CN101870979A - 对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX及其应用”属于生物技术领域。对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。编码该蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO1所示。该基因表现出鳞翅目害虫的高毒力，将其改造序列SEQ ID NO3应用于转化微生物或植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。

Description

对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及苏云金芽孢杆菌对鳞翅目害虫高毒力的新的杀虫基因cryX及其应用。

背景技术

虫害是造成农作物减产的重要原因之一，减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14％，直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10％、小麦减产20％、棉花减产30％以上[夏启中，张明菊，抗植物虫害基因及其应用，鄂州大学学报，2005，(5)：56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，生物杀虫剂成本较高。长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成为可持续发展农业中必须正视的课题之一。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)[Bravo.A.，Gill S.S.，Soberón M.Bacillus thuringiensis Mechanisms and Use.Comprehensive Molecular Insect Science Elsevier，2005，175～206.]，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998.62(3)：775-806.]。从1981年，Schnepf和Whiteley克隆了第一个编码δ-内毒素的cry1Aa1基因，截止2008年6月已发现和克隆了412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、对人畜无害[De Maagd R.A.，Bravo A.，Crickmore N.How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize the insect world.Trends Genet，2001，17：193～199.]，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。

1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1A基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2009年有25个国家的1400万小农户和大农场主种植了1.34亿公顷(3.3亿英亩)的转基因作物，比2008年增长了7％，即900万公顷(2200万英亩)，达到历史最高点；相应的“性状或实际面积”增长了8％，即相比2008年的1.66亿公顷，增长了1400万公顷，达到2009年的1.8亿公顷。1996年至2009年间转基因作物种植面积空前地增长了80倍，使转基因成为农业近代史上利用最快的作物技术。

由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。

因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

发明内容

本发明提供一种新的对小菜蛾、玉米螟、棉铃虫等鳞翅目害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白基因序列，以应用于转化微生物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌的抗药性产生。

对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID NO2所示的第31位-601位氨基酸序列。

对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。

对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX，其核苷酸序列编码上述杀虫基因蛋白CryX。

对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX，其具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX，其具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。

一种表达载体，其含有上述杀虫基因cryX。

所述表达载体为pUX，其结构如图4中所示。

对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX在防治鳞翅目害虫中的应用。

所述应用为将上述杀虫基因蛋白CryX制成杀虫剂用于防治鳞翅目害虫，或者将上述杀虫基因cryX转入植物或微生物中表达抗鳞翅目害虫的特性。

所述植物为玉米。

本发明是从菌株T03B001(保藏号：BGSC No.4AP1，公众可以从中国农业科学院植物保护研究所取得)克隆得到的一个新基因，全长为1.8Kb，其核苷酸序列为SEQ ID NO1，其编码的氨基酸序列为600个见SEQ ID NO2所示，通过分析比例，该蛋白氨基酸序列的31位至601位氨基酸是该蛋白的杀虫活性区域。

经过杀虫活性测定，该基因蛋白对小菜蛾、玉米螟、棉铃虫有高毒力。

针对上述杀虫活性区氨基酸序列，本发明设计合成了用于转基因植物开发的DNA序列，如SEQ ID NO3所示。该合成序列导入到玉米中，对玉米螟有较好的抗虫活性。

附图说明

图1cryX阳性克隆PCR鉴定

其中1，1.9kb PCR产物M，λ/Eco130I

图2CryX在大肠肝菌中的表达

图3序列比对图

Query为SEQ ID NO3

Sbjct为原有cryX序列，即SEQ ID NO1

图4表达载体pUX构建流程图

图5植物表达载pU1Ai的酶切鉴定

其中M：λDNA/Eco130I，1：pU1Ai/SacI+BamHI，2：pT8A/SacI+BamHI，3：p3300-Ubi/Sac I+BamH I

图6抗性植株PCR检测

M：DM2000P：pUX CK：阴性对照1～9：部分转基因植株

图7PCR阳性植株中CryX蛋白占可溶性蛋白比例

图8T0代转基因植株的玉米螟生物活性测定

A，B：未转化植株C：转基因植株

具体实施方式

菌株T03B001(保藏号：BGSC No.4AP1，公众可以从中国农业科学院植物保护研究所取得)

