Nº 20 y secuencias relacionadas.

Según la presente invención, la referencia al gen tic900 y a la proteína toxina codificada, incluye no sólo las secuencias de longitud total dadas a conocer en el presente documento sino también fragmentos de estas secuencias, variantes naturales, mutantes, y derivados recombinantes o genéticamente modificados del gen tic900 que comprende ID. SEC. Nº 3. Tales proteínas codificadas retendrán esencialmente la mismas o mayores propiedades características insecticidas que las de la proteína TIC900 que comprende ID. SEC. Nº 4. Las proteínas útiles en la presente invención pueden también incluir proteínas de fusión que retienen las propiedades características insecticidas esencialmente iguales

o mayores que las de la proteína TIC900. En algunos casos, la proteína de fusión puede contener, además de las propiedades características insecticidas de las proteínas específicamente ejemplificadas en el presente documento, otra actividad insecticida contribuida por la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión. Como alternativa, el análisis cristalográfico de la proteína TIC900 o sus variantes insecticidas puede proporcionar un medio para determinar si la proteína podrá ser un candidato para la construcción de una permuteína que muestre la misma o de preferencia mayor actividad insecticida que la proteína TIC900 nativa o las proteínas relacionadas, y que de preferencia muestre características mejoradas relacionadas con la expresión en una célula huésped de preferencia tal como una célula vegetal.

Resultará evidente para un experto en la técnica que las secuencias de nucleótidos que codifican toxinas inhibidoras de lepidópteros pueden identificarse y obtenerse a través de varios medios. Las secuencias específicas de ejemplo en el presente documento pueden obtenerse a partir de aislamientos depositados en un depósito de cultivos según se describió anteriormente. Estas secuencias, o sus porciones o variantes, pueden también construirse sintéticamente, por ejemplo, por medio del uso de un sintetizador de secuencias de nucleótidos. Las variaciones de las secuencias codificadoras pueden construirse fácilmente usando técnicas convencionales para realizar mutaciones puntuales. También, pueden elaborarse fragmentos de estas secuencias usando exonucleasas o endonucleasas disponibles en el comercio según procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden usarse enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio para escindir sistemáticamente nucleótidos de los extremos de tales secuencias como se ejemplifica en el presente documento o del interior de la secuencia codificadora de la proteína. También, puede obtenerse secuencias de nucleótidos que codifican fragmentos activos de la proteína insecticida usando una diversidad de enzimas de restricción, endonucleasas, procedimientos de amplificación térmica, y similares.

Pueden usarse proteasas tales como la proteinasa K, la tripsina, la quimotripsina, la pepsina, y similares para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas.

Otras toxinas y secuencias de nucleótidos que codifican tales toxinas relacionadas con las toxinas y las secuencias codificadoras de la presente invención pueden obtenerse a partir de ADN derivado de aislamientos de las especies B. thuringiensis, B. laterosporous,

B. sphaericus, y especies de Bacillus relacionadas usando las enseñanzas proporcionadas en la técnica en combinación con las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en el presente documento. Tales toxinas y secuencias de nucleótidos que están relacionadas con las toxinas y las secuencias codificadoras de la presente invención se consideran en el presente documento equivalentes a las toxinas y las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Por “equivalente” se entiende que una proteína muestra las características de la proteína TIC900, incluidas pero no limitadas a similar bioactividad inhibidora insecticida, variedad de huéspedes de bioactividad insecticida, muestra similares epítopos antigénicos que reaccionan de manera cruzada con los anticuerpos surgidos contra la proteína TIC900 y las proteínas relacionadas, muestra un tamaño similar en relación a la proteína TIC900 y las proteínas relacionadas, muestra similares perfiles de expresión y características, muestra una propensión por el aislamiento hacia el entorno extracelular cuando se expresa en Bacillus thuringiensis o en especies bacterianas relacionadas, y similares. La frase “muestra una propensión por el aislamiento hacia el entorno extracelular” pretende incluir la proteína TIC900 y las proteínas relacionadas que incluyen, pero no se limitan a, TIC402, TIC403, TIC404, TIC434, TIC961, TIC962, TIC963, TIC965 y TIC966 que son producidas por la bacteria o la célula huésped como una proteína precursora que contiene una secuencia de aminoácidos unida a la proteína insecticida que funciona para dirigir la proteína insecticida hacia un aparato secretor bacteriano o de la célula huésped y que, tras entrar en contacto con el aparato secretor, sufre una escisión proteolítica por una peptidasa señal, liberando la proteína madura o insecticida al entorno extracelular en el caso de un microbio gram positivo, al menos en el periplasma en el caso de un microbio gram negativo, y en el retículo endoplásmico o la vesícula secretora o en un orgánulo subcelular tal como una mitocondria o un cloroplasto o plastidio en el caso de una célula fúngica o vegetal o de otra célula huésped eucariótica.

Existe una serie de procedimientos para identificar la presencia y para obtener toxinas insecticidas equivalentes relacionadas con los péptidos dados a conocer en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos para las toxinas insecticidas dadas a conocer y reivindicadas en el presente documento para identificar y aislar otras toxinas de una mezcla de proteínas. Específicamente, pueden generarse anticuerpos contra las porciones de las toxinas que son más constantes dentro de una nueva clase de proteínas y más diferentes de otras toxinas de B. thuringiensis. Estos anticuerpos pueden utilizarse a continuación para identificar específicamente toxinas equivalentes con la actividad característica por inmunoprecipitación, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o transferencia Western. Los anticuerpos contra las toxinas dadas a conocer en el presente documento, o contra toxinas equivalentes, o fragmentos de estas toxinas, pueden prepararse fácilmente usando procedimientos convencionales en la técnica. Las secuencias de nucleótidos que codifican estas toxinas pueden obtenerse a continuación de los microorganismos u otras fuentes diversas.

Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad insecticida de las toxinas de ejemplo estarán dentro del alcance de la presente invención. También, debido a la redundancia del código genético, una diversidad de secuencias de ADN diferentes pueden codificar las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en el presente documento. La creación de estas secuencias alternativas de ADN que codifican las mismas, o esencialmente las mismas, toxinas está dentro del conocimiento habitual de un experto en la técnica. Estas secuencias de ADN variantes están dentro del alcance de la presente invención.

Es bien sabido en la técnica que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en la estructura de una proteína sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de anticuerpos de unión a antígenos o sitios de unión en moléculas sustrato. Puesto que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína son las que definen la actividad biológica funcional de la proteína, pueden realizarse ciertas sustituciones en las secuencias de aminoácidos en una secuencia de proteína, y, por supuesto, en su secuencia de ADN codificadora subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. Por consiguiente los inventores consideran que pueden realizarse diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones dadas a conocer en el presente documento, o en las secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Tales sustituciones son conocidas también en la técnica como sustituciones conservadoras.

Al realizar tales cambios debe considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva en una proteína se conoce por lo general en la técnica (Kyte and Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.

Se sabe también en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente en base a la hidrofilia. La mayor hidrofilia promedio local de una proteína, regulada por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, correlaciona con una propiedad biológica de la proteína (Patente de EEUU Nº 4.554.101).

Como se resumió anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan por lo general en la similitud relativa de los sustituyentes cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones de ejemplo que tienen en cuenta las diversas características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Los péptidos, polipéptidos, y proteínas biológicamente y funcionalmente equivalentes a TIC900, TIC402, TIC403, TIC404, TIC434, TIC961, TIC962, TIC963, TIC965 y TIC966 incluyen las secuencias de aminoácidos que contienen cambios conservadores de aminoácidos en la secuencia fundamental mostrada en ID. SEC. Nº 4, ID. SEC. Nº 6, ID. SEC. Nº 8, ID. SEC. Nº 10, ID. SEC. Nº 30, ID. SEC. Nº 12, ID. SEC. Nº 14, ID. SEC. Nº 16, ID. SEC. Nº 18 e ID. SEC. Nº 20. En tales secuencias de aminoácidos, uno o más aminoácidos de la secuencia fundamental está (n) sustituidos con otro(s) aminoácido (s), cuya carga y polaridad es similar a la del aminoácido nativo, es decir una sustitución conservadora de aminoácidos, que da lugar a un cambio silencioso.

Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia fundamental del polipéptido pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido que se presenta en la naturaleza. Los aminoácidos pueden separarse en los siguientes cuatro grupos: (1) aminoácidos ácidos; (2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos polares neutros; y (4) aminoácidos no polares neutros. Los aminoácidos representativos dentro de estos diferentes grupos incluyen, pero no se limitan a: (1) aminoácidos ácidos (cargados negativamente) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (cargados positivamente) tales como arginina, histidina y lisina; (3) aminoácidos polares neutros tales como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina y glutamina; (4) aminoácidos no polares neutros (hidrófobos) tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina.

Pueden realizarse cambios conservadores de aminoácidos dentro de las secuencias fundamentales del polipéptido de la presente invención sustituyendo un aminoácido dentro de uno de estos grupos con otro aminoácido dentro del mismo grupo. Los equivalentes de TIC900 biológicamente funcionales y las secuencias relacionadas pueden tener 10 o menos cambios conservadores de aminoácidos, de más preferencia siete o menos cambios conservadores de aminoácidos, y de mayor preferencia cinco o menos cambios conservadores de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos codificadora (gen, ADN plasmídico, ADNc, o ADN sintético) tendrá por consiguiente las sustituciones de bases correspondientes, que le permitan codificar las formas de TIC900 equivalentes biológicamente funcionales.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de TIC900 y las secuencias relacionadas puede elaborarse por medio de procedimientos bien conocidos en la técnica.

