JP2020515291A - 新規の昆虫阻害タンパク質 - Google Patents

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Abstract

鞘翅目及び鱗翅目害虫種に対して活性を呈する殺虫性タンパク質クラスが開示され、これはＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９を含むが、これらに限定されない。ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸配列を含有するＤＮＡ構築物が提供される。本発明のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸配列を含有する、鞘翅目及び鱗翅目の侵入に抵抗性があるトランスジェニック植物、植物細胞、種子、及び植物部位が提供される。生体試料中において本発明の組換え核酸配列またはタンパク質の存在を検出する方法、ならびにＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９殺虫性タンパク質を使用して鞘翅目及び鱗翅目種の害虫を防除する方法も提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の参照
本出願は、２０１７年４月３日出願の米国仮特許出願第６２／４８０，６１４号明細書の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表の組込み
コンピュータ可読形式の配列表を含有する「ＭＯＮＳ４４３ＷＯ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のファイルを、２０１８年４月２日に作成した。このファイルは６５３キロバイト（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であり、電子申請（米国特許庁ＥＦＳ−Ｗｅｂ出願システムを使用して）によって同時に出願され、その全体が参照によって本出願に組み込まれる。
本発明は、全般的に昆虫阻害タンパク質の分野に関する。作物及び種子の農業関連の害虫に対して昆虫阻害活性を呈する新規クラスのタンパク質が開示される。特に、開示されるタンパク質は、作物及び種子の農業関連の害虫、特に有害昆虫の鞘翅目及び鱗翅目の種に対して殺昆虫活性がある。開示される毒素タンパク質のうち１つ以上をコードする組換えポリヌクレオチド構築物を含有する植物、植物部位、及び種子が提供される。
とりわけトウモロコシ、ダイズ、サトウキビ、コメ、コムギ、野菜、及び綿を含む農業上重要な植物からの作物収量を改善することは、ますます重要になっている。増加する人口のための食用、衣料用及びエネルギー供給用の農産物に対するニーズの増大に加えて、気候関連の影響及び農作業以外で土地を使用する人口の増加による圧迫が、農業に利用できる耕作地の量を減少させると予測されている。これらの因子は、特に植物バイオテクノロジー及び農学の実践において大幅な改善がない状況で食糧安全保障に関する厳しい予測をもたらしている。これらの圧迫を踏まえると、技術、農業手法、及び害虫管理における環境的に持続可能な改善は、農業に利用できる限られた量の耕作地で作物生産を拡大するための不可欠なツールである。
昆虫、特にＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目及びＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ目内の昆虫は、農作物被害の主な原因と見られ、それによって蔓延した領域にわたって作物収量を低下させる。歴史的に、農業における害虫防除剤として合成化学殺昆虫剤の集中的散布に依存してきた。新たに出現している耐性の問題に加えて、環境及びヒトの健康に対する懸念が、生物学的殺虫剤の研究開発を促した。この研究努力によって、細菌を含む様々な昆虫病原性微生物種の発見及び使用が進んだ。
昆虫病原性細菌、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌の可能性が発見され、生物学的害虫防除剤として開発されると、生物学的防除のパラダイムがシフトした。細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）の株は、Ｂｔ株が特定の昆虫に対して高い毒性を示すことが発見されて以来、殺虫性タンパク質の供給源として使用されている。Ｂｔ株は、胞子形成の開始時及び定常増殖期中に副芽胞結晶封入体内に局在するデルタ−エンドトキシン（例えば、Ｃｒｙタンパク質）を産生することが知られていて、分泌殺昆虫性タンパク質を産生することも知られている。影響を受けやすい昆虫による摂取の時に、デルタ−エンドトキシンに加えて分泌毒素が中腸上皮の表面でそれらの効果を発揮し、細胞膜を破って細胞破壊及び細胞死をもたらす。殺昆虫性タンパク質をコードする遺伝子は、他のＢａｃｉｌｌｕｓならびに多様な追加の細菌種、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（以前はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓとして知られた「Ｌｓ」）及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅなどを含む、Ｂｔ以外の細菌種でも同定されている。
結晶性及び分泌可溶性の殺昆虫性毒素は、それらの宿主に高度に特異的であり、化学殺昆虫剤の代替物として世界中で広く受け入れられている。例えば、殺昆虫性毒素タンパク質は、様々な農業用途で用いられ、昆虫の侵入から農業上重要な植物を保護し、化学殺虫剤散布の必要性を減らして収量を増加させている。殺昆虫性毒素タンパク質は、機械的方法、例えば、様々な細菌株を含有する微生物製剤を植物表面上に分散させる噴霧などによって、ならびに殺昆虫性毒素タンパク質を発現しているトランスジェニック植物及び種子を作製する遺伝的形質転換手法を使用することによって、作物の農業関連の害虫を防除するために使用される。
殺昆虫性毒素タンパク質を発現しているトランスジェニック植物の使用は、世界中で適応されている。例えば、２０１２年には、２，６１０万ヘクタールにＢｔ毒素を発現しているトランスジェニック作物が植えられた（Ｊａｍｅｓ，Ｃ．，Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＭ Ｃｒｏｐｓ：２０１２．ＩＳＡＡＡ Ｂｒｉｅｆ Ｎｏ．４４）。トランスジェニック昆虫保護作物の世界的な使用及びこれらの作物に使用される限られた数の殺昆虫性毒素タンパク質は、現在利用されている殺昆虫性タンパク質に対して耐性を付与する既存の昆虫対立遺伝子に選択圧を作り出している。
殺昆虫性毒素タンパク質に対する標的害虫の耐性発現は、殺昆虫性毒素タンパク質を発現しているトランスジェニック作物に対する昆虫の耐性増加を管理するのに有用な、新しい形態の殺昆虫性毒素タンパク質の発見及び開発に対して継続的な必要性を生じさせる。有効性を改善し、より広範なスペクトラムの影響を受けやすい昆虫種に対して防除を呈する新しいタンパク質毒素は、耐性対立遺伝子を発生させ得る、生残する昆虫数を減少させることになる。加えて、同じ有害昆虫に対して毒性があり、異なる作用機序を示す２つ以上のトランスジェニック殺昆虫性毒素タンパク質の、１種の植物における使用は、任意の単一標的昆虫種における耐性の可能性を減少させる。
したがって、本発明者らは本明細書において、標的の鱗翅目及び鞘翅目に対して、特にウエスタンコーンルートワーム及びノーザンコーンルートワームに対して殺昆虫活性を呈するＢａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｏｕｓに由来する新規のタンパク質毒素ファミリーを、類似した毒素タンパク質、バリアントタンパク質、及び例示的な組換えタンパク質と共に開示する。
本明細書で開示されるのは、本明細書においてＴＩＣ７０４０関連タンパク質毒素と称され、作物の１つ以上の害虫に対して阻害活性を呈することが分かっている、昆虫阻害活性を有する殺虫性タンパク質（毒素タンパク質）の新規の群である。ＴＩＣ７０４０タンパク質及びＴＩＣ７０４０タンパク質毒素クラスのタンパク質は、製剤中で、かつ植物内において単独でまたは他の殺昆虫性タンパク質及び毒剤と組み合わせて使用されることにより、農業システムで現在使用されている殺昆虫性タンパク質及び殺昆虫剤化学物質に選択肢を提供し得る。
一実施形態では、本出願で開示されるのは、殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに機能的に連結される異種プロモーターを含む組換え核酸分子であり、（ａ）殺虫性タンパク質が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７のアミノ酸配列を含む、あるいは（ｂ）殺虫性タンパク質が、（ｉ）配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または（ｉｉ）配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または（ｉｉｉ）配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または（ｉｖ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または（ｖ）配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または（ｖｉ）配列番号：５３及び配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または（ｖｉｉ）配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、あるいは（ｃ）ポリヌクレオチドセグメントが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、または配列番号：１２６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする、あるいは（ｄ）組換え核酸分子が、ベクターと機能的に連結され、ベクターがプラスミド、ファージミド、バクミド、コスミド、及び細菌または酵母の人工染色体からなる群から選択される。組換え核酸分子は、植物中で殺虫性タンパク質を発現するように機能する、または植物細胞中で発現されて殺虫有効量の殺虫性タンパク質を産生する配列を含み得る。
本出願の別の実施形態では、宿主細胞は、本出願の組換え核酸分子を含み、宿主細胞は、細菌細胞及び植物細胞からなる群から選択される。検討される宿主細胞としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、及びＥｒｗｉｎｉａが挙げられる。特定の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓは、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｕｓであり、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。検討される植物宿主細胞としては、双子葉植物細胞及び単子葉植物細胞が挙げられる。さらに検討される植物宿主細胞としては、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ｃｉｔｒｕｓ、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ種）、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、エンバク、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ｓｏｒｇｈｕｍ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギの植物細胞が挙げられる。
さらに別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、ウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、メキシカンコーンルートワーム、ブラジリアンコーンルートワーム、コロラドハムシ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｉｄｕｌａ及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａからなるブラジリアンコーンルートワーム複合種、アブラナ科植物ノミハムシ、キスジノミハムシ、ならびにウエスタンブラックノミハムシを含む、鞘翅目昆虫に対して活性を呈する。
別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、ブラックカットワーム、コーンイヤーワーム、コナガ、ヨーロピアンコーンボーラー、フォールアーミーワーム、サザンアーミーワーム、ダイズシャクトリムシ、サウスウエスタンコーンボーラー、タバコバッドワーム、ベルベットビーンキャタピラー、シュガーケーンボーラー、レッサーコーンストークボーラー、ブラックアーミーワーム、ビートアーミーワーム、オールドワールドボールワーム、オリエンタルリーフワーム、またはピンクボールワームを含む、鱗翅目昆虫に対して活性を呈する。
本出願でさらに検討されるのは、殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに機能的に連結される異種プロモーターを含む組換え核酸分子を含む植物であり、（ａ）殺虫性タンパク質が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７のアミノ酸配列を含む、あるいは（ｂ）殺虫性タンパク質が、（ｉ）配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または（ｉｉ）配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または（ｉｉｉ）配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または（ｉｖ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または（ｖ）配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または（ｖｉ）配列番号：５３及び配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または（ｖｉｉ）配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、あるいは（ｃ）ポリヌクレオチドセグメントが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、または配列番号：１２６のヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズする、あるいは（ｄ）植物が、検出可能な量の殺虫性タンパク質を提示する。特定の実施形態では、殺虫性タンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７を含む。一実施形態では、植物は、単子葉植物または双子葉植物のいずれかである。別の実施形態では、植物は、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ｃｉｔｒｕｓ、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、エンバク、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ｓｏｒｇｈｕｍ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギからなる群から選択される。
さらなる実施形態では、組換え核酸分子を含む種子が開示される。
別の実施形態では、本出願で開示される組換え核酸分子を含む昆虫阻害組成物が検討される。昆虫阻害組成物は、殺虫性タンパク質とは異なる少なくとも１つの他の殺虫剤をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。少なくとも１つの他の殺虫剤は、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、及び補助タンパク質からなる群から選択される。昆虫阻害組成物中の少なくとも１つの他の殺虫剤は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目、またはＨｅｍｉｐｔｅｒａ目のうち１つ以上の害虫種に対して活性を呈する。昆虫阻害組成物中の少なくとも１つの他の殺虫剤は、一実施形態では、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃバリアント、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａバリアント、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ−ＡＸＭＩ−、ＡＸＭＩ−８８、ＡＸＭＩ−９７、ＡＸＭＩ−１０２、ＡＸＭＩ−１１２、ＡＸＭＩ−１１７、ＡＸＭＩ−１００、ＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、及びＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ−１５０、ＡＸＭＩ−１７１、ＡＸＭＩ−１８４、ＡＸＭＩ−１９６、ＡＸＭＩ−２０４、ＡＸＭＩ−２０７、ＡＸＭＩ−２０９、ＡＸＭＩ−２０５、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２２ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ、ＡＸＭＩ−２２４ｚ及びＡＸＭＩ−２２５ｚ、ＡＸＭＩ−２３８、ＡＸＭＩ−２７０、ＡＸＭＩ−２７９、ＡＸＭＩ−３４５、ＡＸＭＩ−３３５、ＡＸＭＩ−Ｒ１及びそのバリアント、ＩＰ３及びそのバリアント、ＤＩＧ−３、ＤＩＧ−５、ＤＩＧ−１０、ＤＩＧ−６５７、ＤＩＧ−１１、Ｃｒｙ７１Ａａ１、Ｃｒｙ７２Ａａ１、ＰＨＩ−４バリアント、ＰＩＰ−７２バリアント、ＰＩＰ−４５バリアント、ＰＩＰ−６４バリアント、ＰＩＰ−７４バリアント、ＰＩＰ−７５バリアント、ＰＩＰ−７７バリアント、Ａｘｍｉ４２２、Ｄｉｇ−３０５、Ａｘｍｉ４４０、ＰＩＰ−４７バリアント、Ａｘｍｉ２８１、ＢＴ−００９、ＢＴ−００１２、ＢＴ−００１３、ＢＴ−００２３、ＢＴ００６７、ＢＴ−００４４、ＢＴ−００５１、ＢＴ−００６８、ＢＴ−０１２８、ＤＩＧ−１７、ＤＩＧ−９０、ＤＩＧ−７９、Ｃｒｙ１ＪＰ５７８Ｖ、Ｃｒｙ１ＪＰＳ１、ならびにＣｒｙ１ＪＰＳ１Ｐ５７８Ｖからなる群から選択される。
本出願で開示される検出可能な量の組換え核酸分子を含む商品生産物が検討される。そのような商品生産物としては、穀物取扱業者によって袋詰めされる商品トウモロコシ、コーンフレーク、コーンケーキ、トウモロコシ粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンサイレージ、コーンスターチ、コーンシリアルなど、ならびに対応する綿商品生産物、例えば、綿実全体または加工綿実、綿実油、リント布、飼料または食料、繊維、紙、バイオマス用に加工される種子及び植物部位、ならびに燃料製品、例えば、綿実油に由来する燃料または綿繰り機廃棄物に由来するペレットなど、ならびに対応するダイズ商品生産物、例えば、ダイズ種子全体または加工ダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズ糠、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズを含む動物飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス、ならびにダイズ植物及びダイズ植物部位を使用して作製される燃料製品など、ならびに対応するコメ、コムギ、ｓｏｒｇｈｕｍ、キマメ、ピーナッツ、果実、メロン、ならびに該当する場合、ジュース、濃縮物、ジャム、ゼリー、マーマレードを含む野菜商品生産物、ならびに検出可能な量の本出願のそのようなポリヌクレオチド及びまたはポリペプチドを含有するそのような商品生産物の他の食用形態が挙げられる。
本出願でさらに検討されるのは、本出願で開示される組換え核酸分子を含む種子を作製する方法である。本方法は、本出願で開示される組換え核酸分子を含む種子のうち少なくとも１つを播種すること、種子に由来する植物を成長させること、及び植物から種子を収穫することを含み、収穫された種子が本出願の組換え核酸分子を含む。
別の例示的な実施形態では、昆虫の侵入に抵抗性がある植物が提供され、植物の細胞は、（ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７に記載されるような、殺昆虫有効量の殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸分子、あるいは（ｂ）（ｉ）配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または（ｉｉ）配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または（ｉｉｉ）配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または（ｉｖ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または（ｖ）配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または（ｖｉ）配列番号：５３及び配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または（ｖｉｉ）配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、殺昆虫有効量のタンパク質を含む。
本出願でさらに開示されるのは、鞘翅目種または鱗翅目種の害虫を防除する方法、及び植物、特に作物の鞘翅目種または鱗翅目種の害虫侵入を防除する方法である。本方法は、一実施形態では、（ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７に記載されるような、殺昆虫有効量の１つ以上の殺虫性タンパク質と害虫を接触させること、あるいは（ｂ）（ｉ）配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または（ｉｉ）配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または（ｉｉｉ）配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または（ｉｖ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または（ｖ）配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または（ｖｉ）配列番号：５３及び配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または（ｖｉｉ）配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、殺昆虫有効量の１つ以上の殺虫性タンパク質と害虫を接触させることを含む。
本明細書でさらに提供されるのは、殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む組換え核酸分子の存在を検出する方法であり、（ａ）殺虫性タンパク質が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７のアミノ酸配列を含む、あるいは（ｂ）殺虫性タンパク質が、（ｉ）配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または（ｉｉ）配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または（ｉｉｉ）配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または（ｉｖ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または（ｖ）配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または（ｖｉ）配列番号：５３及び配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または（ｖｉｉ）配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、あるいは（ｃ）ポリヌクレオチドセグメントが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、または配列番号：１２６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本発明の一実施形態では、本方法は、本明細書で提供される殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む植物のゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするが、そのセグメントを含まない別の同系植物のゲノムＤＮＡとはそのようなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない核酸プローブと核酸の試料を接触させることを含み、プローブは、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、または配列番号：１２６、あるいは（ｉ）配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または（ｉｉ）配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または（ｉｉｉ）配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または（ｉｖ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または（ｖ）配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または（ｖｉ）配列番号：５３及び配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または（ｖｉｉ）配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫性タンパク質をコードする配列に相同または相補的である。本方法は、（ａ）試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること、ならびに（ｂ）プローブと試料のＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出することをさらに含んでよい。
本発明によってさらに提供されるのは、タンパク質を含む試料中において殺虫性タンパク質またはその断片の存在を検出する方法であり、殺虫性タンパク質が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７のアミノ酸配列を含む、あるいは殺虫性タンパク質が、（ｉ）配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または（ｉｉ）配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または（ｉｉｉ）配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または（ｉｖ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または（ｖ）配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または（ｖｉ）配列番号：５３及び配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または（ｖｉｉ）配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本方法は、（ａ）試料を免疫反応性抗体と接触させること、及び（ｂ）タンパク質の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、検出するステップは、ＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロットを含む。
配列の簡単な説明
配列番号：１は、ＴＩＣ７０４０殺虫性タンパク質配列をコードする、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００５０１９から得られた核酸配列である。
配列番号：２は、ＴＩＣ７０４０タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：３は、ＴＩＣ７０４０ＨＴ殺虫性タンパク質配列をコードする、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００５０１９から得られた核酸配列である。
