JP2003503060A - ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）由来の殺虫性タンパク質およびその共同作用性複合物 - Google Patents

ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）由来の殺虫性タンパク質およびその共同作用性複合物

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JP2003503060A JP2001506833A JP2001506833A JP2003503060A JP 2003503060 A JP2003503060 A JP 2003503060A JP 2001506833 A JP2001506833 A JP 2001506833A JP 2001506833 A JP2001506833 A JP 2001506833A JP 2003503060 A JP2003503060 A JP 2003503060A
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ワーナー，シモン・アンソニー・ジェイムス
ヴィンセント，ジェイソン・リー
リー，マイケル・デイヴィッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は殺虫性タンパク質、特にペシロマイセスsp、例えばペシロマイセス・ファリノサスから得られるタンパク質に関する。好ましい態様では、本発明はSEQ ID NO.1のアミノ酸配列を有する殺虫性タンパク質を提供する。また本発明は、本発明にかかる第１の殺虫性タンパク質を更なるタンパク質と組み合わせて含有する殺虫性共同作用性タンパク質複合物を提供する。好ましくは、更なるタンパク質は殺虫性結晶エンドトキシン（CRY）タンパク質である。また、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびタンパク質またはタンパク質複合物を生成する能力のある植物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は特に、殺虫性タンパク質およびその共同作用性複合物、タンパク質を
コードするDNA配列、および該タンパク質および複合物を含有する植物を生成す
る方法に関する。特に本発明は真菌ペシロマイセスsppから得られる殺虫性ペプ
チドに関する。
【０００２】 多くの真菌は昆虫に対して病原性があり、周知のようにペシロマイセス・フモ
ソロセウス（fumosoroseus）は生物学的防除物質として使用でき、この株は温室
で使用するためのバイオ防除物質として市販されている。しかしながら、現在の
ところペシロマイセスspp由来の殺虫性ペプチドの単離および同定はされていな
い。
【０００３】 ペシロマイセスspp、例えばペシロマイセス・ファリノサスから抽出された殺
虫性ペプチドが新しい型の経口活性のある有効な殺虫性ペプチドを提供すること
が思いがけなく発見された。驚くべきことに、これらのタンパク質は更なるタン
パク質（特にCRYおよびVIPタンパク質）と共に相乗的に作用する能力も有する。
【０００４】 本発明によれば、配列Ｘ1Ｘ2ＩＣＴＰＡＧＶＫＣＰＡＡＬＰＣＣＰＧＬＲＣＩ
ＧＧＶＮＮＫＶＣＲ（SEQ ID NO.1）（式中、Ｘ1およびＸ2はいずれかのアミノ
酸である）を含む殺虫性タンパク質を提供する。本発明の更なる態様では、Ｘ1
およびＸ2位のアミノ酸は以下からなる群から選択される：グリシン；リジン；
セリン；チロシン；アラニン；メチオニン；スレオニン；グルタミン酸；アスパ
ラギン酸；アスパラギン；およびバリン。本発明の更なる態様では、Ｘ1および
Ｘ2位のアミノ酸はそれぞれセリンおよびチロシンである。本発明の更なる態様
では、Ｘ1位のアミノ酸はグルタミンである。本発明の更なる態様では、殺虫性
タンパク質は配列：ＧＫＩＣＴＰＡＧＶＫＣＰＡＡＬＰＣＣＰＧＬＲＣＩＧＧＶ
ＮＮＫＶＣＲ（SEQ ID NO.2）を含有する。本発明は更に以下の配列を含有する
殺虫性タンパク質を提供する：Ｘ1Ｘ2ＧＫＩＣＴＰＡＧＶＫＣＰＡＡＬＰＣＣＰ
ＧＬＲＣＩＧＧＶＮＮＫＶＣＲ（SEQ ID NO.3）（式中、Ｘ1およびＸ2はいずれ
かのアミノ酸であり、好ましくはアミノ酸は以下：グリシン；リジン；セリン；
チロシン；アラニン；メチオニン；スレオニン；グルタミン酸；アスパラギン酸
；アスパラギン；およびバリンからなる群から選択され、更に好ましくはＸ1お
よびＸ2はそれぞれセリンおよびチロシンである）。
【０００５】 本発明は更に、SEQ ID NO.1から3のタンパク質のいずれかと少なくとも55%の
同一性を有する殺虫性タンパク質を提供する。本発明の更なる態様では、殺虫性
タンパク質はSEQ ID NO.1から3のタンパク質のいずれかと少なくとも60%の同一
性を有する。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1から3の
タンパク質のいずれかと少なくとも65%の同一性を有する。本発明の更なる態様
では、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1から3のタンパク質のいずれかと少なくと
も70%の同一性を有する。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク質はSEQ ID
NO.1から3のタンパク質のいずれかと少なくとも75%の同一性を有する。本発明の
更なる態様では、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1から3のタンパク質のいずれか
と少なくとも80%の同一性を有する。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク
質はSEQ ID NO.1から3のタンパク質のいずれかと少なくとも85%の同一性を有す
る。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1から3のタンパク
質のいずれかと少なくとも90%の同一性を有する。本発明の更なる態様では、殺
虫性タンパク質はSEQ ID NO.1から3のタンパク質のいずれかと少なくとも91%の
同一性を有する。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1か
ら3のタンパク質のいずれかと少なくとも92%の同一性を有する。本発明の更なる
態様では、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1から3のタンパク質のいずれかと少な
くとも93%の同一性を有する。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク質はSEQ
ID NO.1から3のタンパク質のいずれかと少なくとも94%の同一性を有する。本発
明の更なる態様では、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1から3のタンパク質のいず
れかと少なくとも95%の同一性を有する。本発明の更なる態様では、殺虫性タン
パク質はSEQ ID NO.1から3のタンパク質のいずれかと少なくとも96%の同一性を
有する。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1から3のタン
パク質のいずれかと少なくとも97%の同一性を有する。本発明の更なる態様では
、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1から3のタンパク質のいずれかと少なくとも98
%の同一性を有する。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.1
から3のタンパク質のいずれかと少なくとも99%の同一性を有する。好ましくは、
本発明にかかる殺虫性タンパク質は-ＬＰＣＣＰＧ-および／または-ＩＣＴＰＡ-
のモチーフ（それぞれSEQ ID NO.64および65）を含有する。タンパク質の配列同
一性の百分率は、最適にアラインした2つの配列を比較ウィンドーにわたって比
較することによって決定するが、ここで、比較ウィンドー内のアミノ酸配列部分
は、2つの配列の最適なアラインメントについて最初の参照配列（添加または欠
失を含まない）に比較して添加または欠失（すなわちギャップ）を含有しうる。
百分率の計算を行うには、同一のアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置を計
数して一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較ウィンドーの位置の総
数で割り、その結果に100をかけて配列の同一性の百分率を求める。配列同一性
の百分率を計算する際、ギャップに関しては計15以下のアミノ酸残基であるとい
う条件で、3ギャップまでを考慮に入れて配列をアラインしてもよい。また、比
較のための最適な配列のアラインメントは既知のアルゴリズムをコンピューター
で実施して行ってもよい。本発明の特定の態様では、配列同一性をFASTAバージ
ョン3アルゴリズムを使用して計算するが、これはピアソンおよびリップマンの
方法（Lipman, D.J.およびPearson, W.R.(1985) 迅速かつ高感度のタンパク質類
似性の調査および科学（Rapid and sensitive protein similarity searches an
d Science） 227:1435-1441；およびPearson, W.R.およびLipman, D.J.(1988)
生物学的配列比較のための改良法（Improved tools for biological sequence c
omparison）PNAS 85:2444-2448）を使用して参照配列（問題の（query）配列と
もいう）およびいずれかの群の配列（更なる配列ともいう）間の類似性を調査す
るものである。また方法は、ポリヌクレオチド配列間の配列同一性の百分率の計
算を可能にする分野に存する。
【０００６】 タンパク質は保存的な、または非保存的なアミノ酸置換によって基本の殺虫性
タンパク質配列（例えばSEQ ID NO.1）と異なってもよい。保存的置換は、広義
に類似する化学的性質を有するアミノ酸で置換されることを意味するものと理解
されるべきである。特に保存的置換は以下の群内のアミノ酸間で行われてもよい
： （i）アラニンおよびグリシン； （ii）セリンおよびスレオニン； （ii）グルタミン酸およびアスパラギン酸； （iii）アルギニンおよびリジン； （iv）アスパラギンおよびグルタミン （v）イソロイシンおよびロイシン； （vi）バリンおよびメチオニン； （vii）フェニルアラニンおよびトリプトファン。
【０００７】 一般に、非保存的置換より保存的置換の方がタンパク質の殺虫性を損なわずに
可能である。本発明にかかる好適な変異タンパク質は、当業者に周知の慣例的な
方法を使用してタンパク質の殺虫性を試験することによって確認してもよい。そ
のような変異タンパク質は標準的な技術を使用して化学的に合成してもよい。
【０００８】 本発明は更に、Ｘ1位のアミノ酸が修飾された上記の殺虫性タンパク質を提供
する。本発明の更なる態様では、Ｘ1位のアミノ酸がアセチル化される。本発明
の更なる態様では、Ｘ1位のアミノ酸がＮ-末端にある。本発明の更なる態様では
、殺虫性タンパク質のN-末端領域は配列Ｘ1Ｘ2ＩＣＴ-（式中、Ｘ1およびＸ2は
いずれかのアミノ酸である）を含有する。
【０００９】 本発明は更に、殺虫性タンパク質を未修飾型でコードするポリヌクレオチドを
提供する。 本発明は更に以下のようなものの相補体であるポリヌクレオチド配列を提供す
