CN1037913C - 编码杀虫蛋白质的融合基因和表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了全合成的编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的DNA序列；包含所说的DNA序列的融合基因构建体；用所说的构建体转化植物细胞、组织和整株植物的方法；以及由此产生的对植物昆虫表现有毒性的转基因植物及其后代和种子。特别是对鳞翅目昆虫如棉铃虫有毒性作用的转基因棉花植物。

Description

编码杀虫蛋白质的融合基因和表达载体及其应用

本发明涉及编码苏云金芽孢杆菌毒素蛋白质的新的DNA序列，包含所说DNA序列的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化的植物细胞，以及由所说的细胞产生的对昆虫表现有毒性的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurigiensis，下文中简称为B.t.)是一种能形成芽孢的革兰氏阳性土壤芽孢杆菌，已知其可产生对多种昆虫，如鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等作物害虫有毒性的伴孢结晶蛋白质(Aronson，Microbiol.Rev.50：1-14，1968)。B.t.产生的毒素代表了一大类用于控制植物害虫的蛋白质(Klausner，Bio/Technoloqy 2：408-419)。由于B.t.毒素杀虫的专一性和高度选择性，所以对植物和包括人在内的动物没有毒害，而且是环境可以接受的。因此，使用B.t.毒素的生物杀虫技术，在控制若干植物虫害中具有广泛的应用前景。

基于B.t.毒素的性质，多年前就已经生产了有关在商业上出售的含有苏云金芽孢杆菌产生的孢子及结晶蛋白质的商品杀虫制剂(商品名为DIPEL和THURICIDE)。这种商品B.t.杀昆虫剂可有效地对抗五十种以上的鳞翅目害虫(Wilcox，etal.，Protein Engineering，Inouye and Sarma(Eds.)Academic Press，NY，1968)。然而，使用B.t.毒素制剂的一个重要限制是由于所说的结晶蛋白质或δ-内毒素在环境中被降解，而需要重复生产和重复应用这种杀虫制剂，从而为农业生产上的实际应用带来困难，并大大增加了生产成本。

随着DNA重组技术发展，自70年代后期以来，许多实验已将B.t.毒素基因导入到不同植物组织的细胞中，并已在被转化的细胞和植物中表达了嵌合基因，从而可由转基因植物本身产生所说的生物杀虫剂，在无需重复使用的情况下，赋予植物以对抗或控制敏感昆虫蚕食者的能力。已经证明利用基因操作技术导入转基因植物中的工程化遗传特性是稳定的，并且证明可通过正常孟德尔遗传将工程化改造的遗传特性(例如杀虫能力)传递给转基因植物的后代。

棉花是导入B.t.杀虫蛋白质基因，也可以有效地产生抗虫能力的典型靶作物。棉花作为一种重要的经济作物，在中国、美国、以色列及欧洲其他一些国家，每年因棉花虫害造成的经济损失是十分巨大的。棉花的鳞翅目害虫包括棉铃虫(Heliothis virescens)、红铃虫(Heliothis zeae)等。Umbeck等人(Bio/Technology，5：262-266，1987)曾利用烟草模型，成功地完成了植物的基因转化和再生。前已证明B.t.结晶体蛋白质本身是由一种称为前毒素的130-160千道尔顿(KDa)的大蛋白质组成的。该前毒素只有在经过蛋白酶水解(在昆虫肠道内被水解切割)后，才能产生对靶昆虫有特异毒性的分子量约55至75KDa的活性肽毒素。缺失分析证明，前毒素的毒性部分定位于前毒素的氨基端，并且可制成氨基和羰基端融合体而不会丢失其杀虫活性。

鉴于上述事实，Vaeck等人(Nature 328：33-37，1987将编码B.t.毒素蛋白质的DNA序列修饰或剪切成约1/2长度然后整合到烟草基因组中并成功地生产出抗虫烟草植株。Fischhoff等人(Bio/Technology 5：807-813，1987)用类似的方法成功地产生了被B.t.杀虫基因转化的蕃茄植株。Barton，K.A.和Umbeck，P.F.(PCT 89004868)描述了能够在植物细胞中表达B.t.δ-内毒素氨基端部分(约700氨基酸)的嵌合基因的构建，以及用携带所说嵌合基因的重组载体转化植物细胞，以产生表达该毒素的转基因植物的方法。然而，上述现有技术都没有用Western印迹法检测到被导入的嵌合基因的表达产物。因此可见，天然B.t.毒素基因在植物中表达太低，很难使被转化的植物获得抗虫性。

Willbur等人(Plant Physiol.92：1-11，1990)的研究表明，低等生物体细菌和高等生物体植物在密码子的使用上存在很大差异。例如密码子XXC/G(其中两个X各自选自A、G、C和T)在植物中的使用率为45％-73.5％，而在苏云金芽孢杆菌库斯塔克HD-1变种(B.t.kurstaki HD-1)(Cry I A(b))的毒素基因中仅为24％。另外，有证据表明，植物中的tRNA很难提供细菌基因在植物细胞中的充分翻译。而且，在B.t.毒素结构基因中存在不利于在植物中转录出完整mRNA的不稳定的ATTTA和AATAA等序列，转录出的mRNA因不完整，故翻译出的蛋白质无杀虫活性。

Perlak等人(Bio/Technology 8：939-942，1990)按照双子叶植物优化密码子，以化学合成方法合成衍生于B.t.(kurstaki HD-1，Cry I A(b))和HD-73，Cry I A(c))的合成基因。其中所说的合成基因中，3′端的1/2序列被缺失且改变了部分保守序列的密码子。所得到的基因序列包含相当于编码615氨基酸序列的1845bp。将该序列连接到带有2个增强子的花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子的下游，借助植物农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化到双子叶植物棉花细胞中，并再生出抗虫棉花植株。其中毒素蛋白质表达量(约占叶子中可溶性蛋白质的0.05％-0.1％)约为编码天然B.t毒素蛋白质基因的表达量的50-100倍。然而，由于其所构建的重组表达载体中合成基因是单基因单方向表达的，抗虫率仅为72％-76％，观察到的棉花植株在生长的中后期抗棉铃虫能力也不甚理想。

另外，藤本英也等人(CN 1073717A)按照适合于单子叶植物的密码子，以化学和酶学方法合成了编码来自B.tKurstaki HD-1变种Cry I A(b)的B.t.毒素基因，其包含2171bp(相当于编码724个氨基酸的B.t.δ-内毒素活性部分)。以电穿孔法将携带处于CaMV35S启动子控制下的所述基因的重组载体转化到水稻原生质体中，再生得到具有抗虫性的转基因水稻植株。

为了研究B.t.基因序列中各个区段的密码子改变对其表达效率的影响，Perlak等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：3324-3328，1991)选择了9个区域对基因序列作各种不同的修饰，并观察这种修饰序列在烟草和蕃茄植物中的表达效率。结果发现，在5′端700bp范围内含有4个修饰区域的情况下，所得表达效率为含全部9个修饰区域的基因的表达效率的大约80％。在用3′端截短为1/2序列的基因转化的植物中没有测出基因的表达。当用在5′端246-283bp间经过修饰的基因转化植物时，表达效率仅为包含全部9个修饰区域的基因的表达效率的53％-80％。Perlak等人的研究还进一步显示，上述修饰过的天然基因在双子叶植物中的表达效率低于相应的合成的基因的表达效率。因此，利用靶植物的优化密码子，设计并合成利于与优选的表达调控元件连接或再组合，并适于在靶植物细胞中表达的B.t.杀虫蛋白质编码序列是至关重要的。

为了使外源B.t.毒素基因产物在植物细胞中的转录和翻译水平上获得有效表达，在包含编码区的外源DNA序列侧翼必须连接有适当的表达调节和控制元件。这些控制元件包括启动子、增强子、终止子，转录产物的未翻译部分和多聚腺苷酸化序列、以及便于在适当的培养基中筛选被转化细胞的选择标记基因等。常用的植物细胞转录启动子包括花椰菜花病毒(CaMV)的35S启动子和根瘤农杆菌T-DNA的胭脂碱合成酶启动子。这些启动子在大多数植物细胞中都是有效的，但其插入位点和插入的拷贝数目不同，将对其下游的蛋白质编码序列的转录和翻译活性产生很大影响。

迄今通常用于转化植物细胞的方法是基于植物病原体根瘤农杆菌(A.tunefaciens)的独特性质。根瘤农杆菌在其对植物的致病过程中将其包含的肿瘤诱导(Ti)质粒的一部分(通常称为T-DNA)导入被感染植物宿主的基因组中。另外，也可使用其他一些植物细胞转化技术，将重组DNA直接掺入植物细胞的胞质，插入植物的基因组中。其中一种方法是以电穿孔法破坏植物细胞的细胞膜，进而使水溶液中的DNA被摄入植物原生质体内。另外，也可以使用基因枪或超声波等基因转移装置将外源DNA物理击入可再生的植物胚胎组织或植物种系发生细胞中的方法。然而，据发明人所知，迄今尚没有利用子房注射外源基因转化植物受精胚囊的方法将重组体杀虫外源基因导入植物(如棉花)胚细胞中以获得具有抗虫性植物的成功例子。

本发明涉及编码B.t.杀虫蛋白质的DNA序列，包含所说的DNA序列的融合基因构建体，用所说的构建体转化植物细胞组织和整株植物的方法，以及由此产生的对植物害虫具有控制和毒杀能力的转基因植物，特别是对鳞翅目昆虫例如棉铃虫具有显著毒杀作用的转基因棉花。

根据本发明的另一个方面，本发明提供编码B.t.kurstaki HD-1和HD-73杀虫蛋白质基因的DNA序列。

众所周知，植物细胞与原核细胞及其他动物来源的真核细胞在密码子使用和偏爱性上有着很大差异。在通过DNA重组技术使植物细胞、组织或整株植物产生所需的抗虫毒素和相应活性时，这种差异将对杀虫蛋白质(B.t.δ-内毒素)的表达水平和进而产生的植物抗虫活性具有不可忽视的影响。

另外，鉴于前已证明的，C/G的高含量对于外源基因在植物细胞获得高表达的重要影响，我们研究并设计了相应于B.t毒素蛋白质中每一个氨基酸的密码子XXC/G(其中每个X分别选自A、G、C、T)的最佳组合方式。同时，还从总体上充分考虑到合成基因中各氨基酸之密码子的一致性分布和各密码子的总体联合用法。

业已发现，当在植物细胞中表达时，合成的基因DNA序列中如存在ATTTA序列和AATAA及AATAAT序列，将在某种程度上干扰基因序列的表达和多聚腺苷酸化序列的错误加入。

因此，本发明人基于已知的B.t.kurstaki HD-1和HD-73杀虫蛋白质的氨基酸序列，经过大量深入的研究工作，仔细分析了全部64个密码子(包括三个终止密码子：TAA、TAG、TGA)的优选用法，和相应的每种氨基酸密码子的优选用法。设计并合成不仅包含植物细胞优化密码子，而且在对上述XXC/G密码子组成进行适当修饰后，使其中XXC/G联合使用率大于53.5％，G+C含量大于48.1％的长度约1758个和1824个碱基对的，大约编码有586个和608个氨基酸的B.t.杀虫蛋白质的核苷酸序列。因此，本发明提供了编码B.t.杀虫蛋白质的核苷酸序列，该序列具有附图1中所示的核苷酸64-1824个或1-1824个核苷酸。在本发明一个特别优选实施方案中，该核苷酸序列中所有编码B.t.杀虫蛋白质中各氨基酸的密码子都是适于植物细胞表达的优化密码子及其组合。根据本发明的一个更为具体的优选实施方案，本发明的被修饰的合成的B.t杀虫蛋白质基因序列中，以XXC和XXG(其中X各自代表A、G、C、T)为代表的密码子的联合使用率大于53.5％，并且其G+C含量在48.1％以上。

为了得到本发明的适于在单子叶植物和双子叶植物，特别是棉花植物中表达的编码B.t.杀虫蛋白质的基因序列，我们按常规DNA合成技术合成了具有不同长度和不同的克隆位点及酶切位点的多个寡核苷酸片段。然后按照前述原则，分别组合并连接这些片段。根据本发明的一个优选实施方案，所说的基因序列由九个预先合成的寡核苷酸片段组成，所说的序列中包含足够的便于使所说的基因序列与其他调控元件连接或便于对所说的基因序列进行修饰的多克隆位点和其他相关酶切位点。

本发明的编码B.t.杀虫蛋白质的DNA序列基本是基于上述密码子优化原则和提供相应酶切位点的需要，按照已知的DNA序列合成方法，使用适当的DNA合成装置合成的。但本领域技术人员可以理解到，为本发明的目的，也可以基于天然B.t杀虫蛋白质基因的野生序列，以核苷酸定点诱变技术、PCR酶促合成等技术制得本发明的具有图1所示核苷酸序列的编码B.t.杀虫蛋白质的DNA序列及其同源序列。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及包含编码B.t.杀述所达表的DNA序列及为在受体植物中有效地表达所述杀虫蛋白体所需之调节及控制元件的融合基因构建体。

如前所述，为了在转录和翻译水平上有效地在受体植物细胞中表达外源基因产物，包含B.t.杀虫蛋白质编码区的外源DNA序列的侧翼必须连接有适当的使DNA转录为相应的mRNA的启动子序列，以及加在启动子5′端的增强启动子转录能力的增强子序列。

增强在DNA指导下经转录过程产生的mRNA在植物细胞中的翻合结力的糖体衍生的翻合增强序列、使mRNA在核糖体结合位点的翻译过程在任何读码情况下均能正确终止的多联终止密码子序列、便于对植物细胞经转录过程得到的mRNA进行正确切割与加工的mRNA切割与加工序列，以及直接加到mRNA 3′端上入多速nRNA一这化入加使腺苷酸化序列及促使加入这一多聚腺苷酸化序列的类似多聚腺苷酸化信号序列。

因此，根据本发明的另一个方面，本发明进一步提供适于在植物中表达B.t.杀虫蛋白质的融合基因构建体，所说的融合基因构建体在其5′至3′方向上包含：

1.5′端非编码区；

2.编码B.t.杀虫蛋白质的氨基端部分的约586个和608个氨基酸的核苷酸序列或其同源序列；以及

3.3′端非编码区：

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明的融合基因构建体中，所说的5′端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个外源基因在植物细胞内翻译过程中起促进作用的编码核糖体结合蛋白质的序列组成。

根据本发明的另一个特别优选的实施方案，所说的5′端非编码区由四个以相反方向连接的增强子序列，两个启动子序列，两个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列，及两个核糖体结合蛋白质编码序列组成，如图39所示。因此，在本发明的这一实施方案中，本发明提供适于在植物细胞中表达B.t.杀虫蛋白质的所谓＂加倍双向＂融合表达载体。

在本发明的融合基因表达载体中，除了上述本发明的B.t杀虫蛋白质的DNA编码序列外，其他位于所说编码序列两侧翼(即5′和3′端边界区域)的用于调节和控制该编码序列在植物细胞中转录和翻译的序列都是本领域已知的和容易得到的。例如，本发明使用的所说的衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列是Ω序列。Ω序列由68bp组成，富集TTAAC序列，5′端有一个UAUUUUUACAACAAT序列以及4个UUAC序列，这些序列在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点(Richards et al.，Eur.J.Biochem.84：513-519，1987)。其中本发明使用的促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白质的序列是如Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak et al.，Nucleic Acids Research12：857-872，1984；Cell，44：283-292，1986)。

适于与本发明B.t.杀虫蛋白质编码序列连接，并在植物细胞中启动该编码DNA序列转录开始的启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性启动子。例如它们包括但不只限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子，mannopine合成酶(MAS)启动子，胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子，玉米乙醇脱氢酶启动子，以及二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶小亚基启动子等。其中，本发明优选的是CaMV35S启动子。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明的融合基因构建体中，所说的3′端非编码区包括一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工序列，一个类似多聚腺苷酸化信号序列及多聚腺苷酸化序列。这些调节和控制序列可以是载体质粒载体中天然固有的，或在其被转化到适当的克隆宿主中之后，在dNTP及适当的DNA合成酶和DNA连接酶的存在与作用下，利用各种已知的技术加入的。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的编码区具有如图1中所说的核苷酸序列或其同源序列。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的编码序列及其5′和3′端侧翼序列是以化学方法合成的。

然而，在本发明的一个优选的实施方案中，上述这些3′端调控序列，基本上都是根据我们的预先设计而人为合成的。本领域技术人员可以理解到，建立在大量理论研究工作基础上的这一实践本发明的实施方案，必将更有利于提高我们制备的B.t.杀虫蛋白质编码序列在植物细胞中的表达效率及其稳定性和准确性。

例如，在本发明的一个特别优选的实施方案中，我们设计并合成了直接连接于前述B.t.杀虫蛋白质结构基因3′端的寡核苷酸5′-TAAGTAGGTGA-3′组成的多联终止密码子序列在该包含十一个核苷酸的短序列中，包括有三个终止密码子(划下线部分)。从而既使在对其左翼的结构基因序列的翻译过程出现错读，也将得以正确终止。另外，在本发明的融合基因构建体的3′端非编码区中，我们设计并在上述多联终止密码子的3′侧连接有一个多聚腺苷酸化poly(A)序列。这样将避免即使在转录后加工过程中由于未知机制不能加入该poly(A)序列时所导致的不利于mRNA稳定的问题。