配列番号：４は、ＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：５は、ＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質と比較してＣ末端切断型を含むＴＩＣ７０４０＿４殺虫性タンパク質配列をコードする核酸配列である。
配列番号：６は、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸１〜６７１からなる、ＴＩＣ７０４０＿４タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：７は、ＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を含むＴＩＣ７０４０＿５殺虫性タンパク質配列をコードする核酸配列である。
配列番号：８は、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸１３〜６１１を含む、ＴＩＣ７０４０＿５タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：９は、ＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を含むＴＩＣ７０４０＿６殺虫性タンパク質配列をコードする核酸配列である。
配列番号：１０は、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸１３〜６７１を含む、ＴＩＣ７０４０＿６タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、ＴＩＣ７０４２殺虫性タンパク質配列をコードする、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００５９７３から得られた核酸配列である。
配列番号：１２は、ＴＩＣ７０４２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、ＴＩＣ７３８１殺虫性タンパク質配列をコードする、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００６７１３から得られた核酸配列である。
配列番号：１４は、ＴＩＣ７３８１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１５は、ＴＩＣ７３８２殺虫性タンパク質配列をコードする、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００７６５７から得られた核酸配列である。
配列番号：１６は、ＴＩＣ７３８２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１７は、ＴＩＣ７３８３殺虫性タンパク質配列をコードする、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００８１０６から得られた核酸配列である。
配列番号：１８は、ＴＩＣ７３８３タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１９は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端切断型を含むＴＩＣ７３８３＿２タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号：２０は、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１５〜１２５６を含む、ＴＩＣ７３８３＿２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：２１は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＣ末端切断型を含むＴＩＣ７３８３＿３タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号：２２は、ＴＩＣ７３８３＿３タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１〜６５９からなる。
配列番号：２３は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＣ末端切断型を含むＴＩＣ７３８３＿４タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号：２４は、ＴＩＣ７３８３＿４タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１〜６７９からなる。
配列番号：２５は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を含むＴＩＣ７３８３＿５タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号：２６は、ＴＩＣ７３８３＿５タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１５〜６５９を含む。
配列番号：２７は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を含むＴＩＣ７３８３＿６タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号：２８は、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１５〜６７９を含む、ＴＩＣ７３８３＿６タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：２９は、ＴＩＣ７３８６殺虫性タンパク質配列をコードする、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００７６５１から得られた核酸配列である。
配列番号：３０は、ＴＩＣ７３８６タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：３１は、ＴＩＣ７３８８殺虫性タンパク質配列をコードする、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００７９６２から得られた核酸配列である。
配列番号：３２は、ＴＩＣ７３８８タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：３３は、ＴＩＣ７３８９殺虫性タンパク質配列をコードする、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００６８７８から得られた核酸配列である。
配列番号：３４は、ＴＩＣ７３８９タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：３５は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０殺虫性タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：３６は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴ殺虫性タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：３７は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴ殺虫性タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：３である。
配列番号：３８は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴ殺虫性タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：４である。
配列番号：３９は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴ殺虫性タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：５である。
配列番号：４０は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴ殺虫性タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：６である。
配列番号：４１は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴ殺虫性タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：７である。
配列番号：４２は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するタンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：４３は、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸１５〜６５１を含む、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：４４は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を含むＴＩＣ７０４０＿６（配列番号：１０）殺虫性タンパク質配列をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：４５は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するタンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：４６は、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸１４〜６７１を含む、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：４７は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質と比較してＣ末端切断型を有するタンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：２である。
配列番号：４８は、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸１〜６６０からなる、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：４９は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質と比較してＣ末端切断型を有するタンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：５０は、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸１〜６２７からなる、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：５１は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４２タンパク質（配列番号：１２）をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：５２は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４２タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するタンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４２＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：５３は、ＴＩＣ７０４２のアミノ酸１１〜６４６を含む、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４２＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：５４は、植物細胞中での発現に使用されるＴＩＣ７０４２タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するタンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４２＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：５５は、ＴＩＣ７０４２のアミノ酸１１〜６６５を含む、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４２＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：５６は、植物細胞中での発現に使用され、ＴＩＣ７３８１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８１＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入される。
配列番号：５７は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８１＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が、ＴＩＣ７３８１タンパク質配列と比較して開始メチオニンの直後に挿入される。
配列番号：５８は、ＴＩＣ７３８２タンパク質をコードする、植物細胞中での発現に使用される合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入される。
配列番号：５９は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が、ＴＩＣ７３８１タンパク質配列と比較して開始メチオニンの直後に挿入される。
配列番号：６０は、ＴＩＣ７３８２タンパク質と比較してＣ末端切断型を含むＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、植物細胞中での発現に使用される合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入される。
配列番号：６１は、Ｃ末端欠失を含むＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が、ＴＩＣ７３８２タンパク質配列と比較して開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８２のアミノ酸１〜６５９を含む。
配列番号：６２は、植物細胞中での発現に使用され、ＴＩＣ７３８３タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入される。
配列番号：６３は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が、ＴＩＣ７３８３タンパク質配列と比較して開始メチオニンの直後に挿入される。
配列番号：６４は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を含むＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：６５は、Ｎ末端及びＣ末端欠失を含むＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が、ＴＩＣ７３８３タンパク質配列と比較して開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸５４〜６６８を含む。
配列番号：６６は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＣ末端切断型を含むＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿８．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿８．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：６７は、Ｃ末端欠失を含むＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿８．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が、ＴＩＣ７３８３タンパク質配列と比較して開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１〜６６１を含む。
配列番号：６８は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＣ末端切断型を含むＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿９．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿９．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：６９は、Ｃ末端欠失を含むＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿９．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が、ＴＩＣ７３８３タンパク質配列と比較して開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１〜６６８を含む。
配列番号：７０は、質量分析法によって決定されるようなＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質のトリプシンコア（ＴＩＣ７０４０ＨＴ＿Ｔｒｙｐ）をコードするコード配列である。
配列番号：７１は、質量分析法によって決定されるようなＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質のトリプシンコア（ＴＩＣ７０４０ＨＴ＿Ｔｒｙｐ）のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸４３〜６２４を含む。
配列番号：７２は、質量分析法によって決定されるようなＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質のキモトリプシンコア（ＴＩＣ７０４０ＨＴ＿Ｃｈｙｍｏ）をコードするコード配列である。
配列番号：７３は、質量分析法によって決定されるようなＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質のキモトリプシンコア（ＴＩＣ７０４０ＨＴ＿Ｃｈｙｍｏ）のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸４５〜６４１を含む。
配列番号：７４は、質量分析法によって決定されるようなＴＩＣ７３８３タンパク質のトリプシンコア（ＴＩＣ７３８３＿Ｔｒｙｐ）をコードするコード配列である。
配列番号：７５は、質量分析法によって決定されるようなＴＩＣ７３８３タンパク質のトリプシンコア（ＴＩＣ７３８３＿Ｔｒｙｐ）のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸５５〜６６８を含む。
配列番号：７６は、ＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１４．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１４．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：７７は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７０４０＿１４．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７０４０ＨＴのアミノ酸５２〜６６０を含む。
配列番号：７８は、ＴＩＣ７３８１タンパク質と比較してＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８１＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８１＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：７９は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８１＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８１のアミノ酸１〜６５８を含む。
配列番号：８０は、ＴＩＣ７３８１タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８１＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８１＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：８１は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８１＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣＴＩＣ７３８１のアミノ酸５０〜６５８を含む。
配列番号：８２は、ＴＩＣ７３８２タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：８３は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８２のアミノ酸５２〜６５９を含む。
配列番号：８４は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿１９．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿１９．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：８５は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿１９．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１５〜６６８を含む。
配列番号：８６は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：８７は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１５〜６６１を含む。
配列番号：８８は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：８９は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸５４〜６６１を含む。
配列番号：９０は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：９１は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸５４〜６６８を含む。
配列番号：９２は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：９３は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸５４〜６６１を含む。
配列番号：９４は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２４．ｎｎｏ＿Ｍｃ：２タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２４．ｎｎｏ＿Ｍｃ：２であり、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：９５は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２４．ｎｎｏ＿Ｍｃ：２タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸７３〜６６１を含む。
配列番号：９６は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２５．ｎｎｏ＿Ｍｃ：３タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２５．ｎｎｏ＿Ｍｃ：３であり、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：９７は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２５．ｎｎｏ＿Ｍｃ：３タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸９４〜６６１を含む。
配列番号：９８は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：９９は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１１４〜６６１を含む。
配列番号：１００は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：１０１は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸５４〜６５８を含む。
配列番号：１０２は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＮ末端及びＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２８．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２８．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：１０３は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２８．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１５〜６５８を含む。
配列番号：１０４は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２９．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２９．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：１０５は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿２９．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３のアミノ酸１〜９６３を含む。
配列番号：１０６は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿３０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿３０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３と比較してアミノ酸位置９６４、９６６、及び９６８に対応するコドンに変異を含み、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：１０７は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿３０．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３と比較して変異Ｋ９６４Ａ、Ｒ９６６Ａ、Ｋ９６８Ａを含む。
配列番号：１０８は、ＴＩＣ７３８３タンパク質と比較してＣ末端切断型を有するＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿３１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿３１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３と比較してアミノ酸位置９６４、９６６、及び９６８に対応するコドンに変異を含み、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：１０９は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿３１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、アミノ酸１〜１０６５を含み、ＴＩＣ７３８３と比較して変異Ｋ９６４Ａ、Ｒ９６６Ａ、Ｋ９６８Ａも含む。