Otro procedimiento para identificar las toxinas y los genes de la presente invención es a través del uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son esencialmente secuencias de nucleótidos que hibridan bajo condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia codificadora de TIC900 o una secuencia relacionada con una secuencia codificadora de TIC900. Como es bien sabido en la técnica, si una molécula sonda y una molécula secuencia de ácido nucleico en una muestra hibridan formando un enlace suficientemente fuerte entre las dos moléculas, puede asumirse razonablemente que las dos moléculas muestran homología sustancial. La unión de la sonda se detecta usando una serie de medios conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, fluorescencia, luminiscencia, isotópica, inmunológicos, espectroscopía de resonancia del plasmón de superficie, y similares. Tal análisis de sondas proporciona un procedimiento rápido para identificar genes que codifican toxinas de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos que se usan como sondas según la invención pueden sintetizarse usando sintetizadores de ADN, usando procedimientos convencionales o por otros medios conocidos en la técnica. Estas secuencias de nucleótidos pueden también usarse como cebadores de PCR para amplificar las secuencias de nucleótidos de la presente invención o sus porciones.

La secuencia tic900 y las secuencias codificadoras de nucleótidos relacionadas según se presentan en el presente documento en ID. SEC. Nº 3, ID. SEC. Nº 5, ID. SEC. Nº 7, ID. SEC. Nº 9, ID. SEC. Nº 29, ID. SEC. Nº 11, ID. SEC. Nº 13, ID. SEC. Nº 15, ID. SEC. Nº 17 e ID. SEC. Nº 19 pueden usarse como sondas de hibridación para identificar y aislar variantes naturales de la secuencia tic900 y las secuencias codificadoras de nucleótidos relacionadas de otras cepas de B. thuringiensis o de otros microorganismos. La presente invención abarca secuencias de nucleótidos de microorganismos, donde las secuencias de nucleótidos pueden aislarse por hibridación con toda, o parte de, la secuencia de nucleótidos de Bacillus de la invención. Pueden realizarse pruebas para la actividad insecticida en las proteínas codificadas por tales secuencias de nucleótidos. La invención también abarca las proteínas codificadas por las secuencias de nucleótidos.

Pueden producirse anticuerpos contra la proteína TIC900 o proteínas relacionadas de la presente invención usando técnicas inmunológicas convencionales para la producción de antisueros policlonales y, si se desea, inmortalizando las células productoras de anticuerpos del huésped inmunizado para utilizarlas como fuente de producción de anticuerpos monoclonales. Las técnicas para producir anticuerpos contra cualquier sustancia de interés son bien conocidas, por ejemplo, según se describe en Harlow and Lane (1988) y en Goding (1986). Los anticuerpos anti TIC900 pueden utilizarse como sondas para identificar cepas de B. thuringiensis u otros microorganismos que producen variantes de la proteína TIC900 o proteínas relacionadas que están codificadas por variaciones de un gen tic900 o un gen relacionado. La presente invención abarca proteínas obtenidas de organismos en las que las proteínas obtenidas reaccionan de manera cruzada con anticuerpos surgidos contra una o más de las proteínas de la presente invención.

Los anticuerpos producidos en la presente invención son también útiles en inmunoensayos para determinar la presencia o cantidad de una proteína TIC900 o proteína relacionada. Tales ensayos también son útiles en la producción de calidad controlada de composiciones que contienen la proteína TIC900 o proteínas relacionadas de la presente invención. Además, los anticuerpos pueden usarse para evaluar la eficacia de la producción recombinante de una proteína TIC900 o proteína relacionada, así como para el cribado de bibliotecas de expresión para buscar la presencia de TIC900 o de secuencias codificadoras de proteínas relacionadas. Los anticuerpos son útiles también como ligandos de afinidad para purificar y/o aislar la proteína TIC900 y proteínas relacionadas. Los epítopos antigénicos de TIC900 y relacionados pueden obtenerse sobreexpresando una secuencia, de longitud completa o parcial que codifica toda o una parte de la proteína TIC900 o proteína relacionada en una célula huésped de preferencia.

Los péptidos de la presente invención están destinados principalmente, aunque no exclusivamente, al uso en plantas, y en determinadas formas de realización de preferencia, las secuencias de nucleótidos modificadas para codificar las proteínas de la presente invención en plantas están contenidas en uno o más vectores plasmídicos. Tales vectores pueden contener una diversidad de elementos reguladores y otros elementos destinados a permitir la expresión óptima de las proteínas de la presente invención en células vegetales. Estos elementos adicionales pueden incluir promotores, terminadores e intrones según se resumió anteriormente. Cualquier vector que contenga la construcción de ADN y cualquier elemento regulador u otro elemento puede seleccionarse del grupo constituido por un cromosoma artificial de la levadura, un cromosoma artificial bacteriano, un plásmido, o un cósmido, y similares. Además, los vectores de expresión en sí mismos pueden ser de una diversidad de formas. Estas formas pueden diferir por diversas razones, y probablemente comprenderán componentes variables según estén destinados a transformar una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea.

Otros vectores previstos dentro del alcance de la presente invención incluyen los vectores capaces de contener un tic900 o composiciones de ácidos nucleicos relacionadas dadas a conocer anteriormente, así como cualquier otra construcción de ADN que comprenda además regiones codificadoras que pueden expresarse en plantas para otras proteínas insecticidas derivadas de especies de Bacillus.

La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína insecticida TIC900 (ID. SEC. Nº 4) o que codifica una secuencia de polipéptidos relacionada tal como TIC402 (ID. SEC. Nº 6), TIC403 (ID. SEC. Nº 8), TIC404 (ID. SEC. Nº 10), TIC434 (ID. SEC. Nº 30), TIC961 (ID. SEC. Nº 12), TIC962 (ID. SEC. Nº 14), TIC963 (ID. SEC. Nº 16), TIC965 (ID. SEC. Nº 18) y TIC966 (ID. SEC. Nº 20) pueden introducirse en una diversidad de microorganismos huésped sin demasiada experimentación, usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica de transformar huéspedes adecuados bajo condiciones que permitan el mantenimiento estable y la expresión de los genes clonados (Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Edición, Cold Spring Habor Press, Nueva York). Los huéspedes adecuados que permiten la expresión de la proteína TIC900 (ID. SEC. Nº 4) y secuencias relacionadas incluyen B. thuringiensis y otras especies de Bacillus tales como Bacillus subtilis o Bacillus megaterium. Los microorganismos genéticamente alterados o manipulados que contienen el gen tic900 (ID. SEC. Nº 3) pueden también contener secuencias de nucleótidos que codifican otras proteínas toxinas presentes en el mismo microorganismo; estas secuencias codificadoras podrán producir de manera simultánea proteínas insecticidas diferentes de la proteína TIC900 o proteínas relacionadas. En particular, resultaría de preferencia producir dos o más proteínas insecticidas diferentes en una célula huésped, en la que cada proteína sea tóxica para la misma especie de insecto y cada proteína muestre un modo de acción diferente de la(s) otra(s).

Pueden usarse también microorganismos colonizadores de plantas o colonizadores de tallos como células huésped para la producción de una proteína TIC900 o proteína relacionada. Los microorganismo huésped de ejemplo para los genes de toxinas de B. thuringiensis incluyen el microbio colonizador de plantas Clavibacter xyli según está descrito por Turner y col. (1993; Endophytes: An alternative genome for crop improvement; International crop science I. International Crop Science Congress, Ames, Iowa, EEUU, 14 al 22 de julio de 1992, páginas 555-560).

Las secuencias de nucleótidos que codifican toxinas que pueden obtenerse a partir de los aislamientos de la presente invención pueden introducirse en una amplia diversidad de microbios o huéspedes vegetales. La expresión del gen de la toxina da como resultado, directa o indirectamente, la producción y el mantenimiento intracelular del plaguicida. Con huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden aplicarse al sitio de la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos por la plaga. El resultado es un control de la plaga. Como alternativa, el microbio que alberga el gen de la toxina puede tratarse bajo condiciones que prolonguen la actividad de la toxina y estabilicen la célula. La célula tratada que retiene la actividad tóxica, puede a continuación aplicarse al entorno de la plaga de diana.

Cuando el gen de la toxina tic900 o una secuencia de nucleótidos codificadora relacionada se introduce por medio de un vector adecuado en un huésped microbiano, y el huésped se aplica al entorno en estado vivo, resulta ventajoso usar determinados microbios huésped. Por ejemplo, pueden seleccionarse microorganismo huésped que se sabe que ocupan el hábitat de la plaga. Los microorganismos huésped pueden también vivir de manera simbiótica con una especie de plaga específica. Estos microorganismos se seleccionan para que sean capaces de competir con éxito en el entorno particular con los microorganismos de tipo natural, proporcionen estable mantenimiento y expresión del gen que expresa el polipéptido plaguicida, y, de manera deseable proporcionen mayor protección del plaguicida frente a la degradación e inactivación ambiental.

Se conoce una gran cantidad de microorganismos que habitan en el hábitat de las plagas. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. Resultan de particular interés los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, los géneros Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes, hongos, por ejemplo, los géneros Metarhizium, Bavaria, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium.

Están disponibles una gran diversidad de medios para introducir un gen de toxina que codifica una toxina en un microorganismo huésped bajo condiciones que permitan el mantenimiento y la expresión estables del gen. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica y están descritos, por ejemplo, en la Patente de EEUU Nº

5.135.867.

