CN112175967B

CN112175967B - 一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的pen1基因及其应用

Info

Publication number: CN112175967B
Application number: CN202011077977.5A
Authority: CN
Inventors: 李培金; 何晨; 王传宏; 陶珍; 陈红亿; 陈晨; 王开机; 朱培玲
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2020-10-10
Filing date: 2020-10-10
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2040-10-10
Also published as: CN112175967A

Abstract

本发明公开了一种增强植物抵抗鳞翅目害虫能力的PEN1基因及其应用，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或与其具有较高同源性的基因序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对过表达PEN1转基因植株的抗虫实验发现，与对照相比，鳞翅目害虫小菜蛾的死亡率显著增加，因此，过表达PEN1基因的转基因植株具有抗虫效应，为开发新的抗虫植物提供研究基础。

Description

一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的PEN1基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的PEN1基因及其应用。

背景技术

虫害是造成农业减产的主要原因之一。据不完全统计，全世界每年因虫害引起的作物减产达总产量的15％，损失高达数千亿美元。鳞翅目昆虫作为昆虫纲中的第2个大目，其幼虫绝大多数为植食性，是农林作物、果树、茶叶、蔬菜、花卉等的重要害虫。鳞翅目害虫在水稻中以二化螟、三化螟、大螟及稻纵卷叶螟为主要代表，在玉米中以玉米螟、玉米粘虫、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、二点委夜蛾为主要代表。小菜蛾是十字花科植物中典型的害虫，尤其对油菜、甘蓝等作物蔬菜危害较大。其在幼虫时期啃食能力较强，尤其是暴食期幼虫能够大面积啃食作物的叶片和茎秆，造成作物减产甚至绝收。小菜蛾在羽化成为成虫后，能够长出翅膀迁徙，继续危害不同地区的作物和蔬菜。因此，开发新型抗小菜蛾的植物品系在农业发展方面具有重大意义。

长期以来人们用各种化学杀虫剂毒杀鳞翅目害虫，导致了严重的环境污染，作物上残留的农药危害人体健康，此外，害虫也产生抗药性、生态平衡遭到破坏。基因工程技术的发展为培育抗虫作物提供了有力手段。因此开发新型植物抗虫品系对促进农业经济发展提供一条新的途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种过表达后能增强植物抵抗鳞翅目害虫能力的PEN1基因及其应用，以利用基因工程技术代替物理防治和传统农药喷洒等技术，为鳞翅目害虫的生物防治提供新型材料，为开发抵抗鳞翅目害虫的新植物提供研究基础。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的PEN1基因，具有如下序列中任意一种：

(1)：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)：如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的互补序列；

(3)：与(1)或(2)的核苷酸序列编码相同蛋白质，且因遗传密码的简并性而与(1)或(2)的核苷酸序列不同的序列；

(4)：具有(1)或(2)的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)的核苷酸序列具有同等功能的同源基因序列。

进一步改进在于，所述PEN1基因是从拟南芥植物中克隆获得。

一种上述PEN1基因的编码蛋白，该编码蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，共编码766个氨基酸。

一种表达载体，所述表达载体为插入上述PEN1基因，并以微生物细胞或植物细胞作为宿主细胞的重组质粒。

一种转化子，所述转化子为含有上述表达载体，或整合有上述PEN1基因的微生物或植物细胞。

一种上述PEN1基因过表达后在增强植物抵抗鳞翅目害虫能力中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种过表达后能增强植物抵抗鳞翅目害虫的PEN1基因及其应用，通过对PEN1过表达植株的抗虫实验发现，与对照相比，鳞翅目害虫小菜蛾的死亡率显著增加，因此，过表达PEN1基因的转基因植株具有抗虫效应，为开发新的抗虫植物提供研究基础。

附图说明

图1为35S-PEN1重组质粒构建示意图，图中A表示PEN1基因全长CDS扩增电泳图，B表示过表达载体构建酶切电泳图；

图2为PEN1基因表达量图；

图3为选择性取食实验结果图；

图4为强制性取食实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1拟南芥PEN1基因过表达重组质粒的构建

2.1.1以拟南芥野生型Col品种为材料，提取DNA，作为PCR扩增的模板。

2.1.2用设计的特异性引物：

PEN1-F：(5'>GGTACCATGTGGAGACTAAGAATTGGAGCTA<3')

PEN1-R：(5'>GAATTCTCAAGGTTGAAGTCGCCGTA<3')

