CN100351269C - 类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的杀虫蛋白基因以及该基因编码的蛋白质。该杀虫蛋白基因，来源于类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，这种基因所编码的蛋白对蝗虫及直翅目昆虫具有广泛的、较强的毒杀作用，可用于作物的虫害防治。本发明还提供了类产碱假单胞菌杀虫蛋白的分离纯化方法。以及提供一种生产抗虫的转基因植株的方法。

Description

类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因

                                   技术领域

本发明涉及类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的杀虫蛋白基因，所述杀虫蛋白基因可用于在宿主细胞中表达。

                                   背景技术

近30年来，已有很多以昆虫病原微生物为主体成分的微生物杀虫剂相继问世。这些微生物杀虫剂由于所使用的病原微生物不同，因而杀虫机制存在很大的差异。业已证实细菌杀虫剂的杀虫机制通常与细菌毒素蛋白有很大的关系(喻子牛，苏云金孢杆菌的生产与应用[M].北京：农业出版社1993)。自1888年发现第一个毒素蛋白即白喉毒素以来，已经相继在各种细菌中发现了数百种细菌毒素。其中，已有很多细菌毒素蛋白得到详细研究。

至今对细菌毒素的研究主要集中于人畜致病菌的毒素蛋白，这类毒素的结构功能及致毒机理研究已取得令人瞩目的成果。例如，已经证实白喉杆菌(Corynebacterium diphteriae)产生的白喉毒素(diphteria toxin)是由A、B两个亚基构成的二聚体，分子量为62kD，其中A亚基分子量为24kD，B亚基分子量为38kD。白喉毒素具有很强的毒性，几微克毒素就足以致人于死命。该毒素是由寄生于白喉杆菌内的溶原性噬菌体基因组编码，其致毒机制是抑制细胞内的蛋白质合成。白喉毒素可与肽链延伸因子EF2发生不可逆结合，从而抑制肽链的移位作用(沈同、王镜岩，生物化学[M].北京：高等教育出版社1991)。铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A)也是一种毒力极强的细菌毒素，一个毒素分子进入细胞质就足以杀死细胞，该毒素蛋白是由613个氨基酸构成的单链蛋白，分子量为66kD。铜绿假单胞菌外毒素A的三个结构功能区都位于一条肽链上，这三个结构功能区可行使其细胞毒性所必需的细胞结合、转位及ADP-核糖基化三种功能。其致毒机制与白喉毒素相似，也是通过灭活延伸因子EF2而产生细胞毒性作用。铜绿假单胞菌外毒素A通过催化真核细胞的EF2发生ADP-核糖基化，从而阻止肽链延伸，终止细胞的蛋白质合成(杜世或，绿脓杆菌外毒素A的结构功能及其重组毒素[J].生物化学与生物物理进展，1995，22：112-117)。

对白喉毒素及铜绿假单胞菌外毒素A等细菌毒素的结构功能进行详细研究，是基于这些细菌毒素在肿瘤疾病的导向治疗方面具有广阔的应用前景。通过基因重组技术，将细菌毒素蛋白基因的细胞结合区去除后，再与特定的抗体基因融合形成杂合基因，转入大肠杆菌等细胞以生产免疫毒素，可用于某些疾病如肿瘤的治疗。

至今发现的细菌毒素蛋白大多对人畜有致毒作用，而专一性作用于昆虫的细菌毒素蛋白还所知甚少，且主要集中于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)。目前应用最广泛的细菌杀虫剂为苏云金芽孢杆菌制剂。苏云金芽孢杆菌的杀虫作用主要是由菌体生长过程中产生的一种毒素蛋白—杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein)所致(Knowles B.H.，Mechanism of action of Bacillusthuringiensis insecticdalσ-endotoxins[J].Adv insect Physiol，1994，24：275-307)。迄今已发现上百种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白，每种杀虫晶体蛋白都具有特定的杀虫谱，可针对不同的靶标昆虫发挥毒杀作用。

最近的研究表明，假单胞菌属(Pseudomonas)的一种细菌类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)也存在一种对昆虫有致毒作用的毒素蛋白，在菌体发酵过程中，杀虫蛋白分泌于发酵液，利用该菌发酵液进行毒力实验，发现对蝗虫有较强的杀虫活力(杨志荣，朱丈，葛绍荣等，类产碱假单胞菌防治草地蝗虫的研究[J].中国生物防治，1996，12(2)：55-57；刘世贵，朱丈，杨志荣等，一株蝗虫病原菌的分离与鉴定[J].微生物学报，1995，35：86-90)。细菌杀虫毒素蛋白的发现和研究，为研制新型高效生物杀虫剂奠定了基础。随着分子生物学的发展和基因工程技术的日益成熟；已有很多细菌杀虫毒素蛋白的编码基因被克隆，例如已从苏云金芽孢的各种菌株中克隆了100多个杀虫晶体蛋白基因(Feitelson J.S，Payne J.，KimL.，Bacillus thuringiensis：Insects and beyond[J].Bio/Technology，1992，10：271-275)，从球形芽孢杆菌的各种菌株中克隆了数十个毒素蛋白基因(Charles J.F，Nielson-LeRoux C，Delecluse A.Bacillus sphaericus toxins：molecular biology and mode of action[J].Ann RevEntomol，1996，41：389-410)。这些毒素蛋白基因在害虫防治方面具有广阔的应用前景，已经利用一些苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因构建了毒力更强的高效工程菌株，开发了多种新型的苏云金芽孢杆菌杀虫剂。此外，还利用遗传工程技术将苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因转入多种植物，培育出了转基因棉花、烟草、水稻等转基因抗虫作物。，