Como se mencionó anteriormente, B. thuringiensis o las células recombinantes que expresan una proteína TIC900 o toxina relacionada pueden tratarse para prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La microcápsula del plaguicida que se forma comprende una o más proteínas TIC900 o toxinas relacionadas dentro de una estructura celular que se ha estabilizado y que protegerá a la toxina o toxinas cuando la microcápsula sea aplicada al entorno de la plaga diana. Las células huésped adecuadas pueden incluir procariotas o eucariotas, estando normalmente limitadas a aquellas células que no producen sustancias tóxicas para los organismos superiores, tales como los mamíferos. No obstante, podrán usarse organismos que producen sustancias tóxicas para los organismos superiores, cuando las sustancias tóxicas sean inestables o el nivel de aplicación sea suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un huésped mamífero. Serán de particular interés como huéspedes las células procariotas así como las eucariotas inferiores, tales como los hongos. Las células de estos organismos estarán usualmente intactas y estarán sustancialmente en la forma proliferativa cuando se traten, más que en una forma de espora, aunque algunas veces pueden utilizarse esporas. Tales microcápsulas pueden también contener una o más proteínas TIC900 o proteínas relacionadas junto con una o más composiciones de proteínas insecticidas no relacionadas incluidas pero no limitadas a las delta endotoxinas insecticidas para las especies de lepidópteros tales como las proteínas Cry1, Cry2 y Cry9, así como las delta endotoxinas insecticidas para las especies de coleópteros tales como las proteínas Cry3, Cry22, ET70, ET80/76, ET33/34, PS149B1, ET100/101 y ET29 y similares.

Las células tendrán por lo general estabilidad estructural mejorada que mejorará la resistencia frente a las condiciones ambientales. Cuando el plaguicida está en una proforma o forma precursora, el procedimiento de tratamiento de la célula debe seleccionarse para que no se vea inhibido el procesamiento de la proforma a la forma madura del plaguicida por el patógeno de la plaga diana. Por ejemplo, el formaldehido entrecruzará las proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un polipéptido plaguicida. El procedimiento de tratamiento de la célula retiene al menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina.

Las secuencias codificadoras de TIC900 y secuencias relacionadas según se presentan en ID. SEC. Nº 3, ID. SEC. Nº 5, ID. SEC. Nº 7, ID. SEC. Nº 9, ID. SEC. Nº 29, ID. SEC. Nº 11, ID. SEC. Nº 13, ID. SEC. Nº 15, ID. SEC. Nº 17 e ID. SEC. Nº 19 y similares pueden usarse como base para construir secuencias de nucleótidos modificadas para incorporar en células vegetales. Resulta aún de más preferencia la síntesis de una secuencia de nucleótidos que no se presenta en la naturaleza que codifica una proteína TIC900 o proteína insecticida relacionada o su equivalente para la expresión en una célula vegetal, estando la síntesis de la secuencia de nucleótidos que no se presenta en la naturaleza basada en la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa sin referencia a la secuencia de nucleótidos nativa de la que se ha deducido la secuencia de aminoácidos nativa. La expresión de tales secuencias en células vegetales dará una planta que comprende tales células más resistentes al ataque de los insectos de las especies de lepidópteros. La manipulación genética de plantas con secuencias modificadas que codifican una o más proteínas TIC900 o proteínas relacionadas o una secuencia de aminoácidos insecticida relacionada puede llevarse a cabo introduciendo el ADN deseado que contiene la secuencia codificadora en los tejidos o células vegetales, usando moléculas de ADN de una diversidad de formas y orígenes que son muy conocido por los expertos en manipulación genética de plantas. Los procedimientos para introducir secuencias de nucleótidos en las plantas, células vegetales y tejidos vegetales son muy conocidos en la técnica.

El ADN que contiene un gen modificado que codifica la proteína TIC900 o una proteína insecticida relacionada, operativamente unido a un promotor funcional de la planta, puede administrarse a las células o tejidos vegetales directamente por una serie de medios que incluyen pero no se limitan a la transformación mediada por Agrobacterium, virus de plantas, electroporación, microinyección, infiltración en vacío, medios de fusión de liposomas, y procedimientos balísticos. El promotor de la planta puede ser un promotor constitutivo; un promotor inducible temporalmente, espacialmente, químicamente, fotosintéticamente, térmicamente o artificialmente; un promotor específico de tejido; o un promotor quimérico o híbrido organizado a partir de partes de otros promotores funcionales de plantas. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S o un derivado funcional vegetal del mismo.

Los genes bacterianos y las secuencias codificadoras nativos a menudo no se expresan bien en las células de plantas transgénicas. El uso de codones de plantas se asemeja más al de otros organismos superiores más que a los organismos unicelulares, tales como las bacterias. Varios informes han dado a conocer procedimientos para mejorar la expresión de genes recombinantes en plantas (Murray y col., 1989, Nucleic Acids Research, Vol.17: 477-498; Diehn y col., 1998 (b), Plant Physiology, 117: 1433-1443; Rocher y col., 1998, Plant Phys. 117:1445 -1461). Estos informes dan a conocer diversos procedimientos para diseñar secuencias codificadoras que representen secuencias que se traducen de manera más eficaz basándose en tablas de frecuencias de codones en plantas, mejoras en la tendencia de la posición de la tercera base de los codones, usando secuencias recombinantes que evitan poliadenilación sospechada o dominios ricos en A/T o secuencias de consenso de empalme de intrones. Aunque estos procedimientos para la construcción de genes sintéticos son notables, los genes sintéticos de la presente invención para expresión en plantas concretas se preparan sustancialmente según el procedimiento de Brown y col. (Patente de EEUU Nº 5.689.052).

El trabajo descrito en el presente documento aprovecha los procedimientos para potenciar la expresión in planta de la proteína TIC900 y proteínas insecticidas relacionadas, que confieren resistencia a los insectos lepidópteros patógenos, por medio de la incorporación o localización de secuencias codificadoras en el genoma nuclear, de plastidios, o cloroplastos de las plantas susceptibles. La Patente de EEUU Nº 5.500.365 y patentes relacionadas describen procedimientos para sintetizar genes de plantas para alcanzar niveles de expresión óptimos de la proteína codificada por el gen sintetizado, que no se presenta en la naturaleza, sintético o artificial. Estos procedimientos se refieren a la modificación de las secuencias genéticas estructurales nativas de Bt para producir una secuencia codificadora que sea más “de tipo vegetal” y por consiguiente que tenga más probabilidad de ser traducida y expresada por la planta, monocotiledónea o dicotiledónea. Sin embargo, el procedimiento según se da a conocer en Brown y col. (Patente de EEUU Nº 5.689.052) proporciona expresión aumentada de transgenes, de preferencia en plantas monocotiledóneas.

Por consiguiente, puede aumentarse la cantidad de un gen que codifica un polipéptido de interés, por ejemplo, una proteína TIC900 o un polipéptido relacionado, en plantas transformando esas plantas utilizando los procedimientos de transformación mencionados anteriormente. En particular, la transformación de cloroplastos o plastidios puede dar lugar a la presencia de las secuencias codificadoras deseadas en cantidades de hasta aproximadamente 10.000 copias por célula en tejidos que contienen estas estructuras de orgánulos subcelulares (McBride y col., documento WO 95/24492).

El ADN que codifica la proteína TIC900 y proteínas relacionadas puede también introducirse en las plantas utilizando un procedimiento de transferencia directa de ADN en el polen, como está descrito (Zhou y col., 1983, Mol. Cell Biol., 10: 4529-4537; Hess, 1987, Hess, Inter Rev Cytol., 107: 367). La expresión de las secuencias codificadoras de polipéptidos, es decir, tic900 y similares, puede obtenerse por inyección del ADN en los órganos reproductores de una planta, como está descrito (Pena y col., 1987, Nature, 325: 274). El ADN también puede inyectarse directamente en las células de embriones inmaduros y en embriones desecados rehidratados, como está descrito (Neuhaus y col., 1987, Theor. Appl. Genet., 75: 30).

Tras realizar la administración de las secuencias de nucleótidos exógenas que codifican la proteína TIC900 o proteínas relacionadas a las células receptoras, la siguiente etapa para obtener una planta transgénica por lo general se refiere a la identificación de las células transformadas para el posterior cultivo y regeneración de la planta, es decir, la selección de las células transformadas. Según se menciona en el presente documento, para mejorar la capacidad para identificar transformantes, puede ser deseable utilizar un gen de un marcador seleccionable o cribable, además del gen expresable de interés. En este caso, por lo general se ensayará a continuación la población celular potencialmente transformada exponiendo las células a un agente o agentes selectivos, o se seleccionarán las células según el rasgo genético deseado del marcador.

Una forma de realización de ejemplo de los procedimientos para identificar células transformadas implica exponer los cultivos transformados a un agente selectivo, tal como un inhibidor metabólico, un antibiótico, un herbicida o similares. Las células que han sido transformadas y que tienen un gen marcador integrado de manera estable que confiere resistencia al agente selectivo utilizado, crecerán y se dividirán en el cultivo. Las células sensibles no serán susceptibles para otro cultivo. Un ejemplo de un gen marcador de preferencia confiere resistencia al herbicida glifosato. Cuando se usa este gen como marcador seleccionable, el cultivo celular supuestamente transformado se trata con glifosato. Tras la exposición al glifosato, las células transgénicas que contienen una enzima GOX recombinante o una enzima EPSPS recombinante insensible al glifosato estarán disponibles para otro cultivo mientras que las células no transformadas, sensibles, no lo estarán (Patente de EEUU Nº 5.569.834). Otro ejemplo de un sistema marcador seleccionable de preferencia es el sistema de resistencia a la neomicina fosfotransferasa (nptII) por el que se confiere resistencia al antibiótico kanamicina, como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.569.834. Una vez más, tras la transformación con este sistema, las células transformadas estarán disponibles para otro cultivo tras el tratamiento con kanamicina, mientras que las células no transformadas no lo estarán. Aún otro sistema de marcador seleccionable de preferencia implica el uso de una construcción genética que confiere resistencia a la paromomicina. El uso de este tipo de sistema marcador seleccionable está descrito en la Patente de EEUU Nº 5.424.412. Otros marcadores seleccionables son muy conocidos en la técnica, incluidos pero no limitados a los marcadores de resistencia a antibióticos tales como nptII, tet, aad,y similares, phnO y otras varias acetilasas (Patente de EEUU Nº 6.448.476), diversas esterasas (Patente de EEUU Nº 6.107.549), barnasa (Hartley, (1988), J. Mol. Biol. 202: 913), enzimas bacterianas que confieren actividad de glifosato oxidasa sobre la célula transformada (gox) (Barry y col., 1992, Inhibitors of amino acid biosynthesis: Strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants. En: Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants. páginas 139-145. Singh, Flores, and Shannon Eds., American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md.) y similares.

