MXPA01012883A - Proteinas insecticidas a partir de paecilomices y combinaciones sinergisticas de las mismas. - Google Patents
Proteinas insecticidas a partir de paecilomices y combinaciones sinergisticas de las mismas.Info
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Abstract
La presente invencion se relaciona a proteinas insecticidas en proteinas particulares obtenibles a partir de Paeci1omyces spp tales como Paeci1omyces fumosoroseus. En una modalidad preferida la invencion proporciona proteinas insecticidas que tienen la secuencia de aminoacidos representada como SEC. DE IDENT. No. 11 La invencion tambien proporciona una combinacion de proteinas sinergistica insecticida que comprende una primera proteina insecticida conforme a la invencion en combinacion con una proteina adicional. Preferentemente la proteina adicional es una endotoxina de cristal insecticida (CRY). Tambien se proporciona polinucleotidos que codifican las proteinas y vegetales que son capaces de producir las proteinas o combinacion de proteinas.
Description
PROTEICAS INSECTICIDAS A PARTIR DE PAECILOMICES Y COMBINACIONES SINERGISTICAS DE LAS MISMAS
DESCRIPCIÓN DE INVENCIÓN La presente invención se refiere a inter alia, éínas insecticidas y combinaciones sinergísticas de las mismas, secuencias de ADN que codifican las proteínas y métodos para producir vegetales que comprenden las proteínas y combinaciones. En particular la invención se refiere a péptidos insecticidas obtenibles a partir del hongo Paecilomyces spp. Muchos hongos son patógenos a los insectos, se sabe que Paecilomyces f?mosoroseus puede usarse como un agente de control biológico y esta cepa se vende comercialmente como un agente de biocontrol para uso en invernadero. Hasta ahora sin embargo, no ha existido aislamiento e identificación de péptidos insecticidas a partir de Paecilomyces spp. Se ha encontrado inesperadamente que péptidos insecticidas extraídos a partir de Paecilomyces spp. , tales como Paecilomyces farinos?s proporcionan un nuevo tipo de péptido insecticida oralmente activo potente. Sorprendentemente, estas proteínas también son capaces de actuar sinergísticamente con proteínas adicionales en particular las proteínas CRY y VIP. Conforme a la presente invención se proporciona una proteína insecticida que comprende la secuencia:
DE IDENT. No. 1) en . En una modalidad
aminoácidos en las posiciones Xi y X2 se seleccionan a partir del grupo que consiste de: Glicina; Lisina; Serina; Tirosina; Alanina; Metionina; Treonina; ácido Glutámico; ácido Aspártico; Asparagina y Valina. En aún una modalidad adicional de la presente invención los aminoácidos en las posiciones Xi y X2 son Serina y Tirosina respectivamente. En aún una modalidad adicional de la presente invención el aminoácido en la posición Xi es Glutamina. En aún una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida comprende la secuencia: GKICTPAGVKCPAALPCCPGLRCIGGVNNKVCR (SEC. DE IDENT. No. 2) . La presente invención proporciona aún adicionalmente una proteína insecticida que comprende la secuencia: XiXzGKICTPAGVKCPAALPCCPGLRCIGGVNNKVCR (SEC. DE IDENT. No. 3) en donde Xi y X2 son cualquier aminoácido, preferiblemente un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de: Glicina; Lisina; Serina; Tirosina; Alanina; Metionina; Treonina; ácido Glutámico; ácido Aspártico; Asparagina y Valina, de mayor preferencia Xi y X2 son Serina y 'Tirosina respectivamente . La presente invención proporciona adicionalmente una proteína insecticida que tiene al menos 55% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC.
*^^DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 60% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún 5 adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 65% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 70% de identidad con 0 cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 75% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún 5 adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 80% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 85% de identidad con 0 cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 90% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún 5 adicional de la presente invención la proteína insecticida
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tiene »ál menos 91% de identidad con cualquiera de las í f protßíiws representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 92% de identidad con
5 cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 93% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún
10 adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 94% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 95% de identidad con
15 cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 96% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. En una modalidad aún
20 adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 97% de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3, En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 98% de identidad con
25 cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE
Ügj^ ^^MMHI
IDENT. Nbs. 1 a 3. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene al menos 99? de identidad con cualquiera de las proteínas representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3. Preferiblemente, la proteína insecticida conforme a la presente invención comprende un motivo representado como -LPCCPG- y o -ICTPA- (SEC. DE IDENT. Nos. 64 y 65 respectivamente) . El porcentaje de identidad de secuencia para las proteínas se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o sustracciones (es decir espacios) en comparación con la secuencia de referencia inicial (que no comprende adiciones o sustracciones) para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales ocurre el residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones de ajuste, dividiendo el número de posiciones de ajuste entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Cuando se calcula el porcentaje de identidad de secuencia, las secuencias pueden alinearse permitiendo hasta 3 espacios con la condición de que con respecto a los espacios, se afecte un total de no más de 15 residuos de aminoácidos. La alineación
óptima de las secuencias para comparación también puede conducirse por implementaciones computarizadas de algoritmos conocidos. En una modalidad particular de la presente invención la identidad de secuencia se calcula usando el algoritmo 3 versión FASTA que usa el método de Pearson and Lipman (Lipman, D.J. and Pearson, WR. (1985) Rapid and sensitive protein similarity searches and Science. 227:1435-1441 y Pearson, W.R. and Lipman, D.J. (1988) Improved tools for biological sequence comparison. PNAS. 85:2444-2448) para buscar por si ilaridades entre la secuencia de referencia (también denominada la secuencia de petición) y cualquier grupo de secuencias (denominadas secuencias adicionales) . También existen métodos en la técnica que permiten calcular el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de polinucleótidos. La proteína puede diferir de la secuencia de proteína insecticida básica (tal como SEC. DE IDENT. No. 1) por sustituciones conservativas o no conservativas de aminoácidos. Debe entenderse que una sustitución conservativa significa que el aminoácido se reemplaza con un aminoácido con propiedades químicas ampliamente similares. En particular las sustituciones conservativas pueden hacerse entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (i) Alanina y Glicina; (ii) Serina y Treonina;
(iii) Acido de Glutámico y ácido de Aspártico; (iv) Arginina y Lisina; (v) Asparagina y Glutamina; (vi) Isoleucina y Leucina, (vii) Valina y Metionina (viii) Fenilalanina y Triptofano. En general, serán posibles sustituciones más conservativas que no conservativas sin destruir las propiedades insecticidas de las proteínas. Las proteínas variantes adecuadas de acuerdo con la presente invención pueden determinarse probando las propiedades insecticidas de la proteína usando métodos de rutina que son bien conocidos a la persona experta en la técnica. Dichas proteínas variantes también pueden sintetizarse químicamente usando técnicas estándar. La presente invención proporciona aún adicionalmente una proteína insecticida como se describió anteriormente en donde el aminoácido en la posición Xi se modifica. En una modalidad adicional de la presente invención el aminoácido en la posición Xi se acetila. En una modalidad aún adicional de la presente invención el aminoácido en la posición Xi está en el N-término. En una modalidad aún adicional de presente invención la región N-término de la proteína insecticida comprende la secuencia X?X2ICT- donde Xi y X2 son cualquier aminoácido.
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La presente invención proporciona aun adicionalmente un poiinucleótido que codifica una proteína insecticida en su forma no modificada. La presente invención proporciona aún 5 adicionalmente una secuencia de polinucleótidos que es el complemento de una que se hibridiza con un polinucleótido como se describió anteriormente a una temperatura de aproximadamente 65°C en una solución que contiene 6 x SSC 0.01% de SDS y 0.25% de polvo de leche descremada, lavando 0 después a la misma temperatura en una solución que contiene 0.2 x SSC y 0.1% de SDS en donde la secuencia de polinucleótido aún codifica una proteína insecticida. En una modalidad adicional de la presente invención la secuencia de polinucleótidos comprende la secuencia representada como SEC. 5 DE IDENT. Nos. 4 a 14. Las secuencias de polinucleótidos adicionales conforme a la presente invención pueden identificarse a partir de bibliotecas de ADN de hongos. Las sondas de oligonucleotidos adecuadas pueden construirse sobre la base 0 de las secuencias de aminoácidos de las proteínas conforme a la presente invención y usadas para seleccionar cualquier dicha biblioteca de ADN para la identificación de polinucleótidos adicionales que codifican las proteínas conforme a la invención.. En una modalidad aún adicional de 5 la presente invención las secuencias de aminoácidos
representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3 pueden usarse para la construcción de sondas de oligonucleótidos por el experto. En una modalidad aún adicional de la presente invención las secuencias representadas como las SEC. DE IDENT. Nos. 4 a 14 pueden usarse para la construcción de sondas de oligonucleotido. En una modalidad aún adicional de la presente invención la biblioteca de ADN es una biblioteca de ADN de Paecilomyces spp. La persona experta en la técnica está bien versada en los métodos para la producción y selección de bibliotecas de ADN y las técnicas necesarias para la subsecuente identificación aislamiento y determinación de secuencia de polinucleótidos que codifican proteína insecticidas adicionales de acuerdo con la presente invención. La persona experta en la técnica apreciará que existen métodos alternativos para la identificación y caracterización de secuencias insecticidas relacionadas a partir de otras fuentes preferiblemente otros miembros del género Paecilomyces . Dichos métodos incluyen estrategias PCR en base a cebadores de oligonucleótido que usan la información de secuencia proporcionada en la presente o a partir de secuencias obtenibles por los métodos d'ecritos anteriormente . En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una combinación sinergística insecticida que comprende una primera proteína que es una proteína como se
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describió anteriormente y al menos una proteína adicional. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína adicional es una proteína CRY insecticida. El término "proteína" CRY incluye proteínas de endotoxina cristal (y CRY secretadas) y las proteínas insecticidas vegetativas (y VIP secretadas) que son activas en contra de insectos que incluyen Lepidoptera , Coleóptera y Díptera . Dichas proteínas están disponibles inter alia, a partir de la bacteria Bacillus thuringienesis y son bien conocidas a la persona experta en la técnica. Particularmente las proteínas CRY preferidas que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen aquellas proteínas obtenibles a partir de Bacillus thuringienesis variedad tenejrionis que ha sido depositada bajo la Colección alemana de microorganismos (Deutsche Sammiung von Microorganism) bajo la referencia DSM
2803 o cepa JHCC 4835 y JHCC 4353 depositadas bajo la
National Collections of Industrial and Marine Bacteria
(Aberdeen) bajo los números de acceso NCIMB 40091 y 40090, respectivamente. En aún una modalidad adicional de la presente invención la proteína adicional comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. Nos. 54 a 59. La presente invención proporciona aún adicionalmente un polinucleótido que comprende regiones que codifican las proteínas primera y adicionales como se
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describió anteriormente. En una modalidad adicional de la presente invención el polinucleótido comprende una región que codifica una primera proteína que comprende la secuencia representada como SEC. DE IDENT. No. 2. En una modalidad aún adicional de la presente invención el polinucleótido comprende una región que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo representado como SEC. DE IDENT. Nos. 4 a 14. Las proteínas o combinaciones de proteínas insecticidas conforme a la invención pueden prepararse en un número de formas que son aparentes a la persona experta en la técnica. Por ejemplo, por síntesis química usando un sintetizador de péptidos estándar, usando tecnología de ADN recombinante para expresar la proteína/combinación en organismos adecuados tales como vegetales y microorganismos tales como E. coli , Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para desarrollar un polinucleótido que codifica una proteína que tiene propiedades insecticidas que comprende: (a) proporcionar una población de variantes del polinucleótido y polinucleótidos adicionales que codifican proteínas adicionales, al menos uno de los cuales está en forma de célula libre; y (b) revolver las variantes y los polinucleótidos adicionales para formar polinucleótidos recombinantes; y (c) escoger o seleccionar polinucleótidos recombinantes que se han desarrollado hacia codificar una
proteína que tiene las propiedes insecticidas; y (d) repetir los pasos (b) y (c) con los polinucleótidos recombinantes conforme al paso (c) hasta que se haya adquirido un polinucleótido desarrollado que codifique una proteína que tenga propiedades insecticidas en donde la población de variantes en parte (a) contenga al menos un polinucleótido que codifica una proteína como se describió anteriormente. En una modalidad adicional de la presente invención el polinucleótido desarrollado codifica una proteína insecticida que tiene proteínas favorables para uso en un contexto aplicado. Por ejemplo actividad o eficiencia mejorada en un cultivo vegetal particular. La presente invención proporciona aún adicionalmente un método como se describió anteriormente en donde la población de variantes en parte (a) contiene al menos un polinucleótido que codifica la proteína representada como SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3 y los polinucleótidos en la parte (a) codifica una proteína CRY. Los métodos para desarrollar un polinucleótido como se describió anteriormente son bien conocidos a la persona experta en la técnica y se describen inter alia, en Patente Norteamericana No. 5,811,238. La presente invención proporciona aún adicionalmente un polinucleótido obtenible u obtenido por los métodos descritos anteriormente y una proteína codificada por
' S I cualquier * dicho polinucleótido. La presente invención proporciona aún adicionalmente una construcción de ADN que comprende en secuencia un promotor operable en vegetales unido operablemente a un polinucleótido que codifica una proteína como se describió anteriormente unida operablemente a una región de terminación de transcripción. En una modalidad adicional de la presente invención la construcción de ADN comprende adicionalmente una región o una pluralidad de regiones que proporciona la selección del producto o productos de proteínas en una ubicación o ubicaciones particulares. Por ejemplo, si se desea proporcionar la proteína fuera de la célula entonces puede ligarse una secuencia objetivo extracelular al polinucleótido que codifica la proteína de la presente invención. Otros ejemplos de selección incluyen selección para un organelo intracelular específico o compartimento tal como un cloroplasto, cualquier otro plástido, retículo endoplas ático, peroxisoma, el cuerpo oleoso, itocondrion o vacuola. Numerosas secuencias de selección de proteínas están disponibles a la persona experta en la técnica y cualquiera de estas secuencias puede usarse para proporcionar (i) la proteína conforme a la presente invención per se y/o (ii) la proteína adicional a, preferiblemente, considerablemente la misma ubicación. En una modalidad aún adicional de la presente invención la secuencia
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objetivo - comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo representado como SEC. DE IDENT. Nos. 15 a 19 o un polinucleótido que codifica una proteína seleccionada a partir del grupo representado como SEC. DE IDENT. Nos. 20 a 24. La secuencia de polinucleótidos para selección puede ubicarse 5' y/o 3' del polinucleótido que codifica la proteína o combinación conforme a la presente invención. La presente invención proporciona aún adicionalmente una construcción de ADN como se describió anteriormente que comprende adicionalmente una región que proporciona la producción de una proteína que actúa como un marcador capaz de seleccionar. El marcador capaz de X seleccionar pueden, en particular, conferir resistencia a canamicina; higromicina o gentamicina. Los marcadores capaces de seleccionar adecuados adicionales incluyen genes que confieran resistencia a herbicidas tales como herbicidas basados en glifosato o resistencia a toxinas tales como eutipina. También están disponibles otras formas de selección tales como sistemas de selección basados en hormonas tales como el sistema Multi Auto Transformation (MAT) de Hiroyrasu Ebinuma et al . 1997. PNAS Vol. 94 pp 2117-2121; sistemas de selección visual que usan la conocida proteína de fluorescencia verde, ß glucoronidasa y cualquier otro sistema de selección tal como mannosa, isomerasa, xilosa isomerasa y 2-desoxiglucosa (2-DOG) .
