MXPA99009043A

MXPA99009043A - Control de plagas de plantas

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Publication number: MXPA99009043A
Application number: MXPA/A/1999/009043A
Authority: MX
Inventors: Jose Estruch Juan; Yu Caoguo; Wayne Warren Gregoy; Manoj Desai Nalini; Gene Koziel Michael; James Nye Gordon
Original assignee: Manoj Desai Nalini; Jose Estruch Juan; Gene Koziel Michael; Novartis Ag; Novartiserfindungen Verwaltungsgesellschaft Mbh; James Nye Gordon; Warren Gregory Wayne; Yu Caoguo
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2000-02-02

Abstract

La presente invención se refiere a una clase novedosa de proteínas y sus receptores. Se proporcionan novedosos procesos, ensayos, y métodos para controlar plagas de plantas.

Description

CONTROL DE PLAGAS DE PLANTAS La presente invención se refiere a una clase novedosa de proteínas para el control de plagas de plantas.

Las plagas de plantas son un importante factor en la pérdida de los cultivos agrícolas comercialmente importantes del mundo, que dan como resultado tanto una opresión económica a los granjeros, como una privación nutritiva para las poblaciones locales en muchas partes del mundo. Se han utilizando extensamente plaguicidas químicos de amplio espectro para controlar o erradicar plagas de importancia agrícola. Sin embargo, existe un interés sustancial en el desarrollo de plaguicidas alternativos efectivos. El control de diferentes plagas a través del uso de moléculas biológicas ha sido posible solamente en un número limitado de casos. Los ejemplos mejor conocidos de moléculas biológicas con uso plaguicidas son las d-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) , que es un microorganismo formador de esporas gram-positivo. Se conocen variedades de Bt que producen más de 25 d-endotoxinas diferentes pero relacionadas. Las cepas de Bt producen d-endotoxinas durante la esporulación, cuyo uso está limitado debido a que son activas solamente contra muy pocas de las muchas plagas de insectos. La especificidad limitada de las endotoxinas de Bt depende, cuando menos en parte, tanto de la activación de la toxina en el intestino del insecto (Haider, M.Z. y colaboradores, 1986, Eur. J. Biochem. 156:531-540) como de su capacidad para enlazarse a los receptores específicos presentes en las células epiteliales del intestino medio del insecto (Hofmann, C.P. y colaboradores, 1988, PNAS 85:7844-7848). Por consiguiente, la capacidad para controlar una plaga de insectos específica utilizando d-endotoxinas en el presente depende de la capacidad para encontrar una d-endotoxina apropiada con el rango de actividad deseado. En muchos casos, no se conoce esta d-endotoxina, y no es seguro inclusive que exista alguna. Las plantas también llegan a infectarse rutinariamente por hongos y bacterias, y muchas especies microbianas han evolucionado para utilizar los diferentes nichos proporcionados por la planta en crecimiento. En adición a la infección por hongos y bacterias, muchas enfermedades de plantas son ocasionadas por nemátodos, gue surgen de la tierra e infectan las raíces, ocasionando típicamente un serio daño cuando se cultiva la misma especie de cultivo por años sucesivos en la misma área de tierra. La severidad del proceso destructivo de la enfermedad depende de la agresividad de la fitopatógeno y de la respuesta del hospedero, y un objetivo de la mayoría de los programas de cría de plantas, es incrementar la resistencia de las plantas hospederas a la enfermedad. Las fuentes genéticas novedosas y las combinaciones desarrolladas para la resistencia a la enfermedad, típicamente han tenido sólo un período limitado de uso con éxito en muchos sistemas de cultivo-patógeno, debido a la rápida evolución de los fitopatógenos para superar a los genes de resistencia. Por consiguiente, se puede ver gue los científicos deben estar constantemente en la búscrueda de nuevos métodos con los cuales proteger a los cultivos contra las plagas de plantas . En la presente invención, se ha descubierto una clase novedosa de proteínas gue se puede utilizar para controlar plagas de plantas. La muerte celular programada es un proceso