La selección transplastonómica (selección de eventos de transformación de plastidios o cloroplastos) se simplifica aprovechando la sensibilidad de los cloroplastos o plastidios a la espectinomicina, como inhibidor de la síntesis de proteínas de plastidios o cloroplastos, pero no de la síntesis de proteínas por los ribosomas citoplásmicos codificadas por el genoma nuclear. La espectinomicina impide la acumulación de proteínas de cloroplastos necesarias para la fotosíntesis de modo que las células vegetales transformadas resistentes a la espectinomicina pueden distinguirse basándose en su diferencia de color: las células transformadas, resistentes, son verdes, mientras que las células sensibles, son blancas, debido a la inhibición de la síntesis de proteínas de los plastidios. La transformación de cloroplastos o plastidios con un gen aad bacteriano adecuado, o con un gen que codifica un ARN ribosómico funcional de plastidio o cloroplasto resistente a la espectinomicina proporciona un medio para la selección y el mantenimiento de los eventos transplastonómicos (Maliga, 1993, Trends in Biotechnology 11:101 -106).

También se contempla que las combinaciones de marcadores cribables y seleccionables puedan ser útiles para la identificación de células transformadas. En algunos tipos de células o tejidos, un agente de selección, tal como glifosato o kanamicina, puede no proporcionar suficiente actividad destructiva para reconocer claramente las células transformadas o puede causar inhibición sustancial no selectiva, de los transformantes y no transformantes igualmente, causando de este modo que la técnica de selección no sea eficaz. Se propone que la selección con un compuesto inhibidor del crecimiento, tal como glifosato o AMPA (ácido amino metil fosfórico) en concentraciones inferiores a las que causan el 100% de inhibición, seguida por el cribado de los tejidos en crecimiento por la expresión de un gen marcador cribable tal como kanamicina, podrá permitir recuperar los transformantes de los tipos de células o tejidos que no son susceptibles de selección solos. Se propone que las combinaciones de selección y cribado pueden permitir identificar los transformantes en una diversidad mayor de tipos de células y tejidos.

El desarrollo o la regeneración de plantas a partir de protoplastos únicos de plantas o

explantes diversos son bien conocidos en la técnica. Este proceso de regeneración y crecimiento incluye típicamente las etapas de selección de las células transformadas, cultivo de las células individualizadas a través de los estadios usuales de desarrollo embrionario a través del estadio de plántula enraizada. Los embriones transgénicos y las semillas se regeneran de manera similar. Los brotes transgénicos enraizados resultantes se plantan posteriormente en un medio de crecimiento vegetal adecuado tal como tierra.

El desarrollo o la regeneración de las plantas que contienen un gen extraño, exógeno que codifica una proteína TIC900 o un polipéptido relacionado introducido en el genoma de la planta por medio de transformación de explantes de hojas con Agrobacterium puede lograrse por medio de procedimientos muy conocidos en la técnica (Horsch y col., Science 227: 1229-1231; 1985). En este procedimiento, los transformantes se cultivan en en presencia de un agente de selección y en un medio que induce la regeneración de los brotes en una cepa de la planta transformada según está descrito (Fraley y col., PNAS, USA 80: 4803; 1983). En particular, la Patente de EEUU Nº 5.349.124 detalla la creación de células de lechuga transformadas genéticamente y las plantas resultantes de las mismas que expresan proteínas cristalinas híbridas que confiere a tales plantas actividad insecticida contra las larvas de lepidópteros.

De preferencia, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas, o el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas crecidas de semillas de importancia agronómica, de preferencia de líneas endogámicas. A la inversa, el polen de las plantas de esas líneas importantes se usa para polinizar las plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TIC900 deseada o un polipéptido relacionado se cultiva usando procedimientos muy conocidos por los expertos en la técnica.

Una planta transgénica de la presente invención tiene por consiguiente cantidad aumentada de una región codificadora que codifica una proteína TIC900 o un polipéptido relacionado. Una planta transgénica de preferencia es un segregante independiente y puede transmitir dicho gen y su actividad a su progenie. Una planta transgénica de más preferencia es homocigota para ese gen, y transmite ese gen a todos sus descendientes en la reproducción sexual. La semilla de una planta transgénica puede crecer en el campo o en invernadero, y las plantas transgénicas sexualmente maduras resultantes se autopolinizan para generar plantas de cultivo verdaderas. La progenie de estas plantas proviene de líneas de cultivo verdaderas que se evalúan para comprobar la expresión aumentada del transgén de B. thuringiensis. Para identificar una planta transgénica que expresa niveles elevados de una proteína TIC900 o proteína relacionada a partir de una secuencia de nucleótidos de preferencia, es necesario cribar los eventos transgénicos seleccionados, (generación R0) para la actividad insecticida y/o para la expresión del gen. Esto puede llevarse a cabo por diversos procedimientos muy conocidos por los expertos en la técnica, que incluyendo pero no se limitan a: 1) obtención de pequeñas muestras de tejido de la planta transgénica R0 y ensayo directo del tejido para comprobar la actividad contra insectos susceptibles, por ejemplo, el barrenador europeo del maíz (ECB), la oruga del tabaco (TBW) y la palomilla dorso de diamante (DBM), en paralelo con tejido derivado de una planta de control negativo que no expresa el gen; 2) análisis de los extractos de proteínas por ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) específicos para la proteína TIC900 o proteína relacionada; o 3) amplificación térmica con transcriptasa inversa (también conocida en la técnica como rtPCR) para identificar eventos de expresión de la secuencia codificadora de la proteína TIC900 o proteína relacionada.

Los siguientes ejemplos ilustran además las características de las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en el presente documento y la actividad insecticida de las proteínas codificadas por las secuencias de nucleótidos dadas a conocer. Además, se dan a conocer procedimientos y métodos para poner en práctica la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Preparación y bioensayo del sobrenadante de cultivo de la cepa EG5438 de

B. thuringiensis

La cepa EG5438 de B. thuringiensis se cultivó en 60 ml de medio de cultivo PYG con agitación durante la noche a 30 ºC. El medio PYG contenía lo siguiente: peptona 11,8 g, extracto de levadura 236 g, glicerol 4 ml, K2HPO4 anhidro 19,4 g y K2HPO4 anhidro 2,2 g. Se añadió agua desionizada hasta 1 litro, y el medio se esterilizó en autoclave durante 15 minutos. El cultivo de B. thuringiensis se centrifugó a 11.000xg durante 30 minutos y el sobrenadante se transfirió a un matraz limpio. El sobrenadante se enfrió hasta 4 ºC, y se añadieron lentamente 34 gramos de sulfato de amonio más 1 ml de NaOH 1 M al sobrenadante con agitación. La mezcla se centrifugó y el sedimento resultante se disolvió en 2 ml de Tris-HCl 20 mM pH 7,5. La disolución se transfirió al tubo de diálisis (6000 MWCO) y se dializó a 4 ºC contra el Tris-HCl 20 mM pH 7,5. A esta disolución se la denomina sobrenadante dializado.

Se probó la toxicidad del sobrenadante dializado para las larvas de la palomilla dorso de diamante (DBM) de la siguiente manera. Se aplicaron cincuenta µl del sobrenadante dializado tópicamente a 2 ml de la dieta del insecto en una cubeta. Se trataron en total treinta y dos cubetas de la dieta con el sobrenadante dializado. Como control se usaron sesenta y cuatro cubetas de la dieta sin tratar con el sobrenadante dializado. Se colocó una DBM en primer estadio larval en cada cubeta de la dieta y tras 7 días se le asignó una puntuación de mortalidad del insecto. Para las larvas en las dietas de control sin tratamiento, murió 1 larva de 64 (2%). Para las larvas en las dietas tratadas con el sobrenadante dializado murieron 29 de 32 (90%), lo que sugiere que el sobrenadante dializado de la cepa EG5438 contenía uno o más factores tóxicos para las larvas de DBM.

Ejemplo 2. Fraccionamiento de proteínas en el sobrenadante dializado y bioensayo de las fracciones proteicas

Las proteínas en el sobrenadante dializado se fraccionaron inicialmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Se mezclaron treinta µl del sobrenadante dializado con 15 µl de tampón de solubilización de proteína, la mezcla se calentó a 100 ºC durante 5 minutos, y se aplicaron 25 µl de la mezcla a un gel de poliacrilamida. Se aplicó una corriente eléctrica al gel para separar por tamaños las proteínas en el gel. Las proteínas se visualizaron a continuación de la electroforesis por tinción con colorante Coomassie. El sobrenadante dializado contenía aproximadamente veinte proteínas con tamaños que variaban desde aproximadamente 20 kDa hasta aproximadamente 100 kDa.

Las proteínas en el sobrenadante dializado se fraccionaron por cromatografía de intercambio iónico DEAE. Dos ml del sobrenadante dializado se aplicaron a una columna DEAE de 1 ml. La columna se lavó con 10 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, seguido por el lavado con 20 ml de un gradiente de NaCl de 0 a 1 M en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. Se recogieron las fracciones de 1 ml. Cada fracción se dializó contra Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, y se probó la toxicidad de cada fracción individual para las larvas de DBM como se describió anteriormente. Se recogieron las fracciones con toxicidad más alta y se combinaron y se las denominó como la combinación DEAE.