La presente invención proporciona aun adicionalmente una construcción de ADN como se describió anteriormente en donde el promotor operable de vegetal se selecciona a partir del grupo que consiste de Agrobacteríum rhizogenes RolD; inhibidor II de papa proteasa; CaMV35S; FMV35S; NOS; OCS; Patatin; E9; interruptor alcA/alcR; interruptor GST; interruptor RMS; oleosina; promotor de subunidad pequeña ribulosa bisfosfato carboxilasa-oxigenasa y otros promotores específicos de raíz incluyendo promotor MR7 (maíz); promotores Gos 9 (arroz) y G0S2. Los terminadores que pueden usarse en las construcciones conforme a la presente invención incluyen Nos, inhibidor II de proteinasa y el terminador de un gen de alfa-tubulina (EP-A 652,286). Es igualmente posible usar, en asociación con el promotor de secuencia de regulación, otras secuencias de regulación que se sitúan entre el promotor y la secuencia que codifica la proteína conforne a presente invención, tales como mejoradores de transcripción o traducción, por ejemplo, activador de traducción del virus etch del tabaco (TEV) descrito en la solicitud de Patente Internacional, número de publicación PCT WO87/07644. El polinucleótido que codifica la proteína o combinación insecticida conforme a la invención también puede optimizarse por codon, o alterar o de otra forma para mejorar por ejemplo, la transcripción una vez que se incorpora dentro del material vegetal. Ejemplos de uso de
il l . codon preferidos a partir de plantas de algodón y maíz se indican en la Tabla 1 siguiente. Tabla 1 D Aminoácido Preferencia de algodón Preferencia de maíz
Alanina GCT GCC Arginina AGG AGG Asparagina AAC ACC Acido Aspártico GAT GAC Cisteina TGC TGC Glutamina CAA CAG Ácido de Glutámico GAG GAG Glicina GGT GGC Histidina GAT CAC Isoleucina ATT ATC Leucina CTT CTG Lisina AAG AAG Metionina ATG ATG Fenilalanina TTC TTC Prolina CCT CCG Serina TCT AGC Treonina ACT ACC Triptofan TGG TGG Tirosina TAC TAC Valina GTT GTG
Dicha optimización por codon también puede usarse para alterar la estructura secundaria predicha de la transcripción de ARN producida en cualquier célula transformada, o para destruir elementos de inestabilidad de AR? críticos presentes en la transcripción no alterada aumentado con eso la estabilidad y/o disponibilidad de la transcripción en la célula transformada (Abler and Green. 1996. Plant Molecular Biology (32) pp63-78) . La expresión de la proteína y/o combinación conforme a la presente invención también puede mejorarse a través de la inclusión de una o más secuencias intrónicas dentro de los polinucleótidos que codifican la proteína y/o combinación. Ejemplos de dichas secuencias son el segundo intrón del gen LSI de Solanum tuberosum y el intron del gen alcohol deshidrogenasa 1 ( adhl ) de especies vegetales monocotiledoneas. El método de expresión de cloroplasto (McBride et al. 1995. Biotechnology
(13) pp369-365) también puede usarse para lograr la expresión mejorada de la proteína y/o recombinación conforme a la presente invención. Este método es bien conocido a la persona experta en la técnica y comprende básicamente la transformación del genoma del cloroplasto con un polinucleótido bajo el control de un promotor funcional activado por cloroplasto o combinación del promotor/mejorador . En un aspecto adicional de la presente invención se
proporciona un método para proporcionar un vegetal o parte de vegetal con una proteína insecticida o una combinación sinergística de proteína insecticida que comprende: (a) insertar dentro del genoma del material vegetal un polinucleótido que codifica una proteína como se describió anteriormente o un polinucleótido que comprende regiones que codifican la proteína primera y adicional como se describió anteriormente o una construcción de ADN como se describió anteriormente; o (a) insertar dentro del genoma del material vegetal que es capaz de producir una proteína adicional, un polinucleótido que codifica una primera proteína como se describió anteriormente;; o (a) insertar dentro del genoma del material vegetal que es capaz de producir una primera proteína como describió anteriormente, un polinucleótido que ' proporciona una proteína adicional; y (b) regenerar vegetales o partes vegetales a partir del material; y (c) seleccionar los vegetales o partes vegetales que tienen la proteína o combinación. La construcción de polinucleótidos/ADN puede incorporarse dentro de la células por técnicas de transformación vegetal que son bien conocidas a la persona experta en la técnica. Dichas técnicas incluyen pero no se limitan a transformación biolistica mediada por partículas, transformación mediada por agrobacterium, transformación de protoplastos (opcionalmente en la presencia de polietilenglicoles); sonicación de tejidos vegetales, células
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o protoplastos en un medio que comrpende el polinucleótido o vector; microinserción del polinucleótido vector dentro de material vegetal totipotente (empleando opcionalmente la técnica de "bigotes" de carburo de silicio conocida) , electroporación y similares. La presente invención proporciona aún adicionalmente un método para proporcionar un vegetal con una combinación sinergística de proteína insecticidas que comprende cruzar un primer vegetal que es capaz de proporcionar una primera proteína como se describió anteriormente con un segundo vegetal que es capaz de producir una proteína adicional y seleccionar el vegetal resultante que es capaz de producir la combinación. La presente invención proporciona aún adicionalmente vegetales o partes vegetales obtenidas conforme al método como se describió anteriormente. D La presente invención proporciona aún adicionalmente vegetales o partes vegetales como se describió anteriormente en donde la proteína o la primera proteína de la combinación se modifica después de la traducción. En una modalidad adicional de la presente invención, la proteína o la primera proteína de la combinación se acetila. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína o la primera proteína se modifica/acetila en el N-término. En
una modalidad aún adicional de la presente invención la región N-terminal de la proteína/primera proteína insecticida comprende la secuencia X?X2ICT en donde Xi y X2 son cualquier aminoácido. En una modalidad adicional de la presente invención X? y X2 se seleccionan a partir del grupo que consiste de: Glicina; Lisina; Serina; Tirosina; Alanina; Metionina; Treonina; ácido de Glutámico; ácido Aspártico; Asparagina y Valina. En una modalidad adicional de la presente invención los aminoácidos en las posiciones Xi y X2 son Serina y Tirosina respectivamente. En una modalidad aún adicional de la presente invención el aminoácido en la posición i es Glutamina. La presente invención proporciona aún adicionalmente vegetales o partes vegetales como se describió anteriormente seleccionadas a partir del grupo que consiste de melones, mangos soya, algodón tabaco remolacha aceite de colsa, cañóla, lino girasol, papa, tomate, alfalfa, lechuga, maíz, trigo, sorgo, centeno, plátanos, cebada, avena, hierva de césped, hierva de forraje, caña de azúcar, chícharos, judía, arroz, pino, álamo, manzana, duraznos, uva, fresas, zanahoria, lechuga, col, cebolla, cítricos, cereales, vegetales de nueces u otros cultivos hortícolas. Los vegetales y partes vegetales de acuerdo con la presente invención muestran mejorada resistencia o mejorada tolerancia a una plaga de insectos cuando se compara con vegetales tipo
silvestre o similares al control. La resistencia puede variar desde un ligero aumento en la tolerancia a la plaga hasta una resistencia total de manera que la planta no es afectada por la presencia de la plaga (en donde la plaga se inhibe severamente o se destruye) . La presente invención proporciona aún adicionalmente un método para proporcionar un vegetal o parte vegetal con una cualidad agronómica deseada adicional que comprende: (a) insertar dentro el genoma del material vegetal un polinucleótido que proporciona la cualidad agronómica deseada; y (b) regenerar vegetales o partes vegetales a partir del material; y (c) seleccionar los vegetales y partes vegetales que tienen la cualidad agronómica deseada en donde el material vegetal es capaz de producir una proteína insecticida o una combinación de proteínas insecticida como se describió anteriormente; o cruzar un primer vegetal cuyo vegetal es capaz de producir una proteína insecticida o una combinación de proteínas insecticida como se describió anteriormente con un segundo vegetal que proporciona la cualidad agronómica deseada adicional y seleccionar el vegetal resultante que es capaz de producir la cualidad agronómica adicional . En una modalidad adicional de la presente invención la cualidad agronómica deseada se selecciona a partir del grupo que consiste de: resistencia a herbicidas; resistencia a insectos; resistencia a nemátodos,
tolerancia a la tensión; rendimiento alterado; valor nutricional alterado o cualquier otra cualidad agronómica deseada. En una modalidad adicional de la presente invención la cualidad agronómica deseada proporciona resistencia a un herbicida que comprende ácido glifosato o una sal agrícolamente aceptable de la misma. La presente invención proporciona aún adicionalmente vegetales o partes vegetales obtenidas conforme al método del párrafo precedente. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un proteína insecticida que comprende la secuencia represenißba como -X?-X2-X3-Cys4-X5-X6-X7-X8-X9-X?o~
C Sn-Xi2- l3Xl4~Xl5 , -Xl6~CySi7-CySi8-Xl9-X20~X2l~X22-CyS 23-X24~X25~ 26~
X27-X28-X29-X3o-X3?-Cys32-X33- (SEC. DE IDENT. No. 60) en donde Xi- 3, 5-?o/ 12-16 19-22/ 2-3i y 33 son cualquier aminoácido. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida comprende la secuencia representada como SEC. DE
IDENT. No. 60 y donde X es cualquier aminoácido con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 14 y 15 no sean cisteina. En una modalidad aún adicional de la presente invención la proteína insecticida comprende la secuencia representada como SEC. DE IDENT. No. 60 donde X es cualquier aminoácido distinto a cisteina. En el caso presente, los péptidos insecticidas representados como inter alia, SEC. DE IDENT. NOS 1 A 3 y 50 y las proteínas purificadas por la SEC.
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DE IDENT. Nos. 4 A 14 contienen seis residuos del cisteina todos los cuales se cree que están involucrados en formar 3 enlaces disulfuro intramoleculares. Así la disposición de los residuos de cisteina puede ser importante para conferir actividad insecticida al péptido. En una modalidad adicional de la presente invención el aminoácido en la posición Xi áe modifica después de la traducción. En una modalidad aún adicional de la presente invención el aminoácido en la posición Xi se acetila. En una modalidad aún adicional de la presente invención el aminoácido en la posición Xi es el N- tér ino. En una modalidad aún adicional de la presente invención la región N-término de la proteína insecticida comprende la secuencia X?X2ICT - donde Xi y X2 son cualquier aminoácido. En aún una modalidad adicional de la presente invención Xi y X2 se seleccionan a partir del grupo que consiste de: Glicina; Lisina; Serina; Tirosina; Alanina; Metionina; Treonina; ácido Glutámico; ácido Aspártico; Asparagina y Valina. En aún una modalidad adicional de la presente invención el aminoácido en la posición Xx es Glicina. En un una modalidad adicional de la presente invención los aminoácidos en las posiciones Xx y X2 son Serina y Tirosina respectivamente. En una modalidad aún adicional de la presente invención el aminoácido en la posición Xi y X2 es Glutamina. La presente invención proporciona aún
adicionalmente una proteína insecticida que tiene una cuenta FASTA opt mayor de 109 en comparación con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3 de FASTA. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene una cuenta FASTA opt mayor de 110 en comparación con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3 de FASTA. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene una cuenta FASTA opt mayor de 115 en comparación con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3 de FASTA. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene una cuenta FASTA opt mayor de 117 en comparación con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3 de FASTA. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene una cuenta FASTA opt mayor de 119 en comparación con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3 de FASTA. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene una cuenta FASTA opt mayor de 120 en comparación con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3 de FASTA. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene una cuenta FASTA opt mayor de 130 en comparación con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3 de FASTA. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene una cuenta FASTA opt mayor de 140 en comparación con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3
de FASTA. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida tiene una cuenta FASTA opt mayor de 150 en comparación con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3 de FASTA. La cuenta FASTA opt puede calcularse usando el algoritmo FASTA como se describió anteriormente. Después de computar las cuentas iniciales, FASTA determina el mejor segmento de similaridad entre la secuencia de petición y las secuencias adicionales usando el algoritmo Smith-Waterman (Smith, T.F. and Water an, M.S. (1981) Comparison of biosequences. Ad. Appl. Math 2:482-489). La producción se presenta en la forma de una cuenta opt y ste procedimiento es bien conocido a la persona expert5a en la técnica. La presente invención aún proporciona adicionalmente una proteína insecticida obtenible u obtenida a partir de Paecilomyces sp. En una modalidad adicional de la presente invención la proteína insecticida se obtiene a partir de Paecilomyces farinosus. La presente invención proporciona aún adicionalmente un método para controlar insectos que comprende proporcionar en un lugar donde los insectos se alimentan, una proteína o combinación de proteínas como describió anteriormente. La presente invención proporciona aún adicionalmente el uso de un polinucleótido que codifica una proteína insecticida como se describió anteriormente o una
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construcción de ADN como se describió anteriormente en un método para la producción de vegetales o partes vegetales que son resistentes a los insectos. En aún una modalidad adicional de la presente invención el polinucleótído comprende la secuencia seleccionada a partir del grupo representado como SEC. DE IDENT. Nos. 4 a 14. La presente invención proporciona aún adicionalmente el uso de una proteína un o una combinación de proteínas como se describió anteriormente como un ingrediente activo de un pesticida. La presente invención proporciona aún adicionalmente el uso de Paecilomyces Sp. en la preparación de un pesticida que contiene como un ingrediente activo, una proteína como se describió anteriormente. En una modalidad adicional de la presente invención Paecilomyces Sp. se ha modificado para permitir la producción aumentada de una proteína como se describió anteriormente. La persona experta en la técnica puede modificar Paecilomyces Sp. de manera que sea capaz de producir las proteínas insecticidas a niveles que están aumentados en comparación con Paecilomyces Sp. similar al control no modificado usando técnicas bien conocidas dentro de la técnica. Por ejemplo, modificando los elementos promotores unidos al polinucleótido que codifica la proteína insecticida como se describió anteriormente para aumentar la producción de proteína. Además de esto o
alternativamente, al insertar una segunda copia del gen que codifica la proteína como se describió anteriormente dentro del Paecilomyces Sp seleccionado. La producción de la proteína insecticida conforme a la presente invención también puede aumentarse a través de programas de mejora de la cepa estándar conocidos a aquellos expertos en la técnica. La presente invención proporciona aún adicionalmente un micro-organismo recombinante que proporciona la producción de una proteína o una combinación de proteínas como se describió anteriormente. En una modalidad adicional de la presente invención el microorganismo es un endofito. Un endofito se acepta generalmente dentro de la técnica como un microorganismo que tiene la habilidad de entrar en relaciones endosimbióticas no patógenas con un huésped vegetal. Un método de protección mejorada con endofito para vegetales se ha escrito en una serie de solicitudes de patente por Crop Genetics International Corporation (por ejemplo, Número de Publicación de Solicitud Internacional WO90/13224, Número de Publicación de Patente Europea EP-125468-B1, Número de Publicación de Solicitud Internacional WO91/10363, Número de Publicación de Solicitud Internacional WO87/03303) . Número de Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO94/16076 (ZENECA Limited) describe el uso de endofitos que se han modificado genéticamente para expresar un péptido insecticida derivado
de vegetales. La presente invención proporciona aún adicionalmente un baculovirus recombinante que comprende una proteína o una combinaión de proteínas como se describió anteriormente. La presente invención proporciona aún adicionalmente el uso de un baculovirus conforme a la oración precedente en un método para controlar insectos. Conforme a un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una proteína insecticida que es capaz de reaccionar con un anticuerpo monoclonal dirigido a la proteína selecciona a partir del grupo representado como SEC. DE IDENT. No. 1 a 3. La presente invención proporciona aún adicionalmente una proteína insecticida que es capaz de reaccionar con un anticuerpo policlonal erigido a la proteína seleccionado a partir del grupo representado como SEC. DE IDENT. No. 1 a 3. Dichos anticuerpos pueden generarse y usarse para identificar otras proteínas dentro del ámbito de la presente invención conforme a técnicas bien conocidas dentro de la técnica. La presente invención proporciona aún adicionalmente una composición que comprende una cantidad efectiva como insecticida de una proteína o una combinación de proteínas como se describió anteriormente y opcionalmente un portador agrícolamente aceptable y/o un diluyente y/o un atrayente de insectos. La composición puede aplicarse a los
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insectos o al ambiente en cual viven, en particular, a partes vegetales o el suel ocircundante, usando técnicas agrícolas estándar por ejemplo rociado. Los proteínas insecticidas y combinaciones de conforme a la presente invención también pueden combinarse para aplicación con otros agroquímicos tales como herbicidas, fungicidas y otros compuestos insecticidas incluyendo otras proteínas insecticidas. Ejemplos de socios de mezcla posibles incluyen lectinas insecticidas, inhibidores de proteasa insecticida y proteínas insecticidas derivadas a partir de especies de Bacill us thurigiensis, Xenorhadus, nematophilus , o Photorabdus l uminescens y otros químicos por ejemplo piretroides, carbamatos, imidacloprid, organoclorinos, acromoleculas tales como spinosad aba ectina o emamectin. La presente invención proporciona aún adicionalmente un polinucleótido que tiene una primera región que codifica una proteína como se describió anteriormente y una segunda región que codifica una proteína adicional. Las regiones pueden separarse por una región que proporciona un polipéptido de autoprocesamiento que es capaz de separar las proteínas tales como el polipéptido de autoprocesamiento descrito en la Patente Norteamericana 5,846,767 o cualquier elemento similarmente funcional. Alternativamente las regiones pueden separarse por una secuencia que actúa como un sitio objetivo para un elemento externo capaz de
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separar las secuencias de proteína. Alternativamente el polinucleótido puede proporcionar una poliproteina que comprende una pluralidad de funciones proteicas. En una modalidad adicional de la presente invención las proteínas de la poliproteína pueden disponerse en tándem. En una modalidad aún adicional de la presente invención la poliproteína comprende una pluralidad de funciones proteicas que se separan por secuencias enlazantes. Dichas poliproteínas pueden comprender las proteínas y/o proteínas adicionales conforme a la presente invención y opcionalmente proteínas adicionales tales como aquellas que codifican cualquier cualidad agronómica deseada. La presente invención proporciona aún adicionalmente una célula vegetal que comprende una proteína o combinación de proteínas como se describió anteriormente o un polinucleótido que codifica una proteína insecticida y/o una combinación de proteínas insecticidas como se describió anteriormente . La presente invención proporciona aún adicionalmente una proteína insecticida que comprende el motivo representado como -LPCCPG - (SEC. DE IDENT. No. 63) y/o -ICTPA- (SEC. DE IDENT. No. 64) . D Los insectos a ser controlados por las proteínas de la presente invención incluyen insectos que mascan vegetales
y las etapas de mascar vegetales de los insectos tales como larvas de insectos que incluyen: Coleóptera, Lepidoptera, Orthoptera y Drosophila, incluyendo, pero no limitado a: Acanthoscelides obtectus, Bruchus sps., Callosobruchus sps. (larvas de escarabajo), Agriotes sps. ( ire orms),
Amphimallon sps. (escarabajos chafer) Anthonomus granáis (gorgojo del algodón) , Ceutorhynchus assimilis (gorgojo de la semilla de la col) , Cylas sps. (gorgojo del camote) , Diabrotica sps. (gusanos de la raíz del maíz) , Epicauta sps. (escarabajo de ampolla negra) , Epilachna sps (escarabajos del melón, etc.) Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la papa Colorado) Meligisthes sps. (escarabajos del capullo), Melolontha sps. (abejorros), Phyleotreta sps., Psyllíodes sps. (escarabajo pulga) , Popillia japónica (escarabajo Japonés), Scolytus sps. (escarabajos oraradores), Sitophilus sps. (gorgojos de los granos), Tenebrio molitor (gusano amarillo de la harina), Tribolium sps. (escarabajos de la arina), Trogoderma granarium (escarabajo Khapra) , Acleris sps. (fruit tree tortrixs), Acraea acerata (mariposa del camote), Agrotis sps. (cutwor s) , Autographa gamma (polilla Y-plata) , Chilo sps. barrenadores del talo) , Cydia pomonella (polilla de la manzana) , Diparopsis sps. (gusanos rojos del maíz) , Ephestia sps. (polillas del almacén), Heliothis sps., Helicoverpa sps. (gusanos de la yema, gusanos del maíz), Mamestra brassicae (polilla de la col) , Manduca sps. (gusanos
de los cuernos), Maruca testulalis (polilla del garbanzo), Mythimna sps . (gusanos guerreros del cereal), Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz Europeo) . Pectinophora gossypiella (gusano del maíz rosa) , Phthorimaea operculella (polilla del tubérculo de papa) , Pieris brassicae (mariposa blanca grande) , Pieris rapae (mariposa blanca chica) , Plodia interpunctella (polilla del grando del Indico) , Plutella xylostella (polilla de espalda de diamante) , Si tatroga cerealella (polilla del grano de Angoumois), Spodoptera sps . (gusanos guerreros), Trichoplusia ni (se igeometrino de la col), Acheta sps . (grillos del campo), Gryllotalph sps . (grillo mole) , Locusta migratoria (cigarra migratoria) , Schistocerca gregaria (cigarra del desierto) , Acrythosiphon pisum y Drosophila sp. La invención se describirá ahora medio de los siguientes ejemplos no limitantes en combinación con las Figuras siguientes y el listado se secuencias de las cuales: La FIGURA 1 - es un diagrama esquemático de la organización del gen Paecilomyces farinosus. La FIGURA 2 - ilustra la parte de fusión del gen señal de una construcción adecuada para la transformación del maíz. La FIGURA 3 - muestra una construcción adecuada para la transformación del maíz e ilustra el vector de cadena principal pat UBI poly2.