杀虫活性测定

将菌株接种到LB固体培养基上，培养72小时，至芽孢与晶体释放。将芽孢与晶体用灭菌水洗下来，悬浮起来，稀释到1亿芽孢每毫升的浓度用于杀虫活性测定。以小菜蛾、玉米螟、棉铃虫，测定对鳞翅目害虫的杀虫活性。结果显示该浓度的芽孢晶体混合物对小菜蛾、玉米螟、棉铃虫具有高活性。三种试虫的死亡率都为100％。

设计引物扩增cryX全长基因

用solexa方法对T03B001基因组测序。

利用已经报道的Bt杀虫基因作为比对数据库进行基因筛选。结果如下表所示，其中contig00361编码的基因与cry1Ca最为相似，但是得分(score)也只有174，说明这是一个新基因。

QueryName	Score	E-value	Overlap/total	Identity	SbjectName
						contig00023	5586	0	2923/2958	98	cry9eb
contig00360	6912	0	3506/3510	99	cry9da
						contig00360	2290	0	1440/1536	93	cry9da
contig00361	174	0	154/176	82	cry1Ca
						contig00363	5388	0	2894/2955	97	cry9aa

根据contig00361编码的基因设计了一对引物(LIU5/LIU3)，序列如下：

LIU5-ATGAATTCAAAGGAACATGATTATCT

LIU3-TTCAACAGGAATAAATTCAATTTTATCC

通过PCR扩增的方法，以T03B001的基因组为模版，克隆cryX基因全长，见图1，连接pEB表达载体得到阳性克隆。获得的重组表达载体质粒命名为pEBs6。

用pfuDNA聚合酶，用如下体系进行PCR扩增。。

10×PCR buffer	5μL
		dNTP(10mM)	1μL
引物对(10mM)	1μL/个
		模板	1uL
pfuDNA聚合酶(5U/μL)	0.5μL

超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。

扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。如图1所示。

cryX全长基因序列分析

对阳性克隆进行测序，得到基因全长序列。

连接方案

载体                   0.1-0.2μg

目的片段DNA            0.5-1.0μg

5×Ligation Buffer     2μL

T4DNALigase            1μL

用超纯水补足体积到10μL，充分混匀，16℃连接4h或4℃连接过夜。

转化方案

1.挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜；

2.按1％接种量接种于LB液体培养基中，37℃，230rpm培养2-2.5hr，(OD₆₀₀＝0.5-0.6)；

3.4℃，4,000rpm离心10min；

4.弃上清，加入预冷的0.1M CaCl₂50ml悬浮细胞，置于冰上30min以上；

5.4℃，4,000rpm离心10min，回收细胞；

6.用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞，分装成200μl/0.5mL离心管中，于4℃保存(可保存一周)。

7.取200μl感受态细胞与5μL连接产物充分混匀，冰浴30min。

8.42℃热激1.5min，冰浴3min。

9.加入800μl LB培养基37℃培养45min。

10.取200μl涂板，加入相应的抗生素，及IPTG，X-gal，37℃培养。

基因全长1.8kb，见SEQ ID NO1，翻译蛋白共601个氨基酸，见SEQ ID NO2。通过利用在线分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，使用蛋白保守结构域数据库比对(Conserved Domain Database)分析，该蛋白氨基酸序列SEQ ID NO2的31至601位氨基酸是该蛋白的杀虫活性区域。

cryX的表达

提取JM110阳性克隆质粒，转化Rosetta(λDE3)，IPTG诱导表达。

诱导表达过程如下：

1)活化菌种(37℃、12hr)；

2)10％接种于LB培养基中(37℃、2hr)；

3)加入诱导物IPTG，150rpm，18-22℃低温诱导4-20h；

4)离心收集菌体，加入10mM Tris·Cl(pH 8.0)悬浮；

5)破碎菌体(超声波破碎完全)；

离心12,000rpm 10min4℃；

收集上清及沉淀各10-15μL，分别电泳检测。

聚丙烯酰胺凝胶配置如下。

                                分离胶8％(ml)               堆积胶5％(ml)