Se aplicó la combinación DEAE a una columna de intercambio iónico de carboximetilcelulosa (CM). La columna se lavó con 10 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, y a continuación se lavó con 20 ml de un gradiente de NaCl de 0 a 1 M en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. Se recogieron fracciones de un ml y se dializaron contra Tris-HCI 20 mM, pH 7,5. Estas fracciones se denominaron fracciones CM. Se probó la toxicidad de las fracciones CM para las larvas de DBM. Este análisis mostró que las fracciones CM tuvieron la toxicidad más alta para DBM y contenían una proteína de aproximadamente 66 kDa. La proteína de 66 kDa se denominó proteína 5438-66, también denominada proteína TIC900, TIC900s, o mTIC900 secretadas (referidas a una forma madura de la proteína identificada en el sobrenadante de cultivo que puede ser diferente de cualquier proteína precursora de TIC900 (pTIC900) no liberada aún de la célula).

Ejemplo 3. Determinación de la secuencia N-terminal de un fragmento de una proteína TIC900

La proteína mTIC900 se purificó a partir del sobrenadante de la cepa EG5438 por DEAE y cromatografía de intercambio iónico de CM. Los intentos para determinar la secuencia N-terminal de la proteína mTIC900 purificada por medio de procedimientos convencionales no fueron satisfactorios. Para superar esta dificultad, la proteína mTIC900 se fragmentó mediante el tratamiento con bromuro de cianógeno (Cordoba y col., J. Biochem. Biophys. Methods 35: 1, 1997). Los fragmentos de TIC900 generados con bromuro de cianógeno se separaron por tamaños por medio de SDS-PAGE sin tinción de Coomassie. Los fragmentos TIC900 separados se transfirieron del SDS-PAGE a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) por electro transferencia. La membrana de PVDF se tiñó brevemente con colorante de Coomassie y una porción de la membrana que contenía un fragmento de aproximadamente 14 kDa de la proteína TIC900 se escindió con una hoja de afeitar. La membrana escindida de PVDF que contenía el fragmento de 14 kDa se sometió a secuenciación de Edmund automatizada, que reveló la secuencia de aminoácidos según se presenta en ID. SEC. Nº 1, en la que los residuos de aminoácidos Xaa en la posición uno (1) eran indeterminables excepto que se presumiera que fueran residuos de Serina, Tirosina, Aspartato o Histidina, pero muy probablemente un residuo de Tirosina, el residuo aminoácido Xaa en la posición 15 era indeterminable excepto que fuera probablemente un residuo de Prolina, y el residuo Xaa en la posición 18 también fue indeterminable excepto que fuera un probable residuo de Arginina.

Ejemplo 4. Clonación del gen tic900 que codifica la proteína TIC900

En base a la secuencia obtenida a partir del fragmento de proteína TIC900 de 14 kDa (ID. SEC. Nº 1), se diseñó un oligonucleótido específico del gen. Por la degeneración del código genético no es posible conocer la secuencia exacta de un gen basado en la secuencia de la proteína codificada por el gen. Por consiguiente para los aminoácidos que pueden ser codificados por más de un solo codón, es necesario conjeturar sobre el codón correcto. La posibilidad de conjeturar con exactitud está aumentada por el hecho de que el genoma de B. thuringiensis tiene aproximadamente 68% de AT (adenosina y timidina). Por consiguiente, para los aminoácidos codificados por más de un codón, se selecciona el codón o los codones que contienen A y T, y para los codones que contienen sustancialmente G/C, se seleccionan los codones que tienen una degeneración en la posición de la tercera base de preferencia en base a si la tercera base es un nucleótido A

o T. Se diseñó un oligonucleótido denominado WD470 (ID. SEC. Nº 2) que es uno de los muchos que podrían codificar de manera concebible el aminoácido según se presenta en ID. SEC. Nº 1, teniendo en consideración el uso de A/T en Bacillus thuringiensis para codones que codifican cualquier aminoácido dado.

El ADN se purificó a partir de células de la cepa EG5438 de B. thuringiensis mediante procedimientos convencionales. Las muestras de ADN de EG5438 se sometieron a digestión con enzimas de restricción HindIII o EcoRI y se fraccionaron por tamaño por medio de electroforesis a través de un gel de agarosa y se sometieron a análisis de transferencia Southern usando una sonda de oligonucleótidos WD470 conjugada con fosfatasa alcalina. Tras la incubación durante aproximadamente 16 horas a 40 ºC se lavó la transferencia, se trató con el tampón quimioluminiscente, y se expuso a una película de rayos X. La sonda WD470 hibridó específicamente con fragmentos de restricción de ADN de EG5438 que tuvieron aproximadamente 2,5 kb (HindIII) y3,0 kb(EcoRI) de longitud, respectivamente.

Se construyó una biblioteca de ADN de EG5438 constituida por fragmentos de EcoRI de aproximadamente 3,0 kb en un plásmido pUC18 tratado con CIP (fosfatasa de intestino de ternera) y digerido con EcoRI. La biblioteca se transformó por electroporación en una cepa XLIBLUE de E. coli y se colocó en placas con LB-ampicilina. Las colonias que surgieron se transfirieron a una membrana y se sondaron con la sonda de oligonucleótidos WD470 conjugada con fosfatasa alcalina. Se seleccionaron varios clones positivos y se obtuvo el ADN del plásmido de cada uno. Los ADN plasmídicos se digirieron con EcoRI para confirmar la presencia de un único inserto de EcoRI constituido por aproximadamente 3,0 kb. Los plásmidos también se sometieron a hibridación con la sonda WD470 conjugada con fosfatasa alcalina para confirmar la complementariedad de la sonda y del ADN insertado. Se seleccionó un único clon para otro análisis y se lo denominó plásmido pEG1398. El ADN insertado en pEG1398 se sometió al análisis de secuencias. Se obtuvo una secuencia que contenía un marco de lectura abierto parcial constituido por la posición del nucleótido 1176 hasta 1803 según se presenta en ID. SEC. Nº 3, así como otros 24 nucleótidos más allá del nucleótido 1803 (datos no mostrados) que contenían un codón de terminación inmediatamente después de los nucleótidos en la posición 1801-1803 según se presenta en ID. SEC. Nº 3.

La secuencia completa de un ORF que codifica la proteína TIC900 no estaba presente dentro del fragmento EcoRI clonado en el plásmido pEG1398. Los cebadores de oligonucleótidos específicos para los extremos 5’ y 3’ de la secuencia allí identificada estaban diseñados para permitir la síntesis de una sonda marcada para usar en la detección de un fragmento clonado más grande de ADN EG5438 que contenía probablemente el ORF de longitud completa que codificaba la proteína TIC900. Se preparó una sonda de ADN marcada con digoxigenina mediante amplificación usando los cebadores y el ADN insertado en pEG1398 como molde. El ADN marcado con DIG se utilizó para sondar una transferencia Southern de ADN de EG5438 que se había resuelto en un gel de agarosa tras la digestión con diversas enzimas de restricción. Se identificó un fragmento HindIII de aproximadamente 2,5 kb de longitud como un fragmento que podría contener el ORF de longitud completa que codifica la proteína TIC900.

Se clonó un fragmento de ADN de EG5438 de aproximadamente 2,5 kb usando medios similares a los descritos anteriormente para el fragmento de EcoRI de aproximadamente 3,0 kb excepto que el fragmento HindIII se clonó en un plásmido pBlueScript KS y la sonda utilizada era un segmento de ADN marcado con DIG constituida por una parte del marco de lectura abierto identificado dentro del fragmento de EcoRIde 3,0kben el plásmido pEG1398. Se seleccionó un plásmido que contenía un fragmento de HindIII de aproximadamente 2,5 kb que hibridó con el fragmento de EcoRI marcado con DIG presente dentro de pEG1398 para otro análisis y se denominó plásmido p5438-2.5-kb-H3. La cepa de E. coli recombinante que alberga p5438-2.5-kb-H3 se denominó 5438 2,5kb H3. Se determinó la secuencia de ADN del inserto HindIII de 2,5 kb en el plásmido p5438-2.5-kb-H3, y la traducción de esta secuencia en los seis marcos de lectura reveló un marco de lectura abierto de 1803 nucleótidos, cuya secuencia se presenta en ID. SEC. Nº 3.

Se predijo que el ORF desde la posición del nucleótido 1 hasta la posición del nucleótido 1803 según se presenta en ID. SEC. Nº 3 codificaba una proteína de aproximadamente

68.868 Da, que se ha denominado en el presente documento proteína TIC900. La secuencia de aminoácidos de la forma precursora predicha de una proteína TIC900 (pTIC900) deducida a partir del marco de lectura abierto en ID. SEC. Nº 3 se muestra según se presenta en ID SEC. Nº 4. La comparación de la identidad y similitud de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos deducida de TIC900 (ID. SEC. Nº 4) con la base de datos de proteínas de GenBank reveló que la identidad más próxima era una proteína Cry1Ca que exhibía aproximadamente el 49% de identidad.

Ejemplo 5. Expresión de un gen tic900 clonado en B. thuringiensis recombinante.