る：約65℃の温度で6xSSC、0.01% SDS、および0.25% スキムミルク粉末を含有す
る溶液中で上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、次いで同じ温度で0.2x
SSCおよび0.1% SDSを含有する溶液中で洗浄するもので、該ポリヌクレオチド配
列はなお殺虫性タンパク質をコードする。本発明の更なる態様では、ポリヌクレ
オチド配列はSEQ ID NO.4から14の配列を含有する。
【００１０】 本発明にかかる更なるポリヌクレオチド配列は真菌DNAライブラリーから同定
してもよい。好適なオリゴヌクレオチド・プローブを本発明にかかるタンパク質
のアミノ酸配列に基づいて構築し、これを使用して本発明にかかるタンパク質を
コードする更なるポリヌクレオチドの同定のためにそのようなDNAライブラリー
をスクリーニングしてもよい。本発明の更なる態様では、当業者がSEQ ID NO.1
から3のアミノ酸配列を使用してオリゴヌクレオチド・プローブを構築してもよ
い。本発明の更なる態様では、SEQ ID NO.4から14の配列をオリゴヌクレオチド
・プローブの構築に使用してもよい。本発明の更なる態様では、DNAライブラリ
ーはペシロマイセスspp DNAライブラリーである。当業者はDNAライブラリーの生
成およびスクリーニングの方法、そしてそれに続く本発明にかかる更なる殺虫性
タンパク質をコードするポリヌクレオチドの同定、単離、および配列決定に必要
な技術に精通している。当業者に評価されるように、他のソース、好ましくはペ
シロマイセス属の他のメンバーから関連する殺虫性配列を同定およびキャラクタ
ライズするための別の方法が存在する。そのような方法には、ここに提供する配
列情報を使用する、または上記の方法で得られる配列からの、オリゴヌクレオチ
ド・プライマーに基づくPCR法がある。
【００１１】 本発明の更なる観点では、上記のタンパク質である第１のタンパク質および少
なくとも1つの更なるタンパク質を含む殺虫性共同作用性複合物を提供する。本
発明の更なる態様では、更なるタンパク質は殺虫性CRYタンパク質である。“CRY
タンパク質”という用語は、鱗翅類（Lepidoptera）、甲虫類（Coleoptera）、
および双翅類（Diptera）を含む昆虫に対して活性を有する結晶エンドトキシン
タンパク質（および分泌CRY）および植物性殺虫性タンパク質（および分泌VIP）
を含む。そのようタンパク質は、特に細菌バシラス・スリンジエンシス（Bacill
us thuringienesis）から得ることができ、また当業者に周知である。本発明に
従って使用してもよい特に好ましいCRYタンパク質にはバシラス・スリンジエン
シスの変種、テネブリオニス（tenebrionis）から得られるタンパク質があり、
これはドイツ微生物コレクション（German Collection of micro-organisms；De
utsche Sammulung von Microorganism）において参照番号DSM 2803または株JHCC
4835およびJHCC 4353として、また国立産業細菌および海洋細菌コレクション（
National Collections of Industrial and Marine Bacteria；Aberdeen）におい
て承認番号NCIMB 40091および40090としてそれぞれ保管されている。本発明の更
なる態様では、該更なるタンパク質はSEQ ID NO.54-59からなる群から選択され
る配列を含む。
【００１２】 本発明は更に、上記の第１のタンパク質および更なるタンパク質をコードする
領域を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明の更なる態様では、ポリヌクレ
オチドはSEQ ID NO.2の配列を含む第１のタンパク質をコードする領域を含む。
本発明の更なる態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO.4-14の群から選択され
る配列を含む領域を含む。本発明の殺虫性タンパク質またはタンパク質複合物は
当業者に明らかな多くの方法で調製してもよい。例えば、標準的なペプチド合成
装置を使用する化学合成によって、または組み換えDNA技術を使用して好適な生
体、例えば植物および微生物（例えばE. coli、サッカロミセス・セレビジエ（S
accharomyces cerevisiae）、またはピチア・パストリス（Pichia pastoris））
においてタンパク質／複合物を発現させる。
【００１３】 本発明の更なる観点では、殺虫性を有するタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドを進化（evolve）させる方法を提供し、これは以下を含む：（a）該ポリ
ヌクレオチドの変異体集団、および更なるタンパク質をコードする更なるポリヌ
クレオチドを提供し（これらのうち少なくとも１つは細胞を含まない形態である
）；（b）該変異体および更なるポリヌクレオチドを混合して組み換えポリヌク
レオチドを生成し；（c）該殺虫性を有するタンパク質をコードするように進化
した組み換えポリヌクレオチドを選択またはスクリーニングし；そして（d）段
階（c）の組み換えポリヌクレオチドを用いて段階（b）および（c）を、殺虫性
を有するタンパク質をコードする進化したポリヌクレオチドが得られるまで反復
し、ここでパート（a）の該変異体集団は上記のタンパク質をコードするポリヌ
クレオチドを少なくとも１つ含有する。本発明の更なる態様では、進化したポリ
ヌクレオチドは適用される環境での使用に好ましい特性を有する殺虫性タンパク
質をコードする。例えば特定の収穫植物における向上された活性または有効性で
ある。
【００１４】 本発明は更に、パート（a）の該変異体集団がSEQ ID NO.1から3のタンパク質
をコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有し、そしてパート（a）の
該更なるポリヌクレオチドがCRYタンパク質をコードする、上記のような方法を
提供する。上記のポリヌクレオチドを進化させるための方法は当業者に周知であ
り、特に米国特許第5,811,238号に記載されている。
【００１５】 本発明は更に、上記の方法で得ることができる、または得たポリヌクレオチド
、およびそれらのポリヌクレオチドのいずれかにコードされるタンパク質を提供
する。
【００１６】 本発明は更に、転写終結領域に機能的に結合する上記のタンパク質をコードす
るポリヌクレオチドに機能的に結合する植物作用性プロモーターを配列中に含有
するDNAコンストラクトを提供する。本発明の更なる態様では、DNAコンストラク
トはタンパク質産物（単数または複数）を特定の位置（単数または複数）にター
ゲッティングするための領域または複数の領域を更に含む。例えば、タンパク質
を細胞の外部に提供することが所望される場合、細胞外標的配列を本発明のタン
パク質をコードするポリヌクレオチドにライゲートしてもよい。ターゲッティン
グの他の例には特定の細胞内オルガネラまたはコンパートメント（例えば葉緑体
、他の色素体のいずれか、小胞体、ペルオキシソーム、oil body、ミトコンドリ
ア、または液胞）へのターゲッティングがある。当業者は多くのタンパク質ター
ゲッティング配列を入手でき、これらの配列のいずれかを使用して（i）本発明
にかかるタンパク質そのものおよび／または（ii）更なるタンパク質を、好まし
くは実質的に同じ位置に、提供してもよい。本発明の更なる態様では、標的配列
はSEQ ID NO.15-19の群から選択される配列またはSEQ ID NO.20-24の群から選択
されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。ターゲッティング・ポ
リヌクレオチド配列は本発明のタンパク質または複合物をコードするポリヌクレ
オチドの5'および／または3'に位置してもよい。
【００１７】 本発明は更に、選択可能なマーカーとして作用するタンパク質を生成するため
の領域を更に含む上記のDNAコンストラクトを提供する。特に、選択可能なマー
カーはカナマイシン、ヒグロマイシン、またはゲンタマイシンに対する耐性を施
与してもよい。更なる好適な選択可能なマーカーは、除草剤（例えばグリホサー
トに基づく除草剤）に対する耐性または毒物（例えばeutypine）に対する耐性を
施与する遺伝子を含む。また、他の型の選択、例えばホルモンに基づく選択系（
例えばHiroyrasu Ebinumaら（1997, PNAS Vol.94 pp2117-2121）のマルチ・オー
ト・トランスフォーメーション（MAT系）；既知の緑色蛍光タンパク質、βクル
コロニダーゼを使用する目視選択系、および他の選択系（例えばマンノース・イ
ソメラーゼ、キシロース・イソメラーゼ、および2-デオキシグルコース（2-DOG
））も使用できる。
【００１８】 本発明は更に、植物作用性プロモーターが以下からなる群から選択される上記
のDNAコンストラクトを提供する：アグロバクテリウム・リゾジンRoID；ジャガ
イモ・プロテアーゼ阻害剤II；CaMV35S；FMV35S；NOS；OCS；パタチン；E9；alc
A/alcRスイッチ；GSTスイッチ；RMSスイッチ；オレオシン；リブロース・ビスリ
ン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼ小サブユニット・プロモーターおよび他
の根部特異的プロモーター（MR7プロモーター（トウモロコシ）；Gos9（コメ）
およびGOS2プロモーターを含む）。本発明にかかるコンストラクトに使用できる
ターミネーターにはNos、プロテアーゼ阻害剤II、およびアルファ・チューブリ
ンの遺伝子のターミネーター（EP-A 652,286）がある。同様にプロモーター調節
配列と共に使用できるものは、転写または翻訳エンハンサーのような、プロモー
ターおよび本発明にかかるタンパク質をコードする配列間に位置する他の調節配
列、例えば国際特許WO87/07644号に記載されるタバコ・エッチウィルス（TEV）
翻訳活性化物質である。本発明にかかる殺虫性タンパク質または複合物をコード
するポリヌクレオチドは、植物体に取り込まれると、コドン最適化するか、また
は例えば転写を促進するように変更してもよい。綿およびトウモロコシ植物から
の好ましいコドンの使用法を以下の表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】 また、そのようなコドンの最適化を使用して、形質転換した細胞で生成される
RNA転写産物の予測される２次構造を変更する、または未変更の転写産物に存在
する潜在的RNA不安定性要素を破壊し、それによって形質転換した細胞における
転写産物の安定性および／または利用能を向上してもよい（AblerおよびGreen,
1996, Plant Molecular Biology (32) pp63-78）。本発明にかかるタンパク質お
よび／または複合物の発現は、１つ以上のイントロン配列を該タンパク質および
／または複合物をコードするポリヌクレオチド内に含有させることによって向上
してもよい（RoseおよびBeliakoff, 2000, Plant Physiology (122) pp535-542
）。そのような配列の例はジャガイモ（Solanum tuberosum）LS1遺伝子の第２イ
ントロンおよび単子葉植物種のアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（adh1）イ
ントロンである。また、葉緑体発現法（McBrideら, 1995, Biotechnolory (13)
pp362-365）を使用して本発明にかかるタンパク質および／または複合物の発現
