CN117616117A

CN117616117A - 新型昆虫抑制蛋白

Info

Publication number: CN117616117A
Application number: CN202280048230.8A
Authority: CN
Inventors: D·J·伯温; C·A·蔡; A·R·豪; K·M·韦格纳
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2021-07-08
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2024-02-27

Abstract

公开了表现出针对鳞翅目和半翅目害虫物种的毒性活性的杀虫蛋白，并且包括但不限于TIC2199。提供了含有编码所公开的杀虫蛋白的重组核酸序列的DNA构建体。提供了对鳞翅目和半翅目侵染具有抗性的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，其含有编码本发明杀虫蛋白的重组核酸序列。还提供了用于检测生物样品中本发明重组核酸序列或蛋白的存在的方法，以及使用TIC2199杀虫蛋白防治鳞翅目和半翅目物种害虫的方法。

Description

新型昆虫抑制蛋白

相关申请的引用

本申请要求2021年7月8日提交的美国临时申请号63/219,604以及2022年6月2日提交的美国临时申请号63/348,278的权益，所述申请全部通过引用整体并入本文。

序列表的并入

名为“MONS530WO.txt”的文件，包含计算机可读形式的序列表，创建于2022年6月13日。该文件为72,115字节(在MS-中测量)，通过电子递交(使用美国专利局EFS-Web提交系统)同时提交，并且通过引用整体并入。

技术领域

本发明总体上涉及昆虫抑制蛋白领域。公开了一类新型毒素蛋白，其对作物植物和种子的农业相关害虫，特别是鳞翅目物种的昆虫害虫表现出昆虫抑制活性。提供了植物、植物部分、种子、包括植物和微生物细胞的细胞、以及含有编码一种或多种所公开的毒素蛋白的重组多核苷酸构建体的载体。

背景技术

提高重要农业植物(包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、棉花、蔬菜、珍珠小米、木豆、花生、马铃薯、大麦、燕麦、果树等)的作物产量已变得越来越重要。除了为不断增长的人口提供食物、衣服和能源的农产品的需求不断增长之外，与气候相关的影响以及不断增长的人口将土地用于农业实践以外的压力预计将减少农业可用耕地的数量。这些因素导致了对粮食安全的严峻预测，特别是在植物生物技术和农艺实践缺乏重大改进的情况下。鉴于这些因素，技术、农业技术和害虫管理方面的环境可持续改进是在数量日益有限的农业可用耕地上扩大作物生产的重要工具。

昆虫，特别是鳞翅目昆虫，是损害大田作物的主要原因，从而降低了受浸染地区的作物产量。对农业产生负面影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于黑粘虫(Spodopteracosmioides)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、棉叶虫(Alabama argillacea)、小菜蛾(Plutella xylostella)、欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、Cry1Fa1抗性草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、旧世界棉铃虫(Helicoverpa armigera)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、斑点棉铃虫(Earias vittella)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、向日葵尺蠖(Rachiplusia nu)、烟夜蛾(Heliothisvirescens)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura，也称为茶蚕(cluster caterpillar))、西方豆虫(Striacosta albicosta)以及绒豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)。

历史上，农业中的害虫防治剂主要依靠合成化学杀虫剂的密集应用。除了新出现的抗性问题以及此类害虫防治剂不区分有益昆虫和其他生物并以有益昆虫和其他生物为目标的事实之外，对环境和人类健康的关注也刺激了专门用于防治造成作物损失的害虫的生物农药的研究和开发。这项研究工作导致了各种昆虫病原微生物物种(包括细菌)的逐步发现和使用。

当昆虫病原细菌，特别是属于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌的潜力被发现并开发为生物害虫防治剂时，生物防治范式发生了转变。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)菌株已被用作杀虫蛋白的来源，因为已发现Bt菌株对特定昆虫表现出高毒性。已知Bt菌株产生δ-内毒素，其在孢子形成开始时和稳定生长期期间位于伴孢晶体包涵体内(例如，Cry蛋白)，并且还已知其产生分泌性杀昆虫蛋白。易感昆虫摄入后，δ-内毒素以及分泌的毒素在中肠上皮表面发挥作用，破坏细胞膜，导致细胞破坏和死亡。还在Bt以外的细菌物种中鉴定出编码杀昆虫蛋白的基因，包括其他芽孢杆菌和多种其他细菌物种，诸如侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)(“Ls”先前也被称为球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus))、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacilluspopilliae)以及缓病类芽孢杆菌(Paenibacillus lentimorbus)。此外，还从多种非细菌来源(包括蕨类植物、蜘蛛毒液)中鉴定出杀昆虫毒素，并且在害虫饮食中递送用于压制必需基因的dsRNA已被确定为有效的害虫管理策略。

结晶和分泌的可溶性杀昆虫毒素对其宿主具有高度特异性，并且作为化学杀虫剂的替代品已获得全世界的认可。例如，杀昆虫毒素蛋白已被用于各种农业应用中，以保护农业重要植物免受昆虫侵染，减少对化学农药应用的需要，以及提高产量。杀昆虫毒素蛋白用于通过以下方法防治作物植物的农业相关害虫：通过机械方法，诸如喷洒以将含有各种菌株的微生物制剂分散到植物表面，以及通过使用遗传转化技术来产生表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物和种子。

表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物的使用已在全球范围内得到应用。例如，在2016年，有2310万公顷种植了表达Bt毒素的转基因作物，并且有7540万公顷种植了表达Bt毒素并具有除草剂耐受性性状的转基因作物(ISAAA.2016.Global Status ofCommercialized Biotech/GM Crops:2016.ISAAA Brief No.52.ISAAA:Ithaca,NY)。转基因防虫作物的全球使用和用于这些作物中的杀昆虫毒素蛋白的有限数量给能赋予对当前使用的杀昆虫蛋白的抗性的现有昆虫等位基因带来了选择压力。

目标害虫对杀昆虫毒素蛋白的抗性的发展产生了对发现和开发新形式的杀昆虫毒素蛋白的持续需求，所述新形式的杀昆虫毒素蛋白可用于管理昆虫对表达杀昆虫毒素蛋白的转基因作物的抗性的增加。具有改进的功效并对更广谱的易感昆虫物种表现出防治作用的新的蛋白毒素，将减少能够产生抗性等位基因的存活昆虫的数量。此外，在一种植物中使用两种或更多种转基因杀昆虫毒素蛋白，它们对同一昆虫害虫具有毒性，并表现出不同的作用模式，或者两种或更多种不同的毒性作用模式(例如，编码靶向待压制的必需基因的dsRNA的转基因联合编码肽或蛋白毒素的转基因，两者对同一昆虫物种具有毒性)，降低了任何单一目标昆虫物种产生抗性的可能性。另外，当与本发明的蛋白一起使用时，使用自限制技术(诸如Oxitec Ltd提供的那些)将提高被赋予表达本发明蛋白的转基因作物的性状的持久性(Zhou等人2018.Combining the high-dose/refuge strategy and self-limiting transgenic insects in resistance management—a test in experimentalmesocosms.Evol Appl11(5):727–738；Alphey等人2009.Combining pest control andresistance management:synergy of engineered insects with Bt crops.Journal ofEconomic Entomology,102:717-732)。

因此，发明人在本文中公开了一种来自苏云金芽孢杆菌的新型蛋白，以及相对于天然毒素表现出修饰的氨基酸序列的改进的工程化蛋白，和示例性重组蛋白，所述蛋白各自表现出针对目标鳞翅目物种的杀昆虫活性，特别是针对小地老虎(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、卷心菜尺蠖虫(Trichoplusia ni)、欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、绒豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)和西方豆虫(Striacosta albicosta)以及半翅目物种牧草盲蝽(Lygus lineolaris)和新热带棕色臭虫(Euschistus heros)。

发明内容

本文公开了一种新型杀虫蛋白TIC2199，已证实其表现出针对作物植物的一种或多种害虫的抑制活性。TIC2199蛋白可以在制剂和植物原位(in planta)中单独使用或与其他杀昆虫蛋白和毒性剂组合使用，从而针对目前在农业系统中使用的杀昆虫蛋白和杀虫化学品提供替代品。

在一个实施方案中，本申请公开了一种重组核酸分子，其包含与编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子，其中所述杀虫蛋白包含SEQ IDNO:2、4、7、10、13、15或17的氨基酸序列；或者所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17的氨基酸序列具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或者所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO:1、3、5、6、8、9、11、12、14、16或18的核苷酸序列的多核苷酸杂交。重组核酸分子可包含具有在植物中表达杀虫蛋白的功能的序列，并且当其在植物细胞中表达时产生杀虫有效量的杀虫蛋白或其杀虫片段。

在本申请的另一个实施方案中，重组核酸分子存在于细菌或植物宿主细胞内。所考虑的细菌宿主细胞至少包括农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)以及欧文氏菌属(Erwinia)。在某些实施方案中，芽孢杆菌属物种是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，或者埃希氏菌属是大肠杆菌(Escherichia coli)。所考虑的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。所考虑的植物细胞还包括苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔属植物(例如，油菜)、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(棉花属(Gossypium)物种)、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、圆橙南瓜(pumpkin)、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜(squash)、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶叶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。

在另一个实施方案中，杀虫蛋白表现出针对鳞翅目昆虫的活性，所述鳞翅目昆虫至少包括小地老虎(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、卷心菜尺蠖虫(Trichoplusia ni)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、绒豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)、西方豆虫(Striacosta albicosta)和小玉米茎螟(Elasmopalpus lignosellus)。

在另一个实施方案中，杀虫蛋白表现出针对半翅目昆虫的活性，所述半翅目昆虫至少包括牧草盲蝽(Lygus lineolaris)和新热带棕色臭虫(Euschistus heros)。

本申请还考虑了包含编码杀虫蛋白TIC2199或其片段的重组核酸分子的细菌和植物及植物部分。重组分子(例如，构建体)可以包含异源启动子，其用于在细菌或植物细胞中表达可操作地连接的编码杀虫蛋白的多核苷酸区段。考虑了双子叶植物和单子叶植物两者。在另一个实施方案中，植物进一步选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔属植物(例如，油菜)、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(即，棉花属物种)、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、圆橙南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、玉米(corn)(即玉米(maize))诸如甜玉米或饲料玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶叶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦。植物部分可以例如包括但不限于叶、块茎、根、茎、种子、胚、花、花序、棉铃、花粉、果实、动物饲料和生物质。还考虑了加工的植物部分，例如由含有编码本发明蛋白的核酸和/或含有杀虫有效量的所编码的毒素蛋白的植物叶、花、根、种子或块茎产生的木材或油、无活力的磨碎种子或分级种子、面粉或淀粉。