D La FIGURA 4 - Muestra un mapa genómico del gen aislable a partir de Paecilomyces farinosus . La FIGURA 5 - Muestra el vector pCR2.1 TOPO. a SEC. DE IDENT. Nos. 1 a 3 - proteínas insecticidas optenibles a partir de Paecilomyces spp. También referidas como "proteína R524445" y "proteína 445". SEC. DE IDENT. Nos. 4 a 6 - Polinucleótidos que codifican las proteínas insecticidas. SEC. DE IDENT. Nos. 7 y 8 - Polinucleótidos que codifican las proteínas insecticidas optimizadas por codon. Para la SEC. DE IDENT. No. 7 - el péptido señal está presente a partir de la posición 1 a 72 y la proteína madura que codifica las secuencias es de 73 a 174 (incluyendo el alto) . Para la SEC. DE IDENT. No. 8 - el péptido señal está presente a partir de la posición 1 a 72 y la proteína madura que codifica las secuencias es de 73 a 174 (incluyendo el alto) . Las SEC. DE IDENT. Nos. 9 y 10 - Polinucleótidos que codifican las secuencias intron que contienen proteínas insecticidas. Para la SEC. DE IDENT. No. 9 - el péptido señal está presente a partir de la posición 1 a 68 y el la secuencia intron es de 99 a 288. La SEC. DE IDENT. No. 10 tienen dos aminoácidos adicionales Serina y Tirosina en el N-
término de la proteína madura. El péptido señal está presenté a partir de la posición 1 a 72, La Ser y Tyr se codifican por los nucleótidos 73 a 78 y la secuencia intron es de 106 a 294. SEC. DE IDENT. NO. 11 - El polinucleótido que codifica las proteínas insecticidas con dos aminoácidos sustituido para Serina y Tirosina en el N-término de la proteína madura. El péptido señal está presente a partir de la posición 1 a 72. Ser y Tyr se codifican por los nucleótidos 73 a 78 y la secuencia intron es a partir de los nucleótidos 100 a 288. SEC. DE IDENT. No. 12 - el polinucleótido que codifica las proteínas insecticidas que contienen intron y codon obtimizado. El péptido señal está presente a partir de la posición 1 a 78 y la secuencia intron es a partir de 105 a 288. SEC. DE IDENT. No. 13 - la secuencia de genómica de la proteína insecticida obtenible a partir de Paecilomyces spp. El péptido señal está presente a partir de la posición 57 a 107. La proteína madura que codifica la secuencias es a partir de 108 a 397 (incluyendo el alto) . SEC. DE IDENT. No. 14 - El polinucleótido que codifica la proteína insecticida madura. SEC. DE IDENT. No. 15 a 19 - Las secuencias de polinucleótidos que codifican los péptidos señal a partir de
Dahlia (Dm-AMP-1), Rábano (Rs-AFPl) , Maíz (glicoproten rico en hidroxiprolina (HRGP) ) , Tabaco (PR-la señal) y Paecilomyces respectivamente. Las SEC. DE IDENT. Nos. 20 a 24 - Secuencias de proteínas para los péptidos señal a partir de Dahlia (Dm-AMP- 1), Rábano (Rs-AFPl), Maíz (glicoproten rico en hidroxiprolina (HRGP) ) , Tabaco (PR-la señal) y Paecilomyces respectivamente . La SEC. DE IDENT. Nos. 25 a 53 - cebadores. La SEC. DE IDENT. Nos. 54 a 59 - secuencias de
Proteínas para proteínas insecticidas cryllal (Embl. Accession No. X62821); crylla2 (Embl. Accession No. M98544); crylla3 (Embl. Accession No. L36338) ; crylla4 (Embl. Accession No. L49391) ; crylla5 (Embl. Accession No. Y08920) y cryllbl (Embl. Accession No. U07642) respectivamente. SEC. DE IDENT. No. 60 - secuencia de proteína insecticida que tiene residuos de cisteina en posiciones particulares. SEC. DE IDENT. No. 61 - Polinucleótido que codifica la secuencia de proteína insecticida genómica. El péptido señal está presente a partir de la posición 57 a 107. La proteína madura que codifica las secuencias es a partir de
108 a 397 (incluyendo el alto) . SEC. DE IDENT. No .62 - Polinucleótido que codifica proteína insecticida obtenible a partir de Paecilomyces sp.
El péptido señal está presente a partir de la posición 110 a 160. La proteína madura que codifica las secuencias es apartir de 161 a 262 (incluyendo el alto) . SEC. DE IDENT. No. 63 Y 64 - motivos de proteína SEC. DE IDENT. No. 65 - región de Proteína. EJEMPLOS Ejemplo 1 Cultivo de Paecilomyces Farinosus Se cultivo Paecilomyces farinosus rutinariamente sobre placas de agar papa dextrosa. Las esporas se cosecharon a partir de las placas agregando agua estéril y raspando con una espátula estéril. Para producción de péptido insecticida se inocularon 6 x 107 esporas dentro de 5 x 200 ml de medios SDB en matraces de 500 ml. Los cultivos se incubaron a 24°C con agitación a 180 rpm durante 7 días antes de cosechar. Ejemplo 2 Purificación de péptido insecticida Se filtraron 500 ml de filtrado de cultivo 7d a través de papel Whatman™ GF/B para eliminar el micelio y el sobrenadante se diluyó 4 veces en 20 mM de MES pH6. El sobrenadante se cargó después sobre una columna de S-Sefarosa FF XK16/10 (Pharmacia Biotech) previamente equilibrada con 20 M de MES pH6. La proteína sin unir se lavó a través de la columna con 3 volúmenes de columna de 20 mM de MES pH6 y la proteína unida se eluyó con un gradiente lineal de 0-1 M de
NaCl en 20 mM de MES pH6 sobre 20 volúmenes de columna. El eluato se observó por péptido midiendo en línea la absorbancia a 280 y 210 nm. Se recolectaron fracciones de 5 ml y se siguió diálisis en contra de 50 mM de regulador de Fosfato de sodio pH7 probado en contra de Heliothi s . Las fracciones activas eluyeron alrededor de 250 mM de NaCl. Estas fracciones se reunieron y siguiendo la concentración sobre polietilenglicol peso molecular 20,000, se purificaron adicionalmente por fase inersa. Se cargo 2 ml de muestra sobre una columna de 3 ml Resource RPC (Pharmacia Biotech) y el péptido unido se eluyó con un gradiente lineal de ácido trifluoroacético al 0.05% (TFA) a 50% de acetonitrilo, 0.05% de TFA sobre 20 volúmenes de columna. El eluato se observó por absorbancia a 210 y 280 nm. El pico activo eluyó a aproximadamente 20% de acetonitrilo. Ejemplo 3 D Identificación de la secuencia peptídica D La secuencia de péptido activo en el producto del
Ejemplo 2 no pudo determinarse directamente, 'debido probablemente a un N-término bloqueado. El péptido se redujo y se sometió a una digestión crítica. Esto produjo una serie de fragmentos que pudieron secuenciarse usando métodos de degradación Edman. Una combinación de esto, y espectrometría
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de masas, la secuencia del péptido se determinó como siendo SEC. DE IDENT. No. 2. Los datos de espectrometría de masa indican que la Glicina N-términal está acetilada. Ejemplo 4 Actividad Biológica en Bioprueba de insectos El péptido aislado se bioprobo en contra de un rango de especies de insectos usando el siguiente método: Antes de la prueba veinte larvas de lepidoptera neonatas se rasparon suavemente dentro de cada uno de tres recipientes "minicazueleta" por tratamiento (es decir tres réplicas por tratamiento) . El péptido del Ejemplo 2 se diluyó usando 0.1% de solución Synperonic™ como un humedecedor y auxiliar en la diseminación del material sobre la cutícula cerosa de la hoja. En pruebas de espectro, los materiales de prueba se reunieron en una concentración alta individual, mientras que en las pruebas de potencia vs H. virescens se probó un rango de velocidad. Tres hojas de algodón recientemente cortadas por tratamiento tenían 0.1 ml del tratamiento apropiado aplicado por pipeta al centro de la superficie axial de cada hoja. La gota se diseminó después sobre un área circular en exceso del diámetro de una minicazuela con una brocha de pintor fina
(una brocha de pintura reciente usándose para cada compuesto para evitar contaminación) . Las hojas se dejaron en una campana para humos solo el tiempo suficiente para que seque
el depósito de la superficie pero se tomo cuidado para evitar el excesivo marchitamiento de la hoja. Una vez secas las hojas se colocaron, con la superficie contaminada hacia abajo sobre la minicazuela apropiadamente marcada y una tapa cerrada sobre ella. Las minicazuelas se colocaron en charolas de plástico y se mantuvieron en una temperatura controlada 25-37°C. Después de tres días se contó el número de larvas vivas restantes y se determinó el porciento de mortalidad. En la prueba de potencia de H. viresces los datos de prueba se corrieron a través de un paquete de análisis logit para establecer la LC5o- Los resultados para 4 plagas de lepidopteran se muestra en la Tabla 2. Tabla 2
b) Citotoxicidad celular Se usaron dos líneas de células para determinar si el péptido del Ejemplo 2 era citotóxido a células de mamífero (células MEL) o células de insecto (células Sf21) . Las células MEL y las células Sf21 se cultivaron en medio de DMEM
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y TC100 respectivamente en placas microtítulo de 96 pozos y se incubaron con la concentración apropiada de péptido. Las células se contaron por muerte celular visible después de 24 horas y la biabilidad y el crecimiento se valoró después de 3 (células MEL) o 4 (Sf21) días usando la reducción de MTT (bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio) para formar un formazan púrpura insoluble como un marcador para células metabólicamente activas. A la velocidad más alta probada (100 µg/ml) el péptido no inhibió el crecimiento celular o causo ningún efecto citotóxico en ninguna línea celular. Ejemplo 5 Comparación de secuencias de proteínas con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando el Algoritmo FASTA: Una búsqueda comparativa FASTA de la SEC. DE IDENT.
