CN110678067B - 新型昆虫抑制蛋白 - Google Patents

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Abstract

公开了一种对鞘翅目和鳞翅目害虫物种表现出毒性活性的杀虫蛋白类别，所述杀虫蛋白类别包括但不限于TIC7040、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389。提供了DNA构建体，所述DNA构建体含有编码所述TIC7040、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389杀虫蛋白的重组核酸序列。提供了抗鞘翅目和鳞翅目侵染的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，它们含有编码本发明的所述TIC7040、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389杀虫蛋白的重组核酸序列。还提供了用于在生物样品中检测本发明的重组核酸序列或蛋白的存在的方法，以及使用所述TIC7040、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389杀虫蛋白控制鞘翅目和鳞翅目物种害虫的方法。

Description

新型昆虫抑制蛋白
相关申请的引用
本申请要求2017年4月3日提交的美国临时申请号62/480,614的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。
序列表的并入
名为“MONS443WO-sequence_listing.txt”的文件创建于2018年4月2日，其中包含序列表的计算机可读形式。该文件为653千字节(在中测得)，同时以电子方式提交(使用美国专利局EFS-Web归档系统(United States Patent Office EFS-Webfiling system))，并且其全文以引用方式并入本申请。
技术领域
本发明整体涉及昆虫抑制蛋白领域。公开了一类新型的对作物植物和种子的农业相关害虫表现出昆虫抑制活性的蛋白。具体地讲，所公开的蛋白对作物植物和种子的农业相关害虫(特别是害虫的鞘翅目(Coleopteran)和鳞翅目(Lepidopteran)物种)具有杀昆虫活性。提供了含有编码一种或多种所公开的毒素蛋白的重组多核苷酸构建体的植物、植物部分和种子。
背景技术
提高重要的农业植物(尤其包括玉米、大豆、甘蔗、稻、小麦、蔬菜和棉花)的作物产量已经变得越来越重要。除了越来越需要农业产品来为不断增长的人口供给食物、衣物并提供能量之外，预测与气候相关的影响以及来自不断增长的人口使用除农业活动之外的土地的压力将会减少可用于耕作的耕地。这些因素导致对食品安全的悲观预期，特别是在植物生物工艺学和农艺操作缺乏重大改进的情况下。鉴于这些压力，在工艺学、农业技术和害虫管理方面的环境可持续改进是在有限量的可用于耕作的耕地上扩大作物生产的至关重要工具。
昆虫，特别是鳞翅目和鞘翅目内的昆虫，被认为是损害大田作物从而降低受侵染地区的作物产量的主要原因。从历史上看，农业中依赖于密集施加合成化学杀昆虫剂作为害虫控制剂。对环境和人类健康的关注，除了出现的抗性问题之外，还刺激了生物杀虫剂的研究和开发。这项研究工作导致逐步发现和使用各种昆虫病原微生物物种，包括细菌。
当昆虫病原细菌(尤其是属于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌)的潜能被发现并开发为生物害虫控制剂时，生物控制模式发生转变。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis(Bt))细菌的菌株已被用作杀虫蛋白的来源，因为发现Bt菌株对特定的昆虫显示出高毒性。已知Bt菌株在孢子形成开始时以及在静止生长期期间产生定位在伴胞晶体包涵体内的δ-内毒素(例如Cry蛋白)，并且还已知其产生分泌型杀昆虫蛋白。一旦被易感昆虫摄取，δ-内毒素以及分泌的毒素在中肠上皮表面发挥其作用，破坏细胞膜，导致细胞破裂和死亡。编码杀昆虫蛋白的基因也已经在除Bt之外的细菌物种中被鉴定出，这些细菌物种包括其他芽孢杆菌属和多种另外的细菌物种，诸如侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)(“Ls”，以前称为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))和日本金龟子芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。
结晶且分泌型的可溶性杀昆虫毒素对其宿主具有高度特异性，并且作为化学杀昆虫剂的替代品已经在全世界获得接受。例如，杀昆虫毒素蛋白已被用于各种农业应用，以保护农业上重要的植物免受昆虫侵染，减少对化学杀虫剂应用的需要，并增加产量。杀昆虫毒素蛋白通过以下方式来控制作物植物的农业相关害虫：通过机械方法，诸如通过喷洒以将含有各种细菌菌株的微生物制剂分散到植物表面上以及通过使用遗传转化技术以产生表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物和种子。
表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物的使用已经全球适应。例如，在2012年，种植了2610万公顷的表达Bt毒素的转基因作物(James，C.，Global Status of CommercializedBiotech/GM Crops：2012.ISAAA Brief No.44)。转基因防昆虫作物的全球使用以及这些作物中所用的有限数量的杀昆虫毒素蛋白已经对现有的昆虫等位基因产生了选择压力，这些现有的昆虫等位基因赋予了对当前使用的杀昆虫蛋白的抗性。
目标害虫对杀昆虫毒素蛋白的抗性的发展产生了对发现和开发新形式杀昆虫毒素蛋白的持续需求，这些新形式杀昆虫毒素蛋白可用于管理对表达杀昆虫毒素蛋白的转基因作物的昆虫抗性的增加。新的蛋白毒素具有改进的功效并且表现出对更广谱的易感昆虫物种的控制，这将减少可以产生抗性等位基因的存活昆虫的数量。此外，在一种植物中使用两种或更多种对相同害虫有毒性并展示出不同作用模式的转基因杀昆虫毒素蛋白在任何单一目标昆虫物种中降低了抗性的可能性。
因此，本发明人在本文中公开了来自侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporous)的新型蛋白毒素家族，以及对目标鳞翅目和鞘翅目，特别是对西方玉米根虫和北方玉米根虫表现出杀昆虫活性的类似毒素蛋白、变体蛋白和示例性重组蛋白。
发明内容
本文公开了一组新型的具有昆虫抑制活性的杀虫蛋白(毒素蛋白)，在本文中称之为TIC7040相关蛋白毒素，其被证明对作物植物的一种或多种害虫表现出抑制活性。所述TIC7040蛋白毒素类别中的一种和多种TIC7040蛋白可以单独地或者与其他杀昆虫蛋白和毒性剂组合地用于制剂和植物中(in planta)，从而为农业系统当前使用的杀昆虫蛋白和杀昆虫剂化学品提供替代品。
在一个实施方案中，本申请公开了一种重组核酸分子，该重组核酸分子包含可操作地连接至编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的异源启动子，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ IDNO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：127的氨基酸序列；或者(b)所述杀虫蛋白包含：(i)与SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：63、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109具有至少75％同一性的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：127具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)与SEQID NO：121或SEQ ID NO：123具有至少85％同一性的氨基酸序列；或(iv)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ NO：81或SEQ ID NO：117具有至少90％同一性的氨基酸序列；或(v)与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30和SEQ IDNO：59具有至少93％同一性的氨基酸序列；或(vi)与SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：55具有至少94％同一性的氨基酸序列；或(vii)与SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：83具有至少99％同一性的氨基酸序列；或者(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ IDNO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQID NO：124或SEQ ID NO：126的核苷酸序列的多核苷酸杂交；或者(d)所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体组成的组。重组核酸分子可包含用于在植物中表达杀虫蛋白的序列；或在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的杀虫蛋白。
在本申请的另一个实施方案中是宿主细胞，其包含本申请的重组核酸分子，其中该宿主细胞选自由细菌和植物细胞组成的组。设想的宿主细胞包括农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)和欧文氏菌属(Erwinia)。在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属物种为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属为侧孢短芽孢杆菌，或所述埃希氏菌属为大肠杆菌(Escherichia coli)。设想的植物宿主细胞包括双子叶细胞和单子叶细胞。进一步设想的植物宿主细胞包括苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(棉属(Gossypium sp.))、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
在又一个实施方案中，杀虫蛋白对鞘翅目昆虫表现出活性，所述鞘翅目昆虫包括西方玉米根虫、南方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、巴西玉米根虫、科罗拉多马铃薯甲虫、由叶甲蝽(Diabrotica viridula)和南美叶甲(Diabrotica speciosa)组成的巴西玉米根虫复合群(Brazilian Com Rootworm complex)、十字花科跳蚤甲虫、黄曲条跳蚤甲虫和西部黑跳蚤甲虫。
在另一个实施方案中，杀虫蛋白对鳞翅目昆虫表现出活性，所述鳞翅目昆虫包括黑切根虫、玉米穗虫、小菜蛾、欧洲玉米螟、秋粘虫、南方粘虫、大豆尺蠖、西南玉米螟、烟草夜蛾、藜豆毛虫、甘蔗螟、小玉米茎螟虫、黑粘虫、甜菜粘虫、东半球棉铃虫、东方叶虫或红铃虫。
本申请还设想了包含重组核酸分子的植物，该重组核酸分子包含可操作地连接至编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的异源启动子，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：127的氨基酸序列；或者(b)所述杀虫蛋白包含：(i)与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109具有至少75％同一性的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ IDNO：125或SEQ ID NO：127具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)与SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：123具有至少85％同一性的氨基酸序列；或(iv)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ NO：81或SEQ ID NO：117具有至少90％同一性的氨基酸序列；或(v)与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：59具有至少93％同一性的氨基酸序列；或(vi)与SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：55具有至少94％同一性的氨基酸序列；或(vii)与SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：83具有至少99％同一性的氨基酸序列；或者(c)所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ D NO：124或SEQ D NO：126的核苷酸序列的互补序列杂交；或者(d)所述植物展现出可检测量的所述杀虫蛋白。在某些实施方案中，杀虫蛋白包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQID NO：125或SEQ ID NO：127。在一个实施方案中，该植物为单子叶植物或双子叶植物。在另一个实施方案中，该植物选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦。
在进一步的实施方案中，公开了包含重组核酸分子的种子。
在另一个实施方案中，设想了包含本申请所公开的重组核酸分子的昆虫抑制组合物。该昆虫抑制组合物还可包含编码与所述杀虫蛋白不同的至少一种其他杀虫剂的核苷酸序列。所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白。昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂对鳞翅目、鞘翅目或半翅目(Hemiptera)的一种或多种害虫物种表现出活性。在一个实施方案中，昆虫抑制组合物中的所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：CrylA、CrylAb、CrylAc、Cryl A.105、CrylAe、CrylB、CrylC、CrylC变体、CrylD、CrylE、CrylF、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、CrylL、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-AXMI-、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1及其变体、IP3及其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657DIG-11、Cry71Aa1、Cry72Aa1、PHI-4变体、PIP-72变体、PIP-45变体、PIP-64变体、PIP-74变体、PIP-75变体、PIP-77变体、Axmi422、Dig-305、Axmi440、PIP-47变体、Axmi281、BT-009、BT-0012、BT-0013、BT-0023、BT0067、BT-0044、BT-0051、BT-0068、BT-0128、DIG-17、DIG-90、DIG-79、CrylJP578V、CrylJPS1和Cry1 JPS1P578V。
设想了包含可检测量的本申请所公开的重组核酸分子的商品产品。此类商品产品包括由谷物处理器装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷类等；以及相应的棉花商品产品，诸如完整的或加工的棉籽、棉油、棉绒、由种子和植物部分加工而成的饲料或食品、纤维、纸材、生物质以及燃料产品，例如来源于棉油的燃料或来源于轧棉机废料的粒料；以及相应的大豆商品产品，诸如完整的或加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粉、大豆面、大豆片、大豆麸皮、豆奶、大豆奶酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸材、包含大豆的乳脂、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品；以及对应的稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、甜瓜和蔬菜商品产品，在适用情况下包括果汁、浓缩物、果酱、果胶、橘子果酱；以及含有可检测量的本申请的此类多核苷酸和/或多肽的其他可食用形式的商品产品。
本申请还设想了一种生产包含本申请所公开的重组核酸分子的种子的方法。该方法包括种植包含本申请所公开的重组核酸分子的种子中的至少一种；由该种子长出植物；并从这些植物收获种子，其中所收获的种子包含本申请的重组核酸分子。
在另一个例示性实施方案中，提供了一种抗昆虫侵染的植物，其中所述植物的细胞包含：(a)编码杀昆虫有效量的如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ IDNO：123、SEQ ID NO：125或SEQ D NO：127所示的杀虫蛋白的重组核酸分子；或(b)杀昆虫有效量的蛋白，其包含：(i)与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ D NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ IDNO：105、SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109具有至少75％同一性的氨基酸序列；或(ii)与SEQID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：127具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)与SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：123具有至少85％同一性的氨基酸序列；或(iv)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：117具有至少90％同一性的氨基酸序列；或(v)与SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：59具有至少93％同一性的氨基酸序列；或(vi)与SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：55具有至少94％同一性的氨基酸序列；或(vii)与SEQID NO：32、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：83具有至少99％同一性的氨基酸序列。
本申请还公开了用于控制鞘翅目或鳞翅目物种害虫，以及控制植物、尤其是作物植物的鞘翅目或鳞翅目物种害虫侵染的方法。在一个实施方案中，该方法包括(a)使害虫与杀昆虫有效量的一种或多种如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ IDNO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：127所示的杀虫蛋白接触；或(b)使害虫与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，该一种或多种杀虫蛋白包含：(i)与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109具有至少75％同一性的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：127具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)与SEQID NO：121或SEQ ID NO：123具有至少85％同一性的氨基酸序列；或(iv)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：117具有至少90％同一性的氨基酸序列；或(v)与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30和SEQ IDNO：59具有至少93％同一性的氨基酸序列；或(vi)与SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：55具有至少94％同一性的氨基酸序列；或(vii)与SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：83具有至少99％同一性的氨基酸序列。