在某些实施方案中，公开了包含重组核酸分子和杀虫有效量的TIC2199毒素蛋白的种子。

在另一个实施方案中，考虑了包含本申请中公开的重组核酸分子的昆虫抑制组合物。昆虫抑制组合物还可包含编码至少一种不同于所述杀虫蛋白的其他杀虫剂的核苷酸序列。在某些实施方案中，至少一种其他杀虫剂选自由昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白组成的组。还考虑了昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种的活性。在一个实施方案中，昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1及其变体、IP3及其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657、DIG-11蛋白、IDP102Aa及其同系物、IDP110Aa及其同系物、TIC868、Cry1Da1_7、BCW003、TIC1100、TIC867、TIC867_23、TIC6757、TIC7641、IDP072Aa、TIC5290、TIC3668、TIC3669、TIC3670、IDP072Aa和IDP103及其同系物、PIP-50和PIP-65及其同系物、PIP-83及其同系物、和Cry1B.34；以及dsRNA介导的基因压制实施方案，其包括靶向压制玉米根虫(Diabrotica)物种基因Dv snf7和Dv ssj1的那些。

还考虑了包含可检测量的本申请中公开的重组核酸分子和毒素蛋白的商品产品。此类商品产品包括通过谷物处理机袋装的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米麦片等，以及对应的大豆、水稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、瓜类和蔬菜商品产品，在适用的情况下，包括果汁、浓缩物、果酱、果冻、橘子酱和含有可检测量的本申请的此类多核苷酸和/或多肽的此类商品产品的其他可食用形式、完整或加工过的棉籽、棉油、皮棉、种子和加工用于饲料或食品的植物部分、纤维、纸张、生物质和燃料产品，诸如衍生自棉油的燃料或衍生自轧棉机废料的颗粒，完整或加工过的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆片、豆麸、豆浆、大豆奶酪、豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的奶油、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。

本申请还考虑了一种产生包含重组核酸分子和杀虫有效量的所编码的TIC2199毒素蛋白的种子的方法。所述方法包括种植至少一种包含本申请公开的重组核酸分子的种子；从种子生长植物；以及从植物收获种子，其中收获的种子包含所提及的重组核酸分子和/或杀虫有效量的所编码的TIC2199毒素蛋白。

在另一个例示性实施方案中，提供了对鳞翅目昆虫侵染具有抗性的植物，其中所述植物的细胞包含本文公开的重组核酸分子。

本申请还公开了用于防治鳞翅目物种害虫和防治植物、特别是作物植物的鳞翅目物种害虫侵染的方法。在一个实施方案中，所述方法包括首先使害虫与杀昆虫有效量的如SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17所示的杀虫蛋白接触；或者使害虫与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述一种或多种杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

本文还提供了一种检测TIC2199毒素蛋白类别的重组核酸分子的存在的方法，其中所述方法包括使核酸样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与包含编码本文提供的杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的植物的基因组DNA杂交，并且在此类杂交条件下不与不包含所述区段的其他同基因(isogenic)植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ ID NO:3、6、9、12、14、16或18或编码杀虫蛋白的序列同源或互补，所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；将样品和探针置于严格杂交条件下；以及检测探针与样品DNA的杂交。在一些实施方案中，检测TIC2199毒素蛋白类别成员的存在的步骤可包括ELISA或蛋白质印迹。

本文还提供了检测来自TIC2199毒素蛋白类别的杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述方法包括使样品与TIC2199毒素蛋白类别免疫反应性抗体或设计用于检测TIC2199蛋白的重组蛋白接触，以及检测抗体与TIC2199毒素蛋白类别蛋白的结合，从而确认样品中所述蛋白的存在。在一些实施方案中，检测步骤包括ELISA或蛋白质印迹。

本申请还考虑了一种用于防治田地中的鳞翅目害虫物种或害虫侵染的方法，其中所述方法包括生长表达杀昆虫有效量的如SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17所示的杀虫蛋白的作物植物；或生长表达杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白的作物植物，所述一种或多种杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及将一种或多种各自携带自限性基因的转基因鳞翅目害虫物种释放到含有编码本发明毒素蛋白的基因的作物的田地中，以用于预防或延迟所述一种或多种鳞翅目害虫物种对毒素蛋白的抗性发生。在一个实施方案中，作物植物可以是单子叶或双子叶。在另一个实施方案中，单子叶作物植物可以是玉米、小麦、高粱、水稻、黑麦或小米。在又另一个实施方案中，双子叶作物植物可以是大豆、棉花或油菜。

序列简述

SEQ ID NO:1是编码从苏云金芽孢杆菌物种EG8639获得的TIC2199杀虫蛋白的核酸序列。

SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1所示的序列编码的TIC2199杀虫蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是编码TIC2199并能够在植物细胞中使用的合成编码序列。

SEQ ID NO:4是TIC2199变体TIC2199_3的氨基酸序列，其中包含分泌肽的N末端44个氨基酸已被去除，并且C末端64个氨基酸也被去除。

SEQ ID NO:5是编码SEQ ID NO:4的TIC2199_3变体的DNA序列。

SEQ ID NO:6是编码SEQ ID NO:4的TIC2199_3变体并能够在植物细胞中使用的合成编码序列。

SEQ ID NO:7是TIC2199变体TIC2199_1的氨基酸序列，其中包含分泌肽的N末端44个氨基酸已被去除。

SEQ ID NO:8是编码SEQ ID NO:7的TIC2199_1变体的DNA序列。

SEQ ID NO:9是编码SEQ ID NO:7的TIC2199_1变体并能够在植物细胞中使用的合成编码序列。

SEQ ID NO:10是TIC2199变体TIC2199_2的氨基酸序列，其中C末端64个氨基酸也被去除。

SEQ ID NO:11是编码SEQ ID NO:10的TIC2199_2变体的DNA序列。

SEQ ID NO:12是编码SEQ ID NO:10的TIC2199_2变体并能够在植物细胞中使用的合成编码序列。

SEQ ID NO:13是变体TIC2199_1变体的氨基酸序列，其起始甲硫氨酸被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽。

SEQ ID NO:14是编码TIC2199_1变体的合成编码序列，其起始甲硫氨酸密码子被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽，并能够在植物细胞中使用。

SEQ ID NO:15是变体TIC2199_2变体的氨基酸序列，其起始甲硫氨酸被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽。

SEQ ID NO:16是编码TIC2199_2变体的合成编码序列，其起始甲硫氨酸密码子被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽，并能够在植物细胞中使用。

SEQ ID NO:17是变体TIC2199_3变体的氨基酸序列，其起始甲硫氨酸被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽。

SEQ ID NO:18是编码TIC2199_3变体的合成编码序列，其起始甲硫氨酸密码子被去除并用于可操作地连接至叶绿体转运肽，并能够在植物细胞中使用。

具体实施方式

农业害虫防治领域中的一个问题可以表征为需要新的毒素蛋白，所述新的毒素蛋白针对目标害虫有效、表现出针对目标害虫物种的光谱毒性、能够在植物中表达而不引起不期望的农艺问题，并提供与目前在植物中商业使用的毒素相比的一种替代的作用方式。

本文公开了以TIC2199为例的新型杀虫蛋白。以杀虫有效量使用所述蛋白可以解决作为本领域问题的昆虫侵染，特别是针对广谱的鳞翅目昆虫害虫，并且更具体地针对小地老虎(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、卷心菜尺蠖虫(Trichoplusiani)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)、绒豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)和西方豆虫(Striacosta albicosta)以及针对半翅目物种牧草盲蝽(Lygus lineolaris)和新热带棕色臭虫(Euschistusheros)。

本申请中提及TIC2199、“TIC2199蛋白”、“TIC2199蛋白毒素”、“TIC2199杀虫蛋白”、“TIC2199相关毒素”、“TIC2199相关毒素”、“TIC2199蛋白毒素类别”、“TIC2199毒素蛋白类别”等，是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含TIC2199(SEQ ID NO:2)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列及其杀虫或昆虫抑制区段或其组合，由其组成，与其基本同源，与其相似或由其衍生，赋予针对鳞翅目害虫的活性，包括表现出杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白，只要这种蛋白与TIC2199的比对导致氨基酸序列同一性为约96％至约100％的任何分数百分比。TIC2199蛋白包括质体靶向和非质体靶向形式的蛋白。

术语“区段”或“片段”在本申请中用于描述比描述TIC2199蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的连续氨基酸或核酸序列。本申请还公开了表现出昆虫抑制活性的区段或片段，只要这种区段或片段与SEQ ID NO:2所示的TIC2199蛋白的对应部分的比对导致所述区段或片段与TIC2199蛋白内的对应氨基酸区段之间的氨基酸序列同一性为约96％至约100％的任何分数百分比。如本文所述的片段可包含TIC2199蛋白的至少50个、至少100个、至少250个、至少400个、至少500个、至少600个或至少800个连续氨基酸残基。例如，SEQ ID NO:2的片段呈现为SEQ ID NO:4。SEQ ID NO:4的氨基酸序列包含TIC2199的结构域I、II和III。根据与其他Cry1I杀虫蛋白的比对，提议的分泌信号肽N末端44个氨基酸已被去除(Ruiz deEscudero等人2006.Molecular and Insecticidal Characterization of aCry1IProtein Toxic to Insects of the Families Noctuidae,Tortricidae,Plutellidae,and Chrysomelidae.Applied and Environmental Microbiology,72(7):4796-4804)，保留了N末端甲硫氨酸残基。此外，SEQ ID NO:4中，预测的胰蛋白酶切割的羧基末端原毒素结构域也已被去除。胰蛋白酶切割位点预期为“DRIEF”序列之后的第一个赖氨酸(K)，所述序列在结构域III末端高度保守，阻断原毒素结构域起始处附近的5(Schnepf等人1998.Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(3):775-806)。SEQ ID NO:4可以例如由SEQ ID NO:5编码以在细菌中表达，或者由SEQ ID NO:6编码以在植物细胞中表达。