Distilled water                 4.6                         2.7

30％Degassed Acrylamide         2.7                         0.67

1.5M Tris(pH8.8)                2.5

1.0M Tris(pH6.8)                                            0.5

10％SDS                         0.1                         0.04

10％APS                 0.1                         0.04

TEMED                   0.006                       0.004

上样：上样10-15μl，电泳：130-150V恒压。

染色与脱色：电泳后取出凝胶，用蒸馏水冲洗后，放入染色液中，60rpm振荡染色1hr左右，脱色液中脱色2hr左右，脱色至凝胶背景透明，清水中漂洗至蛋白带清晰。cryX基因可以表达约66kD的蛋白(见图2)。

杀虫活性测定

以小菜蛾、玉米螟、棉铃虫为例测定蛋白对鳞翅目的杀虫活性，见由表1、表2，3，结果可知CryX蛋白对鳞翅目害虫有高毒力。

敏感小菜蛾的生物活性测定结果如表1，各浓度重复4次，每重复接虫15头。

表1，CryX对敏感小菜蛾的生物活性测定

敏感小菜蛾的生物活性测定结果显示CryX对敏感小菜蛾有高毒力。

对敏感亚洲玉米螟的生物活性测定见表2，各浓度重复3次，每重复接虫24头

表2，CryX敏感亚洲玉米螟的生物活性测定

对敏感亚洲玉米螟的生物活性测定结果显示CryX敏感亚洲玉米螟有高毒力。

对棉铃虫的生物活性测定见表3，各浓度重复3次，每重复接虫24头。

表3CryX敏感棉铃虫的生物活性测定结果

对敏感棉铃虫的生物活性测定结果显示，CryX敏感棉铃虫的生物活性表现为高效抑制发育。CryX蛋白在转基因植物中的应用

根据CryX蛋白的杀虫活性区氨基酸序列设计合成了可以用于转基因植物开发的DNA序列，如SEQ ID NO3。去除了多聚腺苷酸化信号19个，GC含量提高了15.2％。该序列具有GC含量为50.4％的特征；含有利于植物表达的序列，具体见SEQ3。在基因上游添加了Ω序列序列，在基因3’端添加了内质网定位信号。

该合成序列由组成型Ubiquitin启动子驱动，导入到玉米中，对玉米螟螟有较好的抗虫活性。

SEQ ID NO 3

GGATCCAAGCTTTCTAGACCCGGGCCTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAA

CATTACAATTACTATTTACAATTACATGAACTCAAAGGAGCACGACTACCTAAAGGTGTGTAATGAC

TTGAGCGATGCCAACATTAACATGGAGCGGTTTGACAAGAATGATGCGCTGGAAATCGGCATGTCC

ATCGTCTCCGAACTTATCGGTATGATTCCAGGCGGAACAGCCTTGCAGTTCGTGTTCAATCAGTTGTG

GTCTCGTCTGGGTGACTCTGGCTGGAATGCGTTCATGGAACACGTGGAAGAGTTGATTGATACGAAG

ATCGAAGGGTATGCCAAGAACAAAGCCTTATCAGAACTCGCAGGCATTCAGAGAAACCTTGAGACC

TACATCCAACTGCGCAACGAATGGGAGAACGACATCGAGAACTCCAAGGCTCAAGGCAAGGTAGCC

AACTATTACGAGAGTCTTGAGCAGGCGGTTGAGAGGAGCATGCCTCAGTTTGCAGTGGAAAACTTTG

AGGTACCACTTTTGACTGTCTACGTGCAAGCTGCCAATCTTCACTTGCTCCTCCTGAGGGATGTGTCA

GTGTATGGCAAGTGCTGGGGTTGGTCGGAGCAGAAGATCAAGATCTACTACGACAAGCAGATCAAG

TACACCCATGAGTACACCAATCACTGTGTCAACTGGTATAACAAAGGCCTTGAGAGACTCAAAAAC

AAAGGTTCCTCCTACCAAGACTGGTACAACTATAATCGCTTCCGCAGAGAGATGACTCTTACTGTTC

TCGACATCGTTGCTCTCTTCCCGCACTATGATGTCCAGACGTATCCGATAACCACCGTTGCTCAGCTA

ACCAGGGAAGTGTACACGGATCCGCTGCTTAACTTCAACCCCAAACTCCACTCCGTGTCCCAACTGC

CTAGCTTCAGCGACATGGAGAATGCGACCATCCGGACTCCACATCTGATGGAGTTCCTCCGGATGCT

AACCATCTACACAGATTGGTACAGTGTGGGCAGGAACTACTACTGGGGTGGACATCGCGTGACGTC

CTACCATGTAGGTGGCGAGAATATACGATCACCTCTGTATGGTCGGGAGGCCAACCAAGAGGTTCCC

AGAGACTTCTACTTCTATGGACCGGTCTTCAAGACGCTCTCAAAGCCGACTCTAAGACCACTGCAGC

AGCCTGCACCAGCTCCTCCGTTCAATCTCCGTAGCCTGGAGGGAGTCGAGTTCCACACTCCCACAGG

TAGCTTCATGTATCGCGAGAGAGGGTCGGTAGATTCCTTCAATGAGTTGCCCCCCTTCAATCCAGTT

GGGTTACCTCACAAGGTCTACAGTCACCGTCTGTGTCATGCGACGTTTGTTCGCAAGTCTGGGACCC

CCTATCTCACAACAGGAGCCATCTTTTCGTGGACACATCGCAGTGCTGAAGAGACCAACACCATAGA

ATCGAACATCATTACGCAGATCCCGTTAGTCAAAGCGTATCAGATTGGGTCAGGCACTACTGTCAGG

AAAGGCCCAGGCTTCACAGGAGGGGACATACTTCGAAGGACAGGTCCTGGCACCTTTGGCGACATG

AGGATAAACATCAATGCACCACTCTCTCAGAGGTACCGTGTCAGGATTCGCTACGCCTCTACGACAG

ATCTCCAGTTCGTCACGAGCATCAATGGGACCACCATCAACATTGGCAACTTCCCGAAGACGATCAA

CAATCTGAACACTCTGGGTTCTGAGGGCTACCGGACAGTCTCGTTTAGCACTCCCTTCAGCTTCTCGA

ATGCACAAAGTATCTTTCGACTGGGCATACAAGCGTTTTCTGGGGTTCAAGAAGTGTATGTGGACAA

GATTGAGTTTATTCCGGTTGAA

GAACTTTGATAAGGTACCCTCGAGGAGCTCTCC

GAATTC

下划线为Ω序列，边框为KEDL内质网定位信号，上游添加了BamH I、HindIII、XbaI、XmaI、SmaI、NcoI，下游添加了SacI、EcoRI酶切位点，便于载体构建。

合成序列与原有核苷酸序列有83.75％的相似性。比对情况见图3。

图3中，Query：SEQ3

Sbjct：原有cryX序列

Alignment of query(upperline)and subject(lowerline)

Identity＝83.75％(1510/1803)Gap＝0.00％(0/1803)

植物表达载体构建

用BamH I和Sac I双酶切中间载体p3300-Ubi，将回收的载体片段分别与用同样两个限制性内切酶消化的cryX片段相连，构建流程见图4，酶切鉴定(图5)证明植物表达载体pUX构建成功，该载体含有由组成型启动子Ubiquitin驱动的cryX基因，筛选标记为bar基因。玉米遗传转化

玉米的控制授粉

(1)玉米抽雄后，用大口袋套住雄穗，下面用别针别住，收集花粉；

(2)雌穗花丝未抽出前，用小口袋将其套住，并用大头针别好；

(3)在授粉的前一天，当花丝伸出约2cm长时，用剪刀剪去花丝的顶部，促进其伸长；

(4)第二天，当花丝伸长后，依下列组合进行授粉(前为母本，后为父本)：齐31×综31；

(5)授粉后系上小牌，写上授粉的品种和日期，10～12天后收获；

幼胚的剥离和培养

(1)将新收获的玉米雌穗去掉苞叶、花丝，花丝一定要去干净，可用酒精灯将未除净的花丝烧去；用小刀去掉雌穗的头尾部分；

(2)将雌穗浸在70％乙醇中灭菌30sec；

(3)将雌穗取出，浸在2.5％的次氯酸纳中灭菌10～15min，可以在溶液中加几滴Tween20；

(4)用灭菌水清洗3次，用滤纸擦去残留的水珠，置于无菌的环境中备用；

(5)将一只枪式镊子从顶部插入雌穗，用左手持住镊子，右手用装有#21刀片的手术刀切去籽粒的上半部分；

(6)换上#10刀片，将刀尖插入籽粒下部的果皮与胚乳之间，将胚乳挑出；

(7)用刀尖将粘在胚乳顶部或顶部果皮内的幼胚转移到诱导培养基上，操作要小心，不要损伤幼胚。放置时注意胚轴(较平的一面)向下，盾片向上，每皿约放置20～30个；

(8)27～28℃暗培养3～4周，使之开始脱分化，形成愈伤组织；此后，选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养，每2～3周继代一次，选择生长良好的愈伤准备基因枪转化；