本文还提供了一种检测重组核酸分子的存在的方法，该重组核酸分子包含编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ IDNO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ IDNO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：127的氨基酸序列；或者(b)所述杀虫蛋白包含：(i)与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ IDNO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQID NO：105、SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109具有至少75％同一性的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：125或SEQ IDNO：127具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)与SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：123具有至少85％同一性的氨基酸序列；或(iv)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQID NO：79、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：117具有至少90％同一性的氨基酸序列；或(v)与SEQID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：59具有至少93％同一性的氨基酸序列；或(vi)与SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：55具有至少94％同一性的氨基酸序列；或(vii)与SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：83具有至少99％同一性的氨基酸序列；或者(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：72、SEQ IDNO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124或SEQ ID NO：126的核苷酸序列的多核苷酸杂交。在本发明的一个实施方案中，该方法包括使核酸样品与核酸探针接触，该核酸探针在严格杂交条件下与来自包含编码本文所提供的杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的植物的基因组DNA杂交，并且在此类杂交条件下不与来自不包含该区段的其他方面等基因的植物的基因组DNA杂交，其中该探针与SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124或SEQ ID NO：126或编码杀虫蛋白的序列同源或互补，该杀虫蛋白包含：(i)与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109具有至少75％同一性的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ IDNO：125或SEQ ID NO：127具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)与SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：123具有至少85％同一性的氨基酸序列；或(iv)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：117具有至少90％同一性的氨基酸序列；或(v)与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：59具有至少93％同一性的氨基酸序列；或(vi)与SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：55具有至少94％同一性的氨基酸序列；或(vii)与SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：83具有至少99％同一性的氨基酸序列。该方法还可包括(a)使样品和探针经受严格杂交条件；以及(b)检测探针与样品的DNA的杂交。
本发明还提供了在包含蛋白的样品中检测杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ IDNO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ IDNO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQID NO：125或SEQ ID NO：127的氨基酸序列；或者所述杀虫蛋白包含：(i)与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：85、SEQ IDNO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109具有至少75％同一性的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：127具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)与SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：123具有至少85％同一性的氨基酸序列；或(iv)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：57、SEQID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：117具有至少90％同一性的氨基酸序列；或(v)与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：59具有至少93％同一性的氨基酸序列；或(vi)与SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：55具有至少94％同一性的氨基酸序列；或(vii)与SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：83具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该方法包括：(a)使样品与免疫反应性抗体接触；以及(b)检测所述蛋白的存在。在一些实施方案中，检测步骤包括ELISA或蛋白印迹。
序列简述
SEQ ID NO：1是从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC005019获得的编码TIC7040杀虫蛋白序列的核酸序列。
SEQ ID NO：2是TIC7040蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC005019获得的编码TIC7040HT杀虫蛋白序列的核酸序列。
SEQ ID NO：4是TIC7040HT蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是编码TIC7040_4杀虫蛋白序列的核酸序列，该TIC7040_4杀虫蛋白序列相对于TIC7040HT蛋白包含C末端截短。
SEQ ID NO：6是TIC7040_4蛋白的氨基酸序列，由TIC7040HT的氨基酸1至671组成。
SEQ ID NO：7是编码TIC7040_5杀虫蛋白序列的核酸序列，该TIC7040_5杀虫蛋白序列相对于TIC7040HT蛋白包含N末端和C末端截短。
SEQ ID NO：8是TIC7040_5蛋白的氨基酸序列，包含TIC7040HT的氨基酸13至611。
SEQ ID NO：9是编码TIC7040_6杀虫蛋白序列的核酸序列，该TIC7040_6杀虫蛋白序列相对于TIC7040HT蛋白包含N末端和C末端截短。
SEQ ID NO：10是TIC7040_6蛋白的氨基酸序列，包含TIC7040HT的氨基酸13至671。
SEQ ID NO：11是从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC005973获得的编码TIC7042杀虫蛋白序列的核酸序列。
SEQ ID NO：12是TIC7042蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC006713获得的编码TIC7381杀虫蛋白序列的核酸序列。
SEQ ID NO：14是TIC7381蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC007657获得的编码TIC7382杀虫蛋白序列的核酸序列。
SEQ ID NO：16是TIC7382蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17是从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC008106获得的编码TIC7383杀虫蛋白序列的核酸序列。
SEQ ID NO：18是TIC7383蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19是编码TIC7383_2蛋白的核酸序列，该TIC7383_2蛋白相对于TIC7383蛋白包含N末端截短。
SEQ ID NO：20是TIC7383_2蛋白的氨基酸序列，包含TIC7383的氨基酸15至1256。
SEQ ID NO：21是编码TIC7383_3蛋白的核酸序列，该TIC7383_3蛋白相对于TIC7383蛋白包含C末端截短。
SEQ ID NO：22是TIC7383_3蛋白的氨基酸序列，并且由TIC7383的氨基酸1至659组成。
SEQ ID NO：23是编码TIC7383_4蛋白的核酸序列，该TIC7383_4蛋白相对于TIC7383蛋白包含C末端截短。
SEQ ID NO：24是TIC7383_4蛋白的氨基酸序列，由TIC7383的氨基酸1至679组成。
SEQ ID NO：25是编码TIC7383_5蛋白的核酸序列，该TIC7383_5蛋白相对于TIC7383蛋白包含N末端和C末端截短。
SEQ ID NO：26是TIC7383_5蛋白的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸15至659。
SEQ ID NO：27是编码TIC7383_6蛋白的核酸序列，该TIC7383_6蛋白相对于TIC7383蛋白包含N末端和C末端截短。
SEQ ID NO：28是TIC7383_6蛋白的氨基酸序列，包含TIC7383的氨基酸15至679。
SEQ ID NO：29是从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC007651获得的编码TIC7386杀虫蛋白序列的核酸序列。
SEQ ID NO：30是TIC7386蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31是从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC007962获得的编码TIC7388杀虫蛋白序列的核酸序列。
SEQ ID NO：32是TIC7388蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33是从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC006878获得的编码TIC7389杀虫蛋白序列的核酸序列。
SEQ ID NO：34是TIC7389蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35是编码用于在植物细胞中表达的TIC7040杀虫蛋白的合成编码序列CR-BREla.TIC7040.nno_Mc：1。
SEQ ID NO：36是编码用于在植物细胞中表达的TIC7040HT杀虫蛋白的合成编码序列CR-BREla.TIC7040_10.nno_Mc：1。
SEQ ID NO：37是编码用于在植物细胞中表达的TIC7040HT杀虫蛋白的合成编码序列CR-BREla.TIC7040_10.nno_Mc：3。
SEQ ID NO：38是编码用于在植物细胞中表达的TIC7040HT杀虫蛋白的合成编码序列CR-BREla.TIC7040_10.nno_Mc：4。
SEQ ID NO：39是编码用于在植物细胞中表达的TIC7040HT杀虫蛋白的合成编码序列CR-BREla.TIC7040_10.nno_Mc：5。
SEQ ID NO：40是编码用于在植物细胞中表达的TIC7040HT杀虫蛋白的合成编码序列CR-BREla.TIC7040_10.nno_Mc：6。
SEQ ID NO：41是编码用于在植物细胞中表达的TIC7040HT杀虫蛋白的合成编码序列CR-BREla.TIC7040_10.nno_Mc：7。
SEQ ID NO：42是合成编码序列CR-BREla.TIC7040_1.nno_Mc：1，其编码相对于用于在植物细胞中表达的TIC7040HT蛋白具有N末端和C末端截短的蛋白。
SEQ ID NO：43是CR-BREla.TIC7040_1.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，包含TIC7040HT的氨基酸15至651。
SEQ ID NO：44是编码TIC7040_6(SEQ ID NO：10)杀虫蛋白序列的合成编码序列CR-BREla.TIC7040_2.nno_Mc：1，该TIC7040_6(SEQ ID NO：10)杀虫蛋白序列相对于用于在植物细胞中表达的TIC7040HT蛋白包含N末端和C末端截短。
SEQ ID NO：45是合成编码序列CR-BREla.TIC7040_11.nno_Mc：1，其编码相对于用于在植物细胞中表达的TIC7040HT蛋白具有N末端和C末端截短的蛋白。
SEQ ID NO：46是CR-BREla.TIC7040_11.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，包含TIC7040HT的氨基酸14至671。
SEQ ID NO：47是合成编码序列CR-BREla.TIC7040_12.nno_Mc：2，其编码相对于用于在植物细胞中表达的TIC7040HT蛋白具有C末端截短的蛋白。
SEQ ID NO：48是CR-BREla.TIC7040_12.nno_Mc：2蛋白的氨基酸序列，由TIC7040HT的氨基酸1至660组成。
SEQ ID NO：49是合成编码序列CR-BREla.TIC7040_13.nno_Mc：1，其编码相对于用于在植物细胞中表达的TIC7040HT蛋白具有C末端截短的蛋白。
SEQ ID NO：50是CR-BREla.TIC7040_13.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，由TIC7040HT的氨基酸1至627组成。
SEQ ID NO：51是合成编码序列CR-BREla.TIC7042.nno_Mc：1，其编码用于在植物细胞中表达的TIC7042蛋白(SEQ ID NO：12)。
SEQ ID NO：52是合成编码序列CR-BREla.TIC7042_1.nno_Mc：1，其编码相对于用于在植物细胞中表达的TIC7042蛋白具有N末端和C末端截短的蛋白。
SEQ ID NO：53是CR-BREla.TIC7042_1.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，包含TIC7042的氨基酸11至646。
SEQ ID NO：54是合成编码序列CR-BREla.TIC7042_2.nno_Mc：1，其编码相对于用于在植物细胞中表达的TIC7042蛋白具有N末端和C末端截短的蛋白。
SEQ ID NO：55是CR-BREla.TIC7042_2.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，包含TIC7042的氨基酸11至665。
SEQ ID NO：56是编码TIC7381蛋白的合成编码序列CR-BREla.TIC7381_1.nno Mc：1，其中在用于在植物细胞中表达的起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：57是CR-BREla.TIC7381_1.nno_Mc：1的氨基酸序列，其中相对于TIC7381蛋白序列，在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：58是用于在植物细胞中表达的合成编码序列CR-BREla.TIC7382_1.nno_Mc：1，其编码TIC7382蛋白，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：59是CR-BREla.TIC7382_1.nno_Mc：1的氨基酸序列，其中相对于TIC7381蛋白序列，在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：60是用于在植物细胞中表达的合成编码序列CR-BREla.TIC7382_2.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7382蛋白包含C末端截短的CR-BREla.TIC7382_2.nno_Mc：1蛋白，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：61是包含C末端缺失的CR-BREla.TIC7382_2.nno_Mc：1的氨基酸序列，并且包含TIC7382的氨基酸1至659，其中相对于TIC7382蛋白序列，在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：62是编码TIC7383蛋白的合成编码序列CR-BREla.TIC7383_1.nno_Mc：1，其中在用于在植物细胞中表达的起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：63是CR-BREla.TIC7383_1.nno_Mc：1的氨基酸序列，其中相对于TIC7383蛋白序列，在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：64是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_7.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白包含N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7383_7.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：65是包含N末端和C末端缺失的CR-BREla.TIC7383_7.nno_Mc：1的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸54至668，其中相对于TIC7383蛋白序列，在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：66是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_8.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白包含C末端截短的CR-BREla.TIC7383_8.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：67是包含C末端缺失的CR-BREla.TIC7383_8.nno_Mc：1的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸1至661，其中相对于TIC7383蛋白序列，在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：68是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_9.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白包含C末端截短的CR-BREla.TIC7383_9.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：69是包含C末端缺失的CR-BREla.TIC7383_9.nno_Mc：1的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸1至668，其中相对于TIC7383蛋白序列，在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：70是编码TIC7040HT蛋白的胰蛋白酶核心(TIC7040HT_Tryp)的编码序列，如通过质谱法测得。
SEQ ID NO：71是如通过质谱法测得的TIC7040HT蛋白的胰蛋白酶核心(TIC7040HT_Tryp)的氨基酸序列，并且包含TIC7040HT的氨基酸43至624。
SEQ ID NO：72是编码TIC7040HT蛋白的胰凝乳蛋白酶核心(TIC7040HT_Chymo)的编码序列，如通过质谱法测得。