此外，SEQ ID NO:2的片段呈现为SEQ ID NO:7。SEQ ID NO:7的氨基酸包含TIC2199的结构域I、II和III。根据与其他Cry1I杀虫蛋白的比对，提议的分泌信号肽N末端44个氨基酸已被去除。SEQ ID NO:7可以例如由SEQ ID NO:8编码以在细菌中表达，或者由SEQ ID NO:9编码以在植物细胞中表达。SEQ ID NO:2的片段呈现为SEQ ID NO:10。SEQ IDNO:10包含TIC2199的结构域I、II和III。SEQ ID NO:10中，预测的胰蛋白酶切割的羧基末端原毒素结构域也被去除。SEQ ID NO:10可以例如由SEQ ID NO:11编码以在细菌中表达，或者由SEQ ID NO:12编码以在植物细胞中表达。SEQ ID NO:2的片段呈现为SEQ ID NO:13。SEQ ID NO:13的氨基酸序列包含TIC2199的结构域I、II和III。根据与其他Cry1I杀虫蛋白的比对，提议的分泌信号肽N末端44个氨基酸已被去除，并缺乏起始甲硫氨酸。SEQ ID NO:13用于将TIC2199_1氨基酸序列可操作地连接至叶绿体转运肽。SEQ ID NO:13由SEQ IDNO:14编码以在植物细胞中表达。SEQ ID NO:2的片段呈现为SEQ ID NO:15。SEQ ID NO:15的氨基酸序列包含TIC2199的结构域I、II和III。SEQ ID NO:15中，预测的胰蛋白酶切割的羧基末端原毒素结构域也已经与起始甲硫氨酸一起被去除，并用于将TIC2199_2氨基酸序列可操作地连接至叶绿体转运肽。SEQ ID NO:15由SEQ ID NO:16编码以在植物细胞中表达。SEQ ID NO:17的氨基酸序列包含TIC2199的结构域I、II和III。根据与其他Cry1I杀虫蛋白的比对，提议的分泌信号肽N末端44个氨基酸已被去除，并且SEQ ID NO:17中，预测的胰蛋白酶切割的羧基末端原毒素结构域也已经与起始甲硫氨酸一起被去除，并用于将TIC2199_3氨基酸序列可操作地连接至叶绿体转运肽。

本申请中提及的术语“活性(active)”或“活性(activity)”、“杀虫活性(pesticidal activity)”或“杀虫(pesticidal)”或“杀昆虫活性(insecticidalactivity)”、“昆虫抑制(insect inhibitory)”、“杀虫有效(pesticidally effective)”或“杀昆虫(insecticidal)”是指含有有效量的TIC2199蛋白的毒性剂(诸如蛋白毒素)在抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或生存力)、压制(压制生长、摄食、繁殖力或生存力)、防治(防治害虫侵染、防治害虫对特定作物的摄食活动)或杀死害虫(导致其发病、死亡或繁殖力降低)方面的功效。这些术语旨在包括向害虫提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，其中害虫暴露于毒性蛋白导致发病、死亡、繁殖力降低或发育迟缓。这些术语还包括由于在植物内或植物上提供杀虫有效量的毒性蛋白而将害虫从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或植物可能生长的特定地理位置排斥。一般来讲，杀虫活性是指毒性蛋白有效抑制生长、发育、生存力、摄食行为、交配行为、繁殖力的能力，或由昆虫摄食引起的不良影响的任何可测量的减少。毒性蛋白可由植物产生或者可以应用于植物或植物所在位置内的环境。术语“生物活性(bioactivity)”、“有效(effective)”、“有效(efficacious)”或其变体也是在本申请中可互换使用的术语，以描述本发明的蛋白对目标昆虫害虫的作用。

当提供在目标害虫的饮食中时，杀虫有效量的毒性剂在所述毒性剂接触害虫时表现出杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或本领域已知的一种或多种化学剂。杀虫或杀昆虫化学剂可以单独使用或彼此组合使用。化学剂包括但不限于靶向目标害虫中待压制的特定基因的dsRNA分子、有机氯化物、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱类和莱恩碱类(ryanoid)。杀虫或杀昆虫蛋白剂包括本申请中提出的蛋白毒素，以及其他蛋白质类毒性剂，包括靶向鳞翅目的那些，以及用于防治其他植物害虫的蛋白毒素，诸如Cry、Vip和Cyt蛋白、假单胞菌昆虫毒性蛋白以及衍生自蕨类物种的昆虫毒素蛋白，其在本领域中可用于防治鞘翅目、半翅目和同翅目物种。

提及害虫，特别是作物植物的害虫，意指作物植物的昆虫害虫，特别是通过TIC2199蛋白毒素类别防治的那些鳞翅目昆虫害虫。然而，提及害虫还可以包括鞘翅目、半翅目(例如，牧草盲蝽(Lygus lineolaris))和新热带棕色臭虫(Euschistus heros)和同翅目植物昆虫害虫，并且当针对这些害虫的毒性剂与TIC2199蛋白或与TIC2199蛋白具有95％至约100％同一性的蛋白共处或一起存在时，可以包括线虫和真菌。短语“一起存在”或“共处”旨在包括目标昆虫害虫已经被TIC2199毒素蛋白以及相对于目标昆虫害虫也以杀虫有效量存在的任何其他毒性剂接触的任何情况。在某些实施方案中，“接触”旨在指代存在于目标害虫的饮食中，并且所述饮食被目标害虫消耗。

鳞翅目昆虫包括但不限于夜蛾科的粘虫、糖蛾、尺蠖和夜蛾，例如，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、黑粘虫(Spodopteracosmioides)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、贝莎粘虫(Mamestra configurata)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、卷心菜尺蠖虫(Trichoplusia ni)、甘蔗螟(Diatraeasaccharalis)、大豆尺蠖(Pseudoplusia includens)、向日葵尺蠖(Rachiplusia nu)、绒豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)、苜蓿绿夜蛾(Hypena scabra)、烟夜蛾(Heliothisvirescens)、颗粒夜蛾(Agrotis subterranea)、粘虫(Pseudaletia unipuncta)、向日葵尺蠖(Rachiplusia nu)、南美豆虫(Helicoverpa gelotopoeon)、西部切根虫(Agrotisorthogonia)；螟蛾科的螟、鞘蛾、结网毛虫、锥虫(coneworm)、卷心菜虫和雕叶虫，例如，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、脐橙螟(Amyelois transitella)、玉米根结网毛虫(Crambus caliginosellus)、草地结网毛虫(Herpetogramma licarsisalis)、向日葵螟(Homoeosoma electellum)、小玉米茎螟(Elasmopalpus lignosellus)；卷蛾科的卷叶虫、芽虫、种虫和果虫，例如，苹果小卷蛾(Cydia pomonella)、葡萄小卷叶蛾(Endopizaviteana)、梨小食心虫(Grapholita molesta)、向日葵芽蛾(Suleima helianthana)；以及许多其他经济上重要的鳞翅目，例如，小菜蛾(Plutella xylostella)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)和舞毒蛾(Lymantria dispar)。鳞翅目的其他昆虫害虫包括例如，棉叶虫(Alabama argillacea)、果树卷叶蛾(Archips argyrospila)、欧洲卷叶蛾(Archips rosana)和其他卷叶蛾属物种(二化螟(Chilo suppressalis)、亚洲水稻螟(Asiatic rice borer)或水稻螟虫(rice stem borer))、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)、玉米根结网毛虫(Crambus caliginosellus),蓝草结网毛虫(Crambusteterrellus)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、鼎点金刚钻(Earias insulana)、翠纹金刚钻(Earias vittella)、美洲棉铃虫(Helicoverpa armigera)、玉米穗虫(Helicoverpa zea，也称为大豆荚虫和棉铃虫)、烟草芽虫(Heliothis virescens)、草地结网毛虫(Herpetogramma licarsisalis)、西方豆虫(Striacosta albicosta)、欧洲葡萄蛾(Lobesia botrana)、柑橘潜叶虫(Phyllocnistiscitrella)、大白蝶(Pieris brassicae)、小白蝶(Pieris rapae，也称为进口卷心菜虫)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura，也称为茶蚕)以及番茄潜叶虫(Tuta absoluta)。

半翅目的昆虫包括但不限于蝽科的臭虫：Chinavia属的绿色臭虫(Chinaviahilaris、Chinavia marginata和Chinavia pensylvanica)、Chlorochroa属的臭虫(Chlorochroa granulose、Chlorochroa kanei、Chlorochroa ligata、Chlorochroalineate、Chlorochroa opuntiae、Chlorochroa persimilis、Chlorochroa rossiana、Chlorochroa sayi、Chlorochroa uhleri、Chlorochroa belfragii、Chlorochroa faceta、Chlorochroa osborni、Chlorochroa saucia和Chlorochroa senilis)、南方绿色臭虫(稻绿蝽(Nezara viridula))、Edessa属的臭虫(Edessa meditabunda、Edessa bifida和Edessa florida)、新热带棕色臭虫(英雄美洲蝽(Euschistus heros))、美洲蝽(Euschistus)属的臭虫(Euschistus acuminatus、Euschistus biformis、斑点美洲蝽(Euschistus conspersus)、Euschistus crenator、Euschistus egglestoni、Euschistusictericus、Euschistus inflatus、Euschistus latimarginatus、Euschistus obscures、Euschistus politus、Euschistus quadrator、褐美洲蝽(Euschistus sevus)、Euschistusstrenuous、三色美洲蝽(Euschistus tristigmus)和斑点美洲蝽(Euschistusvariolarius))、褐翅臭虫(茶翅蝽(Halyomorpha halys))、红肩臭虫(红肩蝽(Thyantaaccerra))、Thyanta属臭虫(Thyanta calceata、Thyanta custator、Thyantapallidovirens、Thyanta perditor、Thyanta maculate和Thyanta pseudocasta)、绿腹臭虫(Dichelops melacanthus)和Dichelops属的其他臭虫(Dichelops avilapiresi、Dichelops bicolor、Dichelops dimidatus、Dichelops furcatus、Dichelopsfurcifrons、Dichelops lobatus、Dichelops miriamae、Dichelops nigrum、Dichelopsperuanus、Dichelops phoenix和Dichelops saltensis)、红带臭虫(盖德拟壁蝽(Piezodorus guildinni))以及伊犁壁蝽(Piezodorus lituratus)；以及龟蝽科的昆虫，诸如筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)、西部牧草盲蝽(Lygus hesperus)和牧草盲蝽(Lyguslineolaris)。

本申请中提到的“分离的DNA分子”或等同的术语或短语旨在意指所述DNA分子是单独存在或与其他组合物组合存在的，但不在其天然环境中。例如，只要在生物体的基因组的DNA中天然存在的核酸元件(诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等)位于生物体的基因组内并且在其天然存在的基因组内的位置处，所述元件就不被认为是“分离的”。然而，只要这些元件中的每一个以及这些元件的子部分不在生物体的基因组内并且不在其天然存在的基因组内的位置处，其在本公开的范围内就是“分离的”。类似地，只要编码杀昆虫蛋白或该蛋白的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列不在编码所述蛋白的的序列天然存在的细菌的DNA中，所述核苷酸序列就是分离的核苷酸序列。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入植物或细菌细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列，将被认为是分离的核苷酸序列，无论其存在于用于转化细胞的质粒或类似结构中、在植物或细菌的基因组中或以可检测的量存在于衍生自植物或细菌的组织、后代、生物样品或商品产品中。

