CN1614021A - 韧皮部特异性表达启动子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种韧皮部特异性表达启动子。具体地说，该启动子来自于与中国番茄黄化曲叶病毒相伴随的卫星分子－DNAβ。分离的启动子是该DNAβ分子的βC1 ORF的全长启动子及部分缺失启动子序列。实验表明来自于中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF的启动子为韧皮部特异性表达的启动子。本发明涉及了中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF的全长启动子和缺失启动子序列以及含有该βC1 ORF全长启动子和缺失启动子序列的表达盒。

Description

韧皮部特异性表达启动子

技术领域

本发明涉及用于产生转基因植物的DNA构建体和方法。具体地说，本发明涉及中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF全长启动子序列及其缺失启动子序列的分离。本发明也涉及含有连接异源基因的中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF全长启动子和缺失启动子的载体盒的构建。另外，本发明也涉及用含有中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF各种启动子的表达载体进行瞬间表达和稳定表达的方法。

背景技术

植物基因工程的目的是将外源基因导入受体植物后使其正确而有效地表达。然而这一过程受到很多因子的影响与制约，适合的启动子是外源基因有效表达的关键因素。

至今，已有许多不同来源的启动子被用于转化植物细胞。其中一大类是从根癌农杆菌中分离出来的，另一大类为植物本身来源的启动子，由于上述启动子控制的目标基因表达量往往较低，以及与受体植物细胞基因组序列具有一定的同源性，所以在转基因植物中人们通常选用植物病毒启动子。目前在植物基因表达中广泛应用的启动子是组成型启动子，如大多数双子叶转基因植物中使用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因几乎在转基因植物的所有部位和发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物体内持续、高效的表达往往会对植物的生长发育造成负面影响，有时也会与外源基因特异性表达的研究目的背道而驰。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物生长发育的不利影响，人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。目前已发现的特异性启动子大多数来源于植物基因组，如种子特异性表达启动子PHA-L，韧皮部特异表达启动子RsS1，马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)基因启动子，与番茄成熟蛋白有关的特异性启动子以及受光调节的RubisoN亚基和叶绿素a/b结合蛋白基因的启动子等。这些特异性启动子的应用实现了外源基因在植物中时空特异性的表达。

DNAβ分子是与某些单分体双生病毒伴随的卫星分子。该分子大小约1.3kb，是其辅助病毒基因组的一半左右。DNAβ分子依赖于其辅助病毒进行DNA复制，依赖于宿主植物的转录机制进行转录和表达。其基因组中存在一个高度保守的βC1 ORF，已有研究表明该编码区表达的蛋白是一种致病相关因子，其缺失并不影响DNAβ分子的复制，并且已有实验表明DNAβ分子可以做为表达载体进行遗传操作。本发明的开展一方面通过了解决定致病相关蛋白βC1的启动子的活性，可以深入了解该蛋白的表达强度，并且能反映该表达载体的表达效率；另一方面，由于已鉴定的双生病毒的启动子中多数为组织特异性表达的启动子，期望与其伴随的DNAβ分子中的启动子为某种组织特异性表达的启动子，能为植物基因表达提供一些有价值的特异性表达元件。βC1 ORF启动子是影响该病毒卫星载体表达效率的重要因素，该启动子的表达类型也决定了其在转基因中的应用价值。基于此，本发明鉴定了βC1 ORF的全长启动子的活性及表达类型以及各缺失启动子的表达活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种韧皮部特异性表达启动子。

分离的具有下列组序列的DNA，它包括中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1ORF的全长启动子序列和缺失启动子序列：

(a)全长启动子955的SEQ ID NO：1序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；

(b)缺失启动子955Δ784的SEQ ID NO：2序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；

(c)缺失启动子955Δ557的SEQ ID NO：3序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；

(d)缺失启动子955Δ2.27的SEQ ID NO：4序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；

(e)65℃下，在含6×SSC、1％SDS、100μg/ml鲑精DNA和5×Denhardt’s的溶液中在20小时内能与上述(a)-(d)中任一项进行杂交的在植物中具有启动子活性的DNA序列。