进行扩增，得到2301bp的基因片段(如图1所示)，连接到T克隆载体PEASY-T3Cloning Kit上，获得T3-PEN1转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序，测序结果与预测结果一致，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。提取质粒，酶切后连接到连接有35S启动子的过表达载体pCAMBIA1300上，获得pCAMBIA1300-35S-PEN1转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆，提取质粒，酶切验证正确，即完成构建。

2.2获得转基因阳性苗

将拟南芥PEN1基因过表达重组质粒转化进入农杆菌中，菌P验证正确后，用农杆菌浸染拟南芥，待侵染拟南芥种子成熟后，收集种子，晾干待用，该种子为T0代种子。由于T0代种子较多，且我们转入的重组质粒带有Kana抗性，通过抗性板筛选出T0代阳性苗。T0代阳性植株获得T1代种子，T1代为杂合植株，因此需要进一步抗性筛选出纯合植株。直至在抗性平板上不再出现分离即得到纯合植株，一般到T3代即可得到纯合株系。

2.3 RT-PCR检测基因表达量

22℃，18h光照/8h黑暗，条件下生长7天的野生型Col，35S-PEN1转基因材料；提取RNA，反转录，RT-PCR检测

实验所用引物为：PEN1-F(RT-PCR)：TATGGAGGATGCAGTTTCTTAGGG；

PEN1-R(RT-PCR)：CAAGGCCGTAAAATAATGTAATCC，检测结果如图2所示。

2.4拟南芥选择性抗虫实验

选取三龄小菜蛾幼虫，以生长14天的野生型Col或35S-PEN1转基因材料开展小菜蛾选择性取食实验。

2.5小菜蛾对Col和35S-PEN1强制性取食实验

选取二龄小菜蛾幼虫，喂食生长14天的野生型Col或35S-PEN1转基因材料。分别在喂食后24h，48h，72h，100h，120h，148h和168h统计小菜蛾的死亡率。

3、结论

研究结果表明，小菜蛾幼虫相对于35S-PEN1转基因材料更偏向于取食Col野生型(如图3所示)，并且，在强制喂食小菜蛾幼虫35S-PEN1转基因材料后，显著增加了幼虫的死亡率(如图4所示)。因此，PEN1基因在转基因植物抗鳞翅目害虫研究方面具有重要价值。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种增强植物抵抗鳞翅目害虫的PEN1基因及其应用

<141> 2020-10-10

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2301

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis)

