CN108059671A - 一种紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT‑mth2‑36p5及其编码基因与应用。本发明的紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT‑mth2‑36p5是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。通过实验表明：该蛋白对苜蓿斑蚜有很好的抑制作用，对蚜虫的存活率和繁殖率都有抑制作用，可用于蚜虫的防治。

Description

一种紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5及其编码基因与 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5及其编码基因与应用。

背景技术

数千万年的进化植物体产生了抗食草性动物的机制，如蛋白酶抑制剂的形成，植物源蛋白酶抑制剂是一类抑制蛋白水解酶活性的物质，在调控蛋白酶参与的生理生化活动中起着重要作用。而蛋白酶参与了昆虫的食物消化、病原菌的侵染与扩展等过程，因此植物源蛋白酶抑制剂在抗病抗虫中的应用被广泛开发。

关于蛋白酶抑制剂的抗虫机制，目前还不是很清楚。Hahnenberger等认为抗虫作用可能主要源于抑制剂的存在使消化酶的过度分泌造成必需氨基酸的缺乏而非对蛋白酶的直接利用抑制。蛋白酶抑制剂影响的不仅仅是昆虫肠蛋白酶，它们还影响到昆虫的水分平衡、蜕皮以及体内酶的调节。还有研究表明蛋白酶抑制剂能影响昆虫神经系统、免疫系统和蜕皮过程。蛋白酶抑制剂对害虫的作用效果受其合成、积累、降解和诱导昆虫蛋白酶的合成和调控的影响。

另外还有研究表明将KTI加入昆虫食料中，证实KTI可影响昆虫的消化和发育；澳洲日野黑蟋蟀和迁徙蚱蜢的肠道蛋白酶也受多种胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂的抑制，取食抑制剂后其生长发育也明显受到影响；在血液中加入胰蛋白酶抑制剂后，角蝇的生殖力明显下降；用蛋白酶抑制剂含量为50μg/g组织的烟草叶片作为烟草天蛾的唯一食物时，烟草天蛾幼虫的生长就受到明显的抑制；用蛋白酶抑制剂含量高一倍的烟草叶片饲喂部分烟草天蛾的幼虫就死亡；除此之外，大豆胰蛋白酶抑制剂还对棉铃虫、棉铃象甲、甘蓝夜蛾和豌豆蚜等昆虫的生长发育造成影响。

随着分子生物学的发展，一些表达KTI的基因已经被克隆，KTI抗虫谱广泛，有希望发展出一套取代农药的无公害的抗虫技术。很多学者从未成熟的大豆子叶中提取总RNA，然后反转录成单链cDNA，以此为模板，用PCR方法扩增出SK-TI基因，并克隆到载体特定位点上，构建了此基因的一系列植物表达载体，用于烟草、水稻、棉花等作物的转化，研究表明这些转基因作物具有明显的抗虫能力。Manus等将KTI 基因Tia转入白三叶草，发现白三叶草具有一定的抗虫性；转KTI基因所获得的潮霉素抗性水稻植株，部分转基因水稻植株明显地增强了对水稻二化螟虫的抗虫性。 Cordero等的研究结果表明，植物愈伤组织能诱导蛋白酶抑制剂基因的表达，当植物组织受创时，其机体内蛋白酶抑制剂含量急剧上升；Kim等研究发现，马铃薯蛋白酶抑制剂-Ⅱ基因具有损伤诱导型启动子，如果将这类启动子应用于植物基因工程，使其调控其它外源抗虫基因在植物中表达，将体现出重要的应用价值。

苜蓿斑蚜属蚜科、半翅目，是农牧业上重要的刺吸式害虫，主要危害豆科植物苜蓿，由于蚜虫繁殖能力强，发生世代多数多，多年来防治蚜虫危害主要依靠的是化学防治，大量且不合理的化学农药使用导致蚜虫的抗药性不断产生，并且造成了环境污染。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何防治害虫、抑制害虫的生长和发育。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种蛋白酶抑制剂，本发明的蛋白酶抑制剂为胰蛋白酶抑制剂，来源于紫花苜蓿Medicago sativa.，本发明提供的胰蛋白酶抑制剂的名称为MT-mth2-36p5，所述MT-mth2-36p5蛋白质是如下a)或b)或c)或d) 的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由216个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了与MT-mth2-36p5蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与MT-mth2-36p5蛋白质相关的生物材料为下述B1)-B5)中的任一种：