DNA构建体，它包括权利要求1所述的分离的DNA以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因选自于下列组成的基因：杀虫剂基因，除草剂抗性基因，抗真菌基因，抗病毒基因，抗微生物基因。

含有权利要求2所述的重组DNA的载体，转化的细胞为植物细胞。

植物细胞，其中向该植物中导入了权利要求2的重组DNA。

利用植物细胞表达有效基因的方法，包括下列步骤：

(a)以该有效基因可表达的方式将该有效基因连接到权利要求1的分离的DNA的下游以获得重组DNA片段；

(b)将该重组DNA片段插入表达载体中；

(c)用该载体转化植物细胞；

(d)培养该植物细胞。

利用植物细胞制备蛋白质的方法，包括下列步骤：

(a)按照编码所需蛋白质的DNA可以被表达的方式将编码所需蛋白质的DNA连接到权利要求1的分离的DNA的下游以获得重组DNA片段；

(b)将重组DNA片段插入到载体中；

(c)培养该植物细胞；

(d)从培养物中回收所需的蛋白质。

植物基因组，含有权利要求3，4所述的DNA构建体。

表达载体，含有权利要求1的DNA，其中所述载体是适用于植物细胞的质粒载体或表达载体，所述载体可以插入有效基因，其中所述有效基因选自于下列组成的基因：杀虫剂基因，除草剂抗性基因，抗真菌基因，抗病毒基因，抗微生物基因。

本发明的优点

1.应用本发明中的启动子，在植物抗病基因工程中可以实现高效经济的抗病目的。

韧皮部是植物维管组织的重要组成部分，由于主要负责植物体内糖等光合产物从叶到其它组织器官的运输，因而成为许多植物病虫害，特别是一些刺吸式昆虫的直接侵害目标。因为韧皮部在植物组织内部，使得一些杀虫剂的药效不显著，而且目前还没有有效的药物能对一些韧皮部发生的病毒病进行防治，所以采用转基因的方法进行病毒病和病虫害的防治就显得尤为必要，而在此过程中韧皮部启动子的作用则更为关键。组织化学染色法结果表明，本发明中的全长启动子和最小缺失启动子在转基因植株根、茎、叶的韧皮部组织都能够特异性表达(如图6和7)。此外，组成型表达的强启动子通常会导致外源基因在植株体内的过量表达，从而对植株生长发育产生负面影响。本发明中全长启动子活性略强于其它缺失启动子的活性，与强组成型表达启动子CaMV 35S启动子活性相比，全长启动子活性是它的17.77％，所以该启动子驱动的外源基因的表达量并不会对植株的生长发育产生不利影响。综合本发明启动子的韧皮部特异性表达和非过量表达外源基因的优点，应用于植物抗病基因工程中能够达到更经济有效的抗病目的。

2.应用本发明中的启动子，可以消除植物转基因中引起的基因沉默现象。

植物基因工程中使用的植物启动子由于与受体植物基因组具有一定的同源性，往往会在寄主植物体内引起基因沉默现象。而本发明中的启动子，由于与植物基因组序列没有同源性，所以能够避免基因沉默现象的发生。

3.应用本发明中的启动子，可以进行植物分化机制研究。

在植物细胞分化过程中韧皮部特异性启动子对某些特定基因的表达调节及韧皮部的形成可能起着重要作用，所以研究这类启动子的特殊调节功能将会有助于人们对细胞分化分子基础的了解。

附图说明

图1是中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ分子的βC1 ORF启动子的系列缺失图。以βC1 ORF的转译起始位点(ATG)为+1位。

图2是启动子表达载体构建图。克隆后的启动子片段经限制性内切酶HindIII/BamH I双酶切后插入表达载体pINT121的HindIII/BamH I位点，构建成启动子表达载体。

图3是表达载体构建图。表达载体pINT121经限制性内切酶BamH I/EcoRI双酶切后产生的GUS-NOS片段与BamH I/EcoR I双酶切后的pBINPLUS载体片段连接，构建成表达载体pBINGUS，其中pINT121用于阳性对照，pBINGUS用于阴性对照。