SEQ ID NO：73是如通过质谱法测得的TIC7040HT蛋白的胰凝乳蛋白酶核心(TIC7040HT_Chymo)的氨基酸序列，并且包含TIC7040HT的氨基酸45至641。
SEQ ID NO：74是编码TIC7383蛋白的胰蛋白酶核心(TIC7383_Tryp)的编码序列，如通过质谱法测得。
SEQ ID NO：75是如通过质谱法测得的TIC7383蛋白的胰蛋白酶核心(TIC7383_Tryp)的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸55至668。
SEQ ID NO：76是合成编码序列CR-BREla.TIC7040_14.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7040HT蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7040_14.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：77是CR-BREla.TIC7040_14.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列并且包含TIC7040HT的氨基酸52至660，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：78是合成编码序列CR-BREla.TIC7381_2.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7381蛋白具有C末端截短的CR-BREla.TIC7381_2.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：79是CR-BREla.TIC7381_2.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列并且包含TIC7381的氨基酸1至658，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：80是合成编码序列CR-BREla.TIC7381_3.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7381蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7381_3.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：81是CR-BREla.TIC7381_3.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列并且包含TICTIC7381的氨基酸50至658，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：82是合成编码序列CR-BREla.TIC7382_3.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7382蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7382_3.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：83是CR-BREla.TIC7382_3.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列并且包含TIC7382的氨基酸52至659，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：84是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_19.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7383_19.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：85是CR-BREla.TIC7383_19.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸15至668。
SEQ ID NO：86是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_20.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BRE1a.TIC7383_20.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：87是CR-BREla.TIC7383_20.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸15至661。
SEQ ID NO：88是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_21.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7383_21.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：89是CR-BREla.TIC7383_21.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列并且包含TIC7383的氨基酸54至661，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：90是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_22.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7383_22.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：91是CR-BREla.TIC7383_22.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸54至668。
SEQ ID NO：92是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_23.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7383_23.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：93是CR-BREla.TIC7383_23.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸54至661。
SEQ ID NO：94是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_24.nno_Mc：2，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BRE1a.TIC7383_24.nno_Mc：2蛋白并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：95是CR-BREla.TIC7383_24.nno_Mc：2蛋白的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸73至661。
SEQ ID NO：96是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_25.nno_Mc：3，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BRE1a.TIC7383_25.nno_Mc：3蛋白并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：97是CR-BREla.TIC7383_25.nno_Mc：3蛋白的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸94至661。
SEQ ID NO：98是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_26.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BRE1a.TIC7383_26.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：99是CR-BREla.TIC7383_26.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸114至661。
SEQ ID NO：100是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_27.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7383_27.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：101是CR-BREla.TIC7383_27.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列并且包含TIC7383的氨基酸54至658，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：102是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_28.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有N末端和C末端截短的CR-BREla.TIC7383_28.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：103是CR-BREla.TIC7383_28.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，并且包含TIC7383的氨基酸15至658。
SEQ ID NO：104是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_29.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有C末端截短的CR-BREla.TIC7383_29.nno_Mc：1蛋白并且用于在植物细胞中表达，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子。
SEQ ID NO：105是CR-BREla.TIC7383_29.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列并且包含TIC7383的氨基酸1至963，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：106是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_30.nno_Mc：1，其编码CR-BREla.TIC7383_30.nno_Mc：1蛋白，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子，并且相对于TIC7383包含对应氨基酸位置964、966和968的密码子突变，并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：107是CR-BREla.TIC7383_30.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列并且相对于TIC7383包含突变K964A、R966A、K968A，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：108是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_31.nno_Mc：1，其编码相对于TIC7383蛋白具有C末端截短的CR-BREla.TIC7383_31.nno_Mc：1蛋白，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子，并且相对于TIC7383包含对应氨基酸位置964、966和968的密码子突变，并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：109是CR-BREla.TIC7383_31.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列，包含氨基酸1至1065，并且相对于TIC7383还包含突变K964A、R966A、K968A，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：110是合成编码序列CR-BREla.TIC7383_32.nno_Mc：1，其编码CR-BREla.TIC7383_32.nno_Mc：1蛋白，其中在起始甲硫氨酸密码子之后紧跟着插入另外的丙氨酸密码子，并且相对于TIC7383包含对应氨基酸位置964至969的密码子缺失，并且用于在植物细胞中表达。
SEQ ID NO：111是CR-BREla.TIC7383_32.nno_Mc：1蛋白的氨基酸序列并且相对于TIC7383包含氨基酸964至969的缺失，其中在起始甲硫氨酸之后紧跟着插入另外的丙氨酸氨基酸。
SEQ ID NO：112是合成编码序列GOI-TIC10743.nno_Mc：1，其编码由TIC7383的结构域1和2以及TIC7042的结构域3组成的GOI-TIC10743.nno_Mc：1嵌合蛋白。
SEQ ID NO：113是GOI-TIC10743.nno_Mc：1嵌合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：114是合成编码序列GOI-TIC10744.nno_Mc：1，其编码由TIC7383的结构域1和2以及TIC7381的结构域3组成的GOI-TIC10744.nno_Mc：1嵌合蛋白。
SEQ ID NO：115是GOI-TIC10744.nno_Mc：1嵌合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：116是合成编码序列GOI-TIC10745.nno_Mc：1，其编码由TIC7383的结构域1和2以及TIC7382的结构域3组成的GOI-TIC10745.nno_Mc：1嵌合蛋白。
SEQ ID NO：117是GOI-TIC10745.nno_Mc：1嵌合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：118是合成编码序列GOI-TIC10746.nno_Mc：1，其编码由TIC7382的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成的GOI-TIC10746.nno_Mc：1嵌合蛋白。
SEQ ID NO：119是GOI-TIC10746.nno_Mc：1嵌合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：120是合成编码序列GOI-TIC10747.nno_Mc：1，其编码由TIC7381的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成的GOI-TIC10747.nno_Mc：1嵌合蛋白。
SEQ ID NO：121是GOI-TIC10747.nno_Mc：1嵌合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：122是合成编码序列GOI-TIC10748.nno_Mc：1，其编码由TIC7042的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成的GOI-TIC10748.nno_Mc：1嵌合蛋白。
SEQ ID NO：123是GOI-TIC10748.nno_Mc：1嵌合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：124是合成编码序列TIC10764NTermExt1，其编码由TIC7382的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成并且还包含源自TIC7382的N末端延长肽的TIC10764NTermExt1嵌合蛋白。TIC7382的N末端延长包含TIC7382毒素蛋白的氨基酸1-51，并且由TIC7382编码序列的前153个核苷酸编码。
SEQ ID NO：125是TIC10764NTermExt1嵌合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：126是合成编码序列TIC10764NTermExt2，其编码由TIC7382的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成并且还包含源自TIC7383的N末端延长肽的TIC10764NTermExt2嵌合蛋白。TIC7383的N末端延长包含TIC7383毒素蛋白的氨基酸1-53，并且由TIC7383编码序列的前159个核苷酸编码。
SEQ ID NO：127是TIC10764NTermExt2嵌合蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
农业害虫控制领域中的问题可以被描述为需要这样的新毒素蛋白，其对目标害虫有效，对目标害虫物种表现出广谱毒性，能够在植物中表达而不会引起不期望的农艺学问题，并且与目前商业上用于植物的毒素相比，提供了替代的作用模式。
公开了新型杀昆虫蛋白类别，例如TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389以及相关家族成员，它们对鞘翅目和鳞翅目害虫具有抗性，更尤其对玉米根虫害虫物种具有抗性。还公开了被设计用于在植物细胞中表达的合成编码序列，其编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383相关家族成员，以及TIC7040毒素类别中蛋白的N末端和C末端截短变体和嵌合体。还公开了重组核酸分子，其包含与编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388或TIC7389毒素蛋白或相关家族成员或其片段的编码序列可操作地连接的启动子。
本申请中提及的TIC7040、“TIC7040蛋白”、“TIC7040蛋白毒素”、“TIC7040毒素蛋白”、“TIC7040杀虫蛋白”、“TIC7040相关毒素”或“TIC7040相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫或鳞翅目害虫的活性的TIC7040(SEQ ID NO：2)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白，只要此种蛋白与TIC7040比对得出的氨基酸序列同一性为从约90％至约100％的任何分数百分比。
本申请中提及的TIC7040HT、“TIC7040HT蛋白”、“TIC7040HT蛋白毒素”、“TIC7040HT毒素蛋白”、“TIC7040HT杀虫蛋白”、“TIC7040HT相关毒素”或“TIC7040HT相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫或鳞翅目害虫的活性的TIC7040HT(SEQ ID NO：4)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白，只要此种蛋白与TIC7040HT比对得出的氨基酸序列同一性为从约90％至约100％的任何分数百分比。
本申请中提及的TIC7042、“TIC7042蛋白”、“TIC7042蛋白毒素”、“TIC7042毒素蛋白”、“TIC7042杀虫蛋白”、“TIC7042相关毒素”或“TIC7042相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫或鳞翅目害虫的活性的TIC7042(SEQ ID NO：12)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白，只要此种蛋白与TIC7042比对得出的氨基酸序列同一性为从约93％至约100％的任何分数百分比。
本申请中提及的TIC7381、“TIC7381蛋白”、“TIC7381蛋白毒素”、“TIC7381毒素蛋白”、“TIC7381杀虫蛋白”、“TIC7381相关毒素”或“TIC7381相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫或鳞翅目害虫的活性的TIC7381(SEQ ID NO：14)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段，或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白，只要此种蛋白与TIC7381比对得出的氨基酸序列同一性为从约90％至约100％的任何分数百分比。