另外，适用于本发明融合基因构建体还可以包括衍生于花椰菜花叶病毒，Nopaline(Nos)基因及其类似物的终止子。在本发明的一个实施方案中，我们使用了Nos基因的终止子。

为了提高本发明的表达B.t.杀虫蛋白质的基因在单子叶禾木科植物中的表达效率，可在结构基因与启动子序列之间加入适当大小的内含子序列，例如，玉米乙醇脱氢酶基因的第一内含子(参见Gene and Development 1：1183-12001987)、衍生于蓖麻植物的过氧化氢酶基因的第一内含子(参见Tanaka et al.，Nucleic Acids Research 18：6767-6770，1990)等。

可使用本领域中已知的方法将本发明的适于在植物细胞中表达B.t.杀虫蛋白质的融合基因构建体连接到任何一种可在植物细胞自我复制并进行上述表达的载体上。这样的载体例如包括衍生于pUC19的质粒pGUC20，pBI121.1和pBI121.2(Jefferson，et al.，EMBO J.16：3901，1987)，衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19(Gene 1031985)，以及经过不同的修饰而造成不同的多克隆酶切位点的一系列统称为pGEM的质粒载体(由Promega公司生产)。上述各种质粒载体，特别适用于携带上述本发明融合基因构建体的载体是pUC19、pGU20和pBI121.1及pBI121.2，后者特别适于作为制备加倍双向重组表达载体的工具质粒载体或起始质粒载体。

当然，如前所述，为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组的融合表达载体还进一步含有选择标记和报告基因。所使用的选择标记和报告基因的两侧可带有各自的调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记和报告基因是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同的载体中。本发明优选的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶(NPT II)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因并一同包含于同一个重组表达载体内，从而保证了对被转化细胞或植株选择的可靠性。

根据布达佩斯条约的规定，申请人已于1995年12月22日将转化到大肠杆菌DH5α宿主细胞中的本发明构建的融合表达载体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏登记号为CGMCC NO.0247。

如前所述，为了在植物细胞中特别是整株植物中表达杀虫蛋白质，以赋予整株植物及其种子和后代以杀虫能力，必须使用适当的方法将按上述方法制备的携带本发明的合成的编码B.t.杀虫蛋白质的编码序列的重组表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内，

将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但不只限于使用农杆菌(Agrobaeterium)作为植物病原体所介导的Ti-质粒的致病转化法(Pathogenic transformation)、PEG介导的原生质体融合法，脂质体转移法以及外源基因的基因直接转移法等。

一种特别令人感兴趣的在整体植株中导入外源基因的方法是本发明改进的所谓子房注射植物受精胚囊法(参见Zhouet al.，等，Enzymol.Method.101：433-481，1983)。该方法的基本操作步骤包括在成熟植株受精的适当阶段，在受精胚囊刚形成时，切断植物部分，将外源基因涂抹于所说的切割断面上或注入到受精子房内的适当部位，并恰好在胚囊的珠孔和珠心孔道开放及受精过程中，进入胚囊，与受精卵结合，进而整合到植物受精卵细胞的基因组中。尽管这种胚囊法成功的几率相对与操作经验有关，但方法的操作步骤简单，易于实现。而且也可较快地检测到转基因工程植株。

因此，根据本发明的另一个方面，本发明提供了将携带本发明的编码B.t.杀虫蛋白质DNA序列的融合表达载体导入植物体内的方法，其特征在于当受体植物恰好处于受粉后约8-24小时时，借助微量注射器，将所说重组表达载体导入植物胚囊内，然后选择和筛选被转化的植物或其部分或所说植物的种子。

根据本发明的这方面的一个优选实施方案，其中所说的注射是在植物受粉后约10-24小时进行的。

根据本发明的这一方面的一个优选实施方案，其中所说的用于注射携带外源基因的融合载体的是25-50微升的微量注射器。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了用融合基因表达载体转化的对植物害虫特别是鳞翅目昆虫有抗性和杀死能力的转基因植物，其中所说的融合基因表达载体包括：

1).5′端非编码区；

2).编码与B.t.杀虫蛋白质的氨基端部分同源的约586个和608个氨基酸的核苷酸序列或其同源序列；以及

3).3′端非编码区。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的5′端非编码区和3′端非编码区分别具有如前所述的构成元件及其功能。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的编码区域具有如附图1中所示的核苷酸序列或其等同功能性同源序列或突变体。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的编码基因序列及其5′和3′端侧翼序列是以化学方法合成的。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的转基因植物是转基因棉花。

这里应特别指出的是，虽然在本发明下述实施例中以转基因棉花的产生举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味本发明制备的编码B.t.杀虫蛋白质基因的DNA序列及携带该DNA序列的重组融合表达载体只用于转化和生产具有抗虫能力的转基因棉花。

因此，使用本发明的携带B.t.杀虫蛋白质编码序列的，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何已知的适于表达B.t.杀虫蛋白质的植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的导入了外源杀虫蛋白质基因的，具有杀伤或控制植物敏感害虫之能力的植物，其后代及其种子和植物部分，均包括在本发明之内。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了产生对昆虫害虫有抗性和杀死能力的植物的方法，该方法包括：

1).合成包括编码B.t.杀虫蛋白质之氨基端序列的核苷酸序列或其同源序列，和其5′端及3′端非编码区的融合基因序列；

2).将步骤1)中合成的所说的融合基因序列与适当的植物表达载体连接，得到能够在植物细胞或整株植物中表达所说的杀虫蛋白质的重组融合表达载体；

3).将步骤2)中得到的重组融合表达载体转化或转染到植物细胞内并整合到所说植物细胞的基因组中；

4).以细胞或组织培养技术由步骤3)得到细胞或其组织再生整株植物。

根据本发明的另一个方而.本发明提供了产生对害虫有抗性和杀死能力的植物的方法，该方法包括：

1).合成包括编码B.t.杀虫蛋白质之氨基端氨基酸序列的核苷酸序列或其同源序列和位于该序列的5′端及3′端非编码区的融合基因序列；

2).将步骤1)中合成的所说的融合基因序列与适当的植物表达载体连接，得到能够在植物细胞或整株植物中表达所说的杀虫蛋白质的重组表达载体；

3).将步骤2)中提到的重组表达载体导入到成熟的整株植物的受精卵细胞中并整合到其基因组中；

4).由步骤3)中得到的受精卵细胞发育成植物种子，并进而产生对昆虫害虫有抗性或杀死能力的植物及其后代

根据本发明另一个优选实施方案，其中为产生所说的转基因植物的目的，将本发明的重组表达载体导入成熟受体植物受精卵细胞中的方法是如上文所述的，本发明人称之为“子房注射外源基因转化植物受精胚囊法”(简称“子房注射法”)的方法。

可用本发明的编码B.t.杀虫蛋白质之DNA序列的重组基因载体转化的受体植物可以是双子叶或单子叶植物，例如包括但不只限于棉花(例如陆地棉，海岛棉、野生棉)和向日葵等锦葵科植物(Ma1vacoue)；玉米、水稻、小麦等禾木科植物(Gramineae)；苜蓿、大豆、三叶草、绿豆、豌豆等豆科植物(Leguminosae)；甘蓝、萝卜、油菜等十字花科植物(Cruciferae)；烟草、马铃薯、蕃茄、胡椒等茄科植物(Solwna ceae)；甜瓜、黄瓜等葫芦科植物(Cucurbitaceae)；胡萝卜、芹菜、欧洲防风等伞形科植物(Umbelliferae)；甜菜等藜科植物(Chenopodiaceae)，以及各种观赏植物、药用植物和杨树、松树、葡萄树等乔木和灌木植物。

图1显示编码杀虫蛋白质的结构基因序列。图2显示编码杀虫蛋白质的合成基因及调控序列。图3显示合成基因的5′端调控序列。图4显示合成基因的3′端调控序列。图5显示2个增强子和35S启动子的序列。图6图解显示基因小片段合成结构基因及构建载体的程序。图7显示合成的GFM1-(1-8个)寡核苷酸片段及GFM1(片段1)双

链DNA序列。图8显示合成的GFM2-(1-10个)寡核苷酸片段和GFM2(片段2)

双链DNA序列。图9显示合成的GFM3-(1-8个)寡核苷酸片段和GFM3(片段3)双

链DNA序列。图10显示合成的GFM4-(1-9个)寡核苷酸片段和GFM4(片段4)

双链DNA序列。图11显示合成的GFM5-(1-9个)寡核苷酸片段和GFM5(片段5)

双链DNA序列。图12显示合成的GFM6-(1-11个)宿寡核苷酸片段及GFM6(片段

6)双链DNA序列。图13显示合成的GFM7-(1-6个)寡核苷酸片段和GFM7(片段7)

双链DNA序列。图14显示合成的GFM8-(1-10个)寡核苷酸片段和GFM8(片段8)

双链DNA序列。图15显示合成的GFM9-(1-11个)寡核苷酸片段和GFM9(片段9)

双链DNA序列。图16图解显示质粒pGE35SP的构建。图17图解显示质粒pG2E35SΩK的构建。图18图解显示质粒pGΩK的构建。图19图解显示质粒pGUT4A的构建。图20图解显示质粒pGB-1的构建。图21图解显示质粒pGB-2的构建。图22图解显示质粒pGB-3的构建。图23图解显示质粒pGB-4的构建。图24图解显示质粒pGB1-2的构建。图25图解显示质粒pGB1-3的构建。图26图解显示质粒pGB1-4的构建。图27图解显示质粒pGPB.t.F1-4的构建。图28图解显示质粒pGB-5的构建。图29图解显示质粒pGB-6的构建。图30图解显示质粒pGB6-7的构建。图31图解显示质粒pGB5-7的构建。图32图解显示质粒pGB-8的构建。图33图解显示质粒pGB8-9的构建。图34图解显示质粒pGB5-9的构建。图35图解显示质粒pGBPB.t.F1-9的构建。图36图解显示质粒pGB.t.的构建。图37图解显示质粒pGB4AB的构建。图38图解显示质粒pGBI4AB的构建。图39图解显示质粒pGBI4A2B的构建。图40显示子房注射外源基因转化植物受精胚囊示意图。图41显示抗虫转基因棉花的PCR检测。图42显示抗虫转基因棉花的Southern杂交检测。

a)杀虫蛋白质的结构基因

本发明的编码杀虫蛋白质氨基端1-445个氨基酸序列，来于B.t.K.变种HD-1的杀虫蛋白质基因Cry IA(b)序列。编码虫蛋白质羧基端446-608个氨基酸序列来源于B.t.K.HD-73的虫蛋白质基因序列(见图1)。合成基因的64种密码子中氨基酸的种编码密码子用法如表1所示；20种氨基酸中每种氨基酸的用法表2所示；合成基因编码杀虫蛋白质氨基酸的密码子用法如表3示；合成基因密码子XXC/G和适合于植物密码子XXC/G以及原B.毒素密码子XXC/G的使用如表4所示；合成基因编码杀虫蛋白质基酸的密码子适合于在植物中表达的密码子用法和密码子一致分布如表5所示。合成基因序列中已不存在干扰在植物细胞中表的ATTTA、AATAA、AATAAT序列(如图1所示)。该基因不仅基本保了原B.t.毒素蛋白质的氨基酸序列，更适合于在植物中表达的码子用法和一致性，而且由于在合成基因的5′端和3′端非编码加入了表达调控元件序列，从而使该基因更适合于在植物中高表达(参见图2)。表1.编码杀虫蛋白质合成基因中密码子的用法

三联体数  编  码  占总密码子密码子目  氨基酸  数的百分数	三联体数  编  码   占总密码子密码子目  氨基酸   数的百分数
		AUG    8    Met    1.3158AUC   30    Ile    4.9342AUU   14    Ile    2.3026AUA    2    Ile    0.3289GUU   21    Val    3.4539GUG   15    Val    2.4671GUC    4    Val    0.6579GUA    1    Val    0.1645UUC   27    Phe    4.4400UUU    9    Phe    1.4803UUG   20    Leu    3.2895CUC   16    Leu    2.6316CUU    8    Leu    1.3158CUG    3    Leu    0.4934CUA    2    Leu    0.3289UUA    0    Leu    0.0000UCC   20    Ser    3.2895AGC   17    Ser    2.7961UCU   15    Ser    2.4671AGU    7    Ser    1.1513UCA    3    Ser    0.4934UCG    0    Ser    0.0000CCA   18    Pro    2.9605CCU    8    Pro    1.3158CCC    5    Pro    0.8224CCG    1    Pro    0.1645ACC   16    Thr    2.6316ACU   11    Thr    1.8092ACA   10    Thr    1.6447ACG    0    Thr    0.0000GCU   18    Ala    2.9605	GCC    9    Ala    1.4803GCA    8    Ala    1.3158GCG    0    Ala    0.0000UAC   16    Tyr    2.6316UAU    9    Tyr    1.4803CAC   10    His    1.6447CAU    0    His    0.0000CAA   16    Gln    2.6316CAG   11    Gln    1.8092AAC   33    Gln    5.4276AAU   11    Gln    1.8092AAG    2    Lys    0.3289AAA    0    Lys    0.0000GAC   15    Asp    2.4671GAU   10    Asp    1.6447GAG   15    Glu    2.4671GAA   14    Glu    2.3026UGC    2    Cys    0.3289UGU    0    Cys    0.0000UGG   10    Trp    1.6447AGA   16    Arg    2.6316AGG   14    Arg    2.3026CGU   10    Arg    1.6447CGC    2    Arg    0.3289CGA    1    Arg    0.1645CGG    0    Arg    0.0000GGA   21    Gly    3.4539GGU   18    Gly    2.9605GGG    4    Gly    0.0066GGC    2    Gly    0.3289

表2.合成基因编码杀虫蛋白质的20种氨基酸的用法

氨基酸  氨基酸  占B.t.氨基酸名称    数  目  总数的百分比	氨基酸  氨基酸  占B.t.氨基酸名称    数目    总数的百分比
		蛋氨酸    Met    8    1.316	组氨酸    His    10    1.645
异亮氨酸  Ile   46    7.566	谷氨酰胺  Gln    27    4.441
		缬氨酸    Val   41    6.743	天冬酰胺  Asn    44    7.237
苯丙氨酸  Phe   36    5.921	赖氨酸    Lys     2    0.329
		亮氨酸    Leu   49    8.059	天冬氨酸  Asp    25    4.112
丝氨酸    Ser   62   10.197	谷氨酸    Glu    29    4.770
		脯氨酸    Pro   32    5.263	半胱氨酸  Cys     2    0.329
苏氨酸    Thr   37    6.086	色氨酸    Trp    10    1.645
		丙氨酸    Ala   35    5.757	精氨酸    Arg    43    7.072
酪氨酸    Tyr  25     4.112	甘氨酸    Gly    45    7.401

表3.合成基因编码的20种氨基酸中各氨基酸密码子的用法

氨基酸    密码子   占编码该a.a.名称      及数目  密码于总数％	氧基酸    密码子  占编码该a.a．名称      及数目  密码子总数％
		蛋氨酸  Mel AUG  8   100.0	UAC 16    64.0酩氨酸  Tyr UAU  9    16.0
AUC  30  65.2异亮氨酸Ile  AUU 14   30.4AUA  2    4.3
	CAC 10   l00.O组氨酸  His CAU  0     0.0
		GUU  21   51.2GUC  15   36.6缬氨酸  Val GUC   4    9.8GUA   1    2.4	CAA 16    59.3谷氨酰胺Gln CAG 11    40.7
AAC 33    75.0天冬酰胺Asn AAU 11    25.0
	UUG  27   75.0苯丙氨酸Phe UUU   9   25.0
		AAG  2   100.0赖氨酸  Lys AAA  0     0.0
UUG  20   40.8CUC  16   32.7CUU   8   16.3亮氨酸  Leu GUG   3    6.1CUA   2    4.1UUA   0    0.O
	GAC 15    60.0天冬氨燃Asp GAU 10    40.0
		GAG 15    51.7谷氨酸 Glu  GAA 14    48.3
	UCC  20   32.3AGC  17   27.4UCU  15  24．2丝氨酸  Ser AGU   7   11.3UCA   3    4.8UGG   0    0.0		UGG  2   100.0半胱氨酸Cys UGU  0     0.0
色氨酸  Trp UGG 10   l00.0
		CCA  18   56.3CCU   8   25.0脯氨酸  Pro CCC   5   15.6CCG   1    3.1
	AGA 16   57.2AGG 14   32.6CGU 10   23.3精氨酸  Arg  CGC  2    4.7CGA  1    2.3CGG  0    0.0
ACC  16   43.2ACU  11   29.7苏氨酸Thr   ACA  10   27.OACG   0    0.0
		GCU  18   51.4GCC   9   25.7丙氨酸  Ala GCA   8   22.9GGG   0    0.0	GGA 21   46.7GGU 18   40.0甘氨酸  Gly  GGG  4    8.9GGC  2    4.4