<400> 1

atgtggagac taagaattgg agctaaggcc ggaaatgata ctcacttgtt cacgaccaac 60

aactatgttg ggaggcagat ttgggagttt gatgccaacg caggctcccc tcaagaactt 120

gccgaggtcg aggaggctcg tcggaatttc tctaacaata ggtcacatta caaggccagt 180

gctgatctct tatggaggat gcagtttctt agggaaaaag gttttgaaca gaagattcca 240

cgtgtgagag tagaggatgc agcgaaaata aggtatgaag atgcaaaaac cgcattgaaa 300

agaggattac attattttac ggccttgcag gcagatgatg gacactggcc tgcagataac 360

tctggtccaa atttcttcat cgctccttta gttatatgct tgtacattac tggacatctg 420

gagaaaatct ttacagtcga gcatcgtata gagttaatac gttacatgta taaccatcag 480

aacgaagatg gtgggtgggg attacatgta gaaagcccta gtattatgtt ttgtacagtc 540

atcaactaca tttgtttacg aatcgtggga gtagaagccg gtcatgatga tgatcaagga 600

agtacttgta caaaggctcg taagtggata ctcgaccacg gtggtgctac ctacacaccc 660

ttgatcggaa aagcttgcct atcagttctt ggagtgtatg attggtctgg ctgcaaacct 720

atgccgccag agttctggtt ccttccttct tcttttccta ttaatggagg aactctatgg 780

atttatttac gggatatttt catggggttg tcatacttgt atggtaaaaa atttgttgca 840

actccaacac ctctcatcct ccagctccaa gaagagcttt atccagagcc ttacaccaaa 900

atcaattgga ggcttaccag aaaccgatgt gcaaaggaag atctctgtta tccatcctca 960

tttttacaag atttgttttg gaaaggtgtt catatcttct cagagagtat tctaaatcga 1020

tggcctttca acaagctcat aagacaagca gctcttcgaa ccactatgaa actccttcac 1080

tatcaagatg aagccaatag atacattaca ggcggatcag tgccaaaggc ctttcatatg 1140

cttgcatgtt gggtagaaga cccagagggt gaatatttta aaaagcatct tgctcgagtc 1200

tctgatttca tatggattgg cgaggatggc ctcaaaattc agtcttttgg cagccaattg 1260

tgggatacag tcatgtcgct acatttcctg ttagacggtg ttgaggatga tgtcgatgat 1320

gaaattagat ccacgctcgt taaaggatac gattacttga agaaatctca agttacagag 1380

aatcctccta gtgatcacat aaaaatgttc cgccatattt cgaaaggtgg atggacgttt 1440

tcggacaaag atcaaggatg gcctgtttca gactgcactg ctgagagttt aaaatgctgt 1500

ctattatttg agaggatgcc gtcggagttt gttggccaga aaatggatgt ggagaaactc 1560

tttgatgccg ttgattttct tctctacttg cagagtgata acggaggtat aacagcttgg 1620

gaacccgcgg atgggaaaac ctggttagag tggtttagtc cggtggaatt tgttcaagac 1680

acggtcatcg agcatgagta tgtggaatgt acagggtcag ccattgtagc gttgactcag 1740

tttagtaaac aattcccgga gtttagaaag aaagaggttg aaaggtttat aactaacgga 1800

gtgaaataca ttgaggattt gcaaatgaag gatggttcat ggtgcggaaa ctggggagtg 1860

tgctttatct atgggacctt atttgccgta agaggtcttg tggctgcagg aaagactttc 1920

cataactgtg aacccattcg tcgagcagtt cgtttccttc tcgacacgca aaaccaggag 1980

ggtggttggg gagagagcta tctctcttgc ctaaggaaga aatatactcc tttagcagga 2040

aacaagacaa atatagtgag tacaggacaa gcgcttatgg ttctaattat gggtggtcag 2100

atggagagag atcctttgcc ggttcatcgt gctgccaaag tagtgatcaa tttacagttg 2160

gataacggtg atttcccgca acaggaagta atgggagtat tcaatatgaa tgtgctgctc 2220

cattatccaa catataggaa catttattct ctttgggccc tcacactata cacgcaagct 2280

ctacggcggc ttcagccttg a 2301

<210> 2

<211> 766

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis)

<400> 2

Met Trp Arg Leu Arg Ile Gly Ala Lys Ala Gly Asn Asp Thr His Leu

1 5 10 15

Phe Thr Thr Asn Asn Tyr Val Gly Arg Gln Ile Trp Glu Phe Asp Ala

20 25 30

Asn Ala Gly Ser Pro Gln Glu Leu Ala Glu Val Glu Glu Ala Arg Arg

35 40 45

Asn Phe Ser Asn Asn Arg Ser His Tyr Lys Ala Ser Ala Asp Leu Leu

50 55 60

Trp Arg Met Gln Phe Leu Arg Glu Lys Gly Phe Glu Gln Lys Ile Pro

65 70 75 80

Arg Val Arg Val Glu Asp Ala Ala Lys Ile Arg Tyr Glu Asp Ala Lys

85 90 95

Thr Ala Leu Lys Arg Gly Leu His Tyr Phe Thr Ala Leu Gln Ala Asp

100 105 110

Asp Gly His Trp Pro Ala Asp Asn Ser Gly Pro Asn Phe Phe Ile Ala

115 120 125

Pro Leu Val Ile Cys Leu Tyr Ile Thr Gly His Leu Glu Lys Ile Phe

130 135 140

Thr Val Glu His Arg Ile Glu Leu Ile Arg Tyr Met Tyr Asn His Gln

145 150 155 160

Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Val Glu Ser Pro Ser Ile Met

165 170 175

Phe Cys Thr Val Ile Asn Tyr Ile Cys Leu Arg Ile Val Gly Val Glu

180 185 190

Ala Gly His Asp Asp Asp Gln Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ala Arg Lys

195 200 205

Trp Ile Leu Asp His Gly Gly Ala Thr Tyr Thr Pro Leu Ile Gly Lys

210 215 220

Ala Cys Leu Ser Val Leu Gly Val Tyr Asp Trp Ser Gly Cys Lys Pro

225 230 235 240

Met Pro Pro Glu Phe Trp Phe Leu Pro Ser Ser Phe Pro Ile Asn Gly

245 250 255

Gly Thr Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Asp Ile Phe Met Gly Leu Ser Tyr