Los genes de la toxina insecticida de B.thuringiensis a menudo se expresan mal en las cepas de E. coli recombinantes. La cepa EG10650 de B. thuringiensis es una cepa que no produce proteínas cristalinas que fue diseñada para usar como una cepa receptora para probar si los genes Bt clonados codifican las proteínas insecticidas. (EG10650, NRRL Número de referencia del NRRL: B-30217, Patente de EEUU Nº 6.468.52). La secuencia codificadora de TIC900 en el fragmento de HindIII clonado en el plásmido p5438-2.5kb-H3 se transfirió al sitio de restricción de HindIII en el vector lanzadera de B. thuringiensis y E. coli pEG597 (Baum, J. A.; Coyle, D. M.; Gilbert, M. P.; Jany, C. S.; Gawron-Burke, C., 1990 Novel cloning vectors for Bacillus thuringiensis; Applied and Environmental Microbiology 56 (11): 3420-3428) dando como resultado la construcción del plásmido pMON74010 que confiere resistencia al cloramfenicol a las células de Bacillus receptoras. El plásmido pMON74010 se transformó por medio de electroporación en la cepa EG10650 de B. thuringiensis que no produce proteínas cristalinas dando la cepa SIC9002. La cepa EG10650 se cultivó como control en medio PYG como se describió en el Ejemplo 1. La cepa recombinante SIC9002 se cultivó en medio PYG más cloramfenicol 5 ug/ml. Los sobrenadantes de cultivo se prepararon como se describió en el Ejemplo 1. Las proteínas en los sobrenadantes de cultivo se resolvieron por análisis SDS-PAGE convencionales y se visualizaron tras la tinción con azul brillante de Coomassie. Los resultados del análisis de SDS-PAGE revelaron que las cepas EG10650 y SIC9002 secretaron cantidades y tamaños similares de proteínas en sus respectivos sobrenadantes de cultivo con excepción de que el sobrenadante de cultivo de la cepa SIC9002 contenía una proteína de aproximadamente 66 kDa que no parecía estar presente en el sobrenadante de cultivo de la cepa EG10650. Este resultado sugirió que el marco de lectura abierto de tic900 clonado en p5438-2.5kb-H3 codificó una proteína que migró con una masa de aproximadamente 66 kDa en geles de SDS-PAGE. Una discrepancia en los tamaños de la secuencia de aminoácidos deducida a partir del ORF según se presenta en ID. SEC. Nº 3 (aproximadamente 69 kDa) y la masa observada por migración en SDS-PAGE sugiere que la forma secretada de la proteína puede de hecho estar reducida en su tamaño en aproximadamente 2500 hasta 3000 Da. Esto no es inesperado puesto que la mayoría de las proteínas secretadas exhiben una cierta reducción de tamaño por efecto proteolítico a medida que pasan a través de cualquier maquinaria de secreción. Sin embargo, no hay péptido señal de tipo II aparente presente considerando los resultados de un análisis de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína precursora de TIC900 (pTIC900).

Ejemplo 6. Bioensayo de la proteína TIC900 producida a partir de la secuencia codificadora tic900 clonada.

Los sobrenadantes de cultivo de las cepas EG10650 y SIC9002 se aplicaron a la superficie de la dieta del insecto como se describió anteriormente en el presente documento. Se colocaron larvas de barrenador europeo del maíz (ECB) en primer estadio larvario y huevos de oruga del tabaco (TBW) en dieta tratada y se dejaron desarrollar durante 1 semana. Las larvas de insecto se evaluaron visualmente. Las larvas de ECB y las larvas de TBW que se criaron con dieta sin tratar o con dieta tratada, con el sobrenadante EG10650 mostraron un crecimiento normal. En cambio, las larvas de ECB y las larvas de TBW criadas con una dieta tratada con sobrenadante SIC9002 mostraron atrofias significativas. Estos resultados sugirieren que la proteína producida de la expresión del gen tic900 clonado inhibió el crecimiento de las larvas de ECB y de TBW.

Ejemplo 7. Identificación de cepas que contienen homólogos de tic900 Se preparó una sonda marcada con DIG que abarcaba el marco de lectura abierto completo de la secuencia codificadora tic900 usando los siguientes cebadores de amplificación térmica:

5’-gcgctagcatgaattcaaaggaacatgattatctaaaag-3’: ID. SEC. Nº 21, y 5’-cgggctcgagctattcaacaggaataaattcaattttatcc-3’: ID. SEC. Nº 22.

Se digirieron de uno a cinco µg de ADN genómico de una colección de cepas de Bt hasta la terminación con HindIII y los fragmentos resultantes se resolvieron como un frotis en un gel de agarosa. El gel se usó en un procedimiento de transferencia Southern en el que se desnaturalizó el ADN resuelto, se transfirió a una membrana de nailon, se fijó, y se expuso a la sonda marcada con DIG anteriormente descrita. La hibridación se llevó a cabo en la DIG Easy Hybe (Roche) a 42 ºC (DIG Easy Hybe a 42 ºC es equivalente a una hibridación rigurosa a 42 ºC con un sistema tampón de hibridación que contiene formamida al 50%). Los lavados moderadamente rigurosos se llevaron a cabo de la siguiente manera: 1) una vez durante 5 minutos y otra vez durante 15 minutos a 25 ºC en 2X SSC, SDS al 0,1%; y 2) dos veces durante 15 minutos cada uno a 65 ºC en 0,5X SSC, SDS al 0,1%.

Se identificaron trece cepas que contenían entre uno y tres fragmentos de HindIII que hibridaron con la sonda tic900. El ADN de cada una de estas cepas se utilizó como molde para la amplificación térmica de los homólogos de tic900. Los cebadores según se presentan en ID. SEC. Nº 21 y ID. SEC. Nº 22 se utilizaron para amplificar los homólogos tic900 usando el kit de PCR Expand High Fidelity (Roche). Las condiciones de la reacción de amplificación térmica consistían en un volumen de 50 µl que comprendía 200 µM de cada dNTP, 300 nM de cada cebador, 0,1-250 ng de molde de ADN genómico, y 2,6 unidades de mezcla de enzimas en tampón de reacción 1X (suministrado por el fabricante con los reactivos en concentración 10X).

Los ciclos de amplificación térmica estaban constituidos por un ciclo de 2 minutos a 94 ºC; diez ciclos de 15 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC, y 2 minutos a 72 ºC; seguido por veinticinco ciclos de 15 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC, y 2 minutos a 72 ºC, aumentando cada uno de los últimos veinticinco ciclos en 5 segundos por ciclo; y

una fase de extensión terminal de 7 minutos a 72 ºC al final del último ciclo.

El ADN de nueve de las trece cepas sometidas a esta reacción de amplificación térmica produjo los productos de amplificación (amplicones) que a continuación se clonaron y se secuenciaron. Las secuencias terminales 5’ y 3’ de los productos de amplificación térmicos clonados se fijaron por las secuencias de los cebadores y pueden no ser representativas de la secuencia del gen nativo a través de la secuencia establecida por los cebadores de amplificación. A pesar de esto, las secuencias del amplicón fueron sustancialmente las mismas que las secuencias nativas de longitud completa expresadas para el análisis de la actividad insecticida. Un experto en la técnica reconocerá que los amplicones pueden utilizarse como sondas para extraer las secuencias nativas de longitud total que codifican proteínas insecticidas relacionadas con la proteína TIC900. Las proteínas codificadas por el marco de lectura abierto para cada producto de amplificación térmica y las cepas de las que se obtuvo cada producto de amplificación térmica se indican en la Tabla 1, como se muestra a continuación.

También se usaron cebadores de amplificación variantes y múltiples condiciones de amplificación para identificar los homólogos de tic900 de la cepa EG3907de Bt con actividad CRW. Se realizó el mapeo del homólogo de tic900 en EG3907 por medio de transferencia Southern para facilitar la clonación del marco de lectura abierto que codificaba esta proteína. El homólogo de tic900 en EG3907 tenía un patrón de restricción de HindIII diferente al del gen tic900 de EG5438. El homólogo de EG3907 se identificó en un fragmento BamHI / BglII de aproximadamente 13 kb. El ADN de EG3907 digerido con BamHI / BglII se unió en los brazos del fago lambda GEM-11 digerido con BamHI. Las transferencias Southern de ADN de otras 30 cepas de Bt exhibieron actividad CRW en el caldo de fermentación, se identificaron 2 cepas, EG3291, EG3388, que contenían ADN que hibridó con una sonda tic900 bajo condiciones rigurosas. Ambas cepas exhibieron idénticos patrones de restricción de HindIII, pero estos eran diferentes de los patrones de restricción que contenía la secuencia tic900 de la cepa EG5438 según se presenta en ID. SEC. Nº 3, y diferente del patrón de restricción que contenía el homólogo identificado como presente en la cepa EG3907.

Se transfirió ADN (0,5 g) de 132 cepas de Bt a membranas de Nytran y se sondaron con una sonda de ADN tic900 bajo condiciones rigurosas. El ADN de las quince cepas que exhibían las señales más fuertes de hibridación de tic900 se analizaron con detalle. El ADN de cada cepa se digirió hasta completar con HindIII y se sometió a un procedimiento de transferencia Southern como se describió anteriormente. El ADN de varias cepas que parecía hibridar en las manchas transferidas no mostró señales de fuerte hibridación usando el procedimiento de transferencia Southern. 14 cepas que contenían secuencias homólogas al gen tic900 se han analizado usando transferencia Southern de HindIII. En base a los perfiles de hibridación que aparecen usando digestión HindIII, en estas cepas están presentes al menos 4 homólogos de tic900.