(9)在射击前4hr，将切成小块的愈伤转移到含0.4M甘露醇的高渗培养基上；

(10)射击后，使愈伤在高渗培养基上继续培养过夜，然后转移到诱导培养基上，恢复培养一周。

用基因枪进行玉米转化

(1)打开超净台，用70％乙醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部；

(2)打开紫外灯，灭菌30min；

(3)按前述步骤准备微弹；

(4)易裂片、微弹载体、阻拦网灭菌(置于70％乙醇中1.0min，放在滤纸上自然风干)；

(5)打开气瓶，调节压力至2,000psi；

(6)按前述方法安装微弹载体和微弹；

(7)将易裂片、阻拦网和微弹载体安装进固定装置中；射击参数为：Gap distance：20mm；微弹载体飞行距离(Macroprojectile flight distance)：10mm；微弹飞行距离(Particle flight distance)：7cm；压力：1,350psi；真空度：25inches Hg.；

(8)把培养皿放在托盘上，使愈伤都集中在托盘中间的圆圈内，将托盘插入倒数第二档；

(9)打开基因枪的电源；

(10)打开真空泵；

(11)关闭基因枪的门，按下“抽真空”键(Vac)，当真空表读数达到25inches Hg.时，使键置于“保持(Hold)”档；

(12)按下“射击(Fire)”健直到射击结束；

(13)按下“放气”健，使真空表读数归零；

(14)打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子并用封口膜封好；

(15)重复上述步骤，直至完成转化。

转化愈伤组织的筛选和植株的再生

(1)将转化后的愈伤组织置于黑暗中，28℃培养过夜，然后转移到N6诱导培养基上培养5～7天；

(2)将愈伤转移到筛选培养基上(含PPT20mg/L)，两周继代一次，选择色泽正常、分化良好的愈伤，弃去衰老死亡的愈伤。每皿的培养物不宜过多，愈伤块应尽量小些，并使愈伤紧贴培养基；

(3)继代3～4次后，将愈伤移至N6分化培养基上，在光周期为亮/暗＝16/8，28℃条件下培养，每两周继代一次；

(4)将发生绿芽的愈伤组织切分；

(5)当小植株长到1～2cm高时，转移进三角瓶中(含MS生根培养基)继续培养；

(6)3～4叶期且根系较发达时，将小苗移入小花盆中，移入温室培养；二周后移入大花盆，直至开花结实。

转基因植株的PCR检测

转基因植株基因组DNA的提取-SDS法

1.称取0.2g的叶片放入1.5ml离心管，用液氮充分研磨成粉末。

2.加入500μl SDS-Buffer(100mM Tris，50mM EDTA，500mM NaCl，pH 8.0)，混匀。

再加入20μl 20％SDS，轻轻混匀后置于65℃水浴10分钟。

3.加入250μl 5M KAC，混匀，冰上放置30分钟。

4.4℃离心，12000rpm，10分钟。

5.取上清，移入新的离心管中，加入等体积的异丙醇中，冰浴5分钟。

6.4℃离心，12000rpm，10分钟。

7.弃上清，70％乙醇洗涤两次，真空干燥DNA后，加入40μl无菌双蒸水溶解，-20℃保存备用。

PCR检测

反应体系                                  40μl

10×PCR buffer                            4μl

dNTPs(2.5mM)                              3.2μl

引物对(10μM)                             各1.6μl

模板                                      1μl

Taq聚合酶(5U/μl)                         0.4μl

                                                    