本申请中对术语“自限性基因”的提及是指限制宿主存活从而导致宿主群体减少的基因。这种技术由Oxitech Ltd提供。携带转基因自限性基因的转基因雄性昆虫被释放并与野生雌性昆虫一起繁殖。因此，后代遗传了自限性基因的拷贝。所述自限性基因通过在昆虫细胞中过量产生蛋白，干扰细胞产生发育所需的其他必需蛋白的能力，从而破坏昆虫细胞的正常功能。通过破坏昆虫的正常发育，所述基因阻止昆虫存活到成年。例如，自限性小菜蛾(Plutellidae xylostella)菌株OX4319L由Oxitech Ltd开发并携带雄性选择基因，所述雄性选择基因利用性别决定基因doublesex(dsx)的序列。所述基因表达性别交替剪接，以工程化自限性基因的雌性特异性表达，其阻止雌性后代在幼虫阶段之后存活，并允许产生自限性飞蛾的仅雄性群体。雄性被释放后，与害虫雌性交配，导致下一代雌性后代数量减少，从而局部压制小菜蛾种群。为了促进在小菜蛾生产设施中饲养大量雄性以用于释放，通过在幼虫饲料中添加四环素或合适的类似物来遏制OX4319L菌株中雌性特异性dsx的表达。OX4319L还表达荧光蛋白DsRed以允许有效监测该菌株在田地中的存在(Jin等人，2013.Engineered female-specific lethality for control of pest Lepidoptera.ACSSynthetic Biology,2:160-166)。当该技术应用于含有本发明毒素基因的植物的田地时，可以延迟或防止本发明的毒素基因和蛋白所靶向防治的害虫物种的抗性发生，从而使含有本发明的毒素基因和蛋白的任何植物产品具有更大的持久性。

如本申请中进一步描述的，在从苏云金芽孢杆菌物种EG8639获得的DNA中发现了编码TIC2199(SEQ ID NO:1)的开放阅读框(ORF)。使用微生物宿主细胞衍生的TIC2199蛋白进行的生物测定证明了针对以下物种的活性：鳞翅目物种小地老虎(BCW，Agrotisipsilon)、玉米穗虫(CEW，Helicoverpa zea)、卷心菜尺蠖虫(CLW，Trichoplusia ni)、欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(FAW，Spodoptera frugiperda)、南方粘虫(SAW，Spodoptera eridania)、大豆尺蠖(SBL，Chrysodeixis includens)、西南玉米螟(SWC，Diatraea grandiosella)、甘蔗螟(SCB，Diatraea saccharalis)、绒豆毛虫(VBC，Anticarsia gemmatalis)和西方豆虫(WBC，Striacosta albicosta)以及半翅目物种牧草盲蝽(TPB，Lygus lineolaris)和新热带棕色臭虫(NBSB，Euschistus heros)。

产生了设计用于植物细胞中的合成编码序列以表达TIC2199(SEQ ID NO:3)、TIC2199_1(SEQ ID NO:9和14)、TIC2199_2(SEQ ID NO:12和16)和TIC2199_3(SEQ ID NO:6和18)，特别是当可操作地/功能上连接至植物功能启动子和在植物中发挥作用以介导所述蛋白的表达的期望水平和空间特性的其他元件时。表达TIC2199、TIC2199_1、TIC2199_2和TIC2199_3的玉米植物表现出针对鳞翅目物种欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)和西南玉米螟(SWC，Diatraea grandiosella)的有效活性。在巴西，表达TIC2199的玉米植物针对SCB有效，并且针对LCSB高度有效。

为了在植物细胞中表达，TIC2199(SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17)蛋白可以被表达并定位在胞质溶胶(cytosol)中或靶向于植物细胞的各种细胞器。例如，将一种蛋白靶向叶绿体可能导致转基因植物中所表达的蛋白的水平增加，同时如果所表达的蛋白毒素以任何预料之外的方式发生细胞生物学反应，则可以防止出现异常表型(off-phenotype)。靶向还可以导致转基因事件中的害虫抗性功效的增加。目标肽或转运肽是一条短肽链(长度为3-70个氨基酸)，其引导蛋白转运至细胞中的特定区域，包括细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和质膜。蛋白被转运后，一些目标肽被信号肽酶从蛋白上切割下来。为了靶向叶绿体，蛋白含有长度约为40-50个氨基酸的转运肽。对于使用叶绿体转运肽的描述，参见美国专利号5,188,642和美国专利号5,728,925。许多叶绿体定位蛋白作为前体从核基因表达，并通过叶绿体转运肽(CTP)靶向叶绿体。此类分离的CTP的实例包括但不限于与以下相关的那些：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、光捕获复合物蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇式丙酮酸莽草酸磷酸合酶(EPSPS)，和美国专利号7,193,133中描述的转运肽。已经在体内和体外证明，通过使用与异源CTP的蛋白融合体，可以将非叶绿体蛋白靶向叶绿体，并且CTP足以将蛋白靶向叶绿体。并入合适的叶绿体转运肽，诸如拟南芥EPSPS CTP(CTP2)(参见，Klee等人，Mol.Gen.Genet.210:437-442,1987)或矮牵牛EPSPS CTP(CTP4)(参见，della-Cioppa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6873-6877,1986)，已被证明将异源EPSPS蛋白序列靶向转基因植物中的叶绿体(参见，美国专利号5,627,061；5,633,435；和5,312,910；和EP 0218571；EP 189707；EP 508909；和EP 924299)。为了将TIC2199毒素蛋白靶向叶绿体，将编码叶绿体转运肽的序列置于5ˊ位置，与设计用于在植物细胞中表达的编码TIC2199毒素蛋白的合成编码序列可操作地连接并同框。

考虑到可使用TIC2199的氨基酸序列来产生与TIC2199相关的额外毒素蛋白序列，以产生具有新性质的新蛋白。可以对TIC2199毒素蛋白进行比对，以将氨基酸序列水平上的差异组合成新的氨基酸序列变体，并对编码变体的重组核酸序列进行适当改变。

考虑到可以通过使用本领域已知的各种基因编辑方法在植物原位中工程化TIC2199蛋白毒素类别的改进变体。用于基因组编辑的此类技术包括但不限于ZFN(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)和CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)系统。这些基因组编辑方法可用于将植物细胞内转化的毒素蛋白编码序列改变为不同的毒素编码序列。具体而言，通过这些方法，可以改变毒素编码序列内的一个或多个密码子以工程化新的蛋白氨基酸序列。或者，可以替代或删除编码序列内的片段，或者将额外的DNA片段插入到编码序列中，以工程化新的毒素编码序列。新的编码序列可以编码具有新性质(诸如针对昆虫害虫的增加的活性或谱)的毒素蛋白以及提供针对一种或多种昆虫害虫物种的活性，其中针对原始昆虫毒素蛋白的抗性已经产生或可能产生。可以通过本领域已知的方法使用包含基因编辑的毒素编码序列的植物细胞来产生表达新毒素蛋白的完整植物。

还考虑到TIC2199或其蛋白变体的片段可以是截短形式，其中从蛋白的N末端、C末端、中间或其组合删除一个或多个氨基酸，其中所述片段和变体保留昆虫抑制活性。这些片段可以是TIC2199的天然存在的或合成的变体或衍生的蛋白变体，但应当至少保留TIC2199的昆虫抑制活性。

可以使用本领域已知的各种基于计算机的算法来鉴定与TIC2199蛋白类似的蛋白并相互比较。本申请中报告的氨基酸序列同一性是使用这些默认参数进行的Clustal W比对的结果：权重矩阵：blosum，空位开放罚分：10.0，空位延伸罚分：0.05，亲水空位：开，亲水残基：GPSNDQERK，残基特异性空位罚分：开(Thompson等人(1994)Nucleic AcidsResearch,22:4673-4680)。氨基酸同一性百分比进一步通过100％乘以(主题蛋白的氨基酸身份/长度)的乘积来计算。其他比对算法在本领域中也是可用的，并且提供与使用ClustalW比对获得的结果类似的结果并在本文中被考虑。

预期表现出针对鳞翅目昆虫物种的昆虫抑制活性的蛋白在询问中使用(例如，Clustal W比对中)使用时与TIC2199相关，并且如SEQ ID NO:2或4所示的本发明的蛋白在此类比对中鉴定为命中，其中询问蛋白表现出沿着询问蛋白的长度至少96％至约100％的氨基酸同一性，其为约96％、97％、98％、99％、100％或此范围内的任何分数百分比。

除了同一性百分比之外，TIC2199和TIC2199的变体还可以通过一级结构(保守氨基酸基序)、长度和其他特征相关。表1报告了TIC2199和TIC2199蛋白毒素变体的特征。

表1.TIC2199毒素蛋白的所选特征。

如本申请的实施例中进一步描述的，编码TIC2199和TIC2199变体的合成核酸分子序列被设计用于在植物中使用，由SEQ ID NO:3、6、9、12、14、16和18编码。鉴于遗传密码的冗余，产生任何数量的用于编码毒素蛋白的其他序列都在本领域技术范围内，然而，应当理解，为了在植物原位中表达而产生的序列应避免本领域已知的、阻碍或限制编码序列的高效表达的问题，特别是如美国专利5,500,365中所述。

可以根据本领域已知的转化方法和技术构建含有重组核酸序列分子的表达盒和载体并将其引入到植物中，特别是诸如玉米、大豆或棉花植物细胞中。例如，农杆菌介导的转化描述于美国专利申请公开2009/0138985A1(大豆)、2008/0280361A1(大豆)、2009/0142837A1(玉米)、2008/0282432(棉花)、2008/0256667(棉花)、2003/0110531(小麦)、2001/0042257A1(甜菜)、美国专利号5,750,871(油菜)、7,026,528(小麦)和6,365,807(水稻)以及Arencibia等人(1998)Transgenic Res.7:213-222(甘蔗)，所有这些均通过引用整体并入本文。转化的细胞可以再生为表达TIC2199的转化的植物，并且通过使用从转化的植物获得的植物叶盘在鳞翅目害虫幼虫存在下执行的生物测定来证明杀虫活性。植物可以通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术而衍生自植物细胞。用于转化植物的方法是本领域已知的。