配列番号：１１０は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿３２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質をコードする、合成コード配列ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿３２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１であり、追加のアラニンコドンが開始メチオニンコドンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３と比較してアミノ酸位置９６４〜９６９に対応するコドンの欠失を含み、配列は植物細胞中での発現に使用される。
配列番号：１１１は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿３２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１タンパク質のアミノ酸配列であり、追加のアラニンアミノ酸が開始メチオニンの直後に挿入され、ＴＩＣ７３８３と比較してアミノ酸９６４〜９６９の欠失を含む。
配列番号：１１２は、ＴＩＣ７３８３のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７０４２のドメイン３で構成されるＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質をコードする、合成コード配列ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：１１３は、ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１１４は、ＴＩＣ７３８３のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８１のドメイン３で構成されるＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４４．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質をコードする、合成コード配列ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４４．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：１１５は、ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４４．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１１６は、ＴＩＣ７３８３のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８２のドメイン３で構成されるＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４５．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質をコードする、合成コード配列ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４５．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：１１７は、ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４５．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１１８は、ＴＩＣ７３８２のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成されるＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質をコードする、合成コード配列ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：１１９は、ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１２０は、ＴＩＣ７３８１のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成されるＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質をコードする、合成コード配列ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：１２１は、ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１２２は、ＴＩＣ７０４２のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成されるＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４８．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質をコードする、合成コード配列ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４８．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１である。
配列番号：１２３は、ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４８．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１キメラタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１２４は、ＴＩＣ７３８２のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成され、ＴＩＣ７３８２に由来するＮ末端延長ペプチドも含むＴＩＣ１０７６４ＮＴｅｒｍＥｘｔ１キメラタンパク質をコードする、合成コード配列ＴＩＣ１０７６４ＮＴｅｒｍＥｘｔ１である。ＴＩＣ７３８２のＮ末端延長は、ＴＩＣ７３８２毒素タンパク質のアミノ酸１〜５１を含み、ＴＩＣ７３８２コード配列の先頭の１５３ヌクレオチドによってコードされる。
配列番号：１２５は、ＴＩＣ１０７６４ＮＴｅｒｍＥｘｔ１キメラタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：１２６は、ＴＩＣ７３８２のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成され、ＴＩＣ７３８３に由来するＮ末端延長ペプチドも含むＴＩＣ１０７６４ＮＴｅｒｍＥｘｔ２キメラタンパク質をコードする、合成コード配列ＴＩＣ１０７６４ＮＴｅｒｍＥｘｔ２である。ＴＩＣ７３８３のＮ末端延長は、ＴＩＣ７３８３毒素タンパク質のアミノ酸１〜５３を含み、ＴＩＣ７３８３コード配列の先頭の１５９ヌクレオチドによってコードされる。
配列番号：１２７は、ＴＩＣ１０７６４ＮＴｅｒｍＥｘｔ２キメラタンパク質のアミノ酸配列である。
農業の害虫防除の技術分野における問題は、標的害虫に対して有効であり、標的害虫種に対して広範なスペクトラムの毒性を呈し、望ましくない農業問題を引き起こすことなく植物中で発現させることができ、植物で商業的に使用されている現在の毒素と比較して代替作用機序を提供する新しい毒素タンパク質の必要性として特徴付けられ得る。
鞘翅目及び鱗翅目の有害昆虫に対して、より具体的にはコーンルートワーム害虫種に対して抵抗性を提供するＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９ならびに関連ファミリーメンバーによって例示される、新規の殺昆虫性タンパク質クラスが開示される。さらに開示されるのは、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３関連ファミリーメンバーを、ＴＩＣ７０４０毒素クラスにおけるタンパク質のＮ末端及びＣ末端切断型バリアントならびにキメラと共にコードする、植物細胞中での発現のために設計される合成コード配列である。さらに開示されるのは、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、もしくはＴＩＣ７３８９毒素タンパク質、または関連ファミリーメンバー、あるいはその断片をコードするコード配列に機能的に連結されるプロモーターを含む組換え核酸分子である。
本出願におけるＴＩＣ７０４０、「ＴＩＣ７０４０タンパク質」、「ＴＩＣ７０４０タンパク質毒素」、「ＴＩＣ７０４０毒素タンパク質」、「ＴＩＣ７０４０殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ７０４０関連毒素」、または「ＴＩＣ７０４０関連毒素タンパク質」などへの言及は、鞘翅目害虫または鱗翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ７０４０（配列番号：２）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質配列及びその殺虫もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組合せを含む、それらからなる、それらに実質的に相同である、それらに類似している、またはそれらに由来する、任意の新規殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指し、殺虫活性または昆虫阻害活性を呈する任意のタンパク質とＴＩＣ７０４０とのアラインメントが、約９０〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、そのようなタンパク質を含む。
本出願におけるＴＩＣ７０４０ＨＴ、「ＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質」、「ＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質毒素」、「ＴＩＣ７０４０ＨＴ毒素タンパク質」、「ＴＩＣ７０４０ＨＴ殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ７０４０ＨＴ関連毒素」、または「ＴＩＣ７０４０ＨＴ関連毒素タンパク質」などへの言及は、鞘翅目害虫または鱗翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ７０４０ＨＴ（配列番号：４）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質配列及びその殺虫もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組合せを含む、それらからなる、それらに実質的に相同である、それらに類似している、またはそれらに由来する、任意の新規殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指し、殺虫活性または昆虫阻害活性を呈する任意のタンパク質とＴＩＣ７０４０ＨＴとのアラインメントが、約９０〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、そのようなタンパク質を含む。
本出願におけるＴＩＣ７０４２、「ＴＩＣ７０４２タンパク質」、「ＴＩＣ７０４２タンパク質毒素」、「ＴＩＣ７０４２毒素タンパク質」、「ＴＩＣ７０４２殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ７０４２関連毒素」、または「ＴＩＣ７０４２関連毒素タンパク質」などへの言及は、鞘翅目害虫または鱗翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ７０４２（配列番号：１２）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質配列及びその殺虫もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組合せを含む、それらからなる、それらに実質的に相同である、それらに類似している、またはそれらに由来する、任意の新規殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指し、殺虫活性または昆虫阻害活性を呈する任意のタンパク質とＴＩＣ７０４２とのアラインメントが、約９３〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、そのようなタンパク質を含む。
本出願におけるＴＩＣ７３８１、「ＴＩＣ７３８１タンパク質」、「ＴＩＣ７３８１タンパク質毒素」、「ＴＩＣ７３８１毒素タンパク質」、「ＴＩＣ７３８１殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ７３８１関連毒素」、または「ＴＩＣ７３８１関連毒素タンパク質」などへの言及は、鞘翅目害虫または鱗翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ７３８１（配列番号：１４）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質配列及びその殺虫もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組合せを含む、それらからなる、それらに実質的に相同である、それらに類似している、またはそれらに由来する、任意の新規殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指し、殺虫活性または昆虫阻害活性を呈する任意のタンパク質とＴＩＣ７３８１とのアラインメントが、約９０〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、そのようなタンパク質を含む。
本出願におけるＴＩＣ７３８２、「ＴＩＣ７３８２タンパク質」、「ＴＩＣ７３８２タンパク質毒素」、「ＴＩＣ７３８２毒素タンパク質」、「ＴＩＣ７３８２殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ７３８２関連毒素」、または「ＴＩＣ７３８２関連毒素タンパク質」などへの言及は、鞘翅目害虫または鱗翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ７３８２（配列番号：１６）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質配列及びその殺虫もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組合せを含む、それらからなる、それらに実質的に相同である、それらに類似している、またはそれらに由来する、任意の新規殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指し、殺虫活性または昆虫阻害活性を呈する任意のタンパク質とＴＩＣ７３８２とのアラインメントが、約９３〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、そのようなタンパク質を含む。
本出願におけるＴＩＣ７３８３、「ＴＩＣ７３８３タンパク質」、「ＴＩＣ７３８３タンパク質毒素」、「ＴＩＣ７３８３毒素タンパク質」、「ＴＩＣ７３８３殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ７３８３関連毒素」、または「ＴＩＣ７３８３関連毒素タンパク質」などへの言及は、鞘翅目害虫または鱗翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ７３８３（配列番号：１８）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質配列及びその殺虫もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組合せを含む、それらからなる、それらに実質的に相同である、それらに類似している、またはそれらに由来する、任意の新規殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指し、殺虫活性または昆虫阻害活性を呈する任意のタンパク質とＴＩＣ７３８３とのアラインメントが、約７５〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、そのようなタンパク質を含む。
本出願におけるＴＩＣ７３８６、「ＴＩＣ７３８６タンパク質」、「ＴＩＣ７３８６タンパク質毒素」、「ＴＩＣ７３８６毒素タンパク質」、「ＴＩＣ７３８６殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ７３８６関連毒素」、または「ＴＩＣ７３８６関連毒素タンパク質」などへの言及は、鞘翅目害虫または鱗翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ７３８６（配列番号：３０）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質配列及びその殺虫もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組合せを含む、それらからなる、それらに実質的に相同である、それらに類似している、またはそれらに由来する、任意の新規殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指し、殺虫活性または昆虫阻害活性を呈する任意のタンパク質とＴＩＣ７３８６とのアラインメントが、約７５〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、そのようなタンパク質を含む。
本出願におけるＴＩＣ７３８８、「ＴＩＣ７３８８タンパク質」、「ＴＩＣ７３８８タンパク質毒素」、「ＴＩＣ７３８８毒素タンパク質」、「ＴＩＣ７３８８殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ７３８８関連毒素」、または「ＴＩＣ７３８８関連毒素タンパク質」などへの言及は、鞘翅目害虫または鱗翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ７３８８（配列番号：３２）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質配列及びその殺虫もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組合せを含む、それらからなる、それらに実質的に相同である、それらに類似している、またはそれらに由来する、任意の新規殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指し、殺虫活性または昆虫阻害活性を呈する任意のタンパク質とＴＩＣ７３８８とのアラインメントが、約９９〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、そのようなタンパク質を含む。
本出願におけるＴＩＣ７３８９、「ＴＩＣ７３８９タンパク質」、「ＴＩＣ７３８９タンパク質毒素」、「ＴＩＣ７３８９毒素タンパク質」、「ＴＩＣ７３８９殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ７３８９関連毒素」、または「ＴＩＣ７３８９関連毒素タンパク質」などへの言及は、鞘翅目害虫または鱗翅目害虫に対する活性を付与するＴＩＣ７３８９（配列番号：３４）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質配列及びその殺虫もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組合せを含む、それらからなる、それらに実質的に相同である、それらに類似している、またはそれらに由来する、任意の新規殺虫性タンパク質または昆虫阻害タンパク質を指し、殺虫活性または昆虫阻害活性を呈する任意のタンパク質とＴＩＣ７３８９とのアラインメントが、約９０〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、そのようなタンパク質を含む。
「セグメント」または「断片」という用語は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、もしくはＴＩＣ７３８９タンパク質または関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質について記載する完全アミノ酸または核酸配列よりも短い連続アミノ酸または核酸配列について記載するために本出願で使用される。特定の実施形態では、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、またはＴＩＣ７３８９タンパク質の断片が提供され、本明細書に開示されるような殺昆虫活性を有するタンパク質の少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約８５０、少なくとも約９００、少なくとも約９５０、少なくとも約１０００、少なくとも約１０５０、少なくとも約１１００、少なくとも約１１５０、少なくとも約１２００、少なくとも約１２５０、少なくとも約１３００、もしくは少なくとも約１３５０連続アミノ酸、またはそれを超えて含む。特定の実施形態では、本発明は、全長配列の活性を有する、本明細書で提供されるタンパク質の断片を提供する。出発分子からそのような断片を作製する方法は、当該技術分野において周知である。
昆虫阻害活性を呈するセグメントまたは断片はまた、そのようなセグメントまたは断片と、配列番号：２、４、１２、１４、１６、１８、２０、３０、３２、及び３４に記載されるＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、またはＴＩＣ７３８９タンパク質の対応する区間とのアラインメントが、セグメントもしくは断片とＴＩＣ７３８３及びＴＩＣ７３８６タンパク質の対応する区間との間で約７５〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をもたらす場合、またはセグメントもしくは断片とＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７３８１、及びＴＩＣ７３８９タンパク質の対応する区間との間で約９０〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をそれぞれもたらす場合、またはセグメントもしくは断片とＴＩＣ７０４２及びＴＩＣ７３８２タンパク質の対応する区間との間で約９３〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をそれぞれもたらす場合、またはセグメントもしくは断片とＴＩＣ７３８８タンパク質の対応する区間との間で約９９〜約１００パーセントの任意の部分パーセンテージであるアミノ酸配列同一性をそれぞれもたらす場合、本出願で開示される。
本出願における「活性がある」または「活性」、「殺虫活性」または「殺虫性」または「殺昆虫活性」、「昆虫阻害」または「殺昆虫性」という用語への言及は、害虫を阻害すること（増殖、摂食、繁殖力、もしくは生存能力を阻害すること）、抑制すること（増殖、摂食、繁殖力、もしくは生存能力を抑制すること）、防除すること（有効量のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、もしくはＴＩＣ７３８９タンパク質もしくは関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質を含有する特定の作物に対して害虫侵入を防除すること、害虫の摂食活動を防除すること）、または死滅させること（害虫の病的状態、大量死、もしくは繁殖力の減少を引き起こすこと）における、タンパク質毒素などの毒剤の有効性を指す。これらの用語は、殺虫有効量の毒性タンパク質を害虫に提供することの結果を含むことを意図し、毒性タンパク質への害虫の曝露が、病的状態、大量死、繁殖力の減少、または成長阻害をもたらす。これらの用語は、殺虫有効量の毒性タンパク質を植物中にまたは植物上に提供することの結果として、植物、植物の組織、植物部位、種子、植物細胞からの、または植物が成長する可能性がある特定の地理的位置からの、害虫の撃退も含む。一般に、殺虫活性は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目またはＨｅｍｉｐｔｅｒａ目の昆虫を含むが、これらに限定されない特定の標的害虫の、毒性タンパク質、タンパク質断片、タンパク質セグメントまたはポリヌクレオチドの昆虫摂食によって引き起こされる増殖、発達、生存能力、摂食行動、交尾行動、繁殖力を阻害すること、または有害作用のあらゆる測定可能な低減に効果的な毒性タンパク質の能力を指す。毒性タンパク質は、植物によって産生され得る、または植物に、もしくは植物が位置している位置内の環境に適用され得る。「生物活性」、「効果的な」、「有効な」という用語またはその変化形は、標的有害昆虫に対する本発明のタンパク質の効果について記載するために本出願では同じ意味として利用される用語でもある。
殺虫有効量の毒剤は、標的害虫の食餌中に提供される場合、毒剤が害虫と接触する時に殺虫活性を呈する。毒剤は、殺虫性タンパク質または当該技術分野において既知の１つ以上の化学薬剤であり得る。殺虫性または殺昆虫性化学薬剤及び殺虫性または殺昆虫性タンパク質剤は、単独でまたは互いに組み合わせて使用され得る。化学薬剤としては、標的害虫における抑制のために特定の遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子、有機塩化物、有機リン酸エステル、カルバメート、ピレスロイド、ネオニコチノイド、及びリアノイドが挙げられるが、これらに限定されない。殺虫性または殺昆虫性タンパク質剤としては、本出願に記載されるタンパク質毒素、加えて鱗翅目及び鞘翅目の害虫種を標的とするものを含む他のタンパク質性毒剤、加えて同翅目または半翅目種の防除に使用するための当該技術分野で利用可能なＣｒｙタンパク質などの、他の植物害虫を防除するために使用されるタンパク質毒素が挙げられる。
害虫、特に作物の害虫への言及は、作物の有害昆虫、特にＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、もしくはＴＩＣ７３８９タンパク質または関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質によって防除されるものを意味することを意図する。害虫への言及はまた、これらの害虫を標的とする毒剤が、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９タンパク質もしくは関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質、またはＴＩＣ７３８３及びＴＩＣ７３８６と約７５〜約１００パーセント同一であるタンパク質、またはＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７３８１、及びＴＩＣ７３８９と約９０〜約１００パーセント同一であるタンパク質、またはＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８６、及びＴＩＣ７３８２と約９３〜約１００パーセント同一であるタンパク質、またはＴＩＣ７３８８と約９９〜約１００パーセント同一であるタンパク質と共局在化または共存する場合、植物の同翅目及び半翅目の有害昆虫、加えて線虫及び真菌も含み得る。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９及び関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質は、成虫、蛹、幼虫、及び子虫を含む、鞘翅目及び鱗翅目昆虫種の有害昆虫に対して殺昆虫活性を呈する。