NO 1 con una base de datos de secuencias de proteína se llevó a cabo. La SEC. DE IDENT. No. 1 se comparó con todas las secuencias de proteínas públicamente disponibles usando el método FASTA (Versión 3.0t82 de FASTA noviembre 1 de 1997 Referencia: W.R. Pearson & D.J. Lipman PNAS (1988) 85:2444-2448) . Los resultados se dieron en la forma de una cuenta opt. Ejemplo 6 Caracterización de la secuencia de codificación natural del péptido de la SEC. DE IDENT. No. 2
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Cosecha del Material Una cepa de Paecilomyces farinosus que tiene actividad insecticida se cultivó en Sabouraud Dextrose Broth (Difco Laboratories: lOg Bacto Neopeptone, 20 g Bacto Dextrose por litro de agua) durante 5 días a 24°C con agitación a 180 rpm. El cultivo se peletizó (8000 trpm, 10 minutos y se almacenó a -80°C hasta uso. Extracción de ARN El material cosechado se molió en un polvo fino usando una manilla y mortero bajo nitrógeno líquido. El ARN se extrañó a partir de 1 g de pella de hongo usando el equipo
Qiagen Rneasy, siguiendo las especificaciones de los fabricantes . La fracción de ARN total se eluyó a partir de la columna de purificación Rneasy en 1 ml de agua. El Poly(A)+ARN se aisló a partir de 700 µg ARN total usando el sistema de aislamiento de ARNm Promega PolyATract I, seguido por las especificaciones de los fabricantes. La fracción
Poly(A)+ARN se eluyó a partir de las cuentas magnéticas en 1 ml de agua, y se concentró a 15 µl (de aproximadamente 0.5 mg/ml) por precipitación con etanol. Las muestra de ARN se almacenaron a -80°C hasta uso. En las siguientes reacciones, los cebadores y las sondas usadas se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3 Secuencias Cebadoras/de Sonda
donde "F" designa un cebador hacia delante y "R" designa un cebador inverso. RACE PCR Síntesis de ADNc de primera hebra El equipo Clon Tech Advantage RT para PCR se uso para esto, de acuerdo con las especificaciones del fabricante . Se templaron 20 pmol de cebador oligo (d)T 'Anchorl' a 1 µm de ARN total en un volumen total de 13.5 µm calentando a 70°C durante 2 minutos y extinguiendo rápidamente sobre hilo. Se agregaron los siguientes componentes de la reacción : 4 µl de regulador de reacción 5x; 0.5 µl de inhibidor de Rnasa, 1 µl de transcriptasa inversa MMLV; 1 µl de dNTP 10 mM . La reacción se incubó 42 °C durante 1 hora, y la reacción se detuvo desnaturalizando la enzima 95°C durante
5 minutos. Se agregó 80 µl de Rnasa libre de agua y el ADNc se almacenó a -80°C. 3 ' RACE PCR Se usaron 5 µl de la mezcla de reacción a partir de la reacción de síntesis de ADNc de primera hebra como una plantilla con diversas combinaciones de conjunto cebador para amplificar el extremo 3' del péptido que codifica ADNc. Los cebadores (véase Tabla 3) usados se degeneraron, y se
diseñaron sobre la secuencia de aminoácidos conocida del extremo N-terminal del péptido maduro para permitir la amplificación selectiva. Las reacciones PCR se realizaron usando Ready-To-Go PCR Beads (ímersham Pharmacia Biotech) . Estas contienen todos los componentes necesarios para una reacción PCR como una cuenta en un tubo de 0.5 ml . Se agregaron los siguientes componentes: Plantilla de ADNc 5 µm de la mezcla de reacción a partir deJ paso de síntesis ADNc. Cebador hacia delante 25 pmol; Cebador inverso 25 omol; Agua Estéril a un volumen final de 25 µl . Condiciones de ciclo de PCR (1) 95°C 1 minuto; (2) 9 °C 1 min; (3) 64°C* 1 pan; (4) 72°C 1 mm (pasos 2-4 durante 30 ciclos); (5) 72°C 10 mm ( *temperatura de templado variada dependiendo del con]unto cebador) . Los productos PCT se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa en un gel al 1% de agarosa en regulador de TBE. Los productos de PCR discretos se clonaron en pCR2.1 TOPO usando el equipo de clonación Invitrogen TOPO TA de acuerdo a la especificación del fabricante. Cada ligadura contenía: 1 µl de producto PCR; Iµl de vector pCR2.1 TOPO (Figura 5); 3 µl de agua estéril y se incubo a teirperatura ambiente durante 5 minutos. 2 µl de cada mezcla de ligadura se transformaron en ceJulas competentes TOP10 por choque de calor a 42°C durante 30 segundos. Seguido
por incubación sobre hielo durante 2 minutos . Las células transformadas se dejaron expresar beta lactamasa por incubación a 37 °C en medio de SOC (2% de triptona, 0.5% de extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2.5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgS04, 20 mM de glucosa) durante 1 hora con agitación a 225 rpm. Las células se sembraron en placas de Lucía-Betani Agar (1.0% de triptona, 0.5% de extracto de levadura, 1.0% de NaCl, 15 g/L de agar, 0.006% de X-gal, 0.15 M de 1PTG) que conteniendo 50 µg/ml de canamicina para selección transformante de plásmido y permitir la identificación de aquellos aislados que contienen TOPO TA recombinante. Se seleccionaron colonias blancas discretas a partir de diferentes reacciones de PCR TOPO TA, se cultivaron durante la noche en 5 ml de Luria-Bertani (1.0% de triptona, 0.5% de extracto de levadura, 1.0% de NaCl, en agua, pH 7.0), conteniendo 50 µg/ml de canamicina. El ADN plásmido se extrañó a partir de cultivos usando el equipo de purificación de ADN izard (Promega) , siguiendo las especificaciones del fabricante. El ADN se eluyó en 50 µl de agua estéril. El ADN plásmido se digirió con EcoRI para conformir la presencia y tamaño ele inserto. 3 µl de ADN PLásmido; 1 µl de EcoRI (Kramel Biotech); 1 µl de Regulador 6 de Restricción lOx (Kramel Biotech) ; 5 µl de agua estéril. Los digeridos se incubaron a 37 °C durante 2 horas y
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la presencia o ausencia y tamaño de los insertos determinado por electroforesis en gel de agarosa. En base a estos análisis, los plásmidos recombinantes se seleccionaron para secuenciarse sobre un secuenciador de ADN Perkin Elmer ABI377XL con el equipo dispuesto de reacción de secuencíación de ciclo terminador de tinte ABl Prism conforme al protocolo del fabricante. 4 pmol de cebador M13 Univ o M13R; 5 µl de ADN; agua estéril a 12 µl. La secuencia de codificación del péptido de la SEC. DE IDENT. No. fue identifícable por traducción de la secuencia de nucleótidos dentro de la secuencia de aminoácidos en todas las estructuras de lectura posibles y comparación de esta secuencia con la secuencia de aminoácidos conocida del péptido. Este análisis usó el software de análisis de secuenciaADN Star (SeqMan, EditSeq, Macaw, VectorNTI) . 5 ' RACE PCR Se usó una propuesta de ligadura ancla (Troutt, A.B., et al., Proc . Na ti . Acad . Sci . USA . 89, 9823-9825) para obtener la secuencia de nucleótido de la mitad 5 ' del gen 524445. Esto vincula la unión de un cebador ancla específico al extremo 5' de los ADNc de hebra primera. El uso de esta secuencia junto con el ancla ARNm específico para el péptído de los cebadores 3' complementarios a SEC. DE IDENT. No. 2 seguido por la amplificación selectiva del extremo 5' de ADNc que codifica correspondiente.
Templado de Cebador Los oligonucleótido complementarios Anchor3 y unión
Anchor3 se templaron uno con otro en relación equimolar en tres concentraciones finales diferentes (InM, lOOnM, lOmM) . Las mezclas de oligonucleótido se calentaron a 95°C y se enfriaron lentamente a 45°C para templar. (2) Ligadura del cebador templado al ADNc El cebador unido es complementario ai cebador ancla, pero contiene una extensión 3' de 5 bases adicionales completamente degeneradas es decir sintetizadas con A, G, C y T en cada posición. Esta 'cola' degenerada permite a los cebadores de unión individuales templarse con el término 3' de cualquiei molécula de ADNc. Un grupo amido del extremo 3' del cebador bloquea la síntesis de ADN. Un grupo fosfato en el extremo 5' del cebador ancla permite la ligadura de esto al extremo 3 ' de las moléculas de ADNc para proporcionar una secuencia de reconocimiento específica para amplificación PCR. Las reacciones para ligadura de ios cebadores ancla templados a las preparaciones de ADNc de hebra primera contenían: 5 µl de mezcla de reacción a partir de ía síntesis de ADNc de hebra primera; 30 mM de Tris HCl (pH 8); 10 mM de MgCl2; 10 mM de Ditiotreitol; 0.5 mM de ATP; 1 µl de T4 ADN ligasa (4 U/µl) (Kramel Biotech); 1 µl Agua; 1 µl de cebadores ancla templado (concentraciones finales de 100 M, lOnM, lmM) .
Las reacciones se ciclaron durante la noche como sigue 25°C 5 minutos velocidad de rampa lenta 4°C 5 minutos Las reacciones se reunieron, se incubaron a 95°C durante 5 minutos y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Después de descongelar sobre hielo, se eliminaron los cebadores en exceso por purificación a través de una columna de limpieza PCR izard (Promega) usando las especificaciones del fabricante. Los ADNc se eluyeron en 40 µl de agua . (3) RACE PCR Las reacciones PCR se dispusieron usando el ADNc enlazado al ancla como una plantilla, cebadores hacia delante específicos basados en esta secuencia ancla, y cebadores específicos basados en la secuencia de gel del péptido de la SEC. DE IDENT. No. 1 identificada previamente por 3 ' RACE . Las reacciones PCR se realizaron usando Ready-To-Go PCR Beads (Amersham Pharmacia Biotech) como se usó previamente para 3' RACE. Los componentes agregados a las cuentas de PCR fueron: 1 µl de plantilla de ADNc con Anchor3 templado en el extremo 3' del ADNc de hebra primera; 20 pmol de cebador hacia delante; 20 pmol de cebador inverso; agua estéril hasta un volumen total de 25 µl .
Las condiciones de ciclo de PCR fueron: (1) 95°C 1 minuto; (2) 95°C 1 minuto; (3) 58°C* 1 minuto; (4) 72°C 1 minuto (pasos 2-4 durante 30 ciclos); (5) 72°C 10 min (^temperatura de templado variada dependiendo del conjunto cebador) . Los productos PCR se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa y clonados TOPO como se describió anteriormente. El ADN plásmido se extrajo a partir de clones que llevan plásmidos recombinantes candidatos por miniprp xzard, digeridos y secuenciados EcoRI como se realizó previamente para los clones 3 ' RACE (descritos anteriormente) . Biblioteca de ADNc Construcción de Biblioteca Se construyó una biblioteca de ADNc del hongo Paecilomyces fapnosus usando la síntesis de ADNc la bda-ZAP y el equipo ZAP-ADNc Gigapack III Gold Cloning a partir de Stratagene, a conforme a las especificaciones del fabricante a menos que se indique. Se sintetizó ADNc de hebra doble usando 5 µg del ARNm del péptido SEC. DE IDEN. NO. 2 (véase en lo anterior) como una plantilla. Esto involucra la síntesis de ADN de primera y segunda hebra, despuntando los términos de ADNc, ligadura de adaptadores, y digestión con enzimas de restricción específicas para producuir "extremos adhesivos apropiados para clonación direccional. Se uso una columna de Sephacryl S-400 HR MicroSpin (Amersham Pharmacia
Biotech) para eliminar el exceso de adaptadores más que el paso de fraccionación de tamaño sugerido en el equipo. El medio de filtración en gel proporcí onado en le equipo6* (sepharosa CL-2B) separa moléculas sobre La base de tamaño con un corte de 400 bp. Puesto que el peptido insecticida maduro es de solamente 33 aminoácido de largo, es altamente probable que el gen pueda ser más pequeño de 400 bp y abría sido seleccionado en contra usando eí medio de filtración de sefarosa. Los ADNc se ligaron dentro del vector Uni-ZAP XR y
10 se empacaron en un fago. El título de la biblioteca fue 2.5 millones de clones, con un tamaño de inserto promedio de 700bp que varia 150 bp a 2 Kb . Sel ección de biblioteca Se sembró un total de 500,000 placas sobre placas
15 de Luria-Bertam Agar conforme a la especificación del fabricante de la biblioteca de ADNc. Se hicieron alzas por duplicado de las placas sobre membrana de nitrocelulosa (Hybond-N, Amersham Pharmacia Biotech) . Las membranas se prehibpdizaron en solución de
20 hibpdización de Denhardts (SSPE 5x, Reactivo ele Debhardt 5x [Reactivo de Denhardt 50x; 5g de Ficoll, 5g de polivimlp rrolidona, 5g de albúmina de suero bovino, agua estéril hasta 500 ml] , 0.5% de SDS, agua estéril hasta 1 L) conteniendo 200 µl de ADN de esperma de salmol (10 mg/ml) que
25 había sido desnaturalizado hirbiendo durante 10 minutos,
durante 2 horas a 65°C. Se preparó una sonda radioactiva marcando en el extremo un oligonicleótido específico para la secuencia de codificación de un péptido de la SEC. DE IDENT. No. 25 ng de Oligonucleótido (445-Fll); 1 µl de m Regulador de Cinasa polinucleótido (Kramel Biotech); 1.5 µl de T4 Polmucleótido Cinasa (Kramel Biotech) ; 5 µl de gamma 32P dATP; agua estéril hasta 10 µl . Las sonda se incubo a 37°C durante 5 horas. La sonda se agrego a 50 ml de solución de hibridización de Denhardts y se hibridizó durante la noche a 65°C. Las membranas se lavaron en una solución de SSC O.lx, 0.1% de SDS durante 4 x 15 minutos para eliminar sondas sin unir. La exposición a la película de rayos x identificó placas positivas que contienen proteínas que codifican secuencia representada como SEC. DE IDENT. No. 2. Las placas positivas se sembraron a partir de las placas de agar originales en 1 ml de regulador SM (5.8 g de NaCl, 2g de MgS04.7H20, 50 ml 1M de Tris-Hcl pH 7.5, 5 ml de gelatina al 2%, agua esterial hasta 1 L) que contiene 20 ml de cloroformo y se arremolinó. El ADN de fago se dejo entrar al regulador de fago incubando a 40°C durante la noche. Las muestras del fago se diluyeron después y resembraron para obtener aproximadamente 200 placas por placa. El alza de placa y el procedimiento de hibridización anterior se repitió para identificar positivos. El proceso se exhibió durante 3 ciclos de selección
hasta que las placas fueron puras. El autocorte de 12 placas positivas candidato en colonia se realizó como por las especificaciones de Stratagene con el equipo de biblioteca de ADNc. Las colonias candidato se cultivaron en 5 ml de medio Luria Bertani que contiene 100 µg/ml de ampicilina, ADN plásmido extraído usando el equipo minipred de Promega Wizard y los insertos secuenciados usando cebadores Inversos M13 Universal y M13 (véase anteriormente para detalle de todo) . Secuencia de Nucleótido La secuencia del nucleótido del péptido de SEC. DE IDENT. No. 2 se muestra como SEC. DE IDENT. No. 14 y también en la Figura 2. EL codon de iniciación de traducción putativo y el codon de alto se muestran en itálicas. La secuencia que codifica para el péptido maduro se subraya. La secuencia en la Figura 2 indica que existe aproximadamente un secuencia que no codifica de 110 nucleótidos 5' y una secuencia que no codi tica de 160 nucleótidos 3' . Parece hacer un péptido 5' señal de 17 aminoácidos de la secuencia de codificación madura. Se predijeron sitios de desdoblamiento de secuencia de señal potenciales en base al método de von Heijne, G. (1986) . Nucleic Acids Research 14, 4683. El sitio de desdoblamiento potencial se indica por una flecha que apunta hacia abajo. Es probable que un evento de procesamiento secundario elimine el
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péptido <señal a partir del péptido maduro, por ejemplo por un desdoblamiento de péptidasa señal. Ejemplo 7 Expresión del péptido en maíz El Barrenador Europeo del Maíz ( Ostrínia nubilalis) y por lo tanto maíz, Zea mays, que ha sido transformado como para expresar este péptidose esperaría estar protegido en contra de esta plaga. Las construcciones adecuadas para la expresión en maíz pueden resumirse como sigue: Const rucción Promotor Péptido señal Gen Terminador
1 Maize Ubi SEC. DE IDENT. SEC. DE IDENT. nos NO 17 NO 14 2 Maize Ubi SEC. DE IDENT. SEC. DE IDENT. nos NO 15 NO 14+ 3 Maize Ubi SEC. DE IDENT. SEC. DE IDENT. nos NO 19* NO 14+ *Este pépticlo señal contiene un sitio Ncol interno que puede mutar (por ejemplo CCATGG- CTATGG) para destruirlo si se requiere Nccl para clonación. +La secuencia de codificación natural puede modificarse de acuerdo cor la degeneración de código genético, y en particular para el propósito de obtimización de codón en maíz . El péptido señal puede fusionarse al gen maduro por
ejemplo usando una propuesta de PCR de traslapamiento como se ilustra en la Figura 2. La fusión se diseña adecuadamente con sitios de restricción para permitir la clonación dentro de vectores monocot . Por ejemplo, puede comprender los siguiente: 5' Ncol -Kpnl Señal Gen SacI-HindIII 3'
La fusión del gen señal de longitud completa puede ligarse entie el promotor ubicuo de maíz y el terminador nos dentro de un vector de cadena principal que contiene selección PAT (resistencia a herbicida fosfinotricina-basta) . Estas construcciones puedne usarse para transformar células de maíz las cuales pueden cultivarse después dentro de callus como es bien conocido en la técncia. El callus transformado puede someterse a una prueba transiente de callus de maíz y/o un bioensayo in vi vo para confirmar la expresión y actividad del péptido. Ejemplo 8 Expresión del péptido en Algodón El péptido de la invención tiene buena actividad en contra del Gusano Guerrero de la Remolacha { Spodoptera exigua ) que es una plaga principal del algodón. Así el algodón Gossypium hirsutum, que ha sido transformado para expresar este péptido sería protegido en contra de esta plaga . Las construcciones adecuadas para uso en la
transformación en este caso pueden resumirse como : Cons trucción Promotor Péptido señal Gen Terminador
4 RolDFd SEC. DE IDENT. SEC. DE IDENT. Inhibidor II de NO 23 NO 14 proteasa de papa
5 RolDFd SEC. DE IDENT. SEC. DE IDENT. Inhibidor II de NO 20 NO 14 proteasa de papa
6 RolDFd SEC. DE IDENT. SEC. DE IDENT. Inhibidor II de NO 24* NO 14 proteasa de papa
El péptido señal puede fusionarse al gen maduro usando una propuesta PCR de traslapamiento como en el Ejemplo. En este caso, la fusión se diseña adecuadamente con sitios de restricción para permitir la clonación dentro de vectores dicot . La fusión del gen señal de longitud completa puede ligarse dentro de un vector doméstico entre el promotor RolDFd y el terminador de inhibidor II de proteasa de papa. El cásete completo podría cortarse después usando enzimas de restricción y ligarse dentro de un vector binario apropiado. Las construcciones pueden probarse después usando métodos convencionales . Otras modidicaciones de la presente invención serán aparentes a aquellos expertos en la técnica sin apartarse del alcance de la invención. Ejemplo 9 Actividad insecticida de la combinaciones de proteínas Se dispenso la dieta artificial del Barrenador Europeo del Maíz (ECB) previamente preparada en pequeñas
cantidades dentro de tubos y se mantuvo en un baño de agua caliente a 70°C. Se agregó a cada tubo conteniendo 975 ml de la dieta, 75 ml de la muestra de prueba apropiada. Las muestras de prueba comprendieron una mezcla de la proteína cryl Ial (SEC. DE IDENT. No. 54) y la proteína representada como SEC. DE IDENT. No. 2 (la proteína R524445) . La "dieta incorporada" se mezcló bien y se pipetearon después alícuotas de 180 ml sobre 1006 cajas de petp Falcon™, dando cinco réplicas para muestra. Las cajas se plagaron 1-5 horas después que la dieta se dispensa con cinco primeras larvas instar por caja/réplica y después se tapan. La prueba se mantuvo en la oscuridad a 27 °C y 70-80% de HR y los insectos se valoraron 5 días después del tratamiento por mortalidad. Los resultados se muestran en la Tabla 4 siguiente: Tabla 4
LISTA DE SECUENCIA < l l ? > ??N'?CA L IM ITED <12C> PROTEÍNAS INSECTICIDAS A PARTIR DE PAECILOMICES Y COMBINACIONES SINERGISTICAS DE LAS MISMAS <130> PPD50-J31/WO <140> <14I> <150> G3991S215.9 <151> 1999-00-29 <150> G?9930S3Ó.9 <151> 1999-12-23 <1Ó0> 65 <170> Pacentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Paecilc yces sp . t <220 <221> UNSURE <222> (1) . (2) <223> Xaa is any ammo acxd <400> 1 Xaa Xaa He Cys Thr Pro Ala Gly Val Lvs CV? Pro A.la Ala Leu Pro 1 5 lo 15 Cys Cys Pro Gly Leu Arg Cys He Gly Gly Val Asn Asn Lys Val Cys 20 ' 25 * 30 Arg
<210> 2 <211> 33 < 12 > PRT <213> Paecilomyces sp . <400 2 Gl/ Lys He Cys Tr.r Pro Ala Gly Val Lys C/s Pro Ala Ala Leu Pro 1 S ic 15 C/s Cys Pro Gly Leu Arg Cys He Gly Gly Val Asr. Asr. Lys Val Cys 20 25 ' 30
<210> 3 <-211> 3? <2i:> ??.-; <212> Paí cilcp < 220 > <¿- ? > U?:S"??