を促進してもよい。この方法は当業者に周知であり、基本的に、機能性葉緑体活
性化プロモーターまたはプロモーター／エンハンサー複合物の制御下での葉緑体
ゲノムとポリヌクレオチドとの形質転換を含む。
【００２１】 本発明の更なる観点では、殺虫性タンパク質または殺虫性タンパク質の共同作
用性複合物を有する植物または植物部分を提供する方法を提供し、これは以下を
含む：（a）上記のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくは上記の
第１および更なるタンパク質をコードする領域を含むポリヌクレオチド、もしく
は上記のDNAコンストラクトを植物試料のゲノムに挿入し；または（a）更なるタ
ンパク質を生成する能力のある植物試料のゲノムに上記の第１のタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドを挿入し；または（a）上記の第１のタンパク質を生
成する能力のある植物試料のゲノムに更なるタンパク質を提供するポリヌクレオ
チドを挿入し；そして（b）該試料から植物もしくは植物部分を再生させ；そし
て（c）該タンパク質または複合物を有する植物または植物部分を選択する。ポ
リヌクレオチド／DNAコンストラクトは当業者に周知の植物形質転換技術によっ
て細胞に導入してもよい。そのような技術には、それに制限される訳ではないが
、以下がある：微粒子介在型生物学的（biolistic）形質転換、アグロバクテリ
ウム介在型形質転換、プロトプラスト形質転換（必要により、ポリエチレングリ
コールの存在下で）；ポリヌクレオチドまたはベクターを含有する媒質内での植
物組織、細胞またはプロトプラストの超音波処理；ポリヌクレオチドまたはベク
ターの全能性（totipotent）植物試料へのマイクロ挿入（必要により、既知の炭
化シリコン“ウィスカー（whiskers）”技術を使用する）、エレクトロポレーシ
ョンなど。
【００２２】 本発明は更に、殺虫性タンパク質の共同作用性複合物を有する植物を提供する
方法を提供するが、この方法は、上記の第１のタンパク質を生成する能力のある
第１の植物を更なるタンパク質を生成する能力のある第２の植物と交配させ、得
られる植物で該複合物を生成する能力のあるものを選択することを含む。
【００２３】 本発明は更に上記の方法に従って得られる植物または植物部分を提供する。 本発明は更に、該タンパク質または該複合物の第１のタンパク質が翻訳後に修
飾される、上記の植物または植物部分を提供する。本発明の更なる態様では、該
タンパク質または該複合物の第１のタンパク質をアセチル化する。本発明の更な
る態様では、該タンパク質または第１のタンパク質をN-末端で修飾／アセチル化
する。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク質／第１のタンパク質のN-末端
領域は配列Ｘ1Ｘ2ＩＣＴ-（式中、Ｘ1およびＸ2はいずれかのアミノ酸である）
を含有する。本発明の更なる態様では、Ｘ1およびＸ2は以下からなる群から選択
される：グリシン；リジン；セリン；チロシン；アラニン；メチオニン；スレオ
ニン；グルタミン酸；アスパラギン酸；アスパラギン；およびバリン。本発明の
更なる態様では、Ｘ1およびＸ2位のアミノ酸はそれぞれセリンおよびチロシンで
ある。本発明の更なる態様では、Ｘ1位のアミノ酸はグルタミンである。
【００２４】 本発明は更に、以下からなる群から選択される上記の植物または植物部分を提
供する：メロン、マンゴー、大豆、綿、タバコ、テンサイ、セイヨウアブラナ、
キャノーラ、亜麻、ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、レタス、
トウモロコシ、小麦、モロコシ、ライ麦、バナナ、大麦、エン麦、芝、まぐさ、
サトウキビ、エンドウ豆、収穫豆（field bean）、米、松、ポプラ、リンゴ、モ
モ、ブドウ、イチゴ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ、柑橘類、穀物、
ナッツ植物、または他の園芸作物。本発明にかかる植物または植物部分は、対照
様の植物または野生型植物に比較して害虫となる昆虫に対して高い耐性または高
い許容性を示す。耐性は、害虫に対する許容性のわずかな上昇から、完全な耐性
まで様々であり、これによって植物は害虫の存在による影響を受けない（害虫は
激しく阻害または殺虫される）。
【００２５】 本発明は更に、植物または植物部分に更なる所望の農業経済的特性を施与する
、以下を含む方法を提供する：（a）植物試料のゲノムに所望の農業経済的特性
を提供するポリヌクレオチドを挿入し；そして（b）該試料から植物または植物
部分を再生させ；（c）該所望の農業経済的特性を有する植物または植物部分を
選択する（ここで該植物試料は上記の殺虫性タンパク質または殺虫性タンパク質
複合物を生成する能力がある）；または上記の殺虫性タンパク質または殺虫性タ
ンパク質複合物を生成する能力のある第１の植物を、該所望の農業経済的特性を
提供する第２の植物と交配させ、得られる植物で更なる農業経済的特性を生ずる
能力のあるものを選択する。本発明の更なる態様では、該更なる所望の農業経済
的特性は除草剤耐性；昆虫耐性；線虫耐性；ストレス耐性；変更された収量；変
更された栄養価；または他の所望の農業経済的特性からなる群から選択される。
本発明の更なる態様では、更なる農業経済的特性はグリホサート酸（glyphosate
acid）および農業的に許容しうるその塩を含む除草剤に対する耐性である。
【００２６】 本発明は更に、上の節の方法に従って得た植物または植物部分を提供する。 本発明の更なる観点では、以下の配列を含む殺虫性タンパク質を提供する：-
Ｘ1-Ｘ2-Ｘ3-Cys4-Ｘ5-Ｘ6-Ｘ7-Ｘ8-Ｘ9-Ｘ10-Cys11-Ｘ12-Ｘ13-Ｘ14-Ｘ15-Ｘ16 -Cys17-Cys18-Ｘ19-Ｘ20-Ｘ21-Ｘ22-Cys23-Ｘ24-Ｘ25-Ｘ26-Ｘ27-Ｘ28-Ｘ29-Ｘ3 0 -Ｘ31-Cys32-Ｘ33-（SEQ ID NO.60）（式中、Ｘ1-3、5-10、12-16、19-22、24- 31 および33はいずれかのアミノ酸である）。本発明の更なる態様では、殺虫性タ
ンパク質はSEQ ID NO.60の配列を含み、Ｘは、14および15位のアミノ酸がシステ
インではないという条件でいずれかのアミノ酸である。本発明の更なる態様では
、殺虫性タンパク質はSEQ ID NO.60の配列を含み、ここでＸはシステイン以外の
アミノ酸のいずれかである。この場合、特にSEQ ID NO.1-3および50の殺虫性ペ
プチド、そしてSEQ ID NO.4-14にコードされるタンパク質は６個のシステイン残
基を含み、その全てが３つの分子間ジスルフィド結合に関係すると信じられる。
従ってシステイン残基の配置はペプチドに殺虫活性を与えるのに重要でありうる
。本発明の更なる態様では、Ｘ1位のアミノ酸は翻訳後に修飾される。本発明の
更なる態様では、Ｘ1位の該アミノ酸はアセチル化される。本発明の更なる態様
では、Ｘ1位の該アミノ酸はN-末端である。本発明の更なる態様では、殺虫性タ
ンパク質のN-末端領域は配列Ｘ1Ｘ2ＩＣＴ-（式中、Ｘ1およびＸ2はいずれかの
アミノ酸である）を含む。本発明の更なる態様では、Ｘ1およびＸ2は以下からな
る群から選択される：グリシン；リジン；セリン；チロシン；アラニン；メチオ
ニン；スレオニン；グルタミン酸；アスパラギン酸；アスパラギン；およびバリ
ン。本発明の更なる態様では、Ｘ1位のアミノ酸はグリシンである。本発明の更
なる態様では、Ｘ1およびＸ2位のアミノ酸はそれぞれセリンおよびチロシンであ
る。本発明の更なる態様では、Ｘ1位のアミノ酸はグルタミンである。
【００２７】 本発明は更に、FASTAバージョン３を使用してSEQ ID NO.1と比較した場合、FA
STA optスコアが109より高い殺虫性タンパク質を提供する。本発明の更なる態様
では、FASTAバージョン３を使用してSEQ ID NO.1と比較した場合、殺虫性タンパ
ク質はFASTA optスコアが110より高い。本発明の更なる態様では、FASTAバージ
ョン３を使用してSEQ ID NO.1と比較した場合、殺虫性タンパク質はFASTA optス
コアが115より高い。本発明の更なる態様では、FASTAバージョン３を使用してSE
Q ID NO.1と比較した場合、殺虫性タンパク質はFASTA optスコアが117より高い
。本発明の更なる態様では、FASTAバージョン３を使用してSEQ ID NO.1と比較し
た場合、殺虫性タンパク質はFASTA optスコアが119より高い。本発明の更なる態
様では、FASTAバージョン３を使用してSEQ ID NO.1と比較した場合、殺虫性タン
パク質はFASTA optスコアが120より高い。本発明の更なる態様では、FASTAバー
ジョン３を使用してSEQ ID NO.1と比較した場合、殺虫性タンパク質はFASTA opt
スコアが130より高い。本発明の更なる態様では、FASTAバージョン３を使用して
SEQ ID NO.1と比較した場合、殺虫性タンパク質はFASTA optスコアが140より高
い。本発明の更なる態様では、FASTAバージョン３を使用してSEQ ID NO.1と比較
した場合、殺虫性タンパク質はFASTA optスコアが150より高い。FASTA optスコ
アは上記のFASTAアルゴリズムを使用して計算してもよい。初期のスコアを計算
した後、スミス-ウォーターマン・アルゴリズムを使用して問題の配列と更なる
配列間の類似性の最も良好なセグメントを決定する（Smith, T.F.およびWaterma
n, M.S.(1981) 生物配列の比較（Comparison of biosequences.）Adv. Appl. Ma
th. 2:482-489）。計算結果はoptスコアとして表わされるが、この手順は当業者
に周知である。
【００２８】 本発明は更にペシロマイセスspから得られる、あるいは得た殺虫性タンパク質
を提供する。本発明の更なる態様では、殺虫性タンパク質をペシロマイセス・フ
ァリノサスから得る。
【００２９】 本発明は更に、昆虫が食する部位に上記のタンパク質またはタンパク質複合物
を提供することを含む、昆虫の制御方法を提供する。 本発明は更に、上記の殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは
上記のDNAコンストラクトの、昆虫に耐性のある植物または植物部分を生成する
方法への使用法も提供する。本発明の更なる態様では、ポリヌクレオチドはSEQ
ID NO.4-14の群から選択される配列を含む。
【００３０】 本発明は更に、上記のタンパク質またはタンパク質複合物の、殺虫剤の活性成
分としての使用法も提供する。 本発明は更に、ペシロマイセスSp.の、活性成分として上記のタンパク質を含
有する殺虫剤の調製への使用法を提供する。本発明の更なる態様では、該ペシロ
マイセスSp.は上記のタンパク質の生成を増加させるように修飾されている。当
業者は当該分野で周知の技術を使用して該ペシロマイセスSp.を修飾し、未修飾
の対照様ペシロマイセスSp.に比較して高いレベルで殺虫性タンパク質を生成す
る能力を有するようにすることができる。例えば、上記の殺虫性タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドに結合するプロモーター要素を修飾してタンパク質生
成を増加させることによる。これに加えて、または、これとは別に、上記のタン
パク質をコードする遺伝子の第２のコピーを選択したペシロマイセスSp.に挿入
することによる。本発明にかかる殺虫性タンパク質の生成を、当業者に周知の標
準的な系統改良（standard strain improvement）プログラムによって増加させ
てもよい。
【００３１】 本発明は更に、上記のタンパク質またはタンパク質複合物を生成するための組