本申请中提及的TIC7382、“TIC7382蛋白”、“TIC7382蛋白毒素”、“TIC7382毒素蛋白”、“TIC7382杀虫蛋白”、“TIC7382相关毒素”或“TIC7382相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫或鳞翅目害虫的活性的TIC7382(SEQ ID NO：16)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段，或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白，只要此种蛋白与TIC7382比对得出的氨基酸序列同一性为从约93％至约100％的任何分数百分比。
本申请中提及的TIC7383、“TIC7383蛋白”、“TIC7383蛋白毒素”、“TIC7383毒素蛋白”、“TIC7383杀虫蛋白”、“TIC7383相关毒素”或“TIC7383相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫或鳞翅目害虫的活性的TIC7383(SEQ ID NO：18)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段，或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白，只要此种蛋白与TIC7383比对得出的氨基酸序列同一性为从约75％至约100％的任何分数百分比。
本申请中提及的TIC7386、“TIC7386蛋白”、“TIC7386蛋白毒素”、“TIC7386毒素蛋白”、“TIC7386杀虫蛋白”、“TIC7386相关毒素”或“TIC7386相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫或鳞翅目害虫的活性的TIC7386(SEQ ID NO：30)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段，或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白，只要此种蛋白与TIC7386比对得出的氨基酸序列同一性为从约75％至约100％的任何分数百分比。
本申请中提及的TIC7388、“TIC7388蛋白”、“TIC7388蛋白毒素”、“TIC7388毒素蛋白”、“TIC7388杀虫蛋白”、“TIC7388相关毒素”或“TIC7388相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫或鳞翅目害虫的活性的TIC7388(SEQ ID NO：32)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段，或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白，只要此种蛋白与TIC7388比对得出的氨基酸序列同一性为从约99％至约100％的任何分数百分比。
本申请中提及的TIC7389、“TIC7389蛋白”、“TIC7389蛋白毒素”、“TIC7389毒素蛋白”、“TIC7389杀虫蛋白”、“TIC7389相关毒素”或“TIC7389相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下项、由以下项组成、基本上与以下项同源、类似于以下项或来源于以下项：赋予针对鞘翅目害虫或鳞翅目害虫的活性的TIC7389(SEQ ID NO：34)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段，或其组合，包括任何表现出杀虫或昆虫抑制活性的蛋白，只要此种蛋白与TIC7389比对得出的氨基酸序列同一性为从约90％至约100％的任何分数百分比。
在本申请中使用术语“区段”或“片段”来描述比描述TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388或TIC7389蛋白或相关家族成员杀昆虫蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的连续氨基酸或核酸序列。在具体的实施方案中，提供了TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388或TIC7389蛋白的片段，其包含如本文所公开的具有杀昆虫活性的蛋白的至少约50个、至少约75个、至少约95个、至少约100个、至少约125个、至少约150个、至少约175个、至少约200个、至少约225个、至少约250个、至少约275个、至少约300个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约850个、至少约900个、至少约950个、至少约1000个、至少约1050个、至少约1100个、至少约1150个、至少约1200个、至少约1250个、至少约1300个或至少约1350个连续氨基酸或更长的连续氨基酸。在某些实施方案中，本发明提供了本文所提供的蛋白片段，其具有全长序列的活性。从起始分子产生这种片段的方法在本领域是众所周知的。
本申请还公开了表现出昆虫抑制活性的区段或片段，如果将这种区段或片段与SEQ ID NO：2、4、12、14、16、18、20、30、32和34所示的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388或TIC7389蛋白的相应部分进行比对，可得出所述区段或片段与TIC7383和TIC7386蛋白的相应部分之间的氨基酸序列同一性为从约75％至约100％的任何分数百分比；或分别得出所述区段或片段与TIC7040、TIC7040HT、TIC7381和TIC7389蛋白的相应部分之间的氨基酸序列同一性为从约90％至约100％的任何分数百分比；或分别得出所述区段或片段与TIC7042和TIC7382蛋白的相应部分之间的氨基酸序列同一性为从约93％至约100％的任何分数百分比；或分别得出所述区段或片段与TIC7388蛋白的相应部分之间的氨基酸序列同一性为从约99％至约100％的任何分数百分比。
本申请中提及的术语“活性的”或“活性”、“杀虫活性”或“杀虫”或“杀昆虫活性”、“昆虫抑制”或“杀昆虫”是指毒性剂如蛋白毒素在抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或生存力)、遏止(遏止生长、摄食、繁殖力或生存力)、控制(控制害虫侵染，控制对含有有效量的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388或TIC7389蛋白或相关家族成员杀昆虫蛋白的特定作物的害虫摄食活动)或杀死害虫(导致其致病、致死或繁殖力降低)方面的功效。这些术语旨在包括向害虫提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，其中所述害虫暴露于所述毒性蛋白导致致病、致死、繁殖力降低或生长迟缓。这些术语还包括作为在植物内或植物上提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，害虫从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或植物可能生长的特定地理位置上被驱除。一般来讲，杀虫活性是指毒性蛋白有效抑制特定目标害虫(包括但不限于鳞翅目、鞘翅目或半翅目昆虫)的生长、发育、生存力、摄食行为、交配行为、繁殖力或由摄食这种蛋白、蛋白片段、蛋白区段或多核苷酸的昆虫引起的不利影响中的任何可测量的减少的能力。毒性蛋白可以由植物产生，或可以施用于植物或植物所位于的位置内的环境。术语“生物活性”、“有效的(effective)”、“有功效的(efficacious)”或其变型也是本申请中可互换使用的术语，以描述本发明的蛋白对目标害虫的影响。
当提供在目标害虫的饲料中时，杀虫有效量的毒性剂在毒性剂与害虫接触时表现出杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或一种或多种本领域已知的化学剂。杀虫或杀昆虫化学剂和杀虫或杀昆虫蛋白剂可以单独使用或彼此组合使用。化学剂包括但不限于在目标害虫中靶向特定基因以进行抑制的dsRNA分子、有机氯、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱类和瑞诺烷(ryanoids)。杀虫或杀昆虫蛋白剂包括本申请所示的蛋白毒素以及其他蛋白毒性剂，包括靶向鳞翅目和鞘翅目害虫物种的那些，以及用于控制其他植物害虫的蛋白毒素，诸如本领域可用于控制同翅目或半翅目物种的Cry蛋白。
提及的害虫，尤其作物植物的害虫旨在意指作物植物的害虫，特别是受TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388或TIC7389蛋白或相关家族成员杀昆虫蛋白控制的那些。提及的害虫还可包括植物的同翅目和半翅目害虫，以及当靶向这些害虫的毒性剂与以下蛋白共同定位或一起存在时还可包括线虫和真菌：TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7388、TIC7389蛋白或相关家族成员杀昆虫蛋白，或与TIC7383和TIC7386具有约75％至约100％同一性的蛋白，或与TIC7040、TIC7040HT、TIC7381和TIC7389具有约90％至约100％同一性的蛋白，或与TIC7042、TIC7386和TIC7382具有约93％至约100％同一性的蛋白，或与TIC7388具有约99％至约100％同一性的蛋白。
TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389和相关家族成员杀昆虫蛋白对来自鞘翅目和鳞翅目昆虫物种(包括成虫、蛹、幼虫和初孵幼虫)的害虫表现出杀昆虫活性。
鳞翅目昆虫包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘虫、切根虫、尺蠖和棉铃虫，例如秋粘虫(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))、甜菜粘虫(甜菜夜蛾(Spodopteraexigua))、黑粘虫(莎草粘虫(Spodoptera exempta))、披肩粘虫((蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata))、南方粘虫(南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania))、黑切根虫(小地老虎(Agrotis ipsilon))、包菜尺蠖(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、大豆尺蠖(大豆夜蛾(Pseudoplusia includens))、藜豆毛虫(藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis))、苜蓿绿夜蛾(Green cloverworm)(苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra))、烟草夜蛾(绿棉铃虫(Heliothisvirescens))、颗粒地老虎(粒肤地老虎(Agrotissubterranea))、粘虫(一星粘虫(Pseudaletia unipuncta))、西方切根虫(西部灰地老虎(Agrotis orthogonia))；来自螟蛾科(Pyralidae)的螟虫、鞘蛾、结网毛虫、锥形虫、菜青虫和雕叶虫，例如欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、脐橙螟(Amyelois transitella)、玉米根网螟(玉米根草螟(Crambus caliginosellus))、草地螟(水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis))、向日葵螟(向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum))、小玉米茎螟虫(南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus))；来自卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种虫(seedworm)和果蠕虫，例如苹果蠹蛾(苹果卷叶蛾(Cydia pomonella))、葡萄浆果蛾(葡萄小食心虫(Endopiza viteana))、东方果蛾(梨小食心虫(Grapholita molesta))、向日葵芽蛾(Sunflower bud moth)(向日葵芽蛾(Suleima helianthana))；以及许多其他经济上重要的鳞翅目，例如小菜蛾(Plutella xylostella)、红铃虫(棉红铃虫(Pectinophoragossypiella))和舞毒蛾(Gypsy moth)(舞毒蛾(Lymantria dispar))。鳞翅目的其他害虫包括例如棉叶虫(棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea))、果树卷叶蛾(果树黄卷蛾(Archips argyrospila))、欧洲卷叶虫(玫瑰黄卷蛾(Archips rosana))和其他黄卷蛾属物种(二化螟(Chilo suppressalis)、亚洲水稻螟或稻茎螟)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)、玉米根网螟(玉米根草螟)、蓝草网螟(早熟禾草螟(Crambus teterrellus))、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)、甘蔗螟(小蔗杆草螟(Diatraea saccharalis))、多刺螟岭(埃及钻夜蛾(Earias insulana))、斑螟蛉(翠纹钻夜蛾(Earias vittella))、东半球棉铃虫(棉铃实夜蛾(Helicoverpa armigera))、玉米穗虫(谷实夜蛾，也称为大豆豆荚虫和棉铃虫)、西方豆类夜盗虫(豆白缘切根虫(Striacosta albicosta))、欧洲葡萄蛾(葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana))、柑桔潜叶虫(柑桔潜叶蛾(Phyllocnistis citrella))、大菜粉蝶(欧洲粉蝶(Pieris brassicae))、菜白蛾(菜粉蝶(Pieris rapae，也称为菜青虫)、烟夜蛾(斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，也称为丛生毛虫)和番茄潜叶虫(番茄斑潜蝇(Tutaabsoluta))。
鞘翅目昆虫包括但不限于叩甲属(Agriotes spp.)、花象属(Anthonomus spp.)、甜菜隐食甲(Atomaria linearis)、甜菜胫跳甲(Chaetocnema tibialis)、根颈象属(Cosmopolites spp.)、象虫属(Curculio spp.)、皮蠹属(Dermestes spp.)、根萤叶甲属(Diabrotica spp.)、植食瓢虫属(Epilachna spp.)、Eremnus spp.、科罗拉多金花虫(Leptinotarsa decemlineata)、水象甲属(Lissorhoptrus spp.)、鳃金龟属(Melolonthaspp.)、锯谷稻属(Orycaephilus spp.)、耳喙象属(Otiorhynchus spp.)、斑象属(Phlyctinus spp.)、弧丽金龟属(Popillia spp.)、蚤跳甲属(Psylliodes spp.)、谷蠹属(Rhizopertha spp.)、金龟子科(Scarabeidae)、米象属(Sitophilus spp.)、麦蛾属(Sitotroga spp.)、粉甲属(Tenebrio spp.)、拟谷盗属(Tribolium spp.)和斑皮蠹属(Trogoderma spp)，特别是当害虫是西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera)，WCR)、北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)，NCR)、墨西哥玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera zeae)，MCR)、巴西玉米根虫(黄瓜条叶甲(Diabrotica balteata)，BZR)、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpunctata howardii)，SCR)、科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)，CPB)、巴西玉米根虫复合群(BCR，由叶甲蝽)和南美叶甲组成)、十字花科跳蚤甲虫(萝卜菜跳甲(Phyllotreta cruciferae))、黄曲条跳蚤甲虫(黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata))和西部黑跳蚤甲虫(微小菜跳甲(Phyllotreta pusilla))。
半翅目的昆虫包括但不限于蝽科的椿象：来自Chinavia属的绿椿象(绿色蝽(Chinavia hilaris)、Chinavia marginata和Chinavia pensylvanica)、Chlorochroa属的椿象(Chlorochroa granulose、Chlorochroa kanei、Chlorochroaligata、Chlorochroalineate、Chlorochroa opuntiae、Chlorochroa persimilis、Chlorochroa rossiana、Chlorochroa sayi、Chlorochroa uhleri、Chlorochroa belfragii、Chlorochroa faceta、Chlorochroa osborni、Chlorochroa saucia和Chlorochroa senilis)、南方绿椿象(稻绿蝽(Nezara viridula))、来自Edessa属的椿象(Edessa meditabunda、Edessa bifida和Edessa florida)、新热带区布朗椿象(英雄美洲蝽(Euschistus heros))、来自美洲蝽(Euschistus)属的椿象(Euschistus acuminatus、Euschistusbiformis、斑点美洲蝽(Euschistus conspersus)、Euschistus crenator、Euschistus egglestoni、Euschistusictericus，Euschistus inflatus、Euschistus latimarginatus、Euschistus obscures、Euschistus politus、Euschistus quadrator、褐美洲蝽(Euschistus sevus)、Euschistusstrenuous、三色美洲蝽(Euschistus tristigmus)和斑点美洲蝽(Euschistusvariolarius))、褐翅椿象(茶翅蝽(Halyomorpha halys))、红肩椿象(红肩蝽(Thyantaaccerra))、Thyanta属的椿象(Thyanta calceata、Thyanta custator、Thyantapallidovirens、Thyanta perditor、Thyanta maculate和Thyanta pseudocasta)、绿腹椿象(Dichelops melacanthus)和Dichelops属的其他椿象(Dichelops avilapiresi、Dichelops bicolor、Dichelops dimidatus、Dichelops furcatus、Dichelopsfurcifrons、Dichelops lobatus、Dichelops miriamae、Dichelops nigrum、Dichelopsperuanus、Dichelops phoenix和Dichelops saltensis)、红带椿象(盖德拟壁蝽(Piezodorus guildinni))以及伊犁壁蝽(Piezodorus lituratus)；以及龟蝽科的昆虫，诸如筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)、西部牧草盲蝽(豆荚草盲蝽(Lygus hesperus))和牧草盲蝽(美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris))。
在本申请中，提及的“分离的DNA分子”或等效术语或短语旨在意指该DNA分子是单独存在或与其他组合物组合存在，但不在其天然环境中存在的分子。举例来说，对于天然存在于生物体的基因组的DNA内的核酸元件诸如编码序列、内含子序列、未翻译的前导序列、启动子序列、转录终止序列等，只要所述元件在所述生物体的基因组内，并且在它天然存在的基因组内的位置处，该元件就不被认为是“分离的”。然而，这些元件中的每一个以及这些元件的子部分在本公开的范围内将是“分离的”，只要该元件不在生物体的基因组内，也不在其天然存在的基因组内的位置处。类似地，编码杀昆虫蛋白或该蛋白的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列，只要该核苷酸序列不是位于天然发现编码该蛋白的序列的细菌的DNA内。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入植物或细菌的细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列将被认为是分离的核苷酸序列，无论它存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内，植物或细菌的基因组内，抑或以可检测量存在于源于植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。