作为传统转化方法的替代，可将DNA序列(诸如转基因、一个或多个表达盒等)经由定点整合而插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的一个或多个重组DNA构建体和一个或多个分子可包含供体模板序列，所述供体模板序列包含至少一种转基因、表达盒或其他DNA序列，以用于插入到植物或植物细胞的基因组中。这种用于定点整合的供体模板还可包括侧接插入序列(即，待插入到植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的一个或多个重组DNA构建体还可包含一个或多个表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或任何一个或多个相关蛋白以进行定点整合。这一个或多个核酸酶表达盒可以与供体模板存在于同一分子或载体中(顺式)，或存在于单独的分子或载体中(反式)。用于定点整合的若干种方法是本领域已知的，其涉及切割基因组DNA以在期望的基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或切口的不同的蛋白(或蛋白和/或指导RNA的复合物)。简而言之，如本领域中所理解的，在修复由核酸酶引入的DSB或切口的过程期间，供体模板DNA可以在DSB或切口的位点处被整合到基因组中。供体模板中的一个或多个同源臂的存在可促进在通过同源重组的修复过程期间采用插入序列并将其靶向到植物基因组中，尽管插入事件可通过非同源末端连接(NHEJ)发生。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化的或天然的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cas12a)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如，Cas9或Cas12a)的方法，所述一个或多个重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA以将核酸酶引导至植物基因组内的期望位点的序列。

编码细菌和植物表达的TIC2199蛋白的重组核酸分子组合物可以用重组DNA构建体表达，其中具有编码所述蛋白的ORF的多核苷酸分子可操作地连接至遗传表达元件，诸如启动子和在构建体预期的系统中表达所需的任何其他调控元件。非限制性实例包括可操作地连接至TIC2199蛋白编码序列以用于在植物中表达所述蛋白的植物功能启动子或可操作地连接至TIC2199蛋白编码序列以用于在Bt细菌或其他芽孢杆菌属物种中表达所述蛋白的Bt功能启动子。其他元件可以可操作地连接至TIC2199蛋白编码序列，包括但不限于增强子、内含子、非翻译前导序列、编码的蛋白固定标签(HIS-标签)、易位肽(即，质体转运肽、信号肽)、翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和RNAi靶位点。本文提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于与多核苷酸(诸如SEQ ID NO:1、3、5、6、8、9、11、12、14、16或18)可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸编码TIC2199或TIC2199的截短变体或具有如SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17所示的氨基酸序列的蛋白。异源启动子还可以可操作地连接至编码质体靶向的TIC2199的合成DNA编码序列。编码本文公开的蛋白的重组核酸分子的密码子可以被同义密码子替换(本领域中称为沉默替换)。

包含TIC2199蛋白编码序列的重组DNA构建体还可以包含编码一种或多种昆虫抑制剂的DNA区域，所述DNA区域可被配置为与编码TIC2199蛋白、昆虫抑制性dsRNA分子或辅助蛋白的DNA序列同时表达或共表达。辅助蛋白包括但不限于辅因子、酶、结合配偶体或其他有助于昆虫抑制剂有效性的剂，例如通过帮助其表达、影响其在植物中的稳定性、优化低聚反应的自由能、增强其毒性以及增加其活性谱。辅助蛋白可促进例如一种或多种昆虫抑制剂的摄取，或增强毒性剂的毒性作用。

可以组装重组DNA构建体，使得所有蛋白或dsRNA分子从一个启动子表达，或者每种蛋白或dsRNA分子处于单独的启动子控制之下，或其某种组合。本发明的蛋白可以由多基因表达系统表达，其中TIC2199由还含有其他开放阅读框和启动子的共同核苷酸区段表达，这取决于所选择的表达系统的类型。例如，细菌多基因表达系统可以利用单个启动子来驱动从单个操纵子内的多重连接/串联开放阅读框的表达(即，多顺反子表达)。在另一个实例中，植物多基因表达系统可以利用多重未连接或连接的表达盒，每个表达盒表达不同的蛋白或其他剂，诸如一种或多种dsRNA分子。

包含TIC2199蛋白编码序列的重组多核苷酸或重组DNA构建体可以通过载体递送至宿主细胞，所述载体例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒体、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体。此类载体可用于实现TIC2199蛋白编码序列在宿主细胞中的稳定或瞬时表达，或所编码的多肽的随后表达。包含TIC2199蛋白编码序列并且被引入到宿主细胞中的外源重组多核苷酸或重组DNA构建体在本申请中被称为“转基因”。

本文提供了转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分，其含有表达TIC2199的重组多核苷酸或相关家族毒素蛋白编码序列。术语“细菌细胞”或“细菌”可以包括但不限于农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、短芽孢杆菌、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属或根瘤菌属细胞。术语“植物细胞”或“植物”可以包括但不限于双子叶植物或单子叶植物。术语“植物细胞”或“植物”还可以包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔属植物(例如，油菜)、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、圆橙南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、玉米(corn)(即玉米(maize))诸如甜玉米或饲料玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶叶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了从转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物部分。在某些实施方案中，可以通过切割、折断、研磨或以其他方式将部分与植物分离，从转基因种子获得转基因植物。在某些实施方案中，植物部分可以是种子、棉铃、叶、花、茎、根或其任何部分，或转基因植物部分的不可再生部分。如本文中所使用的，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能被诱导以形成完整植物的部分，或不能被诱导以形成能够进行有性和/或无性繁殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分是转基因种子、棉铃、叶、花、茎或根的一部分。

提供了制备包含昆虫鳞翅目抑制或半翅目抑制量的TIC2199蛋白的转基因植物的方法。此类植物可以通过将编码本申请中提供的任何蛋白的重组多核苷酸引入植物细胞中，以及选择衍生自所述植物细胞的表达昆虫鳞翅目抑制量的蛋白的植物来制备。植物可以通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术而衍生自植物细胞。用于转化植物的方法是本领域已知的。

本文还公开了加工的植物产品，其中所述加工的产品包含可检测量的TIC2199、其昆虫抑制区段或片段、或其任何区别性部分。在某些实施方案中，加工的产品选自由以下组成的组：植物部分、植物生物质、油、粗粉、糖、动物饲料、面粉、薄片、麸皮、皮棉、外壳、加工种子和种子。在某些实施方案中，加工的产品是不可再生的。植物产品可以包括衍生自转基因植物或转基因植物部分的商品或其他商业产品，其中可以通过检测编码或包含TIC2199的区别性部分的核苷酸区段或表达的RNA或蛋白，通过商业追踪商品或其他产品。

表达TIC2199蛋白的植物可以通过用表达其他毒素蛋白和/或表达其他转基因性状(诸如除草剂耐受性基因、赋予产量或胁迫耐受性性状的基因等)的转基因事件育种而杂交，或者此类性状可以组合在单个堆叠载体中，使得所有性状都是链接的。

如实施例中进一步描述的，TIC2199蛋白编码序列和与TIC2199具有显著同一性百分比的序列可以使用本领域普通技术人员已知的方法来鉴定，诸如聚合酶链反应(PCR)、热扩增和杂交。例如，蛋白TIC2199可用于产生与相关蛋白特异性结合的抗体，并可用于筛选和寻找密切相关的其他蛋白成员。

此外，编码TIC2199毒素蛋白的核苷酸序列可用作探针和引物，用于使用热循环或等温扩增和杂交方法进行筛选以鉴定所述类别的其他成员。例如，衍生自SEQ ID NO:3、6、9或12所示的序列的寡核苷酸可用于确定衍生自商品产品的脱氧核糖核酸样品中是否存在TIC2199转基因。鉴于采用寡核苷酸的某些核酸检测方法的敏感性，预期衍生自SEQ ID NO:3所示的序列的寡核苷酸可用于检测衍生自混合来源的商品产品中的TIC2199转基因，其中该商品产品的仅一小部分衍生自含有任何转基因的转基因植物。进一步认识到，此类寡核苷酸可用于在SEQ ID NO:1、3、5、6、8、9、11、12、14、16和18中的每一个中引入核苷酸序列变异。此类“诱变”寡核苷酸可用于鉴定在转基因植物宿主细胞中表现出一系列昆虫抑制活性或不同表达的TIC2199氨基酸序列变体。

核苷酸序列同系物，例如在严格杂交条件下由与本申请公开的每个或任何序列杂交的核苷酸序列编码的杀昆虫蛋白，也是本发明的实施方案。本发明还提供了一种用于检测与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列的方法，其中第一核苷酸序列(或其反向互补序列)编码杀虫蛋白或其杀虫片段并且与第二核苷酸序列杂交。在这种情况下，第二核苷酸序列可以是在严格杂交条件下如SEQ ID NO:1、3、5、6、8、9、11、12、14、16或18所示的任何核苷酸序列。核苷酸编码序列在适当的杂交条件(诸如严格杂交条件)下彼此杂交，并且由这些核苷酸序列编码的蛋白与针对任何一种其他蛋白产生的抗血清交叉反应。如本文所定义的严格杂交条件至少包括在42℃下杂交，然后用2X SSC、0.1％ SDS在室温下洗涤两次，每次五分钟，然后在65℃下在0.5X SSC、0.1％ SDS中洗涤两次，每次三十分钟。甚至更高温度下的洗涤构成甚至更严格的条件，例如，68℃的杂交条件，然后在68℃下、在含有0.1％ SDS的2xSSC中洗涤。

本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的冗余，许多其他序列能够编码此类相关蛋白，并且那些序列，就它们在芽孢杆菌菌株或植物细胞中表达杀虫蛋白的功能而言，是本发明的实施方案，当然认识到许多这样的冗余编码序列在这些条件下不与编码TIC2199变体的天然芽孢杆菌序列杂交。本申请考虑使用这些以及本领域普通技术人员已知的其他鉴定方法来鉴定TIC2199变体蛋白编码序列以及与TIC2199变体蛋白编码序列具有显著同一性百分比的序列。

本公开还考虑使用本领域已知的分子方法来工程化和克隆商业上有用的蛋白，其包括来自杀虫蛋白的蛋白的嵌合体；例如，可以从TIC2199蛋白的区段组装嵌合体以得到另外的有用的实施方案，其包括TIC2199蛋白的区段与不同于TIC2199蛋白和相关蛋白的不同蛋白的区段的组装。TIC2199蛋白可以相互比对并且与其他芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属或其他杀虫蛋白(无论这些蛋白在系统发育上是否密切或遥远相关)进行比对，并且可以鉴定每种这样的蛋白的区段，其可用于所比对的蛋白之间的替换，从而导致嵌合蛋白的构建。可以对此类嵌合蛋白进行害虫生物测定分析，并且表征与嵌合体中的每个这种区段所衍生自的亲本蛋白相比，是否存在增加的生物活性或扩大的目标害虫谱。通过将结构域或区段与其他蛋白交换或通过使用本领域已知的定向进化方法，可以进一步工程化多肽的杀虫活性以获得针对特定害虫或更广谱的害虫的活性。