み換え微生物を提供する。本発明の更なる態様では、微生物は内部寄生性植物で
ある。内部寄生性植物は一般に当該分野では、植物ホストと非病原性内部共生関
係を持つ能力を有する微生物として受け入れられている。内部寄生性植物によっ
て増強される植物の保護の方法はCrop Genetics International Corporationに
よる一連の特許出願に記載されている（例えば国際特許WO90/13224号、ヨーロッ
パ特許EP-125468-B1号、国際特許WO91/10363号、国際特許WO87/03303号）。国際
特許WO94/16076（ZENECA社）は、植物由来の殺虫性ペプチドを発現するように遺
伝子的に修飾した内部寄生性植物の使用について記載している。
【００３２】 本発明は更に、上記のタンパク質またはタンパク質複合物を含有する組み換え
バキュロウィルスを提供する。本発明は更に、前文のバキュロウィルスを、昆虫
を制御する方法に使する方法を提供する。
【００３３】 本発明の更なる観点によれば、SEQ ID NO.1-3の群から選択されるタンパク質
に対して産生させたモノクローナル抗体と反応する能力のある殺虫性タンパク質
を提供する。本発明は更に、SEQ ID NO.1-3の群から選択されるタンパク質に対
して産生させたポリクローナル抗体と反応する能力のある殺虫性タンパク質を提
供する。そのような抗体を当該分野で周知の技術を使用して本発明の範囲内の他
のタンパク質の生成および同定に使用してもよい。
【００３４】 本発明は更に、殺虫的有効量の上記タンパク質またはタンパク質複合物、およ
び必要により農業的に許容しうるキャリアーおよび／または希釈剤および／また
は昆虫誘引物質を含有する組成物を提供する。組成物は、標準的な農業技術（例
えばスプレー）を使用して昆虫またはそれが生息する環境、特に植物部分もしく
は周囲の土壌に適用してもよい。本発明にかかる殺虫性タンパク質および複合物
は、他の農薬、例えば除草剤、防かび剤、および他の殺虫性化合物（他の殺虫性
タンパク質を含む）と合わせて適用してもよい。可能な混合パートナーの例には
殺虫性レクチン、殺虫性プロテアーゼ阻害剤、およびバチルス・スリンジエンシ
ス（Bacillus thrigiensis）、ゼノラブダス・ネマトフィルス（Xenorhadus nem
atophilus）、またはフォトラブダス・ルミネセンス（Photorabdus luminescens
）の種から誘導される殺虫性タンパク質、および他の化学物質、例えばピレスロ
イド、カルバメート、イミダクロプリド、有機塩素剤、高分子化合物（例えばア
バメクチン（abamectin）またはエマメクチン（emamectin））がある。
【００３５】 本発明は更に、上記のタンパク質をコードする第１の領域および更なるタンパ
ク質をコードする第２の領域を有するポリヌクレオチドを提供する。領域はタン
パク質を分離する能力のある自己プロセシング（self processing）ポリペプチ
ド（例えば米国特許第5,846,767号に記載される自己プロセシング・ポリペプチ
ド）を提供する領域または他の類似の機能要素によって分離されてもよい。ある
いはまた、領域はタンパク質配列を分離する能力のある外部要素の標的部位とし
て作用する配列によって分離されてもよい。あるいはまた、ポリヌクレオチドは
複数のタンパク質機能を含むポリタンパク質を提供してもよい。本発明の更なる
態様では、ポリタンパク質はタンデムに配置されてもよい。本発明の更なる態様
では、ポリタンパク質はリンカー配列によって分離される複数のタンパク質機能
を含有する。そのようなポリタンパク質は本発明にかかるタンパク質および／ま
たは更なるタンパク質、そして必要により所望の農業経済的特性をコードするも
ののような更なるタンパク質を含有してもよい。
【００３６】 本発明は更に、上記のタンパク質もしくはタンパク質複合物、または上記の殺
虫性タンパク質および／もしくは殺虫性タンパク質複合物をコードするポリヌク
レオチドを含む植物細胞を提供する。
【００３７】 本発明は更に、-LPCCPG-（SEQ ID NO.63）および／または-ICTPA-（SEQ ID NO
.64）のモチーフを含む殺虫性タンパク質を提供する。 本発明のタンパク質によって制御される昆虫には植物咀嚼昆虫、および例えば
幼虫のような植物咀嚼段階の昆虫があり、以下があり：甲虫類、鱗翅類、直翅類
、およびショウジョウバエ属、またこれには、限定される訳ではないが以下があ
る：Acanthoscelides obtectus、Bruchus sps、アズキゾウムシ（Callosobruchu
s）sps（マメゾウムシ科につく甲虫類）、Agriotes sps（根切り虫の類）、Amph
imallon sps（コガネムシ科の甲虫類）、メキシコワタミゾウムシ（Anthonomus
grandis）（綿丸莢につくコクゾウムシ）、Ceutorhynchus assimilis（キャベツ
種子につくコクゾウムシ）、Cylas sps.（サツマイモにつくコクゾウムシ）、Di
abrotica sps.（トウモロコシの根につく虫）、Epicauta sps.（黒色のハンミョ
ウ類昆虫）、Epilachna sps.（メロンにつく昆虫など）、Leptinotarsa decemli
neata（コロラドハムシ）、Meligisthes sps.（花につく甲虫）、Melolontha sp
s.（コフキコガネ）、Phyleotreta sps.、Psylliodes sps.（ノミ）、Popillia
japonica（マメコガネ）、Scolytus sps.（キクイムシ）、シトフィルス属（Sit
ophilus）sps.（穀物につくコクゾウムシ）、Tenebrio molitor（ゴミムシダマ
シ）、Tribolium sps.（小麦粉につく甲虫）、Trogoderma granarium（貯蔵穀物
の害虫；Khapra beetle）、Acleris sps.（果樹のハマキガ）、Acreaea acerata
（サツマイモにつくチョウ）、Agrotis sps.（根切り虫）、Autographa gamma（
silver-Yガ）、ニカメイガ（Chilo sps.）（茎につく穿孔虫）、Cydia pomonell
a（codling moth）、Diparopsis sps.（red bollworms）、Ephestia sps.（ware
house moths）、Heliothis sps.、Helicoverpa sps.（budworm、bollworms）、M
amestra brassicae（キャベツにつくガ）、Manduca sps.（ススメガの幼虫）、M
aruca testulalis（mung moth）、Mythimna sps.（穀物につくアワヨトウの幼虫
）、Ostrinia nubilalis（トウモロコシにつくアワノメイガ）、Pectinophora g
ossypiella（ワタキバガの幼虫）、Phthorimaea operculella（ジャガイモの塊
茎につくガ）、Pieris brassicae（Large white butterfly）、モンシロチョウ
（Pieris rapae）（small white butterfly）、Plodia interpunctella（Indian
grain moth）、Plutella xylostella（コナガ）、Sitatroga cerealella（Ango
umois grain moth）、Spodoptera sps.（アワヨトウの幼虫）、Trichoplusia ni
（キャベツにつくsemilooper）、Acheta sps.（field crickets）、Gryllotalp
sps.（ケラ）、Locusta migratoria（移動性のイナゴ）、Schistocerca gregari
a（砂漠のイナゴ）、Acrythosiphon pisum、およびショウジョウバエ（Drosophi
ls）sp.。
【００３８】 ここで、以下の非制限的な実施例と以下の図および配列リストを合わせて本発
明について記載する。 SEQ ID NO.1-3：ペシロマイセスsppから得られる殺虫性タンパク質。“R52444
5タンパク質”および“445タンパク質”ともいう。
【００３９】 SEQ ID NO.4-6：殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。 SEQ ID NO.7-8：殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド-コドンを最
適化。SEQ ID NO.7では、シグナルペプチドは1-72位に存在し、成熟タンパク質
コード配列は73-174である（停止を含む）。SEQ ID NO.8では、シグナルペプチ
ドは1-72位に存在し、成熟タンパク質コード配列は73-174である（停止を含む）
。
【００４０】 SEQ ID NO.9-10：殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（イントロ
ン配列を含む）。SEQ ID NO.9では、シグナルペプチドは1-68位に存在し、イン
トロン配列は99-288である。SEQ ID NO.10は成熟タンパク質のN-末端に２個の更
なるアミノ酸、セリンおよびチロシンを有する。シグナルペプチドは1-72位に存
在し、SerおよびTyrはヌクレオチド73-78にコードされ、そしてイントロン配列
は106-294である。
【００４１】 SEQ ID NO.11：成熟タンパク質のN-末端にセリンおよびチロシンで置換された
２個のアミノ酸を有する殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。シグ
ナルペプチドは1-72位に存在し、SerおよびTyrはヌクレオチド73-78にコードさ
れ、イントロン配列はヌクレオチド100-288である。
【００４２】 SEQ ID NO.12：最適化されたイントロンおよびコドンを含有する殺虫性タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド。シグナルペプチドは1-78に存在し、イント
ロン配列は105-288である。
【００４３】 SEQ ID NO.13：ペシロマイセスsppから得られる殺虫性タンパク質のゲノム配
列。シグナルペプチドは57-107位に存在する。成熟タンパク質コード配列は108-
397である（停止を含む）。
【００４４】 SEQ ID NO.14：成熟殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。 SEQ ID NO.15-19：それぞれダリア（Dm-AMP-1）、ラディッシュ（Rs-AFP1）、
トウモロコシ（高ヒドロキシプロリン糖タンパク質（HRGP））、タバコ（PR-1 a
シグナル）、およびペシロマイセス由来のシグナルペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列。
【００４５】 SEQ ID NO.20-24：それぞれダリア（Dm-AMP-1）、ラディッシュ（Rs-AFP1）、
トウモロコシ（高ヒドロキシプロリン糖タンパク質（HRGP））、タバコ（PR-1 a
シグナル）、およびペシロマイセス由来のシグナルペプチドのタンパク質配列。
【００４６】 SEQ ID NO.25-53：プライマー。 SEQ ID NO.54-59：それぞれ殺虫性タンパク質cry 1 Ia1（Embl.承認番号X6282
1）；cry 1 Ia2（Embl.承認番号M98544）；cry 1 Ia3（Embl.承認番号L36338）
；cry 1 Ia4（Embl.承認番号L49391）；cry 1 Ia5（Embl.承認番号Y08920）、お
よびcry 1 Ib1（Embl.承認番号U07642）のタンパク質配列。