mediante el cual los estímulos de desarrollo o del medio ambiente activan un programa genético que culmina en la muerte de la célula (Jacobson, M.D. y colaboradores, 1997, Cell 88: 347-354). Este potencial genético existe en la mayoría, sino es que en todos, los organismos multicelulares. En el caso de los invertebrados, la muerte celular programada parece tener un papel doble, al ser una parte integral tanto del proceso de desarrollo del insecto, como un mecanismo de respuesta a las infecciones particularmente de una naturaleza viral (Clern, R.J. y colaboradores, 1991, Science 254: 1388-1390) . La muerte celular programada parece ser ejecutada de varias maneras diferentes que conducen bien sea a la apoptosis, atrofia, o diferenciación. La apoptosis es uno de los tipos mejor caracterizados de muerte celular programada «que abarca cambios citológicos, incluyendo cuerpos apoptóticos enlazados a membrana, y formación de ampollas citoplásmicas, así - como cambios moleculares, tales como endonucleólisis tipificada por la generación de fragmentos de longitud oligosomal (Vaux, D.L. y Strasser, A., 1996, PNAS 93:2239-2244). Aunque la fenomenología apoptótica global está más bien conservada entre los diferentes organismos, es interesante señalar que, para muchas células de insectos, la vacuolización citoplásmica y el hinchamiento, en lugar de la condensación, parecen ser las características citológicas asociadas con los procesos apoptóticos (Bowen, I.D. y colaboradores, 1996, Micros. Res. Techniq. 34:202-217). Se demuestra que la clase novedosa de proteínas dadas a conocer en la presente invención, inducen muerte celular programada, y ejercen un efecto plaguicida. La presente invención se refiere a proteínas VIP3A(c) , incluyendo homólogos de las mismas. También, la presente invención proporciona dominios de proteínas de la clase VIP3 , incluyendo el dominio tóxico y el dominio estabilizante. Una modalidad preferida de la invención es el dominio tóxico de la proteína VIP3A(a) y homólogos de la misma. Otra modalidad preferida son los anticuerpos para las proteínas de la clase VIP3 , pero de preferencia para la proteína VIP3A(c) . La invención también proporciona toxinas híbridas que comprenden un dominio tóxico de una proteína de la clase VIP3. En una modalidad preferida, la toxina híbrida es una proteína quimérica que tiene un dominio central tóxico operativamente enlazado con un dominio estabilizante heterólogo. En otra modalidad preferida, la toxina híbrida comprende un anticuerpo, o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, que reconoce de una manera inmunológica al receptor de VIP3 operativamente enlazado con un dominio tóxico de otras proteínas, en donde el dominio tóxico se obtiene de un número de proteínas citotóxicas, incluyendo, pero no limitándose a, toxinas de Bacillus, incluyendo endotoxinas y proteínas insecticidas vegetativas. La invención también abarca plantas «que comprenden una secuencia de ADN «que codifica una proteína de la clase VIP3, pero de preferencia una proteína VIP3A(c). Las modalidades preferidas incluyen plantas seleccionadas a partir del grupo «que consiste en maíz, sorgo, trigo, girasol, jitomate, cultivos de col, algodón, arroz, frijol de soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y aceite de semilla de colza. En una modalidad particularmente preferida, la planta es una planta de maíz. La invención también proporciona microorganismos que comprenden una secuencia de ADN heterólogo que codifica para una proteína de la clase VIP3, pero de preferencia una proteína VIP3A(c) . En una modalidad preferida, el microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en bacterias, baculovirus, algas, y hongos. En otra modalidad preferida, el microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en Bacillus, Pseudomonas , Clavibacter , y Rhizobium. La invención abarca además composiciones entomoc das que comprenden microorganismos con una secuencia de ADN heterólogo que codifica para una proteína de la clase VIP3, pero de preferencia una proteína VIP3A(c) . La invención se refiere además a plantas y microorganismos que comprenden además una