Las siguientes cepas de Bacillus thuringiensis exhiben fragmentos de HindIII que hibridan con una sonda tic900 bajo condiciones de hibridación rigurosas o específicas: EG3291, EG3388, EG3879, EG3907, EG4090, EG4092, EG4293, EG4332, EG4577, EG4611, EG4963, EG4971, EG5023, EG5438 y EG5526. Estas cepas también producen proteínas extracelulares que pueden evaluarse para la actividad insecticida. Dependiendo de la cepa seleccionada, los fragmentos HindIII de hibridación variaron de tamaños desde aproximadamente 0,8 kb hasta aproximadamente 6,3 kb. Se determinó la secuencia de nucleótidos de cada fragmento que hibridaba con la sonda tic900, y se dedujeron los marcos de lectura abiertos de estas secuencias, presentados cada uno en el presente documento como ID. SEC. Nº 5, ID. SEC. Nº 7, ID. SEC. Nº 9, ID. SEC. Nº 29, ID. SEC. Nº 11, ID. SEC. Nº 13, ID. SEC. Nº 15, ID. SEC. Nº 17 e ID. SEC. Nº 19. La secuencia de aminoácidos de una proteína comparable en tamaño a la de TIC900 se dedujo a partir de cada uno de estos marcos de lectura abiertos, según se presentan respectivamente en ID. SEC. Nº 6, ID. SEC. Nº 8, ID. SEC. Nº 10, ID. SEC. Nº 30, ID. SEC. Nº 12, ID. SEC. Nº 14, ID. SEC. Nº 16, ID. SEC. Nº 18 e ID. SEC. Nº 20. Estas secuencias de aminoácidos deducidas se denominaron respectivamente TIC402, TIC403, TIC404, TIC434, TIC961, TIC962, TIC963, TIC965 y TIC966. Según se expone en la Tabla 1, estas secuencias de nucleótidos se obtuvieron respectivamente de las siguientes cepas de B. thuringiensis: EG3879 (TIC402), EG4332 (TIC403), EG4971 (TIC404), EG4090 (TIC961), EG4293 (TIC962), EG4611 (TIC963 y TIC434), EG5023 (TIC965) y EG4092 (TIC966). Se identificó otra cepa que exhibió una secuencia que hibridó con la sonda tic900. La cepa EG5526 contenía un fragmento de HindIII que era aparentemente idéntico en tamaño al fragmento de HindIII identificado como codificador de TIC402 de la cepa EG3879. El análisis de la secuencia de ADN reveló que el fragmento EG5526 contenía un ORF (TIC964) que era idéntico en secuencia al del ORF de tic402. Las cepas que no producen proteínas cristalinas de B. thuringiensis que contenían plásmidos que codificaban estos homólogos clonados de tic900 se sometieron cada una a bioensayos de insectos y se determinó que mostraban bioactividad insecticida.

Existe un alto grado de identidad entre las secuencias que codifican las proteínas de la presente invención. De hecho, una alineación de los marcos de lectura abiertos que incluyen cada uno de los genes tic revela que ninguno de los ORF tienen menos de aproximadamente el 97% de identidad entre sí. Una alineación de las secuencias de aminoácidos codificadas por cada uno de los ORF también indica que existe un alto grado de identidad entre las proteínas de la presente invención. TIC962 y TIC963 son las que están menos relacionadas, pero aún están muy estrechamente relacionadas puesto que muestran más del 96% de identidad a nivel de la secuencia de aminoácidos. La mayor parte de los cambios a la secuencia de nucleótidos para cualquier cambio dado en cualquier ORF en relación a una secuencia de consenso establecida en base a una alineación de todas las secuencias de nucleótidos indica que los cambios son silenciosos ya que sólo afectan a la tercer base en un codón y como consecuencia no dan como resultado la modificación de la secuencia de aminoácidos codificada.

Los subcultivos de las cepas EG5438 de B. thuringiensis que contenían el gen nativo tic900, y SIC9002 que contenía la secuencia codificadora clonada tic900 se depositaron en la colección permanente de la Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), U.S. Department of Agriculture (USDA), 1815 North University Street, Peoria, IL. 61604, EEUU. La cepa SIC9002 de B. thuringiensis se depositó el 25 de abril de 2002 y se le asignó el número de referencia del NRRL: NRRL B-30582. La cepa EG5438 de B. thuringiensis se depositó el 3 de mayo de 2002 y se le asignó el número de referencia del NRRL: NRRL B-30584.

Ejemplo 8. Genes que codifican proteínas insecticidas quiméricas

Este ejemplo ilustra que las clases de proteínas TIC900 muestran similitudes con la clase Cry1 de proteínas insecticidas de Bt y que la proteína quimérica puede construirse a partir de toda o parte de una proteína de la clase TIC900 unida en fase con toda o parte de una proteína Cry1 y puede probarse su actividad insecticida.

La comparación de cualquiera de las proteínas de la clase TIC900 dadas a conocer en el presente documento con otras proteínas insecticidas de Bt sugiere que estas proteínas están más estrechamente relacionadas con las proteínas de las clases Cry1, y en particular con la porción insecticida de las proteínas Cry1. La proteínas de la clase TIC900 muestran similitud estructural con las porciones de la proteína toxina Cry1 en que las proteínas Cry1 muestran una estructura de dominios constituida por un primer dominio constituido por aproximadamente los primeros 200 hasta aproximadamente los primeros 240 aminoácidos amino terminales que se denomina dominio I, un segundo dominio que está constituido por aproximadamente los aminoácidos desde el aminoácido 240 hasta aproximadamente el aminoácido 400 que se denomina dominio II, y un dominio carboxi terminal denominado dominio III constituido por los aminoácidos desde aproximadamente el residuo 400 hasta el final del dominio de la toxina. Las proteínas de la clase TIC900 parecen mostrar este tipo de estructura de dominios aunque las proteínas de la clase TIC900 por lo general no son tan largas como la mayoría de los dominios de la toxina Cry1. Se ha demostrado previamente que los dominios de toxina Cry1 pueden fusionarse a estructuras peptídicas de protoxina heteróloga, y que las fusiones dan como resultado la formación de cristales, y a menudo también retienen la bioactividad insecticida cuando se prueban los cristales resultantes en un bioensayo. Se construyó una proteína de fusión (ID. SEC. Nº 24, TIC109) en la que se fusionó TIC900 a la estructura peptídica de la protoxina Cry1Ac. La proteína de fusión se expresó a partir de la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 23 en pMON74119 en la cepa EG10650 de B. thuringiensis (cepa recombinante denominada SIC1047). ID. SEC. Nº 23 corresponde a una secuencia codificadora de TIC900 a partir de la posición del nucleótido 1 hasta el 1809, y a una secuencia codificadora del dominio de protoxina Cry1Ac desde la posición del nucleótido 1816 hasta el 3504. La proteína quimérica TIC109 formada en fermentaciones de SIC1047 produjo inclusiones cristalinas, que se probaron en bioensayos frente a la oruga del tabaco, el gorgojo de los cereales, y a la oruga militar tardía. La proteína quimérica mostró similar bioactividad a la exhibida por TIC900, pero no fue biológicamente activa frente a la oruga militar tardía.

TIC110 (ID. SEC. Nº 26) codificada por la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 25 es una proteína insecticida quimérica Cry1F/TIC900 unida a una secuencia peptídica de protoxina Cry1Ac. ID. SEC. Nº 25 corresponde a una secuencia que codifica el dominio I de Cry1F desde aproximadamente la posición del nucleótido 1 hasta el 723, una secuencia que codifica los dominios II y III de TIC900 desde aproximadamente la posición del nucleótido 724 hasta el 1809, y una secuencia codificadora de Cry1Ac desde aproximadamente la posición del nucleótido 1810 hasta el 3510. Esta proteína puede expresarse en una cepa de Bt que no produce proteínas

cristalinas y las inclusiones de proteínas cristalinas pueden probarse en el bioensayo para determinar la actividad biológica frente a diversas especies de plagas de lepidópteros.

TIC111 (ID. SEC. Nº 28) está codificada por la secuencia de nucleótidos según se presenta en ID. SEC. Nº 27. TIC111 corresponde a una proteína quimérica insecticida constituida por un dominio I de Cry1Ac unido a los dominios II y III de TIC900, que está unido a un dominio de protoxina Cry1Ac. TIC111 puede expresarse a partir de pMON74122 y las inclusiones de proteínas cristalinas pueden probarse en el bioensayo para determinar la actividad biológica frente a diversas especies de plagas de lepidópteros.

pMON74122 se transformó en la cepa EG10650 de Bt que no produce proteínas cristalinas dando como resultado la célula huésped transformada SIC1049 que expresó la proteína TIC111. Los cristales de TIC111 se recogieron y se probaron en el bioensayo frente al gusano cortador negro (BCW), la palomilla dorso de diamante (DBM), la oruga del tabaco (TBW), el gusano del fruto del maíz (CEW) y la oruga militar tardía (FAW, Fall Army Worm). Se observó bioactividad insecticida para BCW, DBM y TBW, coherente con la bioactividad insecticida para TIC900.

La referencia a la palabra “que comprende” o “comprendiendo” o “comprenden” ya sea en las reivindicaciones o en la memoria descriptiva tiene la intención de definirse como un término o términos que significan “incluye al menos”.

REFERENCIAS

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Monsanto Technology LLC Donovan, Judith C Donovan, William P Engleman, James T Malvar, Thomas M Pitkin, John W

<120> Proteína insecticida secretada y composiciones de genes de Bacillus thuringiensis y sus usos

<130> 38-21 (52949)

<150> 60/529.917

<151> 16-12-2003

<160> 32

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (1)..(1)

<223> aminoácido desconocido <220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (15)..(15)

<223> aminoácido desconocido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

<222> (18)..(18)

<223> aminoácido desconocido

<400> 1

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<210> 2

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> sonda de oligonucleótido WD470

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1)..(50)

<223> oligonucleótido WD470

<400> 2

tatagagaaa gaggatctgt tgattctttt aatgaattac ctccatttaa 50

<210> 3

<211> 1803

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1803)

<223> TIC900

10

15

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30

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<210> 4

<211> 601

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 4

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<210> 5

<211> 1803

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1803)

<223> TIC402

<400> 5

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10

15

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25

30

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<210> 6

<211> 601

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 6

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<210> 7

<211> 1803

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1803)

<223> TIC403

<400> 7

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10

15

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30

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<210> 8

<211> 601

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

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<210> 9

<211> 1803

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1803)

<223> TIC404

<400> 9

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15

20

25

30

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<210> 10

<211> 601

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

10

15

20

25

30

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<210> 11

<211> 1803

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1803)

<223> TIC961

<400> 11

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<210> 12

<211> 601

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

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<210> 13

<211> 1803

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1803)

<223> TIC962

<400> 13

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<210> 14

<211> 601

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

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10

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30

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<210> 15

<211> 1803

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1803)