在类产碱假单胞菌杀虫蛋白的研究方面，业已证实该蛋白质的分子量较低，为-种外毒素蛋白(张丈，杨志荣，朱文等.类产碱假单胞菌杀虫物质的分离纯化和鉴定[J].微生物学报，1998，38：57-62)，而有关类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因克隆及转基因植物的研究，国内外均未见报道。

                                   发明内容

杀虫蛋白基因及其应用

本发明涉及一种来源于类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的杀虫蛋白基因，该基因编码的蛋白质，所述杀虫蛋白基因可用于在宿主细胞中表达。类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligeres)是一种革兰氏阴性菌。

蝗虫属直翅目(Orthoptera)蝗科(Locustidae)，是一种世界性的有害昆虫。在我国是全国性分布和危害。尤其以北方最为严重，在北方草原，以其“种类多、数量大、分布广、危害重”等特点成为草地第一害虫。仅北方草原和青藏高原草地，每年发生并危害的面积近1000万公顷，严重危害牧草生长，使草地产草量下降30-70％(李克夫、马耀，杜文亮，中国草地[J]，1992，(1)：50-52。)，造成巨大经济损失。蝗虫的危害还是导致草地退化、沙化、自然生态环境条件恶化等的重要因素之一。

1991年在重庆市歌乐山林场发现了许多黄脊竹蝗(Ceracris kiangsu)的自然病死虫，从虫尸内分离到一种病原菌，经回复感染原宿主，能引起原宿主致病并死亡，从虫尸体中分离到同样的病原菌，证明该病原菌为蝗虫自身的致病菌。经感染主要草地害虫的初步试验结果表明，该病原菌对多种草地蝗虫具有较高的感染力，5天的致死率高达90％以上，对草地的草原毛虫(Gynephorap runergensis)、粘虫(Leucania separata)也有一定的感染力。并对多种草地蝗虫有较强的感染力该菌株经鉴定为类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(刘世贵，朱文，杨志荣，等.微生物学报[J]，1995，35(2)：86-90)。

近年来对其杀虫致死机理、杀虫蛋白(张文，杨志荣。微生物学报[J]，1998，38(1)：57-62)、安全性(杨志荣，朱文，葛绍荣等。中国生物防治[J]，1996，12(3)：114-116)等方面进行了深入研究，证明该菌对蝗虫致病，是由于其代谢产生的一种杀虫蛋白所致，该蛋白分子量为25100Da，在国内外属首次报道。经研究表明该菌无芽孢，本身具有较强毒蛋白，故具有构建成为遗传工程菌广泛用于生物防治的潜力。

本发明的一个目的是提供一种新的杀虫蛋白基因，它属于类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(Pseudomonas pseudoalcaligenes insecticidal protein)，来源于类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)(刘世贵，朱文，杨志荣，等.微生物学报[J]，1995，35(2)：86-90.)，这种基因所编码的蛋白对直翅目昆虫具有广泛的、较强的毒杀作用。可用于作物的虫害防治。本发明的杀虫蛋白基因全序列，其编码毒性肽的部分是314-1075位核苷酸，该片段序列编码含有254个氨基酸的成熟毒蛋白；其编码信号肽的部分是248-313位核苷酸，该片段序列编码位于N末端的含22个氨基酸的信号肽。

具体地，本发明的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因可通过如下方法获得，但不限于此。

本发明的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因可用诸如基因组DNA文库筛选法进行分离。即可用合适的载体直接从DNA文库中进行克隆，或利用已知类产碱假单胞菌cDNA、DNA或其部分作为探针通过与微生物的基因组DNA文库杂交来筛选所述类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因，或利用根据类产碱假单胞菌cDNA或类产碱假单胞菌基因组DNA而设计的引物以及用微生物的基因组DNA文库为模板通过聚合酶链式反应(PCR)来筛选所述杀虫蛋白基因。

本发明的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因也可通过常规方法利用核酸的化学合成产生，如膦酰胺法[Mattencci，M.D.&Caruthers，M.H.，美国化学协会杂志[(J.Am.Chem.Soc.)103，3185(1981)]和亚磷酸三酯法[Hunkapiller，M.等，Nature 310，105(1984)]。

本发明的另一个目的是提供一种杀虫蛋白质及分离纯化方法。本发明的蛋白质的序列在不良环境下，类产碱假单胞菌可产生杀虫蛋白(insectieidal protein，IP)。该成熟的毒蛋白质共含有254个氨基酸，分子量26KD，属于完整编码区编码的第23-276位氨基酸。

本发明的杀虫蛋白基因能够在大肠杆菌中进行表达，其表达产物对直翅目昆虫有毒杀作用。利用全长的野生型基因或只用其5’端314-1078核苷酸共765bp的毒性区序列，均可进行植物细胞核转化。对基因序列进行人工改造，使其密码子更适合于在植物中表达，可显著提高表达量或杀虫效果。

本发明的再一个目的是提供一种生产抗虫的转基因植株的方法，包括将本发明的杀虫蛋白基因导入植物的步骤。

将外源基因导入植物的方法是已知的，可使用该方法将本发明的基因构建体插入植物宿主，所述方法包括生物和物理植物转化法，例见Niki等，1993，“将外源DNA导入植物的方法”，植物分子生物学和生物技术方法，Glick和Thompson编，CRC出版公司，Boca Raton，p67-88。选定的方法随宿主植物的不同而不同，包括化学转染法如磷酸钙，微生物指导的基因转移如农杆菌(Horseh等，科学，227：1229-31，1985)，电穿孔，显微注射，基因枪和biolistic轰击。