B1)编码MT-mth2-36p5蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的重组菌；

B5)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的细胞系。

上述生物材料中，所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码MT-mth2-36p5蛋白质的DNA 分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码MT-mth2-36p5 蛋白质的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由651个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码MT-mth2-36p5的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码MT-mth2-36p5的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码 MT-mth2-36p5且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或 85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比 (％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码MT-mth2-36p5的核酸分子的表达盒 (MT-mth2-36p5基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达MT-mth2-36p5的DNA，该 DNA不但可包括启动MT-mth2-36p5转录的启动子，还可包括终止MT-mth2-36p5转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述MT-mth2-36p5基因表达盒的重组载体。在本发明中，构建的含有所述MT-mth2-36p5基因表达盒的重组载体为 pSyno-1-MT-mth2-36p5。所述pSyno-1-MT-mth2-36p5为将序列1所示的MT-mth2-36p5 基因片段插入pSyno-1载体的BamHⅠ和XhoIⅠ酶切位点间，且保持pSyno-1载体的其他序列不变得到的载体。所述重组菌为含有pSyno-1-MT-mth2-36p5的BL21(DE3) 或Arctic Expression(DE3)。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了MT-mth2-36p5蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了MT-mth2-36p5蛋白质作为胰蛋白酶抑制剂在害虫防治中的应用。

本发明还提供了MT-mth2-36p5蛋白质或上述生物材料在害虫防治中的应用。

本发明还提供了MT-mth2-36p5蛋白质或上述生物材料在制备害虫防治的产品中的应用。

本发明还提供了MT-mth2-36p5蛋白质或上述生物材料在降低害虫存活率和/或繁殖率中的应用。

本发明还提供了MT-mth2-36p5蛋白质或上述生物材料在制备降低害虫存活率和/或繁殖率的产品中的应用。

上述应用中，所述害虫可为蚜虫，所述蚜虫具体可为苜蓿斑蚜。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种防治害虫的方法。

本发明提供的防治害虫的方法包括将MT-mth2-36p5蛋白质导入害虫的步骤。

上述方法中，所述导入的方式为饲喂。所述饲喂的方法具体可为将胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5和人工饲料混匀，得到混合物，将所述混合物饲喂害虫。所述胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5在混合物中的浓度为2000μg/ml、3000μg/ml、4000μg/ml、5000μg/ml或6000μg/ml。

上述方法中，所述害虫可为蚜虫，所述蚜虫具体可为苜蓿斑蚜，所述苜蓿斑蚜具体可为苜蓿斑蚜成蚜。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种用于防治害虫的产品。

本发明提供的用于防治害虫的产品的活性成分为MT-mth2-36p5蛋白质。

上述产品中，所述害虫可为蚜虫，所述蚜虫具体可为苜蓿斑蚜。

本发明的有益效果如下：

(1)抗虫范围广。本发明的苜蓿胰蛋白酶抑制剂可用于防治鳞翅目、鞘翅目及直翅目等多种农作物害虫，而其他杀虫蛋白的抗虫谱则相对较窄。

(2)不易产生抗性。胰蛋白酶抑制剂的抗虫机理的关键在于其作用位点是昆虫肠道内蛋白酶的活性中心，而大多数酶的活性中心又是酶分子中最保守的区域。因此，昆虫通过突变来产生抗性的机率很小。但昆虫则易对Bt等其他杀虫蛋白产生耐受性。

(3)特异性表达机制。多数植物受到昆虫侵害后局部或整个植株的蛋白酶抑制剂含量及活性都会明显增加，这是受侵害植物诱导合成蛋白酶抑制剂对外界损伤的一种良性反应。诱导型的蛋白酶抑制剂可以更迅速、有效地抑制昆虫体内蛋白酶的活性，从而抑制其摄入食物的消化。

本发明通过基因克隆技术得到苜蓿胰蛋白酶抑制剂基因MT-mth2-36p5，并对克隆到的基因进行了表达验证，结果发现MT-mth2-36p5蛋白对蚜虫有很好的抑制作用，可明显降低蚜虫的存活率和繁殖率，MT-mth2-36p5基因的克隆与表达功能验证可以作为苜蓿胰蛋白酶抑制剂对苜蓿斑蚜防治的理论依据。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测结果。

图2为MT-mth2-36p5蛋白的功能验证的试验流程图。其中，1：苜蓿斑蚜；2：蚜虫人工饲料；3-5：试验采用的蚜虫饲育器；6：蚜虫取食情况。

图3为苜蓿斑蚜取食不同浓度的抑制剂蛋白MT-mth2-36p5后的存活率和繁殖率的统计结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的苜蓿斑蚜人工饲料配方如下表所示