本申请公开了用TIC2199蛋白防治昆虫、特别是作物植物的鳞翅目侵染的方法。此类方法可以包括生长包含昆虫或鳞翅目抑制量的TIC2199毒素蛋白的植物。在某些实施方案中，此类方法还可包括以下中的任何一项或多项：(i)将包含或编码TIC2199毒素蛋白的任何组合物应用于植物或产生植物的种子；和(ii)用编码TIC2199毒素蛋白的多核苷酸转化植物或产生植物的植物细胞。一般来讲，考虑到TIC2199毒素蛋白可以提供在组合物中、提供在微生物中、或提供在转基因植物中，以赋予针对鳞翅目昆虫的昆虫抑制活性。

在某些实施方案中，TIC2199毒素蛋白的重组核酸分子是通过培养重组芽孢杆菌或任何其他重组细菌细胞而制备的昆虫抑制组合物的杀昆虫活性成分，所述细胞经转化以在适合表达TIC2199毒素蛋白的条件下表达TIC2199毒素蛋白。这种组合物可以通过表达/产生所述重组多肽的此类重组细胞的培养物的干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩来制备。这种过程可以产生芽孢杆菌或其他昆虫病原性细菌细胞提取物、细胞悬液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞沉淀。通过获得如此产生的重组多肽，包含重组多肽的组合物可以包含细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可以配制用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制喷雾产品或作为饮食生物测定中的昆虫抑制制剂。

在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含TIC2199蛋白的昆虫抑制组合物还可包含至少一种额外的多肽，其表现出针对相同鳞翅目昆虫物种的昆虫抑制活性，但其不同于TIC2199毒素蛋白。用于这种组合物的可能的额外多肽包括昆虫抑制蛋白和昆虫抑制dsRNA分子。Baum等人(美国专利公开2006/0021087A1)描述了使用此类核糖核苷酸序列来防治昆虫害虫的一个实例。这种用于防治鳞翅目害虫的额外多肽可以选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，诸如但不限于Cry1A(美国专利号5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公开号10/525,318)、Cry1C(美国专利号6,033,874)、Cry1D、Cry1Da及其变体、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合体(美国专利号7,070,982；6,962,705；和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry1型嵌合体，诸如但不限于TIC836、TIC860、TIC867、TIC869和TIC1100(国际申请公开WO2016/061391(A2))、TIC2160(国际申请公开WO2016/061392(A2))、Cry2A、Cry2Ab(美国专利号7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045(美国专利公开2013-0117884A1)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美国专利公开2013-0310543A1)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公开2013-0104259A1)、AXMI-134(美国专利公开2013-0167264A1)、AXMI-150(美国专利公开2010-0160231A1)、AXMI-184(美国专利公开2010-0004176A1)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209(美国专利公开2011-0030096A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公开2014-0245491A1)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公开2014-0196175A1)、AXMI-238(美国专利公开2014-0033363A1)、AXMI-270(美国专利公开2014-0223598A1)、AXMI-345(美国专利公开2014-0373195A1)、AXMI-335(国际申请公开WO2013/134523(A2))、DIG-3(美国专利公开2013-0219570A1)、DIG-5(美国专利公开2010-0317569A1)、DIG-11(美国专利公开2010-0319093A1)、AfIP-1A及其衍生物(美国专利公开2014-0033361A1)、AfIP-1B及其衍生物(美国专利公开2014-0033361A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公开2014-0007292A1)、PSEEN3174(美国专利公开2014-0007292A1)、AECFG-592740(美国专利公开2014-0007292A1)、Pput_1063(美国专利公开2014-0007292A1)、DIG-657(国际申请公开WO2015/195594A2)、Pput_1064(美国专利公开2014-0007292A1)、GS-135及其衍生物(美国专利公开2012-0233726A1)、GS153及其衍生物(美国专利公开2012-0192310A1)、GS154及其衍生物(美国专利公开2012-0192310A1)、GS155及其衍生物(美国专利公开2012-0192310A1)、如描述于美国专利公开2012-0167259A1的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利公开2012-0047606A1的SEQID NO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利公开2011-0154536A1的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利公开2011-0112013A1的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利公开2010-0192256A1的SEQ ID NO:2或4和4及其衍生物、如描述于美国专利公开2010-0077507A1的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利公开2010-0077508A1的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利公开2009-0313721A1的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利公开2010-0269221A1的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利号7,772,465(B2)的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于WO2014/008054A2的CF161_0085及其衍生物、如描述于美国专利公开US2008-0172762A1、US2011-0055968A1和US2012-0117690A1的鳞翅目毒素蛋白和及其衍生物；如描述于US7510878(B2)的SEQ IDNO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利号7812129(B1)的SEQ ID NO:2或4及其衍生物；等。

在其他实施方案中，此类组合物/制剂还可包含至少一种额外的多肽，其对不被本发明的其他昆虫抑制蛋白抑制的昆虫表现出昆虫抑制活性，以扩大所获得的昆虫抑制谱。例如，为了防治半翅目害虫，本发明的昆虫抑制蛋白的组合可以与半翅目活性蛋白一起使用，诸如TIC1415(美国专利公开2013-0097735A1)、TIC807(美国专利号8609936)、TIC834(美国专利公开2013-0269060A1)、AXMI-036(美国专利公开2010-0137216A1)和AXMI-171(美国专利公开2013-0055469A1)。此外，用于防治鞘翅目害虫的多肽可以选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，诸如但不限于Cry3Bb(美国专利号6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、AXMI134(美国专利公开2013-0167264A1)AXMI-184(美国专利公开2010-0004176A1)、AXMI-205(美国专利公开2014-0298538A1)、AXMI-207(美国专利公开2013-0303440A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公开20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z(美国专利公开2014-0196175A1)、AXMI-279(美国专利公开2014-0223599A1)、AXMI-R1及其变体(美国专利公开2010-0197592A1、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG-10(美国专利公开2010-0319092A1)、eHIPs(美国专利申请公开号2010/0017914)、IP3及其变体(美国专利公开2012-0210462A1)以及-Hexatoxin-Hv1a(美国专利申请公开US2014-0366227A1)。

可以与TIC2199类别的昆虫抑制蛋白组合的用于防治鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫害虫的额外多肽，可见于Neil Crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名网站(万维网网址：btnomenclature.info)。广泛来讲，考虑到本领域普通技术人员已知的任何昆虫抑制蛋白都可以与TIC2199家族的蛋白在植物原位中(通过育种或分子堆积而组合)或在组合物或制剂中作为生物农药或生物农药的组合而组合使用。

本领域已经记载了昆虫对某些杀虫剂产生抗性的可能性。一种昆虫抗性管理策略是采用表达两种通过不同作用方式发挥作用的不同昆虫抑制剂的转基因作物。因此，对任一种昆虫抑制剂具有抗性的任何昆虫都可以通过另一种昆虫抑制剂来防治。另一种昆虫抗性管理策略采用的是使用未针对目标鳞翅目害虫物种进行保护的植物从而为此类未受保护的植物提供庇护。美国专利号6,551,962中描述了一个具体实例，所述专利通过引用整体并入。

与种子处理、喷雾制剂、滴加制剂或擦拭制剂中的蛋白一起使用的其他实施方案(诸如局部应用的杀虫化学品，其被设计用于防治也被本文公开的蛋白防治的害虫)可以直接应用至土壤(土壤浇灌)，应用至表达本文公开的蛋白的生长植物，或配制为应用至含有编码一种或多种所公开蛋白的一种或多种转基因的种子。用于种子处理的此类制剂可以与本领域已知的各种粘着剂和增粘剂一起应用。此类制剂可以含有与所公开的蛋白在作用方式上具有协同性的杀虫剂，使得制剂杀虫剂通过不同的作用方式发挥作用，以防治可以由所公开的蛋白防治的相同或相似的害虫，或者此类杀虫剂用来防治更广泛宿主范围内的害虫或TIC2199杀虫蛋白无法有效防治的植物害虫物种。

上述组合物/制剂还可以包含农业上可接受的载体，诸如诱饵、粉末、粉剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳液、胶体悬浮液、水溶液、芽孢杆菌孢子/晶体制剂、种子处理剂、经转化为表达一种或多种所述蛋白的重组植物细胞/植物组织/种子/植物、或经转化为表达一种或多种所述蛋白的细菌。根据重组多肽固有的昆虫抑制或杀昆虫抑制水平以及应用于植物或饮食测定的制剂水平，组合物/制剂可以包含按重量计不同量的重组多肽，例如，按重量计0.0001％至0.001％至0.01％至1％至99％的重组多肽。

鉴于前述内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的具体方面中做出改变。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制。应当理解，本文引用的每篇参考文献的全部公开内容均并入本申请的公开内容内。

实施例

实施例1

TIC2199的发现、克隆和表达

通过对苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株EG8639的基因组进行序列分析，鉴定了TIC2199杀虫蛋白。Bt菌株EG8639最初被鉴定为含有Bt或Bt样细菌菌株的孢子形成晶体和质粒。从EG8639中分离DNA并进行测序。然后对组装的序列进行生物信息分析。通过内毒素结构域命中的pfam分析以及与GenBank登录号ACD75515的已知Cry1Ib3毒素的同一性，鉴定TIC2199蛋白。全长TIC2199蛋白氨基酸序列与GenBank登录号ACD75515的CryIb3蛋白的氨基酸序列表现出95.13％的同一性。

聚合酶链反应(PCR)引物设计用于从分离自Bt菌株EG8639的总基因组DNA来扩增TIC2199编码区的全长拷贝。使用本领域已知的方法将PCR扩增子克隆到两种质粒构建体中：一种克隆到与Ec可表达启动子和用于蛋白纯化的组氨酸标签可操作地连接的大肠杆菌(Ec)表达载体中；并且另一种克隆到与Bt可表达启动子可操作地连接的Bt表达载体中。衍生自Ec和Bt两者的TIC2199制剂用于生物测定。