图4是各启动子的GUS瞬间表达染色图片。A-D分别代表启动子955Δ784，955Δ557，955，955Δ227，E为阳性对照pINT121，F为阴性对照pBINGUS。

图5是启动子的瞬时表达GUS活性A，各启动子的多次重复GUS活性；B，各启动子的相对平均GUS活性。A，B中pBINGUS为阴性对照，pINT121为阳性对照，n代表每个启动子的独立实验重复次数。通过统计软件SPSS 12中的多重比较方法ANOVA中的LSD检验对实验数据进行差异显著性分析(P＜0.05or P＜0.01)，误差线代表标准差。

图6是全长启动子955的转基因染色图片。A，根的纵切面；B，根的横切面；C，茎的徒手切片；D-E，茎的横切面；F，叶片的背部；G-H，叶片的横切面。rc，根冠；vc，维管柱；vb，维管束；X，木质部；P，韧皮部；ip，内韧皮部；ep，外韧皮部；vein，叶脉；pm，栅栏组织；sm，海绵组织；vb，维管束；bar＝20μm.

图7是缺失启动子955Δ784的转基因染色图片。A，根的纵切面；B，根的横切面；C，茎的徒手切片；D-E，茎的横切面；F，叶片的背部；G-H，叶片的横切面。rc，根冠；vc，维管柱；vb，维管束；X，木质部；P，韧皮部；ip，内韧皮部；ep，外韧皮部；v，叶脉；pm，栅栏组织；sm，海绵组织；vb，维管束；bar＝20μm.

具体实施方式

本发明描述了能在韧皮部特异表达的病毒卫星启动子，它是与中国番茄黄化曲叶病毒相伴随的DNAβ分子(AJ421621)的βC1 ORF启动子。本发明中以感染有中国番茄黄化曲叶病毒的烟草植物总DNA为模板，克隆并鉴定了中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ分子的βC1 ORF全长启动子以及缺失启动子，表1显示了各启动子的序列。中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF全长启动子的全部天然序列有955个碱基对，根据DNAβ分子基因组的结构特征，对全长启动子进行了一系列缺失。缺失启动子955Δ784的特征是缺失全长启动子中-173至-956的片段(启动子的序列为SEQ ID NO：2)；缺失启动子955Δ557的特征是缺失全长启动子中-399至-956的片段(该启动子的序列为SEQ ID NO：3)；缺失启动子955Δ227的特征是缺失-173至-399的片段(该启动子的序列为SEQ IDNO：4)，在启动子的活性分析中发现，各缺失启动子仍保留了活性(图4)。

本发明描述了植物细胞中基因产物表达的方法。将已克隆的启动子与β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)融合构建植物表达载体，通过农杆菌浸润法使GUS基因在烟草植物细胞中进行瞬间表达；将构建后的植物表达载体通过叶盘法转入烟草细胞中，使GUS基因在烟草细胞中进行稳定表达。

本发明还描述了植物细胞中GUS活性的鉴定和检测方法。在植物细胞的瞬间表达体系中，将植物组织进行组织化学染色后通过蓝色位点的出现与否可以鉴定其gus基因是否表达；通过荧光光度分析来检测其表达活性。本发明中的实验证明βC1 ORF全长启动子及其缺失启动子均具有启动子活性，相比之下前者活性较强，但其只是CaMV 35S启动子的10-16％；将各启动子表达载体通过叶盘法转入烟草植株中，GUS组织化学染色后通过蓝色位点的表达部位进一步鉴定其上游启动子的表达类型。结果表明，βC1 ORF全长启动子能够驱动GUS基因在转基因植株根、茎、叶维管组织的韧皮部细胞特异性的表达，韧皮部表达的最小序列位于缺失启动子955Δ784内部，说明该缺失启动子内部存在有韧皮部特异性的表达元件。

本发明中的中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF全长启动子或其缺失启动子可组织特异性地表达所需要的任何异源基因。合适的异源基因的例子包括：杀虫毒素基因，除草剂抗性基因，抗微生物的基因，抗真菌基因，抗病毒基因。