表4.植物基因编码氨基酸密码子XXG/C的用法与合成B.t.、

野生B.t.基因密码子XXG/C的用法比较

氨基酸      密码   植物中     GFM中    WB.t.中名称         子  n  XXG/C％  n XXG/C％ n XXG/C％	氨基酸    密码   植物中    GFM中    WB.t.中名称      子   n XXG/C％ n XXG/C％ n XXG/C％
		蛋氨酸  Met AUG 1356  100    8   100   40  100	UAC 1267    16        42酪氨酸  Tyr UAU  743 63  9   64  161    21
AUC 1374        30         54异亮氨酸Ile AUU 1241   44   14    65  133   22AUA  505         2         63
	CAC  625    l0         9组氨酸  His CAU  575 52  0  100   70    11
		GUU 1478        21         82GUG 1654        15         54缬氨酸  Val GUC 1045   55    4    47   38   32GUA  491         1        111	CAA 1912    16       142谷氨酰胺Gln CAG 1465 43 11   41   27    16
AAC 1646    33        78天冬酰胺Asn AAU 1137 59 11   75  208    27
	UUC 1597        27         45苯丙氨酸Phe UUU 1047   60    9    75  148   23
		AAG 2241     2        32赖氨酸  Lys AAA 1139 66  0  100  104    24
UUG 1185        20         32CUC 1189        16         12CUU 1273         8         62高氨酸  Leu CUG  792   59    3    80   23   20CUA  434         2         59UUA  412         0        154
	GAC 1441    15        54天冬氨酸Asp GAU 1458 50 10   60  167    24
		GAG 2102    15        76谷氨酸  Glu GAA 1616 57 14   52  234    25
	UCC  896        20         46AGC  887        17         28UCU 1009        15         67丝氨酸  Ser AGU  581   48    7    59   82   32UCA  768         3         72UCG  343         0         29		UGC  647     2        18半胱氨酸Cys UGU  432 60  0  100   31    37
色氨酸  Trp UGG  709 100 10 100   64   100
		CCA 1507        18         90CCU 1063         8         55脯氨酸  Pro CCC  755   33    5    19    7   24CCC  492         1         38
	AGA  707     16      113AGG  742     14       28CGU  534     10       52精氨酸  Arg CGC  520 51   2  38   12   19CGA  214      1       33CGG  198      0        8
ACC 1082        16         38ACU  990        11         67苏氨酸  Thr ACA  745   45   10    43  104   35ACG  343         0         55
		GCU 1901   18              79GCC 1548    9              27丙氨酸  Ala GCA 1156   41    8    26   75   32GGG  546   41    0         46	GGA 1629     21      129GGU 1477     18       68甘氨酸  Gly GGG  731  39  4  13   48   30GGC 1179      2       38

表5.植物基因编码氨基酸密码子的用法与合成B.t.、

野生B.t.基因密码子的用法比较

氨基酸      密码  植物中  GFM中  WB.t.中名称         子    n  ％  n  ％   n   ％	氨基酸     密码  植物中  GFM中 WB.t.中名称        子    n  9％  n  ％  n  ％
		蛋氨酸  Met  AUG 1356 100 8 100  40  100	UAC 1267  63 16 64  42  21酪氨酸  Tyr UAU  743  37  9 16 161  79
AUC 1374  44 30 65  54   22异亮氨酸Ile  AUU 1241  40 14 30 133   53AUA  505  16  2  4  63   25
	GAG  625  52 10 100  9  11组氨酸  His CAU  575  48  0  0  70  89
		GUU 1478  34 21 51  82   29GUG 1654  31 15 37  54   19缬氨酸  Val  GUC 1045  24  4 10  38   13GUA  491  11  1  2 111   39	CAA 1912  57 16 59 142  84谷氨酰胺Gln CAG 1465  43 11 41  27  16
AAC 1646  59 33 75  78  27天冬酰胺Asn AAU 1137  41 11 25 208  73
	UUC 1597  60 27 75  45   23苯丙氨酸Phe  UUU 1047  40  9 25 148   77
		AAG 2241  66  2 100 32  24赖氨酸  Lys AAA 1139  34  0  0 104  76
UUG 1185  22 20 41  32    9CUC 1189  22 16 33  12    4CUU 1273  24  8 16  62   18亮氨酸  Leu  CUG  792  15  3  6  23    7CUA  434   8  2  4  59   17UUA  412   8  0  0 154   45
	GAC 1441  50 15 60  54  24天冬氨酸Asp GAU 1458  50 10 40 167  76
		GAG 2102  57 15 52  76  25谷氨酸  Glu GAA 1616  43 14 48 234  75
	UCC  896  20 20 32  46   14AGC  887  20 17 27  28    9UCU 1009  22 15 24  67   21丝氨酸  Ser  AGU  581  13  7 11  82   25UCA  768  17  3  5  72   22UCG  343   8  0  0  29    9		UGC  647  60 2 100  18  37半胱氨酸Cys UGU  432  40 0   0  31  63
色氨酸  Trp UGG  709 100 10 100 64 100
		CCA 1507  39 18 56  90   47CCU  1063  28  8 25  55   29脯氨酸  Pro CCC   755  20  5 16   7    4CCG   492  13  1  3  38   20
	AGA  707  24 16 37 113  46AGG  742  26 14 33  28  11CGU  534  18 10 23  52  21精氨酸  Arg CGC  520  18  2  5  12   5CGA  214   7  1  2  33  13CGG  198   7  0  0   8   3
ACC  1082  34 16 43  38   14ACU   990  31 11 30  67   25苏氨酸  Thr ACA   745  24 10 27 104   39ACG   343  11  0  0  55   21
		GCU  1901  37 18 51  79   25GCC  1548  30  9 26  27   12丙氨酸  Ala GCA  1156  22  8 23  75   22GGG   546  11  0  0  46   20	GGA 1629  32 21 47 129  46GGU 1477  29 18 40  68  24甘氨酸  Gly GGG  731  15  4  9  48  17GGC 1179  24  2  4  38  13

b)合成基因的5′端非编码区序列

合成基因5′端非编码区的表达调控序列，对该基因在植物中的高效表达是致关重要的。Kay等人(Science 236：1299-1302，1987)，Odell等人(Plant Mol.Biot.10：263-273，1988)和方荣祥等人(The Plant Cell，1：142-150，1989)的研究证明，5′端非编码区的启动子，更是致关重要的。在目前众多的启动子中，CaMV35S启动子在植物整体中的表达效率最佳。Odell等进一步研究证明，将35S启动子上游的增强子增加到2个，使报告基因(GUS)在植物中的表达水平提高8-10倍。因此本发明在构建的融合基因中，在35S启动子的上游增加了2个增强子序列，以利于合成基因的表达(如图2所示)。

Richards等人(Eur.J.Biochem.84：513-519，1978)分析和研究了TMV的Ω序列和功能。Ω序列由68bp组成，富集7个AAC序列且在5′端有一个UAUUUUUACAACAAT序列以及4个UUAC序列，这些序列是合成蛋白质的翻译过程中核糖体和rRNA的结合的位点(真核18S rRNA，原核16S rRNA)。所以Ω序列是提高蛋白质表达量的又一关键序列之一。Kozak等人(Nucleic Acid.Res.12：857-872,1984；Cell，44：283-292，1986)在研究真核细胞rRNA翻译蛋白质的效率时发现，启始密码子ATG的上游边界序列也非常重要。编码相同蛋白质的mRNA，使用不同的ATG边界序列即所谓kozak序列，产生蛋白质的效率不同。Lütcke等人(EMBO.J.6(1)：43-48.1987)进一步分析研究了209种动物和61种植物mRNA的ATG边界序列后发现，动物mRNA中ATG的边界序列为CACCATG，而植物为AACA ATG G。这样的结构可形成一个环式结构处在帽子结构和启始密码之间，成为一个更有利于40S提前结合启始的完成；也是一个蛋白质结合帽子(Cap-binding-protein)结构，更有利于RNA产生蛋白质的速度和协助增强蛋白质表达的能力。本发明在构建载体时，在合成基因的同时插入了ATG与Kozak序列(AACA ATG G)，从而更加有利于提高合成基因在植物中表达的协同作用(如图3所示)。c).合成基因的3′端非编码区序列

如本领域技术人员所熟知的真核生物基因的表达，除了5′端非编码区的调控表达元件之外，基因3′端非编码区的调控元件也是影响基因高效表达的重要因素。例如，基因转录成mRNA后，如果不能及时加入poly(A)尾巴，将会很快被3′-5′核酸外切酶降解掉。mRNA在细胞内存在的半衰期越长，产生出的蛋白质量就越多。为了延长mRNA的半衰期，转录后的mRNA就必须迅速在3′端加入poly(A)尾巴，以防止核酸外切酶的降解。因此本发明在合成基因的3′端非编码区加入了一个合成的poly(A)序列。然而，Ingelbrecht等人(The Plant Cell，1：671-680，1989)在提高外源基因在植物细胞中表达效率的研究中发现，在基因的3′端非编码区仅有poly(A)信号序列，不一定能使外源基因得以高效表达。而在植物细胞中能高效表达的基因经3′端缺失研究证明，在3′端都有类似AATAAA信号序列功能的3′端加工序列YGTGTTYY，(其中Y可代表T、C中的任何一种碱基)，将3′端加工序列与poly(A)信号序列联用，可使基因的表达水平提高30-60倍。为了提高mRNA的稳定性，延长mRNA的半衰期，Gallie等人(The Plant Cell 1：301-311，1989)在基因3′端的非编码区加入了一段加工序列，结果使基因表达水平提高了2-5倍。他们进一步研究证明，在基因的5′端加入Ω序列，同时在基因的3′端加入poly(A)序列联合使用，结果使外源基因转录的mRNA的翻译水平提到了16-18倍。因此，本发明在合成基因的3′端进一步加入了合成的poly(A)序列，切割序列(CATTG)和3′端具有类似poly(A)信号的(TGTGTTTCT)加工序列(如图4所示)。

给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。实施例一：编码B.t.杀虫蛋白质的结构基因的制备1).寡核苷酸片段的制备

为了合成编码杀虫蛋白质结构基因，我们首先将所说的基因分成9个大片段(GFM1-9)，然后再进一步把每个大片段的双链DNA的两条链分成碱基数目不同的若干寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的制备可通过已知的标准方法(Matteucci etal J.Am.Chem.Soc.103：3185-3192，1981；Beallcageet al Tetrahedron Lett.22：1859-1862，1981；Bioresearch公司DNA合成仪操作说明书)合成。本发明使用Bioresearch公司的DNA合成仪制备所有寡核苷酸片段。寡核苷酸片段合成后，用28％氨水去保护，然后从柱上洗脱下来后，按照McDridge等人的方法(Biotechniques 6：362-367，1988)用寡核苷酸片段纯化柱(OPC柱，Applied Biosystems)或Oligo反相纯化柱纯化合成的寡核苷酸片段。加入2/3体积冷无水乙醇，1/10体积醋酸钠(3M，pH4.8)，混均匀后，置-70℃低温下10分钟，15000转/分，离心15分钟，沉淀寡核苷酸片段。去掉上清液，冷冻抽干，加适量灭菌的去离子水后在DU70紫外分光光度计(Beckman公司)上测定含量并将所有寡核苷酸片段定量为3μg/μl。编号分组后放-30℃冰箱保存，用于制备双链DNA片段。2.GFM1双链DNA片段的制备

从-30℃冰箱中取出编号为GFM1-(1-8)的8个寡核苷酸单链DNA片段，各取10μl分别对号加入到编号相同的GFM1-(1-8)8个1.5ml新的灭菌管中，0℃放置15分钟。根据试剂(Pharmacia公司)使用说明分别加入T4多聚核苷酸激酶(终浓度：70mM Tris-HCl pH7.6，10mM MgC12，5mM DTT，67mM ATP)10x缓冲溶液10μl，再各加10个单位的T4多聚核苷酸激酶，补加灭菌去离子水使最终体积为100μl，混匀后在37℃反应1小时，使GFM1-(1-8)8个寡核苷酸单链DNA片段的5′端磷酸化。

退火连接形成GFM1双链DNA片段。因GFM1-(1-4)4个寡核苷酸单链DNA片段与GFM1-(5-8)4个寡核苷酸单链DNA片段是相互配对的互补链，所以进行退火连接后，可以形成GFM1双链DNA片段。将磷酸化的GFM1-(1-8)8个寡核苷酸单链DNA片段，各取5μl放入同一个1.5ml灭菌的试管中，加10μl 10×缓冲液的T4 DNA连接酶反应液，并加入灭菌去离子水至90μl，混匀后，95℃放置10分钟。慢慢降温退火至室温，在0℃下放置10分钟，加入50单位的T4 DNA连接酶(BoehringerMannheim公司)，并补加去离子水使终体积至100μl后16℃过夜连接形成GFM1双链DNA片段，并参于基因的合成。制备过程如图6所示。

电泳分离GFM1双链DNA片段。称取2g低融点琼脂糖粉(华美公司)，放入250ml三角瓶中，加100ml的1×TAE(0.04MTris-乙酸，0.001M EDTA，pH8.0)的灭菌电泳缓冲液配制成2％的凝胶。融化后，冷却至约50℃左右加入100μl EB液溶(0.1mg/ml)，混均匀后倒入水平电泳槽中制胶，胶凝固后取出梳子，倒入TAE电泳缓冲液。将过夜连接后的GFM1混合溶液加至凝胶孔中，在4℃冰箱中，50伏电泳1.5小时后，在长波(360nn)紫外灯下，切下含有GFM1双链DNA大片段的凝胶块。放入灭菌的1.5ml小管中，加入200μl的TE(10mM Tris-HCIpH 7.2，1mM EDTA)缓冲液，放置65℃水浴30分钟，待胶融化后，放入-180℃液氮中5分钟。15000转/分离心10分钟，取上清液，得到电泳分离的GFM1双链DNA大片段溶液。纯化制备GFM1双链DNA大片段。加等体积用TAE饱和的重蒸苯酚溶液至电泳分离的GFM1双链DNA大片段溶液中，混匀后，0℃放置10分钟。然后在4℃下1000转/分离心10分钟，取含有DNA大片段的上清液，再加等体积的苯酚：氯仿(1：1)溶液，混匀后，重复上述离心过程。取含有DNA片段的上清液，加适量的正丁醇混匀，1000转/分离心3分钟，去掉上清中的正丁醇溶液，保留下层DNA溶液，并重复上述过程。此过程的目的，一是去掉DNA中的EB，二是使体积浓缩，直至浓缩的体积约100μl时。加入1/10体积的醋酸钠溶液(3M pH4.8)，加2/3体积的无水乙醇后置-70℃1小时并15000转/分离心10分钟。去上清后，收集沉淀的DNA片段，冷冻抽干，加适量的灭菌去离子水，在DU70紫外光光度计上测其含量，最后定量浓度为1μg/μl，从而制得GFM1双链DNA大片段，如图7所示。

本发明合成的所有寡核酸单链DNA片段，都有各自的互补序列，退火时可使单链寡核苷酸形成配对互补的双链DNA片段，并连接成大片段，直接产生出酶切位点的粘性末端或平末端。所以制备产生的GFMl双链DNA片段的5′端带有PstI酶切位点粘性末端，3′端带有NsiI序列和HindIII平末端，可直接用于克隆到pUC19载体的PstI和HindIII位点进行序列分析。该片段序列如图7所示。3.GFM2双链DNA片段的制备

按上文2中所述方法，从-30℃冰箱中取出编号为GFM2-(1-10)的10个寡核苷酸片段，进行磷酸化，退火连接形成GFM2双链DNA大片段，大片段的琼脂糖凝胶电泳分离并进-步纯化后得到GFM2双链DNA大片段。结果如图8所示。GFM2双链DNA大段的5′端有NsiI的粘性末端，可与GFM1 3′端的NsiI粘性末端片段连接。3′端有Hinc II平端接头可与载体pUC19质粒上的HincII相连接，进行克隆和测序。该片段序列如图8所示。4.GFM3双链DNA大片段的制备

按上文2中所述方法，从-30℃冰箱中取出编号为GFM3-(1-8)的8个寡核苷酸片段，进行磷酸化，退火连接并凝胶电泳分离，进一步纯化获得GFM3双链DNA大片段。GFM3大片段DNA的5′端有Hinc II酶切的平端，3′端有Xba I酶切位点可直接用于克隆到pUC19载体的Hinc II和Xba I位点并进行克隆和测序。该片段序列如图9所示。5.GFM4双链DNA大片段的制备

按上文2中所述方法，从-30℃冰箱中取出编号GFM4-(1-9)的9个寡核苷酸片段后，如上文所述，进行磷酸化，退火连接，电泳分离，进一步纯化获得GFM4双链DNA大片段。GFM4双链DNA大片段5′端有Xba I粘性末端，3′端有EocoR I酶切位点，可与pUC19载体的Xba I和EcoR I位点相连接，进行克隆和测序。该片段序列如图10所示。6.GFM5双链DNA大片段的制备