如本文进一步所述，在从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC005019获得的DNA中发现了编码TIC7040(SEQ ID NO：1)的开放阅读框(ORF)，所述DNA编码如SEQ ID NO：2所示的蛋白毒素。在使用从TIC7040ORF设计的引物扩增后，使用从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC005019获得的DNA(在本文中称为TIC7040HT(SEQ ID NO：3))扩增稍长的编码序列，所述DNA编码如SEQ IDNO：4所示的蛋白。使用微生物宿主细胞来源的TIC7040HT蛋白的生物测定显示出对以下害虫的活性：鞘翅目害虫西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)，WCR)、Cry3Bb抗性西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，WCRHP)、北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)，NCR)、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpunctata howardii)，SCR)和科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)，CPB)，以及鳞翅目害虫玉米穗虫(谷实夜蛾(Helicoverpa zea)，(CEW)，也称为大豆豆荚虫(Soybean Podworm)和棉铃虫)、小菜蛾(DBM)、欧洲玉米螟(ECB)、秋粘虫(草地贪夜蛾，FAW)、大豆尺蠖(大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includes)，SBL)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella)，SWCB)和藜豆毛虫(藜豆夜蛾，VBC)。
如本文进一步所述，在从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC005973获得的DNA中发现了编码TIC7042(SEQ ID NO：11)的ORF，所述DNA编码如SEQ ID NO：12所示的蛋白毒素。使用微生物宿主细胞来源的TIC7042蛋白的生物测定显示出对鞘翅目害虫WCR、WCRHP、NCR、SCR和CPB以及鳞翅目害虫BCW、CEW、DBM、FAW、SBL和VBC的活性。
如本文进一步所述，在从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC006713获得的DNA中发现了编码TIC7381(SEQ ID NO：13)的ORF，所述DNA编码如SEQ ID NO：14所示的蛋白毒素。使用微生物宿主细胞来源的TIC7381蛋白的生物测定显示出对鞘翅目害虫WCR、WCRHP、NCR、SCR和CPB以及鳞翅目害虫CEW、DBM、ECB、FAW、SBL、SWCB和VBC的活性。
如本文进一步所述，在从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC007657获得的DNA中发现了编码TIC7382(SEQ ID NO：15)的ORF，所述DNA编码如SEQ ID NO：16所示的蛋白毒素。使用微生物宿主细胞来源的TIC7382蛋白的生物测定显示出对鞘翅目害虫WCR、WCRHP、NCR、SCR和CPB以及鳞翅目害虫DBM、ECB、SBL、SWCB和VBC的活性。
如本文进一步所述，在从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC008106获得的DNA中发现了编码TIC7383(SEQ ID NO：17)的ORF，所述DNA编码如SEQ ID NO：18所示的蛋白毒素。使用微生物宿主细胞来源的TIC7383蛋白的生物测定显示出对鞘翅目害虫WCR、WCRHP、NCR、SCR和CPB以及鳞翅目害虫CEW、DBM、ECB和VBC的活性。
如本文进一步所述，分别在从侧孢短芽孢杆菌菌株DSC007651、DSC007962和DSC006878获得的DNA中发现了编码TIC7386(SEQ ID NO：29)、TIC7388(SEQ ID NO：31)和TIC7389(SEQ ID NO：33)的ORF，它们编码本文中示出为SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32和SEQID NO：34的蛋白。使用微生物宿主细胞来源的TIC7389蛋白的生物测定显示出对鳞翅目害虫SBL和鞘翅目害虫WCR和CPB的活性。
如本文进一步所述，相对于全长TIC7040HT和TIC7383，TIC7040HT的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶消化物以及TIC7383的胰蛋白酶消化物保持对WCR的活性。此外，相对于全长TIC7040HT和TIC7383，TIC7040HT和TIC7383的截短保持对WCR和CPB的活性，并且在一些情况下活性增加。
本文进一步描述了由源自TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7042的结构域组成的嵌合毒素。嵌合毒素TIC10743(SEQ ID NO：113，由SEQ ID NO：112编码)由TIC7383的结构域1和2以及TIC7042的结构域3组成。嵌合毒素TIC10744(SEQ ID NO：115，由SEQ ID NO：114编码)由TIC7383的结构域1和2以及TIC7381的结构域3组成。嵌合毒素TIC10745(SEQ ID NO：117，由SEQ ID NO：116编码)由TIC7383的结构域1和2以及TIC7382的结构域3组成。嵌合毒素TIC10746(SEQ ID NO：119，由SEQ ID NO：118编码)由TIC7382的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成。嵌合毒素TIC10747(SEQ ID NO：121，由SEQ ID NO：120编码)由TIC7381的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成。嵌合毒素TIC10748(SEQ ID NO：123，由SEQ IDNO：122编码)由TIC7042的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成。嵌合毒素TIC10746NTermExtl(SEQ ID NO：125，由SEQ ID NO：124编码)由TIC7382的结构域1和2、TIC7383的结构域3以及TIC7382的N末端延长组成。TIC7382的N末端延长包含TIC7382毒素蛋白的氨基酸1-51，并且由TIC7382编码序列的前153个核苷酸编码。嵌合毒素TIC10746NTermExt2(SEQ ID NO：127，由SEQ ID NO：126编码)由TIC7382的结构域1和2、TIC7383的结构域3以及TIC7383的N末端延长组成。TIC7383的N末端延长包含TIC7383毒素蛋白的氨基酸1-53，并且由TIC7383编码序列的前159个核苷酸编码。
对于在植物细胞中的表达，TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383或其变体、截短变体或嵌合体可以表达以驻留在胞质溶胶中，或靶向植物细胞的各种细胞器。例如，将蛋白靶向叶绿体可使得转基因植物中表达蛋白的水平增加，同时防止发生表型异常。靶向也可能使得转基因事件中害虫抗性功效的增加。靶肽或转运肽是引导蛋白转运至细胞特定区域的短(3-70个氨基酸长)肽链，该细胞特定区域包括细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和质膜。一些靶肽在蛋白被转运之后通过信号肽酶从蛋白中裂解。为了靶向叶绿体，蛋白含有大约40-50个氨基酸的转运肽。对于使用叶绿体转运肽的描述，参见美国专利号5,188,642和5,728,925。许多叶绿体定位蛋白作为前体从核基因中表达并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向至叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与小亚单位(SSU)核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)以及描述于美国专利号7,193,133中的转运肽相关联的那些蛋白。已经在体内和体外证明了非叶绿体蛋白可以通过使用与异源CTP的蛋白融合物来靶向叶绿体，并且CTP足以将蛋白靶向至叶绿体。并入合适的叶绿体转运肽(诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS CTP(CTP2)(参见Klee等人，Mol.Gen.Genet.210：437-442，1987)或矮牵牛(Petuniahybrida)EPSPS CTP(CTP4)(参见della-Cioppa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：6873-6877，1986)已被证明在转基因植物中将异源EPSPS蛋白序列靶向至叶绿体(参见美国专利号5,627,061、5,633,435和5,312,910；以及EP 0218571、EP 189707、EP 508909和EP924299)。为了将TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383及其变体、截短变体和嵌合体靶向叶绿体，编码叶绿体转运肽的序列以5′可操作地连接并与编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383蛋白或其变体、截短变体或嵌合体的合成编码序列同框放置，后者被设计用于在植物细胞中最佳表达。
可以设想，通过使用天然存在的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389的氨基酸序列构建具有新特性的新型蛋白，可以构建与TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389相关的其他毒素蛋白序列。TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389毒素蛋白可以与其他类似于TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389的蛋白比对，以将氨基酸序列水平上的差异结合到新型氨基酸序列变体中并对编码变体的重组核酸序列进行适当的改变。
本公开进一步设想了TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389蛋白毒素类别的改进变体可通过使用本领域已知的多种基因编辑方法在植物中进行工程改造。用于基因组编辑的此类技术包括但不限于ZFN(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、TALEN(类转录激活因子效应物核酸酶)和CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)系统。这些基因组编辑方法可以用于将在植物细胞内转化的毒素蛋白编码序列改变为不同的毒素编码序列。具体地讲，通过这些方法，毒素编码序列内的一个或多个密码子被改变以工程化新的蛋白氨基酸序列。另选地，将编码序列内的片段替换或缺失或将另外的DNA片段插入到编码序列中，以工程化新的毒素编码序列。新的编码序列可以编码具有新的特性(诸如针对害虫增加的活性或谱)的毒素蛋白，以及提供针对其中已针对原始昆虫毒素蛋白产生抗性的害虫物种的活性。可以通过本领域已知的方法使用包含基因编辑的毒素编码序列的植物细胞以生成表达新的毒素蛋白的完整植物。
还可以设想，TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389蛋白或其蛋白变体的片段可以是截短形式，其中通过昆虫抑制活性，一个或多个氨基酸从N末端、C末端、蛋白的中间或它们的组合缺失。这些片段可以是TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389或其蛋白变体的天然存在的或合成的变体，但应保留TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389的昆虫抑制活性。
可使用本领域已知的各种基于计算机的算法通过彼此比较来鉴定类似于TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389蛋白的蛋白。例如，可以使用Clustal W比对，使用以下默认参数分析与TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389相关的蛋白的氨基酸序列同一性：重量矩阵：blosum，空位开放罚分：10.0，空位延伸罚分：0.05，亲水性空位：开，亲水性残基：GPSNDQERK，残基特异性空位罚分：开(Thompson等人，(1994)Nucleic AcidsResearch，22：4673-4680)。进一步通过100％乘以(氨基酸同一性/主题蛋白的长度)的乘积来计算氨基酸同一性百分比。其他比对算法也是本领域可获得的，并且提供与使用ClustalW算法获得的那些结果类似的结果。
其意图是，如果对鳞翅目或鞘翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性的蛋白与TIC7383或TIC7386的比对沿查询蛋白长度表现出至少75％至约100％的氨基酸同一性，即查询蛋白与主题蛋白之间约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的氨基酸序列同一性(或该范围内的任何百分比分数)；或者如果这种查询蛋白与TIC7040HT、TIC7381或TIC7389的比对沿查询蛋白长度表现出至少90％至约100％的氨基酸同一性，即查询蛋白与主题蛋白之间约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的氨基酸序列同一性(或该范围内的任何百分比分数)；或者如果这种查询蛋白与TIC7042或TIC7382的比对沿查询蛋白长度表现出至少93％至约100％的氨基酸同一性，即查询蛋白与主题蛋白之间约93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的氨基酸序列同一性(或该范围内的任何百分比分数)；或者如果这种查询蛋白与TIC7040HT、TIC7381或TIC7388的比对沿查询蛋白长度在查询蛋白与主题蛋白之间表现出至少99％至约100％的氨基酸同一性(或该范围内的任何百分比分数)，则这种查询蛋白与TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389相关。
使用Clustal W算法将示例性蛋白TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389彼此比对。创建每个全长蛋白的氨基酸序列同一性百分比的成对矩阵，如表1中所报告的。两个序列之间相同氨基酸的数量示于括号中。
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除同一性百分比之外，TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389蛋白还可按一级结构(保守氨基酸基序)、长度(约1243至约1259个氨基酸)和其他特征相关联。生物信息学分析表明TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389属于Cry43蛋白家族。表2中报告了TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389蛋白的特征。
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如本申请的实施例进一步所述，编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383及其变体、截短变体和嵌合体的重组核酸分子序列被设计用于植物中。被设计用于植物中的示例性植物优化的重组核酸分子序列，以及对应的核苷酸和蛋白序列、描述和修饰示于实施例5的表8中。
可根据本领域已知的转化方法和技术构建含有这些重组核酸分子序列的表达盒和载体并将其引入玉米、大豆、棉花或其他植物细胞中。例如，农杆菌(Agrobacterium)介导的转化在美国专利申请公布2009/0138985A1(大豆)、2008/0280361A1(大豆)、2009/0142837A1(玉米)、2008/0282432(棉花)、2008/0256667(棉花)、2003/0110531(小麦)、2001/0042257 A1(甜菜)、美国专利号5,750,871(芥花)、7,026,528(小麦)和6,365,807(稻)中，以及Arencibia等人(1998)Transgenic Res.7：213-222(甘蔗)中有所描述，这些文献全部以引用方式全文并入本文。转化的细胞可以再生成表达TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383的转化植物。为了测试杀虫活性，使用从转化植物获得的植物叶盘在鳞翅目害虫幼虫的存在下进行生物测定，如实施例所述。为了测试针对鞘翅目害虫的杀虫活性，使用Ro和F1代的转化植物进行根虫测定，如实施例所述。为了测试针对半翅目害虫的杀虫活性，使用来自从植物取下的或保留在植物上的组织中的转化植物的豆荚、玉米穗或叶进行测定，如实施例所述。
作为传统转化方法的替代方案，可通过定点整合将DNA序列(诸如转基因、表达盒等)插入或整合到植物或植物细胞基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的重组DNA构建体和分子可包括供体模板序列，该供体模板序列包含用于插入到植物或植物细胞的基因组中的至少一个转基因、表达盒或其他DNA序列。用于定点整合的此类供体模板还可包括侧接插入序列(即，待插入到植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的重组DNA构建体还可包含编码位点特异性核酸酶和/或任相关蛋白的表达盒以进行定点整合。这些核酸酶表达盒可作为供体模板(顺式)存在于相同的分子或载体中或存在于单独的分子或载体(反式)上。用于定点整合的若干种方法在本领域中是已知的，其涉及切割基因组DNA以在所需基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或缺口的不同蛋白(或蛋白复合物和/或指导RNA)。如本领域所理解的，在修复由核酸酶引入的DSB或缺口的过程中，供体模板DNA可在DSB或缺口的位点处整合到基因组中。尽管插入事件可通过非同源末端接合(NHEJ)发生，但供体模板中同源臂的存在可通过同源重组促进修复过程中插入序列在植物基因组中的接受性和靶向。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如Cas9或Cpf1)的方法，重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA的序列以将核酸酶引导至植物基因组内的所需位点。
设想了编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389或相关家族成员杀昆虫蛋白的重组核酸分子组合物。例如，TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389或相关家族成员杀昆虫蛋白可以用重组DNA构建体表达，其中具有编码该蛋白的ORF的多核苷酸分子可操作地连接至遗传表达元件如启动子和在构建体所针对的系统中表达所必需的任何其他调节元件。非限制性实例包括可操作地连接至用于在植物中表达蛋白的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389或相关家族成员杀昆虫蛋白编码序列的植物功能性启动子，或可操作地连接至用于在Bt细菌或其他芽孢杆菌属物种中表达蛋白的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389或相关家族成员杀昆虫蛋白编码序列的Bt功能性启动子。其他元件可操作地连接至TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389或相关家族成员杀昆虫蛋白编码序列，包括但不限于增强子、内含子、非翻译前导序列、编码蛋白固定化标签(HIS-标签)、易位肽(即，质体转运肽、信号肽)、翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和RNAi靶位点。本文提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于可操作地连接至诸如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：126的多核苷酸的异源启动子，所述多核苷酸编码具有如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ IDNO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ IDNO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：127所示氨基酸序列的多肽或蛋白。异源启动子也可以可操作地连接至编码质体靶向或非靶向的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383及其变体、截短变体和嵌合体以及非靶向TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383及其变体、截短变体和嵌合体或相关家族成员杀昆虫蛋白的合成DNA编码序列。编码本文所公开的蛋白的重组核酸分子的密码子可被同义密码子取代(在本领域中称为沉默取代)。