本发明中将含有中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF启动子和异源基因的构建体插入到一种载体中，产用该载体转化一种真核宿主。优选的真核宿主是一种植物细胞，优选的载体是对于双子叶植物而言可以是一种根癌农杆菌(agrobacterium)Ti质粒衍生物，该质粒衍生物通过农杆菌介导的双元载体技术导入植物细胞，这种技术是本领域内所熟知的。将已转化植物细胞培养于一种合适培养基中，并再生出植株。

本发明包括来自于中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF全长启动子和缺失启动子DNA序列以及含有以上序列的DNA构建体。同时，本发明还包括是中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF启动子的“功能等同物”的DNA序列，以及含有有效连接到异源基因上的这样的DNA序列的构建体。

本发明还包括使用如本文所述的βC1 ORF启动子的“功能等同物”赋予处于它们控制下的任何基因的组织特异性的表达。

如在整个说明书和权利要求书中所使用的，应用如下定义：

本发明中使用的术语“启动子”包括TATA盒或类似区域，它定位于转译起始点(+1)上游20-30个碱基处并且它具有诱导RNA聚合酶在正确位置上启动转录的功能，但不限于该区域附近的部分。

本发明中使用的术语“启动子活性”是指当以该基因的可表达方式将有效基因连接到启动子的下游，并导入到宿主(植物细胞)中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该有效基因产物的功能。通常是将容易定性、定量检测的蛋白质编码基因(报告基因)连接至启动子的下游，然后将构建后的基因导入宿主内，检测表达蛋白情况，以此来确定是否存在特定启动子的活性以及其效力如何。

“缺失启动子”是指任何有缺失而仍具有启动子活性的中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF启动子。

“功能等同物”是指在严格杂交条件下与一个DNA序列互补的任何DNA序列，该序列与该参照物杂交并且有类似于中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1ORF启动子的活性。

具体实施方式

采用下面的非限制性实施例对本发明作进一步描述。

实施例1全长启动子和缺失启动子的构建

基本上按照Sambrook等所述方法(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1989)实施分子技术。

中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF启动子片段的克隆以及序列测定

以感染中国番茄黄化曲叶病毒的烟草叶片为材料，用CTAB法提取植物总DNA[Murray MG et al.，1987，EMBO J，6：3901～3907]。预扩增的各启动子片段见图1。以植物总DNA为模板，通过特异性引物扩增中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF的各启动子片段。引物FL(5′CCGAAGCTTTACATATATATACG3′，相应于SEQ ID NO1中的1-14位，引入了HindIII位点)和RL(5′AATGGATCCTGAGTCTGTTCTG3′，相应于SEQ ID NO1中的955-943位，引入了BamHI位点)扩增全长启动子(SEQ ID NO：1)。引物F1(5′GGCAAGCTTTTTTACTATTTTAGTTTAT 3′，相应于SEQ ID NO：2中的1-19位，引入了HindIII位点)和RL(5′AATGGATCCTGAGTCTGTTCTG 3′，相应于SEQ ID NO：2中的172-160位，引入了BamHI位点)扩增缺失启动子955Δ784(SEQ ID NO：2)。引物F2(5′GGCAAGCTTTTTACTATTITAGTITA3′，相应于SEQ ID NO：3中的1-17位，引入了HindIII位点)和RL(5′AATGGATCCTGAGTCTGTTCTG 3′，相应于SEQ ID NO：3中的399-387位，引入了BamHI位点)扩增缺失启动子955Δ557(SEQ ID NO：3)。引物FL和RAD(5′AATAAGCTTTGAGTCTGTTCTG 3′，相应于SEQ ID NO：3中的399-387位，引入了HindIII位点)扩增的片段与缺失启动子955Δ784的片段连接产生缺失启动子955Δ227(SEQ ID NO：4)。扩增后的PCR产物经HindIII和BamHI直接酶切后经QiaGen凝胶纯化试剂盒回收目的片段，用于载体构建。