实施例2

TIC2199在昆虫生物测定中表现出鳞翅目活性

使用实施例1中描述的载体在重组Ec和Bt中表达杀虫蛋白TIC2199，并且测定在这些系统中表达的所得蛋白对鳞翅目、鞘翅目和半翅目的不同物种的毒性。

测定TIC2199对以下的毒性：鳞翅目昆虫物种小地老虎(BCW，Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(CEW，Helicoverpa zea，也称为大豆荚虫)、卷心菜尺蠖虫(CLW，Trichoplusiani)、欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)草地贪夜蛾(FAW，Spodoptera frugiperda)南方粘虫(SAW，Spodoptera eridania)、大豆尺蠖(SBL，Chrysodeixis includens)、甘蔗螟(SCB，Diatraea saccharalis)、西南玉米螟(SWC，Diatraea grandiosella)和绒豆毛虫(VBC，Anticarsia gemmatalis)；鞘翅目物种西方玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera)和南方玉米根虫(SCR，Diabrotica undecimpunctata howardii)；半翅目物种牧草盲蝽(TPB，Lygus lineolaris)、西方牧草盲蝽(Lygus hesperus)和新热带棕色臭虫(NBSB，Euschistus heros)。生物测定结果呈现在下表2中，其中“+”表示活性，并且“-”表示无活性。

表2.TIC2199针对鳞翅目、鞘翅目和半翅目昆虫物种的活性。

从表2中呈现的数据可以看出，TIC2199表现出针对鳞翅目物种BCW、CLW、ECB、FAW、SAW、SBL、SCB、SWC、VBC和WBC以及半翅目物种TPB和NBSB的活性。

实施例3

设计用于植物中表达的TIC2199人工编码序列。

编码TIC2199和TIC2199的截短物的人工编码序列SEQ ID NO:3、6、9、12、14、16和18被设计用于在植物细胞中表达。根据美国专利5,500,365中一般描述的方法合成人工(或者称为合成)序列，以避免某些有害问题序列，诸如富含ATTTA和A/T的植物多腺苷酸化序列，同时保留天然芽孢杆菌蛋白的氨基酸序列。

使用本领域已知的技术，将编码TIC2199、TIC2199_1、TIC2199_2和TIC2199_3的人工序列克隆到植物转化载体中，位于植物启动子的下游并与其功能性地连接，从而当在植物细胞中时驱动编码序列的表达。用于转化玉米植物的所得转化载体中的五种包含用于表达TIC2199杀虫蛋白的第一转基因盒，其包含组成型启动子，可操作地连接至前导序列的5′，可操作地连接至内含子的5′，可操作地连接至编码TIC2199的人工编码序列的5′，进而可操作地连接至3'UTR的5′；以及第二转基因盒，其用于使用草甘膦选择来选择转化的植物细胞。九种植物转化载体还含有叶绿体转运肽(CTP)，其被克隆为可操作地连接至TIC2199编码序列的5′并与其同框，以指导叶绿体中的蛋白积累。包含叶绿体转运肽的九种植物转化载体中的六种包含编码序列SEQ ID NO:3、6、9或12。包含叶绿体转运肽的九种植物转化载体中的三种包含编码序列SEQ ID NO:14、16或18。

实施例4

当在稳定转化的玉米植物中表达时

TIC2199表现出鳞翅目活性

使用本领域已知的方法来克隆二元植物转化载体，其包含设计用于表达TIC2199和TIC2199截短变体杀虫蛋白的转基因盒。所得载体用于稳定转化玉米植物。从转化体收获组织并用于针对各种鳞翅目昆虫物种的昆虫生物测定。

使用农杆菌介导的转化方法，使用如实施例3中所述的6种二元转化载体来转化玉米植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞来形成植物。类似于美国专利号8,344,207中描述的那些，使用植物叶盘进行生物测定。将单个刚孵化的小于一天的新生幼虫放置在每个叶盘样品上并允许其进食大约四天。使用未转化的玉米植物来获得用作阴性对照的组织。针对小地老虎(BCW，Agrotis ipsilon)、欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(FAW，Spodoptera frugiperda)和西南玉米螟(SWC，Diatraea grandiosella)对来自每个二元载体的多重转化R₀单拷贝插入事件进行了评估。根据生物测定中的叶片损伤的百分比，为每个事件分配范围为0至3的功效评级分数，0表示无功效，并且3表示高度有效。

根据功效评级分数，TIC2199、TIC2199_1、TIC2199_2和TIC2199_3在具有或不具有CTP的情况下在针对ECB和SWC的转化R₀单拷贝事件中表现出3的功效评级分数，并且针对这两种昆虫害虫物种高度有效。

将衍生自表达TIC2199的3种转化载体的所选R₀植物与未转化的野生型优良品种植物杂交以产生杂交种子。使包含TIC2199的杂合F₁种子生长并且如上所述针对小弟老虎(BCW，Agrotis ipsilon)、欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)和西南玉米螟(SWC，Diatraea grandiosella)进行测定。根据功效评级分数，表达TIC2199的稳定转化的杂合F₁玉米植物在具有或不具有CTP的情况下针对ECB和SWC高度有效。

使用类似于上述那些的叶盘测定，针对甘蔗螟(SCB，Diatraea saccharalis)和小玉米茎螟(LCSB，Elasmopalpus lignosellus)测定表达TIC2199的植物。TIC2199针对SCB有效，并且针对LCSB高度有效。

实施例5

TIC2199在稳定转化的大豆植物中针对鳞翅目昆虫害虫的活性测定

使用本领域已知的方法来克隆二元植物转化载体，其包含设计用于表达TIC2199杀虫蛋白的转基因盒。所得载体用于转化稳定转化的大豆植物。从转化体收获组织并用于针对各种鳞翅目昆虫物种的昆虫生物测定。

使用本领域已知的技术将编码TIC2199和TIC2199截短变体的人工编码序列克隆到植物转化载体构建体中。所得转化载体构建体包含用于表达TIC2199杀虫蛋白的第一转基因盒，其包含植物可表达启动子，可操作地连接至前导序列的5ˊ，任选地可操作地连接至内含子的5'，可操作地连接至编码TIC2199的人工编码序列的5'，进而可操作地连接至3'UTR的5'；以及第二转基因盒，其用于使用大观霉素选择来选择转化的植物细胞。叶绿体转运肽(CTP)可以任选地克隆至人工TIC2199编码序列的5'并与其同框。

使用农杆菌介导的转化方法转化大豆植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞来形成植物。类似于美国专利号8,344,207中描述的那些，使用植物叶盘进行生物测定。将单个刚孵化的小于一天的新生幼虫放置在每个叶盘样品上并允许其进食大约四天。使用未转化的玉米植物来获得用作阴性对照的组织。针对以下鳞翅目昆虫物种来评估来自每个二元载体的多重转化R₀单拷贝插入事件，诸如但不限于小地老虎(BAW，Spodopteracosmioides)、南方粘虫(SAW，Spodoptera eridania)、大豆尺蠖(SBL，Chrysodeixisincludens)、大豆荚虫(SPW，Helicoverpa zea)、向日葵尺蠖(SFL，Rachiplusia nu)和绒豆毛虫(VBC，Anticarsia gemmatalis)。根据每个事件的生物测定中的叶片损伤百分比以及共享最低损伤百分比范围的事件百分比(外显率)，为每个事件分配范围从0至3的功效评级分数，如表3所示。

表3.功效评级分数。

功效分数	叶片损伤百分比	外显率
			0	>50％	>80％
1	<50％	>20％
			2	<30％	>20％
3	<10％	>50％

实施例6

TIC2199在稳定转化的大豆植物中

针对半翅目昆虫害虫的活性测定

使用本领域已知的技术将编码TIC2199的人工编码序列克隆到植物转化载体构建体中。所得转化载体构建体与上文实施例5中描述的那些相似。叶绿体转运肽(CTP)可以任选地克隆至人工TIC2199编码序列的5'并与其同框。

使用农杆菌介导的转化方法转化大豆植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞来形成植物。使用多种技术执行针对半翅目害虫的活性测定，所述技术将取决于半翅目害虫的物种和该害虫的优选靶组织。例如，半翅目害虫物种臭虫通常以大豆植物正在发育的种子和豆荚为食。为了测定针对臭虫的活性，从表达TIC2199的转基因大豆植物中收获R5阶段的豆荚，并将其放置在含有一层琼脂或湿纸的有盖培养皿或大型多孔板中，从而为摄食环境提供湿度。将第二龄臭虫若虫放置在培养皿或大型多孔板中。在摄食环境上方放置一个盖子，用于提供氧气交换，同时防止干燥。允许臭虫若虫进食若干天。测量发育迟缓和死亡，并且与进食未转化大豆植物的豆荚的臭虫若虫进行比较。

或者，也可以对整个的稳定转化的植物执行活性测定。表达TIC2199的转化植物在生长室或温室中生长。在R5阶段，将植物封闭在由透气塑料“授粉”片(Vilutis andCompany Inc,Frankfort,IL)制成的笼子中。使用系带将片套固定在土壤表面上方的主茎上。每株植物都侵染了特定数量的第二龄臭虫若虫。若虫通过笼子一侧的小缝被释放到每个单独的笼子中，然后将笼子牢固地关闭，以确保昆虫不会逃脱。允许若虫进食大豆豆荚若干天至一周或更长时间。每天进行观察以确定发育迟缓和死亡的测量。在进食期结束时，收集活的和死亡的若虫。将笼子下面的植物切割并转移到实验室，在那里收集每株植物的昆虫。在打开笼子之前，剧烈摇动植物，以确保所有昆虫从其进食地点掉落到笼子底部。然后打开笼底，取出所有植物材料并放置在黑色片材上。可以使用抽吸器或其他一些方式来收集昆虫。记录每株植物的昆虫数量及其发育阶段。此外，还记录了死亡若虫的数量和发育阶段。将这些测量结果与从作为阴性对照的未转化植物获得的测量结果进行比较。

如果与未转化对照相比存在显著差异，则臭虫若虫的发育延迟(发育迟缓)或死亡被解释为毒性的迹象。

实施例7

TIC2199在稳定转化的棉花植物中

针对半翅目昆虫害虫的活性测定

本实施例描述了在稳定转化以表达TIC2199的棉花植物中针对半翅目昆虫害虫的活性测定。

使用本领域已知的方法克隆二元植物转化载体，其包含设计用于表达质体靶向和非靶向TIC2199的转基因盒。

使用二元植物转化载体来转化棉花植物。诱导转化的棉花植物来形成完整植物。使用多种技术执行针对半翅目害虫的活性测定，所述技术将取决于半翅目害虫的物种和该害虫的优选靶组织。例如，半翅目害虫物种臭虫通常以种子为食，因此对棉铃的伤害是首要问题。它们主要通过刺穿棉铃并以种子为食来损害棉花。它们的摄食活动可能导致在发生摄食的情况下，较大棉铃的外侧出现直径约1/16英寸的黑点。种子摄食可能会导致皮棉产量减少以及摄食位点附近的皮棉染色。由于其体型较大，成虫以及第四龄和第五龄若虫对棉铃的破坏潜力最大，因此在其早期若虫阶段杀死昆虫非常重要。半翅目害虫物种草盲蝽主要以方块和幼棉铃为食。若虫是更贪婪的摄食者，并且往往会造成最严重的损害。当以方块为食时，草盲蝽瞄准正在发育的花药，这通常会导致方块枯萎并从植物上掉落。对于发育成棉铃的那些方块，棉铃可能具有无法形成花粉的花药、未受精的种子和空的小室。当以棉铃为食时，草盲蝽瞄准正在发育的种子，从而在棉铃的外部产生黑色的小凹点。