按上文2中所述方法，从-30℃冰箱中取出编号为GFM5-(1-9)的9个寡核酸片段，如上文所述，进行寡核苷酸片段的磷酸化，退火连接，电泳分离和纯化获得GFM5双链DNA大片段。GFM5大片段的5′端有Hpa I平端接头，3′端有Acc I粘性末端，可直接克隆到pGUC20载体上并进行克隆和测序。该片段序列如图11所示。7.GFM6双链DNA大片段的制备

按上文2中所述方法，从-30℃冰箱中取出编号为GFM6-(1-11)的11个寡核苷酸片段，进行5′端的磷酸化，退火连接并电泳分离和纯化获得GFM6的双链DNA大片段。GFM6大片段的5′端Acc I粘性末端和3′端有Nco I粘性末端位点，可直接克隆到pGUC20载体上并进行克隆和序列分析。该片段序列如图12所示。8.GFM7双链DNA大片段的制备

按上文2中所述方法，从-30℃冰箱中取出编号为GFM7-(1-6)的6个寡核苷酸片段，进行5′端的磷酸化，退火连接并电泳分离纯化获得GFM7双链DNA片段。GFM7大片段的5′端有Nco I粘性末端位点，3′端有Pst I粘性位点，可直接进行克隆和序列分析。该片段序列如图13所示。9.GFM8双链DNA大片段制备

按上文2中所述方法，从-30℃冰箱中取出编号为GFM8-(1-10)的10个寡核苷酸片段，5′端磷酸化，退火连接并电泳分离纯化获得GFM8双链DNA大片段。GFM8大片段的5′端有Pst I粘性末端和3′端Sma I平端可直接进行克隆和序列分析。该片段序列如图14所示。10.GFM9双链DNA大片段的制备

按上文2中所述方法，从-30℃冰箱中取出编号为GFM9-(1-11)的11个寡核苷酸片段，进行5′端的磷酸化、退火连接并电泳分离和纯化获得GFM9双链DNA大片段。该片段5′端为平端，可以与GFM8片段3′端的Sma I位点相连，其3′端有Sac I粘性末端，可直接进行克隆和测序。该片段序列如图15所示。11.编码杀虫蛋白质结构基因的合成

将测序正确的9个GFM1-9双链DNA大片段进行亚克隆和拼接，合成编码杀虫蛋白质的结构基因，其全序列如图1所示。实施例二：表达调控元件的构建1.加倍增强子元件的构建：0dell等人研究证明，35S启动子上带有增强基因表达的增强子序列，它位于35S启动子的-90bp(EcoR V)和-39 3bp(Acc I)酶切位点之间。所以用HindIII和Sma I酶切pBIl21.1质粒DNA(Jefferson et al EMBO.J.6(13)：1301-1307，1987)后，可通过上文所说的凝胶电泳分离纯化DNA片段的方法，分离纯化出0.8Kb的DNA片段。该DNA片段携带有35S启动子和1个增强子的序列。将该序列用于下文实施例三中所述的pG2E 35SΩ重组质粒的构建。人工合成一个含有HindIII酶切位点序列的正链引物(5′-CAAGCTTCATACAGAGCTCAATGAC-3′)和含有EcoR V酶切平端并与正链完全互补的负链引物(5′-ATCACATCAATCCACTTGC-3′)，通过PCR方法(Am.J.Hum Genet.37：172，1985)，以pBI121.1质粒DNA为模板，在总体积100μl反应混合物(10mMTris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl₂，50mM KCl，0.005％吐温20，0.005％NP-40，0.001％明胶，4种各200μ M的dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，2单位的Taq DNA聚合酶中进行30个反应循环，每个循环93℃，45秒；55℃，1分钟；72℃2分钟。得到380bp双链DNA片段。片段5′端含有Hind III酶切位点，3′端为EcoR V酶切位点。用于pG2E35SΩK的构建如图17所示。2.增强翻译蛋白质之表达的Ω和Kozak序列的制备：用上文所述的合成寡核苷酸片段方法，合成了互为引物又互为模板序列的寡核苷酸单链DNA片段，并通过上文所说的PCR方法，合成了91bp含有Ω和Kozak序列的双链DNA片段。该片段的5′端带有BamH I酶切位点，3′端带有合成编码杀虫蛋白质结构基因的ATG启始密码子和Kozak序列。在ATG启始密码子下游的+7位置有PstI酶切位点，以用于组装合成的编码杀虫蛋白质结构基因，如图3所示。3.合成基因的3′端非编码序列的制备

(1)多联终止密码子序列的制备：按上文所述的寡核苷酸片段合成方法，合成了两条寡核苷酸片段，经退火互补后形成如下所示的命名(UT)的多联终止密码子序列。该序列5′端含有一个Xho I酶切位点，可与合成基因3′端中的Xho I位点相连而不改变合成基因的读码框架。(UT)3′端含有一个HpaI平端酶切位点，可用于克隆多聚腺苷酸化序列(poly(A))，另外还带有一个Sac I酶切位点的粘性末端，可以直接连接到载体的Sac I酶切位点上。(UT)序列：

Xho I       Hpa I   Sac I5′-CACTCGAGGC TGAGTAAGTA GGTGAGTTAA CGAGCT-3′(36b)3′-GTGAGCTCCG ACTCATTCAT CCACTCAATTGC-5′     (32b)

(2)多聚腺苷酸化序列的制备：按上文所述的制备寡核苷酸片段方法，合成了两条寡核苷酸片段，退火后形成命名为poIy(1A)的多聚腺苷酸化序列。该poly(1A)序列的5′端为平端，3′端含有一个Dra I平端酶切位点和一个Sac I酶切位点粘性末端，从而可用于克隆下一个poly(1A)片段。Sac I酶切位点的粘性末端还可与载体上的Sac I位点相连接。poly(1A)序列如下：

                            Dra I  Sac I5′-AACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTAAAGAGCT-3′(39b)3′-TTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATTTC-3′    (35b)

(3)切割和加工调控序列的制备：按上文所述合成寡核苷酸片段方法，合成如下所示的4条寡核苷酸片段：GSP-1：5′-AACTTTGAGT ATTATGGCAT TGGAAAAGCC

       ATTGTTCTGC TTGTAATTTA CTGTGTTCTT-3′(60b)GSP-2：5′-TCAGTTTTTG TTTTCGGACA TCAAGTT-3′   (27b)GSP-3：3′-TTGAAACTCA TAATACCGTA ACCTTTTCGG-5′(30b)GSP-4：3′-TAACAAGACG AACATTAAAT GACACAAGAA

       AGTCAAAAAC AAAAGCCTGT AGTTCAA-5′   (57b)按上文所述的方法经磷酸化、退火连接并分离纯化DNA片段后，获得一条88bp的切割和类似AATAA的加工双链DNA片段。该片段含有2个切割序列(CATTG)和1个加工(TGTGTTC)序列，它们在转录后的表达调控中起着重要的作用。该序列的5′端序列(AAC)和3′端序列(GTT)，可插入Hpa I位点，而不使Hpa I位点失活，仍保持了Hpa I的酶切位点序列(GTTAAC)。该含有切割序列(Splicing sequence)和加工序列(Processingsequence)88bp的序列被命名为3′端GSP序列。可将3′端GSP序列片段直接克隆到pGUT4A质粒中的Hpa I位点上，得到了符合本发明设计要求的pGSPUT4A重组质粒。pGSPUT4A重组质粒携带有多联终止密码子序列(UT)，切割和加工序列(GSP)和多聚腺苷酸化序列poly(4A)，从而制得编码杀虫蛋白质合成基因所需的3′端非编码区的表达调控的元件序列(如图4所示)。实施例三：携带有非编码区序列的重组质粒的构建

1.重组质粒pG2E35sPΩ的构建

按下述程序制备用于本发明的克隆载体pUC19：首先在100ml LB培养基中(每升含10克NaCl，5克酵母提取物，10克胰蛋白胨，调pH至7.4)接种携带质粒pUC19的大肠杆菌DH5α菌株(本实验室保存)，置37℃振荡培养约12小时。培养后转入250ml离心管中，在4℃，5000 rpm离心5分钟，收集沉淀的菌体。然后用STE溶液(含有0.1N NaCl，10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)洗涤一次，再次离心收集菌体沉淀。用碱变性法(J.Sambrookel al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)提取质粒DNA。向菌体沉淀中加入5ml溶液I(50mM蔗糖，25mM Tris，10mM EDTA，pH8.0)，用旋涡混合器振荡，以使菌体沉淀完全悬浮。然后向细胞悬液中加入10ml新配制的溶液H(含有0.2N NaOH，1％SDS)，盖好离心管盖后轻轻上下颠倒几次，立刻冰上放置10分钟。再向管内加入7.5ml预冷的溶液III(3M KAc，pH4.8)，轻轻上下混匀数次，并在冰上放置15分钟。然后4℃，10,000rpm离心15分钟，收集上清液。向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀并在室温下放置10分钟。在室温下以10,000rpm离心10分钟，用70％乙醇将所得到的沉淀洗2次，并再次离心，去除乙醇。真空抽干DNA沉淀，并溶解于1nl TE缓冲液(10mM Tris，1nM EDTA)中。向所得溶液中加入RNA酶A(Promega公司)至浓度为200μg/nl，并于37℃保温0.5小时。将所得的DNA溶液分装于几个Eppendoff管中，分别用苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，每次加入抽提液后，摇匀1分钟，然后以12,000rpm离心10分钟，小心吸回上层水相。最后再加入1/10体积的3MNaAc(pH4.8)和2倍体积的无水乙醇，混匀后在冰上静置沉淀10分钟。在4℃，12,000rpm离心10分钟，除去上清，用70％乙醇洗DNA沉淀并真空抽干，然后重新溶解在200μl TE缓冲液中。取1μl样品在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，以粗略确定pUC19质粒DNA的浓度。

按如下程序及附图16所示的方法构建带有1个增强子及一个35S启动子的重组载体pGE35SP。在1.5ml Eppendoff管中加入2μl(约4μg)本实施例中所制备的DUC19质粒DNA，2μl多用酶切缓冲液(multi-core buffer)(Promega公司)，10U限制性内切酶Sma I(Promega公司，以下不再标出)，加重蒸水至20μl总体积。将酶切反应混合物于25℃水浴中保温1.5小时。然后向该反应体系中补加1μl限制性内切酶HindIII(12U)，37℃保温1.5小时后，65℃保温20分钟，以失活所用的限制性内切酶。

然后，电泳回收pUC19 Sma I-HindHI大片断，以去除Sma I-Hind III小片段对以后操作步骤的影响，将酶切后的DNA通过0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，并在长波紫外灯(365nm)观察DNA条带的位置。切下含有约2.7Kb的DNA片段的胶块。用冻融法回收该DNA片段，即先加200μl苯酚，液氮冷冻4分钟，取出融化，混匀后再用液氮冷冻。如此反复四次。然后以12,000 rpm离心10分钟，吸取上层水相并再次用氯仿抽提一次。向所回收的约200μl上清中加入20μl 3M NaAc(pH 4.8)和400μl无水乙醇，-20℃沉淀过夜。12,000rpm离心10分钟，并用70％乙醇洗所得DNA沉淀，再以12,000rpm离心5分钟。除去乙醇，真空抽干并用20μl重蒸水溶解沉淀的DNA。取1μl所回收的DNA，用DU70紫外分光光度计(Beckman公司)测260nm光吸收。经计算，回收的DNA浓度为150ng/μl。然后将如此得到的载体DNA与所合成的2E-.35S.P.片段相连接。在0.5ml Eppendoff管中进行如下连接反应。反应混合物包含14μl H₂ 0，2μl连接酶10×缓冲液，Iμl按上述方法所回收的载体DNA(约150ng)，2μl实施例2中所回收的1 E-35S.P.DNA(约100ng)以及1.5μl T4 DNA连接酶(4.5U)(Promega公司)。连接反应在18℃水浴中进行16～18小时。用所得到的连接混合物转化大肠杆菌。

按下述方法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。先用2ml LB培养基接种DH5α单菌落，并在37℃振荡培养过夜。然后将DH5α菌体细胞转入200ml LB培养基中37℃振荡培养2～3小时，至OD600约为0.6。取出培养瓶并置冰上30分钟。然后在无菌条件下将菌体悬浮液转移到离心管中，4℃，5,000rpm离心收集菌体细胞。然后加入40ml预冷的0.1M CaCl₂，再次离心，去除上清液。加入8ml 0.1M CaCl₂重新悬浮细胞沉淀，再加入1.2毫升甘油，混匀后按每管200μl分装于1.5ml Eppendoff管中，置于-70℃冰箱中保存备用。

转化时，取出三管感受态细胞，在冰上溶化后，一管加入10μl上述的连接产物；一管加入2μl连接时所用的经Sma I和HindIII切过的pUC19载体DNA(阴性对照)；一管加入1μl未切的pUC19载体DNA(阳性对照)。混匀后在冰上放置约30分钟。然后转至42℃水浴中热激90秒。再向各管中加入700μl液体LB培养基，在37℃振荡培养45分钟，然后分别将将菌体悬浮液铺敷在添加了100μg/ml氨苄青霉素的固体LB X-gal平板上(含800μgIPTG，600μg X-gal)，在37℃温箱中保温约18小时。保温后，取出平板观察转化结果，发现阴性对照平板上几乎没有菌落，阳性对照平板上出现密集生长的蓝色菌落。经连接的DNA转化的平板上出现许多白色的菌落。从该平板上选取白色菌落，接种于液体LB培养基中，于37℃振荡培养12～18小时，然后小量提取质粒DNA并用限制性内切酶Hind III和BamH I进行双酶切鉴定。选择酶切结果中出现2.7Kb和0.8Kb两条DNA带的克隆。如此得到定名为pGE35SP的重组质粒(如图16所示)。

接下来再将实施例2中经PCR获得的约380bp增强子DNA片段克隆到质粒pGE35SP上，以构建重组质粒pG2E35SP。方法步骤如下：在1.5ml Eppendoff管中进行如下酶切反应：5μl质粒pG2E35SP(约10μg)，4μl酶切缓冲液G，限制性内切酶Acc I20U加双蒸水至总体积为40μl。37℃保温2小时，65℃保温20分钟。利用绿豆芽核酸酶(Mung Bean Nuclease，Promega公司)将反应后的DNA的粘性未端切平。向酶切反应体系中补加5μlM.B.10×缓冲液，1μl绿豆芽核酸酶(90U)，4μl H₂O。37℃继续保温15分钟。用等体积的苯酚、苯酚-氯仿、氯仿抽提纯化反应后的DNA，每次抽提后，均小心吸回上清液。然后加5μl3M NaAc(pH4.8)，用二倍乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗后，用17μ1双蒸水溶解DNA沉淀。向所得DNA沉淀中加入2μl酶切缓冲液B和1μl限制性内切酶HindIII(16U)，于37℃反应1小时。65℃加热，20分钟失活所用内切酶之后，用2.0％琼脂糖凝胶电泳回收约3.1kb的Hind III-Acc I/M.B.大片段，并溶于20μl双蒸水中。

接下来进行构建重组质粒pG2E35SP的连接反应。在1.5nIEppendoff管中加入2μl所回收的pGE35SP Hind III-Acc I/M.B.大片段(约100ng)，2μl实施例2中经PCR而获得的约380bp增强子DNA片段(约50ng)，2μl连接酶10×缓冲液，12.5μl双蒸水，1.5μl T4 DNA连接酶(4.5U，Promega公司)。连接反应在18℃进行16-18小时。仍按上述转化方法，用所连接的DNA转化DH5α感受态细胞。所不同的是不需要在LB平板上加IPTG及X-gal。转化后，提取质粒DNA，选择能切下约0.8kb的Acc I-EcoR I片段的克隆。该重组质粒定名为pG2E35SP。

然后采用双脱氧法对所克隆上去的DNA片段进行序列分析，以确证所得到的重组质粒携带有正确的双倍增强子DNA序列。步骤如下：

将含有重组质粒pG2E35SP的重组体细胞在添加有氨苄青霉素100μg/ml的LB固体平板上划线。置37℃培养12～18小时后，选取单菌落并接种在5ml添加有氨苄青霉素100Dg/ml的液体LB培养基中，置37℃振荡培养12～18小时后，一部分做为菌种在4℃保存备用。取大约1.2ml菌体悬浮液在1.5ml Eppendoff管中小量提取质粒DNA(方法与实施例2中提取质粒pUC19的方法相同)。并用苯酚以及氯仿抽提纯化质粒DNA。乙醇沉淀后，将DNA溶于20μl重蒸水中，作为测序的模板DNA。

按如下方法对模板DNA进行变性处理。取大约2Dg待测序的质粒DNA加H₂O至32Dl，再加入8μl 2M NaOH，轻轻混匀，于室温(25℃)下放置10分钟后，再加入7Dl 3M NaAc(pH4.8)，4Dl H₂O和120μl无水乙醇，混匀并在冰上放置10分钟。最后以12,000rpm离心10分钟，除去上清，用70％乙醇将沉淀物洗涤两次，真空抽干，并将残留物重新溶解于10μl重蒸水中。然后加入2Dl测序引物，2μl退火缓冲液(200mM Tris·HCl PH7.5，100mMMgCl₂，250mM NaCl)，轻轻混匀，并瞬时离心。于65℃水浴中保温5分钟后，迅速转至37℃水浴中保温10分钟，最后在室温放置至少5分钟，再次瞬时离心，完成模板DNA与引物的退火。