<::: (i: . {2) <223> Xaa is anv a mo acid <400> 3 Xaa Xaa Gly Lys He Cys Thr Pro Ala Gly Val Lys Cys Pro Ala Ala L 5 10 15 ^eu Pro Cv; Pro Glv Leu Arq C Lv.'S: i.. ' i ;lv Glv al Asn Asr. Lys 30 Val Cys Arg
:210> :2U> 332 .2 2> DNA ,213> Paecilomvces so. <400> 4 ggcaagaccc gcactcctgc tggagctgca cgcattttca tccatttcct ycaccacccc 60 tccaacacga agcaactttc tcttccctct agaaatgtcc cgcggccccc ccttgctgcc 120 ccggacctcg ctgcaccggc ggcgccaacg taagtcacca tggatccggc aagcgagacc 180 ataacacgac gcagtatact aaccctggcc gttatagaac aaggttgcga gtcgacatgc 240 t tacaaccc ctacaaacgc gcgcactaat gacaacggta gtgccggcaa ttccagtgcc 300 gcaacttttg agcgcgggat aagtatgctt cg 332 0> 5 2I1> 320 ^212^- DMA <213> Paecilomyces sp <400> 5 gggaaaattt gtacgccggc gggggttgta cgtattctca tccatttcct ccaccacccc SO tctaacatga agcaactctc tcttctctct agaaatgtcc cgcggctctt ccttgctgcc 120 ccggacctcg ccgcatcggc ggcgccaacg taagtcacca ccctgacacg acgtgaaggc ISO aatgtaccga ccctggccgc tatagaacaa ggttgtgagt cgacatgttc tacaacctcc 240 acaaacgcgc gcactaatga caacggtagt gccggtaatt ctagcgtcgc aactcctgag 300 cgt ggacaa gtaCgcctcg 320
<210> S <211> 320 <212> DNA <213> Paecilomyces sp . <400> 6 gggaaaatct gtacgccggc gggggttgta cgtattttca tccatttcct ccaccactcc 60 tctaacatga agcaacttcettce ttccttttccttcccccctt aarraaaaaattggttcccc ccggccggggccttcctctc ccccccttggccttggccc 120 ccggacttcg ctgcatc:99c ggcgccaacg taagtcacca tcct acacg acgtgaaggc 130 aa gcactga ccccggcrceggt ttaattaaggaaaaccaaaa ggggttccggttggaaggt cgacatgttt tacaaccccc 240 acaaacgcgc gcactaatga caacggtagt ccggtaatt ctagtgtcgc aactcttga 300 cgtgggataa gtatgcctcg 320
<210> 7 <211> 174 <212> DNA <213> Arcificial equence <220> <223> Descripción of Artificial Sequence - Synthetic polynucleotide coaon optimised <400> 7 acgggcggca gcggcagggc tgctctgccg ctgyccctgg tggccgtgag ccCggccgtg 60 gagatecagg ccggcaagat ctscaccccc gccggcgtga agcgcccggc cgccctcccg 120 tgctgcccgg gcccccgctg caccggcggc gegaacaaca aggcgcgccg ccgi 174
< ; i o > s ^ 2 i 1 > 174 •;212> DNA v-213> Artificial Sesuence :220> ,223> Descripción oc Artificial Seq epc jvnt átic polvnucleotide codon oocimisec 4Q0> S atgggtggca ccsgcagggc tgctctgctg ctggccctgg tggccgcgag cctggccgtg 60 gagacccagg ccggcaaaat ttgtaccccg gccggcgtga agcgcccggc cgccctcccg 120 tgttgcccgg cctcaggtg tattggtggt gccaataata aa tgtgccg ccga 17- 210 > 9 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Descripción of Artificial Sequence : Synthecic sequence containing mtron sequence <400> 9 atgggtggca gcggcagggc tgctctgctg ctggccctgg tggccgtgag cccggccgtg 60 gagatecagg ccggcaagat ccgcactcct gctggagtcg cctgtttccg ctcccacctc 120 cgatatatat acaataatCa tcattaatta gtagcaacat aatacttcaa atatcttttc 180 caaaataaaa gaatgtagta tatageaatt gcttctctgc ag ccataag tgcgcacact 240 ttaatttaca acttttctaa tatatgacca aaacatggcg atgctcagaa atgtcccgcg 3C0 gctcttcctt gctgccccgg acttcgctgc atcggcggcg tcaacaacaa ggtttgccgg 360 taa 363
<210> 10 <211 369 <212> DNA <213> .Artificial Sequence
Descripción of Artificial Sequence . SyntheCic sesuence <400> 10 atgggtggca gcggcagggc tgctctgctg ctggccctgg tggccgtgag cctggccgtg 60 gagatecagg ccccctacgg caagatctgc actcctgctg gagttgtttg tctctgctcc 120 tacctttgat atatatataa taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatac 180 ttttttcaaa ataaaagaat gtagtatata ccaatcgctt ttctgtagcc tataagtgtg 240 tatatcttaa tttataactt ttctaatata tgaccaaaac atggtgatgt teagaaaege 300 cccgcggctc ttccttgcts ccccggactt cgctgcaccg gcggcgtcaa caacaaggct 3S0 tgccggtaa 369
< 210 > 11 <211> 363 <212> DiJA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : SyntheCic seauence < 400 > 11 acgggcggca gcg cagggc tgctcC ctg ctggccctgg tggccgtpag cccggccgc 60 gagatecagg ccccctacat ctgcactcct gccgg.- gttg cttgttcctg cttccacccc L¿f tgatatatat ataataatta tcattaatta gtagtaatat aatatttcaa acactcttcc 160 caaaataaaa gaatgtagta tatageaatt gcccccccgi. ag ctataag tgtgtatatt 240 ttaatttaca acttttctaa tatatgacca aaacatggtg acgtctagaa atgtcccgcg 300
j| ¡i?já^?
gcggcg teaacaacaa ggcttgccgg 360
<210^ 12 < ib 363 212> DMA •=213> Artificial sauenc- .220. .223 > Descripción of Artificial Sequence =yntnecic sequer.ce concaining mcror. anc coaon optimised <400> 12 atgggtggca gcggcagggc tgctctgctg rtggccct g tggccgtgag cctggccgcg 60 gagatecagg ccggcaagat ct Tcccgcgtgg tttgcccctg cctctacctt 120 tgatatacat acaataatta tcaccaatta gtagcaacac aatatetcaa atattttttt ISO caaaataaaa gaatgtagta tatageaatt gctttcctgc agttcataag cgtgtacacc 240 ecaaettata acttttccaa taCacgacca aaacatggtg atgtttagaa gtgcccggcc 300 gccctcccgt gctgcccggg ccccr ccgc atcggcggcg tgaacaacaa ggtgtgccgc 360 csa 363 <210> 13 <211> 439 <212> DNA <213> Paecilomvces SD. <400> 13 cctacttctt catctcacgc catatatect cccaaaatca cacctcttce ttcaccatgc 60 aaatctccgc cg cactgtc gcacccttcg ccagcgccgc catggccggc aagatctgca 120 ctcctgctgg agttgtacgt attttcatcc at tcccyca ccactcctct aacaegaage 180 aactttctcc tccccctaga aatgtcccgc ggctcttcct tgctgccccg gacttcgctg 240 caccggcggc gtcaacgtaa gtcaccatgg atctggcaag cgagaccata acatgaegea 300 gtacaccaac cctggccgtt atagaacaag gttgtgagtc gacacgttkt acaacctcta 360 caaacgcgcg cactaatgac aacggtagtg ccggtaattc tagtgtcgca acttttgagc 420 gcgggataag taCgct teg 439 210> 14 <211> 102 •-212> DNA <213> Paecilomyces sp < 400 > 14 ggcaagatcc gcactcctgc tggagttaaa tgtcccgcgg ctcttccttg ctgccccgga 60 cttcgctgca CcggcggcgC caacaacaag gtttgccggt aa 10Í <210> 15 <211> 84 <212> DNA <213-> Dahlia so <400> 15 atggtcaaCa gacctgctgc tCtCCctgct tttgttctta ttctttttgt tttggctac; 50 CcagaCaCCg cCccCgtttc agga 34 <210> 16 <211> 87 ;212> DNA < 213 Arcifici al Sequence :220 :223> Deccni artificial Sequence • Radish sigr sequenc <400> ÍS atggcCaagt c gcttctat tactgctctt ttc tttg tg cacttgttt: gtttgctgca 60 tttg -.actc cacccatggt tgaaqct 87
-
<21ü 17 211> 72 <212> DNA <213> Zea mays <400> 17 atgggtggca gcggcagggc tgctctgctg etggccctgg tggccgcgag cctggccgtg 60 qaga ccagg cc >- <210> 13 <211> 90 <212> DNA <213> Nicociana so <400> ÍS atgggatttg ttctcttttc acaaccgccc :cttc ttgtctct rttctctca 60 ttcctagtaa tatcccactc ttgccgtgcc 90 210- 19 <211> 51 <212> DMA <213> Paecilomvces <400> 19 atgcaaacct ccgccgtcat tgtcgcactc ttcgccagcg ccgccatggc c 51
<210> 20 211> 28 <212> PRT 213> Dahlia sp <400> 20 Met Val Asn Arg Ser Val Ala Phe Ser Ala Pne Val Leu He Leu Phe 1 5 10 15 Val Leu Ala He Ser Asp He Ala Ser Val Ser Gly 20 25
<210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> A.rtif cial Sequence <220> <223> Descripción of Artificial Sequence Radish protein target sesuence <400> 21 Met Ala Lys Pne Ala Ser He He Ala Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Ala Phe Glu Ala Pro Tnr Met Val Glu 20 25
<210> 22 <21i-> 24 <212> PRT <213> Zea mavs <400> 22 Me Glv ( ;ly ?ei Giv Arg Ala A.la Leu Leu Leu Ala Leu Val A.la Val 5 10 15
i t.í *. sátMl£afc¿. fe AUBtim* i
-0-
<210> 23 •.211=. 30 <212> PRT <2i3> Nicociana sp <-00> 23 Met Gly Phe Val Leu Pne Ser Glp Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Set 1 * 5 10 15 Thr Leí Leu Leu Phe Leí Sei r.is Se Cv; ?g Ala 20 25 30
<21Q> 24
•-213-> Paecilomyces sp <400> 24 Mee Glr. He Ser Ala Val He Val Ala Leu Pne Ala Ser Ala Ala Met 1 5 10 15 Ala
<210> 25 <211> 44 212-- DNA <213> Artificial Sequence <220> Descriotion of Artificial
Pnmers <400^ 25 tcgggcccgc atgaattcgc ggccgcattc tttttttttt tttt 44
<21C- 26 <2il> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DescriDtion of Artificial Sesuence Pnmers <400> 26 tcgggctcgc atgaattcg 19
<210> 27 <21i> 13 <212> DMA <213> Artificial Sequence <220> <223> Descpotion of Arciticial Sesuence Pnmers -400> 27 atgaacccgc ggccgcat 18
<210> 23 <21H 21 <21?^ D A
"-"i-t rt^-f - 1 n? l' m '"'V-^HHFtHH
-7-
•-2L3-> Artificial Sesuence 220> •223> Descripción of Arciricial Sequence Primera 400 > 2 S tcgggctcgc atgaattcgc g <210> 29 <211> 21 <- 12> DNA ;213> Artificial Sesuence <220> <223> Description of Artificial Sequence Ppmers <400> 29 ctcgcatgaa ttcgcggccg c <210> 30 <211> 17 < 212 > DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Descripción of Artificial Sesuence Primers < 400 > 30 acncgyacnc cngcngg 17 <210> 31 <211> 20 <212 DNA .213 Artificial Sequence <220> <.223> Descripción of Artificial Sesuence Ppmers <400> 31 athtgyacnc cngcnggngt 20 ^210> 32 <211-> 17 <212> DNA <213> Artificial Sesuence <220> <223> Descripción of Artificial Sequence . Primers <400> 32 acnccngcng gngtnaa 17 <210> 33 <21I> 17 .212^ D17A <213> A.rtificial Sesuence <220> <2?3-> Description of Artificial Sesuence Primers <400> 33 ccntgytgyc cnggnyc 17 < ? 10 - 34 <211-- 16 <212^ DM»
-S- 213> ArtLticial Sequence <220> 223> Descripción of Artincial Sequence Primers 100 > 24 tr.aarcgyac hggngg <210 35 <211 20 <212> DNA --213-» Art-£?c?ai Sequerce ^220> <223> Descripción of Artiricial Sequence Ppmers <400 35 sgngtnaaya ayaargtntg 20 <210> 35 <211> 25 <212 DNA <213 Artificial Sequence 220> <223> Descripción of Ar ificial Sesuence Primers < 400 > 35 aarathcgya ciccigcigg ígtiaa <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence Primers <400> 37 ccigciggig Ciaarcgycc ígcigc <210> 3S <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 <223> Descripción of ArCificial Sesuer.ce - Primers <400> 38 tgyccigcig ciyticcitg ytg/cc <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Descri tion of
Sequence ?r?ters <400> 39 cgyatnggig cxqtic yea yaar t <210^. 40 <211> 21 <212 DNA
I U U üétx fiit •' j — '*- ^-x aaétaaÜjtti ¡X ^^ ^^JM^JÉMlLb
-o- 2U^ Are i ricial Sequep.ce ^ 2 > <223-> Descpption of Arci||cial Se -ence Ppmers <.400^ 40 taaatgcccc gcggctcttc c <210> 41 <211> 21 <212> DNA 213> Artificial Secuence <220> <223> Descpption of Arcicicial Sesuerce Priméis <400> 41 cggcececcc ctgctgcccc g <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Arcificial Sesuence <220> <223> Description of Artificial Sequence : rimers <400> 42 tgctgccccg gacttcgccg c 21
<210> 43 <211> 27 <212> DMA <213> Artificial Sesuence <220> <223> Description sf Artificial Sequence Prime <400> 43 ggttcaacca cccaagtttg agnnnnn 27 210> 4i <211, 2? <212> DNA <213> Artificial Seqaence <220> <223> Description of Artificial Sequence Ppmers <-400> 44 ctceaacttg ggtaattaaa cc -.210> 45 <211> 18 <212> DNA ^213 Artificial Sequer.ce <220 ,223> Descripción of Artificial Seque ice Primers <400 45 ggttcaaLta ccceagtt <210> 45 <211,- 18 <212> DNA
^i a,. ? .. ¿Jto *L* ^^Li^ ~ -*l?^^
•10-
Arcificial Sesuence :20> > Descriotion of Artificial Sesue ce Primers ^400> 46 taattaccca aqttt 18 -0> 47 •c2H> 22 <2-2> DN3 <213> Artificial Sesuence -220- -223> Descripción of Artificial Seq-.=nce Pprrers <400> 47 ggtttaacca cccaagtttg ag <210> 48 <211> 23 <212> DNA 213> Arcificial Sequence <220> <223> Descripción of Artificial Sequence Pnmers <400> 48 caiacyttrt trcciacicc ice 23 <210-> 49 <211> 21 <212> DNA .213> A.rCificial Sequence ; 220 -> <223> Descripción of Artificial Sesuence Pnmers < 400 > 49 atgcagcgaa gtccggggca g <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sesuence <220> <223> Description of Artificial Sequence Ppmers < 400 > 50 ggggcagcaa ggaagagccg c 21 <210- 51 211 > 21 <212> DNA --213> Artificial Sequence <2?0 223^ DeacriDtion of Artificial Sesuence Primers <.<O0> 51 aagagccgcg ggacatt aa c 21 <210> 52 < 211 > 49 < 12> DNA
• 1 1 -
: 13 - Arti f icial Sesuence . 220 ; <.223 -- Descripc ión of Art i f ic ial Sequence Primers ,-100 - 52 agcraaacgt cccgcggccc tcccecgctg cc cggaccc cgctgcatc -210> S3 <211> 1S 212> DNA <213> Artificial Sesuence <220- 223 Descriotion of Artificial Sesuence - Ppmers ,400> 53 gat cagcga ageccggg 18
<210> 54 <211> 71S <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223 > Descript ion of Art i f ic ial Sequence PROTEIN cryl lal Embl Accession No X62S21 <400> 5! Met Lys Leu Lys Asn Gln Aso Lys His Gln Ser Phe Ser Ser Asn Ala 1 5 * 10 15 Lys Val Asp Lys He Ser Thr Asp Ser Leu Lys Asn Glu Thr Asp He 20 * 25 30 Glu Leu Cln Asn He Asn His Glu Asp Cys Leu Lys Met Ser Glu Tyr 35 40 45 Glu Asn Val Glu Pro Phe val Ser Ala Ser Thr He Gln Tnr Gly He 50 55 60 Gly He Aia Gly Lys He Leu Gly Tnr Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly 65 70 7*5 80
Glr. V-l Ala Ser Leu Tyr Ser Pne He Lea Gly Glu Leu Trp Pro Lys 85 90 95 Gly Lys Asn Gln Trp Glu lie Pne Met Glu His Val Glu Glu He He 100 105 110 Asn Gln L s He Ser Thr T/r Ala Arg Asn Lys A.la Leu Thr Asp Leu 11D 120 * 125 Lys Gly Leu Gl/ Asp Ala Leu A.ia Val Tyr Fis Asp Ser Leu Glu Ser 130 " 135 140 Trp Val Gl/ Asn Asn Asn Tnr Arg Ala Arg Ser Val Val Lys Se
14í 150 155 160