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫としては、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ科のアーミーワーム、カットワーム、シャクトリムシ、及びヘリオサイン（ｈｅｌｉｏｔｈｉｎｅ）、例えば、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ビートアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ブラックアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｅｍｐｔａ）、バーサアーミーワーム（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ブラックカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、キャベツシャクトリムシ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーワーム（Ｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、グラニュレートカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、アーミーワーム（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、ウエスタンカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）、Ｐｙｒａｌｉｄａｅ科の穿孔虫、繭を作る昆虫、ウェブワーム、コーンワーム、アオムシ及び葉を食い荒らす幼虫、例えば、ヨーロピアンコーンボーラー（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ネーブルオレンジワーム（Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、コーンルートウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ソドウェブワーム（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、サンフラワーモス（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、レッサーコーンストークボーラー（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ科のハマキムシ、バッドワーム、シードワーム、及びフルーツワーム、例えば、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、グレープベリーモス（Ｅｎｄｏｐｉｚａ ｖｉｔｅａｎａ）、オリエンタルフルーツモス（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）、サンフラワーバッドモス（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）、ならびに多くの他の経済的に重要なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、例えば、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ピンクボールワーム（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）及びマイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目のその他の有害昆虫としては、例えば、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、フルーツツリーリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ）、ヨーロピアンリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ｒｏｓａｎａ）及び他のＡｒｃｈｉｐｓ種、（Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、アジアチックライスボーラー、またはライスステムボーラー）、ライスリーフローラー（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）、コーンルートウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ブルーグラスウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ）、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、シュガーケーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、スピニーボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｉｎｓｕｌａｎａ）、スポッテドボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ）、オールドワールドボールワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、コーンイヤーワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、ダイズポッドワーム及びコットンボールワームとしても知られる）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、ヨーロピアングレープバインモス（Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ）、ミカンハモグリガ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ）、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ、輸入アオムシとしても知られる）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、クラスターキャタピラーとしても知られる）、ならびにトマトハモグリバエ（Ｔｕｔａ ａｂｓｏｌｕｔａ）が挙げられる。
Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目の昆虫としては、Ａｇｒｉｏｔｅｓ種、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ種、Ａｔｏｍａｒｉａ ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｔｉｂｉａｌｉｓ、Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ種、Ｃｕｒｃｕｌｉｏ種、Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ種、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種、Ｅｐｉｌａｃｈｎａ種、Ｅｒｅｍｎｕｓ種、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ種、Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ種、Ｏｒｙｃａｅｐｈｉｌｕｓ種、Ｏｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ種、Ｐｈｌｙｃｔｉｎｕｓ種、Ｐｏｐｉｌｌｉａ種、Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ種、Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ種、Ｓｃａｒａｂｅｉｄａｅ、Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ種、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ種、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ種及びＴｒｏｇｏｄｅｒｍａ種、特に害虫が、ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、ＮＣＲ）、メキシカンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ、ＭＣＲ）、ブラジリアンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｌｔｅａｔａ、ＢＺＲ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉｉ、ＳＣＲ）、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ＣＰＢ）、ブラジリアンコーンルートワーム複合種（ＢＣＲ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｉｄｕｌａ及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａからなる）、アブラナ科植物ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、キスジノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｔｒｉｏｌａｔａ）、ならびにウエスタンブラックノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｐｕｓｉｌｌａ）である場合が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目の昆虫としては、Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ科のカメムシ：Ｃｈｉｎａｖｉａ属のアオカメムシ（Ｃｈｉｎａｖｉａ ｈｉｌａｒｉｓ、Ｃｈｉｎａｖｉａ ｍａｒｇｉｎａｔａ、及びＣｈｉｎａｖｉａ ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ属のカメムシ（Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｇｒａｎｕｌｏｓｅ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｋａｎｅｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｌｉｇａｔａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｌｉｎｅａｔｅ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｒｏｓｓｉａｎａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｓａｙｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｕｈｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｂｅｌｆｒａｇｉｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｆａｃｅｔａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｏｓｂｏｒｎｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｓａｕｃｉａ、及びＣｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｓｅｎｉｌｉｓ）、ミナミアオカメムシ（Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ）、Ｅｄｅｓｓａ属のカメムシ（Ｅｄｅｓｓａ ｍｅｄｉｔａｂｕｎｄａ、Ｅｄｅｓｓａ ｂｉｆｉｄａ、及びＥｄｅｓｓａ ｆｌｏｒｉｄａ）、ネオトロピカルチャイロカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ属のカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｃｏｎｓｐｅｒｓｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｃｒｅｎａｔｏｒ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｅｇｇｌｅｓｔｏｎｉ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｉｃｔｅｒｉｃｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｉｎｆｌａｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｌａｔｉｍａｒｇｉｎａｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｏｂｓｃｕｒｅｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｐｏｌｉｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｑｕａｄｒａｔｏｒ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｖｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｔｒｅｎｕｏｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｔｒｉｓｔｉｇｍｕｓ、及びＥｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｖａｒｉｏｌａｒｉｕｓ）、クサギカメムシ（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ ｈａｌｙｓ）、レッドショルダードカメムシ（Ｔｈｙａｎｔａ ａｃｃｅｒｒａ）、Ｔｈｙａｎｔａ属のカメムシ（Ｔｈｙａｎｔａ ｃａｌｃｅａｔａ、Ｔｈｙａｎｔａ ｃｕｓｔａｔｏｒ、Ｔｈｙａｎｔａ ｐａｌｌｉｄｏｖｉｒｅｎｓ、Ｔｈｙａｎｔａ ｐｅｒｄｉｔｏｒ、Ｔｈｙａｎｔａ ｍａｃｕｌａｔｅ、及びＴｈｙａｎｔａ ｐｓｅｕｄｏｃａｓｔａ）、グリーンベリーカメムシ（Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｍｅｌａｃａｎｔｈｕｓ）ならびにＤｉｃｈｅｌｏｐｓ属のその他のカメムシ（Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ａｖｉｌａｐｉｒｅｓｉ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｄｉｍｉｄａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｆｕｒｃａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｆｕｒｃｉｆｒｏｎｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｌｏｂａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｍｉｒｉａｍａｅ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｎｉｇｒｕｍ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｐｅｒｕａｎｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｐｈｏｅｎｉｘ、及びＤｉｃｈｅｌｏｐｓ ｓａｌｔｅｎｓｉｓ）、レッドバンデッドカメムシ（Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ ｇｕｉｌｄｉｎｎｉ）に加えてＰｉｅｚｏｄｏｒｕｓ ｌｉｔｕｒａｔｕｓ、ならびにタイワンマルカメムシ（Ｍｅｇａｃｏｐｔａ ｃｒｉｂｒａｒｉａ）などのＰｌａｔａｓｐｉｄａｅ科の昆虫、ウエスタンサビイロカスミカメムシ（Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、及びサビイロカスミカメムシ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本出願における「単離されたＤＮＡ分子」、または同等の用語もしくは語句への言及は、ＤＮＡ分子が単独でまたは他の組成物と組み合わせて存在するが、その自然環境内には存在しないものであることを意味することを意図する。例えば、核酸エレメント、例えば、生物ゲノムのＤＮＡ内で天然に見出される、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列などは、そのエレメントが生物のゲノム内にあり、かつそれが天然に見出されるゲノム内の位置にある限り、「単離されている」とは見なされない。しかしながら、これらのエレメントの各々、及びこれらのエレメントの下位区分が、そのエレメントが生物のゲノム内に存在せず、かつそれが天然に見出されるゲノム内の位置に存在しないのであれば、本開示の範囲内で「単離されている」ことになる。同様に、殺昆虫性タンパク質またはそのタンパク質の任意の天然に存在する殺昆虫性バリアントをコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列が、そのタンパク質をコードする配列が天然に見出される細菌のＤＮＡ内に存在しなかったのであれば、単離されたヌクレオチド配列であるということになる。天然に存在する殺昆虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的では単離されていると見なされることとする。本開示の目的では、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノム中に挿入される、または染色体外ベクター中に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、細胞を形質転換するために使用されるプラスミドもしくは類似した構造体内に存在するか、植物もしくは細菌のゲノム内に存在するか、または植物もしくは細菌に由来する組織、子孫、生体試料もしくは商品生産物中に検出可能な量で存在する場合も、単離されたヌクレオチド配列であると見なされることとする。
本明細書でさらに記載される通り、ＴＩＣ７０４０をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号：１）は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００５０１９から得られたＤＮＡ中で発見されたものであり、それは配列番号：２として提示されるタンパク質毒素をコードする。ＴＩＣ７０４０ＯＲＦから設計したプライマーを使用した増幅時に、わずかに長いコード配列が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００５０１９から得られたＤＮＡを使用して増幅され、本明細書ではＴＩＣ７０４０ＨＴ（配列番号：３）と称され、それは配列番号：４として提示されるタンパク質をコードする。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７０４０ＨＴタンパク質を使用したバイオアッセイは、鞘翅目害虫のウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）、Ｃｒｙ３Ｂｂ耐性ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲＨＰ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、ＮＣＲ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉｉ、ＳＣＲ）、及びコロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ＣＰＢ）、ならびに鱗翅目有害昆虫のコーンイヤーワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、（ＣＥＷ）ダイズポッドワーム及びコットンボールワームとしても知られる）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、ＤＢＭ）、ヨーロピアンコーンボーラー（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、ＥＣＢ）、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ＦＡＷ）、ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、ＳＢＬ）、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、ＳＷＣＢ）、及びベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、ＶＢＣ）に対する活性を実証した。
本明細書でさらに記載される通り、ＴＩＣ７０４２をコードするＯＲＦ（配列番号：１１）は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００５９７３から得られたＤＮＡ中で発見されたものであり、それは配列番号：１２として提示されるタンパク質毒素をコードする。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７０４２タンパク質を使用したバイオアッセイは、鞘翅目害虫のＷＣＲ、ＷＣＲＨＰ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＣＰＢ、ならびに鱗翅目有害昆虫のＢＣＷ、ＣＥＷ、ＤＢＭ、ＦＡＷ、ＳＢＬ、及びＶＢＣに対する活性を実証した。
本明細書でさらに記載される通り、ＴＩＣ７３８１をコードするＯＲＦ（配列番号：１３）は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００６７１３から得られたＤＮＡ中で発見されたものであり、それは配列番号：１４として提示されるタンパク質毒素をコードする。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７３８１タンパク質を使用したバイオアッセイは、鞘翅目害虫のＷＣＲ、ＷＣＲＨＰ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＣＰＢ、ならびに鱗翅目有害昆虫のＣＥＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、ＳＢＬ、ＳＷＣＢ、及びＶＢＣに対する活性を実証した。
本明細書でさらに記載される通り、ＴＩＣ７３８２をコードするＯＲＦ（配列番号：１５）は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００７６５７から得られたＤＮＡ中で発見されたものであり、それは配列番号：１６として提示されるタンパク質毒素をコードする。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７３８２タンパク質を使用したバイオアッセイは、鞘翅目害虫のＷＣＲ、ＷＣＲＨＰ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＣＰＢ、ならびに鱗翅目有害昆虫のＤＢＭ、ＥＣＢ、ＳＢＬ、ＳＷＣＢ、及びＶＢＣに対する活性を実証した。
本明細書でさらに記載される通り、ＴＩＣ７３８３をコードするＯＲＦ（配列番号：１７）は、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００８１０６から得られたＤＮＡ中で発見されたものであり、それは配列番号：１８として提示されるタンパク質毒素をコードする。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７３８３タンパク質を使用したバイオアッセイは、鞘翅目害虫のＷＣＲ、ＷＣＲＨＰ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＣＰＢ、ならびに鱗翅目有害昆虫のＣＥＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、及びＶＢＣに対する活性を実証した。
本明細書でさらに記載される通り、ＴＩＣ７３８６（配列番号：２９）、ＴＩＣ７３８８（配列番号：３１）、及びＴＩＣ７３８９（配列番号：３３）をコードするＯＲＦは、それぞれＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株ＤＳＣ００７６５１、ＤＳＣ００７９６２、及びＤＳＣ００６８７８から得られたＤＮＡ中で発見されたものであり、それらは配列番号：３０、配列番号３２、及び配列番号：３４として本明細書に提示されるタンパク質をコードする。微生物宿主細胞由来のＴＩＣ７３８９タンパク質を使用したバイオアッセイは、鱗翅目有害昆虫のＳＢＬならびに鞘翅目害虫のＷＣＲ及びＣＰＢに対する活性を実証した。
本明細書でさらに記載されるには、ＴＩＣ７０４０ＨＴのキモトリプシン及びトリプシン消化物、ならびにＴＩＣ７３８３のトリプシン消化物は、全長ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３と比較して、ＷＣＲに対する活性を維持した。加えて、ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３の切断型は、全長ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３と比較して、ＷＣＲ及びＣＰＢに対する活性を維持し、いくつかの場合には活性を増加させた。
本明細書でさらに記載されるのは、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７０４２に由来するドメインで構成されるキメラ毒素である。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４３（配列番号：１１３、配列番号：１１２によってコードされる）は、ＴＩＣ７３８３のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７０４２のドメイン３で構成される。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４４（配列番号：１１５、配列番号：１１４によってコードされる）は、ＴＩＣ７３８３のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８１のドメイン３で構成される。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４５（配列番号：１１７、配列番号：１１６によってコードされる）は、ＴＩＣ７３８３のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８２のドメイン３で構成される。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４６（配列番号：１１９、配列番号：１１８によってコードされる）は、ＴＩＣ７３８２のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成される。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４７（配列番号：１２１、配列番号：１２０によってコードされる）は、ＴＩＣ７３８１のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成される。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４８（配列番号：１２３、配列番号：１２２によってコードされる）は、ＴＩＣ７０４２のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成される。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４６ＮＴｅｒｍＥｘｔ１（配列番号：１２５、配列番号：１２４によってコードされる）は、ＴＩＣ７３８２のドメイン１及び２、ＴＩＣ７３８３のドメイン３、ならびにＴＩＣ７３８２のＮ末端延長で構成される。ＴＩＣ７３８２のＮ末端延長は、ＴＩＣ７３８２毒素タンパク質のアミノ酸１〜５１を含み、ＴＩＣ７３８２コード配列の先頭の１５３ヌクレオチドによってコードされる。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４６ＮＴｅｒｍＥｘｔ２（配列番号：１２７、配列番号：１２６によってコードされる）は、ＴＩＣ７３８２のドメイン１及び２、ＴＩＣ７３８３のドメイン３、ならびにＴＩＣ７３８３のＮ末端延長で構成される。ＴＩＣ７３８３のＮ末端延長は、ＴＩＣ７３８３毒素タンパク質のアミノ酸１〜５３を含み、ＴＩＣ７３８３コード配列の先頭の１５９ヌクレオチドによってコードされる。