然后按下述程序完成测序反应。在分别标记A、C、G、T的四个Eppendoff管中分别加入2.5μl四种双脱氧的终止反应液(80DM dGTP，80μM dCTP，80μM dATP，80DM dTTP，8μMdd(A、C、G、T)TP，50mM NaCl)，置于37℃水浴中预热。吸取2μl酶稀释缓冲液，加到置于冰上的Eppendoff管中，向各管内加入0.5μl测序用DNA聚合酶(Pharmacia公司)，混匀备用。立刻进行放射性同位素的标记反应，在上面得到的经过退火后的含有变性模板及引物的管中(体积为14μl)加入3μl标记混合液(180μM dGTP，dCTP，dATP，dTTP，50mM NaCl)，1μlα-³²P标记的dATP(10μCi)，以及2μl稀释后的测序用T7 DNA聚合酶，轻轻混匀后，室温放置5分钟。迅速向在37℃水浴中预热的标有A、C、G、T的四个管中分别加入4.5μl标记反应液，混匀、瞬时离心，于37℃放置5分钟。然后向各管中分别加入5μl终止液(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝和0.05％二甲苯蓝)，离心混匀，并于37℃放置2分钟，以完成测序反应。

使用DNA测序装置(Bio-Rad公司)制备测序用的聚丙烯酰胺凝胶，并以聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行测序测定。取50ml胶液(每500ml含甲叉双丙烯酰胺1.5g，丙烯酰胺28.5g，尿素240g，10×TBE缓冲液50ml)，加入180μl过硫酸铵和30μlTEMED(Sigma公司)，制备垂直板聚丙烯酰胺凝胶。在电泳装置的上下槽中加入1×TBE作为电泳缓冲液(0.09M Tris-硼酸，100mM EDTA)，预电泳1小时，以使测序板温度达到50℃左右。将上面制备好的待测样品置于80～90℃水浴中变性2～3分钟后，将样品按C、A、T、G的顺序分别加入到凝胶相邻的上样孔中，每个上样孔中加2～3μl。电泳约2小时，溴酚蓝走到板底部后，二次上样，然后继续电泳，以便读出更多的序列。待二次上样的溴酚蓝再次走到板底部时，结束电泳。然后，用X-光片在-70℃冰箱中放射自显影12～24小时。然后冲洗X光片，进行主序列的同源分析。下面所提及的序列分析均采用如上方法。

按下述程序及附图18所示的步骤构建携带有Ω序列的重组质粒pGΩK。

在1.5ml Eppendoff管中进行如下酶切反应：2μl pUC19质粒DNA(约4μg)，2μl酶切缓冲液E，12U BamH I，加双蒸水至总体积20μl。将酶切反应混合物置于37℃保温1.5小时。向反应后的混合物中加2μl NaAc溶液(3M pH4.8)，44μl无水乙醇，冰上放置10分钟后，在4℃，12000rpm离心10分钟。再用200μl70％的乙醇洗所得DNA沉淀2次。真空抽干，除去乙醇，加入17μl双蒸水溶解沉淀的DNA。再向管中加入2μl酶切缓冲液H，1μl Pst I(12U)，于37℃继续酶切1.5小时。65℃加热，20分钟将酶失活后，按上述回收pUC19 Sam I-HindIII大片段的方法回收pUC19 BamH I-Pst I大片段。接下来的连接反应体系包含：13μl H2O，2μl连接酶10×缓冲液，1μl pUC19 BamH I-Pst I大片段(约100ng)，3μl所合成的Ω序列DNA片段(约50ng)，1μl(含3U)T4 DNA连接酶。将反应物于16℃水浴中保温16-18小时。然后用连接后的DNA转化DH5α细胞。提取质粒后，用HindIII及EcoR I进行双酶切鉴定，选择能切下约100bp小片段的克隆进行序列分析。将得到的正确的重组质粒定名为pGΩK，然后按如下程序及附图18所示的步骤构建带有5′端非编码区调控序列的重组载体pG2E35SPΩ。用本实施例中回收pUC19 Sma I-Hind III 2.7kb大片段的方法，用Sma I及BamH I双切重组质粒DNA pG2E35SP，并回收pG2E35SP 3.5kb大片段。作为构建pG2E35SPK的载体。

用Hind III酶切重组载体pGΩk的反应体系包括：5μl质粒pGΩk DNA(20ug)，4μl酶切反应缓冲液E，45U Hind III，加H₂O至总体积40μl，37℃反应2小时。65℃加热20分钟失活内切酶。利用绿豆芽核酸酶(Mung Bean Nuclease，Promega公司〕将反应后的线性DNA的Hind III粘性末端切平。向酶切反应体系中补加5μl M.B.10×缓冲液，1μl绿豆芽核酸酶(90U)，4μlH₂O。37℃继续保温15分钟。用等体积的苯酚、苯酚-氯仿、氯仿抽提纯化反应后的DNA，每次抽提后，均小心吸回上清液。然后加5μl 3M NaAc(pH4.8)，用二倍乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗后，用17μl双蒸水溶解DNA沉淀。向所得DNA沉淀中加入2μl酶切缓冲液E和1μl限制性内切酶BamH I(16U)，于37℃反应1小时。65℃加热20分钟失活所用酶后，用2.0％琼脂糖凝胶电泳回收约100bp的BamH I-Hind III/M.B.小片段，并溶于20μl双蒸水中。

接下来进行构建重组质粒pG2E35SPK的连接反应。在1.5mlEppendoff管中加入2μl所回收的pG2E35SP BamH I-Sma I大片段(约100ng)，4μl所回收的pGΩK BamH I-Hind III/M.B.小片段约50ng、2μl连接酶10x缓冲液，10.5μl双蒸水，1.5μl T4 DNA连接酶(4.5U，Promega公司)。连接反应在18℃进行16-18小时。仍按上述的转化方法，用所连接的DNA转化DH5α感受态细胞。所不同的是不需要在LB平板上加IPTG及X-gal。转化后，提取质粒DNA，用Pst I切成线性约3.6kb的克隆。该重组质粒定名为pG2E35SΩK。如图17所示。

2.包括3′端非编码区调控序列的重组质粒pGUTSP4A的构建

在1.5ml Eppendoff管中加入2μl(约4μg)本实施例中所制备的pUC19质粒DNA，2μl多用酶切缓冲液(multi-corebuffer)(Promega公司)，限制性内切酶Sac I及Hinc II各10U，加重蒸水至20μl总体积。将酶切反应混合物于37℃水浴中保温1.5小时。65℃保温20分钟，以失活所用的限制性内切酶。用0.8％琼脂糖凝胶电泳回收2.7kb的pUC19 Sac I-Hinc II大片段。连接反应体系包含：13μl H2O，2μl连接酶10x缓冲液，1μ1 pUC19 Sac I-Hinc II大片段(约100ng)，3μl实施例2中合成的UT序列DNA片段(约50ng)，1μl(约3U)T4 DNA连接酶。将反应混合物于16℃水浴中保温16-18小时。然后仍按上述转化方法，用连接后的DNA转化DH5α细胞。提取质粒后，选择用Xho I能切开的克隆并进一步进行序列分析，得到了正确的带有UTDNA片段的重组质粒，并定名为pGUT。然后按下述程序构建重组载体pGUTA：在1.5ml Eppendoff管中加入2μl(约2μg)如上制备的pGUT质粒DNA，2μl多用酶切缓冲液，限制性内切酶Sac I及Hpa I各6U，加重蒸水至20μl总体积。将酶切反应混合物于37℃水浴中保温1.5小时。65℃保温20分钟。用0.8％琼脂糖凝胶电泳回收2.74kb的pGUT Sac I-Hipa I大片段。接下来的连接反应体系包含：13μl H₂O，2μl连接酶10x缓冲液，2μ1所回收的pGUT Sac I-Hpa I大片段(约100ng)，2μl实施例2中所合成的Poly(1A)序列DNA片段(约50ng)，1μl(约3U)T4 DNA连接酶。将反应物于16℃水浴中保温16-18小时。然后仍按上述转化方法，选择转化DH5α细胞。提取质粒后，进一步进行序列分析，选择正确地加入了Poly(A)DNA片段的重组质粒，并定名为pGUTA。如图19中所示。

然后构建重组载体pGUT2A。用Dra I和Sac I双酶切重组质粒pGUTA的步骤为：在1.5ml Eppendoff管中加入质粒DNA pGUTA2μl(约2μg)，2μl缓冲液B，1μl(10U)限制性切酶Dra I，加双蒸水至总体积20μl。37℃切割1.5小时后用乙醇沉淀，用17μI双蒸水溶解沉淀的DNA并补加2μl缓冲液J，1μl Sac I(10U)。37℃继续保温1.5小时。65℃失活所用酶后，电泳回收pGUTA的约2.77kb Dra I-Sac I大片段。然后再连接上一个实施例2中所合成的一端为平末端，一端为Sac I粘末端的Poly(1A)序列DNA片段。通过序列分析得到正确的插入了二个Poly(1A)序列DNA片段的重组质粒pGUT2A。用上面Dra I和Sac I双酶切重组质粒pGUTA的方法双酶切重组质粒pGUT2A，并回收约2.79kb的pGUT2A Dra I-Sac I大片段，用于构建重组质粒pGUT4A。同时用上面Hpa I和Sac I双酶切重组质粒pGUT的方法大量双酶切重组质粒pGUT2A并回收pGUT2A的约50bp Sac I-Hpa I片段。然后连接到所回收的pGUT2A的约2.79kb Dra I-Sac I大片段上，通过序列分析鉴定获得重组质粒pGUT4A。如图19中所示。

接下来进行重组质粒pGUTSP4A的构建。在1.5ml Eppendoff管中加入质粒DNA pGUTSP4A 2μl(约2μg)，2μl缓冲液J，1μl(6U)Hpa I限制性切酶，并加双蒸水至总体积20μl。37℃保温1.5小时，65℃再保温20分钟。其后的连接反应体系包含：13μl H₂O，2μl连接酶10x缓冲液，1μl得自pGUT4A的Hpa1-Hpa I片段(约100ng)，3μl实施例2中合成的SP序列DNA片段(约50ng)，0.5μ)(含1.5U)T4 DNA连接酶。将反应混合物于16℃水浴中保温16-18小时。然后转化大肠杆菌，并选择能用EcoR I、Hind III切下约230bp DNA片段的克隆并进行序列分析。将携带有整个3′端非编码区调控序列的重组质粒定名为pGUTSP4A。该重组质粒的构建，如图19中所示。

实施例四：携带GFM基因的重组载体的构建

为构建带有GFM基因的重组质粒pGBPB.t.F1-9，共进行下述的16次克隆连接。

1.重组质粒pGB-1的构建(如图20所示)。

在1.5ml Eppendoff管中进行如下酶切反应：5μl实施例1中制备的pUC19质粒DNA(约10μg)，5μl多用酶切缓冲液，双蒸水38μl，2μl限制性内切酶Hinc II(20U)。37℃保温2小时，65℃保温20分钟。将所得的用Hinc II切开的线性pUC19DNA：保存待用。取酶切后的DNA用乙醇沉淀，70％乙醇洗过后，溶于17.5μlH₂O中。向该DNA溶液中补2μl 10x缓冲液E，0.μl Pst I(5U).37℃保温1小时，再65℃保温20分钟。用实施例1中所述的电泳回收法回收pUC19的Pst I-Hinc II大片段，并将实施例3中制备的pUC19与B.t.F-1片段(0.2kb)退火连接.连接体系包含13μl H₂O，2μl连接酶10x缓冲液，2μl所回收的pUC19Pst I-Hinc II大片段(100ng)，2μl合成的B.t.F-1片段(约50ng)，以及1.5μl T4 DNA连接(4.5U，Promega公司)

18℃连接16-18小时后，按实施例1中的转化方法转化DH5α感受态细胞.提取质粒并用HindIII、EcoR I双酶切鉴定，选出能切下约200bp的克隆，并进一步进行序列分析。将获得的带有正确插入序列的重组质粒定名为pGB-1。

2.重组质粒pGB-2的构建(如图21所示)

构建重组质粒pGB-2的连接反应如下：0.5μl步骤1中制备的用Hinc II切开的pUC19载体DNA(约100ng)，2μl实施例3合成的B.t.F-2 DNA片段(0.25kb，100ng)，1μl T4 DNA连接酶缓冲液及T4 DNA连接酶(3U)和6.5μl H₂O。连接反应在12℃进行6小时。同样，重复步骤1中的转化及重组质粒的鉴定。选出能切下约250bp的克隆并进行序列分析。将获得的带有正确插入序列并且Nsi I位点位于载体Hind III一侧的重组质粒，并将其定名为pGB-2。

3.重组质粒pGB-3的构建(如图22所示)

构建重组质粒pGB-2的连接反应如下：0.5μl步骤1中制备的用Hinc II切开的pUC19载体DNA，向其中补加0.5μl(5U)限制性内切酶Xba I。37℃酶切2小时后，将酶失活，电泳回收pUC19的2.7kb Xba I-Hinc II大片段。构建重组质粒pGB-3的连接反应如下：12.5μl H₂O，2μl 10x连接缓冲液，2μl回收的pUC19 Hinc II-Xba I大片段(约100ng)，2μl所合成的B.t.F-3片段(约50ng)，以及1.5μl T4DNA连接酶(4.5U，Promega公司)。连接反应在18℃进行16-18小时。选择能用EcoR I、HindIII切下约190bp DNA片段的克隆并进行序列分析。将该重组质粒定名为pGB-3。

4.重组质粒pGB-4的构建(如图23所示)

载体pUC19 2.7kb Xba I-EcoR I大片段的获得采用如下酶切反应体系：2μl质粒pUC19 DNA(约4μg)，2μl多用酶切缓冲液，各10U限制性内切酶Xba I及EcoR I，加双蒸水至20μl总体积。37℃反应1.5小时。电泳回收2.7kb DNA片段，并进行如下连接反应：13.5μl H₂O，2μl 10x连接缓冲液，2μl所回收的pUC19 Xba I-EcoR I大片段DNA(约100ng)，2μl所合成的B.t.F-4片段(约75ng)，T4 DNA连接酶0.5μl(1.5U)。于16℃保温18-2小时。获得定名为pGB-4的重组质粒。

5.重组质粒pGB1-2的构建(如图24所示)

用Nsi I切割重组质粒pGB-1及pGB-2。酶切反应体系为：质粒DNA 4μl(约5μg)，2μl缓冲液D，1μl(10U)限制性切酶Nsi I，加双蒸水至总体积20μl。37℃切割1.5小时后用乙醇沉淀，并用70％乙醇洗沉淀2-3次，用17μl双蒸水溶解同时补加2μl缓冲液B，1μl(10U)限制性内切酶Hind III，37℃1.5小时，然后65℃保温15分钟。用电泳回收方法分别制备pGB-1的2.7kb Nsi I-Hinc II大片段和pGB-2 250bp Nsi I-Hinc II小片段。二者退火连接以构建重组质粒pGB1-2。连接反应体系包含2μl pGB1 Nsi I-Hinc II大片段(约50ng)，2μl缓冲液，1.5UT4 DNA连接酶，加H₂O到总体积20μl。将反应物在15℃保温16-18小时。转化大肠杆菌并鉴定质粒DNA后，选出能被切下约0.45kb的EcoR I-HindIII小片段的克隆，并定名为pGB1-2。

6.重组质粒pGB1-3的构建(如图25所示)

采用Hinc II及Xba I分别双酶切重组质粒pGB1-2及pGB-3。反应体系均为：4μl质粒DNA(约4μg)，2μl多用酶切缓冲液，限制性内切酶Hinc II及Xba I各10U。然后分别回收pGB1-2的3.15kb Xba I-Hinc II大片段及pGB-3的0.2kb Xba I-Hinc II小片段。用于以下的的连接反应：10.5μl pGB-3的Xba I-HincII小片段(约50ng)，2μl连接缓冲液，0.5μl T4 DNA连接酶(1.5U)。16℃连接16-18小时。转化(涂敷的LB平板不需加IPTG及X-gal)大肠杆菌并鉴定质粒DNA后，选出能切下0.65kb的HindIII-EcoR I片段的克隆，并命名为pGB1-3。

7.重组质粒pGB1-4的构建(如图26所示)

采用Xba I及EcoR I分别双酶切重组质粒pGB1-3及pGB-4。反应体系均为：4μl质粒DNA(约4μg)，2μl多用酶切缓冲液，限制性内切酶EcoR I及Xba I各10U。然后分别回收pGB1-3的3.35kb Xba I-EcoR I大片段及pGB-4的0.23kb Xba I-EcoR I小片段。用于以下的的连接反应：10.5μl pGB-3的Xba I-HincII小片段(约50ng)，2μl连接缓冲液，0.5μl T4 DNA连接酶(1.5U)。14℃连接18-20小时。按上述方法转化大肠杆菌并鉴定质粒DNA后，选择能切下约0.9kb的Hind III-EcoR I片段的克隆，获得定名为pGB1-4的重组质粒。