【００４７】 SEQ ID NO.60：特定の位置にシステイン残基を有する殺虫性タンパク質配列。 SEQ ID NO.61：ゲノム殺虫性タンパク質配列をコードするポリヌクレオチド。
シグナルペプチドは57-107位に存在する。成熟タンパク質コード配列は108-397
である（停止を含む）。
【００４８】 SEQ ID NO.62：ペシロマイセスspから得られる殺虫性タンパク質をコードする
ポリヌクレオチド。シグナルペプチドは110-160位に存在する。成熟タンパク質
コード配列は161-262である（停止を含む）。
【００４９】 SEQ ID NO.63-64：タンパク質モチーフ。 SEQ ID NO.65：タンパク質領域。実施例 実施例１ ペシロマイセス・ファリノサスの培養 ペシロマイセス・ファリノサスをジャガイモ・デキストロース寒天プレート上
で慣例的に培養した。無菌水を添加して無菌のスパチュラで掻き取って芽胞をプ
レートから回収した。殺虫性ペプチドを生成するために、6x107の芽胞を、500ml
フラスコ中の5x200ml SDB培地に接種した。培養液を180rpmで攪拌しながら24℃
で7日間インキュベートした後に回収した。実施例２ 殺虫性ペプチドの精製 500mlの7d 培養液濾過物をワットマンTMGF/B濾紙で濾過して菌糸を除去し、上
清を20mM MES（pH6）で4倍に希釈した。次いで上清を、20mM MES（pH6）であら
かじめ平衡化したS-セファロースFF XK16/10カラム（Pharmacia Biotech）に負
荷した。3カラム容量の20mM MES（pH6）で未結合のタンパク質をカラムから洗い
出し、結合したタンパク質を0-1M NaCl／20mM MES（pH6）の20カラム容量にわた
る直線グラジエントで溶出した。溶出物を、280および210nmの吸光度のオンライ
ン測定によってモニタリングした。5ml画分を回収し、次いで50mM リン酸ナトリ
ウムバッファー（pH7）に対して透析し、Heliothis virescensに対してアッセイ
した。
【００５０】 活性画分は250mM NaCl付近に溶出された。これらの画分をプールしてポリエチ
レン・グリコールMwt20,000で濃縮し、逆相で更に精製した。２mlの試料を３ml
のResource RPCカラム（Pharmacia Biotech）に負荷し、結合したペプチドを0.0
5% トリフルオロ酢酸（TFA）から50% アセトニトリル、0.0% TFAの20カラム容量
にわたる直線グラジエントで溶出した。溶出物を210および280nmの吸光度でモニ
タリングした。活性ピークは約20％アセトニトリルで溶出した。実施例３ ペプチド配列の同定 実施例２の産物中の活性ペプチドの配列は、おそらくN-末端がブロックされて
いるために、直接決定できなかった。ペプチドを還元してトリプシン消化を行っ
た。これによって一連のフラグメントが生成され、これをエドマン分解法を使用
してシーケンシングすることができた。これと質量分析を併用してペプチドの配
列がSEQ ID NO.2であることが確認された。質量分析のデータはN-末端グリシン
がアセチル化されていることを示した。実施例４ 昆虫バイオアッセイにおける生物学的活性 単離したペプチドで、以下の方法を使用して昆虫種の範囲についてバイオアッ
セイを行った： アッセイに先立ち、鱗翅類の新生幼虫20匹を処理毎に3つの“ミニポット”容
器のそれぞれに静かに払い入れた（すなわち処理毎に３重測定）。実施例２から
のペプチドを0.1% SynperonicTM溶液を使用して希釈し、湿潤剤として作用して
ろう様の葉のクチクラ上への物質のスプレッドを促進した。スペクトル・アッセ
イでは試験物質を単一の高濃度に調製し、H. virescensに対する有効性のアッセ
イでは比率（rate）の範囲を試験した。
【００５１】 処理毎に３検体の新たに切った綿の葉に、それぞれの葉の軸面の中央に0.1ml
の好適な処理をピペットで適用した。次いで、先の細い美術用の絵筆を使用して
ミニポットの直径より大きい円形の範囲に小滴を広げた（汚染を防ぐためにそれ
ぞれの物質に新たな絵筆を使用した）。葉を、表面の付着物が乾燥するまでの間
、蒸発棚（fume cupboard）に放置したが、葉が過度にしおれないように配慮し
た。
【００５２】 乾燥後、好適に標識したミニポット上に、汚染表面を下にして葉を置き、フタ
を閉めた。ミニポットをプラスチック・トレイに置き、25-27℃に温度を制御し
た。
【００５３】 ３日後、生き残った幼虫を計数し、死亡率を算定した。H. virescensに対する
有効性のアッセイでは、試験データについてlogit分析パッケージを行ってLC50
を確立した。４つの鱗翅類殺虫剤の結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】 ｂ）細胞障害性 ２つの細胞系を使用して実施例２のペプチドが哺乳動物細胞（MEL細胞）また
は昆虫細胞（Sf21細胞）のいずれかに対して細胞障害性を有するかどうかを試験
した。96ウェルのマイクロタイター・プレートで、MEL細胞およびSf21細胞をそ
れぞれDMEMおよびTC100培地中で増殖させ、好適な濃度のペプチドと共にインキ
ュベートした。24時間後に肉眼による細胞死の計数を行い、生存力および成長の
評価を３日後（MEL細胞）または４日後（Sf21）に、MTT（3-(4,5-ジメチルチア
ゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）の還元によって代
謝的に活性な細胞のマーカーとして不溶性紫色ホルマザンを生成させて行った。
試験を行った最も高濃度（100μg/ml）で、ペプチドは細胞増殖を阻害せず、い
ずれの細胞系にもいずれの細胞障害作用も誘引しなかった。実施例５ FASTAアルゴリズムを使用するタンパク質配列とSEQ ID NO.1との比較 タンパク質配列のデータベースに対するSEQ ID NO.1のFASTA比較サーチを実施
した。FASTA法（FASTAバージョン3.0t82 1997年11月1日 文献：W.R. Pearson &
D.J. Lipman PNAS(1988) 85:2444-2448）を使用して全ての公共の入手できるタ
ンパク質配列とSEQ ID NO.1を比較した。結果はoptスコアとして得た。実施例６ SEQ ID NO.2のペプチドの天然コード配列のキャラクタリゼーション 試料の回収 殺虫性を有するペシロマイセス・ファリノサス株をサブロー・デキストロース
ブロス（Difco Laboratories：10g Bacto Neopeptone、20g Bacto Dextrose／1
リットル水）中、180rpmで攪拌しながら24℃で5日間増殖させた。培養液を沈殿
させ（8000rpm、10分間）、使用まで-80℃で保存した。RNA抽出 回収した試料を、液体窒素下で乳棒と乳鉢を使用して粉砕し、微細な粉末とし
た。Qiagen RNeasyキットを使用し、製造者の説明書に従って1gの真菌ペレット
からRNAを抽出した。総RNA画分を1mlの水でRNeasy精製カラムから溶出した。Pro
mega PolyA Ttract mRNA単離システムIを使用し、製造者の説明書に従って700μ
gの総RNAからPoly(A)+RNAを単離した。Poly(A)+RNA画分を1mlの水で磁気ビーズ
から溶出し、エタノール沈殿によって15μl（約0.5mg/ml）まで濃縮した。RNAサ
ンプルは使用まで-80℃で保存した。以下の反応で使用したプライマーおよびプ
ローブを表３に要約する。
【００５６】
【表３】
【００５７】 表中、“Ｆ”は順向きプライマーを示し、“Ｒ”は逆向きプライマーを示す。RACE PCR １本鎖cDNAの合成 ClonTech Advantage RT-for-PCRキットを、製造者の説明書に従ってこれに使
用した。20pmolのオリゴ(d)Tプライマー‘アンカー１’を、総容量13.5μl中で7
0℃で2分間加熱することによって1μgの総RNAにアニールさせ、氷上で迅速にク
エンチングした。以下の反応成分を添加した： 4μlの5x反応バッファー；0.5μlのRNアーゼ阻害剤；1μlのMMLV逆転写酵素；1
μlの10mM dNTP。反応液を42℃で1時間インキュベートし、95℃で5分間酵素を変
性させることによって反応を停止させた。80μlのRNアーゼを含有しない水を添
加し、cDNAを-80℃で保存した。3'RACE PCR １本鎖cDNA合成反応からの5μlの反応混液をテンプレートとし、種々のプライ
マーセットの組み合わせと併用してペプチドをコードするcDNAの3'末端を増幅し
た。使用したプライマー（表３参照）を変性させ、成熟ペプチドのN-末端の既知
のアミノ酸配列に設計して、選択的に増幅できるようにした。PCR反応をReady-T
o-Go PCRビーズ（Amersham Pharmacia Biotech）を使用して実施した。これらは
0.5mlの試験管中のビーズとして、PCR反応に必要な成分を全て含有する。以下の
成分を添加した：cDNA合成段階からのcDNAテンプレート５μl反応混液；順向き
プライマー25pmol；逆向きプライマー25pmol；無菌水で最終容量25μlとした。
PCRサイクル条件 （1）95℃、1分間；（2）95℃、1分間；（3）64℃*、1分間、（4）72℃、1分
間（段階2-4を30サイクル）；（5）72℃、10分間（*アニーリング温度はプライ
マーセットによって変化する）。PCR産物をTBEバッファー中の1%アガロースゲル
上でのアガロースゲル電気泳動によって可視化した。分離したPCR産物を、Invit
rogen TOPO TAクローニングキットを使用し、製造者の説明書に従ってpCR2.1 TO
POにクローニングした。それぞれのライゲーション（以下を含有：1μlのPCR産
物；1μlのpCR2.1 TOPOベクター（図５）；3μlの無菌水）を室温で5分間インキ
ュベートした。それぞれのライゲーション混合液2μlを、42℃で30秒間の熱ショ
ックおよびそれに続く氷上での2分間のインキュベーションによってTOP10コンピ
ーテント細胞に形質転換した。形質転換した細胞を、SOC培地（2% トリプトン、
0.5% 酵母抽出物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM グル
コース）中、37℃で1時間、225rpmで攪拌しながらインキュベートし、ベータ・
ラクタマーゼを発現させた。
【００５８】 プラスミド形質転換体の選択のために50μg/mlのカナマイシンを含有するLuri
a-Bertani寒天プレート（1.0% トリプトン、0.5% 酵母抽出物、1.0% NaCl、15g/
L 寒天、0.006% X-gal、0.15mM IPTG）上に細胞を播種し、組み換えTOPO TA単離
体を含有するものを同定できるようにした。別々の白色コロニーを異なるPCR TO
PO TA反応から選択し、50μg/mlのカナマイシンを含有する5mlのLuria-Bertani
（1.0% トリプトン、0.5% 酵母抽出物、1.0% NaCl／水、pH7.0）中で一晩増殖さ
せた。
【００５９】 Wizard DNA精製キット（Promega）を使用し、製造者の説明書に従って培地か
らプラスミドDNAを抽出した。DNAは50μlの無菌水で溶出した。プラスミドDNAを
EcoRIで消化し、挿入断片の存在およびサイズを確認した。3μl プラスミドDNA
；1μl EcoRI（Kramel Biotech）；1μl 10x制限バッファー6（Kramel Biotec
h）；5μl 無菌水。消化物を37℃で2時間インキュベートし、アガロースゲル電
気泳動によって挿入断片の存在または不在、およびサイズを確認した。これらの
分析に基づいて、Perkin Elmer ABI 377XL DNAシークエンサーでABI Prism色素