Cln Tyr He Ala Leu Glu Leu :'^t Pne Val Glr Lys Leu Pro Ser Pne 165 170 175 íla Val Ser Gly Glu Glu Val Pro Leu Leu Pro He T/r -la Gin Ala 180 185 190 Ala Asn Leu his Leu L^u L= _ L ^ c. I sp Al? Ser He Pne Cly L-
Glu Tro Gly Leu Ser Ser Ser Glu He Ser Thr Phe Tyr A f? Arg Glr. 210 215 220 Val clu Arg Aia Gly Asp Tyr Ser Tyr r.is Cys Val Lys Trp Tyr Ser 225 230 235 240
Tnr Gly Leu Asn Asn Leu Arg Gl/ Thr Asn Ala Glu Ser Trp Val Arg 245 " 250 255 T.r Asn Gin Phe A.rg Arg Asp Mee Tnr Lea Met Val Leu Asp Leu Val 260 " 255 270 Ala Leu Pne Pro Ser Tyr Asp Thr Gln ec Tyi Pro He Lys Thr Thr 275 2S0 225 Ala Gln Leu Tnr Arg Glu Val Tyr Tr.r Asp Ala He Gly Tnr Val Kis 290 295 300 Pro Kis Pro Ser Phe Thr Ser Thr Thr Trp Tyr Asn A=n Asn Ala Pro 305 310 315 320 Ser Phe Ser Ala He Glu Ala Ala Val Val Arg Asn Pro Kis Leu Leu 325 330 335 Asp Pne Leu Glu Gln Val Thr He Tyr Ser Leu Leu Ser Arg Trp Ser 340 345 350 Asn Tnr Gln Tyr Mee Asn Mee Trp Gly Gly Kis Lys Leu Glu Phe Arg 355 360 365 Thr He Gly Gly Thr Leu As- He Ser Thr Glr. Gly Ser Thr Asn Thr 370 375 380 Ser He Asn Pro Val Thr Leu Pro Phe Thr Ser ?rg Asp Val Tyr Arg 385 390 395 -100 Thr Glu Ser Leu Ala Gly Leu Asn Leu Phe Leu Tnr Glr. Pro Val A.sn 405 410 415 Val Pro Arg Val Asp Phe His Trp Lys Phe Val Tnr his Pro He Ala 420 -25 430 Ser Asp Asn Pne Tyr Tyr Pro Gly T/r Ala Giy He Gly Thr Gln Leu 435 440 445 Glr. Asp Ser Glu Asn Glu Leu Pro Pro Glu Ala Tnr Gly Gln Pro Asn 450 455 460 Tyr Glu Ser Tyr Ser Hp A.rg Lea Ser his He Gly Leu He Ser Ala 465 470 475 -180 Ser His Val Lys Aid Leu Val Tyr Ser Trp Thr Fis Arg Ser Ala Asp 485 490 495 Arg Thr Asn Tnr He Gla Pro Asn Ser He Thr Gln He Pro Leu Val 500 505 510 Lys Ala Ppe Asn Leu Ser Ser Gly H Ala Val Val Arg Gly Pro Gly 515 320 525 Phe T-.r Gly Gly Asp He Leu Aig Arg Thr Asn Thr Giy Tnr Pne Gly 530 535 540 Asp I I Val Asn H e A sn Pro Pro Pne Ala Gln T/r Arg Val
- • - ' : "**" " •""' '*• •
-1.
545 550 ;ss 560
Arg He Arg Tyr Aia Ser Thr Thr Asp Leu Gl.n Phe Kis Thr Ser He 565 ~ 570 575
Asn Gly Lys Ala He Asr. Gln Gly Asn Phe Ser Aia Thr Mee Asn Arg 530 ' 535 S90 Gly Glu Asp Leu Asp Tyr L/s Thr Phe Xaa Thr Val Gly Phe Thr Thr 595 SOC 505 Pro Phe Ser Leu Leu Asp Val Gln Ser Tnr Phe Thr He Gly Ala Trp 610 615 620 Asr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr He Asp Arg He Glu Phe Val 625 630 635 640
Pro Val Glu Val Tnr Tyr Glu Ala Giu Tyr Asp Phe Glu Lys Ala Gln 645 650 655
Glu Lys Val Thr Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Pro Arg Gly Leu Lys 660 655 670 Thr Asp Val Lys Asp Tyr Kis He Asp Gln Val Ser Aan Leu Val Glu 675 680 635 Ser Leu Ser Asp Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe Glu 690 695 700 He Val Lys Tyr Ala Lys Gln Leu His He Glu Arg Asn Met 705 7*10 71S
<210> 55 <211> 719 212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Descpption of Artificial Sesuence - PROTEIN crylla2 Embl. Accession No M9854Í <400> 55 et Lys Leu Lys Asn Gln Aso Lys His Gln Ser Phe Ser Ser Asn Ala 1 * 5 " 10 15
Lys Val Asp Lys He Ser Thr Asp Ser Leu Lys Asn Glu Thr Asp He 20 25 30 Glu Leu Gln Asn He Asn His Glu Asp Cys Leu Lys ílet Ser Glu Tyr 35 40 45 Gia Asn Val Glu Pro Pne Val Ser Ala Ser Thr He Gln Thr Gly He 50 55 60 Gl/ He Ala Gly Lys He Leu Gly Thr Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly
Glr. Val Ala Ser Leu Tyr Ser Phe He Leu Gly Glu Leu Trp Pro Lys 85 90 S5
Gl/ L.,?, Asn Gin Trp Glu He r e Met Glu his Val Glu Glu He He
ICO " 105 110 As^ Gin Lys He Ser Tnr Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu Tnr Asp Leu 115 ' 120 125
-14-
Lvs Gly Leu Gly Asp Ala Leu Ala Val Tyr :-*?s Asp Ser Leu Glu Ser 130 135 1 0 Trp l Gl/ Asn Arg .Asn Asn Thr Arg Aia Arg Ser Val Val Lvs Ser 145 150 155 lóO
Gln Tyr He Aia Leu Giu Leu Met Phe Val Gln Lys Leu Pro Ser Phe 165 170 175
Ala Val Ser Gly Giu Giu Val Pro Leu Leu Pro He Tyr Aia Gln Ala 130 1S5 190 Ha Asn Leu Kis Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser He Phe Gly Lys 195 20, 205 Gia Trp Gly Leu Ser Ser Ser Glu He Ser Tnr Phe Tyr Asn Arg Gln 210 215 220 Val Clu Arg Ala Gly Asp Tyr Ser Asp b i s Cys Val Lys Trp Tyr Ser 225 230 235 240
Thr Gly Leu Asn Asn Leu Arg Giy Thr Asr. Ala Glu Ser Trp Val Arg 245 250 255
Tyr Asn Gln Pne Arg Arg Asp Met Thr Leu Met Val Leu Asp Leu Val 260 265 270 Ala Leu Pne Pro Ser Tyr Asp Thr Gln Met Tyr Pro He Lvs Thr Thr 275 280 285 Ala Gln Leu Thr Are GH Val Tyr Thr Asp Ala He Gl/ Tnr Val Kis 290 295 300 Pro His Pro Ser Phe Thr Ser Thr Thr Trp Tyr Asn A.sn Asn Ala Pro 305 310 " 315 320
Ser Phe Ser Ala He Glu Ala Ala Val Val Arg Asn Pro his Leu Leu 325 330 335
Asp Phe Leu Glu Gln Val Thr He Tyr Ser Leu Leu Ser ?rg Trp Ser 340 345 350 Asn Tnr Gl-i Tyr Met Asn Met Trp Gly Gly his L/s Leu Giu Phe Arg 355 360 365 Tnr He Gly Gly Thr Leu Asn He Ser Thr Gln Gly Ser Tnr Asn Thr 370 375 380 Ser He Asn Pro Val Thr Leu Pro Pne Tnr Ser Arg Aso Val Tyr A.rg 385 390 395 400
Tnr Glu Ser Leu Ala Gly Leu fsi Leu P->e Leu Thr Cl-1 Pro Val 'si 405 410 415
Gly Val Fro Arg Val Asp Pne Kis Trp Lys Phe Val Tnr F_s Pro He 420 425 430 Ala Ser Asp Asn Phe Tyr Tyr Pro Gly Tyr Ala Gly He Gl/ Thr Gln 435 440 445 Leu Gln Asp S r Glu Asn Glu Leu Pro Pro Glu A.la Tnr Gly Gln Pro 450 455 460 Asn Tyr Glu Ser T/r Ser Kis Arg Leu Ser His He Gl/ Le He Sei 465 470 475 430
¿i*?_| tekifc jii ijái u
Ala Ser His Val Lys Ala Leu Val Tyr Ser Trp Thr Kis Arg Ser Aia 485 ' 490 * 495
Asp Arg Thr Asn Thr He Glu Pro Asn Ser He Thr Gln He Pro Leu 500 505 510 Val Lys Ala Phe Asn Leu Ser Ser Gly Aia Ala Val Val Arg Gly Pro 515 520 ' 525 Giy Phe Thr Gly Gly Asp He Leu A.rg Arg Thr Asn Thr Gly Thr Phe 530 535 540 Gly Asp lie Arg Val Asn He Asn Pro Pro Phe Ala C-lp Arg Tyr Arg .545 550 555 560
Val Arg He Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe His Thr Ser 565 570 575
He Asn Gly Lys Ala He Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Asr. 530 585 590 Arg Gly Glu Asp Leu Asp Tyr Lys Thr Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr 595 600 605 Thr Pro Phe Ser Phe Leu Asp Val Gln Ser Thr Phe Thr He Gly Ala 610 615 620 Trp Asn Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr He Asp Arg He Glu Phe 625 630 ' 635 640
Val Pro Val Glu Val Thr Tyr Glu Ala Glu Tyr Asp Phe Glu Lys Ala 645 650 655
Gln Glu Lys Val Thr Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Pro Arg Gly Leu 660 665 670 Lys Thr Asp Val Lys Asp Tyr His He Asp Gln Val Ser Asn Leu Val 675 680 685 Glu Ser Leu Ser Asp Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe 690 695 700 Giu He Val Lys Tyr Ala Lys Gln Leu His He Glu Arg Asn Met 705 710 715
<210> 56 <211> 719 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> < 223 > Descripc ión of Art if i c i al Sequence : PROTEI N cr/l l a3 Etnol . Access ion No L3 633 3 <400> 55 Mee L/s Leu Lys Asn Gln Asp Lys His C-ln Ser Phe Ser Ser Asn Ala 1 5 10 15
Lys Val .? sp Lys He Ser Tnr Asp Ser Leu Lys Asn Glu Thr Asp He 20 25 30 Glu Leu G] Il£ .S Giu Aso Cy; Leu Lys Mee Ser Giu Tyr 40
tiL&iáJiA?s
Glu Asn Val Giu Pro Phe Val Ser Aia Ser Thr He Gin Thr Gly He 50 55 o 0 Gly He Ala Gly Lys He Leu Giy Thr Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly 55 70 75 80
Gln Val Ala Ser Leu Tyr Ser Phe He Leu Giy Giu Leu Trp Pro Lys 85 95
Giy Lys Asn C-ln Trp Glu He Pne Mee Glu Kis Val Glu Glu He He 100 105 110 Asn Gin Lys H¿ Ser Tnr Tyr Ala Ala Leu Thr Asp Leu 115 120 125 Lys Giy Leu Gly Asp A.la Leu Ai; Asp Ser Leu Glu Ser
130 135 140 Trp Val Giy Asn Arg Asn Asn Tnr Arg Aia Arg Ser Val Val Lys Ser 145 150 155 160
Gln Tyr He Ala Leu Glu Leu Met Phe Val Gln Lys Leu Pro Ser Phe 165 170 ' 175
Ala Val Ser Gly Glu Glu Val Pro Leu Leu Pro He Tyr Ala Gln Ala 180 185 190 Ala Asn Leu Kis Leu Leu Leu Leu Arg Aso Ala Ser He Phe Gly Lys 19S 200 205 Glu Trp Gly Leu Ser Ser Ser Glu He Ser Thr Phe Tyr Aon Arg Gln 210 215 220 Val Glu Arg Ala Gly Asp Tyr Ser Tyr Kis Cys Val Lys Trp Tyr Ser 225 230 235 240
Thr Gly Leu Asn Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Val Arg 245 250 255
Tyr Asn Gin Pne Arg Arg Asp Met Thr Leu Met Val Leu Asp Leu Val 6o " " 265 270 Ala Leu. Phe Pro Ser Tyr Asp Thr Glr. Met Tyr Pro He Lys Tnr Tnr 275 280 285 Ala Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Ala He Gly Thr Val Kis 290 295 300 Pro His Pro Ser Phe Thr Ser Thr Thr Trp Tyr Asn Asn Asn Ala Pro 305 310 " 315 320
Ser Phe Ser Aia He Glu A.la A.la Val Val Arg Asn Pro Kis Leu Leu 325 330 335
Asp Phe Leu Glu Gln Val Thr He Tyr Ser Leu Leu Ser Arg Trp Ser 340 345 350 Asn Thr Gln Tyr KeC Asn Met Trp Gly Gly Kis Lys Leu Glu Pne Are 355 360 3S5 Tr.r He Gly Gly Tnr Leu Asn He Ser Tnr Gin Gly Ser Thr Asn Tnr 370 375 380 Ser He Asn Pro Val Thr Leu Pro Pne Thr Ser A.rg ep Val Tyr Arg 325 390 395 400
,«, a i
Thr Glu Ser Leu Aia Gly Leu Asn Leu Pne Leu Thr Gln Pro Val Asn 405 410 415
Gly Val Pro Arg Val Asp Phe His Trp Lys Pne Val Thr His Pro He 420 425 430 Aia Ser Aso Asn Pne Tyr Tyr Pro Gly Tyr Ala Gly He Gly Tnr Glp 435 440 4 i 5 Leu Gln A.sp Ser Giu Asn Glu Leu Pro Pro Giu Ala Thr Gly Gln Pro 450 455 450 Asn Tyr Glu Ser T/r Ser Kis Arg Leu Ser Kis He Gly Leu He Ser 455 470 475 4S0
Ai; Kis Val Lys Ala Leu Val Tyr Ser Trp Tnr Kis Arg Ser A.la 485 490 495 so Arg Thr Asn Thr He Glu Pro Asn Ser He Thr Gln He Pro Leu
500 505 510 Val Lys Ala Phe Asn Leu Ser Ser Gly Ala Ala Val Val Arg Gly Pro SIS 520 ' 525 Gly Phe Thr Gly Gly Asp He Leu Arg Arg Thr Asn Thr Gly Thr Phe 530 * 535 540 Gly Asp He Arg Val Asn He Asn Pro Pro Phe Ala Gln Arg Tyr Arg 545 550 555 560
Val .Arg He Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe Kis Thr Ser 565 570 575
He Asp Gly Lys Ala He Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Asn 580 585 590 Arg Gly Giu Asp Leu Asp Tyr Lys Thr Phe Arg Tnr Val Gly Phe Thr 595 600 605 Thr Pro Pne Ser Phe Leu Asn Val Gln Ser Thr Phe Thr He Gly Ala 610 615 620 Trp Asn Phe Ser Ser Cly Asn Glu Val Tyr He A.sp Arg He Glu Pne 625 630 635 640
Val Pro Val Glu Val Thr Tyr Glu Ala Glu Tyr Asp Pne Glu Lys Ala 645 650 655
Gln Giu Lys Val Tnr Ala Leu Pne Tnr Ser Thr Asn Pro Arg Gly Leu 660 665 670 Lys Thr Aso Val L^s Aso T/r Kis He -Aso Gln Val Ser Asn Leu Val
67; :S0 685 Glu Ser Leu Ser Asp Glu Pne T/r L -u A.sp Glu Lys Arg Glu Leu Phe 690 695 700 Glu He Val L/s Tyr Ala Asr. Clu Leu his He Glu Arg A.sn Met 705 710 715
<210> 57 <211> 719 <212> PPT <213> Artificial Sesuence
-223- Description of Artificial Sequence • PROTEIN cryllai Lnvbi . Accession Mo L 19391 <400- 57 Met Lys Leu Lys Asn Gln Asp Lys Kis Glp Ser Pba Ser Ser Asn Ala 1 5 ' ' 10 15 Lys VH Asp Lys He Ser Thr Asp Ser Leu Lys Asn Glu Thr Asp He 20 25 30 Glu Leu Gin Asn He Asn His Glu Asp Cys Leu Lys Met Ser Glu Tyr 35 40 45 Giu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Ser Tnr He Glp Tnr Gly He 50 55 60 Gly He Ala Gly Lys He Leu Gly Thr Leu Gly al Pro Phe Aia Giy 65 70 75 80 Gln Val Ala Ser Leu Tyr Ser Phe He Leu Gly Giu Leu Trp Pro Lys 85 90 95 Gly Lys Asn Gln Trp Glu He Phe Met Glu Kis Val Glu Glu He He 100 " 105 110 Asn Gln Lys He Ser Thr Tyr Ala A.rg Asn Lys Ala Leu Thr Asp Leu 115 120 123 Lys Gly L-_>a Gly Asp Ala Leu Ala Val Tyr Kis Asp Ser Leu Glu Ser 130 " 135 140 Trp Val Gly Asn Arg Asn Asn Thr Arg Ala Arg Ser Val Val Lys Ser 145 150 155 160 Gln Tyr He Ala Leu Glu Leu Met Phe Val Gln Lys Leu Pro Ser Phe 165 170 i 75 Ala Val Ser Gly Glu Glu Val Pro Leu Leu Pro He Tyr Ala Gln Ala 130 185 190 Ala A.sn Leu Kis Leu Leu Leu Leu Arg A.sp A.la Ser He Pne Gly Lys 195 200 " 2Ci Glu Trp Gly Leu Ser Ser Ser Glu He Ser Thr Phe Tyr Asn .Arg Gln 210 215 220 Val Glu A.rg A.la Gly Asp Tyr Ser Asp HÍS Cys Val Lys Trp Tyr Ser 225 ' 230 * 235 240 Thr Gly Leu Asn Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Val A.rg 245 2S0 255 Tyr Asn Gln Pne Arg Arg Asp ?let Thr Leu Met Val Leu A.sp Leu Val 250 " 265 270 Avia Leu Phe Pro Ser Tyr Asp Thr Gln Met Tyr Pro He Lys T r Thr 275 230 285 Ala Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp .Ala He Cly Thr Val His 290 295 300 Pro HLS Pro Ser Pne Thr Ser Thr Tnr Trp Tyr A.sn A.sn Asn Ala Pro 305 310 " 3*15 320 Ser P>'-= ?^r ala :;<•> G" i Al-> Ala Val Val Axq Asr -T Kis Leu Lea
-19-
325 330 335
Asp Phe Leu Giu Gln Val Thr He Tyr Ser Leu Leu Ser Arg Tro Ser 340 345 350 Asn Thr Gin Tyr Met Asn Met Trp Gly Gly Kis Lys Leu Ciu Phe Arg 355 360 355 Thr He Gly Giy Thr Leu Asn ile Ser Tnr Gln Gly Ser Tnr Asn Tnr 370 * ' 375 3S0 Ser He Asn Pro Va1 Thr Leu Pro Pr.e Thr Ser Arg A.sp Val Tyr Arg 335 390 395 400
Thr Glu Ser Leu Aia Gly Leu Asn Leu Phe Leu Thr Glr. Pro Val Asr. 405 ' 410 415