植物细胞的表达载体和体外培养方法或植物的组织转化和再生是已知的，可以获得的，例见Gruber等，1993，“植物转化载体”，植物分子生物学和生物技术方法，Glick和Thompson编，CRC出版公司，Boca Raton，p89-119。

本发明的杀虫蛋白基因可以不经改造可直接用于植物转化。在进行植物转化时，可将该基因(在植物基因启动子的驱动下)定点插入单双子叶植物通用的质粒pCAMBIA2301G(Chenof fertile transgenic rice plants。Plant Cell Reports 18：25-31V)植物叶绿体基因组的Tnos基因和P35s基因之间。

本发明中的杀虫蛋白基因用于植物细胞核转化时，所有常规方法均可使用。

                                   附图说明

图1是类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因重组表达载体pT7-6-IP构建。

图2是pCAMBIA2301G-IP转化载体构建。

                                 具体实施方式

下丈将通过实施例对本发明做进一步说明，但实施例不以任何方式限制本发明。

实施例1

类产碱假单胞菌杀虫蛋白的分离纯化

1.1培养基制备

将类产碱假单胞菌接种于肉汤培养基(周德庆.微生物学实验手册[M]，上海科技出版社，1985)，培养基组分(g/L)：牛肉膏5g，蛋白陈10g，NaCl 5g，pH7.2。35℃培养12h后，再转接种于同样的培养基中，35℃，120r/min，振荡培养36h备用。

1.2类产碱假单胞菌培养物的杀虫活性检测

类产碱假单胞菌培养物于4℃、6000g离心10min，获得细菌培养物上清液及细菌沉淀。细菌沉淀经去离子水洗涤3次后进行匀浆，所获匀浆液经10000g离心后，收集匀浆上清液，经测定其蛋白质浓度为43mg/ml。用反透析法将细菌培养物上清液进行适当浓缩后，测得其蛋白浓度为8.3mg/ml。将两种溶液均稀释至5mg/ml，加入蔗糖至浓度为20％，用于杀虫活性测定。测定结果表明，细菌培养物上清液对3龄蝗虫有杀虫作用，而细菌匀浆上清液以及经蛋白酶K处理的细菌培养物上清液则不具杀虫活性，提示杀虫蛋白存在于细菌培养物上清液，为菌体分泌的一种外毒素蛋白，这与丈献报道的结果一致。

1.3.杀虫蛋白的分离纯化

1.3.1粗杀虫蛋白提取物的制备

挑取冻存的类产碱假单胞菌，接种于LB琼脂平板上，于35℃培养16h，使菌种活化。然后挑取3-4个分隔良好的菌落，接种于牛肉膏-蛋白胨培养基中于35℃振荡(转速为140r/min)培养12h，然后再转接到同样的培养基中继续振荡培养(转速，140r/min；温度，35℃)36h。

将细菌培养物分装于离心管中，4℃离心(6000g)20min，弃去细菌沉淀，收集上清液。所获上液。直接用Millipore超滤系统进行超滤。超滤系统预先经0.5mol/L HCL洗涤一次，然后用蒸馏水洗涤至中性，再用0.5mol/L NaOH洗涤一次，用蒸馏水洗涤至中性。在超滤时，先采用可截流40kD以上蛋白质的滤膜进行超滤，滤液中所含的蛋白质均在40kD以下，收集滤液，测定杀虫活性。再换用可截流10kD以下蛋白质的滤膜，对上步超滤所获得的滤液进行超滤，收集未滤过的部分并测定杀虫活性。再将这部分蛋白溶液装入透析袋，置于PEG2000粉末中，浓缩至一定体积，获得粗杀虫蛋白提取物。

1.3.2DEAE-纤维素-32柱层析

DEAE-纤维素-32用蒸馏水充分溶胀后，除去漂浮物，用0.5mol/L NaOH处理20min，用蒸馏水洗涤至中性。然后用0.5mol/L HCl浸泡20min，洗涤至中性.再用0.5mol/L NaOH处理一次并洗涤至中性，用抽滤法抽干水分，置于50mmol/L Tris-HCl(pH7.8)缓冲液中。

将DEAE-纤维素-32装入层析柱(2.5×30cm)，用平衡缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.8)充分平衡。将粗杀虫蛋白提取物上样于经平衡后的DEAE-纤维素-32柱，用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，流速为30ml/h，待A₂₈₀低于0.02后，改用含0-0.6mol/L NaCl的平衡缓冲液进行线性梯度洗脱，洗速为30ml/h，分部收集洗脱液，测定相应的杀虫活性.然后合并含杀虫活性的洗脱液，在4℃对pH为7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液充分透析，以除去蛋白质溶液中的NaCl。再用PEG20000浓缩至一定体积。

1.3.3 Sephadex G-100凝胶过滤

Sephadex G-100粉末加入50mmol/L Tris-HCl(pH7.8)后，在沸水浴中加热5h，使其充分溶胀，用倾泻法除去漂浮在缓冲液的细颗粒，待冷至操作温度后装入层析柱(1.6×80cm)，用3倍柱体积的50mmol/L Tris-HCl(pH7.8)平衡该层析柱，再将经DEAE-纤维素-32纯化后的杀虫蛋白样品上样于该层析柱，用平衡缓冲液洗脱，分部收集洗脱液，测定A₂₈₀及杀虫活性，合并含杀虫活性的洗脱液，在4℃对蒸馏水充分透析，再用PEG20000浓缩。