实施例2 GUS融合表达载体的构建

用限制性酶HindIII和BamHI消化双元表达载体pINT121(该载体由中科院微生物所方荣祥院士惠赠)，将酶切后的全长启动子和各种缺失启动子片段插入该位点，构建为启动子表达载体(图2)：全长启动子构建体为pINT-FL，缺失启动子955Δ784的构建体为pINTΔ784，缺失启动子955Δ557的构建体为pINTΔ557，缺失启动子955Δ227的构建体为pINTΔ227。

用BamHI和EcoR I双酶切表达载体pINT121，酶切后的GUS-NOS片段插入到表达载体pBINPLUS的BamHI/EcoR I位点中，构建后的载体为pBINGUS，该载体作为阴性对照，载体pINT121作为阳性对照(图3)。

实施例3农杆菌转化

将各启动子构建物通过三亲交配法导入农杆菌宿主细胞[王关林，植物基因工程原理与技术.北京：科学教育出版社，1998]。具体方法如下：构建后的启动子表达载体需要通过辅助质粒pROK2013的介导才能进入农杆菌EHA105。构建后的启动子表达载体接种5ml含Km(50μg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养；EHA105接种5ml含Sm(50μg/ml)YEP液体培养基，28℃下200rpm培养48小时；辅助质粒pROK2013接种5ml含Km(50μg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养。三种菌液各取400μl，颠倒混匀后，6000rpm 30秒收集菌液，收集的菌体用200μl ddH₂O悬浮，用玻璃涂棒涂布于没有抗性的YEP固体培养基平板进行三亲交配，28℃培养24小时后，蘸取少量菌斑连续涂布分别含有Km(50μg/ml)和Sm(50μg/ml)的二块YEP固体培养基平板上，以此得到含有启动子构建体的单菌落。用特异性引物对其进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。

实施例4启动子的瞬间表达

1)农杆菌的培养及诱导：参照文献[Jyoti Kapila et al.，1997.Plant Science122：101-108]将各启动子表达载体的农杆菌菌液接种于含相应抗生素的液体培养基YEB(5g/L牛肉浸膏，1g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，5g/L蔗糖，2mM硫酸镁，pH5.8)中，培养至对数生长期，离心收集菌体，重悬于MMA溶液(10mmol/L2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES，pH5.6)、100μmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L氯化镁)，并调整菌液浓度使其OD₆₀₀＝1.5，室温静置放置3h。

2)瞬间表达：参照文献[刘兆明等，2002，生物工程学报18卷4期：411-414；Yinong Yang et al.2000.The Plant Journal，22(6)，543-551]对植株叶片采取农杆菌浸润法。具体方法：选取6-7周龄本氏烟植株中部未完全展开叶片，取一支1ml的一次性注射器，摘掉针头，用针管靠压力将500μl重悬菌液完全注入每片叶片的脉间细胞中。对植株茎部采用农杆菌注射法，即将500μl重悬菌液用1ml的一次性注射器注入植株茎的中部。将农杆菌浸润和农杆菌注射后的植株于25℃恒温室中培养，光照周期为16/8小时。60-72h后取样进行GUS组织化学染色和GUS荧光活性分析。

实施例5 GUS检测

组织化学染色法：参照文献[Jefferson RA et al.EMBO J，1987，6：3901～3907.]将注射后的植株茎部做徒手切片。置于含有1mmol/L X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸)染色液中于37℃温育3小时至过夜。样品经75％乙醇脱水至无色，经解剖镜观察照相。如图4，图中的A-D分别代表启动子955Δ784，955Δ557，955，955Δ227，E为阳性对照pINT121，F为阴性对照pBINGUS。从图中可以看出，全长启动子955及其缺失启动子均能驱动β-葡萄糖醛酸酶基因在植物茎中瞬间表达，其中全长启动子955及缺失启动子955Δ227的表达活性略强于缺失启动子955Δ784和955Δ557，阳性对照pINT121呈现了明显的蓝色表达位点，而阴性对照pBINGUS没有出现蓝色表达位点。从表达强度上看，中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF的各个启动子的GUS基因表达强度远远低于阳性对照pINT121。