Gly Val Pro Arg Val Asp Phe Kis Trp Lys Phe Val Thr His Pro He 420 " 425 430 Ala Ser Asp Asn Phe Tyr Tyr Pro Gly Tyr Val Gly He Gly Thr Glr. 435 440 445 Leu Gln Asp Ser Glu Asn Glu Leu Pro Pro Glu Ala Thr Gly Gln Pro 450 45S 460 Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser Kis Arg Leu Ser His He Gly Leu He Ser 46S 470 475 430
Ala Ser Kis Val Lys Ala Leu Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala 485 490 495
Asp Arg Thr Asn Thr He Glu Pro Asn Ser He Thr Gln He Pro Leu 500 505 510 Val Lys Ala Phe Asn Leu Ser Ser Gly Ala Ala Val Val Arg Gly Pro 515 520 525 Gly Phe Thr Gly Gly Asp He Leu Arg Arg Thr Asn Thr Gly Thr Phe 530 " 535 540 Gly Asp He Arg Val Asn He Asn Pro Pro Phe Ala Gln Arg Tyr Arg 545 550 555 560
Val Arg He Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe His Tnr Ser 565 570 575
He Asn Gly Lys Ala He Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Mee A.sn 580 585 590 A.rg Gly Glu A.sp Leu Asp Tyr Lys Thr Phe Arg Tnr Val Gly Phe Thr 595 600 605 Thr Pro Pne Ser Phe Leu Asp Val Gln Ser Thr Phe Thr He Gly Ala 610 615 620 Trp Asn Pne Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr He Asp A.rg He Glu Phe 625 630 635 640
Val Pro Val Glu Val tnr Tyr Glu A.la Glu Tyr Asp Phe Glu Lys Ala 545 650 655
31n Glu Lys Val Tnr Ala Leu Phe Thr Ser Tnr A.sn Pro Arg Gly Leu 660 665 670 T ,\/=! T Tnr Acó Val Lvs Ar,~> TM HIS He Asp Gln Val Ser Asn Leu Val
t MJUJ^^? ^AAafálfáii
-20-
75 680 635 Glu Ser Leu Ser Asp Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe 690 695 700 Glu He Val Lvs Tvr Ala Lvs Gl Leu Kis He Glu Arg Asn Met 705 710 715
210> 53 <211> 719 <212> PRT -213 > Artificial Sequence <220> - 223 - De scr ip c ión o f Art i t i c ia l Sequence . PROTEIN cryl l a5 E bl Acces s ion No Y08920 <400> 5S Met Lys Leu Lvs Asn Gln Aso Lys Kis Gln Ser Pne Ser Ser Asn Ala 1 ' " 5 10 15
Lys Val Asp Lys He Ser Thr A.sp Ser Leu Lys Asn Glu Tr.r Asp He 20 * 25 30 Glu Leu Gln Asn He Asn Kis Glu Asp Cys Leu Lys Met Ser Glu Tyr 35 40 45 Glu Aen Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Ser Thr He Gln Thr Gly He 50 55 60 Gly He Ala Gly Lys He Leu Gly Thr Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly 65 70 75 80
Gln Val Ala Ser Leu Tyr Ser Phe He Leu Gly Glu Leu Trp Pro Lys 85 90 95
Gly Lys Asn Gln Trp Glu He Phe Met Glu Kis Val Glu Glu He He 100 105 110 Asn Gln Lyo He Ser Thr Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu Tnr Asp Leu 115 120 125 Lys Gly Lea Gly Aso Ala Leu Ala Val Tyr Kis Asp Ser Leu Glu Ser 130 135 140 Trp Val Cly Asn Arg Asn Asn Tnr Arg Ala Arg Ser Val Val Arg Ser 145 " 150 155 160
Gin Tyr He A.la Leu Glu Leu Met Phe Val Glr. Lys Leu Pro Ser Phe 165 170 " 175
Ala Val Ser Glv Glu Glu Val Pro Leu Leu Pro He T/r Ala Gln Ala 13*0 185 1S0 Ala Asr. Leu His Lea Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser He Phe Gly Lys 195 200 205 Glu Trp Gly Leu Ser Ser Ser Glu He Ser Tnr Phe Tyr Asn Arg Glr. 210 215 220
Thr Gly Leu A.sn Asn Leu Arg Gly Tnr Asn Ala Glu Ser Trp Val Arg 245 250 ^55
^!f^^^
-21-
Tyr Asn Gin P.ne Arg Arg Asp Mee Tr.r Leu Met Val Leu Aso Leu Val 250 ' " 265 270 Ala Leu Phe Pro Ser Tyr Asp Thr Gln Mee Tyr Pro He Lys Thr Thr 275 280 285 Ala Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr A=p Ala He Gly Thr Val Kis 290 "* 295 300 Pro Kis Pro Ser Pne Thr Ser Thr Thr Trp Tyr Asn Asn Asn Ala Pro 305 10 315 320
Ser Pne Ser Ala He Glu Ala Ala Val Val Arg Asn Pro Kis Leu Leu 325 330 335
Aso Pne Leu Glu Gln Val Thr He Tyr Ser Leu Leu Ser Arg Trp Ser 340 345 350 Asn Thr Gln Tyr Mee Asn Mee Trp Gly Gly Kis Lys Leu Glu Phe Arg 355 360 365 Thr He Gly Gly Thr Leu Asn He Ser Thr Gln Gly Ser Thr Asn Thr 370 ' 375 380 Ser He Asn Pro Val Thr Leu Pro Phe Thr Ser Arg Asp Val Tyr Arg 335 390 395 400
Thr Glu Ser Leu Ala Gly Leu Asn Leu Pne Leu Thr Gln Pro Val Asn 405 ' -'-10 415
Gly Val Pro Arg Val Asp Phe Kis Trp Lys Phe Val Thr Kis Pro He 420 " 425 430 Ala Ser Asp Asn Phe Tyr Tyr Pro Gly Tyr Ala Gly He Gly Thr Gln 435 440 445 Leu Gln Asp Ser Glu Asn Glu Leu Pro Pro Glu Ala Tnr Gly Gln Pro 450 455 460 Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser His Arg Leu Ser Hie He Gly Leu He Ser 465 470 475 480
Ala Ser Kis Val Lys Ala Leu Val Tyr Ser Trp Thr Kis Arg Ser Ala 485 490 495
Asp Arg Thr Asn Thr He Glu Pro Asn Ser He Thr Gln He Pro Leu 500 505 510 Val Lys Ala Phe Asn Leu Ser Ser Gly Ala Ala Val Val Arg Gly Pro 515 520 525 Gly Pne :nr ./ Gly Asp He Leu Arg A.rg Thr Asn Thr Gly Thi 530 535 540 Gly Asp He Arg Val Asn He Asn Pro Pro Phe Ala Gln Arg Tyr Arg 545 550 555 560
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He Asn Giy Lvs Ala He Asn Gln Gly Asn Phe Ser Aia Tnr Met Asn
580 585 590 Arg Gly Giu Asp Leu Asp Tyr Lys Thr Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr
535 600 6C5
Thr Pro Phe Ser Phe L=y*É. §Í Val Gln Ser Thr Pne Thr lie Giy Ala
Trp A=n Phe Ser Ser Gly Asn Giu Val Tyr He Asp Arg He Giu Phe 625 630 635 64 C
Val Pro Val Glu Val Thr Tyr Clu Aia Glu Tyr A.sp Pne Glu Lys Al? 645 550 655
Cin Glu Lys Val Tnr Ala Lau Pne Thr Ser Tnr Asr Pro Arg Giy Leu 660 655 b70 Lys Thr Asp Val Lys Asp Tyr Fr= He A=p Glr. Val Ser Asn Leu Val 675 680 685 Glu Ser Leu Ser Asp Glu Phe Tyi Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Pne 690 * 695 700 Glu He Val Lvs Tvr Ala Asn Glu Leu Kis He Glu Arg Asn Met 705 710 715
<210> 59 <211> 719 <212> PRT <213> Artificial Sesuence 220 > -- 22 > De cpp-ior. of Articicial Sesuence PROTEIN cryllbl Em l Accession' No U07542 <400> 59 Mee Lys Leu Lys Asn Pro Asp Lys His Gln Ser Leu Ser Ser Asn Ala 1 5 10 15
Lys Val Asp Lys He Ala Thr Aep Ser Leu Lys Asn Glu Thr Asp He 20 25 30 Glu Leu Lys Asn Met Asn Asn Glu Asp Tyr Leu Arg Met Ser Glu His 35 40 45 Glu Ser He Asp Pro Phe Val Ser Ala Ser Thr He Gln Thr Gly He 50 55 60 Gly He A.la Gly Lys He Leu Gly Tnr Leu Gly Val Pro Pne Ala Giy 65 ' 70 75 80
Gln He A.la Ser Leu Tyr Ser Pne He Leu Gly Glu Leu Trp Pro Lys 85 90 95
Gly Lys Ser Gln Trp Glu He Phe Met Glu Kis Val Glu Glu He He 100 105 110 Asn Gln Lys He Leu Thr Tyr Ala Arg Asn Lys A.la Leu Ser Asp Leu 115 120 125 Arg Gly Leu Gly Asp Ala Leu Ala Val Tyr His Glu Ser Leu Giu Ser 130 135 140 Trp Val Glu Asn A.rg Asn Asn Thr Arg A.la Arg Ser Val Val Lys Asn 145 150 155 160 in Tyr lie Ala Leu Glu Leu ee Pne Val Gln Lys Leu Pro Ser Phe 165 170 175
Ala Val Ser Gly Giu Giu Val Pro Leu Leu Pío He Tyr Ala Gln Ala 180 185 0 Ala Asn Leu Kis Leu Leu iati Leu .Arg Asp .Ala Ser He Pne Gly 195 200 Glu Tro Cly Leu Ser Ala Ser Ci lie Ser Thr Pne Tyr Asn Arg Gln 210 2i5 220 Val Glu Arg Tnr Arg Aso T\ r Ser Aso Kis Cvs He Lys Trp Tyr Asn 225 230 ' 235 240
Thr Gly Leu A=n Asn Leu Arq Gly Thr Asn Ala Lys Ser Trp Val Arg 245 250 255
Tyr Asn Gln Phe Arg Lys Asp Mee Tr.r Leu Mee Val Leu Asp Leu Val 250 " ' " 255 2"O .Ala Leu Phe Pro Set Tyr Asp Th Leu Val Tyr Pro He Lys Tnr Tnr 275 ' " 230 285 Ser Gln Leu Tnr A.rg Glu Val Tyr Thr Asp Ala He Gly Thr Val Kis 290 295 " 300 Pro Asn Gln Ala Phe Ala Ser Thr Tnr Trp Tyr Asn Asn Asn Ala Pro 305 310 " 3?5 320
Ser Phe Ser Ala He Glu Ala Ala Val He Arg Ser Pro Kis Leu Leu 325 330 335
Asp Phe Leu Glu Lys Val Thr He Tyr Ser Leu Leu Ser Arg Trp Ser
340 345 350 Asn Thr Gln Tyr Met Asn Met Trp Gly Gly Kis Arg Leu Glu Ser Arg 355 " 360 * * 365 Pro He Gly Gly Ala Leu Asn Thr Ser Tnr Gln Gly Ser Thr A.sn Tnr 370 375 380 Ser He A.sn Pro Val Tnr Leu Gln Phe Thr Ser A.rg Asp Val Tyr Arg 385 390 395 400
Thr Glu S=r Leu Ala Gly Leu Asn Leu Phe Leu Thr Gln Pro Val Asn 405 ' 410 415
Gly Val Pro Arg Val Asp Pre Kis Trp Lys Phe Pro Tnr Leu Pro He 420 425 430 A.la Ser Asp Asn Pr.e Tyr Tyr Leu Gly Tyr Ala Gly Val Gly Tnr Gln 425 440 445 Leu Gln Asp Ser Glu Asn Glu Leu Pro Pro Giu Thr Tnr Gly Gln Pro 450 455 460 Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser his Arg Leu Ser Kis He Gly Leu He Ser 465 4 o 475 430
Ala Ser his Val Lys Ala Leu Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala 435 490 495
A.SD Ara Tnr Asn TÍ He Glu Pro Asn Ser He Thr Gln He Pro Leu 50 50b 510 Val Lys Ala Phe Asn Leu Ser Ser Gny A.la Ala Val Val Aig Giy Pro 515 520 525
-24-
Gly Pne Thr Gly Gly Asp ,Iíe Leu Arg Arg Thr Asr Thr Glv Thr Pne 530 ' ' ~ S35 540 Glv Asp He Arg Val A=n He Asn ?h> Pro Phe A. a Glr Ar Tyr Arg 545 550 .## 555 550
Va l Arg He Arg Tyr Aia Ser Thr Thr Asp Leu C l p Phe Th- da- 56 5 570 Asn Giv Lv-s Ala He Asn Glr. Clv A; Ala Met SSO ¡90 ra Glv Glu so Leu .Aso Tvr Lvs Tr.r :le Cl, 105 T.-.r Pro Pn= Ser Phe Ser .Asp Val Cln Ser Trr Pra Tnr He Cl/ aia 610 615 520 Trp Asn Pne Ser Ser Gly Asn Giu Val T/r He A.sp Arg He Glu Ppe 525 630 635 = 0
Val Pro Val Glu Val Tnr Tyr Glu Ala Giu Tyr Asp Pne GH Lys Ala 645 650 655
Gin Glu Lys Val Thr Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Pro Arg Gly Leu 660 665 670 Lys Tnr A.sp Val Lys Asp Tyr Kis He Asp Glr. Val Ser Asn Leu Val 675 680 685 Glu Ser Leu Ser Asp Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Pne 690 " 695 700 Glu He Val Lys Tyr Ala Lys Gln He Kis He Glu Arg Asn Mee 705 710 715
<210.> 60 <21I> 33 <212- PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence PROTEIN <220> <221> UNSÜPE <222> (1) (3) <223> Xaa ís ar.v ammo ai :?d <220> <221> U17SUPE (5) (10. <223> Xaa ?s ar aramo aci <220> <22I> UIISUPE < "'12 > (12) (15) <223> Xaa _s an/ aniño acia <22C <22i> UNSU'-? --222^ (19) (22) <223- Xaa _s any ammo ccia <22C
< 22 l > Ü SUR2 <222> (24) . (31) 223 Xaa is any amino acid <220> -221> ÜNSUR? -222> (33) -2 3^ Xaa ís ar.y ammo acid < 400 > 60 Xaa Xaa Xaa Cvs Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa C/= Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 ' 5 10 15 CVÍ vs Xaa Xc Xaa Xaa Cy; la Xaa Xaa Xaa X..-.3
<210> 61 <211> 439 <212> DNA <213> Paecilomyces <400> 61 tctacttctt catctcacgc catatatcct cccaaaatca caccecttcc ttcaccatgc 60 aaatctccgc cgccaccgtc gcactcttcg ccagcgccgc catggccggc aagatctgca 120 ctcctgctgg agttgtacgt attttcatcc atttcceyca ccactcctct aacatgaagc 180 aacc ttctct tctccctaga aacgtcccgc ggcecttcct tgccgccccg gacttcgctg 240 caccggcggc gtcaacgtaa gtcaccatgg atctgscaag cgagaccata acatgac ca 300 gcataccaac cccggccgtc acagaacaag gccgcgagcc gacatcttkc acaacctcta 360 caaacgcgcg caccaatgac aacggtagtg ccggtaattc tagegccgca acttttgagc 420 gtgggataag tatgcttcg 439
<210> 62 <211> 43d <212> DNA <213> Paecilomyces sp <400> 62 attacccaag tttgagggca ttcaatttca cacagtctca cgctttcgac gcatccactt 60 cttcgtceca cgccatacat cctcccaaaa tcacacctct tccttcacca tgcaaatctc 120 cgccgtcact gtcgcactct tcgccagcgc cgccatggcc ggcaagatct gcactcctgc ISO tggagttaaa tgtcccgcgg ctcttccttg ctgceccgga cttcgctgca tcggcggcgc 240 caacaacaag gtftgccggt aattctagtg tcgcaacttt tgagcgtggg ataagtatgc 300 ttcgtccgtt gtatggagtt ctcctccgga gtttaagctc ggccggccga cagcgggtce 360 gctatacttg atcttacagc gatactattg atagaaatgc acatcttcat tcatgcgcca 42? tgaaaaaaaa aaaaaaaa --s-
<210 63 211> 6 <212> PRT <213 Artificial Sequence <220> <223 > Descriotion of Art i f ic i al Sequepce IIISECTICIDAL PROTEIN KOTI F < 400 > 63 Leu Pro Cys Cys Pro Gly 1 5
<210> 64
m i í? Mi
-26-
<211- 5 <212> PPT <2L3> Artificial Secuence -220> -.233 > Descripción of .Artificia oeraer.i :e :\S32TICIDAL PROTEIÑ MOTI? -400> ¿ He Cvs Thr ro Al;
<21C> - 211 > <213 Artificial Sequence <220> <223> Description Artificial Sequen ;IN REGIÓN N-TERMINAL <220> <221> U SUR? <222> (1) (2) <223> Xaa ís any ammo acid <400--. 65 Xaa Xaa He Cys Thr 1 5
Claims (1)