植物細胞中での発現について、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３、またはそのバリアント、切断型バリアント、もしくはキメラは、サイトゾル中に存在するように発現され得る、または植物細胞の様々な細胞小器官に対して標的化され得る。例えば、葉緑体をタンパク質の標的にすることは、トランスジェニック植物中の発現タンパク質のレベル増加をもたらす可能性がありながら、外れた表現型が生じるのを防ぐ。標的化はまた、トランスジェニック事象において害虫抵抗性の有効性増加をもたらす可能性もある。標的ペプチドまたは輸送ペプチドは、核、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、葉緑体、アポプラスト、ペルオキシソーム及び原形質膜を含む、細胞中の特定の領域に向けてタンパク質を輸送する短い（３〜７０アミノ酸長）ペプチド鎖である。一部の標的ペプチドは、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。葉緑体への標的化について、タンパク質は、およそ４０〜５０のアミノ酸である輸送ペプチドを含有する。葉緑体輸送ペプチドの使用の記載については、米国特許第５，１８８，６４２号明細書及び同第５，７２８，９２５号明細書を参照のこと。多くの葉緑体局在性タンパク質が、前駆体として核遺伝子から発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に対して標的化される。そのような単離された葉緑体タンパク質の例としては、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシン酸化還元酵素、集光性複合体タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、ならびに米国特許第７，１９３，１３３号明細書に記載されている輸送ペプチドと関連するものが挙げられるが、これらに限定されない。非葉緑体タンパク質は、異種ＣＴＰとのタンパク質融合体の使用によって葉緑体に対して標的化される可能性があり、ＣＴＰは葉緑体をタンパク質の標的とするのに十分であることがインビボ及びインビトロで実証されている。好適な葉緑体輸送ペプチド、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＥＰＳＰＳ ＣＴＰ（ＣＴＰ２）（Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：４３７−４４２，１９８７を参照のこと）またはＰｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａのＥＰＳＰＳ ＣＴＰ（ＣＴＰ４）（ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：６８７３−６８７７，１９８６を参照のこと）などの組込みは、トランスジェニック植物中において葉緑体を異種ＥＰＳＰＳタンパク質配列の標的にすることが示されている（米国特許第５，６２７，０６１号明細書、同第５，６３３，４３５号明細書、及び同第５，３１２，９１０号明細書、ならびにＥＰ０２１８５７１、ＥＰ１８９７０７、ＥＰ５０８９０９、及びＥＰ９２４２９９を参照のこと）。葉緑体をＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３ならびにそのバリアント、切断型バリアント及びキメラの標的とすることについて、葉緑体輸送ペプチドをコードする配列は、植物細胞中での最適発現のために設計されているＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３タンパク質、またはそのバリアント、切断型バリアント、もしくはキメラをコードする合成コード配列に機能的に連結され、かつインフレームで５’に配置される。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９に関連する追加の毒素タンパク質配列は、新規タンパク質を作製して新規特性を持たせるために、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９の天然に存在するアミノ酸配列を使用することによって作製され得ると考えられる。ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９毒素タンパク質を、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９に類似した他のタンパク質とアラインメントし、アミノ酸配列レベルでの差異を新規アミノ酸配列バリアントに組み合わせて、バリアントをコードする組換え核酸配列を適切に変更し得る。
本開示はさらに、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９タンパク質毒素クラスの改善されたバリアントが、当該技術分野において既知の様々な遺伝子編集方法を使用することによって植物内で操作され得ることを検討する。ゲノム編集に使用されるそのような技術としては、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、及びＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムが挙げられるが、これらに限定されない。これらのゲノム編集方法は、植物細胞内で形質転換される毒素タンパク質コード配列を、異なる毒素コード配列に変更するために使用され得る。具体的には、これらの方法によって、毒素コード配列内の１つ以上のコドンが、新しいタンパク質アミノ酸配列を操作するために変更される。あるいは、コード配列内の断片が置き換えられる、もしくは欠失される、または追加のＤＮＡ断片が、新しい毒素コード配列を操作するためにコード配列中に挿入される。新しいコード配列は、新しい特性、例えば、有害昆虫に対する活性増加またはスペクトラム増加などの特性を有する毒素タンパク質をコードし、加えて元々の昆虫毒素タンパク質に対して耐性が発現している有害昆虫種に対して活性を提供し得る。遺伝子編集された毒素コード配列を含む植物細胞は、新しい毒素タンパク質を発現する植物全体を生成するために当該技術分野において既知の方法によって使用され得る。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９タンパク質またはそのタンパク質バリアントの断片は、昆虫阻害活性を有する、１つ以上のアミノ酸がタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、中央から欠失される切断型、またはそれらを組み合わせた切断型であり得るとも考えられる。これらの断片は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９の天然に存在するバリアントもしくは合成バリアントまたはそのタンパク質バリアントであり得るが、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９の昆虫阻害活性を保持するべきである。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９タンパク質に類似しているタンパク質は、当該技術分野において既知の様々なコンピュータベースのアルゴリズムを使用して互いに比較することによって同定され得る。例えば、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９に関連するタンパク質のアミノ酸配列同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを使用し、これらのデフォルトパラメータ：重み行列：ｂｌｏｓｕｍ、ギャップ開放ペナルティ：１０．０、ギャップ伸長ペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、残基特異的ギャップペナルティ：オン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０）を使用して分析され得る。パーセントアミノ酸同一性はさらに、１００％に（アミノ酸同一性／対象タンパク質の長さ）を乗じた積によって算出される。他のアラインメントアルゴリズムも当該技術分野において利用可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを使用して得られるものと類似の結果を提供する。
鱗翅目または鞘翅目の昆虫種に対して昆虫阻害活性を呈するタンパク質は、そのようなクエリータンパク質とＴＩＣ７３８３もしくはＴＩＣ７３８６とのアラインメントが、クエリータンパク質と対象タンパク質との間で約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（もしくはこの範囲内における任意の部分パーセンテージ）である、クエリータンパク質の長さに沿って少なくとも７５％〜約１００％のアミノ酸同一性を呈する場合、またはそのようなクエリータンパク質とＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７３８１、もしくはＴＩＣ７３８９とのアラインメントが、クエリータンパク質と対象タンパク質との間で約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（もしくはこの範囲内における任意の部分パーセンテージ）である、クエリータンパク質の長さに沿って少なくとも９０％〜約１００％のアミノ酸同一性を呈する場合、またはそのようなクエリータンパク質とＴＩＣ７０４２、もしくはＴＩＣ７３８２とのアラインメントが、クエリータンパク質と対象タンパク質との間で約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性（もしくはこの範囲内における任意の部分パーセンテージ）である、クエリータンパク質の長さに沿って少なくとも９３％〜約１００％のアミノ酸同一性を呈する場合、またはそのようなクエリータンパク質とＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７３８１、もしくはＴＩＣ７３８８とのアラインメントが、クエリータンパク質と対象タンパク質との間でクエリータンパク質の長さに沿って少なくとも９９％〜約１００％のアミノ酸同一性（もしくはこの範囲内における任意の部分パーセンテージ）を呈する場合、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９に関連することを意図する。
例示的なタンパク質のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９を、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して互いにアラインメントした。表１で報告した通り、全長タンパク質の各々についてパーセントアミノ酸配列同一性のペアワイズマトリックスを作成した。２つの配列間における同一のアミノ酸数を、丸括弧内に示す。
表１．例示的なタンパク質のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９のペアワイズマトリックス表示。
Figure 2020515291
パーセント同一性に加えて、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９タンパク質はまた、一次構造（保存されたアミノ酸モチーフ）によって、長さ（約１２４３〜約１２５９アミノ酸）によって、及び他の特徴によっても関連付けられ得る。バイオインフォマティクス解析は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９が、タンパク質のＣｒｙ４３ファミリーに属することを示唆している。ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９タンパク質の特徴を、表２に報告する。
表２．ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９タンパク質ならびに関連ファミリーメンバータンパク質の選択された特徴。
Figure 2020515291
Figure 2020515291
Figure 2020515291
本出願の実施例でさらに記載した通り、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３、ならびにそのバリアント、切断型バリアント、及びキメラをコードする組換え核酸分子配列を、植物中での使用のために設計した。植物中での使用のために設計した、例示的な植物用に最適化した組換え核酸分子配列を、対応するヌクレオチド及びタンパク質配列、説明ならびに修飾と共に、実施例５の表８に提示する。
これらの組換え核酸分子配列を含有する発現カセット及びベクターは、当該技術分野において既知の形質転換方法及び手法に従って構築され、トウモロコシ、ダイズ、綿または他の植物の細胞中に導入され得る。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換は、米国特許出願公開２００９／０１３８９８５Ａ１（ダイズ）、同２００８／０２８０３６１Ａ１（ダイズ）、同２００９／０１４２８３７Ａ１（トウモロコシ）、同２００８／０２８２４３２（綿）、同２００８／０２５６６６７（綿）、同２００３／０１１０５３１（コムギ）、同２００１／００４２２５７Ａ１（テンサイ）、米国特許第５，７５０，８７１号明細書（キャノーラ）、同第７，０２６，５２８号明細書（コムギ）、及び同第６，３６５，８０７号明細書（コメ）に、ならびにＡｒｅｎｃｉｂｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．７：２１３−２２２（サトウキビ）に記載され、その全ての全体が参照によって本明細書に組み込まれる。形質転換細胞は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、またはＴＩＣ７３８３を発現する形質転換植物中に再生され得る。殺虫活性を試験するために、実施例に記載される通り、形質転換植物から得られた植物のリーフディスクを使用してＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ害虫の幼虫の存在下でバイオアッセイを実施する。鞘翅目害虫に対する殺虫活性を試験するために、実施例に記載される通り、Ｒ０及びＦ１世代の形質転換植物をルートワームアッセイで使用する。半翅目害虫に対する殺虫活性を試験するために、実施例に記載される通り、形質転換植物の鞘、トウモロコシの穂または葉が、植物から取り出した組織または植物上に残った組織のいずれかに由来するものをアッセイに使用する。
従来の形質転換方法の代わりに、ＤＮＡ配列、例えば、導入遺伝子、発現カセット（複数可）などが、部位特異的組込みによって植物または植物細胞のゲノム内における特定の部位または遺伝子座に挿入されてよい、または組み込まれてよい。したがって、本開示の組換えＤＮＡ構築物（複数可）及び分子（複数可）は、植物または植物細胞のゲノム中に挿入するために少なくとも１つの導入遺伝子、発現カセット、または他のＤＮＡ配列を含むドナー鋳型配列を含んでよい。部位特異的組込みのためのそのようなドナー鋳型は、挿入配列（すなわち、植物ゲノム中に挿入される配列、導入遺伝子、カセットなど）に隣接する１つまたは２つの相同性アームをさらに含んでよい。本開示の組換えＤＮＡ構築物（複数可）は、部位特異的組込みを行うために部位特異的ヌクレアーゼ及び／または任意の関連タンパク質（複数可）をコードする発現カセット（複数可）をさらに含んでよい。これらのヌクレアーゼ発現カセット（複数可）は、ドナー鋳型と同じ分子もしくはベクター中に存在してよい（シスで）、または別個の分子もしくはベクター上に存在してよい（トランスで）。部位特異的組込みのいくつかの方法が当該技術分野において既知であり、ゲノムＤＮＡを切断して、所望のゲノム部位または遺伝子座に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを生じさせる様々なタンパク質（あるいはタンパク質及び／またはガイドＲＮＡの複合体）を含む。当該技術分野において理解されている通り、ヌクレアーゼ酵素によって導入されたＤＳＢまたはニックを修復するプロセスの間に、ドナー鋳型ＤＮＡがＤＳＢまたはニックの部位でゲノム中に組み込まれることになってよい。ドナー鋳型中における相同性アーム（複数可）の存在は、相同組換えによる修復プロセスの間に植物ゲノム中への挿入配列の受容及び標的化を促進してよいが、挿入事象が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって生じてもよい。使用されてよい部位特異的ヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作された、または天然のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ、及びＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）が挙げられる。ＲＮＡ誘導型部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を使用する方法について、組換えＤＮＡ構築物（複数可）は、植物ゲノム内の所望の部位にヌクレアーゼを向かわせる１つ以上のガイドＲＮＡをコードする配列も含むことになる。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質をコードする組換え核酸分子組成物が検討される。例えば、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質は、タンパク質をコードするＯＲＦを有するポリヌクレオチド分子が、プロモーターなどの遺伝子発現エレメント及び構築物が意図されるシステム中での発現に必要な任意の他の調節エレメントに機能的に連結される、組換えＤＮＡ構築物によって発現され得る。非限定的な例としては、植物中におけるタンパク質発現のために、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９もしくは関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質をコードする配列に機能的に連結される植物機能的プロモーターまたはＢｔ細菌もしくは他のＢａｃｉｌｌｕｓ種中におけるタンパク質発現のために、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９もしくは関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質をコードする配列に機能的に連結されるＢｔ機能的プロモーターが挙げられる。他のエレメントが、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質をコードする配列に機能的に連結され得、エレメントとしては、エンハンサー、イントロン、非翻訳リーダー、コードされるタンパク質固定化タグ（ＨＩＳタグ）、転座ペプチド（すなわち、色素体輸送ペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素のためのポリペプチド配列、リボソーム結合部位、及びＲＮＡｉ標的部位が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される例示的な組換えポリヌクレオチド分子としては、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、及び配列番号：１２７に記載されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、及び配列番号：１２６などのポリヌクレオチドに機能的に連結される異種プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。異種プロモーターは、色素体標的または非標的ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、そのバリアント、切断型バリアント、及びキメラならびに非標的ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、そのバリアント、切断型バリアント、及びキメラまたは関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質をコードする合成ＤＮＡコード配列にも機能的に連結され得る。本明細書に開示されるタンパク質をコードする組換え核酸分子のコドンは、同義コドンによって置換され得る（サイレント置換として当該技術分野において既知である）。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質のコード配列を含む組換えＤＮＡ構築物は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９もしくは関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９もしくは関連ファミリーメンバーの殺昆虫性タンパク質とは異なるタンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、または補助タンパク質をコードするＤＮＡ配列に付随して発現する、または共発現するように構成され得る、１つ以上の昆虫阻害剤をコードするＤＮＡの領域をさらに含み得る。補助タンパク質としては、例えば、その発現を助けること、植物中におけるその安定性に影響を与えること、オリゴマー化のための自由エネルギーを最適化すること、その毒性を増強すること、及び活性のそのスペクトラムを増加させることによって、昆虫阻害剤の有効性に役立つように機能する補因子、酵素、結合パートナー、または他の剤が挙げられるが、これらに限定されない。補助タンパク質は、例えば、１つ以上の昆虫阻害剤の取込みを容易にしてよい、または毒剤の毒性作用を増強してよい。
組換えＤＮＡ構築物は、全てのタンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子が１つのプロモーターから発現されるように、または各タンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子が別個のプロモーター制御下にあるように、またはそのある組合せであるように組み立てられ得る。本発明のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９及び関連ファミリーメンバータンパク質は、１つ以上のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバータンパク質が、選択される発現系の種類に応じて、他のオープンリーディングフレーム及びプロモーターも含有する共通のヌクレオチドセグメントから発現される多重遺伝子発現系から発現され得る。例えば、細菌の多重遺伝子発現系は、単一プロモーターを利用して単一オペロン内からの多重結合／タンデムオープンリーディングフレームの発現（すなわち、ポリシストロニック発現）を促進し得る。別の例では、植物の多重遺伝子発現系は、各々が異なるタンパク質または１つ以上のｄｓＲＮＡ分子などの他の剤を発現する多重非結合発現カセットを利用し得る。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバータンパク質をコードする配列を含む組換え核酸分子または組換えＤＮＡ構築物は、ベクター、例えば、プラスミド、バキュロウイルス、合成染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージ、またはウイルスベクターによって宿主細胞に送達され得る。そのようなベクターは、宿主細胞中におけるＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９もしくは関連ファミリーメンバータンパク質をコードする配列の安定発現もしくは一過性発現、またはコードされるポリペプチドの後続の発現を達成するために使用され得る。タンパク質をコードする配列を含み、宿主細胞中に導入される外来性組換えポリヌクレオチドまたは組換えＤＮＡ構築物は、本明細書では「導入遺伝子」と称される。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバータンパク質をコードする配列のうちいずれか１つ以上を発現する組換えポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック細菌、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物、及びトランスジェニック植物部位が、本明細書で提供される。「細菌細胞」または「細菌」という用語は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ細胞を含み得るが、これらに限定されない。「植物細胞」または「植物」という用語は、双子葉植物細胞または単子葉植物細胞を含み得るが、これらに限定されない。検討される植物及び植物細胞としては、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ｂｒａｓｓｉｃａ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ｃｉｔｒｕｓ、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、エンバク、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ｓｏｒｇｈｕｍ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギの植物細胞または植物が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、トランスジェニック植物細胞から再生されるトランスジェニック植物及びトランスジェニック植物部位が提供される。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、植物の部位を切断する、折る、粉砕するまたはさもなければ分離することによって、トランスジェニック種子から得られ得る。特定の実施形態では、植物部位は、種子、丸莢、葉、花、茎、根、もしくはそれらの任意の部分、またはトランスジェニック植物部位の再生不可能な部分であり得る。本文脈中で使用される場合、トランスジェニック植物部位の「再生不可能な」部分は、植物全体を形成するように誘導され得ない、あるいは有性及び／または無性生殖が可能な植物全体を形成するように誘導され得ない部分である。特定の実施形態では、植物部位の再生不可能な部分は、トランスジェニック種子、丸莢、葉、花、茎、または根の部分である。
昆虫、ＣｏｌｅｏｐｔｅｒａまたはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ阻害量のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバータンパク質を含むトランスジェニック植物を作製する方法が提供される。そのような植物は、本出願で提供される任意のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバータンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを植物細胞中に導入し、昆虫、ＣｏｌｅｏｐｔｅｒａまたはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ阻害量のタンパク質を発現する植物細胞に由来する植物を選択することによって作製され得る。植物は、再生、種子、花粉、または分裂組織形質転換の手法によって植物細胞から得られ得る。植物を形質転換する方法は、当該技術分野において既知である。
加工植物産物が、検出可能な量のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラもしくは関連ファミリーメンバータンパク質、その昆虫阻害セグメントもしくは断片、またはその任意の識別部分を含む、加工産物も本出願で開示される。特定の実施形態では、加工産物は、植物部位、植物バイオマス、油、粗挽き粉、糖（ｓｕｇａｒ）、動物飼料、粉、フレーク、糠（ｂｒａｎ）、リント布、殻、加工種子、及び種子からなる群から選択される。特定の実施形態では、加工産物は再生不可能である。植物産物は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物部位に由来する商品または商業の他の製品を含み得、商品または他の製品は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバータンパク質の識別部分をコードする、または含むヌクレオチドセグメントまたは発現ＲＮＡもしくはタンパク質を検出することによって商業を介して追跡され得る。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバータンパク質を発現する植物は、他の毒素タンパク質を発現する、及び／または他のトランスジェニック形質、例えば、除草剤耐性遺伝子、収量もしくはストレス耐性の形質を付与する遺伝子などを発現するトランスジェニック事象と繁殖させることによって交配され得る、あるいはそのような形質は、形質が全て連鎖されるように単一ベクター内で組み合わされ得る。
実施例でさらに記載される通り、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３のバリアント、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３の切断型バリアント、ならびにＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１及びＴＩＣ７３８２のキメラをコードする配列を植物中で使用するために設計して、実施例５の表８に提示する。
これらの合成または人工ヌクレオチド配列を含有する発現カセット及びベクターは、当該技術分野において既知の形質転換方法及び手法に従って構築され、トウモロコシ、綿、及びダイズの植物細胞中に導入され得る。形質転換細胞は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３、またはそのバリアント、切断型バリアントもしくはキメラを発現すると観察される形質転換植物中に再生される。殺虫活性を試験するために、鱗翅目、鞘翅目及び半翅目の害虫の存在下でバイオアッセイを実施する。