segunda secuencia de ADN que codifica para una segunda proteína insecticida. Las segundas secuencias de ADN particularmente preferidas, son aquellas que codifican para una d-endotoxina, aquellas que codifican para otra proteína de la clase VIP3 , o aquellas que codifican para una proteína de las clases VIP1 ó VIP2. En una modalidad más preferida, la d-endotoxina es activa contra un insecto seleccionado a partir del grupo que consiste en Lepidópteros y Coleópteros. En una modalidad más particularmente preferida, la d-endotoxina es activa contra Ostrinia o Diabrotica . En otra modalidad particularmente preferida, está una segunda secuencia de ADN que codifica una proteína de d-endotoxina seleccionada a partir del grupo que consiste en Cryl, Cry3 , Cry5 , y Cry9. En una modalidad más particularmente preferida, la d-endotoxina se selecciona a partir del grupo que consiste en CrylAa, CrylAb, CrylAc, CrylB, CrylC, CrylD, CrylEa, CrylFa, Cry3A, Cry9A, Cry9C, y Cry9B. Se prefieren más particularmente las d-endotoxinas seleccionadas a partir del grupo «que consiste en proteínas CrylAb, CrylBa, y Cry9C. La invención proporciona además un método para controlar insectos, mediante el contacto de los insectos con una cantidad insecticida de una proteína de la clase VIP3, pero de preferencia una proteína VIP3A(c) , o una cantidad insecticida de un ligando químico para un receptor de la clase de proteínas VIP3. En una modalidad preferida, los insectos se ponen en contacto con una planta transgénica que comprende una secuencia de ADN que expresa una proteína de la clase VIP3, pero de preferencia una proteína VIP3A(c) . En otra modalidad preferida, los insectos se ponen en contacto con una composición entomocida «que comprende una proteína de la clase VIP3 , pero de preferencia una proteína VIP3A(c) , o «que comprende una secuencia de ADN que expresa una proteína de la clase VIP3 , pero de preferencia una proteína VIP3A(c) . En otra modalidad preferida, la planta transgénica comprende una secuencia de ADN que expresa la proteína VIP3A(a) . En otra modalidad preferida, el insecto se selecciona a partir del grupo que consiste en Coleópteros, Dípteros, Himenópteros , Lepidópteros, Malófagos, Homópteros, Hemípteros, Ortrópteros, Tisanópteros, Dermápteros, Isópteros, Anoplura, Sifonápteros, Tricópteros, y Acaros . En una modalidad particularmente preferida, el insecto es un Coleóptero o Lepidóptero. En otra modalidad particularmente preferida, el insecto se selecciona a partir del grupo que consiste en oruga nocturna negra (Agrotis ípsilon) , gusano guerrero de otoño (Spodoptera. frugiperda) , gusano guerrero de remolacha (S . exigua.) , gusano guerrero de franjas amarillas ( S. orni thogalli) , barrenador de maíz suroccidental (Diatraea grandiosella) , barrenador de caña de azúcar (D. saccharalis) , gusano de mazorca de maíz (Helicoverpa zea) , barrenador de maíz del mediterráneo (Sesamia nonagroides) , oruga de col ( Trichoplusia ni) , oruga de frijol de terciopelo (Anticarsía gemmatalis) , polilla de lomo de diamante (Plutella xylostella) , y gusano de capullo de tabaco (Heliothis virescens) . La invención también proporciona un método para controlar insectos, en donde la planta transgénica o el microorganismo comprende además una segunda secuencia de ADN que codifica para una segunda proteína insecticida, tal como aquellas mencionadas anteriormente en la presente. La invención proporciona además secuencias de ADN recombinantes que codifican para una proteína VIP3a(c), incluyendo homólogos de la misma. En otra modalidad preferida, la secuencia de ADN es una secuencia sintética que se ha alterado para una expresión óptima en una planta, particularmente en donde la secuencia de ADN se ha optimizado para expresarse en una planta de maíz. También se prefieren las secuencias de ADN que comprenden tanto una porción sintética como una porción nativa. En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de ADN que codifica para la proteína VlP3A(c) , se ha optimizado para expresarse en una planta de maíz. Otra modalidad preferida son secuencias de ADN que son homologas para una secuencia de ADN que codifica