实施例1、MT-mth2-36p5蛋白及其编码基因的获得

1、苜蓿种植

将紫花苜蓿种子(购买于北京正道生态科技有限公司)在温水(50℃)中浸泡10min，使种皮软化，以提高种子发芽率；然后将种子播种于营养土：蛭石＝3：1混合的30cm口径的花盆中，在室温(25℃左右)、光照16h/黑暗8h下种植培养，培养过程中保持土壤中含有少量水分。

2、RNA提取

苜蓿长到三叶期以上，取苜蓿叶部进行苜蓿RNA的提取。具体步骤如下：

1)将苜蓿叶从-80℃取出放于液氮下研磨至粉末，将粉末加到1.5ml离心管中，加入1ml Ttrizol，振荡混匀；

2)室温下静置5-10min，4℃，1300rpm离心10min；

3)取上清液，加入200μL氯仿，震荡15-20s，静置3-5min，4℃，1300rpm离心 10min；

4)重复步骤3)；

5)吸取上清液300μL至新的试剂盒中的管内，加入等体积异丙醇，震荡15s，移到RNA滤管2ml中，冰上10min；

6)4℃，1000rpm离心3min，弃掉滤液；

7)加入600μL无水乙醇，4℃，1000rpm离心2min，弃掉滤液；

8)重复步骤7)；

9)空离3min，将滤网移到1.5ml离心管中；

10)加入50μL预热的去离子水，余热下静置5min，4℃，13000rpm离心3min；

11)收集滤液，电泳检测；将滤液保存于-80℃长期保存。

3、cDNA合成

以步骤2提取的RNA为模板进行反转录，得到cDNA，-20℃下保存。

4、PCR扩增

以步骤3获得的cDNA为模板，采用引物F和引物R进行PCR扩增，得到PCR 产物。引物序列如下：

引物F：5'-GCACCCTTATCTAACAATGAAGC-3'；

引物R：5'-TCAAACAACAGACTTAATATACTCAGC-3'。

PCR扩增体系如下：模板1μL、正向引物2μL、反向引物2μL、Ex-Taq 0.25μL、 10xEx-Taqbuffer 5μL、dNTPmixture 4μL、ddH₂O补足至总体积为50μL。

PCR扩增条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃ 10min；4℃终止。

PCR扩增结束后，回收纯化PCR扩增产物，得到回收纯化后的PCR产物；然后将其与PMD18-T载体连接，得到重组质粒，并将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中培养后进行菌液PCR验证；最后菌液PCR验证连接成功后送去测序公司进行测序。

结果表明：PCR扩增得到大小为651bp的扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，并将序列1所示的基因命名为MT-mth2-36p5基因，MT-mth2-36p5基因编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示，将序列2所示的氨基酸序列命名为 MT-mth2-36p5蛋白。将MT-mth2-36p5基因和MT-mth2-36p5蛋白的氨基酸序列在 NCBI中进行Blast比对，确定MT-mth2-36p5基因为苜蓿胰蛋白酶抑制剂基因， MT-mth2-36p5蛋白为苜蓿胰蛋白酶抑制剂。

实施例2、MT-mth2-36p5蛋白的制备

1、重组表达载体的构建

1)以实施例1步骤4中的回收纯化后的PCR产物为模板，采用酶切引物F和酶切引物R进行PCR扩增，得到MT-mth2-36p5基因片段。引物序列如下(下划线标注的碱基为酶切位点)：

酶切引物F：5'-CCGGGATCCAAGCATC TTTTATC-3'；

酶切引物R：5'-GCCTCGAGAACAACAGAC-3'。

2)用限制性内切酶BamHⅠ和XhoIⅠ对pSyno-1载体(购买于苏州泓迅生物科技股份有限公司，产品目录号：SGSGC19)进行双酶切，得到载体骨架；

3)连接MT-mth2-36p5基因片段和载体骨架，得到重组表达载体 pSyno-1-MT-mth2-36p5并对其进行测序验证；

结果表明：重组表达载体pSyno-1-MT-mth2-36p5为将序列1所示的MT-mth2-36p5基因片段插入pSyno-1载体的BamHⅠ和XhoIⅠ酶切位点间，且保持pSyno-1载体的其他序列不变得到的载体。

2、重组菌的构建及培养

将1μl重组表达载体pSyno-1-MT-mth2-36p5分别加入100μl BL21(DE3)(购买于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B528414-0010)和Arctic Expression (DE3)(购买于北京盛科博源生物科技有限公司，货号：230192)感受态细菌中，得到重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/BL21(DE3)和重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/Arctic Expression(DE3)。然后将重组菌置于冰上20min；42℃热激90s，迅速置冰中3min；加入600μl LB培养液；37℃，220rpm振摇培养1h，取200μl菌液涂布于含50μg/ml Kan 的LB平板，37℃倒置培养过夜。