1.3.4杀虫蛋白的活性测定

采用de Leon等(1995)的微滴饲喂法进行测定，实验动物为黄脊竹蝗。将采自四川江安竹海的黄脊竹蝗卵块用0.1％的高锰酸钾溶液清洗后，再用灭菌水漂洗两次，晾干后置于恒温箱，于28℃孵化，幼虫生长至3龄，即用于杀虫蛋白的活性测定，用微量注射器取30μl杀虫蛋白溶液(含20％蔗糖)，饲喂饥饿的3龄幼虫，对照组则饲喂20％蔗糖溶液。经饲喂的蝗虫再转移至新鲜玉米幼苗上5d，对照组和实验组各25只蝗虫，统计5d内蝗虫的死亡情况，该实验重复3次，根据实验结果计算死亡率以鉴定待测样品的杀虫活性。

1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用Ausubel等的方法(Ausubel F.M，Brent R，Kingston R.E，et al.Current Protocolsin Molecular Biology[M].USA：John Wiley&Sons，Inc.1997)，进行不连续的垂直板状电泳。分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为40％。切割浓缩杀虫蛋白的胶段，用缓冲液洗脱回收。

1.4杀虫蛋白的N-末端氨基酸序列分析

纯化杀虫蛋白干粉溶于专用试剂后点于PVDF膜上，经固定处理后Beckman LF3000蛋白质自动测序仪进行测定，测定结果表明，纯化的杀虫蛋N-末端10个氨基酸的序列为Gly ValTrp Gln His Gln Ser His Ala ALa，据此可用于寡核苷酸探针的设计。

实施例2

类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因克隆及原核表达和杀虫实验。

2.1类产碱假单胞菌基因组文库的构建

通过CTAB法提取类产碱假单胞菌基因组DNA，然后取少量基因组DNA进行Sau3AI酶切预实验，确定产生的随机DNA片段集中于2-10kb时酶切条带在该条件下对基因组DNA进行Sau3AI部分酶切，酶切产物通过0.5％琼脂糖凝胶电泳分离，从琼脂糖凝胶中回收2-10kb的片段。采用pUC19质粒(Norrander，J.et al.，Gene(1983)26：101-106)为克隆载体，以该质粒载体的BamHI位点为克隆位点。当pUC19经BamHI完全消化，转变为线性分子，用牛小肠碱性磷酸酶去除线状分子两端的5’磷酸基团，获得去磷酸化线性质粒。

将去磷酸化线性质粒与基因组DNA的部分酶切片段混合，加入T4DNA连接酶进行连接，使类产碱假单胞菌的基因组DNA片段插入pUC19的BamHI位点，形成重组质粒，然后用于转化大肠杆菌DH5a，转化产物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平扳，37℃培养16h后共获得约15000个菌落。

为了确定菌落的重组频率，随机挑取160个菌落点种于含IPTG和X-gal氨苄青霉素-LB平板，37℃培养16h后，放置于4℃显色数小时，出现109个白色菌落，这些白色菌落即为携带重组质粒的重组菌落，根据白色菌落占总菌落的比例，计算出重组频率为68％。

随机挑取20个白色菌落，用于提取质粒以检测质粒的插入片段长度。经限限制性酶切和电泳分析，发现插入片段的平均长度为4.5kb左右。按公式N＝ln(1-p)/ln(1-f)，计算任意给定DNA序列出现概率(P)为0.99时所需的重组菌落数目，以此来评估文库质量。细菌基因组DNA大小通常在5000kb以下，因为重组菌落的平均长度插入片段在基因组中的比率(f)至少应为0.09％，所需重组菌落数目(N)至多为5115。

本实验获得的重组菌落已达一万余个，因而已经包含了类产碱假单胞菌的所有DNA序列，完全达到了作为基因组文库的要求。用灭菌水将转化大肠杆菌时所得的所有转化子从氨苄青霉素-LB平板上洗下，经离心后弃去上清液，收集菌体，加入10ml含50％甘油的LB培养基，于-20℃保存该基因组文库。

2.2杀虫蛋白基因阳性克隆的筛选和鉴定

取出-20℃保存的基因组文库，吸取少量菌液，并用灭菌水稀释至每毫升约10000个细菌，然后涂布于含IPTG和X-gal的氨苄青霉素-LB平板，37C培养当菌落达0.2mm时直接将尼龙膜放到培养基表面，使菌落复印到尼龙膜之上。尼龙膜经裂解、变性、中和以及真空干烤固定后，菌落释放的DNA原位结合于尼龙膜上，此时的尼龙膜即为菌落原位裂解膜，可用寡聚核苷酸探针进行杂交。

实验中所使用的寡聚核苷酸探针是根据杀虫蛋白N末端的氨基酸排列顺序设计的；探针长度为17个核苷酸，其序列为GGNGTNTGGCARCAYCA，其中N表示任意碱基，Y表示嘧啶，R表示嘌呤。该寡聚核苷酸探针序列对应于杀虫蛋白的N末端的6个氨基酸残基的排列顺序。用该探针与菌落原位裂解膜进行杂交，共出现16个阳性杂交信号。