para una proteína VIP3A(c) . Se prefieren particularmente las secuencias de ADN que se hibridan bajo condiciones moderadamente estringentes con la secuencia de codificación vip3A(c) . Todavía otra modalidad de la invención es una secuencia de ADN recombinante que expresa una proteína de la clase VIP3, de preferencia una proteína VIP3A(c) , bajo el control de un promotor heterólogo, o en donde las regiones de codificación se incorporan en el genoma de un organismo en donde no se expresan naturalmente, o se expresan en niveles más altos que lo que se presenta naturalmente. La invención se refiere además a un método para identificar y aislar homólogos de una proteína VIP3A(c) , o de una secuencia de ADN que codifica para esta proteína. La invención también proporciona casetes de expresión «que comprenden un promotor operativamente enlazado con una secuencia de ADN que codifica para una proteína de la clase VIP3, pero de preferencia para una proteína VIP3A(c) . En una modalidad preferida, el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste en promotores constitutivos específicos del tejido y preferidos por el tejido, para expresarse en plantas. En una modalidad particularmente preferida, el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste en ubiquitina, carboxilasa PEP, y promotores LPT y MTL. En otra modalidad preferida, el promotor es funcional en un microorganismo. La invención proporciona además un receptor para una proteína de la clase VIP3, y sus secuencias de ADN. En una modalidad ?Je_ la invención, el receptor comprende un dominio de muerte y un motivo EGF repetido. Una modalidad más preferida de la invención comprende un receptor para la VIP3A(a) . Una modalidad más particularmente preferida, es la secuencia de proteína receptora estipulada en la SEQ ID NO: 9, y los homólogos de la misma. La invención también abarca secuencias de ADN «que codifican estas proteínas receptoras, por ejemplo, la secuencia de ADN estipulada en la SEQ ID NO: 8, y homólogos de la misma. El ADNc para el receptor VIP3 está contenido en el plásmido pCIB7113, que fue depositado el 29 de marzo de 1997, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el NRRL [Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL) , Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604, E.U.A.] , y tiene el número de acceso B-21676. La invención también abarca anticuerpos para un receptor de la clase de proteínas VIP3. La invención también proporciona un método para identificar un compuesto como un ligando «químico de receptor VIP3 «que tiene actividad plaguicida, el cual comprende exponer a una célula, de preferencia una célula de insecto, a un compuesto de prueba, y ensayar esta prueba para determinar la actividad apoptótica. En otra modalidad de la invención, el método comprende medir el enlace específico entre el receptor VIP3 y un compuesto de prueba. Una modalidad preferida es de ligandos de receptor VIP3 identificados mediante el método.

Definí ci ones "Plaga de planta" significa cualquier organismo que se sepa que se asocia con las plantas, y que, como un resultado de esa asociación, ocasiona un efecto perjudicial sobre la salud y el vigor de la planta. Las plagas de plantas incluyen, pero no se limitan a, hongos, bacterias, insectos, y nemátodos. El término "planta", como se utiliza en la presente, abarca plantas enteras y partes de plantas, tales como raíces, tallos, hojas, y semillas, así como células y tejidos adentro de las plantas o de las partes de las plantas. La "clase de proteínas VIP3" comprende VIP3A(a) , VIP3A(b) , VIP3A(c), y sus homólogos. "Homólogo" se utiliza para indicar que la proteína o el polipéptido indicado lleva una relación definida con otros miembros de la clase de proteínas VI 3. Esta relación definida incluye, pero no se limita a: 1) proteínas que son cuando menos 70 por ciento, más preferiblemente 80 por ciento, y muy preferiblemente 90 por ciento idénticas al nivel de la secuencia, a otro miembro de la clase de proteínas VIP3 , mientras que también retienen actividad plaguicida, 2) proteínas que reaccionan cruzadamente con los anticuerpos que reconocen inmunológicamente