- 57 REIVINDICACIONES 1. Una proteina insecticida caracterizada porque comprende la secuencia: X]X2ICTPAGVKCPAALPCCPGLRCIGGVNNKVCR (SEC. DE IDENT. No . 1 ) en donde Xx y X2 son cualquier aminoácido. 2. La proteina insecticida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque Xi y X2 se seleccionan a partir del grupo que consiste de: Glicina; Lisina; Serina; Tirosina; Alanina; Metionina; Treonina; ácido Glutámico; ácido Aspártico; Asparagina y Valina. 3. La proteina insecticida de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende la secuencia: GKICTPAGVKCPAALPCCPGLRCIGGVNNKVCR (SEC. DE IDENT. No. 2) . 4. La proteina insecticida que tiene al menos 55% de identidad con una proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5. La proteina insecticida que tiene al menos 70% de identidad con una proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 6. La proteina insecticida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque se modifica el aminoácido en la posición X| . 7. La proteina insecticida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque se acetila el 58 aminoácido en la posición Xi. 8. La proteina insecticida de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque el aminoácido en la posición Xi está en el N-término. 9. El polinucleótido que codifica una proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 10. La secuencia de polmucleótidos que es el complemento de una que se hibpdiza a un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, a una temperatura de aproximadamente 65°C en una solución que contiene SSC 6x, 0.001 de SDS y 0.25% de leche en polvo descremada, seguido por elevar a la misma temperatura en una solución que contiene SSC 0.2x y 0.1% de SDS en donde la secuencia de polmucleótidos aún codifica una proteina insecticida. 11. La secuencia de poli nucleótidos de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende la secuencia representada como las SEC. DE IDENT. Nos. 4 a 14. 12. La combinación sinergistica Insecticida caracterizada porque comprende una pirimera proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y al menos una proteina adicional. 13. La combinación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la protema adicional es una proteina CRY insecticida. 14. La combinación de conformidad con la 59 reivindicación 13, caracterizada porque la proteina adicional comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. NOS 54 A 59. 15. El polinucleótido caracterizado porque 5 comprende regiones que codifican la proteina primera y adicional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14. 16. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la región que 10 codifica la primera proteina comprende una secuencia seleccionada a partir de un grupo representado como las SEC. DE IDENT. Nos. 4 a 14. 17. Un método para desarrollar un polinucleótido que codifica una proteina que tiene propiedades insecticidas 15 caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una población de variantes del polinucleótido y polinucleótidos adicionales que codifican proteinas adicionales, en donde al menos uno de los polinucleótidos está en forma de célula libre; y 20 (b) redistribuir las variantes y los polinucleótidos adicionales para formar polinucleótidos recombinantes; y (c) escoger o seleccionar polinucleótidos recombinantes que se han desarrollado hacia codificar una 25 proteina que tiene las propiedades insecticidas; y 60 ?lfí (d) repetir los pasos (b) y (c) con los polmucleotidos recombmantes de acuerdo con el paso (c) hasta que haya sido adquirido un polmucleotido desarrollado que codifique una proteina que tenga propiedades insecticidas 5 en donde la población de variantes en la parte (a) contenga al menos un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, 15 o 16. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la población de variantes en la 10 parte (a) contiene al menos un polmucleótido que codifica la protema representada como SEC. DE IDENT. No. 1 a 3 y/o los polmucleotidos adicionales en la parte (a) codifican una proteina CRY. 19. El polmucleótido obtenible u obtenido por el 15 método de conformidad con la reivindicación 17 ó 18. 20. La proteina codificada por un polmucleótido de conformidad con la reivindicación L9. 21. La construcción de ADN caracterizada porque comprende er secuencia un promotor vegetal operab] e enlazado 20 operablemente a un polmucleotido de conformidad con cualquiera ele las reivindicaciones 9 a 1 1 , 15, 16 ó 19 o un poJ mucleotido que codifica una proteina de acuerdo con la reivindicación 20 enlazado operablemente a una región de terminación de transcripción. 25 22. La construcción de ADN de conformidad con la 61 reivindicación 21, caracterizada porque comprende adicionalmente una región que proporciona la selección del producto de proteina en una ubicación particular . 23. Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 21 ó 22, caracterizada porque comprende adicionalmente una región que se proporciona para la producción de una proteina que actúa como un marcador capaz de seleccionar. 24. La construcción de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizada porque el promotor vegetal operable se selecciona a partir del grupo que consiste de Agroba cterim rhizogenes RolD; inhibidor II de proteasa de papa; CaMV35S; FMV35S; NOS; OCS; Patatin; E9; interruptor alcA/alcR; interruptor GST; interruptor RMS; oleosina; promotor de subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa-oxigenasa y otros promotores específicos de raiz incluyendo promotor MR7 (maiz); promotores Gos9 (arroz) y GOS2. 25. Un método para proporcionar un vegetal o parte vegetal con una proteina insecticida o una combinación sinergistica insecticida caracterizado porque comprende: (a) insertar dentro del genoma del material vegetal un polinucleótido de conformida con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, 15, 16 ó 19 o un polinucleótido que codifica una proteina de acuerdo con la reivindicación 20 o 62 una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24; o (a) insertar dentro del genoma del material vegetal - que es capaz de producir una proteina adicional, un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, 19 o un polinucleótido que codifica una proteina de acuerdo con la reivindicación 20 o una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24; o (a) insertar dentro del genoma del material vegetal que es capaz de producir una primera de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una proteina provista por un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 ó 19, un polinucleótido que proporciona una proteina adicional; y (b) regenerar vegetales o partes vegetales a partir del maferial; y (c) seleccionar los vegetales o partes vegetales que tienen la proteina o combinación. 26. Un método para proporcionar un vegetal con una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque comprende cruzar un primer vegetal que es capaz de proporcionar una primera proteina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una primera proteina proporcionada por un polinucleótido de 63 acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 ó 19 con un segundo vegetal que es capaz de producir una proteína adicional y seleccionar el vegetal resultante que es capaz de producir la combinación. 27. Vegetales o partes vegetales obtenidos de conformidad con el método de la reivindicación 25 o vegetales obtenidos de acuerdo con el método de la reivindicación 26. 28. Vegetales o partes vegetales de conformidad con la reivindicación 27, caracterizados porque la proteína o la primera proteína de la combinación se modifica después de la traducción . 29. Vegetales o partes vegetales de conformidad con la reivindicación 28, caracterizados porque la proteína o la primera proteína de la combinación se acetila. 30. Vegetales o partes vegetales de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizados porque la proteína o la primera proteína se modifica/acetila en el N- término. 31. Vegetales o partes vegetales de conformidad con las reivindicaciones 27 a 30, seleccionados a partir del grupo que consiste de melones, mangos, soya, algodón, tabaco, remolacha, aceite de colza, cañóla, lino, girasol, papa, tomate, alfalfa, lechuga, maíz, trigo, sorgo, centeno, plátanos, cebada, avena, hierba de césped, hierba de forraje, caña de azúcar, chícharos, judía, arroz, pino, álamo, manzana, duraznos, uva, fresas, zanahoria, lechuga, col, 64 cebolla, cítricos, cereales, plantas de nueces u otros cultivos hortícolas. 32. El método para proporcionar un vegetal o parte vegetal con una cualidad agronómica deseada adicional caracterizado porque comprende: (a) insertar dentro del genoma del material vegetal un polinucleótido que proporciona la cualidad agronómica deseada; y (b) regenerar vegetales o partes vegetales a partir del material; y (c) seleccionar los vegetales o partes vegetales que tienen la cualidad agronómica deseada en donde el material vegetal es capaz de producir un insecticida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una combinación de acuerdo con las reivindicaciones 12 a 14; o cruzar un primer vegetal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 con un segundo vegetal que proporciona la cualidad agronómica deseada adicional y seleccionar el vegetal resultante que es capaz de producir la cualidad agronómica adicional. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la cualidad agronómica deseada se selecciona a partir del grupo que consiste de: resistencia a herbicidas; resistencia a insectos, resistencia a nemátodos tolerancia a la tensión, rendimiento a iterado; valor 65 nutricional alterado o cualquier otra cualidad agronómica deseable . 34. Vegetales o partes vegetales obtenidos de conformidad con el método de las reivindicaciones 32 ó 33. 35. Una proteína insecticida caracterizada porque comprende la secuencia representada como: -Xl-X2-X3-CyS 4 -X5-X6-X7~X8~X9 _Xl0~CyS L L~"Xl2~Xl3-Xl4 ~Xl5~ Xl6~CyS? -CyS L8_Xl9-X20~X21~X22~CyS23~ 24 ~X25~X26~ 27-X28~X29-X30-X31" Cys32-X33- (SEC. DE IDENT. No. 60) en donde X?-3, 5-10, 12-16/ 19- 22, 24-31 y 33 son cualquier aminoácido. 36. Una proteína insecticida que tiene una cuenta opt FASTA mayor de 109 cuando se compara con la SEC. DE IDENT. No. 1 usando la Versión 3 del algoritmo FASTA. 37. Una proteína insecticida obtenible a partir Paecilomyces sp . 38. La proteína insecticida de conformidad con la reivindicación 37 obtenible a partir de Paecilomyces farinosus . 39. El método para controlar insectos caracterizado porque comprende proporcionar en un Lugar donde se alimentan los insectos, una proteína, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 20, 35 a 38 o una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14. 40. El uso de un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, 15, 16 ó 19 o una 66 construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 en la producción de vegetales o partes vegetales que son resistentes a los insectos. 41. El uso de una proteína de conformidad con cualquiera ele las reivindicaciones 1 a 8, 20, 35 a 38 o una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 como un ingrediente activo de un pesticida. 42. El uso de un Paecil omyces sp . en la preparación de un pesticida que contiene como un ingrediente activo una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 43. El uso de conformidad con la reivindicación 42 en donde el Paecilomyces sp . ha sido modificado para permitir la producción aumentada de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 44. Un microorganismos recombinante que proporciona la producción de una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 20, 35 a 38 o una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 o una proteína codificada por un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, 15, 16 ó 19. 45. El baculovirus recombinante caracterizado porque comprende una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 20, 35 a 38 o una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 o 67 una proteína codificada por un polmucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, 15, 16 ó 19. 46. El uso de un baculovirus de conformidad con la reivindicación 45, en un método para controlar insectos. 47. Una proteína insecticida que es capaz de reaccionar con un anticuerpo monoclonal erigido a la proteína representada como SEC. DE IDENT. No. 1. 48. Una composición caracterizada porque comprende una cantidad con acción insecticida efectiva de una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 20, 35 a 38 o una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 o una proteína codificada por un polmucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, 15, 16 ó 19 y opcionalmente un portador agrícolamente aceptable y/o un diluyente y/o un atrayente de insectos . 49. Un polinucleótido caracterizado porque comprende una primera región que codifica una proteína insecticida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 20, 35 a 38 y una región adicional que codifica una proteína adicional. 50. La célula vegetal caracterizada porque comprende una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 20, 35 a 38 o una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 o un ^ áü.i?^^^^ i ^^ 68 polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, 15, 16 ó 19. 51. Una proteína insecticida caracterizada porque comprende el motivo representado como -LPCCPG- (SEC. DS IDENT. No. 63) .
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