荧光光度测定法：参照文献[Jefferson RA et al.EMBO J，1987，6：3901～3907.]将采样后的植株叶片经液氮研磨，加入3倍体积的GUS提取液(50mmol/L磷酸缓冲液pH7.0，10mmol/L乙二胺四乙酸二钠，0.1％(w/v)Triton X-100，0.1％(w/v)十二烷基肌氨酸钠，10mmol/L β-巯基乙醇)，离心后取上清10ul与4-MUG(4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸)反应，荧光光度仪测定GUS活性。如图5，A为各个启动子构建物多次重复后(重复次数不小于4)测得的GUS活性，B为各启动子构建物的平均表达活性。实验数据通过spss12.0软件的多次重复比较ANOVA的LSD方法进行分析，以阳性对照pINT121的35S启动子活性为参照，结果表明全长启动子955的活性是阳性对照的17.77％，缺失启动子955Δ784的活性是35S启动子的6.41％，缺失启动子955Δ557活性是35S启动子的8.29％，缺失启动子955Δ227的活性是35S启动子的15.44％。全长启动子955与缺失启动子955Δ784(P＝0.000)以及和缺失启动子955Δ557(P＝0.003)的差异均达到了极显著水平(P＜0.01)；全长启动子955与缺失启动子955Δ227之间存在显著性差异(P＝0.441，P＞0.05)；缺失启动子955Δ784和缺失启动子955Δ557之间存在显著性差异(P＝0.519，P＞0.05)；缺失启动子955Δ227与缺失启动子955Δ784(P＝0.008)之间存在极显著性差异(P＜0.01)，与缺失启动子955Δ557(P＝0.037)之间存在显著性差异(P＜0.05)，见表2。

表2

启动子                       缺失片段         相对GUS平均活性       实验重复次数

955Δ784                    -956～-173         6.41±0.55                6

955Δ557                    -956～-359         8.29±1.34                5

956Δ227                    -399～-173         15.44±1.47               4

955                         -                  17.77±8.04               7

Promoterless(pBINGUS)                          1.19±0.26                6

CaMV 35S(pINT121)                              100.00±19.64             8

注：—代表无缺失片段；表中相对活性以CaMV 35S启动子为参照。

实施例6植物转化

从健康普通烟草植株上采集叶片，参考文献[Horsch RB et al.，Science，1985，227：1229～1231]。具体如下：将切好的烟草叶片小块浸润于各个启动子构建物90秒后置于无抗的生芽培养基上预培养2天。然后用培养至对数生长期的农杆菌菌液进行转化，置于无抗的生芽培养基上暗培养2天，再转至抗性培养基上(卡那霉素100μg/ml和羧苄青霉素500μg/ml)培养。待抗性小芽长至约1厘米时切下，移至生根培养基中(卡那霉素200mg/L和羧苄青霉素100mg/L)，长至一个月大小的抗性小苗用于组织化学分析。