a otro miembro de la clase de proteínas VIP3 , 3) proteínas que reaccionan cruzadamente con un receptor para otro miembro de la clase de proteínas VIP3, y retienen la capacidad para inducir la muerte celular programada, y 4) proteínas «que son cuando menos 70 por ciento, más preferiblemente 80 por ciento, y muy preferiblemente 90 por ciento idénticas al nivel de la secuencia, a la región del núcleo tóxico de otro miembro de la clase de proteínas VIP3, mientras «que también retienen la actividad plaguicida. Una "toxina híbrida" se utiliza para indicar una fusión genética, que tiene dominios operativamente enlazados, de tal manera que, cuando se traducen, se forma una proteína quimérica funcional que tiene, én el agregado, las propiedades de los dominios individuales. "Dominio" se utiliza para indicar una región o porción de una proteína, o confiere una función o estructura reconocible que contribuye a la funcionalidad global de la proteína. Se reconoce que una secuencia de ADN que codifique para un dominio de proteína, también está abarcada por esta definición. "Heterólogo" se utiliza para indicar «que una proteína, polipéptido, o secuencia de nucleótidos, tiene un origen natural diferente con respecto a su hospedero actual. Por ejemplo, si un gen vip3A(a) de Bacillus thuringiensis se transforma genéticamente en una célula de planta, entonces el gen se describe como heterólogo con respecto a su hospedero actual, que es la célula de planta. Además, si un gen vip3A(a) de Bacillus thuringiensis se transforma genéticamente en una bacteria Pseudomonas, entonces el gen también se describe como heterólogo con respecto a la Pseudomonas . "Heterólogo" también se utiliza para indicar «que uno o más de los dominios presentes en una proteína «quimérica, polipéptido, o secuencia de nucleótidos, difiere en su origen natural con respecto a otros dominios presentes. Por ejemplo, si el dominio tóxico de la proteína VIP3A(a) se funde con el dominio de enlace desde la proteína VIPlA(a) para hacer una proteína insecticida funcional, entonces la fusión quimérica tendría dominios que son heterólogos unos para otros. En adición, una proteína quimérica o polipéptido heterólogo que comprende la fusión de un dominio tóxico de la proteína VIP3A(a) para el dominio de enlace de la proteína VIPlA(a) , cuando se exprese en una planta, también se consideraría heterólogo con respecto a la planta hospedera. El término "quimérico", se utiliza para indicar que la proteína, el polipéptido, o la secuencia de nucleótidos, está comprendida de dominios, cuando menos uno de los cuales tiene un origen que es heterólogo con respecto a los otros dominios presentes. Estas proteínas o polipéptidos quiméricos, son codificados por secuencias de nucleótidos quiméricas «que se han fundido o ligado entre sí, dando como resultado una secuencia de codificación «que no se presenta naturalmente . Estas construcciones quiméricas también se pueden designar como "recombinantes" . "Cásete de expresión", como se utiliza en la presente, significa una secuencia de ADN capaz de dirigir la expresión de un gen en células de planta, que comprende un promotor operativamente enlazado con una región de codificación de aminoácidos que está operativamente enlazada con una región de terminación. El gen puede ser quimérico, significando que cuando menos un componente del gen es heterólogo con respecto a cuando menos otro componente del gen. El gen también se puede presentar naturalmente, pero «que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la transformación genética de una planta o microorganismo .

Figuras Figura 1: Secuencia de aminoácidos del receptor para VIP3A(a) traducida a partir del ADNc. Se muestran varias características de la proteína: línea punteada - péptido de señal (aminoácidos 13 a 35) ; i tálicas - dominio que se extiende en el dominio de muerte supuesto (aminoácidos 81-205) ; doble subrayado - secuencias con una fuerte homología con secuencias encontradas en los dominios de muerte en consenso; negrillas -motivo CKC repetido seis veces, extendiéndose en los motivos EGF; subrayado - secuencias repetidas dentro de los motivos EGF.