在确定阳性杂交信号所对应的菌落后，用灭菌牙签挑取这些可疑菌落点种于覆盖尼龙膜的氨苄青霉素-LB平板及相应的保存平板，于37℃培养至菌落达0.2mm时剥离尼龙膜进行原位裂解，所制备的原位裂解膜再用于第二轮杂交筛选.在第二轮杂交筛选时，杂交温度从第一轮筛选的48℃提高到50℃，漂洗温度亦提高2℃使杂交和漂洗在更严格的条件下进行。在第二轮筛选中共获得5个阳性克隆。经亚克隆和Southern杂交验证得到克隆1.4kb片段的质粒pSC1-1，该片段即为编码杀虫蛋白基因片段，。通过DNA序列测定得到全长序列，该片段编码全长为26kD的氨基酸序列。

2.3类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因在大肠杆菌中表达：

用EcoRI和BamHI从克隆载体pSC1-1上切出杀虫蛋白基因，连接到用同样酶切的原核表达载体pT7-6[Tabor，S.，(1990)，Current protocols in molecular biology(F.A.Ausubel et al.，eds)pp.16.2.1-16.2.11.Greene publishing and Wiley-Interscience，New York]上构建pT7-6-IP(见图1)，转化大肠杆菌井在AMP平板上筛选重组子，然后提取质粒进行酶切鉴定。

经过鉴定的含有杀虫蛋白基因的重组细菌在37℃培养诱导基因表达，具体方法参照文献(曾庆等，病毒学报，1992，8：205-209)。杀虫蛋白的表达产物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western印迹分析(喻子牛，孙明，刘子铎等，苏云金芽孢杆菌的分类及生物活性泳检测和Western印迹分析(喻子牛，孙明，刘子铎等，苏云金芽孢杆菌的分类及生物活性蛋白基因[J].中国生物防治，1996，12：85-89)证明该表达菌株产生26kD的杀虫蛋白分子。

2.4杀虫实验

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析，已经证实携带pT7-6-IP重组质粒的大肠杆菌在诱导3h后，具有较高的杀虫蛋白含量。因此，采用诱导表达的菌体进行杀虫活性检测。离心收集100ml饱和培养物的菌体，加4ml20％蔗糖溶液进行匀浆，通过离心除去细菌碎片，收集上清液。采用微滴饲喂法测定匀浆上清液对3龄蝗虫的杀虫活性，以含pT7-6的大肠杆菌匀浆上清液为对照，实验中样品组和对照组均为100只蝗虫，统计喂食后5d内蝗虫的死亡情况，结果表明，样品组死亡36只，对照组死亡11只，说明大肠杆菌表达的外源蛋白有一定的杀虫活性，这进一步证实重组菌携带的外源基因为杀虫蛋白基因。

实施例3

杀虫蛋白基因用于苜蓿转化和培育抗虫苜蓿

3.1载体构建：

3.1.1载体pCAMBIA2301G的构建

载体pCAMBIA2301G的构建过程如图2所示。首先，对植物表达载体pBI121和pCAMBIA2301进行EcoRI、HindIII双酶切。然后，回收pBI121 3Kb左右的片段、pCAMBIA2301 11Kb左右的片段，并用T₄DNA连接酶连接，得到载体pCAMBIA2301G。

3.1.2载体pCAMBIA2301G-IP的构建

以载体pSC1-1为模板PCR扩增类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因片段，用XbaI、SacI双酶切，回收1.4kb片段。同时，载体pCAMBIA2301G也用XbaI、SacI双酶切并回收12Kb左右的片段，然后与酶切后的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因片段连接，得到表达载体pCAMBIA2301G-IP(见图2)。

3.2农杆菌转化

3.2.1大肠杆菌CaCl₂法感受态细胞的制备及转化

大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α感受态细胞的制备。LB平板上挑取DH5α单菌落，在2ml LB培养基中37℃培养过夜。取0.5ml培养物，加入50ml LB培养基中28℃继续培养至OD₆₀₀≈0.5。加入1.5ml离心管中，4℃离心收集菌体。用500μl 0.1mol/L冰CaCl₂重悬，冰浴30分钟后再离心，用200μl 0.1mol/L冰CaCl₂重悬，于0℃保存30分钟至24小时后用于转化。入42℃水浴中热激2分钟，迅速取出后0℃放置2分钟。然后加入800μl LB，37℃培养1小时。最后离心2分钟，将菌体涂布于LB+抗生素的平板上，37℃培养过夜。

3.2.2农杆菌感受态细胞的制备和转化(王关林等，植物基因工程原理与技术，科学出版社，1999)。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，感受态细胞的制备。根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD₆₀₀≈0.5时，4℃离心收集菌体，用0.1mol/L冰CaCl₂重悬，冰浴30分钟后离心，用0.1mol/L冰CaCl₂重悬后，于0C保存。

冻融法转化根癌农杆菌。在200μl感受态细胞中加入5-10μl质粒，冰浴30分钟后，在液氮中速冻1-2分钟，迅速取出，放入37℃水浴中溶解。溶解完全后加入800μl LB，28℃培养3～5小时。最后离心2分钟，将菌体涂布于LB+利福平(40mg/L)+链霉素(25mg/L)+卡那霉素(75mg/L)平板上，28℃培养2天。