实施例7组织切片

切芽一个月后，随机选取4株PCR筛选到的阳性转基因小苗，分别将其根、茎制作徒手切片和小块，叶片切成小块，置于1mmol/L X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸)染色液中于37℃温育3至12小时。根、茎的徒手切片以及叶片小块用75％乙醇溶液脱水至无色，在解剖镜下观察照相。染色后的根、茎及叶片的小块经2.5％戊二醛4℃固定过夜。用梯度浓度的乙醇溶液(50％，70％，80％，90％，95％，100％)对样品进行脱水处理，最后用环氧树脂包埋过夜。包埋好的各样品用半薄切片机进行切片，显微镜下观察照相。发现全长启动子955在转基因植株的根、茎及叶中均能表达。其中在根的维管柱中有明显的GUS表达，而在根冠中没有观察到GUS染色(图6，A)；在根部组织的横切面中可以观察到维管组织的韧皮部中有明显的蓝色表达位点，而木质部中没有任何表达位点出现(图6，B)；在茎的维管组织，尤其是韧皮部组织中有较明显的GUS染色，而在皮层薄壁细胞及维管组织中的木质部组织中均没有观察到GUS表达位点(图6，C-E)；在转基因植株叶片背部的叶脉组织中有明显的蓝色表达位点，而在旁侧的脉间细胞没有GUS表达位点(图6，F)，叶片横切面的观察结果与此一致，在栅栏组织、海绵组织中均没有观察到蓝色的表达位点，而在次级维管组织的韧皮部中观察到了蓝色表达位点(图6，G，H)。在缺失启动子955Δ784的转基因植株中观察到了相同的表达模式(图7，A-H)，即在其根、茎、叶的维管组织中韧皮部细胞都能特异性表达gus基因，而在其它细胞中如皮层薄壁细胞，木质部细胞、叶肉细胞中都没有发现GUS表达位点，但强度较全长启动子有所下降。以上结果表明βC1 ORF全长启动子955在植物细胞中具有韧皮部表达的组织特异性，这种组织特异性在其缺失启动子955Δ784中依然存在，说明在缺失启动子955Δ784的序列中存在有韧皮部特异性表达的元件。

以上的实例是用来描述本发明，而不是限制本发明。由前面的描述来看，除了本文所说明和描述的外，本发明的各种修改对本领域技术人员来说是浅显易懂的，且这些修改在附加权利要求的范围内。

           序列表

(1)一般资料

(i)申请人：浙江大学

(ii)发明主题：一种韧皮部特异性表达启动子

(iii)序列数：4

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：955碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)推测：非

(iv)反义：非

(v)序列描述：SEQ ID NO：1

tacatatata tacgtattca aatatatgaa ttaaataaaa ttcttattat tctgacctaa 60

tttatttatt ttaaataggc ccaatataca aagtccatta aatataggcc cataacttaa 120

cggcccaatt gcattaccaa agcccatttt ccttactttt ctttatgtgg gacccacctc 180

aacggcaaag accccgctcg ccaccggtaa tattagaacg gtggcgagct aagctccggc 240

gtagctaagg ctgctgcgta gcgtagtggt ttctaccctc ccaggggtac acactgccgc 300

gcgtgtcgca aattgatgac cggaaggccc tcaatcggag ttccggtgag tttttggaga 360

gagaaactta actttttcag cgcaatacca cgcgcccctc agacacaggg ataagggtat 420

ttttggaaat tgcacattgg ggcactaata ggggaaccga tgtatcggtg tcccaattac 480

cattggtgtc ccaattattt acctctgaga tgaaagtagt ttttttatta ccgcgcagta 540

aaatcatcat gacgatttta ctattttagt ttatttgttt tgattttatt ctttttattt 600

ttttatttta ctatcttgtt gattttattt gtttcaaatt tacctttttt tttttccgct 660

gcgctccctt ttctttctta atatatattt gtttgggttt atgtttatta tcttatttcc 720

ttttcttttt tattttattc tatatttact tcttctttct actcctcttt ccatttcttt 780

ttacacataa taatccagat tattatgtca ttagtaaaag taatcatggt taatattcat 840

gtcactatca aacatacata tctccactag taggcatatg aacaacaatg aaacacgtaa 900

atcattacag tccatatatc acaattccta gcattattta agcagaacag actca      955

(3)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：172碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)推测：非

(iv)反义：非

(v)序列描述：SEQ ID NO：2

cacataataa tccagattat tatgtcatta gtaaaagtaa tcatggttaa tattcatgtc 60

actatcaaac atacatatct ccactagtag gcatatgaac aacaatgaaa cacgtaaatc 120

attacagtcc atatatcaca attcctagca ttatttaagc agaacagact ca         172

(4)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：399碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)推测：非