ターミネーター・サイクル・シーケンシング・レディー反応キットを使用して、
製造者の説明書に従って、組み換えプラスミドをシーケンシングで選択した。4p
mol プライマー M13 UnivまたはM13R；5μl DNA；無菌水（12μlまで）。SEQ
ID NO.2のペプチドのコード配列は、ヌクレオチド配列を全ての可能なリーディ
ング・フレームでアミノ酸配列に翻訳し、この配列をペプチドの既知のアミノ酸
配列と比較することによって同定できた。この分析にはDNA Star配列分析ソフト
ウェア（SeqMan, EditSeq, Macaw, VectorNTI）を使用した。5'RACE PCR アンカー・ライゲーション法（Troutt, A.B.ら, Proc. Natl. Sci. USA. 89,
9823-9825）を使用して524445遺伝子の5'側半分のヌクレオチド配列を得た。こ
れには特定のアンカー・プライマーが１本鎖cDNAの5'末端へ結合することが必要
であった。この配列をSEQ ID NO.2に相補的な3'プライマーのペプチドに特異的
なmRNAと共に使用することによって相当するコードcDNAの5'末端の選択的増幅が
可能となった。プライマーのアニーリング 相補的オリゴヌクレオチド・アンカー3およびアンカー3-結合部を、３つの異
なる最終濃度（1nM、100nM、10mM）で等モル比で互いにアニールさせた。オリゴ
ヌクレオチド混合物を95℃まで加熱し、徐々に45℃まで冷却してアニールさせた
。（2）アニールしたプライマーのcDNAへのライゲーション 結合プライマーはアンカー・プライマーに相補的であるが、５個の更なる完全
に変性した塩基（すなわちそれぞれの部位にA、G、C、およびTで合成した）の3'
伸長鎖を含有する。この変性“テール”によって個々の結合プライマーはいずれ
かのcDNA分子の3'末端にアニールするようになる。プライマーの3'末端のアミノ
基はDNA合成を阻害する。アンカー・プライマーの5'末端のリン酸基により、こ
れがcDNA分子の3'末端にライゲートすることによってPCR増幅のための特異的認
識配列が提供される。アニールしたアンカー・プライマーを１本鎖cDNA標品にラ
イゲートさせるための反応液は以下を含有する：5μlの1本鎖cDNA合成からの反
応混液；30mM トリスHCl（pH8）；10mM MgCl2；10mM ジチオトレイトール；0.5m
M ATP；1μl T4 DNAリガーゼ（4U/μl）（Kramel Biotech）；1μl 水；1μlの
アニールしたアンカー・プライマー（最終濃度100mM、10nM、1mM）。 反応は以下のサイクルで一晩行った： 25℃、5分間 ←（緩慢な速度で）→4℃、5分間 反応液をプールし、95℃で5分間インキュベートし、液体窒素で急速に凍結し
た。氷上で解凍した後、Wizard PCRクリーンナップ・カラム（Promega）を通し
て、製造者の説明書を使用して過剰のプライマーを除去した。cDNAを40μlの水
で溶出した。（3）RACE PCR テンプレートとしてのアンカーが結合したcDNA、このアンカー配列に基づく特
定の順向きプライマー、および既に3'RACEによって同定されているSEQ ID NO.1
のペプチドの遺伝子配列に基づく特定のプライマーを使用してPCR反応を開始し
た。PCR反応は前に3'RACEで使用したようにReady-To-Go PCRビーズ（Amersham P
harmacia Biotech）を使用して実施した。PCRビーズに添加した成分は以下であ
る：１本鎖cDNAの3'末端にアニールさせたアンカー3を有するcDNAテンプレート1
μl；20pmolの順向きプライマー；20pmolの逆向きプライマー；無菌水（最終容
量25μlまで）。
【００６０】 PCRサイクル条件は以下の通りである：（1）95℃で1分間；（2）95℃で1分間
；（3）58℃*で1分間；（4）72℃で1分間（段階2-4を30サイクル）；（5）72℃
で10分間（*アニーリング温度はプライマー・セットによって異なる）。PCR産物
を上記のようにアガロースゲル電気泳動で可視化し、TOPOクローン化した。先に
3'RACEクローンで行ったように（上記）、Wizardミニプレップによって候補とな
る組み換えプラスミドを保有するクローンからプラスミドDNAを抽出し、EcoRI消
化し、シーケンシングした。cDNAライブラリー ライブラリーの構築 真菌ペシロマイセス・ファリノサスのcDNAライブラリーを構築したが、これに
はラムダ-ZAP cDNA合成およびZAP-cDNA Gigapack III Goldキット（Stratagene
）を使用し、特に記載しない限り、製造者の説明書に従って行った。テンプレー
トとしてSEQ ID NO.2のペプチド由来のmRNA（上記参照） 5μgを使用して２本鎖
cDNAを合成した。これは１本（first）および２本（second）鎖cDNA合成、cDNA
末端の平滑化、アダプターのライゲーション、および特定の制限酵素での消化に
よる直接クローニングのための好適な‘付着端（sticky ends）’の生成を含む
。キットで示されているサイズ分画ではなく、Sephacryl S-400 HR MicroSpinカ
ラム（Amersham Pharmacia Biotech）を使用して過剰のアダプターを除去した。
キットで提供されるゲル濾過媒体（sepharose CL-2B）は400bpのカット・オフで
サイズに基づいて分子を分離する。成熟殺虫性ペプチドはわずか33アミノ酸長で
あるため、遺伝子は400bp未満であると考えられ、セファロース濾過媒体を使用
するのではなく、これを選択した。cDNAをUni-ZAP XRベクター内にライゲートし
、ファージに封入した。ライブラリー力価は250万クローンであり、挿入断片の
サイズは150bpから2Kbの範囲で、平均700bpであった。ライブラリー・スクリーニング 合計500,000プラークを、cDNAライブラリーの製造者の説明に従ってLunia-Ber
tani寒天プレートに播種した。重複採取したプラーク（duplicate lifts of the
plaques）をニトロセルロース膜（Hybond-N, Amersham Pharmacia Biotech）上
に施与した。膜をDenhardtsハイブリダイゼーション溶液（5xSSPE、5x Denhardt
's試薬［50x Denhardt's試薬：5g Ficoll、5g ポリビニルピロリドン、5g ウシ
血清アルブミン、無菌水（500mlまで）］、0.5% SDS、無菌水（1Lまで））（10
分間煮沸し、65℃で2時間加熱して変性させてあった200μl サケ精子DNA（10mg/
ml）を含有）中であらかじめハイブリダイズさせた。SEQ ID NO.1のペプチドの
コード配列に特異的なオリゴヌクレオチドの末端標識によって放射活性なプロー
ブを調製した：25ng オリゴヌクレオチド（445-F11）；1μl ポリヌクレオチド
・キナーゼ・バッファー（Kramel Biotech）；1.5μl T4ポリヌクレオチド・キ
ナーゼ（Kramel Biotech）；5μl ガンマ32P dATP；無菌水（10μlまで）。プロ
ーブを37℃で5時間インキュベートした。プローブを50ml Denhardtsハイブリダ
イゼーション溶液に添加し、65℃で一晩ハイブリダイズさせた。膜を0.1xSSC、0
.1% SDS溶液中で4x15分間洗浄し、未結合のプローブを除去した。x線に暴露して
SEQ ID NO.2のタンパク質をコードする配列を含有する陽性プラークを同定した
。
【００６１】 陽性プラークをもとの寒天プレートからくり抜き、1mlのSMバッファー（5.8g
NaCl、2g MgSO4・7H2O、50ml 1M トリス-HCl（pH7.5）、5ml 2% ゼラチン、無菌
水（1Lまで））（20ml クロロホルム含有）に添加し、ボルテックスで攪拌した
。4℃で一晩インキュベートしてファージDNAをファージバッファーに溶出させた
。次いでファージのサンプルを希釈し、再播種してプレート当たり約200プラー
クを得た。上記のプラーク採取およびハイブリダイゼーションの方法を反復して
陽性のものを同定した。
【００６２】 この過程に次いで、プラークが純粋になるまで3ラウンドのスクリーニングを
行った。cDNAライブラリー・キットを用い、Stratageneの説明書によって、12の
候補となる陽性プラークを自分で切除（self excision）してコロニーとした。
【００６３】 候補のコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを含有する5ml Luria-Bertani培
地中で一晩増殖させ、PromegaのWizardミニプレップ・キットを使用してプラス
ミドDNAを抽出し、M13ユニバーサルおよびM13逆向きプライマーを使用して挿入
断片のシーケンシングをした（全ての詳細は上記参照）。ヌクレオチド配列 SEQ ID NO.2のペプチドのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.14として表し、また
図2にも示す。推定される翻訳開始コドンおよび終結コドンは斜体で示す。成熟
ペプチドをコードする配列には下線を付す。
【００６４】 図２の配列は、約110ヌクレオチドの5'非コード配列および160ヌクレオチドの
3'非コード配列が存在することを示している。成熟コード配列の5'に17アミノ酸
のシグナルペプチドが存在すると考えられる。可能性のあるシグナル配列開裂部
位をvon Heijne, G.（1986, Nucleic Acids Research. 14, 4683）の方法に基づ
いて予測した。可能性のある開裂部位を下向きの矢印で示す。おそらく、２番目
のプロセシング事象は、例えばシグナルペプチダーゼ開裂によって、シグナルペ
プチドを成熟ペプチドから除去することである。実施例７ トウモロコシにおけるペプチドの発現 ヨーロッパ・トウモロコシ穿孔虫（European Corn Borer；Ostrinia nubilali
s）、および、このようにこのペプチドを発現するように形質転換したトウモロ
コシ（Zea mays）はこの害虫に対して保護されると期待される。トウモロコシで
の発現に好適なコンストラクトを以下に概説する：
【００６５】
【表４】
【００６６】* このシグナルペプチドは内部NcoI部位を含有し、これはクローニングにNcoI
が必要な場合、変異して（例えばCCATGG→CTATGG）それを破壊することができる
。+ 天然コード配列は、特にトウモロコシにおけるコドンの最適化の目的で、遺
伝子コードの変性（degeneracy）に従って修飾できる。
【００６７】 シグナルペプチドは、例えば図２に示す重複PCR法を使用して、成熟遺伝子に
融合させることができる。融合体が制限部位を有して単子葉植物ベクターにクロ
ーニングできるように好適に設計する。例えば、以下を含んでもよい： 5' NcoI-KpnI--------シグナル--------遺伝子--------SacI-HindII 3' 完全長のシグナル-遺伝子融合体はトウモロコシ・ユビキチン・プロモーター
およびnosターミネーター間でPAT選択を含むバックボーン・ベクターにライゲー
トすることができる（ホスホノトリシン-basta除草剤耐性）。
【００６８】 当該分野で周知のように、これらのコンストラクトを使用してトウモロコシ細
胞を形質転換し、次いでこれを増殖させてカルスとすることができる。形質転換
したカルスでトウモロコシ・カルス一過性アッセイおよび／またはin vivoにお
けるバイオアッセイを行い、ペプチドの発現および活性を確認することができる
。実施例８ 綿におけるペプチドの発現 本発明のペプチドは綿の主要な害虫であるシロイチモンジヨトウガの幼虫（Sp
odoptera exigua）に対して良好な活性を有する。従ってこのペプチドを発現す