3.3叶盘法转化苜蓿

3.3.1根癌农杆菌叶盘法转化苜蓿(吕德扬，等.苜蓿高含硫氨基酸蛋白转基因植株再生[J].遗传学报，2000，27(4)：331-337.Lu D.Y，et al.Acomparison of the cultural bahaviour ofprotoplasts from leaves，cotyledons and roots of Medicago sativa[J].Plant Sci.lett，1983，31：87-99)。

取在MS₀培养基上苗龄5-7d的紫花苜蓿(Medicago Sative L.)(该苜蓿不具有GUS基因遗传背景)无菌苗的子叶，从两端共切去1/3，将余下的2/3子叶浸入已经离心且用液体MS₀重悬的根瘤农杆菌菌液中，摇床培养30min，用药勺取出于无菌滤纸上吸去表面菌液，接种到加盖一层滤纸的UM培养基上，暗培养60h后，依次用无菌水、无菌水+羧苄青霉素(500mg/L)和MS₀+羧苄青霉素(500mg/L)，将子叶表面农杆菌洗掉，转到筛选培养基(UM+50mg/L卡那霉素+100mg/L头孢霉素)上，在25℃左右，进行16h/d的光照培养.30d以后，将诱导出的不定芽转至MSD₄+100mg/L头孢霉素上诱导生根，再过约30d后转到MS₀上，诱导完整植株再生.

3.3.2转化植株的筛选和移栽切去再生植株的叶片，再分成两半，接种到UM+100mg/L卡那霉素上。将卡那霉素抗性的植株培养到根系发达后，移入1/10MS₀液体培养基中培养一周练苗，再移至装有营养土的花盆中。

3.4转基因苜蓿的鉴定

3.4.1 Southern杂交

Southern杂交用改进的CTAB法(袁庆华，桂枝等，苜蓿基因组DNA提取和RAPD反应条件优选[J]草地学报，2001，9(2)：99-105)抽提苜蓿植株总DNA，称取100mg鲜嫩苜蓿叶片，将其剪碎后置于1.5mL离心管中，加入液氮，用研棒研至粉末后，加入900μl65℃预热的2×CTAB缓冲液，65℃下水浴20min(每隔2min摇匀一次)后取出放凉。加入500μl氯仿异戊醇混合液(24∶1)。摇匀，4℃下7500r/min离心10min。取上清液置于1.5ml离心管中，加入500μl氯仿异戊醇.混匀后4℃下7500r/min离心10min。将上清液移入新的离心管中，加入1/10体积3mol/L NaAc和等体积的异丙醇，轻摇至出现絮状沉淀。弃去上清液后。用100μl 75％乙醇清洗两次，室温下干燥1h，溶于TE缓冲液(pH8.0)中。选择杀虫蛋白基因序列内无识别位点的限制性内切酶EcoRI进行完全酶切，浓缩DNA样品。以pCAMBIA2301G-IP为模板作PCR扩增，产物经低熔点琼脂糖回收纯化后。按地高辛标记与检测试剂盒操作手册进行探针标记。DNA的转膜，和固定过程按文(颜子颖.王海林译，精编分子生物学实验指南[M]北京.科学出版社，1998，35-36)的方法进行。预杂交、杂交和显色过程，按地高辛标记与检测试剂盒操作手册进行。Southern杂交显示阳性信号者，被确定为类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因转化体。

3.4.2杀虫蛋白基因转化体的抗虫实验

取杀虫蛋白基因转化体(T1代)的叶片饲喂竹蝗，四天后统计幼虫死亡率。结果表明苜蓿杀虫蛋白基因转化体具有很高的抗虫性。此结果证明了本发明中的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因在苜蓿中能够高效表达，并且杀虫效果显著。

                                 生物材料样品

保藏日期：2003年9月10日

保藏编号：1001

分类命名：Pseudomonas Pseudoalcaligenes

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所

核酸序列表

<110>杨志荣 张杰 赵建 岳碧松

<120>类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因

<160>1

<170>PatentIn Version 2.1

<210>1

<211>1377

<212>DNA

<213>类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)

<220>

<221>gene

<222>(1)…(1377)

<220>

<221>Promoter

<222>(1)…(247)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(248)…(313)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(314)…(1075)

<220>

<221>CDS

<222>(248)…(1078)

<220>

<221>gene

<222>(1)…(1367)