Plagas de Artrópodos Para los propósitos de la presente invención, las plagas incluyen insectos y arácnidos seleccionados de los órdenes de Coleópteros, Dípteros, Himenópteros , Lepidópteros, Malófagos, Homópteros, Hemípteros, Ortrópteros, Tisanópteros , Dermápteros, Isópteros, Anoplura, Sifonápteros , Tricópteros, y Acaros, particularmente Coleópteros y Lepidópteros. Una lista de plagas asociadas con plantas de cultivo mayores se proporciona, por ejemplo, en las Tablas 1 a 10 de las páginas 13 a 20 de la Publicación Internacional Número WO 96/10083, la cual se incorpora a la presente como referencia. Otras plagas se proporcionan en las siguientes Tablas 1 a 8. Estas plagas se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Tabla 1; Lepidópteros (Mariposas v Polillas) Maíz Sesamia nonagroides , barrenador de maíz del mediterráneo Ostrinia fumacalis, barrenador de maíz asiático Algodón Helicoverpa armígera, gusano de bola de algodón Arroz Chilo suppressalis, barrenador de arroz asiático Scirpophaga sp.

Jitomate Helicoverpa zea, gusano de fruta de jitomate Spodoptera exigua, gusano guerrero de remolacha Spodoptera frugiperda, gusano guerrero de otoño Spodoptera orni thogalli , gusano guerrero de franjas amarillas Spodoptera praefica, gusano guerrero de franjas amarillas occidental Spodoptera eridania, gusano guerrero del sur Agrotis ípsilon, oruga nocturna negra Peridroma saucia, oruga nocturna variegado Papaipema nebris, barrenador de tallos Trichoplusia ni , oruga de col Keiferia lycopersicella, gusano picador de jitomate Manduca sexta, gusano de cuerno de tabaco Manduca quinquemaculata, gusano de cuerno de jitomate Cruciferas (brócoli, col, coliflor, berzas) Artogeia rapae, «gusano de col importado Pieris brassicae, mariposa de col Trichoplusia ni , oruga de col Plutella xylostella, polilla de lomo de diamante Spodoptera exigua, gusano guerrero de remolacha Agrotis ípsilon, oruga nocturna negra Agrotis segetum, oruga nocturna común Mamestra configura, gusano guerrero bertha Uvas Endopiza viteana, polilla de baya de uva Frutas y nueces deciduas Cydia pomonella, polilla bacalao Platynota idaeusalis, polilla de capullo de manzana de borla Pimientos Ostrinia nubilalis, barrenador de maíz europeo Spodoptera exigua, gusano guerrero de remolacha Spodoptera eridania, gusano guerrero del sur Papa Ostrinia nubilalis, barrenador de maíz europeo Phthorimaea operculella, gusano de tubérculos de papa Cañóla Plutella xylostella, polilla de lomo de diamante Caña de azúcar Diatraea saccharalis, barrenador de caña de azúcar Tabla 2 : Coleópteros (Escarabajos) Arroz Oulema oryzae, escarabajo de arroz Jitomate Leptinotarsa decemlineata, escarabajo de papa de Colorado Epi trix hirtipennis , escarabajo de tabaco Cruciferas (brócoli, col, coliflor, berzas) Phyllotreta cruciferae, escarabajo de cruciferas Phyllotreta pusilla, escarabajo negro del occidental Pimientos Antho.no/jius eugenii , escarabajo de pimiento Papa Leptinotarsa decemlineata, escarabajo de papa de Colorado Epi trix cucumeris, escarabajo de papa Hemicrepidus memnonius, gusano de alambre Melanpotus spp. , gusanos de alambre Cañóla Ceutorhychus aasmilis, escarabajo de semilla de col Phyllotreta cruciferae, escarabajo de cruciferas Tabla 3 : Homópteros (Moscas Blancas, Afidos, etcétera) Arroz Ni 1 parva ta 1 ugens Sogatella furcifera Laodelphaax striatellus Jitomate Myzus persicae, áfido de durazno verde Macrosiphum euphorbiae, áfido de papa Trileurodes vaporariorum, mosca