在稳定转化的棉花植物中测定TIC2199活性的一种方法是在昆虫生物测定中使用方块。这些方块从表达TIC2199的转化棉花植物中收获。可以将这些方块放置在培养皿中或将每个方块放置在大型孔板的孔中。将幼小的新生草盲蝽或臭虫若虫放置在培养皿或大型孔板中，并允许其在规定的时间内进食。随着进食时间的推移测量发育迟缓和死亡，并且与其中在测定中使用衍生自未转化的棉花植物的方块的对照进行比较。

或者，可以对整个的转化的棉花植物执行活性测定。例如，为了针对草盲蝽物种进行测定，将衍生自表达一种TIC2199的植物的R₁种子播种在10英寸盆中。使用未转化的棉花植物作为阴性对照，优选来自与转化的植物相同的品种的棉花植物。将植物维持在环境室中，光周期为三十二(32)摄氏度下十六(16)小时光照和二十三(23)摄氏度下八(8)小时黑暗，并且光照强度介于八百(800)和九百(900)微爱因斯坦之间。在种植后四十(40)至四十五(45)天，将单个植物封闭在由透气塑料“授粉”片(Vilutis and Company Inc,Frankfort,IL)制成的笼子中。使用系带将片套固定在土壤表面上方的主茎上。将来自实验室培养物的两对性成熟的雄性和雌性牧草盲蝽或西方牧草盲蝽成虫(六天大)收集到14毫升圆底塑料管(Becton Dickinson Labware,Franklin Lakes,NJ)中并用于每株植物。成虫通过笼子一侧的小缝被释放到每个单独的笼子中，然后将笼子牢固地关闭，以确保昆虫不会逃脱。允许昆虫交配，并且将植物放置在笼子中保持二十一(21)天。

二十一(21)天后，然后将笼子下面的植物切割并转移到实验室，在那里收集每株植物的昆虫并计数。在打开笼子之前，剧烈摇动植物，以确保所有昆虫从其进食地点掉落到笼子底部。然后打开笼底，取出所有植物材料并放置在黑色片材上。使用抽吸器收集昆虫。然后对植物进行彻底检查，以回收任何剩余的昆虫。记录每株植物收集的昆虫数量及其发育阶段。根据草盲蝽的成熟度，将昆虫计数分为若干组：若虫至第3龄、第4龄、第5龄和成虫。

为了针对臭虫物种进行测定，将衍生自表达TIC2199的植物的R1种子播种到盆中，并如上所述生长和笼养。未转化的棉花植物也用作阴性对照。第二龄臭虫若虫用于侵染植物，并允许其以方块和棉铃为食若干天或若干周。如上所述收集笼养的植物，检查收集的臭虫并对其死亡进行评分，并且记录若虫的成熟度。然后将这些分数与阴性对照植物进行比较。

按照本公开的内容不需要过度的实验即可制得和执行本文公开和要求保护的所有组合物。虽然以前述说明性实施方案的方式描述了本发明的组合物，但是本领域技术人员将清楚，可以在不偏离本发明的真实理念、精神和范围的情况下对本文所述的组合物应用变化、改变、修改和替代。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些剂可以替代本文所述的剂，同时将实现相同或相似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有此类相似的替换和修改均被认为是在由所附的权利要求书定义的本发明的精神、范围和概念之内。

本说明书中引用的所有出版物和公开的专利文件都通过引用并入本文，其程度如同各个单独的出版物或专利申请具体地和单独地表示为通过引用并入。

Claims

1.一种重组核酸分子，其包含与编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子，其中任选地：

a.所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17的氨基酸序列；

b.所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或者

c.所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO:1、3、5、6、8、9、11、12、14、16或18的核苷酸序列的多核苷酸杂交。

2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中：

a.所述重组核酸分子在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的所述杀虫蛋白或杀虫片段；或者

b.所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体组成的组。

3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其存在于宿主细胞内，其中所述宿主细胞选自由细菌细胞和植物细胞组成的组。

4.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述细菌宿主细胞来自选自由以下组成的组的细菌属：农杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和欧文氏菌属。

5.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述芽孢杆菌属是蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属是侧芽短芽孢杆菌，并且所述埃希氏菌属是大肠杆菌。

6.如权利要求2所述的重组核酸，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。

7.如权利要求6所述的重组核酸，其中所述植物细胞选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔属植物、油菜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、圆橙南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶叶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。

8.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述蛋白表现出针对鳞翅目昆虫的活性。

9.如权利要求8所述的重组核酸分子，其中所述鳞翅目昆虫选自由以下组成的组：小地老虎(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、卷心菜尺蠖虫(Trichoplusiani)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、南方粘虫(Spodoptera eridania)、大豆尺蠖(Chrysodeixis includens)、西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)、甘蔗螟(Diatraea saccharalis)、绒豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)、西方豆虫(Striacosta albicosta)和小玉米茎螟(Elasmopalpus lignosellus)。

10.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述蛋白表现出针对半翅目昆虫的活性。

11.如权利要求10所述的重组核酸分子，其中所述半翅目昆虫选自由以下组成的组：牧草盲蝽(Lygus lineolaris)和新热带棕色臭虫(Euschistus heros)。

12.一种植物，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子，或其部分。

13.如权利要求12所述的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，或其部分。

14.如权利要求12所述的植物，其中所述植物选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔属植物、油菜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、圆橙南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶叶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦。

15.如权利要求12所述的植物，其中所述植物的其部分是种子，并且其中所述种子包含所述重组核酸分子。

16.一种昆虫抑制组合物，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子。

17.如权利要求16所述的昆虫抑制组合物，其还包含编码至少一种不同于所述杀虫蛋白的其他杀虫剂的核苷酸序列。

18.如权利要求17所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂选自由昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子、化学分子和辅助蛋白组成的组，其中所述至少一种其他杀虫剂与所述杀虫蛋白或其杀虫片段对相同的害虫具有毒性。

19.如权利要求17所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种的活性。

20.如权利要求17所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1D变体、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100、AXMI-115、AXMI-113和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI-171、AXMI-184、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209、AXMI-205、AXMI-218、AXMI-220、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z和AXMI-225z、AXMI-238、AXMI-270、AXMI-279、AXMI-345、AXMI-335、AXMI-R1及其变体、IP3及其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-657、DIG-11蛋白、IDP102Aa及其同系物、IDP110Aa及其同系物、TIC868、Cry1Da1_7、BCW003、TIC1100、TIC867、TIC867_23、TIC6757、TIC7641、IDP072Aa、TIC5290、TIC3668、TIC3669、TIC3670、IDP103及其同系物、PIP-50和PIP-65及其同系物、PIP-83及其同系物以及Cry1B.34。

21.如权利要求16所述的昆虫抑制组合物，其被定义为包含表达来自如权利要求1所述的重组核酸分子的杀虫蛋白的植物细胞。

22.一种商品产品，其由如权利要求12所述的植物或其部分产生，其中所述商品产品包含可检测量的所述重组核酸分子、所述杀虫蛋白或其杀虫片段。

23.如权利要求22所述的商品产品，其选自由以下组成的组：通过谷物处理机袋装的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米麦片等，以及对应的大豆、水稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、瓜类和蔬菜商品产品，在适用的情况下，包括果汁、浓缩物、果酱、果冻、橘子酱和含有可检测量的本申请的此类多核苷酸和/或多肽的此类商品产品的其他可食用形式、完整或加工过的棉籽、棉油、皮棉、种子和加工用于饲料或食品的植物部分、纤维、纸张、生物质和燃料产品，诸如衍生自棉油的燃料或衍生自轧棉机废料的颗粒，完整或加工过的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆片、豆麸、豆浆、大豆奶酪、豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的奶油、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。

24.一种产生包含如权利要求1所述的重组核酸分子的后代种子的方法，所述方法包括：

a.种植包含所述重组核酸分子的第一种子；

b.从所述步骤a的种子生长植物；以及

c.从所述植物收获所述后代种子，其中所述收获的种子包含所述重组核酸分子。

25.一种对昆虫侵染具有抗性的植物，其中所述植物的细胞包含如权利要求1所述的重组核酸分子。

26.一种用于防治鳞翅目物种害虫或害虫侵染的方法，所述方法包括：

a.使所述害虫与杀昆虫有效量的如SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17所示的杀虫蛋白接触；或者

b.使所述害虫与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述一种或多种杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

27.一种检测包含植物基因组DNA的样品中的如权利要求1所述的重组核酸分子的存在的方法，其包括：

a.使所述样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与包含如权利要求1所述的重组核酸分子的植物的基因组DNA杂交，并且在此类杂交条件下不与不包含如权利要求1所述的重组核酸分子的其他同基因植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ IDNO:3、6、9、12、14、16或18或编码杀虫蛋白的序列同源或互补，所述杀虫蛋白包含与SEQ IDNO:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；

b.将所述样品和所述探针置于严格杂交条件下；以及

c.检测所述核酸探针与所述重组核酸分子的杂交。

28.一种检测包含蛋白的样品中的杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列；或者所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；所述方法包括：

a.使所述样品与免疫反应性抗体接触；以及

b.检测所述杀虫蛋白或其片段的存在。

29.如权利要求26所述的方法，其中所述检测步骤包括ELISA或蛋白质印迹。

30.一种杀虫有效量的蛋白，其包含如SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17所示的氨基酸序列。

31.一种用于防治田地中的鳞翅目害虫物种或害虫侵染的方法：

a.生长表达杀昆虫有效量的如SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17所示的杀虫蛋白的作物植物；或者

b.生长表达杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白的作物植物，所述一种或多种杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:2、4、7、10、13、15或17具有至少96％、或97％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及任选地

c.将携带自限性基因的转基因鳞翅目害虫物种释放到所述田地中以降低所述害虫物种对所述杀虫蛋白产生抗性的可能性。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述作物植物是单子叶或双子叶作物植物。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述单子叶作物植物是玉米、小麦、高粱、水稻、黑麦或小米。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述单子叶作物植物是玉米。

35.如权利要求31所述的方法，其中所述双子叶作物植物是大豆、棉花或油菜。