(iv)反义：非

(v)序列描述：SEQ ID NO：3

tttactattt tagtttattt gttttgattt tattcttttt atttttttat tttactatct 60

tgttgatttt atttgtttca aatttacctt tttttttttc cgctgcgctc ccttttcttt 120

cttaatatat atttgtttgg gtttatgttt attatcttat ttccttttct tttttatttt 180

attctatatt tacttcttct ttctactcct ctttccattt ctttttacac ataataatcc 240

agattattat gtcattagta aaagtaatca tggttaatat tcatgtcact atcaaacata 300

catatctcca ctagtaggca tatgaacaac aatgaaacac gtaaatcatt acagtccata 360

tatcacaatt cctagcatta tttaagcaga acagactca                        399

(5)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：728碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)推测：非

(iv)反义：非

(v)序列描述：SEQ ID NO：4

tacatatata tacgtattca aatatatgaa ttaaataaaa ttcttattat tctgacctaa 60

tttatttatt ttaaataggc ccaatataca aagtccatta aatataggcc cataacttaa 120

cggcccaatt gcattaccaa agcccatttt ccttactttt ctttatgtgg gacccacctc 180

aacggcaaag accccgctcg ccaccggtaa tattagaacg gtggcgagct aagctccggc 240

gtagctaagg ctgctgcgta gcgtagtggt ttctaccctc ccaggggtac acactgccgc 300

gcgtgtcgca aattgatgac cggaaggccc tcaatcggag ttccggtgag tttttggaga 360

gagaaactta actttttcag cgcaatacca cgcgcccctc agacacaggg ataagggtat 420

ttttggaaat tgcacattgg ggcactaata ggggaaccga tgtatcggtg tcccaattac 480

cattggtgtc ccaattattt acctctgaga tgaaagtagt ttttttatta ccgcgcagta 540

aaatcatcat gacgatcaca taataatcca gattattatg tcattagtaa aagtaatcat 600

ggttaatatt catgtcacta tcaaacatac atatctccac tagtaggcat atgaacaaca 660

atgaaacacg taaatcatta cagtccatat atcacaattc ctagcattat ttaagcagaa 720

cagactca                                                          728

Claims (9)

1.一种分离的具有下列组序列的DNA，其特征在于包括中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF的全长启动子序列和缺失启动子序列：

(a)全长启动子955的SEQ ID NO：1序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；

(b)缺失启动子955Δ784的SEQ ID NO：2序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；

(c)缺失启动子955Δ557的SEQ ID NO：3序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；

(d)缺失启动子955Δ227的SEQ ID NO：4序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；

(e)65℃下，在含6×SSC、1％SDS、100μg/ml鲑精DNA和5×Denhardt’s的溶液中在20小时内能与上述(a)-(d)中任一项进行杂交的在植物中具有启动子活性的DNA序列。

2.一种DNA构建体，其特征在于包括权利要求1所述的分离的DNA以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因选自于下列组成的基因：杀虫剂基因，除草剂抗性基因，抗真菌基因，抗病毒基因，抗微生物基因。

3.含有权利要求2所述的重组DNA的载体。

4.根据权利要求2或3所述的DNA构建体，其特征在于转化的细胞为植物细胞。

5.植物细胞，其中向该植物中导入了权利要求2的重组DNA。

6.利用植物细胞表达有效基因的方法，包括下列步骤：

(a)以该有效基因可表达的方式将该有效基因连接到权利要求1的分离的DNA的下游以获得重组DNA片段；

(b)将该重组DNA片段插入载体中；

(c)用该载体转化植物细胞；

(d)培养该植物细胞。

7.利用植物细胞制备蛋白质的方法，包括下列步骤：

(a)按照编码所需蛋白质的DNA可以被表达的方式将编码所需蛋白质的DNA连接到权利要求1的分离的DNA的下游以获得重组DNA片段；

(b)将重组DNA片段插入载体中；

(c)培养该植物细胞；

(d)从培养物中回收所需的蛋白质。

8.一种植物基因组，其特征在于含有权利要求2或3所述的DNA构建体。

9.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1的DNA，其中所述载体是适用于植物细胞的质粒载体或表达载体，所述载体可以插入有效基因，其中所述有效基因选自于下列组成的基因：杀虫剂基因，除草剂抗性基因，抗真菌基因，抗病毒基因，抗微生物基因。

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