                                    超纯水补至40μl

PCR反应条件

94℃预变性5min

72℃延伸         10min

16℃             1min             终止反应

检测引物：

Jc1XF：AAAGCCTTATCAGAACTCGC

Jc1XR：GACATCATAGTGCGGGAAGA

经过抗性筛选得到9株抗性植株，提取抗性植株基因组，以其做模板，进行PCR检测，共得到5株PCR阳性植株(图6)。提取PCR阳性植株可溶性蛋白，3号植株CryX蛋白的含量最高可占总可溶蛋白的0.21％。(见图7)

PCR阳性植株的生物活性测定

将PCR阳性植株移栽，当植株生长到6～8叶时，将玉米螟初孵幼虫接于心叶中，以未转化植株作为阴性对照，接虫2周后调查食叶级别。结果显示，人工接虫玉米螟后，转基因植株单株间的抗虫性表现有一定差异：转基因植株对玉米螟表现为抗性，没有或只有很小的玉米螟危害的虫孔(图8)，未转化植株被玉米螟咬食严重，叶片虫孔大且虫孔数目多，已影响到植株的正常生长。

表4T₀代转基因植株的抗虫性统计

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院植物保护研究所

 

<120>对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX及其应用

 

<130>P10297/ZWB

 

<160>3

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>1803

<212>DNA

<213>对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX的基因

 

<400>1

atgaattcaa aggaacatga ttatctaaaa gtttgtaatg atttaagtga cgccaatatt     60

aatatggaac ggtttgataa gaatgatgca ctggaaattg gtatgtccat tgtatctgaa    120

cttattggta tgattccagg cggaacagct ttgcaatttg tgtttaatca attgtggtct    180

cgtttaggtg attctggatg gaatgcgttc atggaacatg tggaggaatt aattgatact    240

aaaatagaag ggtatgcaaa aaataaagcc ttatctgaat tagcaggtat acaaagaaac    300

cttgaaacat atatacaatt acgtaatgaa tgggaaaatg atattgaaaa ctcaaaggct    360

caaggtaagg tagctaatta ctatgaaagt cttgagcagg cggttgaaag gagtatgcct    420

caatttgcag tggagaattt tgaagtacca cttttaactg tctatgtgca agctgctaat    480

cttcatttat tattattaag agatgtttca gtttatggaa agtgttgggg atggtcggag    540

cagaaaatta aaatttatta tgataaacag attaagtata cccatgaata cacaaatcat    600

tgtgtaaatt ggtataataa aggacttgag agattaaaaa ataaaggttc ttcttatcaa    660

gattggtaca attataatcg tttccgtaga gaaatgactc ttactgtttt agatatcgtt    720

gctttattcc cgcactatga tgtacaaact tatccaataa caaccgttgc tcagctaaca    780

agggaagttt atacggatcc tttacttaat tttaatccta aattacattc tgtgtctcaa     840

ttacctagtt ttagtgacat ggaaaatgca acaattagaa ctccacatct gatggaattt     900

ttaagaatgc taacaattta tacagattgg tatagtgtgg gaagaaacta ttattgggga     960

ggacatcgcg tgacgtctta ccatgtagga ggagagaata taagatcacc tctatatggt    1020

agagaggcaa atcaagaggt tcctagagat ttttattttt atggacccgt ttttaagacg    1080

ttatcaaagc cgactctaag accattacag cagcctgcac cagctcctcc ttttaattta    1140

cgtagcttag agggagtaga attccacact cctacaggta gttttatgta tcgtgaaaga    1200

ggatcggtag attcttttaa tgagttgccg ccttttaatc cagttgggtt acctcataag    1260

gtatacagtc accgtttatg tcatgcaacg tttgttcgta aatctgggac cccttattta    1320

acaacaggtg ccatcttttc ttggacacat cgtagtgctg aagaaaccaa tacaattgaa    1380

tcaaatatta ttacgcaaat cccgttagta aaagcatatc aaattgggtc aggcactact    1440

gtaaggaaag gaccaggatt cacaggaggg gatatacttc gaagaacagg tcctggaaca    1500

tttggagata tgagaataaa tattaatgca ccattatctc aaagatatcg tgtaaggatt    1560

cgttatgctt ctacgacaga tttacaattt gtcacgagta ttaatgggac caccattaat    1620

attggtaact tcccgaaaac tattaataat ctaaatactt taggttctga gggctataga    1680

acagtatcgt ttagtactcc atttagtttc tcaaatgcac aaagcatatt tagattaggt    1740

atacaagcat tttctggagt tcaagaagtt tatgtggata aaattgaatt tattcctgtt    1800

gaa                                                                  1803

 