実施例でさらに記載される通り、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバータンパク質をコードする配列及びこれらのタンパク質と実質的にパーセンテージ同一性を有する配列が、当業者に既知の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、熱増幅及びハイブリダイゼーションなどを使用して同定され得る。例えば、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３タンパク質及びバリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバータンパク質は、関連タンパク質に特異的に結合する抗体を作製するために使用され得、かつ密接に関連する他のタンパク質メンバーをスクリーニングし、それらを見出すために使用され得る。
さらに、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３及びバリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、熱サイクルまたは等温増幅及びハイブリダイゼーション方法を使用してクラスの他のメンバーを同定するために、スクリーニング用のプローブ及びプライマーとして使用され得る。例えば、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、及び配列番号：１２６として記載されるような配列から得られるオリゴヌクレオチドは、商品生産物から得られたデオキシリボ核酸試料中におけるＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３タンパク質、もしくはバリアント、切断型バリアント、キメラ、または関連ファミリーメンバータンパク質導入遺伝子の有無を決定するために使用され得る。オリゴヌクレオチドを用いる特定の核酸検出方法の感度を考慮すると、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、及び配列番号：１２６として記載されるような配列から得られるオリゴヌクレオチドは、商品生産物の一部のみが、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、または配列番号：１２６のいずれかを含有するトランスジェニック植物に由来しているプールされた供給源から得られた商品生産物中においてＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３、そのバリアント、切断型バリアント、またはキメラ導入遺伝子を検出するために使用され得ると予想される。そのようなオリゴヌクレオチドが、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、または配列番号：１２６中にヌクレオチド配列変異を導入するために使用され得ることがさらに認識される。そのような「変異誘発」オリゴヌクレオチドは、トランスジェニック植物宿主細胞中において様々な昆虫阻害活性または多様な発現を呈するＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバーアミノ酸配列バリアントの同定に有用である。
ヌクレオチド配列ホモログ、例えば、ハイブリダイゼーション条件下において本出願で開示される配列の各々またはそのいずれかにハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる殺昆虫性タンパク質も本発明の実施形態である。本発明は、第２ヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１ヌクレオチド配列を検出する方法も提供し、第１ヌクレオチド配列（またはその逆相補配列）が、殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片をコードし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第２ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。そのような場合、第２ヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、及び配列番号：１２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列であり得る。ヌクレオチドコード配列は、適切なハイブリダイゼーション条件下において互いにハイブリダイズし、これらのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は、他のタンパク質のいずれか１つに対して作製された抗血清と交差反応する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本明細書で定義される通り、少なくとも４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いた室温での各５分間の洗浄２回、続いて０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中における６５℃での各３０分間の洗浄２回を含む。さらに高い温度での洗浄は、より一層ストリンジェントな条件、例えば、６８℃のハイブリダイゼーション条件、続いて０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中における６８℃での洗浄となる。
当業者は、遺伝子コードの冗長性ゆえに、多くの他の配列がＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、またはＴＩＣ７３８９に関連するタンパク質をコードすることができ、これらの配列は、それらがＢａｃｉｌｌｕｓ株中または植物細胞中のいずれかにおいて殺虫性タンパク質を発現するように機能する限りにおいて、本発明の実施形態であると認識することになり、多くのそのような冗長コード配列は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、またはＴＩＣ７３８９をコードする天然のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ配列に、これらの条件下ではハイブリダイズしないことになると当然認識する。本出願は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバータンパク質をコードする配列及びそれらと実質的なパーセンテージ同一性を有する配列を同定するための、当業者に既知のこれらの及び他の同定方法の使用を検討する。
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、もしくはＴＩＣ７３８９または関連ファミリーメンバータンパク質を用いて昆虫、特にＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａの作物への侵入を防除する方法も、本出願で開示される。そのような方法は、昆虫、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ阻害量のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバー毒素タンパク質を含む植物を成長させることを含み得る。特定の実施形態では、そのような方法は、（ｉ）ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバー毒素タンパク質を含む、またはコードする任意の組成物を、植物または植物を生じさせる種子に適用すること、及び（ｉｉ）ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバー毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、植物または植物を生じさせる植物細胞を形質転換することのうちいずれか１つ以上をさらに含み得る。一般に、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアントまたは関連ファミリーメンバー毒素タンパク質は、鱗翅目または鞘翅目昆虫に対して昆虫阻害活性を付与するために組成物中に提供され得る、微生物中に提供され得る、またはトランスジェニック植物中に提供され得ると考えられる。
特定の実施形態では、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバー毒素タンパク質の組換え核酸分子は、タンパク質を発現するために形質転換された組換えＢａｃｉｌｌｕｓまたは任意の他の組換え細菌細胞を培養することによって調製される昆虫阻害組成物の殺昆虫活性成分である。そのような組成物は、組換えポリペプチドを発現する／産生するそのような組換え細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈殿、または濃縮によって調製され得る。そのようなプロセスは、Ｂａｃｉｌｌｕｓまたは他の昆虫病原性細菌の細胞抽出物、細胞懸濁液、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞上清、細胞濾液、または細胞ペレットをもたらし得る。そのように産生された組換えポリペプチドを得ることによって、組換えポリペプチドを含む組成物は、細菌細胞、細菌胞子、及び副芽胞封入体を含み得、農業用昆虫阻害噴霧製品として、または食餌バイオアッセイにおける昆虫阻害製剤として含む、様々な用途のために製剤化され得る。
一実施形態では、耐性発現の可能性を減少させるために、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバーを含む昆虫阻害組成物は、同じ鱗翅目または鞘翅目昆虫種に対して昆虫阻害活性を呈するが、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラまたは関連ファミリーメンバー毒素タンパク質とは異なる、当業者に既知の少なくとも１つの追加のポリペプチドをさらに含み得る。そのような組成物用の考え得る追加のポリペプチドとしては、昆虫阻害タンパク質及び昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子が挙げられる。有害昆虫を防除するためのそのようなリボヌクレオチド配列の使用に関する一例は、Ｂａｕｍ，ｅｔ ａｌ．（米国特許公開２００６／００２１０８７Ａ１）に記載されている。
鱗翅目害虫を防除するためのそのような追加のポリペプチドは、昆虫阻害タンパク質、例えば、これらに限定されないが、Ｃｒｙ１Ａ（米国特許第５，８８０，２７５号明細書）、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ（米国特許公開第１０／５２５，３１８号明細書）、Ｃｒｙ１Ｃ（米国特許第６，０３３，８７４号明細書）、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｄａ及びそのバリアント、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、及びＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ（米国特許第７，０７０，９８２号明細書、同第６，９６２，７０５号明細書、及び同第６，７１３，０６３号明細書）、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ１型キメラ、例えば、これらに限定されないが、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、及びＴＩＣ１１００など（国際出願公開ＷＯ２０１６／０６１３９１（Ａ２））、ＴＩＣ２１６０（国際出願公開ＷＯ２０１６／０６１３９２（Ａ２））、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ（米国特許第７，０６４，２４９号明細書）、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ１４１５、Ｖｉｐ３Ａ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＶＩＰ３Ｂ、ＡＸＭＩ−００１、ＡＸＭＩ−００２、ＡＸＭＩ−０３０、ＡＸＭＩ−０３５、及びＡＸＭＩ−０４５（米国特許公開２０１３−０１１７８８４Ａ１）、ＡＸＭＩ−５２、ＡＸＭＩ−５８、ＡＸＭＩ−８８、ＡＸＭＩ−９７、ＡＸＭＩ−１０２、ＡＸＭＩ−１１２、ＡＸＭＩ−１１７、ＡＸＭＩ−１００（米国特許公開２０１３−０３１０５４３Ａ１）、ＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、ＡＸＭＩ−００５（米国特許公開２０１３−０１０４２５９Ａ１）、ＡＸＭＩ−１３４（米国特許公開２０１３−０１６７２６４Ａ１）、ＡＸＭＩ−１５０（米国特許公開２０１０−０１６０２３１Ａ１）、ＡＸＭＩ−１８４（米国特許公開２０１０−０００４１７６Ａ１）、ＡＸＭＩ−１９６、ＡＸＭＩ−２０４、ＡＸＭＩ−２０７、ＡＸＭＩ−２０９（米国特許公開２０１１−００３００９６Ａ１）、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０（米国特許公開２０１４−０２４５４９１Ａ１）、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２２ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ、ＡＸＭＩ−２２４ｚ、ＡＸＭＩ−２２５ｚ（米国特許公開２０１４−０１９６１７５Ａ１）、ＡＸＭＩ−２３８（米国特許公開２０１４−００３３３６３Ａ１）、ＡＸＭＩ−２７０（米国特許公開２０１４−０２２３５９８Ａ１）、ＡＸＭＩ−３４５（米国特許公開２０１４−０３７３１９５Ａ１）、ＡＸＭＩ−３３５（国際出願公開ＷＯ２０１３／１３４５２３（Ａ２））、ＤＩＧ−３（米国特許公開２０１３−０２１９５７０Ａ１）、ＤＩＧ−５（米国特許公開２０１０−０３１７５６９Ａ１）、ＤＩＧ−１１（米国特許公開２０１０−０３１９０９３Ａ１）、ＡｆＩＰ−１Ａ及びその誘導体（米国特許公開２０１４−００３３３６１Ａ１）、ＡｆＩＰ−１Ｂ及びその誘導体（米国特許公開２０１４−００３３３６１Ａ１）、ＰＩＰ−１ＡＰＩＰ−１Ｂ（米国特許公開２０１４−０００７２９２Ａ１）、ＰＳＥＥＮ３１７４（米国特許公開２０１４−０００７２９２Ａ１）、ＡＥＣＦＧ−５９２７４０（米国特許公開２０１４−０００７２９２Ａ１）、Ｐｐｕｔ＿１０６３（米国特許公開２０１４−０００７２９２Ａ１）、ＤＩＧ−６５７（国際出願公開ＷＯ２０１５／１９５５９４（Ａ２））、Ｐｐｕｔ＿１０６４（米国特許公開２０１４−０００７２９２Ａ１）、ＧＳ−１３５及びその誘導体（米国特許公開２０１２−０２３３７２６Ａ１）、ＧＳ１５３及びその誘導体（米国特許公開２０１２−０１９２３１０Ａ１）、ＧＳ１５４及びその誘導体（米国特許公開２０１２−０１９２３１０Ａ１）、ＧＳ１５５及びその誘導体（米国特許公開２０１２−０１９２３１０Ａ１）、米国特許公開２０１２−０１６７２５９Ａ１に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、米国特許公開２０１２−００４７６０６Ａ１に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、米国特許公開２０１１−０１５４５３６Ａ１に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、米国特許公開２０１１−０１１２０１３Ａ１に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、米国特許公開２０１０−０１９２２５６Ａ１に記載されるような配列番号：２及び４ならびにその誘導体、米国特許公開２０１０−００７７５０７Ａ１に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、米国特許公開２０１０−００７７５０８Ａ１に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、米国特許公開２００９−０３１３７２１Ａ１に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、米国特許公開２０１０−０２６９２２１Ａ１に記載されるような配列番号：２または４及びその誘導体、米国特許第７，７７２，４６５（Ｂ２）号明細書に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、ＷＯ２０１４／００８０５４Ａ２に記載されるようなＣＦ１６１＿００８５及びその誘導体、米国特許公開ＵＳ２００８−０１７２７６２Ａ１、ＵＳ２０１１−００５５９６８Ａ１、及びＵＳ２０１２−０１１７６９０Ａ１に記載されるような鱗翅目毒性タンパク質及びそれらの誘導体、ＵＳ７５１０８７８（Ｂ２）に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、米国特許第７，８１２，１２９（Ｂ１）号明細書に記載されるような配列番号：２及びその誘導体、Ｃｒｙ７１Ａａ１及びＣｒｙ７２Ａａ１（米国特許公開ＵＳ２０１６−０２３０１８７Ａ１）、Ａｘｍｉ４２２（米国特許公開ＵＳ２０１６−０２０１０８２Ａ１）、Ａｘｍｉ４４０（米国特許公開ＵＳ２０１６−０１８５８３０Ａ１）、Ａｘｍｉ２８１（米国特許公開２０１６−０１７７３３２Ａ１）、ＢＴ−００４４、ＢＴ−００５１、ＢＴ−００６８、ＢＴ−０１２８及びそのバリアント（ＷＯ２０１６−０９４１５９Ａ１）、ＢＴ−００９、ＢＴ−００１２、ＢＴ−００１３、ＢＴ−００２３、ＢＴ００６７及びそのバリアント（ＷＯ２０１６−０９４１６５Ａ１）、Ｃｒｙ１ＪＰ５７８Ｖ、Ｃｒｙ１ＪＰＳ１、Ｃｒｙ１ＪＰＳ１Ｐ５７８Ｖ（ＷＯ２０１６−０６１２０８Ａ１）などからなる群から選択されてよい。
鞘翅目害虫を防除するためのそのような追加のポリペプチドは、昆虫阻害タンパク質、例えば、これらに限定されないが、Ｃｒｙ３Ｂｂ（米国特許第６，５０１，００９号明細書）、Ｃｒｙ１Ｃバリアント、Ｃｒｙ３Ａバリアント、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ３４／３５、５３０７、ＡＸＭＩ１３４（米国特許公開２０１３−０１６７２６４Ａ１）、ＡＸＭＩ−１８４（米国特許公開２０１０−０００４１７６Ａ１）、ＡＸＭＩ−２０５（米国特許公開２０１４−０２９８５３８Ａ１）、ＡＸＭＩ２０７（米国特許公開２０１３−０３０３４４０Ａ１）、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０（米国特許公開２０１４０２４５４９１Ａ１）、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ（米国特許公開２０１４−０１９６１７５Ａ１）、ＡＸＭＩ−２７９（米国特許公開２０１４−０２２３５９９Ａ１）、ＡＸＭＩ−Ｒ１及びそのバリアント（米国特許公開２０１０−０１９７５９２Ａ１）、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ３１３１、ＤＩＧ−１０（米国特許公開２０１０−０３１９０９２Ａ１）、ｅＨＩＰ（米国特許出願公開第２０１０／００１７９１４号明細書）、ＩＰ３及びそのバリアント（米国特許公開２０１２−０２１０４６２Ａ１）、ω（オメガ）−ヘキサトキシン−Ｈｖ１ａ（米国特許出願公開ＵＳ２０１４−０３６６２２７Ａ１）、ＰＨＩ−４バリアント（米国特許出願公開２０１６−０２８１１０５Ａ１）、ＰＩＰ−７２バリアント（ＷＯ２０１６−１４４６８８Ａ１）、ＰＩＰ−４５バリアント、ＰＩＰ−６４バリアント、ＰＩＰ−７４バリアント、ＰＩＰ−７５バリアント、及びＰＩＰ−７７バリアント（ＷＯ２０１６−１４４６８６Ａ１）、ＤＩＧ−３０５（ＷＯ２０１６１０９２１４Ａ１）、ＰＩＰ−４７バリアント（米国特許公開２０１６−０１８６２０４Ａ１）、ＤＩＧ−１７、ＤＩＧ−９０、ＤＩＧ−７９（ＷＯ２０１６−０５７１２３Ａ１）、ＤＩＧ−３０３（ＷＯ２０１６−０７００７９Ａ１）などからなる群から選択されてよい。
他の実施形態では、そのような組成物／製剤は、得られる昆虫阻害のスペクトラムを拡大するために、本発明の別の昆虫阻害タンパク質によって阻害されない昆虫に対して昆虫阻害活性を呈する少なくとも１つの追加のポリペプチド、例えば、半翅目またはアザミウマ目に対して昆虫阻害活性を呈する追加のポリペプチドをさらに含み得る。
特定の殺昆虫剤に対して耐性を発現する昆虫の可能性は、当該技術分野において記録されている。１つの昆虫耐性管理戦略とは、異なる作用機序を介して作用する２つの異なる昆虫阻害剤を発現するトランスジェニック作物を用いることである。したがって、昆虫阻害剤のいずれか一方に対して耐性を持ついずれかの昆虫が、他方の昆虫阻害剤によって防除され得る。別の昆虫耐性管理戦略は、標的とされる鞘翅目または鱗翅目害虫種に対して保護されていない植物の使用を用いて、そのような保護されていない植物の避難を提供する。１つの特定の例は、米国特許第６，５５１，９６２号明細書に記載されていて、その全体が参照によって組み込まれる。
他の実施形態、例えば、製剤を噴霧する、滴下する、または拭き取る種子処理においてタンパク質と共に使用される、本明細書に開示されるタンパク質によっても防除される害虫を防除するために設計された局所的に適用される殺虫化学物質などは、土壌に直接適用され得る（土壌灌注）、本明細書に開示されるタンパク質を発現する植物を成長させるために適用され得る、または開示されるタンパク質のうち１つ以上をコードする１つ以上の導入遺伝子を含有する種子に適用されるように製剤化され得る。種子処理に使用するためのそのような製剤は、当該技術分野において既知の様々な展着剤及び粘着付与剤と共に適用され得る。そのような製剤は、作用機序において開示されるタンパク質と相乗的である殺虫剤を含有し得るため、製剤殺虫剤が異なる作用機序を介して作用し、開示されるタンパク質によって防除され得る同じもしくは類似した害虫を防除する、またはそのような殺虫剤が、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９、バリアント、切断型バリアント、キメラ、もしくは関連ファミリーメンバー殺虫性タンパク質によって効果的に防除されない幅広い宿主範囲もしくは植物害虫種内で害虫を防除するように作用する。
上述した組成物／製剤は、農業上許容できる担体、例えば、餌、粉末、細粉、ペレット、顆粒、噴霧剤、エマルジョン、コロイド懸濁液、水溶液、Ｂａｃｉｌｌｕｓ胞子／結晶調製物、種子処理、タンパク質のうち１つ以上を発現するように形質転換された組換え植物細胞／植物組織／種子／植物、またはタンパク質のうち１つ以上を発現するように形質転換された細菌などをさらに含み得る。組換えポリペプチドに固有の昆虫阻害または殺昆虫性阻害のレベル及び植物または食餌アッセイに適用される製剤のレベルに応じて、組成物／製剤は、様々な重量の組換えポリペプチド、例えば、０．０００１重量％〜０．００１重量％〜０．０１重量％〜１重量％〜９９重量％の組換えポリペプチドを含み得る。
前述したことを考慮すると、当業者は、開示されている特定の態様に変更を行い、それが本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく依然として同様のまたは類似した結果を得ることができると理解すべきである。したがって、開示される特定の構造的及び機能的詳細は、限定であると解釈されるべきではない。各引用文献の開示全体が、本開示内に組み込まれると理解されるべきである。
実施例１
ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、ＴＩＣ７３８９の発見
本実施例は、殺虫性タンパク質ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９の発見について記載する。
新規のＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（Ｂｌ）殺虫性タンパク質をコードする配列を同定してクローニングし、配列を確認して昆虫バイオアッセイで試験した。殺虫性タンパク質ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ＴＩＣ７３８６、ＴＩＣ７３８８、及びＴＩＣ７３８９を、表３に列挙したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株から単離して、毒素のＣｒｙ４３ファミリーに属する新規の殺虫性タンパク質を表す。
表３．新規のＣｒｙ４３殺虫性毒素タンパク質及び対応するＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株。
Figure 2020515291
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを、表３に列挙した各Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株のシーケンシングから得られたコンティグに基づいて設計した。各タンパク質毒素に対する全長コード配列のアンプリコンを、表３に列挙した各株から単離した全ＤＮＡを使用して生成した。ＴＩＣ７０４０に関しては、増幅によって３，８８８ｂｐのコード配列を生成し、予測した３，７８０ｂｐのコード配列とは異なった。増幅コード配列及び対応するアミノ酸配列を「ＴＩＣ７０４０ＨＴ」と称して、それを元々の予測したコンティグのＴＩＣ７０４０とは区別した。ＴＩＣ７０４０を除いたアンプリコンの各々を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）発現可能プロモーターと機能的に連結したＢｔ発現ベクター中に、当該技術分野において既知の方法を使用してクローニングした。
実施例２
ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３は、昆虫バイオアッセイにおいて鞘翅目及び鱗翅目活性を実証する
本実施例は、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ及びＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの様々な種に対してＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３タンパク質が呈する阻害活性を例示する。
殺虫性タンパク質ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３をＢｔ中で発現し、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ及びＣｏｌｅｏｐｔｅｒａの様々な種に対する毒性についてアッセイした。各毒素の調製物を、鞘翅目種のウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）、Ｃｒｙ３Ｂｂ耐性ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲＨＰ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、ＮＣＲ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉｉ、ＳＣＲ）、及びコロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ＣＰＢ）に対してアッセイした。各毒素の調製物を、鱗翅目種のブラックカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ、ＢＣＷ）、コーンイヤーワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、（ＣＥＷ）、ダイズポッドワーム及びコットンボールワームとしても知られる）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、ＤＢＭ）、ヨーロピアンコーンボーラー（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、ＥＣＢ）、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ＦＡＷ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ、ＳＡＷ）、ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、ＳＢＬ）、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、ＳＷＣＢ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、ＴＢＷ）、及びベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、ＶＢＣ）に対してもアッセイした。毒素調製物を、半翅目種のサビイロカスミカメムシ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、ウエスタンサビイロカスミカメムシ（Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、及びネオトロピカルチャイロカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）に対してもアッセイした。
ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、またはＴＩＣ７３８３を発現する形質転換したＢｔを２４時間成長させて、胞子に加えて可溶化タンパク質をアッセイのために昆虫食餌に添加した。大量死及び成長阻害を、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、またはＴＩＣ７３８３を発現するＢｔ株の培養物を含む食餌上の昆虫と、未処理対照培養物を含む食餌上の昆虫との増殖及び発達を比較することによって評価した。ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、またはＴＩＣ７３８３については、半翅目有害昆虫に対して活性を観察しなかった。鞘翅目及び鱗翅目有害昆虫に対しては活性を観察した。各タンパク質で観察した成長阻害（Ｓ）及び大量死（Ｍ）に関するバイオアッセイでの活性を、表４（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）及び表５（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）に提示し、表中「＋」は活性を示し、空白のセルは活性を全く観察しなかったことを示し、「ＮＴ」は、その特定の有害昆虫に対して毒素をアッセイしなかったことを示す。
表４．鞘翅目有害昆虫に対するＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３のバイオアッセイでの活性。
Figure 2020515291
 表５．鱗翅目有害昆虫に対するＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３のバイオアッセイでの活性。
Figure 2020515291
表４及び表５に見ることができる通り、殺虫性タンパク質ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３は、鞘翅目及び鱗翅目有害昆虫種の多くに対して活性を実証した。ＴＩＣ７０４０ＨＴは、鞘翅目害虫のＷＣＲ、ＷＣＲＨＰ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＣＰＢ、ならびに鱗翅目有害昆虫のＣＥＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、ＳＢＬ、ＳＷＣＢ、及びＶＢＣに対する活性を実証した。ＴＩＣ７０４２は、鞘翅目害虫のＷＣＲ、ＷＣＲＨＰ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＣＰＢ、ならびに鱗翅目有害昆虫のＢＣＷ、ＣＥＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、ＳＢＬ、及びＶＢＣに対する活性を実証した。ＷＣＲに対してＴＩＣ７０４２が引き起こした大量死は、非常に多かった。ＴＩＣ７３８１は、鞘翅目害虫のＷＣＲ、ＷＣＲＨＰ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＣＰＢ、ならびに鱗翅目有害昆虫のＣＥＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、ＳＢＬ、ＳＷＣＢ、及びＶＢＣに対する活性を実証した。ＴＩＣ７３８２は、鞘翅目害虫のＷＣＲ、ＷＣＲＨＰ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＣＰＢ、ならびに鱗翅目有害昆虫のＤＢＭ、ＥＣＢ、ＳＢＬ、ＳＷＣＢ、及びＶＢＣに対する活性を実証した。ＴＩＣ７３８３は、鞘翅目害虫のＷＣＲ、ＷＣＲＨＰ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、及びＣＰＢならびに、鱗翅目有害昆虫のＣＥＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、及びＶＢＣに対する活性を実証した。
殺虫性タンパク質ＴＩＣ７３８３は、鞘翅目害虫のＷＣＲ及びＣＰＢに対する活性を実証した。ＴＩＣ７３８９を、鱗翅目有害昆虫種のコーンイヤーワーム、フォールアーミーワーム、及びダイズシャクトリムシ、加えて半翅目種のサビイロカスミカメムシ及びウエスタンサビイロカスミカメムシに対してもアッセイした。ＳＢＬについては成長阻害を観察したが、他方の２つの鱗翅目種及び２つの半翅目有害昆虫では観察しなかった。
昆虫毒素ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７３８９は、様々な鞘翅目及び鱗翅目有害昆虫種に対して活性を実証する。昆虫毒素ＴＩＣ７３８９は、鱗翅目有害昆虫のダイズシャクトリムシに対して毒性を実証する。
実施例３
トリプシン消化したＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３、ならびにキモトリプシン消化したＴＩＣ７０４０ＨＴは、ウエスタンコーンルートワームに対して活性を実証する
本実施例は、ウエスタンコーンルートワームに対してトリプシン及びキモトリプシン消化したＴＩＣ７０４０ＨＴ、ならびにトリプシン消化したＴＩＣ７３８３タンパク質が呈する阻害活性を例示する。
ＴＩＣ７０４０ＨＴのタンパク質試料を、別個の反応物中でトリプシン及びキモトリプシン消化に供した。同様に、ＴＩＣ７３８３をトリプシン消化に供した。トリプシン及びキモトリプシン消化を、当該技術分野において既知の方法を使用して実施した。消化したタンパク質を質量分析法によって分析し、得られたタンパク質断片を決定した。ＴＩＣ７０４０ＨＴの得られたトリプシン及びキモトリプシン断片、ならびにＴＩＣ７３８３の得られたトリプシン断片を表６に提示する。
消化したタンパク質を、ウエスタンコーンルートワームに対するバイオアッセイに使用した。表６は、消化した各タンパク質調製物、ならびに全長ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３タンパク質の活性のアッセイを示す。
表６．ウエスタンコーンルートワームに対するＴＩＣ７０４０ＨＴ、トリプシン及びキモトリプシン消化したＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７３８３、ならびにトリプシン消化したＴＩＣ７３８３のバイオアッセイでの活性。
Figure 2020515291
表６に見ることができる通り、トリプシン及びキモトリプシン消化したＴＩＣ７０４０ＨＴならびにトリプシン消化したＴＩＣ７３８３タンパク質は、ウエスタンコーンルートワームに対する活性を保持した。
実施例４
ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３の切断型は、昆虫バイオアッセイにおいて鞘翅目活性を実証する
本実施例は、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａの様々な種に対してＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３タンパク質の切断型が呈する阻害活性を例示する。
ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３の切断型をコードするコード配列を、当該技術分野において既知の方法を使用して生成し、Ｂｔ中で発現されるように細菌発現ベクターにクローニングした。切断型タンパク質を昆虫食餌中に提供し、鞘翅目有害昆虫に対する活性についてアッセイした。全長ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３に対する切断型ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３毒素のアミノ酸位置を表７に示す。
ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３の切断型を発現する形質転換したＢｔを２４時間成長させて、胞子に加えて可溶化タンパク質をアッセイのために昆虫食餌に添加した。大量死及び成長阻害を、ＴＩＣ７０４０ＨＴまたはＴＩＣ７３８３の切断型を発現するＢｔ株の培養物を含む食餌上の昆虫と、未処理対照培養物を含む食餌上の昆虫との増殖及び発達を比較することによって評価した。
ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３の切断型を、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａの様々な種に対する毒性についてアッセイした。各毒素の調製物を、鞘翅目種のウエスタンコーンルートワーム、Ｃｒｙ３Ｂｂ耐性ウエスタンコーンルートワーム、及びコロラドハムシに対してアッセイした。
鞘翅目有害昆虫に対して活性を観察した。各タンパク質で観察した成長阻害（Ｓ）及び大量死（Ｍ）に関するバイオアッセイでの活性を表７に提示し、表中「＋」は活性を示し、空白のセルは活性を全く観察しなかったことを示し、「ＮＴ」は、その特定の有害昆虫に対して毒素をアッセイしなかったことを示す。全長ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３の活性を、切断型タンパク質活性との比較のためにも提供する。
表７．鞘翅目有害昆虫に対するＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３の切断型に関するバイオアッセイでの活性。
Figure 2020515291
表７に見ることができる通り、ＴＩＣ７０４０ＨＴ及びＴＩＣ７３８３の切断型は、ＷＣＲ及びＣＰＢに対する活性を維持した。
実施例５
植物細胞中での発現のための、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ならびにＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３の切断型バリアントをコードする合成コード配列の設計
合成または人工コード配列を、植物中におけるＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ならびにＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３の切断型バリアントの発現に使用するために構築した。これらの合成コード配列をバイナリー植物形質転換ベクターにクローニングし、それらを使用して植物細胞を形質転換した。合成核酸配列を米国特許第５，５００，３６５号明細書に一般に記載されている方法によって合成し、これは特定の好ましくない問題配列、例えば、ＡＴＴＴＡ及びＡ／Ｔリッチ植物ポリアデニル化配列などを回避しながら、天然のＢｌタンパク質のアミノ酸配列を保存した。ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ならびにＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３殺虫性タンパク質の切断型バリアントの合成コード配列を、表８に提示する。
表８．ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ならびにＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３の切断型バリアントをコードする、植物細胞中での発現のために使用した合成コード配列。
Figure 2020515291
Figure 2020515291
Figure 2020515291
実施例６
植物細胞中におけるＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、ならびにＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、及びＴＩＣ７３８３の切断型バリアントの発現を目的とした発現カセット
様々な植物発現カセットを、表８に記載されるような配列を用いて設計した。そのような発現カセットは、植物プロトプラスト中での一過性発現または植物細胞の形質転換に有用である。典型的な発現カセットを、植物細胞内でのタンパク質の最終的な配置に関して設計する。色素体標的タンパク質について、合成ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３殺虫性タンパク質の切断型バリアントコード配列を、葉緑体標的化シグナルペプチドコード配列とインフレームで機能的に連結する。得られた植物形質転換ベクターは、５’でリーダーに機能的に連結され、５’でイントロンに機能的に連結され（または場合によりイントロン無し）、色素体標的または非標的ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３タンパク質の切断型バリアントをコードする合成コード配列に５’で機能的に連結され、それが次に５’で３’ＵＴＲに機能的に連結される、構成的プロモーターを含む殺虫性タンパク質の発現を目的とした第１導入遺伝子カセット、及び、グリホサート選択または抗生物質選択を使用する形質転換植物細胞の選択を目的とした第２導入遺伝子カセットを含む。上に記載したエレメントの全てを、制限エンドヌクレアーゼ部位またはライゲーション非依存性クローニング部位などの、発現カセットの構築のために提供した追加の配列と多くの場合に隣接して配置する。
実施例７
ＴＩＣ７３８２は、安定に形質転換したトウモロコシ植物中で発現させる場合、ウエスタンコーンルートワームに対して有効な抵抗性を提供する
本実施例は、植物中で発現され、食餌として各々の有害昆虫に提供される場合、ウエスタンコーンルートワームなどのＣｏｌｅｏｐｔｅｒａに対してＴＩＣ７３８２の切断型が呈する阻害活性を例示する。
非標的ＴＩＣ７３８２（ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１）ならびに切断型バリアントのＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１及びＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１を発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターを、当該技術分野において既知の方法を使用してクローニングした。植物形質転換ベクターは、５’でリーダーに機能的に連結され、５’でイントロンに機能的に連結され、ＴＩＣ７３８２または切断型バリアントをコードする合成コード配列に５’で機能的に連結され、その各々が開始メチオニンの直後に追加のアラニン残基を含んでいて、それが次に５’で３’ＵＴＲに機能的に連結された、根優先的プロモーターを含んだＴＩＣ７３８２殺虫性タンパク質または切断型バリアントのうち１つの発現を目的とした第１導入遺伝子カセット、及び、グリホサートを使用する形質転換植物細胞の選択を目的とした第２導入遺伝子カセットを含んでいた。得られたベクターを使用し、当該技術分野において既知の方法を使用してトウモロコシ植物を安定に形質転換した。単一のＴ−ＤＮＡ挿入事象を選択して成長させた。殺虫活性を、安定に形質転換したトウモロコシ植物の根を餌とするウエスタンコーンルートワームに対してアッセイした。
Ｒ０の安定に形質転換した植物を使用して、鞘翅目抵抗性についてアッセイし、加えてＦ１子孫を生成した。複数の単一コピー事象を、各バイナリーベクター形質転換から選択した。各バイナリーベクター形質転換から生じるこれらの事象の一部を鞘翅目アッセイに使用した一方で、事象の別の一部を使用して、さらなる試験のためにＦ１子孫を生成した。
Ｒ０アッセイ植物を８インチのポットに移植した。植物にウエスタンコーンルートワームの卵を植え付けた。植付け前に卵をおよそ１０日間インキュベートして植付けの４日後に孵化するようにし、確実に十分な数の幼虫が生残してトウモロコシの根を攻撃できるようにする。形質転換植物に、およそＶ２〜Ｖ３段階で植え付けた。侵入後、およそ２８日間植物を成長させた。植物をポットから取り出し、根を慎重に洗浄して土を全て除去した。根の損傷を、表９で提示した通り、１〜５の損傷評価尺度を使用して評価した。陰性対照との比較も行い、アッセイを適正に実施したことを保証した。低い根の損傷スコアは、ＷＣＲに対するＴＩＣ７３８２タンパク質または切断型バリアントによって付与された抵抗性を示す。１．０〜２．５のＲＤＲスコアは良好な有効性を表し、２．６〜３．５のＲＤＲスコアは中等度の有効性を表し、３．６〜５．０のＲＤＲスコアは低い有効性を表す。
表９．Ｒ０根の損傷評価スコア。
Figure 2020515291
Ｆ１アッセイについて、ウエスタンコーンルートワームの卵をおよそ１０日間インキュベートし、植付け後４日以内に孵化するようにした。植物に、およそＶ２〜Ｖ３段階で植え付けた。各ポットに約２，０００個の卵を植え付けた。侵入後、およそ２８日間植物を成長させた。植物をポットから取り出し、根を慎重に洗浄して土を全て除去した。根の損傷を、表１０で提示した通り、０〜３の損傷評価尺度を使用して評価した。陰性対照との比較を行い、アッセイを適正に実施したことを保証した。低い根の損傷スコアは、ＷＣＲに対するＴＩＣ７３８２、または切断型によって付与された抵抗性を示す。０．０〜０．７５のＦ１でのＲＤＲは良好な有効性を表し、０．７６〜１．５のＲＤＲは中等度の有効性を表し、１．６〜３．０のＲＤＲは低い有効性を表す。
表１０．Ｆ１根の損傷評価スコア。
Figure 2020515291
表１１は、ＴＩＣ７３８２タンパク質及び切断型バリアントについてアッセイした根の損傷評価（ＲＤＲ）平均を示す。
表１１．ＴＩＣ７３８２または切断型バリアントを発現するトランスジェニックトウモロコシ植物の根の損傷評価（ＲＤＲ）平均。
Figure 2020515291
表１１に見ることができる通り、切断型バリアントのＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１を生じさせるＴＩＣ７３８２タンパク質のＣ末端切断は、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１の根の損傷評価と比較して有効性を改善した。切断型バリアントのＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１を生じさせるＮ末端及びＣ末端の両方でのＴＩＣ７３８２タンパク質切断は、トウモロコシの根に対する損傷をより少なくし、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１及びＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿２．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１の根の損傷評価と比較した場合、より低いＲ０根の損傷評価によって実証される通り、さらに有効性を改善した。
実施例８
安定に形質転換したトウモロコシ植物中で発現させる場合の、鞘翅目コーンルートワーム害虫に対するＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、またはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントの活性アッセイ
本実施例は、トウモロコシの根を餌とする異なった鞘翅目種に対するＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントの阻害活性を例示する。
色素体標的及び非標的の両方のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントを発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターを、当該技術分野において既知の方法を使用してクローニングし、これらは表８に示すような配列を含む。得られたベクターを使用し、当該技術分野において既知の方法を使用してトウモロコシ植物を安定に形質転換する。単一のＴ−ＤＮＡ挿入事象を選択して成長させる。殺虫活性を、安定に形質転換したトウモロコシ植物の根を餌とする鞘翅目害虫のウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、ＮＣＲ）、メキシカンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ、ＭＣＲ）、ブラジリアンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｌｔｅａｔａ、ＢＺＲ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉｉ、ＳＣＲ）、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ＣＰＢ）、またはブラジリアンコーンルートワーム複合種（ＢＣＲ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｉｄｕｌａ及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａからなる）に対してアッセイする。
Ｒ０の安定に形質転換した植物を使用して、鞘翅目抵抗性についてアッセイし、加えてＦ１子孫を生成する。複数の単一コピー事象を、各バイナリーベクター形質転換から選択する。各バイナリーベクター形質転換から生じる事象の一部をＲ０鞘翅目アッセイに使用する一方で、事象の別の一部を使用して、さらなる試験のためにＦ１子孫を生成する。
Ｒ０アッセイ植物を８インチのポットに移植する。植物に、ウエスタンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、またはサザンコーンルートワームの卵を植え付ける。植付け前に卵をおよそ１０日間インキュベートして植付けの４日後に孵化するようにし、確実に十分な数の幼虫が生残してトウモロコシの根を攻撃できるようにする。形質転換植物に、およそＶ２〜Ｖ３段階で植え付ける。侵入後、およそ２８日間植物を成長させる。植物をポットから取り出し、根を慎重に洗浄して土を全て除去する。根の損傷を、実施例５の表９で提示した通り、１〜５の損傷評価尺度を使用して評価する。陰性対照との比較も行い、アッセイを適正に実施したことを保証する。各バイナリーベクター形質転換についての複数のＲ０事象を、鞘翅目アッセイで使用する。低い根の損傷スコアは、試験した鞘翅目害虫に対するＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントによって付与された抵抗性を示す。
各バイナリーベクター形質転換から生じるＲ０の安定に形質転換した事象の一部を使用して、Ｆ１子孫を生成する。Ｒ０の安定に形質転換した植物を自家受粉させて、Ｆ１子孫を生成する。Ｆ１種子を播種する。ヘテロ接合体植物を、当該技術分野において既知の分子方法によって同定し、鞘翅目害虫に対するアッセイ、加えて毒素タンパク質のＥＬＩＳＡ発現測定に使用する。各事象からのヘテロ接合体Ｆ１子孫の一部を昆虫アッセイに使用する一方で、別の一部を使用して毒素タンパク質発現を測定する。
ウエスタンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、またはサザンコーンルートワームの卵をおよそ１０日間インキュベートし、植付け後４日以内に孵化するようにする。ＷＣＲについては、各ポットに約２，０００個の卵を植え付ける。ＮＣＲについては、この種の卵の利用可能性が低いため、より少ない卵を使用する場合がある。植物に、およそＶ２〜Ｖ３段階で植え付ける。侵入後、およそ２８日間植物を成長させる。植物をポットから取り出し、根を慎重に洗浄して土を全て除去する。根の損傷を、実施例５の表１０で提示した通り、０〜３の損傷評価尺度を使用して評価する。陰性対照との比較を行い、アッセイを適正に実施したことを保証する。低い根の損傷スコアは、鞘翅目害虫に対するＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３タンパク質の切断型バリアントによって付与された抵抗性を示す。
実施例９
安定に形質転換したトウモロコシ、ダイズ、または綿植物中で発現させる場合の、鱗翅目害虫に対するＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントの活性アッセイ
本実施例は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントを発現する安定に形質転換したトウモロコシ、ダイズまたは綿植物の組織を摂食した様々な鱗翅目害虫種に対する活性のアッセイを例示する。
色素体標的及び非標的の両方のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントを発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターを、当該技術分野において既知の方法を使用してクローニングし、これらは表８に提示したようなコード配列を含む。
トウモロコシ、ダイズ、または綿を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換方法を使用して、上に記載した形質転換バイナリーベクターで形質転換する。形質転換細胞を当該技術分野において既知の方法によって誘導し、植物を形成する。植物リーフディスクを使用するバイオアッセイを、米国特許第８，３４４，２０７号明細書に記載されるものと同様に実施する。非形質転換トウモロコシ、ダイズ、または綿植物を使用して、陰性対照として使用する組織を得る。各バイナリーベクターの複数の形質転換事象を、鱗翅目害虫、例えば、これらに限定されないが、ブラックカットワーム、コーンイヤーワーム、コナガ、ヨーロピアンコーンボーラー、フォールアーミーワーム、サザンアーミーワーム、ダイズシャクトリムシ、サウスウエスタンコーンボーラー、タバコバッドワーム、及びベルベットビーンキャタピラーなどに対して評価する。昆虫バイオアッセイにおいて成長阻害及び／または大量死を実証するそれらの昆虫を、試験したＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３昆虫毒素殺虫性タンパク質の切断型バリアントの効果を受けやすいと決定する。
実施例１０
安定に形質転換したキャノーラ植物中で発現させる場合の、ノミハムシ害虫に対するＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントの活性アッセイ
本実施例は、ＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントを発現するトランスジェニックキャノーラ植物全体またはトランスジェニックキャノーラ植物に由来する組織を餌とさせる場合の、ノミハムシの様々な種に対する活性のアッセイを例示する。
色素体標的及び非標的の両方のＴＩＣ７０４０、ＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、またはＴＩＣ７０４０ＨＴ、ＴＩＣ７０４２、ＴＩＣ７３８２、もしくはＴＩＣ７３８３の切断型バリアントを発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターを、当該技術分野において既知の方法を使用してクローニングし、これらは表８に提示したようなコード配列を含む。
得られたバイナリー形質転換ベクターを使用し、当該技術分野において既知の方法を使用してキャノーラ植物細胞を安定に形質転換する。形質転換細胞を誘導し、植物を形成する。植物リーフディスクを使用するバイオアッセイを、畑で収集したノミハムシを使用して、米国特許第８，３４４，２０７号明細書に記載されるものと同様に実施する。非形質転換キャノーラ植物を使用して、陰性対照として使用する組織を得る。各バイナリーベクターの複数の形質転換事象を、鞘翅目ノミハムシ害虫、例えば、これらに限定されないが、アブラナ科植物ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、キスジノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｔｒｉｏｌａｔａ）、及びウエスタンブラックノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｐｕｓｉｌｌａ）などに対して評価する。ノミハムシの大量死を、ノミハムシが摂食し続けている各々の日で決定する。リーフディスクを１２日間にわたって２〜３日ごとに交換し、摂食のために新鮮な材料がノミハムシに利用可能であることを保証し、試料中のタンパク質分解に関するいかなる影響も減少させる。
あるいは、形質転換したキャノーラ植物を、ノミハムシの侵入が発生している畑に植えることができる。植物をテント内に収容すると、土壌から出現するこれらのノミハムシが試験区から脱出するのを防止し得る。キャノーラ葉の損傷評価を行って、どの植物がより損傷が少なかったのか、かつノミハムシに対して抵抗性を実証したのかを決定し得る。
実施例１１
ＴＩＣ７３８３の切断型は、安定に形質転換したトウモロコシ植物中においてコーンルートワームに対する有効性を改善する
本実施例は、Ｎ末端、Ｃ末端、または両方の末端での切断によるＴＩＣ７３８３の有効性の改善を例示する。
非標的ＴＩＣ７３８３及び切断型バリアントを発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターを、当該技術分野において既知の方法を使用してクローニングした。植物形質転換ベクターは、５’でリーダーに機能的に連結され、５’でイントロンに機能的に連結され、ＴＩＣ７３８３または切断型バリアントをコードする合成コード配列に５’で機能的に連結され、その一部が開始メチオニンの直後に追加のアラニン残基を含んでいて、それが次に５’で３’ＵＴＲに機能的に連結された、根優先的プロモーターを含んだＴＩＣ７３８３殺虫性タンパク質または切断型バリアントの発現を目的とした第１導入遺伝子カセット、及び、グリホサートを使用する形質転換植物細胞の選択を目的とした第２導入遺伝子カセットを含んでいた。得られたベクターを使用し、当該技術分野において既知の方法を使用してトウモロコシ植物を安定に形質転換した。単一のＴ−ＤＮＡ挿入事象を選択して成長させた。殺虫活性を、安定に形質転換したトウモロコシ植物の根を餌とするウエスタンコーンルートワームに対してアッセイした。