包含TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389或相关家族成员杀昆虫蛋白的编码序列的重组DNA构建体还可包含编码一种或多种昆虫抑制剂的DNA区域，该DNA区域被配置成与编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389或相关家族成员杀昆虫蛋白、不同于TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389或相关家族成员杀昆虫蛋白的蛋白、昆虫抑制性dsRNA分子或辅助蛋白的DNA序列同时表达或共同表达。辅助蛋白包括但不限于辅因子、酶、结合配偶体或起有助于昆虫抑制剂的有效性的作用的其他试剂，例如通过帮助它的表达，影响它在植物中的稳定性，优化寡聚自由能，加强它的毒性，以及增大它的活性谱。辅助蛋白可以促进对一种或多种昆虫抑制剂的摄取，例如或加强毒性剂的毒性影响。
可以组装重组DNA构建体，使得所有蛋白或dsRNA分子从一个启动子表达，或每种蛋白或dsRNA分子处于单独的启动子控制或其一些组合之下。本发明的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389和相关家族成员蛋白可以由多基因表达系统表达，其中一种或多种TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389或相关家族成员蛋白由共同的核苷酸区段表达，该共同的核苷酸区段还包含其他开放阅读框和启动子，具体取决于所选表达系统的类型。例如，细菌多基因表达系统可利用单个启动子从单个操纵子内驱动多重连接/串联开放阅读框的表达(即，多顺反子表达)。又如，植物多基因表达系统可利用未多重连接的各自表达不同蛋白的表达盒或其他试剂如一种或多种dsRNA分子。
包含TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389或相关家族成员蛋白编码序列的重组核酸分子或重组DNA构建体可通过载体例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒粒子、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体递送至宿主细胞。此类载体可用于在宿主细胞中实现TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389或相关家族成员蛋白编码序列的稳定或瞬时表达，或所编码多肽的后续表达。包含蛋白编码序列并被引入宿主细胞中的外源重组多核苷酸或重组DNA构建体在本文中被称为“转基因”。
本文提供了含有表达TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389或相关家族成员蛋白编码序列中的任一种或多种的重组多核苷酸的转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分。术语“细菌细胞”或“细菌”可包括但不限于农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属或根瘤菌属细胞。术语“植物细胞”或“植物”可包括但不限于双子叶细胞或单子叶细胞。设想的植物和植物细胞包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了由转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物部分。在某些实施方案中，转基因植物可以从转基因种子通过切割、折断、研磨或以其他方式从该植物分离所述部分来获得。在某些实施方案中，植物部分可以是种子、圆荚、叶、花、茎、根或其任何部分或转基因植物部分的不可再生部分。如在此上下文中所用，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能被诱导以形成完整植物的部分或不能被诱导以形成能够有性和/或无性繁殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分为转基因种子、圆荚、叶、花、茎或根的一部分。
提供了制备包含昆虫鞘翅目或鳞翅目抑制量的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员蛋白的转基因植物的方法。此类植物可通过将编码本申请中提供的任何TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员蛋白的重组多核苷酸引入植物细胞中，并选择来源于表达昆虫鞘翅目或鳞翅目抑制量的蛋白的植物细胞的植物来制备。植物可以通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术而来源于植物细胞。用于转化植物的方法是本领域已知的。
本申请还公开了经加工的植物产品，其中经加工的产品包含可检测量的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员蛋白、其昆虫抑制区段或片段或其任何区别部分。在某些实施方案中，经加工的产品选自由以下组成的组：植物部分、植物生物质、油、粕、糖、动物饲料、粉、薄片、麸皮、棉绒、壳、加工的种子，和种子。在某些实施方案中，经加工的产品是不可再生的。植物产品可包含来源于转基因植物或转基因植物部分的商品或其他商业产品，其中商品或其他产品可通过检测编码或包含TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员蛋白的区别部分的核苷酸区段或表达的RNA或蛋白来进行商业跟踪。
表达TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员蛋白的植物可通过育种与表达其他毒素蛋白和/或表达其他转基因性状如除草剂耐受性基因、赋予产量或胁迫耐受性状的基因等的转基因事件杂交，或此类性状可以组合在单个载体中，使得性状全部相关。
如实施例中进一步描述的，编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383的序列，TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383的变体，TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383的截短变体，以及TIC7383、TIC7042、TIC7381和TIC7382的嵌合体被设计用于植物中，并呈现在实施例5的表8中。
可以构建含有这些合成或人工核苷酸序列的表达盒和载体，并根据本领域已知的转化方法和技术将其引入玉米、棉花和大豆植物细胞中。将转化的细胞再生到被观察到表达TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383或其变体、截短变体或嵌合体的转化植物中。为了测试杀虫活性，在鳞翅目、鞘翅目和半翅目害虫的存在下执行生物测定。
如实施例中进一步描述的，编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员蛋白的序列以及与这些蛋白具有显著同一性百分比的序列可以使用本领域普通技术人员已知的方法如聚合酶链反应(PCR)、热扩增和杂交来鉴定。例如，TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383蛋白和变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员蛋白可用于产生与相关蛋白特异性结合的抗体，并且可用于筛查和找到其他密切相关的蛋白成员。
此外，编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383和变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员蛋白的核苷酸序列可作为探针和引物用于筛查以使用热循环或等温扩增和杂交方法鉴定该类别的其他成员。例如，来源于如SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：126所示的序列的寡核苷酸可用于确定来源于商品产品的脱氧核糖核酸样品中TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383蛋白或变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员蛋白转基因的存在与否。考虑到采用寡核苷酸的某些核酸检测方法的灵敏度，预期来源于如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ IDNO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：126所示的序列的寡核苷酸可用于检测来源于合并来源的商品产品中的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383、其变体、截短变体或嵌合体转基因，其中仅一小部分商品产品来源于含有SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124或SEQ ID NO：126中任一种的转基因植物。还认识到，这种寡核苷酸可用于将核苷酸序列变异引入SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124或SEQ ID NO：126中。这种“诱变”寡核苷酸可用于鉴定在转基因植物宿主细胞中表现出一系列昆虫抑制活性或不同的表达的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389或相关家族成员氨基酸序列变体。
核苷酸序列同源物例如由在杂交条件下与本申请公开的每个或任何序列杂交的核苷酸序列编码的杀昆虫蛋白也是本发明的实施方案。本发明还提供了一种用于检测与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列的方法，其中第一核苷酸序列(或其反向互补序列)编码杀虫蛋白或其杀虫片段，并且在严格杂交条件下与第二核苷酸序列杂交。在这种情况下，第二核苷酸序列可以是在严格杂交条件下的选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ IDNO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ IDNO：122、SEQ ID NO：124和SEQ ID NO：126。核苷酸编码序列在适当杂交条件下彼此杂交，由这些核苷酸序列编码的蛋白与针对任何一种其他蛋白产生的抗血清交叉反应。如本文所定义的严格杂交条件包括至少在42℃下杂交，再在室温下用2X SSC、0.1％SDS洗涤两次，每次五分钟，接着在65℃下在0.5X SSC、0.1％SDS中洗涤两次，每次三十分钟。在甚至更高的温度下洗涤构成甚至更严格的条件，例如68℃的杂交条件，接着在68℃下在含有0.1％SDS的2xSSC中洗涤。
本领域的技术人员将认识到，由于遗传密码的冗余，许多能够编码与TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388或TIC7389相关的蛋白的其他序列，以及用于在芽孢杆菌菌株或植物细胞中表达杀虫蛋白的那些序列是本发明的实施方案，当然也将认识到许多这样的冗余编码序列在这些条件下不会与编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388或TIC7389的天然短芽孢杆菌序列杂交。本申请设想使用本领域普通技术人员已知的这些和其他鉴定方法鉴定TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389或相关家族成员蛋白编码序列以及与其具有显著同一性百分比的序列。
本申请还公开了用TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388或TIC7389或相关家族成员蛋白控制作物植物的昆虫、特别是鳞翅目或鞘翅目侵染的方法。此类方法可包括培育包含昆虫、鞘翅目或鳞翅目抑制量的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员毒素蛋白的植物。在某些实施方案中，此类方法还可包括以下任何一种或多种：(i)将包含或编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员毒素蛋白施用于植物或长出植物的种子；以及(ii)用编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员毒素蛋白的多核苷酸转化植物或长出植物的植物细胞。通常，可以设想，TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体或相关家族成员毒素蛋白可以在组合物中提供、在微生物中提供或在转基因植物中提供，以针对鳞翅目或鞘翅目昆虫赋予昆虫抑制活性。
在某些实施方案中，TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员毒素蛋白的重组核酸分子是通过培养重组芽孢杆菌或任何其他被转化以表达蛋白的重组细菌细胞制备的昆虫抑制剂组合物的杀昆虫活性成分。此种组合物可以通过脱水、冻干、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩表达/产生所述重组多肽的此类重组细胞的培养物来制备。此类方法可得到芽孢杆菌或其他昆虫病原细菌细胞提取物、细胞悬液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞沉淀。通过获得如此产生的重组多肽，包含重组多肽的组合物可以包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可以配制用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制喷雾产品或作为饲料生物测定中的昆虫抑制制剂。
在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员的昆虫抑制组合物还可包含本领域普通技术人员已知的至少一种其他多肽，所述至少一种多肽针对相同的鳞翅目或鞘翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性，但不同于TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员毒素蛋白。用于此种组合物的可能的另外的多肽包括昆虫抑制蛋白和昆虫抑制dsRNA分子。使用此类核糖核苷酸序列控制害虫的一个实例在Baum等人(美国专利公布2006/0021087 A1)中有所描述。
用于控制鳞翅目害虫的这种另外的多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，诸如但不限于Cry1A(美国专利号5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公布号10/525,318)、Cry1C(美国专利号6,033,874)、Cry1D、Cry1Da及其变体、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合体(美国专利号7,070,982、6,962,705和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、CrylJ、Cry1K、Cry1L、Cry1型嵌合体(诸如但不限于TIC836、TIC860、TIC867、TIC869和TIC1100(国际申请公布WO2016/061391(A2))、TIC2160(国际申请公布WO2016/061392(A2))、Cry2A、Cry2Ab(美国专利号7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、AND AXMI-045(美国专利公布2013-0117884 A1)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美国专利公布2013-0310543 A1)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公布2013-0104259 A1)、AXMI-134(美国专利公布2013-0167264 A1)、AXMI-150(美国专利公布2010-0160231 A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176 A1)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209(美国专利公布2011-0030096 A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布2014-0245491 A1)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公布2014-0196175 A1)、AXMI-238(美国专利公布2014-0033363 A1)、AXMI-270(美国专利公布2014-0223598 A1)、AXMI-345(美国专利公布2014-0373195 A1)、AXMI-335(国际申请公布WO2013/134523(A2))、DIG-3(美国专利公布2013-0219570 A1)、DIG-5(美国专利公布2010-0317569 A1)、DIG-11(美国专利公布2010-0319093 A1)、AfIP-1A及其衍生物(美国专利公布2014-0033361 A1)、AfIP-1B及其衍生物(美国专利公布2014-0033361 A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公布2014-0007292 A1)、PSEEN3174(美国专利公布2014-0007292 A1)、AECFG-592740(美国专利公布2014-0007292 A1)、Pput_1063(美国专利公布2014-0007292A1)、DIG-657(国际申请公布WO2015/195594(A2))、Pput_1064(美国专利公布2014-0007292A1)、GS-135及其衍生物(美国专利公布2012-0233726 A1)、GS153及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、GS154及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、GS155及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、如美国专利公布2012-0167259 A1中所述的SEQ IDNO：2及其衍生物、如美国专利公布2012-0047606 A1中所述的SEQ ID NO：2及其衍生物、如美国专利公布2011-0154536 A1中所述的SEQ ID NO：2及其衍生物、如美国专利公布2011-0112013 A1中所述的SEQ ID NO：2及其衍生物、如美国专利公布2010-0192256 A1中所述的SEQ ID NO：2和4及其衍生物、如美国专利公布2010-0077507A1中所述的SEQ ID NO：2及其衍生物、如美国专利公布2010-0077508 A1中所述的SEQ ID NO：2及其衍生物、如美国专利公布2009-0313721 A1中所述的SEQ ID NO：2及其衍生物、如美国专利公布2010-0269221A1中所述的SEQ ID NO：2或4及其衍生物、如美国专利号7,772,465(B2)中所述的SEQ IDNO：2及其衍生物、如WO2014/008054 A2中所述的CF161_0085及其衍生物、如美国专利公布US2008-0172762 A1、US2011-0055968 A1和US2012-0117690 A1中所述的鳞翅目毒素蛋白及其衍生物；如US7510878(B2)中所述的SEQ ID NO：2及其衍生物、如美国专利号7812129(B1)中所述的SEQID NO：2及其衍生物、Cry71Aa1和Cry72Aa1(美国专利公布US2016-0230187 A1)、Axmi422(美国专利公布US2016-0201082 A1)、Axmi440(美国专利公布US2016-0185830 A1)、Axmi281(美国专利公布2016-0177332 A1)、BT-0044、BT-0051、BT-0068、BT-0128及其变体(WO 2016-094159 A1)、BT-009、BT-0012、BT-0013、BT-0023、BT0067及其变体(WO 2016-094165 A1)、Cry1JP578V、Cry1JPS1、Cry1 JPS1P578V(WO 2016-061208A1)；等等。