るように形質転換した綿Gossypium hirsutumはこの害虫から保護される。
【００６９】 この場合に形質転換に使用するのに好適なコンストラクトを以下に概説する：
【００７０】
【表５】
【００７１】 実施例７のような重複PCR法を使用してシグナルペプチドを成熟遺伝子に融合
させることができる。この場合、融合体が制限部位を有して双子葉植物ベクター
にクローニングできるように好適に設計する。完全長のシグナル-遺伝子融合体
をハウスキーピング・ベクターに、RolDFdプロモーターおよびジャガイモ・プロ
テアーゼ阻害剤IIターミネーター間でライゲートできる。次いで制限酵素を用い
てカセット全体を切り出し、好適な２元ベクターにライゲートさせる。その後、
従来法を使用してコンストラクトを試験できる。本発明の他の修飾を本発明の範
囲から逸脱することなく行えることは当業者に明らかである。実施例９ タンパク質複合物の殺虫活性 先に調製したヨーロッパ・トウモロコシ穿孔虫（ECB）の人工餌を試験管内に
少量投与し、温水浴で70℃に保持した。975mlの餌を含む各試験管に75mlの好適
な試験サンプルを添加した。試験サンプルはcry1Ia1タンパク質（SEQ ID NO.54
）およびSEQ ID NO.2のタンパク質（R524445タンパク質）の混合物を含有する。
“組み込んだ餌”を十分混合し、次いで180mlアリコートをピペットでFalconTM1
006ペトリ皿上に、各サンプル毎に５重複となるように採取した。皿／重複ごと
に５匹の１齢幼虫を餌に施与してふたをした後、皿を1-5時間、侵襲させた。試
験は27℃、70-80% RHで暗室に保持し、処理後５日目に昆虫の運動性について評
価した。結果を以下の表４に示す：
【００７２】
【表６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ペシロマイセス・ファリノサス遺伝子の構成の概要図で
ある。
【図２】 図２は、トウモロコシの形質転換に好適なコンストラクトのシグ
ナル遺伝子融合部分を示す。
【図３】 図３は、トウモロコシの形質転換に好適なコンストラクトおよび
バックボーン・ベクターpat UB1 poly2を示す。
【図４】 図４は、ペシロマイセス・ファリノサスから単離できる遺伝子の
ゲノムマップを示す。
【図５】 図５は、ベクターpCR2.1 TOPOを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カーライル，アマンダ・ジェイン イギリス国バークシャー アールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッ ツ・ヒル・インターナショナル・リサー チ・センター (72)発明者 ケイリー，パトリシア・ジェイン イギリス国バークシャー アールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッ ツ・ヒル・インターナショナル・リサー チ・センター (72)発明者 マッケイ，エレイン・アン イギリス国バークシャー アールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッ ツ・ヒル・インターナショナル・リサー チ・センター (72)発明者 ワーナー，シモン・アンソニー・ジェイム ス イギリス国バークシャー アールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッ ツ・ヒル・インターナショナル・リサー チ・センター (72)発明者 ヴィンセント，ジェイソン・リー イギリス国バークシャー アールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッ ツ・ヒル・インターナショナル・リサー チ・センター (72)発明者 リー，マイケル・デイヴィッド イギリス国バークシャー アールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッ ツ・ヒル・インターナショナル・リサー チ・センター Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 4B024 AA08 BA80 CA04 CA07 DA01 EA02 FA02 FA18 GA11 HA12 4B065 AA58Y AA88X AB01 AC14 AC20 BA01 CA24 CA53 4H011 AC01 BA01 BB06 BB21 4H045 AA10 AA30 BA10 BA18 BA41 CA15 DA83 EA06 FA74

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の配列を含む殺虫性タンパク質であり： Ｘ1Ｘ2ＩＣＴＰＡＧＶＫＣＰＡＡＬＰＣＣＰＧＬＲＣＩＧＧＶＮＮＫＶＣＲ（SE
    Q ID NO.1） 式中、Ｘ1およびＸ2がいずれかのアミノ酸である上記タンパク質。
  2. 【請求項２】 Ｘ1およびＸ2が以下：グリシン；リジン；セリン；チロシン
    ；アラニン；メチオニン；スレオニン；グルタミン酸；アスパラギン酸；アスパ
    ラギン；およびバリンからなる群から選択される、請求項１記載の殺虫性タンパ
    ク質。
  3. 【請求項３】 以下の配列： ＧＫＩＣＴＰＡＧＶＫＣＰＡＡＬＰＣＣＰＧＬＲＣＩＧＧＶＮＮＫＶＣＲ（SEQ
    ID NO.2） を含む、請求項２記載の殺虫性タンパク質。
  4. 【請求項４】 請求項１から３のいずれかに記載するタンパク質と少なくと
    も55％の同一性を有する殺虫性タンパク質。
  5. 【請求項５】 請求項１から３のいずれかに記載するタンパク質と少なくと
    も70％の同一性を有する殺虫性タンパク質。
  6. 【請求項６】 Ｘ1位のアミノ酸が修飾される、請求項１から５のいずれか
    に記載する殺虫性タンパク質。
  7. 【請求項７】 Ｘ1位のアミノ酸がアセチル化される、請求項６記載の殺虫
    性タンパク質。
  8. 【請求項８】 Ｘ1位のアミノ酸がN-末端にある、請求項６または７記載の
    殺虫性タンパク質。
  9. 【請求項９】 請求項１から５のいずれか１つに記載するタンパク質をコー
    ドするポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 約65℃の温度で6xSSC、0.01% SDS、および0.25% スキムミ
    ルク粉末を含有する溶液中で請求項９記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズ
    し、次いで同じ温度で0.2xSSCおよび0.1% SDSを含有する溶液中で洗浄するもの
    の相補体であるポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列がなお
    殺虫性タンパク質をコードする、上記ポリヌクレオチド配列。
  11. 【請求項１１】 SEQ ID NO.4から14の配列を含む、請求項10記載のポリヌ
    クレオチド配列。
  12. 【請求項１２】 請求項１から８のいずれか１つに記載の第１のタンパク質
    および少なくとも１つの更なるタンパク質を含有する殺虫性共同作用性複合物。
  13. 【請求項１３】 該更なるタンパク質が殺虫性CRYタンパク質である、請求
    項１２記載の複合物。
  14. 【請求項１４】 該更なるタンパク質がSEQ ID NO.54から59からなる群から
    選択される配列を含有する、請求項１３記載の複合物。
  15. 【請求項１５】 請求項１２から１４のいずれか１つに記載する第１のタン
    パク質および更なるタンパク質をコードする領域を含有するポリヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 該第１のタンパク質をコードする領域がSEQ ID NO.4から1
    4の群から選択される配列を含有する、請求項１５記載のポリヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】 殺虫性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    を進化（evolving）させる方法であり、以下： （ａ）該ポリヌクレオチドの変異体集団および更なるタンパク質をコードする更
    なるポリヌクレオチドを提供し、ここで該ポリヌクレオチドの少なくとも１つは
    無細胞形であり； （ｂ）該変異体および更なるポリヌクレオチドを混合して組み換えポリヌクレオ
    チドを生成し； （ｃ）該殺虫性を有するタンパク質をコードするように進化した組み換えポリヌ
    クレオチドを選択またはスクリーニングし；そして （ｄ）段階（ｃ）の組み換えポリヌクレオチドを用いて段階（ｂ）および（ｃ）
    を、殺虫性を有するタンパク質をコードする進化したポリヌクレオチドが得られ
    るまで反復する を含み、パート（ａ）の該変異体集団が請求項９から１１、１５または１６のい
    ずれか１つに記載するポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有する、上記方法。
  18. 【請求項１８】 パート（ａ）の該変異体集団がSEQ ID NO.1から3のタンパ
    ク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび／またはCRYタンパ
    ク質をコードするパート（ａ）の更なるポリヌクレオチドを含む、請求項１７記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１７または１８記載の方法によって得ることができ
    る、または得たポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 請求項１９記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパ
    ク質。
  21. 【請求項２１】 転写終結領域に機能的に結合する請求項９から１１、１５
    、１６、もしくは１９のいずれか１つに記載するポリヌクレオチドまたは請求項
    ２０記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に結合する植物作
    用性プロモーターを配列中に含有するDNAコンストラクト。
  22. 【請求項２２】 タンパク質産物を特定の位置へターゲッティングさせるた
    めの領域を更に含む、請求項２１記載のDNAコンストラクト。
  23. 【請求項２３】 選択可能なマーカーとして作用するタンパク質を生成させ
    るための領域を更に含む、請求項２１または２２記載のDNAコンストラクト。
  24. 【請求項２４】 植物作用性プロモーターが以下：アグロバクテリウム・リ
    ゾジン（Agrobacterium rhizogenes）RoID；ジャガイモ・プロテアーゼ阻害剤II
    ；CaMV35S；FMV35S；NOS；OCS；パタチン（Patatin）；E9；alcA/alcRスイッチ
    ；GSTスイッチ；RMSスイッチ；オレオシン（oleosin）；リブロース・ビスリン
    酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼ小サブユニット・プロモーターおよび他の
    根部特異的プロモーター（MR7プロモーター（トウモロコシ）；Gos9（コメ）お
    よびGOS2プロモーターを含む）からなる群から選択される、請求項２１から２３
    のいずれか１つに記載するDNAコンストラクト。
  25. 【請求項２５】 殺虫性タンパク質または殺虫性共同作用性複合物を有する