260 265 270

Leu Tyr Gly Lys Lys Phe Val Ala Thr Pro Thr Pro Leu Ile Leu Gln

275 280 285

Leu Gln Glu Glu Leu Tyr Pro Glu Pro Tyr Thr Lys Ile Asn Trp Arg

290 295 300

Leu Thr Arg Asn Arg Cys Ala Lys Glu Asp Leu Cys Tyr Pro Ser Ser

305 310 315 320

Phe Leu Gln Asp Leu Phe Trp Lys Gly Val His Ile Phe Ser Glu Ser

325 330 335

Ile Leu Asn Arg Trp Pro Phe Asn Lys Leu Ile Arg Gln Ala Ala Leu

340 345 350

Arg Thr Thr Met Lys Leu Leu His Tyr Gln Asp Glu Ala Asn Arg Tyr

355 360 365

Ile Thr Gly Gly Ser Val Pro Lys Ala Phe His Met Leu Ala Cys Trp

370 375 380

Val Glu Asp Pro Glu Gly Glu Tyr Phe Lys Lys His Leu Ala Arg Val

385 390 395 400

Ser Asp Phe Ile Trp Ile Gly Glu Asp Gly Leu Lys Ile Gln Ser Phe

405 410 415

Gly Ser Gln Leu Trp Asp Thr Val Met Ser Leu His Phe Leu Leu Asp

420 425 430

Gly Val Glu Asp Asp Val Asp Asp Glu Ile Arg Ser Thr Leu Val Lys

435 440 445

Gly Tyr Asp Tyr Leu Lys Lys Ser Gln Val Thr Glu Asn Pro Pro Ser

450 455 460

Asp His Ile Lys Met Phe Arg His Ile Ser Lys Gly Gly Trp Thr Phe

465 470 475 480

Ser Asp Lys Asp Gln Gly Trp Pro Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ser

485 490 495

Leu Lys Cys Cys Leu Leu Phe Glu Arg Met Pro Ser Glu Phe Val Gly

500 505 510

Gln Lys Met Asp Val Glu Lys Leu Phe Asp Ala Val Asp Phe Leu Leu

515 520 525

Tyr Leu Gln Ser Asp Asn Gly Gly Ile Thr Ala Trp Glu Pro Ala Asp

530 535 540

Gly Lys Thr Trp Leu Glu Trp Phe Ser Pro Val Glu Phe Val Gln Asp

545 550 555 560

Thr Val Ile Glu His Glu Tyr Val Glu Cys Thr Gly Ser Ala Ile Val

565 570 575

Ala Leu Thr Gln Phe Ser Lys Gln Phe Pro Glu Phe Arg Lys Lys Glu

580 585 590

Val Glu Arg Phe Ile Thr Asn Gly Val Lys Tyr Ile Glu Asp Leu Gln

595 600 605

Met Lys Asp Gly Ser Trp Cys Gly Asn Trp Gly Val Cys Phe Ile Tyr

610 615 620

Gly Thr Leu Phe Ala Val Arg Gly Leu Val Ala Ala Gly Lys Thr Phe

625 630 635 640

His Asn Cys Glu Pro Ile Arg Arg Ala Val Arg Phe Leu Leu Asp Thr

645 650 655

Gln Asn Gln Glu Gly Gly Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Leu Arg

660 665 670

Lys Lys Tyr Thr Pro Leu Ala Gly Asn Lys Thr Asn Ile Val Ser Thr

675 680 685

Gly Gln Ala Leu Met Val Leu Ile Met Gly Gly Gln Met Glu Arg Asp

690 695 700

Pro Leu Pro Val His Arg Ala Ala Lys Val Val Ile Asn Leu Gln Leu

705 710 715 720

Asp Asn Gly Asp Phe Pro Gln Gln Glu Val Met Gly Val Phe Asn Met

725 730 735

Asn Val Leu Leu His Tyr Pro Thr Tyr Arg Asn Ile Tyr Ser Leu Trp

740 745 750

Ala Leu Thr Leu Tyr Thr Gln Ala Leu Arg Arg Leu Gln Pro

755 760 765

Claims

1.一种PEN1基因过表达后在增强植物抵抗鳞翅目害虫能力中的应用，其特征在于，所述鳞翅目害虫为小菜蛾，所述植物为拟南芥，所述PEN1基因序列为如下序列中任意一种：

（1）如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

（2）与（1）的核苷酸序列编码相同蛋白质，且因遗传密码的简并性而与（1）的核苷酸序列不同的序列。