<210>2

<211>0

<212>PRT

<213>对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX的氨基酸序列

 

<400>2

1         METAsnSerLysGluHisAspTyrLeuLysValCysAsnAspLeuSerAspAlaAsnIle

21          AsnMETGluArgPheAspLysAsnAspAlaLeuGluIleGlyMETSerIleValSerGlu

41          LeuIleGlyMETIleProGlyGlyThrAlaLeuGlnPheValPheAsnGlnLeuTrpSer

61          ArgLeuGlyAspSerGlyTrpAsnAlaPheMETGluHisValGluGluLeuIleAspThr

81          LysIleGluGlyTyrAlaLysAsnLysAlaLeuSerGluLeuAlaGlyIleGlnArgAsn

101         LeuGluThrTyrIleGlnLeuArgAsnGluTrpGluAsnAspIleGluAsnSerLysAla

121         GlnGlyLysValAlaAsnTyrTyrGluSerLeuGluGlnAlaValGluArgSerMETPro

141         GlnPheAlaValGluAsnPheGluValProLeuLeuThrValTyrValGlnAlaAlaAsn

161         LeuHisLeuLeuLeuLeuArgAspValSerValTyrGlyLysCysTrpGlyTrpSerGlu

181         GlnLysIleLysIleTyrTyrAspLysGlnIleLysTyrThrHisGluTyrThrAsnHis

201         CysValAsnTrpTyrAsnLysGlyLeuGluArgLeuLysAsnLysGlySerSerTyrGln

221         AspTrpTyrAsnTyrAsnArgPheArgArgGluMETThrLeuThrValLeuAspIleVal

241         AlaLeuPheProHisTyrAspValGlnThrTyrProIleThrThrValAlaGlnLeuThr

261         ArgGluValTyrThrAspProLeuLeuAsnPheAsnProLysLeuHisSerValSerGln

281         LeuProSerPheSerAspMETGluAsnAlaThrIleArgThrProHisLeuMETGluPhe

301         LeuArgMETLeuThrIleTyrThrAspTrpTyrSerValGlyArgAsnTyrTyrTrpGly

321         GlyHisArgValThrSerTyrHisValGlyGlyGluAsnIleArgSerProLeuTyrGly

341         ArgGluAlaAsnGlnGluValProArgAspPheTyrPheTyrGlyProValPheLysThr

361         LeuSerLysProThrLeuArgProLeuGlnGlnProAlaProAlaProProPheAsnLeu

381         ArgSerLeuGluGlyValGluPheHisThrProThrGlySerPheMETTyrArgGluArg

401         GlySerValAspSerPheAsnGluLeuProProPheAsnProValGlyLeuProHisLys

421         ValTyrSerHisArgLeuCysHisAlaThrPheValArgLysSerGlyThrProTyrLeu

441         ThrThrGlyAlaIlePheSerTrpThrHisArgSerAlaGluGluThrAsnThrIleGlu

461         SerAsnIleIleThrGlnIleProLeuValLysAlaTyrGlnIleGlySerGlyThrThr

481         ValArgLysGlyProGlyPheThrGlyGlyAspIleLeuArgArgThrGlyProGlyThr

501         PheGlyAspMETArgIleAsnIleAsnAlaProLeuSerGlnArgTyrArgValArgIle

521         ArgTyrAlaSerThrThrAspLeuGlnPheValThrSerIleAsnGlyThrThrIleAsn

541         lleGlyAsnPheProLysThrIleAsnAsnLeuAsnThrLeuGlySerGluGlyTyrArg

561         ThrValSerPheSerThrProPheSerPheSerAsnAlaGlnSerIlePheArgLeuGly

581         IleGlnAlaPheSerGlyValGlnGluValTyrValAspLysIleGluPheIleProVal

601         Glu***

<210>3

<211>1946

<212>DNA

<213>对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX的基因序列

 