    植物または植物部分を提供する方法であり、以下： （ａ）植物試料のゲノムに請求項９から１１、１５、１６、もしくは１９のいず
    れか１つに記載するポリヌクレオチド、または請求項２０記載のタンパク質をコ
    ードするポリヌクレオチド、または請求項２１から２４のいずれか１つに記載す
    るDNAコンストラクトを挿入し；または （ａ）更なるタンパク質を生成する能力のある植物試料のゲノムに請求項９から
    １１、１９のいずれか１つに記載するポリヌクレオチド、または請求項２０記載
    のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または請求項２１から２４のいず
    れか１つに記載するDNAコンストラクトを挿入し；または （ａ）請求項１から８のいずれか１つに記載するタンパク質または請求項９から
    １１もしくは１９のいずれか１つに記載するポリヌクレオチドによって提供され
    るタンパク質を生成する能力のある植物試料のゲノムに、更なるタンパク質を提
    供するポリヌクレオチドを挿入し；そして （ｂ）該試料から植物または植物部分を再生し；そして （ｃ）該タンパク質または複合物を有する植物または植物部分を選択する を含む、上記方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１２から１４のいずれか１つに記載する複合物を有
    する植物を提供する方法であり、請求項１から８のいずれか１つに記載する第１
    のタンパク質または請求項９から１１もしくは１９のいずれか１つに記載するポ
    リヌクレオチドによって提供される第１のタンパク質を提供する能力のある第１
    の植物を更なるタンパク質を生成する能力のある第２の植物と交配させ、そして
    得られた植物で該複合物を生成する能力のあるものを選択することを含む、上記
    方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２５記載の方法によって得られる植物もしくは植物
    部分、または請求項２６記載の方法によって得られる植物。
  28. 【請求項２８】 該タンパク質または該複合物の第１のタンパク質が翻訳後
    に修飾される、請求項２７記載の植物または植物部分。
  29. 【請求項２９】 該タンパク質または該複合物の第１のタンパク質がアセチ
    ル化される、請求項２８記載の植物または植物部分。
  30. 【請求項３０】 該タンパク質または第１のタンパク質がN-末端で修飾／ア
    セチル化される、請求項２８または２９記載の植物または植物部分。
  31. 【請求項３１】 メロン、マンゴ、大豆、綿、タバコ、テンサイ、セイヨウ
    アブラナ、キャノーラ、亜麻、ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、アルファルファ
    、レタス、トウモロコシ、小麦、モロコシ、ライ麦、バナナ、大麦、エン麦 、芝、まぐさ、サトウキビ、エンドウ豆、収穫豆（field bean）、米、松、ポプ
    ラ、リンゴ、モモ、ブドウ、イチゴ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ、
    柑橘類、穀物、ナッツ植物、または他の園芸作物からから成る群から選択される
    、請求項２７から３０に記載する植物または植物部分。
  32. 【請求項３２】 更なる所望の農業経済的特性を有する植物または植物部分
    を提供する方法であり、以下： （ａ）植物試料のゲノムに所望の農業経済的特性を提供するポリヌクレオチドを
    挿入し； （ｂ）該試料から植物または植物部分を再生させ；そして （ｃ）該所望の農業経済的特性を有する植物または植物部分を選択する（ここで
    該植物試料は請求項１から８のいずれか１つに記載する殺虫性タンパク質または
    請求項１２から１４に記載する複合物を生成する能力がある）；または 請求項２７から３１のいずれか１つに記載する第１の植物を該更なる所望の農業
    経済的特性を提供する第２の植物と交配させて、得られる植物で更なる農業経済
    的特性を生ずる能力のあるものを選択する を含む、上記方法。
  33. 【請求項３３】 更なる所望の農業経済的特性が以下：除草剤耐性；昆虫耐
    性；線虫耐性；ストレス耐性；変更された収量；変更された栄養価；または他の
    いずれかの好ましい農業経済的特性から成る群から選択される、請求項３２記載
    の方法。
  34. 【請求項３４】 請求項３２または３３の方法によって得られる植物または
    植物部分。
  35. 【請求項３５】 以下の配列：-Ｘ1-Ｘ2-Ｘ3-Cys4-Ｘ5-Ｘ6-Ｘ7-Ｘ8-Ｘ9-Ｘ 10 -Cys11-Ｘ12-Ｘ13-Ｘ14-Ｘ15-Ｘ16-Cys17-Cys18-Ｘ19-Ｘ20-Ｘ21-Ｘ22-Cys23-
    Ｘ24-Ｘ25-Ｘ26-Ｘ27-Ｘ28-Ｘ29-Ｘ30-Ｘ31-Cys32-Ｘ33-（SEQ ID NO.60）（式
    中、Ｘ1-3、5-10、12-16、19-22、24-31および33はいずれかのアミノ酸である）
    を含有する殺虫性タンパク質。
  36. 【請求項３６】 FASTAアルゴリズム・バージョン3を使用してSEQ ID NO.1
    と比較した場合にFASTA optスコアが109より高い殺虫性タンパク質。
  37. 【請求項３７】 ペシロマイセスspから得られる殺虫性タンパク質。
  38. 【請求項３８】 ペシロマイセス・ファリノサス（farinosus）から得られ
    る請求項３７記載の殺虫性タンパク質。
  39. 【請求項３９】 昆虫を制御する方法であり、昆虫が摂食する部位に請求項
    １から８、２０、３５から３８のいずれか１つに記載するタンパク質または請求
    項１２から１４のいずれか１つに記載する複合物を提供することを含む上記方法
    。
  40. 【請求項４０】 昆虫に耐性のある植物または植物部分の生成における、請
    求項９から１１、１５、１６、もしくは１９のいずれか１つに記載するポリヌク
    レオチド、または請求項２１から２４のいずれか１つに記載するDNAコンストラ
    クトの使用。
  41. 【請求項４１】 殺虫剤の活性成分としての請求項１から８、２０、３５か
    ら３８のいずれか１つに記載するタンパク質、または請求項１２から１４のいず
    れか１つに記載する複合物の使用。
  42. 【請求項４２】 請求項１から８のいずれか１つに記載するタンパク質を活
    性成分として含有する殺虫剤の調製におけるペシロマイセスSpの使用。
  43. 【請求項４３】 該ペシロマイセスSpが請求項１から８のいずれか１つに記
    載するタンパク質の生成を増加させるように修飾されている、請求項４２記載の
    使用。
  44. 【請求項４４】 請求項１から８、２０、３５から３８のいずれか１つに記
    載するタンパク質、または請求項１２から１４のいずれか１つに記載する複合物
    、または請求項９から１１、１５、１６、もしくは１９のいずれか１つに記載す
    るポリヌクレオチドにコードされるタンパク質を生成されるための組み換え微生
    物。
  45. 【請求項４５】 請求項１から８、２０、３５から３８のいずれか１つに記
    載するタンパク質、または請求項１２から１４のいずれか１つに記載する複合物
    、または請求項９から１１、１５、１６、もしくは１９のいずれか１つに記載す
    るポリヌクレオチドにコードされるタンパク質を含有する組み換えバキュロウィ
    ルス。
  46. 【請求項４６】 昆虫を制御する方法における請求項４５記載のバキュロウ
    ィルスの使用。
  47. 【請求項４７】 SEQ ID NO.1のタンパク質に対して産生させたモノクロー
    ナル抗体と反応する能力のある殺虫性タンパク質。
  48. 【請求項４８】 殺虫的有効量の請求項１から８、２０、３５から３８のい
    ずれか１つに記載するタンパク質または請求項１２から１４のいずれか１つに記
    載する複合物または請求項９から１１、１５、１６、もしくは１９のいずれか１
    つに記載するポリヌクレオチドにコードされるタンパク質、および必要により農
    業的に許容されるキャリアーおよび／または希釈剤および／または昆虫誘引物質
    を含有する組成物。
  49. 【請求項４９】 請求項１から８、２０、３５から３８のいずれか１つに記
    載する殺虫性タンパク質をコードする第１の領域および更なるタンパク質をコー
    ドする更なる領域を含有するポリヌクレオチド。
  50. 【請求項５０】 請求項１から８、２０、３５から３８のいずれか１つに記
    載するタンパク質、または請求項１２から１４のいずれか１つに記載する複合物
    、または請求項９から１１、１５、１６、もしくは１９のいずれか１つに記載す
    るポリヌクレオチドを含有する植物細胞。
  51. 【請求項５１】 -LPCCPG-（SEQ ID NO.63）のモチーフを含有する殺虫性タ
    ンパク質。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0113900D0 (en) * 2001-06-07 2001-08-01 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
CN1748033B (zh) * 2003-02-06 2011-10-05 作物培植股份有限公司 改变植物生长特性的方法
CA2782572A1 (en) * 2009-12-16 2011-06-23 Dow Agrosciences Llc Insecticidal protein combinations comprising cry1ab and cry2aa for controlling european corn borer, and methods for insect resistance management
EP2361927A1 (en) * 2010-02-26 2011-08-31 BASF Plant Science Company GmbH Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
MX364353B (es) 2011-04-29 2017-06-13 Inst De Ecologia A C Star Usos, métodos y composiciones biológicas del género paecilomyces para el control, prevención y erradicación de fitoparásitos en cultivos de solanaceas.
US10743535B2 (en) 2017-08-18 2020-08-18 H&K Solutions Llc Insecticide for flight-capable pests

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1112280A (ja) * 1997-06-25 1999-01-19 Hokko Chem Ind Co Ltd 新規抗生物質ａｂ５５２９、その製造法および殺虫剤

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103819270A (zh) * 2014-02-24 2014-05-28 陕西省蒲城美尔果农化有限责任公司 一种用于植物增强光合作用的叶面肥及其制备方法

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