8.重组质粒pGPB.t.F1-4的构建(如图27所示)

用Pst I分别酶切质粒pG 2E35SΩK和pGB1-4。酶切体系包含4μl质粒DNA(约4μg)，2μl缓冲液H，0.5μl Pst I(6U)，加H₂O至总体积20μl。37℃保温1小时后，用乙醇沉淀。70％乙醇洗2-3次，所得沉淀并再用17.5μl H₂O重新溶解。分别向两管DNA溶液中补加2μl缓冲液E和0.5μl限制性内切酶Hind III(5U)，37℃继续酶切1小时。分别电泳回收pG2E35SΩK的0.8kbHindIII-Pst I小片段和pGB1-4的3.6kb的HindIII-pst I大片段。用于下面的连接反应。在1.5ml Eppendoff管中加入6μl H₂O，1.5μl pGB1-4的Hind III-Pst I大片段(约100ng)，1μlpG2E 35SPΩ K的0.8kb Hind III-Pst I小片段约60ng，1μl连接酶缓冲液，0.5μl T4 DNA连接酶(1.5U)。于16℃保温16-18小时。转化大肠杆菌DH5α细胞并选择能切下约1.5kb Kind III-EcoR I片段的克隆，命名为pGPB.t.F1-4。

9.重组质粒pGB-5的构建(如图28所示)

制备载体pGUC21质粒DNA的方法同实施例1中制备质粒DNApUC19的方法。带有质粒pGUC21的细菌由本实验室保存。

在1.5ml的Eppendoff管中进行如下的酶切反应：5μlpGUC21质粒DNA(约10ng)，缓冲液G4μl，限制性内切酶Acc I2μl(20U)，加双蒸水至总体积40μl。37℃保温1小时。然后用乙醇沉淀反应后的线性DNA，再用70％乙醇洗2-3次，并重新溶解于20μl H₂O中。取10μl上面所得到的pGUC21质粒DNA，向其中加入7μl H₂O，2μl缓冲液J及1μl限制性内切酶Hpa I(10U)。置37℃酶切2小时。用电泳回收pGUC21约2.7kb Hpa I-Acc I大片段DNA，用于如下的连接反应：5.5μl H2O，2μlpGUC21 Hpa I-Acc I大片段(约100ng)，1μl如上制备的B.t.F-5片段(约5 0ng)，1μl连接酶缓冲液，0.5l T4 DNA连接酶(1.5U)。于16℃连接16-18小时。按上述方法转化大肠杆菌并鉴定质粒DNA后，选出能切下约200bp HindIII-EcoR I小片段的克隆，进一步经过序列分析，将携带有正确插入片段的重组质粒定名为pGB-5。

10.重组质粒pGB-6的构建(如图29所示)

取10μl步骤9中所得到的经Acc I切开的线性pG；UC21质粒DNA，在其中加入2μl缓冲液D，7μl H₂O以及1μl Nco I(10U)，37℃保温2小时。回收pGU2 1的2.7kb Acc I-Nco I大片段DNA，进一步进行如下连接反应：5.5μl H2O，2μl pGUC21，Nco I-Acc I大片段(约100ng)，1μl如上制备的B.t.F-6片段约(50ng)，1μl连接酶10x缓冲液.0.5μl T4 DNA连接酶(1.5U)。16℃连接16-18小时。按上述方法转化大肠杆菌并鉴定后，选出能切下约230bp的Hind III-EcoR I片段的克隆，进一步进行序列分析，所获得重组质粒定为pGB-6。

11.重组质粒pGB6-7的构建(如图30所示)

在1.5ml Eppendoff管中加入4μl如上制得的pGB-6质粒DNA(约4μg)，2μl缓冲液H，0.5μl限制性内切酶(5U)并加双蒸水至总体积20μl。37℃保温1小时，然后用乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗2-3次后，重新溶解沉淀的DNA于17.5μl H₂O中，向其中加入2μl缓冲液D，0.5μl Nco I(5U)，37℃继续酶切1小时，然后电泳回收pGB-6的2.93kb Pst I-Nco I大片段。构建重组质粒pGB6-7的连接反应包含：5.5μl H₂O，2μl所回收的pGB-6 Pst I-Nco I大片段(约1 00ng)，1μl B.t.F-7片段(约50ng)，1μl T4 DNA连接酶10x缓冲液，0.5μl T4 DNA连接酶(0.5U)。16℃连接16-18小时后转化大肠杆菌DH5α，并选出能切下约160bp HindIII-EcoR I片段的克隆。选择恰当的测序引物进行序列分析。将所得到的携带有正确插入序列的重组质粒定名为pGB6-7。

12.重组质粒pGB5-7的构建(如图31所示)

用Pst I分别酶切质粒pGB5和pGB6-7。酶切体系包含：4μl质粒DNA(约4μg)，2μl缓冲液H，0.5μl Pst I(6U)，加H₂O至总体积20μl。37℃保温1小时后，用乙醇沉淀。70％乙醇洗2-3次，所得沉淀再用17.5μl H2O重新溶解。分别向两管DNA溶液中补加2μl缓冲液G和0.5μl限制性内切酶Acc I(5U)。37℃继续酶切1小时。分别电泳回收pGB5的2.88kb Acc I-Pst I大片段和pGB6-7的0.36kb Acc I-Pst I小片段。用于下面的连接反应。在1.5ml Eppendoff管中加入6μl H₂O，1.5μl pGB52.88kb Acc I-Pst I大片段(约100ng)，1μl pGB6-7的0.36kbAcc I-Pst I小片段(约60ng)，1μl连接酶缓冲液，0.5μl T4DNA连接酶(1.5U)。于16℃保温16-18小时。转化大肠杆菌DH5α细胞并选择能切下约0.54kb HindIII-EcoR I片段的克隆，并命名为pGB5-7。

13.重组质粒pGB-8的构建(如图32所示)

在1.5ml Eppendoff管中加入2μl pGUC21质粒DNA(约4μg)，2μl缓冲液H，0.5μl PstI(5U)，加双蒸水至总体积20μl。37℃酶切1小时，用乙醇沉淀，并用70％乙醇洗所得沉淀的DNA.2-3次，重新将DNA溶解于17μl H₂O中。向其中加入2μl缓冲液J，0.5μl限制性内酶切Sma I(5U)。于37℃继续保温1.5小时。然后电泳回收pGUC21的2.7kb Pst I-Sma I大片段。取2μl(约100ng)所回收的DNA用于构建重组质粒pGB-8的连接反应。反应体系中含有5μl H₂O，1μl如上合成的B.t.F-8(约50ng)，1μ1 10x连接酶缓冲液，1μl T4 DNA连接酶(3U)。在18℃保温16-18小时。连接后，仍用上面的转化和鉴定方法，选择能切下约200bp HindIII-EcoR I小片段的克隆。通过序列分析，得到携带有正确插入序列的被定名为pGB-8的重组载体。

14.重组质粒pGB8-9的构建(如图33所示)

用Sma I和EcoR I双切重组质粒pGB-8：在1.5ml的Eppendoff管中含有4μl pGB-8质粒DNA(约4μg)，2μl多用酶切10x缓冲液，1μl限制性内切酶Sma I(10U)，加双蒸水到总体积20μl。于25℃保温1.5小时后，向反应体系中补加1μl限制性内切酶Sac I，于37℃继续保温1小时，然后在65℃保温20分钟。电泳回收pGB-8的2.88kb Sma I-Sac I大片段。在1.5mlEppendoff管中加入5μl H₂O，2μl所回收的pGB-8 Sma I-SacI大片段DNA(约100ng)，如上合成制备的B.t.F-9片段1μ1(约50ng)，1μl 10x连接酶缓冲液，1μl T4 DNA聚合酶(3U)。18℃连接16-18小时。然后通过转化鉴定得到能切下约0.4 kb的HindIII-EcoR I片段的克隆，该克隆定名为pGB8-9。

15.重组质粒pGB5-9的构建(如图34所示)

按如下步骤分别对重组质粒pGB5-7和pGB8-9进行双酶切。在1.5ml Eppendoff管中加入4μ1质粒DNA(约4μg)，2μl缓冲液J，1μl限制性内切酶Sac I(10U)，加双蒸水至20μl。37℃保温1.5小时后，向反应体系中加入2μl缓冲液H，1μl限制性切酶Pst I(10U)。37℃继续反应1.5小时。65℃保温20分钟后，分别电泳回收pGB5-7的3.24kb Pst I-Sac I大片段和pGB8-9的0.42kb Pst I-Sac I小片段。然后将这两个片段退火连接。反应体系中包含3.5μl H₂O，1μl pGB5-7的3.24kb Pst I-Sac I大片段，(约100ng)，4μl pGB8-9的0.42kb Pst I-Sac I小片段的(约50ng)，1μl连接酶缓冲液，0.5μl T4 DNA连接酶。在16℃保温16-18小时。转化DH5α感受态细胞并酶切鉴定所获得的重组克隆，选择能正确切下约0.96.kb Hind III-EcoR I片段的克隆并定名为pGB5-9。

16.重组质粒pGBPB.t.F1-9的构建(如图35所示)

先用Hind III和Hpa I双酶切重组质粒pGB5-9，并电泳回收约3.6kb的Hind III-Hpa I大片段DNA。酶切的反应体系包含pGB5-9质粒DNA 2μl(约2μg)，2μl多用酶切缓冲液，Hind III及Hpa I各5U，加H₂O至总体积20μl。37℃保温2小时。对重组质粒pGBPB.t.F1-4进行如下操作：先用EcoR I将该质粒切开，再用绿豆芽核酸酶将切开的DNA的末端补平。进而用Hind III酶切并回收1.8kb Hind III-EcoR I/M.b.片段。具体操作步骤为：在1.5mlEppendoff管中加入10μl pGBPB.t.F1-4质粒DNA(约10μg)，5μl缓冲液H，2μl限制性内切酶EcoR I(24U)，加双蒸水至总体积50μl。37℃酶切1.5小时。65℃处理20分钟。向反应混合物中加入6μl绿豆芽核酸酶10x缓冲液，3.5μl H₂O，0.5μl绿豆芽核酸酶(45U)。37℃保温15分钟，然后按实施例4中绿豆芽核酸酶处理后的操作步骤纯化、沉淀并重新用17μl H₂O溶解所得到的DNA。向其中加入2μl缓冲液E，1μl限制性内切酶Hind III(10U)，并于37℃保温1小时。65℃加热20分钟失活所用限制性内切酶后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳回收约1.8kb的Hind III-EcoR I/M.B.片段。接下来的连接反应体系包含5μl H₂O，1μ1 pGB5-9的3.66kb Hind III-Hpa I DNA(约100ng)，2μl 1.8kb的pGBPB.t.F1-4的Hind III-EcoR I/M.B.DNA片段(约150ng)，1μl连接酶缓冲液，1μl T4 DNA连接酶(20U)。18℃连接18-20小时。然后转化DH5α感受态细胞。用Pst I酶切鉴定所得到的重组体，选择能切下约1.2kb Pst I-Pst I片段的克隆，并定名为pGBPB.t.F1-4。实施例五.植物表达载体的制备

1.质粒pGB.t.的构建：(如图36所示)

取质粒pGBPB.t.F1-95μg，3.5μl限制性内切酶EcoR I(20U/μl)(Promega公司)，3.5μl EcoR I 10x酶切缓冲液，用重蒸水定容总体积至35μl。37℃水浴保温1.5小时后补加2μ1 CIP(碱性磷酸酶，Boehringer Bannheim公司，1U/μl)，CIP10x缓冲液(Boehringer Mannheim公司)10μl，重蒸水53μl。37℃水浴保温2小时。之后加2μl EDTA终止反应，并用等体积苯酚、苯酚/氯仿及氯仿/异戊醇各抽提一次，最后水相加1/10体积3MNaAc(pH4.8)及2.5体积无水乙醇，混合后-20℃放置数小时。4℃下12000rpm离心10分钟。沉淀物用冰冷的70％乙醇洗后冷冻抽干，并溶于适量无菌重蒸水中。

3′Hind III接头序列设计如下：AATTCAAGCTT。按上文所述文法合成该寡核苷酸片段并溶于适量重蒸水中，置94℃水浴10分钟后使其缓慢冷却至室温，以使单链相互退火成双链的3′Hind III接头。取1μg退火产物，T4多聚核苷酸激酶(8U/μl，Promega公司)1.5μl，ATP(6mmol/L，Promega公司)，1.5μl，多聚核苷酸激酶10x缓冲液(Promega公司)1.5μl，用重蒸水定容总体积至15μl。37℃水浴保温0.5小时。之后65℃水浴0.5小时灭活激酶。

取质粒pGBPB.t.F1-9的EcoR I酶切并沉淀后的DNA 0.1μg，3′Hind III接头加磷后混合物0.1μg，dATP(5mmol/L，Promega公司)1μl，T4 DNA连接酶(6U/μl，华美公司)1μl，T4 DNA连接酶10x缓冲液(华美公司)1μl，用重蒸水定容至总体积10μl，并于16℃水浴中保温过夜。之后用该连接反应物转化大肠杆菌JM103菌株(本室保存)感受态细胞。

挑取已转化的菌落接种于液体LB培养基中37℃振荡培养，并按上述方法提取质粒DNA。用Hind III酶切筛选阳性克隆体，琼脂糖电泳可见约3kb的片段，从而得到质粒pGB.t.。

2.质粒pGB4AB的构建(如图37所示)

取质粒pGB.t.DNA 2μg，限制性内切酶Xho I(华美公司，40U/μl)2μl，Xho I酶切10x缓冲液(华美公司)2μl，加重蒸水至总体积20μl。37℃水浴保温1.5小时后，取2μl反应混合物用于1％琼脂糖凝胶电泳以观察酶切情况，余下18μl反应混合物加入1.8μl 3M NaAc(pH4.8)，40μl无水乙醇，混合后置-20℃沉淀。4℃下12000rpm离心10分钟。用冰冷的70％乙醇洗沉淀后冷冻抽干。将沉淀物溶于适量无菌重蒸水中，加入2.5μl限制性内切酶Sac I(华美公司，20U/μl)，2.5μl Sac I 10x酶切缓冲液(华美公司)，用重蒸水补加至25μl的反应体积，37℃水浴保温1.5小时。65℃水浴保温10分钟灭活Sac I后加入2.5μl 3M NaAc(pH4.8)，55μl无水乙醇，混合后置-20℃沉淀。4℃下12000rpm离心10分钟。用冰冷的70％乙醇洗沉淀物后冷冻抽干。沉淀溶于10μl无菌重蒸水中。从pGUT4A质粒DNA中，回收Xho I-Sac I 3′端非编码片段约0.3μg，加入T4多聚核苷酸激酶(8U/μl，Promega公司)1.5μl，ATP(6mmol/L，Promega公司)1.5μl，多聚核苷酸激酶10x缓冲液(Promega公司)1.5μl，用重蒸水定容至总体积15μl，37℃水浴保温0.5小时。保温后65℃水浴0.5小时以灭活激酶。

取质粒pG4AB经Xho I和Sac I酶切并沉淀后得到的悬浮液1μl(约含DNA0.1μg)，加入磷酸化的3′-非编码片段混合液7μl，T4 DNA连接酶(6U/μl，华美公司)1μl，T4 DNA连接酶10x缓冲液(华美公司)1μl。16℃水浴保温过夜。之后转化大肠杆菌JM103菌株(本室保存)感受态细胞。

挑取已被转化的菌落接种培养后提取质粒方法如上所述。用Xho I及Sac I按本实例所述的方法酶切鉴定重组质粒。经2％琼脂糖凝胶电泳后出现约230bp片段者即为阳性克隆，成功构建了质粒pG4AB。

3质粒pGBI 4AB的构建(图38所示)

取质粒pG4AB 2μg，限制性内切酶Hind III(华美公司，10U/μl)2.5μl，Hind III酶切10x缓冲液(华美公司)2.5μl，加重蒸水至总体积25μl。37℃水浴保温2小时，之后进行1％琼脂糖凝胶电泳以回收3.2kb片段，并用上文所述的方法回收及纯化DNA。最后将DNA沉淀物溶于适量无菌重蒸水中。

取质粒pBI 121.1(本室保存)2μg，限制性内切酶Hind III(10U/μl，华美公司)2μl，Hind III酶切10x缓冲液(华美公司)2μl，用重蒸水补至20μl。37℃水浴保温2小时。取2μl反应混合物用于0.7％琼脂糖凝胶电泳以检查酶切结果，余下的18μl混合物中加入1.8μl 3M NaAc(pH4.8)，40μl无水乙醇，混合后置-20℃沉淀。12000rpm，4℃离心10分钟。用冰冷的70％乙醇洗沉淀物，冷冻抽干后重新悬浮于适量无菌重蒸水中。