3、MT-mth2-36p5蛋白的获得

1)次日，挑取2个重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/BL21(DE3)的单克隆和1个重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/Arctic Expression(DE3)的单克隆，分别将其接种于含 50μg/mlKan的4ml LB培养液的试管中，37℃，220rpm振摇培养至下午1点左右， OD约为0.6；

2)向一管重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/BL21(DE3)的菌液中加入IPTG中至终浓度为1mM，37℃诱导3小时，另一管重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/BL21(DE3) 的菌液不加IPTG做阴性对照；

向单管重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/Arctic Expression(DE3)的菌液中加入IPTG 至终浓度为0.1mM，16℃诱导过夜；

3)次日，12000rpm离心1min，弃上清液，收集菌体；

4)用破菌缓冲液(20mM PB，150mM NaCl，pH7.4)重悬菌体后进行超声破碎，超声破碎的条件如下：350W功率，破碎4s，间隔6s，共30循环，得到破碎后菌体；

5)将破碎后菌体12,000rpm离心15min，收集上清液(含有胰蛋白酶抑制剂 MT-mth2-36p5的粗酶液)进行镍柱纯化，平衡液配方：20mM Tris，500mM NaCl，pH8.0；洗脱液配方：20mM Tris，500mM NaCl，500mM imidazole，pH8.0，得到纯化后的 MT-mth2-36p5蛋白，并基于SDS-PAGE分析蛋白表达情况。

结果如图1所示。其中，泳道1：纯化浓缩后蛋白；泳道2：未纯化浓缩蛋白；泳道3：蛋白质maker(18kDa-100kDa)。从图中可以看出，MT-mth2-36p5蛋白的大小为65KDa(含标签)。且实验结果表明：重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/BL21(DE3) 和重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/Arctic Expression(DE3)均可诱导表达得到蛋白 MT-mth2-36p5，但重组菌pSyno-1-MT-mth2-36p5/Arctic Expression(DE3)所表达的 MT-mth2-36p5蛋白量更高。

实施例3、MT-mth2-36p5蛋白的功能验证

一、试验方法

用沾湿的毛笔随机挑选4日龄苜蓿斑蚜的成蚜进行试验，试验中采用人工饲料饲养蚜虫，饲养方法为膜取食系统，该取食系统通过双层泊拉膜夹液态人工饲养组成，根据是否在人工饲料中添加胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5，设置1个处理组(添加胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5)和1个对照组，每个处理组和对照组均设有6次重复，每次重复采用1个装有10头蚜虫的饲育器。具体实验流程如图2所示。

1、处理组

将实施例2步骤3的5)中上清液(含有胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5的粗酶液) 直接添加到人工饲料中，与人工饲料混匀，使胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5在混合饲料中的终浓度分别为2000μg/ml、3000μg/ml、4000μg/ml、5000μg/ml和6000μg/ml，得到不同浓度的混合饲料。用第一层拉薄的泊拉膜封闭，在上面分别滴加100μl的不同浓度的混合饲料，再用第二层泊拉膜封闭保湿。然后将蚜虫饲育器放入智能人工气候箱中进行饲养，饲养条件为每天温度26℃，湿度70％，光照黑暗比为16h：8h。饲养72h后观察记录苜蓿斑蚜蚜虫的存活率和繁殖率。

2、对照组

用第一层拉薄的泊拉膜封闭，在上面滴加100μl的人工饲料，再用第二层泊拉膜封闭保湿。然后将蚜虫饲育器放入智能人工气候箱中进行饲养，饲养条件为每天温度 26℃，湿度70％，光照黑暗比为16h：8h。饲养72h后观察记录苜蓿斑蚜成蚜的存活率和繁殖率。成蚜存活率和繁殖率的计算公式如下：

二、试验结果

1、成蚜存活率

成蚜存活率的统计结果如图3A所示。从图中可以看出：苜蓿斑蚜取食不同浓度的胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5的混合饲料72h后，存活率随着浓度的增加逐渐降低，胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5浓度在2000μg/ml、3000μg/ml、4000μg/ml、 5000μg/ml和6000μg/ml的存活率分别为36％、30％、30％、28％和22％，在高浓度(＞ 3000μg/ml)下显著低于对照组的存活率。