用于控制鞘翅目害虫的这种另外的多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，诸如但不限于Cry3Bb(美国专利号6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、AXMI134(美国专利公布2013-0167264A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176A1)、AXMI-205(美国专利公布2014-0298538 A1)、AXMI-207(美国专利公布2013-0303440 A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z(美国专利公布2014-0196175 A1)、AXMI-279(美国专利公布2014-0223599 A1)、AXMI-R1及其变体(美国专利公布2010-0197592 A1、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG-10(美国专利公布2010-0319092A1)、eHIP(美国专利申请公布号2010/0017914)、IP3及其变体(美国专利公布2012-0210462 A1)、六聚毒素-Hv1a(美国专利申请公布2014-0366227 A1)、PHI-4变体(美国专利申请公布2016-0281105 A1)、PIP-72变体(WO 2016-144688 A1)、PIP-45变体、PIP-64变体、PIP-74变体、PIP-75变体和PIP-77变体(WO 2016-144686 A1)、DIG-305(WO 2016109214 A1)、PIP-47变体(美国专利公布2016-0186204 A1)、DIG-17、DIG-90、DIG-79(WO2016-057123 A1)、DIG-303(WO 2016-070079 A1)；等等。/>
在其他实施方案中，此类组合物/制剂还可包含至少一种另外的多肽，其对昆虫表现出不被本发明的昆虫抑制蛋白抑制的昆虫抑制活性，以扩展获得的昆虫抑制谱，例如对半翅目或缨翅目昆虫表现出昆虫抑制活性的另外的多肽。
本领域已经记录了昆虫对某些杀昆虫剂产生抗性的可能性。一种昆虫抗性管理策略是采用表达两种通过不同作用模式起作用的不同昆虫抑制剂的转基因作物。因此，对任一昆虫抑制剂具有抗性的任何昆虫都可由另一昆虫抑制剂控制。另一昆虫抗性管理策略是使用未针对所靶向鞘翅目或鳞翅目害虫物种加以防护的植物以便为所述未保护植物提供庇护。一个具体的实例在美国专利号6,551,962中有所描述，该专利全文以引用方式并入本文。
其他实施方案诸如被设计用于控制同样由本文所公开的蛋白控制的害虫、待与蛋白一起用于种子处理的局部施用的杀虫化学物质、喷雾制剂、滴注制剂或擦拭制剂可以直接施用于土壤(土壤浸润)，施用于表达本文所公开的蛋白的生长植物，或配制成施用于含有编码一种或多种所公开蛋白的一种或多种转基因的种子。用于种子处理的此类制剂可以用本领域已知的各种贴剂和增粘剂施用。此类制剂可含有与所公开的蛋白在作用模式上具有协同作用的农药，使得制剂杀虫剂通过不同的作用模式起作用以控制可由所公开的蛋白控制的相同或相似害虫，或者使得这些杀虫剂用于控制不受TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389、变体、截短变体、嵌合体或相关家族成员杀虫蛋白有效控制的更广泛宿主范围内的害虫或植物害虫物种。
前述组合物/制剂还可包含农业上可接受的载体，诸如诱饵、粉末、粉尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体悬浮剂、水性溶液剂、芽孢杆菌孢子/晶体制备物、种子处理、转化以表达一种或多种蛋白的重组植物细胞/植物组织/种子/植物或转化以表达一种或多种蛋白的细菌。根据重组多肽固有的昆虫抑制或杀昆虫抑制水平和待施加于植物或应用于膳食测定的制剂水平，以重量计，所述组合物/制剂可包含各种量的重组多肽，例如0.0001重量％至0.001重量％至0.01％至1重量％至99重量％的重组多肽。
实施例
鉴于上述情况，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在所公开的具体方面作出改变，并且仍然获得相似或类似的结果。因此，所公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的。应当理解，每个引用的参考文献的全部公开内容均并入本公开中。
实施例1
TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389的发现
该实施例描述了杀虫蛋白TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389的发现。
在昆虫生物测定中对编码新型侧孢短芽孢杆菌(Bl)杀虫蛋白的序列进行鉴定、克隆、序列确认并测试。从表3中列出的侧孢短芽孢杆菌菌株分离出杀虫蛋白TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388和TIC7389，这些杀虫蛋白代表属于Cry43毒素家族的新型杀虫蛋白。
表3.新型Cry43杀虫毒素蛋白和对应的侧孢短芽孢杆菌菌株
基于由表3中列出的每种侧孢短芽孢杆菌菌株的测序得到的重叠群设计聚合酶链反应(PCR)引物。使用从表3中列出的每种菌株分离的总DNA产生每种蛋白毒素的全长编码序列的扩增子。对于TIC7040，3，888bp的编码序列通过扩增产生，其与预测的3，780bp的编码序列不同。将扩增的编码序列和对应的氨基酸序列命名为“TIC7040HT”，以将其与初始预测的重叠群TIC7040区分开。使用本领域已知的方法将每个扩增子(TIC7040除外)克隆到与可表达苏云金芽孢杆菌(Bt)的启动子可操作地连接的Bt表达载体中。
实施例2
TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383在昆虫生
物测定中显示出鞘翅目和鳞翅目活性
该实施例说明了TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383蛋白对鞘翅目和鳞翅目的多种物种表现出的抑制活性。
杀虫蛋白TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383在Bt中表达，并测定它们对鳞翅目和鞘翅目的多种物种的毒性。针对鞘翅目物种西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，WCR)、Cry3Bb抗性西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，WCRHP)、北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲，NCR)、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲，SCR)和科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲，CPB)测定每种毒素的制剂。还针对鳞翅目物种黑切根虫(小地老虎，BCW)、玉米穗虫(谷实夜蛾，(CEW)，也称为大豆豆荚虫和棉铃虫)、小菜蛾(DBM)、欧洲玉米螟(ECB)、秋粘虫(草地贪夜蛾，FAW)、南方粘虫(南方灰翅夜蛾，SAW)、大豆尺蠖(大豆尺夜蛾，SBL)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟，SWCB)、烟草夜蛾(绿棉铃虫，TBW)和藜豆毛虫(藜豆夜蛾，VBC)测定每种毒素的制剂。还针对半翅目物种牧草盲蝽(美洲牧草盲蝽)、西部牧草盲蝽(豆荚草盲蝽)和新热带区褐臭蝽(英雄美洲蝽)测定毒素制剂。
使表达TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383的转化的Bt生长二十四(24)小时，并将孢子以及溶解的蛋白添加到昆虫饲料中以进行测定。通过将接受含有来自表达TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383的Bt菌株的培养物的饲料的昆虫的生长和发育与接受含有未经处理的对照培养物的饲料的昆虫进行比较来评估致死性和生长迟缓。对于TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382或TIC7383，半翅目害虫未观察到活性。观察到鞘翅目和鳞翅目害虫的活性。对于每种蛋白观察到的关于生长迟缓(S)和致死性(M)的生物测定活性示于表4(鞘翅目)和表5(鳞翅目)中，其中“+”表示活性，空细胞表示未观察到活性，并且“NT”表示未针对该特定害虫测定毒素。
表4.TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383对鞘翅目害虫的生物测定活性
表5.TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383对鳞翅目害虫的生物测定活性
从表4和表5中可以看出，杀虫蛋白TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382和TIC7383显示出针对许多鞘翅目和鳞翅目害虫物种的活性。TIC7040HT显示出对鞘翅目害虫WCR、WCRHP、NCR、SCR和CPB以及鳞翅目害虫CEW、DBM、ECB、FAW、SBL、SWCB和VBC的活性。TIC7042显示出对鞘翅目害虫WCR、WCRHP、NCR、SCR和CPB以及鳞翅目害虫BCW、CEW、DBM、ECB、FAW、SBL和VBC的活性。TIC7042对WCR造成的致死性非常高。TIC7381显示出对鞘翅目害虫WCR、WCRHP、NCR、SCR和CPB以及鳞翅目害虫CEW、DBM、ECB、FAW、SBL、SWCB和VBC的活性。TIC7382显示出对鞘翅目害虫WCR、WCRHP、NCR、SCR和CPB以及鳞翅目害虫DBM、ECB、SBL、SWCB和VBC的活性。TIC7383显示出对鞘翅目害虫WCR、WCRHP、NCR、SCR和CPB以及鳞翅目害虫CEW、DBM、ECB和VBC的活性。
杀虫蛋白TIC7389显示出对鞘翅目害虫WCR和CPB的活性。还针对鳞翅目害虫物种玉米穗虫、秋粘虫和大豆尺蠖以及半翅目物种牧草盲蝽和西部牧草盲蝽测定了TIC7389。观察到SBL生长迟缓，但未观察到其他两种鳞翅目物种和两种半翅目害虫生长迟缓。
昆虫毒素TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7389显示出对多种鞘翅目和鳞翅目害虫物种的活性。昆虫毒素TIC7389显示出对鳞翅目害虫大豆尺蠖的毒性。
实施例3
经胰蛋白酶消化的TIC7040HT和TIC7383以及经胰凝乳蛋白酶消化的TIC7040HT显示出针对西方玉米根虫的活性
该实施例说明了经胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化的TIC7040HT以及经胰蛋白酶消化的TIC7383蛋白针对西方玉米根虫表现出的抑制活性。
在单独的反应中使TIC7040HT的蛋白样品经受胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化。同样，使TIC7383经受胰蛋白酶消化。使用本领域已知的方法进行胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化。通过质谱法分析经消化的蛋白以确定所得蛋白片段。所得的TIC7040HT的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化片段以及所得的TIC7383的胰蛋白酶消化片段示于表6中。
将经消化的蛋白用于针对西方玉米根虫的生物测定中。表6示出了每种经消化的蛋白制剂和全长TIC7040HT和TIC7383蛋白的活性测定。
表6.TIC7040HT、经胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化的TIC7040HT、TIC7383以及经胰蛋白酶消化的TIC7383针对西方玉米根虫的生物测定活性
从表6中可以看出，经胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化的TIC7040HT和经胰蛋白酶消化的TIC7383蛋白保留了针对西方玉米根虫的活性。
实施例4
TIC7040HT和TIC7383的截短在昆虫生物测定中显示出鞘翅目活性
该实施例说明了TIC7040HT和TIC7383蛋白的截短针对多种鞘翅目物种表现出的抑制活性。
使用本领域已知的方法生成编码TIC7040HT和TIC7383的截短的编码序列，并将其克隆到细菌表达载体中以在Bt中表达。在昆虫饲料中提供截短的蛋白并测定针对鞘翅目害虫的活性。截短的TIC7040HT和TIC7383毒素相对于全长TIC7040HT和TIC7383的氨基酸位置示于表7中。
使表达TIC7040HT和TIC7383的截短的转化的Bt生长二十四(24)小时，并将孢子以及溶解的蛋白添加到昆虫饲料中以进行测定。通过将接受含有来自表达TIC7040HT和TIC7383的截短的Bt菌株的培养物的饲料的昆虫的生长和发育与接受含有未经处理的对照培养物的饲料的昆虫进行比较来评估致死性和生长迟缓。
测定TIC7040HT和TIC7383的截短针对各个鞘翅目物种的毒性。针对鞘翅目物种西方玉米根虫、Cry3Bb抗性西方玉米根虫、和科罗拉多马铃薯甲虫测定每种毒素的制剂。
观察到鞘翅目害虫的活性。对于每种蛋白观察到的关于生长迟缓(S)和致死性(M)的生物测定活性示于表7中，其中“+”表示活性，空细胞表示未观察到活性，并且“NT”表示未针对该特定害虫测定毒素。还提供全长TIC7040HT和TIC7383的活性以与截短的蛋白活性进行比较。
表7.TIC7040HT和TIC7383的截短对鞘翅目害虫的生物测定活性
从表7中可以看出，TIC7040HT和TIC7383的截短保持了针对WCR和CPB的活性。
实施例5
编码用于在植物细胞中表达的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383以及TIC7040HT、TIC7042、TIC7382和TIC7383的截短变体的合成编码序列的设计
构建合成或人工编码序列，用于在植物中表达TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383以及TIC7040HT、TIC7042、TIC7382和TIC7383的截短变体。将这些合成编码序列克隆到二元植物转化载体中，并用于转化植物细胞。合成核酸序列根据美国专利5,500,365中大体描述的方法来合成，避免了某些有害的问题序列，诸如富含ATTTA和A/T的植物聚腺苷酸化序列，同时保留了天然Bl蛋白的氨基酸序列。TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383以及TIC7040HT、TIC7042、TIC7382和TIC7383杀虫蛋白的截短变体的合成编码序列示于表8中。
表8.用于在植物细胞中表达的编码TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383以及TIC7040HT、TIC7042、TIC7382和TIC7383的截短变体的合成编码序列
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实施例6
用于在植物细胞中表达TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383以及TIC7040HT、TIC7042、TIC7382和TIC7383的截短变体的表达盒
设计了具有如表8所示序列的多种植物表达盒。此类表达盒可用于植物原生质体中的瞬时表达或植物细胞的转化。典型的表达盒是相对于蛋白在植物细胞内的最终放置而设计的。对于质体靶向蛋白，合成的TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383杀虫蛋白截短变体的编码序列在框内与叶绿体靶向信号肽编码序列可操作地连接。所得植物转化载体包含用于表达杀虫蛋白的第一转基因盒，其包含组成型启动子，以5′可操作地连接至前导序列，以5′可操作地连接至内含子(或任选地无内含子)，以5′可操作地连接至编码质体靶向或非靶向TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383蛋白的截短变体的合成编码序列，其依次以5′可操作地连接至3′UTR，以及用于使用草甘膦或抗生素选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。上述所有元件常常与提供用于构建表达盒的另外的序列(诸如限制性内切酶位点或连接非依赖性克隆位点)连续排列。
实施例7
TIC7382在稳定转化的玉米植物中表达时提供对西方玉米根虫的有效抗性
本实施例说明了TIC7382的截短在植物中表达并作为饲料提供给相应的害虫时针对鞘翅目(诸如西方玉米根虫)表现出的抑制活性。
使用本领域已知的方法克隆包含被设计用于表达非靶向TIC7382(CR-BREla.TIC7382_1.nno_Mc：1)以及截短变体CR-BREla.TIC7382_2.nno_Mc：1和CR-BREla.TIC7382_3.nno_Mc：1的转基因盒的二元植物转化载体。该植物转化载体包含用于表达TIC7382杀虫蛋白或截短变体之一的第一转基因盒，其包含根优选启动子，以5′可操作地连接至前导序列，以5′可操作地连接至内含子，以5′可操作地连接至编码TIC7382或截短变体的合成编码序列，其中每一者包含紧接在起始甲硫氨酸之后的另外的丙氨酸残基，其又以5′可操作地连接至3′UTR，以及用于使用草甘膦选择转化的植物细胞的第二转基因盒。使用本领域已知的方法将所得载体用于稳定转化玉米植物。选择并培养单个T-DNA插入事件。针对摄食稳定转化的玉米植物的根的西方玉米根虫测定杀虫活性。
使用R0稳定转化的植物测定鞘翅目抗性并生成F1子代。从每个二元载体转化中选择多个单一复制事件。将来自每个二元载体转化的一部分事件用于鞘翅目测定，而另一部分事件用于生成F1子代以进一步测试。
将R0测定植物移植到八英寸的盆中。用来自西方玉米根虫的卵接种植物。在接种之前将卵孵育大约十(10)天以使其在接种之后四(4)天发生孵化，以确保足够数量的幼虫存活并且能够攻击玉米根。在大约V2至V3阶段接种转化的植物。侵染大约二十八(28)天之后，使植物生长。从盆中取出植物，小心地洗涤根以去除所有的土壤。如表9所呈现的，使用1-5的损害等级量表来评估对根部的损害。还与阴性对照进行了比较以确保测定已经适当地执行。低根损害分数指示TIC7382蛋白或截短变体赋予WCR的抗性。RDR分数为1.0至2.5表示良好功效，RDR分数为2.6至3.5表示中等功效，RDR评分为3.6至5.0表示低功效。
表9.R0根损害等级分数
根损害分数 描述
1 没有可见的摄食
2 一定程度的摄食；没有切断
3 切断至少一个根
4 整个节点被切断
5 多于一个节点被切断
对于F1测定，将来自西部玉米根虫的卵孵育约十(10)天，以在接种后四(4)天内孵化。在大约V2至V3阶段接种植物。每盆用约两千个卵接种。侵染大约二十八(28)天之后，使植物生长。从盆中取出植物，小心地洗涤根以去除所有的土壤。如表10所呈现的，使用0-3的损害等级量表来评估对根部的损害。与阴性对照进行了比较以确保测定已经适当地执行。低根损害分数指示TIC7382或截短赋予WCR的抗性。F1的RDR为0.0至0.75表示良好功效，RDR为0.76至1.5表示中等功效，RDR为1.6至3.0表示低功效。
表10.F1根损害等级分数
根损害分数 描述
0 没有可见的摄食
0.01-0.09 摄食疤痕和轨迹
0.1-0.9 根切断，但少于一个全长节点
1.0-1.9 在1.5英寸的植物内破坏至少一个全长节点(或等同物)
2.0-2.9 两个或更多个节点消失
3 三个或更多个节点消失
表11示出了针对TIC7382蛋白和截短变体测定的平均根损害等级(RDR)。
表11.表达TIC7382或截短变体的转基因玉米植物的平均根损害等级(RDR)
从表11中可以看出，产生截短变体CR-BREla.TIC7382_2.nno_Mc：1的TIC7382蛋白的C末端截短相对于CR-BREla.TIC7382_1.nno_Mc：1的根损害等级提高了功效。产生截短变体CR-BREla.TIC7382_3.nno_Mc：1的TIC7382蛋白的N末端和C末端截短导致对玉米根的损害较小，并且与CR-BREla.TIC7382_1.nno_Mc：1和CR-BREla.TIC7382_2.nno_Mc：1的根损害等级相比进一步提高了功效，如较低的R0根损害等级所证实。
实施例8
TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383以及TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体在稳定转化的玉米植物中表达时针对鞘翅目玉米根虫害虫的活性测定
该实施例说明了TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体针对摄食玉米根的不同鞘翅目物种的抑制活性。