<400>3

ggatccaagc tttctagacc cgggcctatt tttacaacaa ttaccaacaa caacaaacaa     60

caaacaacat tacaattact atttacaatt acatgaactc aaaggagcac gactacctaa    120

aggtgtgtaa tgacttgagc gatgccaaca ttaacatgga gcggtttgac aagaatgatg    180

cgctggaaat cggcatgtcc atcgtctccg aacttatcgg tatgattcca ggcggaacag    240

ccttgcagtt cgtgttcaat cagttgtggt ctcgtctggg tgactctggc tggaatgcgt     300

tcatggaaca cgtggaagag ttgattgata cgaagatcga agggtatgcc aagaacaaag     360

ccttatcaga actcgcaggc attcagagaa accttgagac ctacatccaa ctgcgcaacg     420

aatgggagaa cgacatcgag aactccaagg ctcaaggcaa ggtagccaac tattacgaga     480

gtcttgagca ggcggttgag aggagcatgc ctcagtttgc agtggaaaac tttgaggtac     540

cacttttgac tgtctacgtg caagctgcca atcttcactt gctcctcctg agggatgtgt     600

cagtgtatgg caagtgctgg ggttggtcgg agcagaagat caagatctac tacgacaagc     660

agatcaagta cacccatgag tacaccaatc actgtgtcaa ctggtataac aaaggccttg     720

agagactcaa aaacaaaggt tcctcctacc aagactggta caactataat cgcttccgca     780

gagagatgac tcttactgtt ctcgacatcg ttgctctctt cccgcactat gatgtccaga     840

cgtatccgat aaccaccgtt gctcagctaa ccagggaagt gtacacggat ccgctgctta     900

acttcaaccc caaactccac tccgtgtccc aactgcctag cttcagcgac atggagaatg     960

cgaccatccg gactccacat ctgatggagt tcctccggat gctaaccatc tacacagatt    1020

ggtacagtgt gggcaggaac tactactggg gtggacatcg cgtgacgtcc taccatgtag    1080

gtggcgagaa tatacgatca cctctgtatg gtcgggaggc caaccaagag gttcccagag    1140

acttctactt ctatggaccg gtcttcaaga cgctctcaaa gccgactcta agaccactgc    1200

agcagcctgc accagctcct ccgttcaatc tccgtagcct ggagggagtc gagttccaca    1260

ctcccacagg tagcttcatg tatcgcgaga gagggtcggt agattccttc aatgagttgc    1320

cccccttcaa tccagttggg ttacctcaca aggtctacag tcaccgtctg tgtcatgcga    1380

cgtttgttcg caagtctggg accccctatc tcacaacagg agccatcttt tcgtggacac    1440

atcgcagtgc tgaagagacc aacaccatag aatcgaacat cattacgcag atcccgttag    1500

tcaaagcgta tcagattggg tcaggcacta ctgtcaggaa aggcccaggc ttcacaggag    1560

gggacatact tcgaaggaca ggtcctggca cctttggcga catgaggata aacatcaatg    1620

caccactctc tcagaggtac cgtgtcagga ttcgctacgc ctctacgaca gatctccagt    1680

tcgtcacgag catcaatggg accaccatca acattggcaa cttcccgaag acgatcaaca    1740

atctgaacac tctgggttct gagggctacc ggacagtctc gtttagcact cccttcagct    1800

tctcgaatgc acaaagtatc tttcgactgg gcatacaagc gttttctggg gttcaagaag    1860

tgtatgtgga caagattgag tttattccgg ttgaatacca taaggatgaa ctttgataag    1920

gtaccctcga ggagctctcc gaattc                                         1946

Claims (10)

1.对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID NO2所示的第31位-601位氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。

3.对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX，其核苷酸序列编码权利要求1或2所述的杀虫基因蛋白。

4.如权利要求3所述的对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX其具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

5.如权利要求3所述的对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX，其具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。

6.一种表达载体，其含有权利要求3、4、5任一所述的杀虫基因cryX。

7.如权利要求6所述的表述载体，其为pUX，结构如图4中所示。

8.对鳞翅目害虫高毒力的杀虫基因cryX在杀害鳞翅目害虫中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，为将权利要求1或2所述的杀虫基因蛋白CryX制成杀虫剂用于杀害鳞翅目害虫，或者将权利要求5所述的杀虫基因cryX转入植物或微生物中，表达抗鳞翅目害虫的特性。

10.如权利要求9所述的应用，所述植物为玉米。

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