取经Hind III消化后回收的质粒pBI121.10.2μg，经电泳回收的约3.2kb片段0.2μg，T4 DNA连接酶(6U/μl，华美公司)1μl，T4 DNA连接酶10x缓冲液(华美公司)1μl，用重蒸水定容至10μl，并于16℃水浴中保温过夜。之后用于转化大肠杆菌JM103菌株(本室保存)感受态细胞。

挑取已转化的菌落接种培养后提取质粒。用Hind III酶切鉴定重组质粒。在1％琼脂糖凝胶电泳上观察到约3.2kb片段，从而得到成功构建质粒pGBI4AB。

4.质粒pGBI 4A2B的构建(如图39所示)

取质粒pG4AB 30μg，限制性内切酶Hind III(华美公司，20U/μl)40μl，Hind III酶切10x缓冲液(华美公司)40μl，加重蒸水补足总体积400μl。37℃水浴保温1.5小时后，取3μl反应液用于1％琼脂糖凝胶电泳以检查酶切结果，在余下的反应混合物加入40μl 3M NaAc(pH4.8)，1100μl无水乙醇，混合后置-20℃沉淀。12000rpm于4℃离心10分钟。用冰冷的70％乙醇洗沉淀，将沉淀物冷冻抽干后悬浮于208μ1无菌蒸馏水中。向悬浮液中加入限制性内切酶EcoR I(20U/μl，华美公司)36μl后，EcoR I酶切10x缓冲液(华美公司)36μl。37℃水浴保温1.5小时。向反应混合物中加36μl 3M NaAc(pH4.8)，900μl无水乙醇，混匀后置-20℃沉淀。4℃下12000rpm离心10分钟。用冰冷的70％乙醇洗沉淀，将沉淀物冷冻抽干并重新悬浮于16μl无菌重蒸水中。向悬浮液中加入2μl T4 DNA连接酶(6U/μl，华美公司)，2μl T4 DNA连接酶10x缓冲液(华美公司)后，于16℃水浴保温过夜。向连接混合物中加入限制性内切酶EcoR I(20U/μ1，华美公司)5μl，EcoR I酶切10x缓冲液(华美公司)5μl，重蒸水20μl，于37℃水浴中保温1.5小时。对反应混合物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收约6.4kb的大片段。将回收后纯化的DNA沉淀物重新悬浮于4μl无菌重蒸水中。

取质粒pBI 121.1(本室保存)3μg，加入限制性内切酶EcoRI(20U/μl，华美公司)0.5μl，EcoR I酶切10x缓冲液(华美公司)2μl，用重蒸水定容至20μl并37℃水浴保温1.5小时。保温后向其中加入小牛碱性磷酸酶(CIP，1U/μl，BoehringerMannheim公司)0.5μl，CIP 10x缓冲液(Boehringer Mannheim公司)10μl，重蒸水70μl，于37℃水浴保温1小时。之后加入2μl 0.5M EDTA终止反应。分别用苯酚、苯酚/氯仿及氯仿/异戊醇抽提水相。向水相内加入1/10体积3M NaAc(pH4.8)及2体积的无水乙醇，混匀后置-20℃沉淀。于4℃下12000rpm离心10分钟。沉淀用冰冷的70％乙醇洗过。并冷冻抽干后，悬于20μl重蒸水中。

取4μl酶切并沉淀后悬浮的质粒pBI121.1，加入4μl回收的6.4kb大片段.1μl T4 DNA连接酶(6U/μl，华美公司)，1μlT4 DNA连接酶10x缓冲液后。16℃水浴保温过夜。用连接混合物转化感受态细胞。挑取菌落接种液体培养基培养并提取质粒。用EcoR I酶切鉴定重组质粒，并在0.8％琼脂糖凝胶电泳图谱上可观察到6.4kb片段，结果表明已成功构建了质粒pGBI 4A2B。实施例六：用编码杀虫蛋白质的合成基因重组体转化植物并

    检测其在植物中的表达1.农杆菌转化介导法

1).无菌籽苗的制备

先将棉花种子用去污剂水溶液洗10分钟，然后将种子放入400ml加入了3滴吐温20的30％chlorox溶液中搅拌20分钟。用灭菌蒸馏水洗2次后将种子浸入双氧水中10分钟，用灭菌蒸馏水洗3次，在无菌条件下，将种子放入1/2半固体的MS盐中。种子于28℃黑暗中萌发3-10天。然后将子叶和胚轴切成段，放入含3％葡萄糖，2mg/L NAA，1mg/L激动素的固体MS培养基(MSS培养基)中，或者放在含3％葡萄糖，维生素B5，100mg/L肌醇、0.75mg/L MgCl₂，0.1mg/L 2.4-D，及0.1或0.5mg/L激动素的Gelrite固体培养基(MST培养基)中，以形成愈伤组织。

将愈伤组织于25℃以16/8光周期保持于这二种培养基之一中，直到开始胚胎发生。胚胎发生的愈伤组织的继代培养与开始时相同，但在用3％的蔗糖代替葡萄糖的培养基上进行。将体细胞胚胎移入不含植物生长调节剂但含0.75g/L MgCl₂的Gelrite固体培养基中，使其萌发并生长成植株。

2).被转化植物中杀虫蛋白质的表达：

将携带有编码杀虫蛋白质合成基因的植物表达载体的农杆菌在YEP液体培养基中培养过夜，第二天按1/100接菌到新的液体YEP培养基中继续培养至0D为0.1-0.3，并接种子叶和下胚轴切段。将外植体在含1/10浓度MS盐的MSS或MST培养基中共培养2-3天。用滤纸吸去外植体上多余的农杆菌，再将外植体移至含500mg/L羧苄青霉素和30-100mmg/L卡那霉素的MSS或MST培养基上。转化的愈伤组织将在此培养基上生长并产生胚，然后将该胚培养成植株。通过已知的检测外源基因及基因表达方法，检测植株转化情况。可用PCR法，Southeern、Northern或Western等印迹分析法检测合成基因在植株中的表达。但生物抗虫检测可能是检测杀虫蛋白质表达的最灵敏的最直接的并最具说服力的手段。2.子房注射植物受精胚囊的转化

编码B.t.杀虫蛋白质的合成基因在植物中的高效表达对于产生转基因植物是最为关键的，但是外源基因转化植物是否能获得成功，也是致关重要的环节。在本发明之前，本领域技术人员熟知的利用农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等方法转化植物虽然有许多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不仅受到实验室条件和昂贵的仪器及费用极高等的限制，更重要的是上述方法都有一个不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生产上发挥着重要作用的优良植物品种，由于基因型的不同，不能通过愈伤途径再生成植株；或再生植株极为困难。在这样的情况下，本申请的发明人不仅广泛研究和成功地制备了编码B.t.毒素类似物的合成基因(GFM Gene)，首次利用该基因，通过植物受精胚囊注射转化的技术或称植物受精胚囊注射转化法，成功地获得了具有高抗虫能力的抗虫转基因棉花。虽然本发明优选棉花作为子房注射外源基因转化植物受精胚囊方法的起始植物，但并不限于棉花。子房注射外源基因转化植物受精胚囊技术的优点在于：1).适合于所有植物的基因型；2).方法简单，有效；3).不受实验室条件、仪器的限制，且费用低；4).速度快，一年内即可获得转基因植物种子及后代。

子房注射外源基因转化植物受精胚囊技术或称植物受精胚囊注射转化技术(简称“子房注射法”)是在下文所述的基础上建立的。本领域技术人员已熟知，胚囊是高等植物的雌性生殖结构，内有卵核，当与精核受精后，子代在此得以形成。植物解剖学研究显示，它的结构如图40所示。胚囊被二层珠被组织包被着，内层称为内珠被，外层称为外珠被，内、外珠被不连续处的微孔称为珠孔。珠孔至胚囊之间的珠心组织是致密的细胞层，只有在花粉管进入胚囊之前的一段时间内，此处的珠心组织才退化形成一条由珠孔至胚囊的孔称为珠心孔道。植物开花授粉后，花粉粒在柱头上萌发出花粉管，沿着花柱向下生长，延伸。在其到达胚珠前，珠孔开始张大，珠心孔道开始形成。当花粉管延伸到珠孔时，珠心孔道形成的直径已是花粉管直径的数倍，因此已到达珠孔的花粉管便可以顺利通过珠心孔道进入胚囊，释放出精核与卵核完成受精。此时，即可用外源基因注射子房，转化受精胚囊。然后珠心孔道逐渐关闭，受精胚囊开始分裂，最终发育成子代。

在本发明的一个优选实例中，成熟的棉花植物一般在早晨7-8时开花，授粉，经10小时左右花粉管通过珠孔和珠心孔道进入胚囊，释放精核，完成双受精后，珠心孔道逐渐封闭。在受精后的一段时间内，受精卵细胞的质膜系统和初生细胞壁尚未完善，此时的受精卵细胞在形态上近似于裸露的原生质体，因而极易接受外源基因。

(1)外源基因转化植物

在本实例中，子房注射外源基因转化植物受精胚囊的方法，是在棉花开花授粉后的大约10-24小时之间进行的。在珠心孔道封闭之前，用微量注射器将外源基因溶液注射到子房内，外源基因溶液即可通过珠孔和珠心孔道，逐渐扩散到或在珠心孔道封闭的过程中被挤压到刚受精后的胚囊内。在受精卵分裂的过程中，外源基因被吸收整合到受精卵细胞的基因组中，从而完成外源基因导入和整合过程。

棉花是常异花授粉作物，为保持品种(系)的相对纯度在开花的前一天下午，将要在第二天开花的蕾用线扣紧，使花瓣不易张开，以使其自花授粉。开花后约10小时左右，即开花当天的晚6点钟左右花粉管进入胚囊后，即可进行外源基因的注射。注射前将花辨连同雄蕊剥去，露出幼铃，抹去幼铃顶端的花柱，用微量注射器吸取预冷的外源基因溶液，从抹掉花柱的幼铃的顶端，沿中轴垂直插入幼铃大小的2/3处(如图40所示)，再将微量注射器向上提到1/3的地方，留下约幼铃1/3的插入空间，缓慢将注射装置内的外源基因溶液注射到插入空间内。此后，外源DNA溶液将沿着珠孔和珠心孔道向受精胚囊内扩散，或由于珠心孔在逐渐封闭而被挤压进受精胚囊中而实现其整合。一般每个棉花幼铃注射的外源基因溶液为10μl，DNA总量约为0.25-0.5μg。当然，对于不同的植物可根据其子房内胚珠数目的多少，适当地增加或减少外源基因的注射量。外源基因注射后，为了防止和减少幼铃的脱落，提高成铃率，在幼铃柄基部用毛笔涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夹在幼铃柄基部和茎(枝)之间，同时将所说注射外源基因的幼钤所在的枝条项端摘掉，以保持幼铃的充分营养，从而将有利于成钤和铃内种子的发育。

(2)化学组织法检测外源杀虫基因在植物中的表达

本发明的基因加倍双向高效植物表达载体除了携带有合成基因外，还带有独立表达的报告基因(GUS)。粗测报告基因在植物中表达可间接证明外源基因是否被转入植物中。按Jeferson等人(1987)的方法检测，发现约有1％左右由转化种子生长出的籽苗中有GUS阳性反应。结果如下列表6所示。

表6.GUS基因的表达分析

受体棉花及基因	种子数	出苗数	阳性株数	阳性％	存活株数
						泗棉3号+基因	4200	3545	53	1.5	21
中棉12号+基因	3852	1360	17	1.25	13
						泗棉3号CK	120	101	0	0

4. 转基因抗虫植物的分子生物学检测(1)棉花总DNA的提取

按下述程序制备棉花总DNA：取棉花植株置黑暗处放置2-3天以降低糖类累积后，剪取幼嫩健康的棉叶3-5g，用含少许洗涤剂的清水洗涤叶片后再用大量清水洗去洗涤剂。再次用重蒸水清洗后置于滤纸上吸去叶面水珠。将叶片置研钵中，加少许Al₂O₃助磨剂，添加液氮，在低温下研磨成粉末。将所得粉末移入已加有15ml植物DNA提取液(含100mM Tris-HCl pH8.0)，50mM EDTA(pH8.0)，250mM NaCl，1％SDS，0.25％β-巯基乙醇)中并于65℃预热的50ml塑料离心管中，剧烈振荡后置65℃水浴中保温10分钟，并不时倒管混合之。然后取出离心管将内容物倒在冰水中。加入5ml预冷的5M KAc，轻轻颠倒混合，并在冰上放置0.5小时。12000rpm，4℃离心30分钟。将上清转入新的离心管中。用等量酚/氯仿、氯仿/异戊醇抽提一次。在上清液中加入15ml预冷的异丙醇，仔细混匀后置-20℃ 0.5小时。10000rpm，4℃离心20分钟。用冰冷的70％乙醇洗沉淀物2次并将沉淀物悬浮于700μ1 TE(10mM Tris.HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，并转入1.5ml Eppendoff管中，15000rpm离心5分钟。然后将上清转入新的Eppendoff管中，加入RNase A(10mmg/ml，Boehringer Mannheim公司)20μl，在37℃水浴中保温20分钟。之后用等量苯酚、苯酚/氯仿、氯仿/异戊醇抽提至无蛋白质沉淀为止。向上清中加1/10体积3M NaAc(pH5.2)及2.5体积无水乙醇，温和地混匀，-20℃静置沉淀。13000rpm，4℃离心20分钟。用冰冷的70％乙醇洗沉淀物后再次以13000rpm，4℃离心2分钟以压实沉淀物。弃去上清，将沉淀物冷冻抽干，并重新悬浮于适量无菌重蒸水中。取适量DNA溶液进行0.5％琼脂糖凝胶电泳分析，以λDNA(华美公司，0.35μg/μl)做为标准分子量。所提取的棉花植物总DNA长度较为均一的宽带，大小约在50～100kb之间。

(2).PCR检测棉花植株总DNA中的B.t.杀虫蛋白质基因片段

使用Promega公司的Taq DNA聚合酶进行转基因植株的PCR鉴定。所用的PCR反应体系包含：模板棉花植株叶DNA 2μl(约2μg)，10xPCR反应缓冲液5μl，MgCl₂ 3μl(25mM)，dNTP各5μl(100mM)，5′端引物及3′端引物各1μg(引物采用在基因设计合成过程中所合成的两段分别为39b和27b的寡核苷酸片段，这对引物在B.t杀虫蛋白质基因上的距离约为0.8kb)。先于94℃水浴10分钟，充分复性后再加入Taq DNA聚合酶1μl(3U/μl)。加双蒸水至总体积50μl，混匀并在反应管上部覆盖50μl矿物油。

采用GeneAmp PCR System 9600型PCR仪(PERKIN ELMER公司)，按如下反应程序进行PCR：93℃变性60秒，50℃退火60秒，72℃延伸2分钟，共进行30次循环。之后取5μl PCR反应产物溶液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，结果检查到了800bp的PCR产物。(如附图41所示)。结果证明合成的基因已转化到植物细胞中。

(3).用于Southern印迹分析的DNA探针的制备

取实施例五-(3)构建的质粒pBI4AB 30μg，加入限制性内切酶PstI(16U/μl，华美公司)4μl，Pst I酶切10x缓冲液(华美公司)4μl，用重蒸水定容至40μl。37℃水浴保温1.5小时后经1％琼脂糖凝胶电泳回收约1.4kb片段。将如此纯化后的DNA沉淀悬浮于适量无菌重蒸水中。

用Pharmacia公司的NICK^TM柱(内含Sephadex G-50)按其作手册用[α-³²P]dATP对回收的DNA片段进行DNA缺口平移标记及纯化。纯化的标记探针经沉淀后离心，最后的沉淀物重新溶于适量无菌重蒸水中。

(4).Southern印迹分析鉴定PCR产物

用Southern杂交分析法(J.Sambrook et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989)鉴定棉花植物叶DNA PCR扩增产物如下：

取适量步骤(2)PCR检测的各扩增反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。紫外灯下观察电泳情况并在凝胶上做标记后紫外照相留用。之后切去凝胶四周无用部分，将凝胶置于变性溶液(含1.5M NaCl，0.5M NaOH)中于旋转平台上振摇浸泡45分钟使DNA变性。之后用重蒸水大致漂洗凝胶，换用中和液(1M Tris.HCl(pH7.4)，1.5M NaCl)室温中和，伴随温和的振动。更换一次中和液后继续浸泡15分钟。

此时可准备一张Whatman 3MM滤纸包住一个玻璃平板，将其放于一方磁盘中的平台上，使滤纸下缘浸入转移缓冲液(10×SSC)中。当滤纸全部浸透后用玻棒赶走滤纸与玻璃板之间的气泡。裁出一张稍大于凝胶的硝酸纤维素滤膜，用重蒸水彻底浸润后改用20×SSC液浸泡5分钟以上。在滤膜上做与凝胶相应的标记。