2、繁殖率

繁殖率的统计结果如图3B所示。从图中可以看出：苜蓿斑蚜取食不同浓度的胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5的混合饲料72h后，繁殖率随着浓度的增加逐渐降低，浓度在2000μg/ml、3000μg/ml、4000μg/ml、5000μg/ml和6000μg/ml的繁殖率分别为 72％、62％、50％、36％和28％，在高浓度(＞3000μg/ml)下显著低于对照组的繁殖率。

以上结果可以看出：本发明的胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5对苜蓿斑蚜有致死作用，可明显抑制蚜虫的生长和繁殖，可开发为一种用于防治蚜虫危害的新型生物制剂。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一种紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5及其编码基因与应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>651

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgaagcatc ttttatcact aaccctttcc ttcttcatct ttgttttcat caccaatctt 60

tcactagcta cttcaaatga tgttgagcaa gtattggaca taaatggtaa ccccattttc 120

ccaggtggtc aatactacat tttgccagca cttcgtggcc ccggaggagg aggagtaaga 180

ttaggaagaa ccggtgattt aaagtgtcca gttaccgtct tacaagatcg tagagaagtc 240

aagaatggtc taccagtgaa attcaccata ccaggaataa gtcctggtat aattttcact 300

ggtacaccac ttgagatcga gtacacgaag aaacctagtt gcgctgaatc aacaaaatgg 360

ttaatatttg ttgataatgt tattggaaaa gcttgtgttg gtattggtgg tcctgaaaat 420

taccctggtg tgcaaacatt gagtggcaaa tttaatattc agaaacatgc atctggattt 480

ggttatcagc tagggttttg tgttacgggg tctcctactt gtttggatat tggaaggttt 540

gataatgatg aagctggaag acgtttgaat ttgactgaac atgaggttta tcatgttgtg 600

tttgttgatg cagctactta tgaagctgag tatattaagt ctgttgtttg a 651

<210>2

<211>216

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Lys His Leu Leu Ser Leu Thr Leu Ser Phe Phe Ile Phe Val Phe

1 5 10 15

Ile Thr Asn Leu Ser Leu Ala Thr Ser Asn Asp Val Glu Gln Val Leu

20 25 30

Asp Ile Asn Gly Asn Pro Ile Phe Pro Gly Gly Gln Tyr Tyr Ile Leu

35 40 45

Pro Ala Leu Arg Gly Pro Gly Gly Gly Gly Val Arg Leu Gly Arg Thr

50 55 60

Gly Asp Leu Lys Cys Pro Val Thr Val Leu Gln Asp Arg Arg Glu Val

65 70 75 80

Lys Asn Gly Leu Pro Val Lys Phe Thr Ile Pro Gly Ile Ser Pro Gly

85 90 95

Ile Ile Phe Thr Gly Thr Pro Leu Glu Ile Glu Tyr Thr Lys Lys Pro

100 105 110

Ser Cys Ala Glu Ser Thr Lys Trp Leu Ile Phe Val Asp Asn Val Ile

115 120 125

Gly Lys Ala Cys Val Gly Ile Gly Gly Pro Glu Asn Tyr Pro Gly Val

130 135 140

Gln Thr Leu Ser Gly Lys Phe Asn Ile Gln Lys His Ala Ser Gly Phe

145 150 155 160

Gly Tyr Gln Leu Gly Phe Cys Val Thr Gly Ser Pro Thr Cys Leu Asp

165 170 175

Ile Gly Arg Phe Asp Asn Asp Glu Ala Gly Arg Arg Leu Asn Leu Thr

180 185 190

Glu His Glu Val Tyr His Val Val Phe Val Asp Ala Ala Thr Tyr Glu

195 200 205

Ala Glu Tyr Ile Lys Ser Val Val

210 215

Claims (10)

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的重组菌；

B5)含有B1)所述核酸分子或含有B2)所述表达盒或含有B3)所述重组载体的细胞系。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.权利要求1所述蛋白质作为胰蛋白酶抑制剂在害虫防治中的应用；

或，权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在害虫防治中的应用；

或，权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在制备害虫防治的产品中的应用。

5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在降低害虫存活率和/或繁殖率中的应用；

或，权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在制备降低害虫存活率和/或繁殖率的产品中的应用。

6.一种防治害虫的方法，包括将权利要求1所述蛋白质导入害虫的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述导入的方式为饲喂。

8.一种用于防治害虫的产品，其活性成分为权利要求1所述蛋白质。

9.根据权利要求4或5所述的应用或权利要求6或7所述的方法或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述害虫为蚜虫。

10.根据权利要求9所述的应用或方法或产品，其特征在于：所述蚜虫为苜蓿斑蚜。