Ｒ０の安定に形質転換した植物を使用して、ウエスタンコーンルートワームに対する抵抗性についてアッセイし、加えてＦ１子孫を生成した。複数の単一コピー事象を、各バイナリーベクター形質転換から選択した。各バイナリーベクター形質転換から生じるこれらの事象の一部を鞘翅目アッセイに使用した一方で、事象の別の一部を使用して、さらなる試験のためにＦ１子孫を生成した。Ｒ０及びＦ１の根の損傷評価スコアを、実施例７に提示した、それぞれ表９及び表１０に提示したような根の損傷評価スコアを使用して決定した。表１２は、ＴＩＣ７３８３及び切断型バリアントを発現するＲ０及びＦ１の安定に形質転換したトウモロコシ植物から得られた根の損傷評価スコアの平均を示す。ＴＩＣ７３８３及び対応する切断型バリアントのタンパク質発現レベルも表１２に示し、百万分率（ｐｐｍ）として表す。
表１２に見ることができる通り、Ｎ末端、Ｃ末端、または両方の末端での切断は、全長ＴＩＣ７３８３タンパク質（ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿１．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１）と比較して、より低い根の損傷評価スコアの平均によって実証される通り、切断型バリアントの一部において有効性を改善した。ＴＩＣ７３８３毒素の切断は、ほとんどの場合において同様に植物内での発現も改善した。
表１２．ＴＩＣ７３８３及び切断型バリアントを発現する安定に形質転換したトウモロコシ植物の根の損傷評価（ＲＤＲ）スコア平均。
Figure 2020515291
実施例１２
安定に形質転換したトウモロコシ植物中におけるウエスタンコーンルートワームに対するＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３及びＴＩＣ７０４２のキメラの活性アッセイ
本実施例は、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７０４２のキメラの設計ならびにキメラを発現する安定に形質転換したトウモロコシ植物中におけるウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）に対する活性のアッセイを例示する。
ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７０４２のキメラを設計し、１つの毒素のドメイン１及び２（Ｄ１Ｄ２）を、別の毒素の第３ドメイン（Ｄ３）と組み合わせた。以下の表１３は、各キメラの組成を示す。
表１３．ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７０４２キメラの組成。
Figure 2020515291
ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７０４２の非標的キメラを発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターを、当該技術分野において既知の方法を使用してクローニングした。植物形質転換ベクターは、５’でリーダーに機能的に連結され、５’でイントロンに機能的に連結され、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７０４２のキメラをコードする合成コード配列に５’で機能的に連結され、それらが開始メチオニンの直後に追加のアラニン残基を含んでいて、それが次に５’で３’ＵＴＲに機能的に連結された、根優先的プロモーターを含んだキメラ毒素殺虫性タンパク質の発現を目的とした第１導入遺伝子カセット、ならびに、グリホサートを使用する形質転換植物細胞の選択を目的とした第２導入遺伝子カセットを含んでいた。得られたベクターを使用し、当該技術分野において既知の方法を使用してトウモロコシ植物を安定に形質転換した。単一のＴ−ＤＮＡ挿入事象を選択して成長させた。殺虫活性を、安定に形質転換したトウモロコシ植物の根を餌とするウエスタンコーンルートワームに対してアッセイした。
Ｒ０の安定に形質転換した植物を使用して、ウエスタンコーンルートワームに対する抵抗性についてアッセイし、加えてＦ１子孫を生成した。複数の単一コピー事象を、各バイナリーベクター形質転換から選択した。各バイナリーベクター形質転換から生じるこれらの事象の一部を鞘翅目アッセイに使用した一方で、事象の別の一部を使用して、さらなる試験のためにＦ１子孫を生成した。Ｒ０及びＦ１の根の損傷評価スコアを、実施例７に提示した、それぞれ表９及び表１０に提示したような根の損傷評価スコアを使用して決定した。表１４は、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７０４２のキメラまたは切断型バリアントを発現するＲ０及びＦ１の安定に形質転換したトウモロコシ植物から得られた根の損傷評価スコアの平均を示し、「ＮＴ」は未試験を示す。Ｎ末端及びＣ末端プロトキシンドメインで切断したＴＩＣ７３８２バリアント（ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１）ならびにＮ末端及びＣ末端プロトキシンドメインで切断したＴＩＣ７３８３バリアント（ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１）との比較を行う。
表１４．ウエスタンコーンルートワームに対する、ＴＩＣ７３８１、ＴＩＣ７３８２、ＴＩＣ７３８３、及びＴＩＣ７０４２のキメラを発現する安定に形質転換したトウモロコシ植物の根の損傷評価（ＲＤＲ）スコア平均。
Figure 2020515291
表１４に見ることができる通り、ＴＩＣ７３８２のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成されるキメラ毒素ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１は、陰性対照、ＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８２＿３．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１、及びＣＲ−ＢＲＥｌａ．ＴＩＣ７３８３＿７．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１と比較してＲ０及びＦ１で良好な有効性を示した。ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１を発現する４つのＦ１事象をアッセイに含めた。根の損傷評価スコアは０．１１〜０．７９の範囲であり、（ＲＤＲ：０．１１、０．２０、０．３０、及び０．７９）であった。０．１１のＲＤＲを有する、ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１を発現する１つの事象は、商業的防除に相当する。上に提示したデータに加えて、キメラ毒素ＧＯＩ−ＴＩＣ１０７４６．ｎｎｏ＿Ｍｃ：１を発現する細菌から単離したタンパク質は、食餌バイオアッセイで提示した場合、ノーザンコーンルートワームに対する活性も実証した。
実施例１３
安定に形質転換したトウモロコシ植物中におけるコーンルートワームに対するＴＩＣ７３８２及びＴＩＣ７３８３のキメラの活性アッセイ
本実施例は、ＴＩＣ７３８２及びＴＩＣ７３８３のキメラの設計ならびにキメラを発現する安定に形質転換したトウモロコシ植物中におけるウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）に対する活性のアッセイを例示する。
植物中での発現のために設計した、ＴＩＣ７３８２のドメイン１及び２ならびにＴＩＣ７３８３のドメイン３で構成されるキメラ毒素をコードする合成コード配列を、当該技術分野において既知の方法を使用してクローニングする。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４６ＮＴｅｒｍＥｘｔ１（配列番号：１２５、配列番号：１２４によってコードされる）は、ＴＩＣ７３８２のＮ末端延長を含む。キメラ毒素ＴＩＣ１０７４６ＮＴｅｒｍＥｘｔ２（配列番号：１２７、配列番号：１２６によってコードされる）は、ＴＩＣ７３８３のＮ末端延長を含む。合成コード配列を、実施例１２に記載したものと同様にバイナリー植物形質転換ベクターにクローニングし、それらを使用してトウモロコシ植物を形質転換する。コーンルートワーム種、例えば、ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ＷＣＲ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、ＮＣＲ）、メキシカンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ、ＭＣＲ）、ブラジリアンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｌｔｅａｔａ、ＢＺＲ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉｉ、ＳＣＲ）、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ＣＰＢ）、またはブラジリアンコーンルートワーム複合種（ＢＣＲ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｉｄｕｌａ及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａからなる）などの侵入後のＲ０及びＦ１植物について、実施例８で先に記載した通りに、根アッセイを実施する。非形質転換トウモロコシ植物対照物と比較した、Ｒ０及びＦ１植物に関する低い根の損傷評価（ＲＤＲ）スコアの平均は、キメラ毒素の発現によって付与されたコーンルートワーム種に対する抵抗性を実証している。
本明細書で開示され、かつ請求される組成物の全ては、本開示を踏まえて過度な実験を行うことなく作製され、かつ実行され得る。本発明の組成物が前述の例示的な実施形態の観点から記載されてきた一方で、変形、変化、修正、及び変更が、本発明の真の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物に適用されてよいことが当業者には明らかとなる。より具体的には、化学的かつ生理学的の両方に関連する特定の剤が、本明細書に記載される剤と置換されてもよいが、同じまたは類似の結果が達成されることになることが明らかとなる。当業者には明らかなそのような類似した置換及び修正は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される通り、本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあると見なされる。
本明細書で引用される全ての出版物及び公開特許文献は、個々の出版物または特許出願が、参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同程度に参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (29)

  1. 殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに機能的に連結される異種プロモーターを含む組換え核酸分子であって、
    ａ．前記殺虫性タンパク質が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７のアミノ酸配列を含む、あるいは
    ｂ．前記殺虫性タンパク質が、
    ｉ．配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または
    ｉｉ．配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または
    ｉｉｉ．配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または
    ｉｖ．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または
    ｖ．配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または
    ｖｉ．配列番号：５３、もしくは配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または
    ｖｉｉ．配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、あるいは
    ｃ．前記ポリヌクレオチドセグメントが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、または配列番号：１２６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズする、前記組換え核酸分子。
  2. ａ．前記組換え核酸分子が、植物中で前記殺虫性タンパク質を発現するように機能する配列を含む、または
    ｂ．前記組換え核酸分子が、殺虫有効量の前記殺虫性タンパク質を産生するために植物細胞中で発現される、または
    ｃ．前記組換え核酸分子が、ベクターと機能的に連結され、前記ベクターがプラスミド、ファージミド、バクミド、コスミド、及び細菌もしくは酵母の人工染色体からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  3. 宿主細胞内に存在すると定義され、前記宿主細胞が、細菌細胞及び植物細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  4. 前記細菌宿主細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、及びＥｒｗｉｎｉａからなる群から選択される細菌の属に由来する、請求項３に記載の組換え核酸分子。
  5. 前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ種が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、前記Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｕｓであり、または前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項４に記載の組換え核酸分子。
  6. 前記植物細胞が、双子葉植物または単子葉植物の植物細胞である、請求項３に記載の組換え核酸分子。
  7. 前記植物宿主細胞が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ｃｉｔｒｕｓ、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、エンバク、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ｓｏｒｇｈｕｍ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギの植物細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の組換え核酸分子。
  8. 前記殺虫性タンパク質が、鞘翅目昆虫に対して活性を呈する、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  9. 前記昆虫が、ウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、メキシカンコーンルートワーム、ブラジリアンコーンルートワーム、コロラドハムシ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｉｄｕｌａ及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａからなるブラジリアンコーンルートワーム複合種、アブラナ科植物ノミハムシ、キスジノミハムシ、またはウエスタンブラックノミハムシである、請求項８に記載の組換え核酸分子。
  10. 前記殺虫性タンパク質が、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫種に対して活性を呈する、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  11. 前記昆虫が、ブラックカットワーム、コーンイヤーワーム、コナガ、ヨーロピアンコーンボーラー、フォールアーミーワーム、サザンアーミーワーム、ダイズシャクトリムシ、サウスウエスタンコーンボーラー、タバコバッドワーム、ベルベットビーンキャタピラー、シュガーケーンボーラー、レッサーコーンストークボーラー、ブラックアーミーワーム、ビートアーミーワーム、オールドワールドボールワーム、オリエンタルリーフワーム、またはピンクボールワームである、請求項１０に記載の組換え核酸分子。
  12. 請求項１に記載の前記組換え核酸分子を含む、植物またはその部位。
  13. 前記植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項１２に記載の植物またはその部位。
  14. 前記植物が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ｃｉｔｒｕｓ、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、エンバク、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、パイン、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ｓｏｒｇｈｕｍ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギからなる群から選択される、請求項１２に記載の植物またはその部位。
  15. 請求項１２に記載の前記植物の種子であって、前記種子が前記組換え核酸分子を含む、前記種子。
  16. 請求項１に記載の前記組換え核酸分子を含む、昆虫阻害組成物。
  17. 前記殺虫性タンパク質とは異なる少なくとも１つの他の殺虫剤をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１６に記載の昆虫阻害組成物。
  18. 前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、及び補助タンパク質からなる群から選択される、請求項１７に記載の昆虫阻害組成物。
  19. 前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目、またはＨｅｍｉｐｔｅｒａ目のうち１つ以上の害虫種に対して活性を呈する、請求項１７に記載の昆虫阻害組成物。
  20. 前記少なくとも１つの他の殺虫性タンパク質が、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃバリアント、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａバリアント、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ−ＡＸＭＩ−、ＡＸＭＩ−８８、ＡＸＭＩ−９７、ＡＸＭＩ−１０２、ＡＸＭＩ−１１２、ＡＸＭＩ−１１７、ＡＸＭＩ−１００、ＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、及びＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ−１５０、ＡＸＭＩ−１７１、ＡＸＭＩ−１８４、ＡＸＭＩ−１９６、ＡＸＭＩ−２０４、ＡＸＭＩ−２０７、ＡＸＭＩ−２０９、ＡＸＭＩ−２０５、ＡＸＭＩ−２１８、ＡＸＭＩ−２２０、ＡＸＭＩ−２２１ｚ、ＡＸＭＩ−２２２ｚ、ＡＸＭＩ−２２３ｚ、ＡＸＭＩ−２２４ｚ及びＡＸＭＩ−２２５ｚ、ＡＸＭＩ−２３８、ＡＸＭＩ−２７０、ＡＸＭＩ−２７９、ＡＸＭＩ−３４５、ＡＸＭＩ−３３５、ＡＸＭＩ−Ｒ１及びそのバリアント、ＩＰ３及びそのバリアント、ＤＩＧ−３、ＤＩＧ−５、ＤＩＧ−１０、ＤＩＧ−６５７、ＤＩＧ−１１、Ｃｒｙ７１Ａａ１、Ｃｒｙ７２Ａａ１、ＰＨＩ−４バリアント、ＰＩＰ−７２バリアント、ＰＩＰ−４５バリアント、ＰＩＰ−６４バリアント、ＰＩＰ−７４バリアント、ＰＩＰ−７５バリアント、ＰＩＰ−７７バリアント、Ａｘｍｉ４２２、Ｄｉｇ−３０５、Ａｘｍｉ４４０、ＰＩＰ−４７バリアント、Ａｘｍｉ２８１、ＢＴ−００９、ＢＴ−００１２、ＢＴ−００１３、ＢＴ−００２３、ＢＴ００６７、ＢＴ−００４４、ＢＴ−００５１、ＢＴ−００６８、ＢＴ−０１２８、ＤＩＧ−１７、ＤＩＧ−９０、ＤＩＧ−７９、Ｃｒｙ１ＪＰ５７８Ｖ、Ｃｒｙ１ＪＰＳ１、ならびにＣｒｙ１ＪＰＳ１Ｐ５７８Ｖからなる群から選択される、請求項１９に記載の昆虫阻害組成物。
  21. 前記組換え核酸分子を発現する植物細胞を含むと定義される、請求項１６に記載の昆虫阻害組成物。
  22. 請求項１２に記載の前記植物またはその部位から作製される商品生産物であって、前記商品生産物が、検出可能な量の前記組換え核酸分子またはそれによってコードされる殺虫性タンパク質を含む、前記商品生産物。
  23. 穀物取扱業者によって袋詰めされる商品トウモロコシ、コーンフレーク、コーンケーキ、トウモロコシ粉、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンサイレージ、コーンスターチ、コーンシリアルなど、綿実全体または加工綿実、綿実油、リント布、飼料または食料、繊維、紙、バイオマス用に加工される種子及び植物部位、ならびに燃料製品、例えば、綿実油に由来する燃料または綿繰り機廃棄物に由来するペレットなど、ダイズ種子全体または加工ダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズ糠、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズを含む動物飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス、ならびにダイズ植物及びダイズ植物部位を使用して作製される燃料製品からなる群から選択される、請求項２２に記載の商品生産物。
  24. 種子の作製方法であって、
    ａ．請求項１９に記載の少なくとも第１種子を播種することと、
    ｂ．前記種子に由来する植物を成長させることと、
    ｃ．前記植物から種子を収穫することとを含み、前記収穫された種子が前記組換え核酸分子を含む、前記方法。
  25. 昆虫の侵入に抵抗性がある植物であって、前記植物の細胞が請求項１に記載の前記組換え核酸分子を含む、前記植物。
  26. 鞘翅目または鱗翅目種の害虫または害虫侵入の防除方法であって、
    ａ．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７に記載されるような、殺昆虫有効量の殺虫性タンパク質と前記害虫を接触させること、あるいは
    ｂ．ｉ．配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または
    ｉｉ．配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または
    ｉｉｉ．配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または
    ｉｖ．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または
    ｖ．配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または
    ｖｉ．配列番号：５３、もしくは配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または
    ｖｉｉ．配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、殺昆虫有効量の１つ以上の殺虫性タンパク質と前記害虫を接触させることを含む、前記方法。
  27. 植物ゲノムＤＮＡを含む試料中における、請求項１に記載の前記組換え核酸分子の存在の検出方法であって、
    ａ．請求項１に記載の前記ＤＮＡ分子を含む植物のゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするが、請求項１に記載の前記組換え核酸分子を含まない別の同系植物のゲノムＤＮＡとはそのようなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない核酸プローブと前記試料を接触させ、前記プローブが、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、または配列番号：１２６、あるいは
    ｉ．配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または
    ｉｉ．配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または
    ｉｉｉ．配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または
    ｉｖ．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または
    ｖ．配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または
    ｖｉ．配列番号：５３、もしくは配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または
    ｖｉｉ．配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫性タンパク質をコードする配列に相同または相補的であることと、
    ｂ．前記試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供することと、
    ｃ．前記プローブと前記試料のＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出することとを含む、前記方法。
  28. タンパク質を含む試料中における殺虫性タンパク質またはその断片の存在の検出方法であって、前記殺虫性タンパク質が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号３２、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、配列番号：１０９、配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１７、配列番号：１１９、配列番号：１２１、配列番号：１２３、配列番号：１２５、または配列番号：１２７のアミノ酸配列を含み、あるいは前記殺虫性タンパク質が、
    ｉ．配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７５、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３、配列番号：１０５、配列番号：１０７、もしくは配列番号：１０９と少なくとも７５％の同一性、または
    ｉｉ．配列番号：１１１、配列番号：１１３、配列番号：１１５、配列番号：１１９、配列番号：１２５、もしくは配列番号：１２７と少なくとも８０％、または
    ｉｉｉ．配列番号：１２１もしくは配列番号：１２３と少なくとも８５％の同一性、または
    ｉｖ．配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号１４、配列番号：３４、配列番号：４３、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５７、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８１、もしくは配列番号：１１７と少なくとも９０％の同一性、または
    ｖ．配列番号：１２、配列番号：１６、配列番号：３０、及び配列番号：５９と少なくとも９３％の同一性、または
    ｖｉ．配列番号：５３、もしくは配列番号：５５と少なくとも９４％の同一性、または
    ｂ．配列番号：３２、配列番号：６１、もしくは配列番号：８３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記方法が、
    ｉ．前記試料を免疫反応性抗体と接触させることと、
    ｉｉ．前記タンパク質の前記存在を検出することとを含む、前記方法。
  29. 検出の前記ステップが、ＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロットを含む、請求項２８に記載の方法。
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