  1 GGAICCCGGC TTGCGGCCCC CCTTTGTTTC GCAAGACGGC GTGGTCTTTG

 51 AACTGGAAAC CTTGGACCCG CGACCCTGGC GCGCTTTTTG GGAAGCAGTG

101 GGCGTACCGG CCGATCTGGC TGGTCAGGCC TGGAAAGCGT TTTTGCTGCG

151 CTATGCCAAG GCGGTGTGCC CTGTGCCAGC GGCATGTTTA AGCAGTCTGC

201 AAGCCCTGAA CTTTGCCCGT TTGCAGGAAC TGGCCCTGCA GACGGGA

248 ATG GCT ATC TTG CCG GTA CGT ACC CCG GCT CAA CGC CAG AGC GTT

  1 MET Ala Ile Leu Pro Val Arg Thr Pro Ala Gln Arg Gln Ser Val

293 AGT GAT TAC GCG GCC TTG GCC GGT GTG TGG CAG CAT CAG AGT CAT

16  Ser Asp Tyr Ala Ala Leu Ala Gly Val Trp Gln His Gln Ser His

338 GCC GCG CCC GGC TCA TTG AGC ACC TTG CCG TCC AAG GCC GAT TTG

 31 Ala Ala Pro Gly Ser Leu Ser Thr Leu Pro Ser Lys Ala Asp Leu

383 CCC CTG CGT GGT TTG CGG GTG GTG GAG TCC TGC CGT CGG ATT CAA

 46 Pro Leu Arg Gly Leu Arg Val Val Glu Ser Cys Arg Arg Ile Gln

428 GGG CCT ATT GCC GGT CAC TTG CTG GCG CTG CTG GGG GCG GAA GTG

 61 Gly Pro Ile Ala Gly His Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Glu Val

473 ATT CGT CTG GAA CCG CCC GGT GGT GAT CCC TTG CGT GCC ATG CCG

 76 Ile Arg Leu Glu Pro Pro Gly Gly Asp Pro Leu Arg Ala MET Pro

518 CCG TGC GTG GAT GGC TGC TCG GTG CGC TTT GAT GCG CTC AAT CAA

 91 Pro Cys Val Asp Gly Cys Ser Val Arg Phe Asp Ala Leu Asn Gln

563 TTC AAG ACG GTG CAG GAA GTG GAC ATC AAA TCG GCT CAA GGC CGC

106 Phe Lys Thr Val Gln Glu Val Asp Ile Lys Ser Ala Gln Gly Arg

608 CAG GCC ATT TAC GAA TTG GTG AGC CAG TCT GAT GTA TTT CTG CAT

121 Gln Ala Ile Tyr Glu Leu Val Ser Gln Ser Asp Val Phe Leu His

653 AAC TGG GCA CCC GGC AAG GCG GCC GAG CTG CAA CTG GAT GCC CAG

136 Asn Trp Ala Pro Gly Lys Ala Ala Glu Leu Gln Leu Asp Ala Gln

698 GAC TTG CAC GCG GTG CGC CCG GAT CTG GTC TAC GCC TAT GCG GGC

151 Asp Leu His Ala Val Arg Pro Asp Leu Val Tyr Ala Tyr Ala Gly

743 GGT TGG GGT CAG GAG CAA GTG GAC GCA CCG GGC ACG GAC TTC ACG

166 Gly Trp Gly Gln Glu Gln Val Asp Ala Pro Gly Thr Asp Phe Thr

788 GTG CAA GCC TGG TCG GGT ATT GCT CAC ACC ATT TCT CAA ACC TCG

181 Val Gln Ala Trp Ser Gly Ile Ala His Thr Ile Ser Gln Thr Ser

833 GAT GCA CGG GGC GGG TCG TTG TTT ACG GTG CTG GAT GTG CTG GGC

196 Asp Ala Arg Gly Gly Ser Leu Phe Thr Val Leu Asp Val Leu Gly

878 GGG GTG ATG GCC GCG CTG GGT ATC AGT GCC GCC TTG CTG CGC CGG

211 Gly Val MET Ala Ala Leu Gly Ile Ser Ala Ala Leu Leu Arg Arg

923 GGC CTG AGC GGG TCG GGC TTG CGG GTA GAC AGC TCC TTG TTG GCC

226 Gly Leu Ser Gly Ser Gly Leu Arg Val Asp Ser Ser Leu Leu Ala

968 ACG GCC GAT CAT CTG GCC CAG GCC GTT TCT CCC ATC AGT AAA ACT

241 Thr Ala Asp His Leu Ala Gln Ala Val Ser Pro Ile Ser Lys Thr

1013 GGC GTG TCG GCG GTG TTC CAG ACG GGC GAG GGC TTC ATC GTC ATC

256  Gly Val Ser Ala Val Phe Gln Thr Gly Glu Gly Phe Ile Val Ile

1058 GAC TGC CAG GAT CAA ACG TGA

271  Asp Cys Gln Asp Gln Thr ***

1079 CT GCATGCCCTG GCCGGGTGGC

1101 TGAATGTGTC GCCCGATGCT GTCTGGACGG TTTTGCCGGA TCGTCTTCTG

1151 TCCCAGTCTG CCCGTAGCCT GGAAACGCAA CTGGATGTGC TGGGCATACC

1201 GGCCCGCCGC GTCCATAGCA ATCTGGCGCA ACTGCGTGCT GATCCACGTC

1251 TGACGTCTCA TTTCCATGAC AAGGGCTATT CGTCTGTTAA TTCTCCCTGG

1301 AGGTTTTTAT GAATCACGCT GGCATCATCG ATCTGGTCCC TGCGTCATTG

1351 CGCCAACGCT GGATAGAGGA CGGTACC

Claims (7)