包含被设计用于表达质体靶向和非靶向TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体的转基因盒的二元植物转化载体使用本领域已知的方法克隆，并且包含如表8所示的序列。使用本领域已知的方法将所得载体用于稳定转化玉米植物。选择并培养单个T-DNA插入事件。针对摄食稳定转化的玉米植物的根的鞘翅目害虫西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，WCR)、北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲，NCR)、墨西哥玉米根虫(玉米根萤叶甲，MCR)、巴西玉米根虫(黄瓜条叶甲，BZR)、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲，SCR)、科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲，CPB)、巴西玉米根虫复合体(BCR，由叶甲蝽和南美叶甲组成)测定杀虫活性。
使用R0稳定转化的植物测定鞘翅目抗性并生成F1子代。从每个二元载体转化中选择多个单一复制事件。将来自每个二元载体转化的一部分事件用于R0鞘翅目测定，而另一部分事件用于生成F1子代以进一步测试。
将R0测定植物移植到八英寸的盆中。用来自西方玉米根虫、北方玉米根虫或南方玉米根虫的卵接种植物。在接种之前将卵孵育大约十(10)天以使其在接种之后四(4)天发生孵化，以确保足够数量的幼虫存活并且能够攻击玉米根。在大约V2至V3阶段接种转化的植物。侵染大约二十八(28)天之后，使植物生长。从盆中取出植物，小心地洗涤根以去除所有的土壤。如实施例5的表9所呈现的，使用1-5的损害等级量表来评估对根部的损害。还与阴性对照进行了比较以确保测定已经适当地执行。将每个二元载体转化的多个R0事件用于鞘翅目测定中。低根损害分数指示TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体赋予所测试的鞘翅目害虫的抗性。
将从每个二元载体转化产生的一部分R0稳定转化事件用于产生F1子代。使R0稳定转化植物自花授精，产生F1子代。种植F1种子。通过本领域已知的分子方法鉴定杂合植物，并将其用于针对鞘翅目害虫的测定，以及毒素蛋白的ELISA表达测量。将来自每个事件的一部分杂合F1子代用于昆虫测定，而另一部分用于测量毒素蛋白表达。
将来自西方玉米根虫、北方玉米根虫或南方玉米根虫的卵孵育约十(10)天以使其在接种后四(4)天内孵化。对于WCR，每个盆接种约两千个卵。对于NCR，由于该物种的卵的可得性较低，可以使用较少的卵。在大约V2至V3阶段接种植物。侵染大约二十八(28)天之后，使植物生长。从盆中取出植物，小心地洗涤根以去除所有的土壤。如实施例5的表10所呈现的，使用0-3的损害等级量表来评估对根部的损害。还与阴性对照进行了比较以确保测定已经适当地执行。低根损害分数指示TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383蛋白的截短变体赋予鞘翅目害虫的抗性。
实施例9
TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体在稳定转化的玉米、大豆或棉花植物中表达时针对鳞翅目害虫的活性测定。
该实施例说明了针对摄食来自表达TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体的稳定转化的玉米、大豆或棉花植物的组织的各种鳞翅目害虫物种的活性测定。
包含被设计用于表达质体靶向和非靶向TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体的转基因盒的二元植物转化载体使用本领域已知的方法克隆，并且包含如表8所呈现的编码序列。
将玉米、大豆或棉花使用农杆菌介导的转化方法用上述二元转化载体进行转化。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。使用植物叶盘的生物测定类似于美国专利号8,344,207中所述的那些来执行。使用未转化的玉米、大豆或棉花植物来获得用作阴性对照的组织。将来自每个二元载体的多个转化事件针对鳞翅目害虫进行评估，所述鳞翅目害虫诸如但不限于黑切根虫、玉米穗虫、小菜蛾、欧洲玉米螟、秋粘虫、南方粘虫、大豆尺蠖、西南玉米螟、烟草夜蛾和藜豆毛虫。在昆虫生物测定中显示出生长迟缓和/或致死性的那些昆虫被确定为对所测试TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383昆虫毒素杀虫蛋白的截短变体的作用敏感。
实施例10
TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体在稳定转化的芥花植物中表达时针对跳蚤甲虫害虫的活性测定
该实施例说明了当允许摄食来自表达TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体的转基因芥花植物的整个转基因芥花植物或组织时，针对各种跳蚤甲虫物种的活性测定。
包含被设计用于表达质体靶向和非靶向TIC7040、TIC7040HT、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383或TIC7040HT、TIC7042、TIC7382或TIC7383的截短变体的转基因盒的二元植物转化载体使用本领域已知的方法克隆，并且包含如表8所呈现的编码序列。
使用本领域已知的方法，将所得的二元转化载体用于稳定转化芥花植物细胞。诱导转化的细胞形成植物。使用植物叶盘的生物测定类似于美国专利号8,344,207中所述的那些，使用现场收集的跳蚤甲虫来执行。使用未转化的芥花植物来获得用作阴性对照的组织。来自每个二元载体的多个转化事件针对鞘翅目跳蚤甲虫进行评估，所述鞘翅目跳蚤甲虫诸如但不限于十字花科跳蚤甲虫(萝卜菜跳甲)、黄曲条跳蚤甲虫(黄曲条跳甲)和西部黑跳蚤甲虫(微小菜跳甲)。随着甲虫继续摄食，每天测定跳蚤甲虫的致死率。在十二(12)天内，每两(2)至三(3)天更换一次叶盘，以确保有新鲜物质可供跳蚤甲虫摄食，并减少样品中蛋白降解的任何影响。
另选地，可以在存在跳蚤甲虫侵染的田地中种植转化的芥花植物。植物可以置于棚内，以防止土壤中出现的跳蚤甲虫逃离实验田。可采用芥花叶的损害等级来确定哪些植物经历的损害较小并且显示出对跳蚤甲虫的抗性。
实施例11
TIC7383的截短在稳定转化的玉米植物中提高了针对玉米根虫的功效
该实施例说明了通过N末端、C末端或两个末端处的截短实现的TIC7383功效的提高。
使用本领域已知的方法克隆包含被设计用于表达非靶向TIC7383和截短变体的转基因盒的二元植物转化载体。该植物转化载体包含用于表达TIC7383杀虫蛋白或截短变体的第一转基因盒，其包含根优选启动子，以5′可操作地连接至前导序列，以5′可操作地连接至内含子，以5′可操作地连接至编码TIC7383或截短变体的合成编码序列，其中一些包含紧接在起始甲硫氨酸之后的另外的丙氨酸残基，其又以5′可操作地连接至3′UTR，以及用于使用草甘膦选择转化的植物细胞的第二转基因盒。使用本领域已知的方法将所得载体用于稳定转化玉米植物。选择并培养单个T-DNA插入事件。针对摄食稳定转化的玉米植物的根的西方玉米根虫测定杀虫活性。
使用R0稳定转化的植物测定对西方玉米根虫的抗性并生成F1后代。从每个二元载体转化中选择多个单一复制事件。将来自每个二元载体转化的一部分事件用于鞘翅目测定，而另一部分事件用于生成F1子代以进一步测试。使用如实施例7提供的表9和表10中所示的根损害等级分数确定R0和F1根损害等级分数。表12示出了从表达TIC7383和截短变体的R0和F1稳定转化的玉米植物获得的平均根损害等级分数。TIC7383的蛋白表达水平和相应的截短变体也示于表12中，并以百万分率(ppm)表示。
从表12中可以看出，N末端、C末端或两个末端处的截短提高了一些截短变体的功效，如通过相对于全长TIC7383蛋白(CR-BREla.TIC7383_1.nno_Mc：1)的较低平均根损害等级分数所显示。在大多数情况下，TIC7383毒素的截短也改善了植物内的表达。
表12.表达TIC7383和截短变体的稳定转化的玉米植物的平均根损害等级(RDR)分数
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实施例12
TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7042的嵌合体在稳定转化的玉米植物中针对西方玉米根虫的活性测定
该实施例说明了TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7042的嵌合体的设计以及在表达嵌合体的稳定转化的玉米植物中针对西方玉米根虫(WCR)的活性测定。
设计TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7042的嵌合体，其中一种毒素的结构域1和2(D1D2)与另一种毒素的第三结构域(D3)组合。下表13示出了每种嵌合体的组成。
表13.TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7042嵌合体的组成
使用本领域已知的方法克隆包含被设计用于表达TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7042的非靶向嵌合体的转基因盒的二元植物转化载体。该植物转化载体包含用于表达嵌合毒素杀虫蛋白的第一转基因盒，其包含根优选启动子，以5′可操作地连接至前导序列，以5′可操作地连接至内含子，以5′可操作地连接至编码TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7042的嵌合体的合成编码序列，其包含紧接在起始甲硫氨酸之后的另外的丙氨酸残基，其又以5′可操作地连接至3′UTR，以及用于使用草甘膦选择转化的植物细胞的第二转基因盒。使用本领域已知的方法将所得载体用于稳定转化玉米植物。选择并培养单个T-DNA插入事件。针对摄食稳定转化的玉米植物的根的西方玉米根虫测定杀虫活性。
使用R0稳定转化的植物测定对西方玉米根虫的抗性并生成F1后代。从每个二元载体转化中选择多个单一复制事件。将来自每个二元载体转化的一部分事件用于鞘翅目测定，而另一部分事件用于生成F1子代以进一步测试。使用如实施例7提供的表9和表10中所示的根损害等级分数确定R0和F1根损害等级分数。表14示出了从表达TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7042的嵌合体或截短变体的R0和F1稳定转化的玉米植物获得的平均根损害等级分数，其中“NT”表示未测试。将在N末端和C末端原毒素结构域处截短的TTC7382变体(CR-BREla.TIC7382_3.nno_Mc：1)与在N末端和C末端原毒素结构域处截短的TIC7383变体(CR-BREla.TIC7383_7.nno_Mc：1)进行比较。
表14.针对西方玉米根虫，表达TIC7381、TIC7382、TIC7383和TIC7042的嵌合体的稳定转化的玉米植物的平均根损害等级(RDR)分数
描述 平均R0RDR 平均F1RDR
阴性对照 2.8
GOI-TIC10743.nno_Mc：1 3.4 2
GOI-TIC10744.nno_Mc：1 3.3 2.3
GOI-TIC10745.nno_Mc：1 3.8 2.6
GOI-TIC10746.nno_Mc：1 1.3 0.4
GOI-TIC10747.nno_Mc：1 NT NT
GOI-TIC10748.nno_Mc：1 3.3 2.7
CR-BREla.TIC7382_3.nno_Mc：1 1.6 1.0
CR-BREla.TIC7383_7.nno_Mc：1 3 1.5
从表14中可以看出，相对于阴性对照CR-BREla.TIC7382_3.nno_Mc：1和CR-BREla.TIC7383_7.nno_Mc：1，由TIC7382的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成的嵌合毒素GOI-TIC10746.nno_Mc：1在R0和F1上提供了更好的功效。表达GOI-TIC10746.nno_Mc：1的四个F1事件包括在测定中。根损害等级分数在0.11至0.79的范围内(RDR：0.11、0.20、0.30和0.79)。一个表达GOI-TIC10746.nno_Mc：1且RDR为0.11的事件等于商业对照。除上述数据之外，从表达嵌合毒素GOI-TIC10746.nno_Mc：1的细菌中分离的蛋白在饲料生物测定中也显示出针对北方玉米根虫的活性。
实施例13
TIC7382和TIC7383嵌合体在稳定转化的玉米植物中针对玉米根虫的活性测定
该实施例说明了TIC7382和TIC7383的嵌合体的设计以及在表达嵌合体的稳定转化的玉米植物中针对西方玉米根虫(WCR)的活性测定。
使用本领域已知的方法克隆编码被设计用于在植物中表达的由TIC7382的结构域1和2以及TIC7383的结构域3组成的嵌合毒素的合成编码序列。嵌合毒素TIC10746NTermExt1(SEQ ID NO：125，由SEQ ID NO：124编码)包含TIC7382的N末端延长。嵌合毒素TIC10746NTermExt2(SEQ ID NO：127，由SEQ ID NO：126编码)包含TIC7383的N末端延长。将合成编码序列克隆到类似于实施例12中描述的二元植物转化载体中并用于转化玉米植物。如先前在实施例8中针对玉米根虫物种侵染后的R0和F1植物进行根测定，所述玉米根虫物种诸如西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，WCR)、北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲，NCR)、墨西哥玉米根虫(玉米根萤叶甲，MCR)、巴西玉米根虫(黄瓜条叶甲，BZR)、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲，SCR)、科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲，CPB)、巴西玉米根虫复合群(BCR，由叶甲蝽和南美叶甲组成)。相对于未转化的玉米植物对照，R0和F1植物的平均低根损害等级(RDR)分数表明对嵌合毒素表达赋予的对玉米根虫物种的抗性。
按照本公开，本文公开的并且要求保护的所有组合物可在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本发明的组合物已经根据前述示例性实施方案加以描述，但对本领域技术人员显而易见的是可使本文所述的组合物发生变化、改变、修改和变更，而不偏离本发明的真实概念、实质和范围。更具体地讲，显而易见的是，化学和生理相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时可获得相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改均被认为是在所附权利要求书所限定的本发明的实质、范围和概念之内。
本说明书中引用的所有出版物和公布的专利文献均以引用方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出以引用方式并入一样。

Claims (23)

1.一种重组核酸分子，其包含异源启动子和多核苷酸区段，其中所述异源启动子可操作地连接至所述多核苷酸区段，其中所述多核苷酸区段编码杀虫蛋白，并且其中
所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:127所示。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中：
a.所述重组核酸分子包含用于在植物中表达所述杀虫蛋白的序列；或者
b.所述重组核酸分子在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的所述杀虫蛋白；或者
c.所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒以及细菌或酵母人工染色体组成的组。
3.如权利要求1所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子被限定为存在于宿主细胞内，其中所述宿主细胞选自由细菌和植物细胞组成的组。
4.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述细菌宿主细胞来自选自由以下组成的组的细菌属：农杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和欧文氏菌属。
5.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述芽孢杆菌属物种为蜡状芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属为侧孢短芽孢杆菌，或者所述埃希氏菌属为大肠杆菌。
6.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述植物细胞是双子叶或单子叶植物细胞。
7.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、包菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、茄子、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、胡椒、马铃薯、南瓜、萝卜、油菜籽、稻、红花、灌木、高粱、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
8.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：鹰嘴豆、豌豆、木豆和大豆细胞。
9.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：花旗松、火炬松、辐射松和南方松细胞。
10.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞是甜玉米细胞。
11.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞是花生细胞。
12.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞是黑小麦细胞。
13.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自由以下组成的组：松树、桉树和白杨树细胞。
14.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述杀虫蛋白对根萤叶甲属昆虫表现出活性。
15.如权利要求14所述的重组核酸分子，其中所述昆虫是西方玉米根虫、南方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、巴西玉米根虫或由叶甲蝽和南美叶甲组成的巴西玉米根虫复合群。
16.如权利要求15所述的重组核酸分子，其中所述杀虫蛋白对西方玉米根虫和北方玉米根虫表现出活性。
17.一种昆虫抑制组合物，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子。
18.如权利要求17所述的昆虫抑制组合物，其还包含编码与所述杀虫蛋白不同的至少一种其他杀虫剂的核苷酸序列。
19.如权利要求18所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂选自由昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白组成的组。
20.如权利要求18所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种表现出活性。
21.如权利要求20所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫蛋白选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-AXMI-、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1及其变体、IP3及其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657DIG-11、Cry71Aa1、Cry72Aa1、PHI-4变体、PIP-72变体、PIP-45变体、PIP-64变体、PIP-74变体、PIP-75变体、PIP-77变体、Axmi422、Dig-305、Axmi440、PIP-47变体、Axmi281、BT-009、BT-0012、BT-0013、BT-0023、BT0067、BT-0044、BT-0051、BT-0068、BT-0128、DIG-17、DIG-90、DIG-79、Cry1JP578V、Cry1JPS1和Cry1JPS1P578V。
22.如权利要求17所述的昆虫抑制组合物，所述昆虫抑制组合物被限定为包含表达所述重组核酸分子的植物细胞，其中所述植物细胞是不可再生的。
23.一种用于控制根萤叶甲属害虫或害虫侵染的方法，所述方法包括：
使所述害虫与杀昆虫有效量的如SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:127所示的杀虫蛋白接触。
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