<223> TIC963

<400> 15

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<210> 16

<211> 601

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

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10

15

20

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<210> 17

<211> 1803

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1803)

<223> TIC965

10

<400> 17

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<210> 18

<211> 601

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 18

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<210> 19

<211> 1803

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1803)

<223> TIC966

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25

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<210> 20

<211> 601

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 20

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<210> 21

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación térmica 5’ de tic900

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1)..(39)

<223> cebador de amplificación térmica 5’ de tic900

<400> 21

gcgctagcat gaattcaaag gaacatgatt atctaaaag 39

<210> 22

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación térmica 3’ de tic900

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1)..(41)

<223> cebador de amplificación térmica 3’ de tic900

<400> 22

cgggctcgag ctattcaaca ggaataaatt caattttatc c 41

<210> 23

<211> 3504

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> CDS de tic109 constituida por CDS para TIC900 unida en fase a la CDS para la protoxina Cry1Ac

<220> 5 <221> CDS

<222> (1)..(3504)

<223> dominios I-III de la toxina TIC900 1-1803; conector Xhol 1804-1809; dominio de protoxina Cry1Ac 1810-3504

10

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<400> 23

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<210> 24

<211> 1168

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<223> CDS de tic900 constituida por CDS para TIC900 unida en fase a CDS para la protoxina Cry1Ac

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210> 25

<211> 3510

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDS de tic110 constituida por CDS para el Dominio I de Cry1F unida en fase a 5 CDS para el Dominio II-III de TIC900 unida en fase a CDS para la protoxina Cry1Ac

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3510) 10 <223> Dominio I de Cry1F nt 1-723 (aminoácidos 1-233); Dominio II-III de TIC900 nt 7241809 (aminoácidos 234-603); dominio de protoxina Cry1Ac nt 1810-3510 (aminoácidos 604-1170)

15

20

25

30

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<210> 26

<211> 1170

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDS de tic110 constituida por CDS para el Dominio I de Cry1F unida en fase a CDS para el Dominio II-III de TIC900 unida en fase a CDS para la protoxina Cry1Ac

<400> 26

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10

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<210> 27

<211> 3516

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDS de TIC111 constituida por CDS para el dominio I de Cry1F unida en fase a CDS para el dominio II-III de TIC900 unida en fase a CDS para la protoxina Cry1Ac

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3516)

<223> TIC111 que comprende el dominio I de Cry1Ac nt 1-705 (aminoácidos 1-235); dominio II-III de TIC900 nt 706-1815 (aminoácidos 236-605); dominio de protoxina Cry1Ac nt 1822-3516 (aminoácidos 608-1172)

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<210> 28

<211> 1172

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> CDS de TIC111 constituida por CDS para el dominio I de Cry1Ac unida en fase a

CDS para el dominio II-III de TIC900 unida en fase a CDS para la protoxina Cry1Ac

10

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<400> 28

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<211> 7585

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

<220>

<221> CDS

<222> (415)..(2238)

<223> CDS de TIC434

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<210> 30

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<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

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<210> 31

<211> 3525

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3525)

<223> CDS de TIC435; 1-1825 corresponde a CDS de TIC434; 1826-3525 corresponde a protoxina Cry1

<400> 31

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<210> 32

<211> 1175

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 32

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Claims (14)

1.

Un polinucleótido aislado que codifica una proteína toxina insecticida de Bacillus thuringiensis activa frente a una plaga de insectos lepidópteros, comprendiendo dicha proteína toxina insecticida una secuencia polipeptídica seleccionada de ID. SEC. Nº 4, (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966), o una porción de las mismas que tenga actividad insecticida contra lepidópteros, con la condición de que la proteína toxina no tenga la secuencia de ID. SEC. Nº 6 con la siguiente secuencia N terminal adicional: Met Ser Glu Leu Lys Gly Lys Phe Lys Lys Ser Thr Asn Arg Thr Cys Cys Leu Leu Lys Ile Ile Asn Ile Gly Gly Arg Gly.

2.

El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde

(i)

dicha plaga de insectos lepidópteros se selecciona de las familias Noctuidae, Tortricidae, Epinotia aporema, Anticarsia gemmatalis, Psedoplusia includens, el barrenador europeo del maíz (ECB), la oruga del tabaco (TBW), el gusano cortador negro (BCW) y la palomilla dorso de diamante (DBM); o

(ii)

dicha toxina tiene un peso molecular entre 65 kDa y 70 kDa, y seleccionándose dicha toxina insecticida de ID. SEC. Nº 4, (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966).

3.

El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos se ha optimizado para la expresión en plantas, de preferencia dicha secuencia de nucleótidos se ha optimizado para

(a) expresión en una planta monocotiledónea, comprendiendo dicha optimización una

o más de las etapas seleccionadas de

(i)

eliminar las secuencias de poliadenilación,

(ii)

ajustar el contenido de A y T de la secuencia de nucleótidos para que sea del

40% al 49% sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína, y

(iii) modificar los codones en la secuencia codificadora para que resulten coherentes con las etapas (a)(i) y (a)(ii); o

(b) expresión en una planta diocotiledónea, comprendiendo dicha optimización una o más de las etapas seleccionadas de

(i)

eliminar las secuencias de poliadenilación,

(ii)

ajustar el contenido de A y T de la secuencia de nucleótidos para que sea del 40% al 49% sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína, y

(iii) modificar los codones en la secuencia codificadora para que resulten coherentes con las etapas (b)(i) y (b)(ii).

4.

Una proteína insecticida aislada de Bacillus thuringiensis que comprende una secuencia polipeptídica seleccionada de ID. SEC. Nº 4 (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966), o una porción de las mismas que tenga actividad insecticida contra lepidópteros, con la condición de que la proteína toxina no tenga la secuencia de ID. SEC. Nº 6 con la siguiente secuencia N terminal adicional: Met Ser Glu Leu Lys Gly Lys Phe Lys Lys Ser Thr Asn Arg Thr Cys Cys Leu Leu Lys Ile Ile Asn Ile Gly Gly Arg Gly.

5.

La proteína aislada como en la reivindicación 4, en la que

(i)

dicha porción insecticida se selecciona de ID. SEC. Nº 4 (TIC900), ID. SEC. Nº 6 (TIC402), ID. SEC. Nº 8 (TIC403), ID. SEC. Nº 10 (TIC404), ID. SEC. Nº 30 (TIC434), ID. SEC. Nº 12 (TIC961), ID. SEC. Nº 14 (TIC962), ID. SEC. Nº 16 (TIC963), ID. SEC. Nº 18 (TIC965) e ID. SEC. Nº 20 (TIC966), o

(ii)

dicho Bacillus thuringiensis es EG5438 depositado en el NRRL bajo el número de referencia NRRL B-30584.

6.

Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7.

Una célula huésped transformada para contener un polinucleótido según se define en

una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8.

La célula huésped de la reivindicación 7, siendo dicha célula huésped una célula vegetal y dicho polinucleótido se ha optimizado según se define en la reivindicación 3.

9.

Un procedimiento para combatir una plaga de insectos lepidópteros que comprende poner en contacto dicha plaga con una cantidad plaguicida de una toxina de Bacillus thuringiensis de 70 kDa de la reivindicación 1 o 2.

10.

La célula huésped de la reivindicación 8 que comprende una célula de planta monocotiledónea seleccionada de una célula de planta de maíz, una célula de planta de trigo, una célula de planta de arroz, una célula de planta de avena, una célula de planta de cebolla y una célula de planta de hierba.

11.

La célula huésped de la reivindicación 8 que comprende una célula de planta dicotiledónea seleccionada de una célula de planta de algodón, una célula de planta de canola, una célula de planta de soja, un célula de planta de tabaco, una célula de planta de árboles frutales, una célula de planta crucífera, una célula de planta de pimiento o pimentero, una célula de planta ornamental, una célula de planta de girasol, una célula de planta cucurbitácea y una célula de planta de melón.

12.

Un procedimiento para expresar en una planta una proteína insecticida tóxica para los insectos lepidópteros, que comprende las etapas de:

(a)

insertar en el genoma de una célula vegetal una secuencia de ácido nucleico que comprende en la dirección 5’ a 3’ una molécula de ADN de doble hebra, recombinante y unida de manera operativa, en la que la molécula de ADN de doble hebra, recombinante comprende:

(i)

un promotor que funciona en la célula vegetal

(ii)

una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos insecticida según se presenta en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(iii) una secuencia de nucleótidos 3’ no traducida que funciona en las células de la planta provocando la terminación de la transcripción;

(b)

obtener una célula vegetal transformada que contiene la secuencia de ácido nucleico de la etapa (a); y

c) generar a partir de dicha célula vegetal transformada una planta que expresa la 5 proteína insecticida en la planta transformada.

13. Una semilla de la planta que puede obtenerse por el procedimiento de la reivindicación12 o una progenie de dicha semilla, comprendiendo dicha semilla y dicha progenie la secuencia de ácido nucleico según se define en una cualquiera de las

10 reivindicaciones 1 a 3.

14. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que dicha célula vegetal es

(a) una célula de planta monocotiledónea que comprende una célula de planta de

15 maíz, una célula de planta de trigo, una célula de planta de arroz, una célula de planta de avena, una célula de planta de cebolla y una célula de planta de hierba, o

(b) una célula de planta dicotiledónea que comprende una célula de planta de algodón, una célula de planta de canola, una célula de planta de soja, un célula de

20 planta de tabaco, una célula de planta de árboles frutales, una célula de planta crucífera, una célula de planta de pimiento o pimentero, una célula de planta ornamental, una célula de planta de girasol, una célula de planta cucurbitácea y una célula de planta de melón.

25 15. Una muestra biológica derivada de los tejidos o semilla de la planta que puede obtenerse por el procedimiento de la reivindicación 12, comprendiendo la muestra una cantidad detectable de la secuencia de nucleótidos según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

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