从中和液中取出凝胶，背面朝上放于平台上湿的3MM滤纸上并赶走气泡。用保鲜膜盖住凝胶四周以防盘内液体直接从边缘渗透到上层纸巾。将浸润的硝酸纤维素滤膜覆盖住凝胶，以赶走气泡。其上再盖上两张与凝胶大小相同并用2×SSC溶液浸润的3MM滤纸，并赶走气泡。最后再在上面放一厚叠裁好的纸巾纸巾上压一块玻璃板，板上压一重物(如500g的砝码)以形成液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜上行的流路，使凝胶中变性的DNA被洗脱迁移并吸附至纤维素滤膜上。维持液体毛细迁移8-24小时，每当纸巾浸湿后须更换纸巾。

转移结束后揭去纸巾及上面的3MM滤纸，翻转凝胶和纤维素滤膜，放于一张干的3MM滤纸上。用铅笔透过凝胶标记出加样孔在纤维素膜上的位置，之后剥离弃掉凝胶。用6×SSC溶液室温浸泡滤膜5分钟以除去滤膜上沾有的凝胶碎片。取出滤膜置纸巾上室温晾干30分钟以上。之后用两张3MM滤纸夹住滤膜在真空炉中80℃干烤0.5～2小时。

按每平方厘米硝酸纤维素滤膜0.2ml用量配制适量预杂交液(含6×SSC，5×Denhardt试剂)，0.5％SDS，100μg/ml经变性并断裂剪切成片段的鲑鱼精子DNA)。将烤干的滤膜浮于6×SSC液面上待其完全湿润后沉入液面内泡2分钟。然后将湿滤膜装入塑料袋中，加入配好的预杂交液，赶尽袋内气泡，用塑料封口机热封住塑料袋口，置68℃水浴中保温1～2小时。取步骤3制备的放射性标记的合成基因的探针1.4kb(双链DNA片段)适量，100℃水浴中保温5分钟使双链变性后，立即置冰上骤冷以防复性。从水浴中取出杂交袋，迅速剪开一角，将变性的探针液加入预杂交液中，赶尽气泡后重新封口，再用一新塑料袋封住杂交袋以防污染水浴，然后放回水浴中按所需杂交时间进行温育。完毕后取出杂交袋，剪开袋口倒弃杂交液至废物缸中，取出滤膜转入大体积的2×SSC及0.5％SDS溶液中室温浸泡5分钟。之后将滤膜转入大体积的2×SSC和0.1％SDS溶液中室温浸泡15分钟，伴随温和的摇动。之后，将滤膜转至新配的大体积的0.1×SSC及0.5％SDS溶液中37℃温育0.5～1小时，伴随温和的摇动。然后更换一次所泡溶液，并将盛溶液的容器转入68℃水浴0.5～1小时。这时可用手提式探测器检测膜上放射性活度值。最后再用0.1×SSC于室温下短暂漂洗滤膜，之后取出滤膜放于纸巾上吸去大部分液体。这时的滤膜即可下托一张保鲜膜，放入曝光夹中压上X光片及增感屏，置-70℃曝光适当时间(几小时至几天)。对X光片进行显影即可得到Southern阳性杂交的结果。(如附图42所示)。结果证明，从转基因植物中PCR扩增出的DNA片段，为合成基因的片段。

(5).植物总RNA的提取及mRNA的纯化和Northern杂交：

按下述程序制备棉叶总RNA及纯化mRNA：植物总RNA提取方法(S.B.Gelrin et al.，Plant Moldcular Biology MannalB1：1-22，Kluwer Academic Publishers 1988)如下。采摘新鲜幼嫩的棉叶，称重后放入盛有液氮的塑料离心管中，离心管则置于装有液氮的容器内。在另一离心管中加入等体积的RNA抽提缓冲液(含有100mM LiCl，1％SDS，100mM Tris-NaOH，pH9.0，10mMEDTA)加有0.1％的8-OH喹啉的重蒸苯酚，混合物置90℃水浴中预热。先将研钵和杆用液氮预冷，之后将棉叶转入研钵，在液氮液中研磨棉叶至均匀的细粉。取一在-80℃下预冷的三角瓶放在冰盐混合物中，将磨好的细粉转入三角瓶中，按每克植物鲜重加2ml的量加入混好的苯酚/抽提缓冲液，用力振摇三角瓶。可不时地在90℃水浴上加热直至不再含有冷冻材料的团块而成为乳状液。此时混合物的最终温度应在25～30℃之间。将三角瓶在旋转摇床上室温振摇，300rpm，5分钟。每克植物材料补加1ml氯仿，继续在室温振摇15～30分钟。将乳状液从三角瓶中转至离心管中，20000g离心30分钟(25℃)。取水相至新的三角瓶中，每克植物材料加1ml氯仿后，在振荡摇床上300rpm摇动，15分钟。之后将液体转入塑料离心管中，12000g离心15分钟，25℃。上相转至离心管中，加入1/3体积8M LiCl(已过滤灭菌)，混匀，置4℃沉淀RNA 16-48小时。最后离心12000，g，4℃，30分钟。用2M LiCl(已过滤灭菌)4℃下洗RNA沉淀一次，用80％乙醇洗沉淀2次，之后冷冻抽干。沉淀溶于适量重蒸水中，贮于-20℃。

按Pharmacia公司提供mRNA纯化试剂盒所述方法，从总RNA中纯化棉叶的mRNA，纯化后的mRNA可稀释后直接用于上文所说方法进行Northern印迹杂交：结果有约2kb的阳性杂交带出现，证明合成基因在植物中能够得以转录和表达。

(6).植物蛋白质的提取及Western杂交分析：

按下述方法(N.B.Carozszi et al.，Expression ofachimeric CaMV 35S Bacillus thuringiens isinsecticidalprotein gene in transgenic tobacco.Plant Mol.Biol.20：539-548，1992)提取植物蛋白质，所用植物蛋白质提取缓冲液含有50mM Na₂CO₃(pH9.5)，100mM NaCl，0.05％Triton，0.05％Tween，1M苯甲基磺酰氟，(PMSF)，1μM抑酶肽(leupeptin)10mM DTT。所得到的蛋白质等量地点到硝酸纤维素滤膜上用于Western杂交分析。用于杂交制备方法为：从表达所合成的B.t基因的重组菌中提取B.t.蛋白质作为制备一抗，然后取抗源100μg溶解于0.5ml缓冲液中加入等体积佐剂。采用肌肉内注射法免疫家兔获得抗体。Western blotting方法(M.J.Adang.etal..The reconstruction and expression of a Bacillusthuringiensis Cry III A gene in protoplasts and potatoplants.Plant Mol.Biol.21：1131-1145，1993)如下所述。将所提取的待测蛋白质样品上样进行聚丙烯酰胺电泳。然后转移至醋酸纤维素膜上。所用转移缓冲液包含25mM(Tris-HCl，pH9.5)192mM甘氨酸，20％甲醇。转膜后加入一抗(1％Moducyte)1小时。(抗体1∶100)，然后用TTBS(50mM Tris-HclpH7.5，200M NaCl，0.05％Tween)洗膜三次，每次5分钟。然后在TTBS缓冲液中加入1∶7500的二抗(连接有碱性磷酸酶的抗兔IgG(Promega)。反应30分钟后，洗涤硝酸纤维素膜数次。配制以下三种溶液用于蛋白质的染色，用10ml 0.001％二甲基甲酰胺溶解0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(RCIP)，用10ml 70％二甲基甲酰胺溶解0.5g氮蓝四唑(NBT)。磷酸酯酶缓冲液包含100mMNaCl，5mM MgCl₂，100mM Tris，pH 9.5，染色时取66μlNBT，10ml磷酸酯酶缓冲液，33μlBCIP，膜放入后，室温平缓摇动温育，至蛋白质带颜色浓度达到要求(约20分钟)。有一条约68KDa主蛋白质带出现，与合成基因表达杀虫蛋白质分子量基本相同，结果证明，合成基因在植物能够表达出杀虫蛋白质。

(8).重组植物的抗虫性试验

用生物抗虫方法进行抗虫鉴定试验，是上文所说方法中可能是最灵敏有效的方法。采摘R1代(当代种子为RO代，种子发芽生长出的植株为R1代)植株顶部或枝顶展开的嫩叶二张，分别放在两个培养皿中，每个培养皿放12头三日龄幼虫，置28℃恒温室内，于接虫后72小时计算死虫数，活虫数，并观察叶片受损程度，重复三次。计算死亡率或校正死亡率。

用农杆菌介导的方法，转化晋棉7号和晋棉12号的北方棉花品种命名为国家抗虫棉，简称GBJR。获得的三个独立系进行上文所说的抗虫试验，结果证明，合成基因能在植物中高效表达，并能遗传给后代和种子，R2代抗虫性接近正常的3:1遗传分离，最高抗虫性可达90％左右。结果如表7所示。

表7.R1代和R2代(GBJR)室内抗虫试验

R1代棉花植株	死亡率	R2代棉花株数	平均校正死亡率
				GBJR-20	72％	78	65％
		21	0
				GBJR-23	82％	36	79％
		13	0
				GBJR-24	96％	121	93％
		38	0
				SJ(对照)	3.7％	12	20％

用子房注射转化植物受精胚囊方法，转化2个棉花生产品种，获得34株GUS阳性植株，具有高抗虫性的植株有5个株系见表7，约占15％。其中以泗棉3号为启始品种的高抗虫性植株有4株(545，591，6369，1001)，中棉所12号为启始品种的高抗虫性植株有1株(1109)，这些独立抗虫棉花株系被命名为国家抗虫棉，简称GR棉。南方品种的转基因抗虫棉简称GNSR棉，北方品种的转基因抗虫棉，简称为GBZR棉的转基因抗虫棉。抗虫结果如表8所示。

由R1代GR棉产生的自交后代为R2代，如上文所说的方法进行的抗虫试验。来自不同群体的R2代，抗虫性表现出较大差异，4个GNSR株系均有抗虫性。抗虫性在80％-100％的植株223株，占86.4％；抗虫性在50％-100％的植株35株，占13.6％GBZR 1个株系，抗虫性在80％-100％的16株，占11％，抗性在50％-80％的34株，占21.7％；抗虫性在20％-50％106株，占67.5％，小于20％的有1株，占0.6％，对照组植物没有抗虫性。以上结果证明，合成基因能在植物中高效表达，用注射外源基因转植物受精胚囊方法得到的转基因植株，抗虫性能遗传给后代和种子，但抗虫性不成正常3∶1遗传分离的比例，结果如表9所示。表8.R1代GNSR和GBZR室内抗棉铃虫检测

棉花名称	编号	虫的平均死亡率(％)	叶片受损害率(％)
				GNSR	545	91.60	轻微
	591	93.75	轻微
					636	92.30	轻微
	1001	85.70	轻微
				泗棉3号(对照)		0	严重
GBZR	1109	75.00	轻微
				中棉12号(对照)		0	严重

表9.R2代国家抗虫棉(CR)株系群体抗虫检测(校正死亡率％)

R1代	R2代株数	100-80％	80-50％	50-20％	20-0％
						GNSR-545	103	93	10	0	0
GNSR-591	88	78	10	0	0
						GNSR-636	65	50	15	0	0
GNSR-1001	2	2	0	0	0
						GBZR-1109	157	16	34	106	1
泗棉3号(对照)	10	0	0	0	10
						中棉12号(对照)	10	0	0	0	10

检测抗虫棉在田间(网室)的抗虫试验结果见表9。结果证明与室内检测的结果基本一致。表现出较好的抗虫性。表10.R2代田间(网室)整株接种调查

棉花名称	校正死亡率	蕾铃被害率	顶尖被害率
				GRJR-20	75％	1.00％	0％
GRJR-23	85％	1.19％	0％
				GRJR-21	92％	0.78％	0％
GNSR-11	100％	0％	0％
				GNSR-16	85％	0％	0％
GNSR-36	90％	0.6％	0％
				泗棉3号(对照)	0％	14.1％	45％

总之，本发明制备的编码杀虫蛋白质的合成基因，有与植物相适应的碱基序列，与高效表达调控元件序列重组，构建成的基因加倍双向高效植物表达载体，通过农杆菌介导法和子房注射转化植物受精胚囊方法转化棉花及棉花生产品种，证明该合成基因能在植物中高效表达，并能将抗虫性遗传给后代和种子。获得的具有高抗虫能力的遗传稳定后的转基因棉花，能够应用于农业生产。

Claims (27)

1.合成的编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质或其部分的如附图1所示的核苷酸序列及其同源序列。

2.根据权利要求1的核苷酸序列，特征在于其编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质从氨基端约586至608个氨基酸的多肽序列或其同源序列。

3.根据权利要求1的核苷酸序列，特征在于其具有如附图1所示的核苷酸64至1824的序列。

4.根据权利要求1至3中任一项的核苷酸序列，特征在于其基本上是由适合于在植物细胞中表达的优化密码子组成的。

5.根据权利要求1至4中任一项的核苷酸序列，特征在于该序列是以化学方法合成的。

6.适于在植物细胞中表达苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质或其部分的融合基因构建体，其中包含：

1).5’端非编码区；

2).编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质氨基端的约586至608个氨基酸的核苷酸序列或其同源序列；以及

3).3’端非编码区。

7.根据权利要求6的融合基因构建体，其中所说的5’端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个编码核糖体结合蛋白的序列组成。

8.根据权利要求6的融合基因构建体，其中所说的5’端非编码区由以相反方向连接的四个增强子序列，两个启动子序列，两个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，及两个核糖体结合蛋白质的编码序列组成。

9.根据权利要求7或8的融合基因构建体，其中所说的启动子序列是CaMV 35S启动子序列。

10.根据权利要求7或8的融合基因构建体，其中所说的衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列是Ω序列。

11.根据权利要求7或8的融合基因构建体，其中所说的核糖体结合蛋白质的编码序列是Kozak序列。

12.根据权利要求6的融合基因构建体，其中2)中所说的编码序列具有如附图1中所示的核苷酸1-1824的序列。

13.根据权利要求6的融合基因构建体，其中2)中所说的编码序列具有如附图1中所示的核苷酸64至1824的序列。

14.根据权利要求6的融合基因构建体，其中3)中所说的3’端非编码区由一个多联终止子序列，一个融合基因转录产物的切割序列和一个融合基因转录产物的加工序列，一个类似多聚腺苷酸化信号序列，和一个多聚腺苷酸化序列所组成。

15.根据权利要求6的融合基因构建体，特征在于该融合表达载体的5’端非编码区和苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质基因序列及3’端非编码区均是以化学方法合成的。

16.用于携带权利要求6的融合基因构建体的载体，特征在于该载体带有根据权利要求9的5’端非编码区和权利要求15的3’端非编码区序列的，并且其中所述的编码蛋白质的核苷酸序列可用任何其他适于在植物中高效表达的外源基因序列所代替。

17.根据权利要求16的载体可选于自质粒载体pGUC20、pBI121.1和pBI121.2。

18.适于在植物细胞或整株植物中表达苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的重组表达载体，其具体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC NO.0247的携带于大肠杆菌DH5α中的重组表达载体的特征。

19.将携带外源基因的重组表达载体导入成熟的植物体内的方法，该方法包括恰好在所说的植物受精6-24小时左右，将所说的外源基因或其重组构建体通过子房注射到所说植物的受精胚囊中。

20.产生对害虫有抗性或杀虫能力的植物的方法，该方法包括：

1).合成包括如同附图1所示编码B.t.杀虫蛋白质之氨

基端氨基酸序列的核苷酸序列，和位于该序列的5’

端及3’端非编码区的融合基因序列；

2).将步骤1)中合成的所说的融合基因序列与适当的

植物表达载体连接，得到能够在植物细胞或整株植

物中表达所说的杀虫毒素蛋白质的重组表达载体；

3).将步骤2)中得到的重组表达载体转化或转染到植物

细胞内并整合到所说植物细胞的基因组中；

4).以细胞或组织培养技术由步骤3)得到的细胞或其组

织再生整株植物。

21.产生对害虫有抗性或杀虫能力的植物的方法，该方法包括：

1).合成包括如附图1所示编码B.t.杀虫蛋白质之氨基

端氨基酸序列的核苷酸序列，和位于该序列的5’端

及3’端非编码区的融合基因序列；

2).将步骤1)中合成的所说的融合基因序列与适当的植

物表达载体连接，得到能够在植物细胞或整株植物

中表达所说的杀虫蛋白质的重组表达载体；

3).将步骤2)中提到的重组表达载体导入到成熟的整株

植物的受精卵细胞中并整合到其基因组中；

4).由步骤3)中得到的包含所说的重组表达载体的受精

卵细胞发育成植物种子，并进而再生对昆虫害虫有

抗性或杀伤能力的植物及其后代。

22.根据权利要求20或21的方法，其中步骤1)中所说的融合基因序列具有权利要求1-5中任一项所限定的特征。

23.根据权利要求20或21的方法，其中步骤2)中所说的重组表达载体具有保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为(CGMCC)0247的携带于大肠杆菌DH5α宿主中的重组表达载体的特征。

24.根据权利要求21的方法，其中所说的将步骤3)中得到的重组表达载体导入成熟的整株植物的方法是如权利要求19所限定的方法。

25.根据权利要求20和21的方法，其中所说的植物是单子叶植物。

26.根据权利要求20和21的方法，其中所说的植物是双子叶植物。

27.根据权利要求20和21的方法，其中所说的植物是棉花植物。

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