1.一种杀虫蛋白质，它具有如下所示的氨基酸序列：

  1 Gly Val Trp Gln His Gln Ser His Ala Ala Pro Gly Ser Leu Ser

 16 Thr Leu Pro Ser Lys Ala Asp Leu Pro Leu Arg Gly Leu Arg Val

 31 Val Glu Ser Cys Arg Arg Ile Gln Gly Pro Ile Ala Gly His Leu

 46 Leu Ala Leu Leu Gly Ala Glu Val Ile Arg Leu Glu Pro Pro Gly

 61 Gly Asp Pro Leu Arg Ala MET Pro Pro Cys Val Asp Gly Cys Ser

 76 Val Arg Phe Asp Ala Leu Asn Gln Phe Lys Thr Val Gln Glu Val

 91 Asp Ile Lys Ser Ala Gln Gly Arg Gln Ala Ile Tyr Glu Leu Val

106 Ser Gln Ser Asp Val Phe Leu His Asn Trp Ala Pro Gly Lys Ala

121 Ala Glu Leu Gln Leu Asp Ala Gln Asp Leu His Ala Val Arg Pro

136 Asp Leu Val Tyr Ala Tyr Ala Gly Gly Trp Gly Gln Glu Gln Val

151 Asp Ala Pro Gly Thr Asp Phe Thr Val Gln Ala Trp Ser Gly Ile

166 Ala His Thr Ile Ser Gln Thr Ser Asp Ala Arg Gly Gly Ser Leu

181 Phe Thr Val Leu Asp Val Leu Gly Gly Val MET Ala Ala Leu Gly

196 Ile Ser Ala Ala Leu Leu Arg Arg Gly Leu Ser Gly Ser Gly Leu

211 Arg Val Asp Ser Ser Leu Leu Ala Thr Ala Asp His Leu Ala Gln

226 Ala Val Ser Pro Ile Ser Lys Thr Gly Val Ser Ala Val Phe Gln

241 Thr Gly Glu Gly Phe Ile Val Ile Asp Cys Gln Asp Gln Thr。

2.一种编码权利要求1所述的蛋白质的核苷酸序列。

3.按照权利要求2所述的核苷酸序列，它具有如下的序列：

  1 GGATCCCGGC TTGCGGCCCC CCTTTGTTTC GCAAGACGGC GTGGTCTTTG

 51 AACTGGAAAC CTTGGACCCG CGACCCTGGC GCGCTTTTTG GGAAGCAGTG

101 GGCGTACCGG CCGATCTGGC TGGTCAGGCC TGGAAAGCGT TTTTGCTGCG

151 CTATGCCAAG GCGGTGTGCC CTGTGCCAGC GGCATGTTTA AGCAGTCTGC

201 AAGCCCTGAA CTTTGCCCGT TTGCAGGAAC TGGCCCTGCA GACGGGAATG

251 GCTATCTTGC CGGTACGTAC CCCGGCTCAA CGCCAGAGCG TTAGTGATTA

 301 CGCGGCCTTG GCCGGTGTGT GGCAGCATCA GAGTCATGCC GCGCCCGGCT

 351 CATTGAGCAC CTTGCCGTCC AAGGCCGATT TGCCCCTGCG TGGTTTGCGG

 401 GTGGTGGAGT CCTGCCGTCG GATTCAAGGG CCTATTGCCG GTCACTTGCT

 451 GGCGCTGCTG GGGGCGGAAG TGATTCGTCT GGAACCGCCC GGTGGTGATC

 501 CCTTGCGTGC CATGCCGCCG TGCGTGGATG GCTGCTCGGT GCGCTTTGAT

 551 GCGCTCAATC AATTCAAGAC GGTGCAGGAA GTGGACATCA AATCGGCTCA

 601 AGGCCGCCAG GCCATTTACG AATTGGTGAG CCAGTCTGAT GTATTTCTGC

 651 ATAACTGGGC ACCCGGCAAG GCGGCCGAGC TGCAACTGGA TGCCCAGGAC

 701 TTGCACGCGG TGCGCCCGGA TCTGGTCTAC GCCTATGCGG GCGGTTGGGG

 751 TCAGGAGCAA GTGGACGCAC CGGGCACGGA CTTCACGGTG CAAGCCTGGT

 801 CGGGTATTGC TCACACCATT TCTCAAACCT CGGATGCACG GGGCGGGTCG

 851 TTGTTTACGG TGCTGGATGT GCTGGGCGGG GTGATGGCCG CGCTGGGTAT

 901 CAGTGCCGCC TTGCTGCGCC GGGGCCTGAG CGGGTCGGGC TTGCGGGTAG

 951 ACAGCTCCTT GTTGGCCACG GCCGATCATC TGGCCCAGGC CGTTTCTCCC

1001 ATCAGTAAAA CTGGCGTGTC GGCGGTGTTC CAGACGGGCG AGGGCTTCAT

1051 CGTCATCGAC TGCCAGGATC AAACGTGACT GCATGCCCTG GCCGGGTGGC

1101 TGAATGTGTC GCCCGATGCT GTCTGGACGG TTTTGCCGGA TCGTCTTCTG

1151 TCCCAGTCTG CCCGTAGCCT GGAAACGCAA CTGGATGTGC TGGGCATACC

1201 GGCCCGCCGC GTCCATAGCA ATCTGGCGCA ACTGCGTGCT GATCCACGTC

1251 TGACGTCTCA TTTCCATGAC AAGGGCTATT CGTCTGTTAA TTCTCCCTGG

1301 AGGTTTTTAT GAATCACGCT GGCATCATCG ATCTGGTCCC TGCGTCATTG

1351 CGCCAACGCT GGATAGAGGA CGGTACC。

4.一种杀虫蛋白分离纯化方法，包括将权利要求1所述的杀虫蛋白使用DEAE-纤维素-32柱层析、Sephadex G-100凝胶过滤、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化的步骤。

5.一种生产抗虫的转基因植株的方法，包括将权利要求2所述的核苷酸序列导入植物的步骤。

6.权利要求5所述的一种生产抗虫的转基因植株的方法，包括将权利要求2所述的核苷酸序列定点插入中间载体pCAMBIA2301G，通过农杆菌介导浸染植物。

7.一种转化细胞，其特征在于它含有外源的权利要求2所述的核苷酸序列，转化宿主细胞包括植物细胞、微生物细胞。

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