blanca de invernadero Bemisia tabaci, mosca blanca de camote Bemisia argentifolii , mosca blanca de hoja de plata Cruciferas (brócoli, col, coliflor, berzas) Brevícoryne brassicae, áfido de col Myzus persicae, áfido de durazno verde Pimientos Myzus persicae, áfido de durazno verde Papa Empoasca fabae, saltamontes de papa Myzus persicae, áfido de durazno verde Macrosiphum euphorbiae, áfido de papa Paratrioza cockerelli , psílido de papa Melón Bemisia aroentifolii , mosca blanca de hoja de plata Bemisia tabaci , mosca blanca de hoja de camote Zanahoria Cavariella aegopodii , áfido de zanahoria Cañóla Brevicoryne brassicae, áfido de col Verduras Aphis fabae, áfido de frijol Remolacha azucarera Pemphigus popullivenae, áfido de raíz de remolacha azucarera Frutas y nueces deciduas Dysaphi s plantaginea, áfido de manzana rosada Caña de azúcar Saccharosydne saccharivora , mosca de caña de la India Occidental Sipha flava, áfido de caña de azúcar amarillo Tabla 4: Hemípteros (Chinches) Jitomate chinche ligus Acrosternum hilare, chinche verde Euschistus servus, chinche castaña Tabla 5 : Ortópteros (Saltamontes, Grillos, y Cucarachas) Trigo Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorios Tabla 6 : Dípteros (Moscas y Mosquitos) Jitomate Liriomyza trifolii , minero de hojas Liriomyza sativae, minero de hojas de verduras Scrobipalpula absoluta, minero de hojas de jitomate Cruciferas (brócoli, col, coliflor, berzas) Delia brassi cae, larva de col Delia radicu , mosca de raíz de col Zanahoria Psilia rosae, mosca de óxido de zanahoria Remolacha azucarera Tetanops myopaeformis , larva de raíz de remolacha azucarera Verduras Liviomyza sativae, minero de hojas de verduras Tabla 7 : Tisanópteros (Trips) Jitomate Franklini ella occidentakis , tisanópteras de flor occidental Frankliniella fusca , tisanópteras de tabaco Thrips tabaci , tisanopteras de cebolla Cruciferas (brócoli, col, coliflor, berzas! Thrips tabaci , tisanópteras de cebolla Pimientos Thrips palmi , tisanópteras de melón Papa Thrips palmi , tisanópteras de melón Tabla 8 : Acaros (Garrapatas y Acaros) Jitomate Tetranychus urticae, acaro rojo de dos manchas Aculops lycopersi ci , acaro de roseta de jitomate Steneotarsonemus pallidus , acaro de ciclamen Cítricos Panonychus ci tri , acaro rojo de cítricos Brevipalpus lewisi , acaro plano de cítricos Phyllocoptru tra oleivora , acaro de óxido de cítricos Frutas y nueces deciduas Panonychus ulmi , acaro rojo europeo Tetranchus sp, acaro rojo Para los propósitos de la presente invención, las plagas también incluyen fitopatógenos fúngales de plantas . En la Tabla 9 se proporciona una lista de plagas fúngales asociadas con plantas de cultivo mayores . Estas plagas se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Tabla 9 : Enfermedades Fúngales de las Plantas Mohos de mazorca Moho de mazorca Gibberella Gibberella zeae G. saubinetti Putrefacción de mazorca de Aspergillus Aspergillus flavus A. parasi ticus Putetracción de mazorca de Diplodia Diplodia mayáis D. macrospora Putetrafacción de mazorca de Fusarium Fusarium moniliforme F. monilif. var. subglutin Putrefacciones de tallo Putrefacción de tallo de Pythium Phythium aphanidermata Putrefacción de tallo de Anthracnose Colletotrichum graminicola C. tucuanensis Glomerella graminicola Putrefacción de tallo de Diplodia Diplodia may dis D. zeae-maydis Stenocarpella may dis Macrodiplodia zeae Sphaeria may dis S. zeae D. macrospora Putrefacción de tallo de Fusarium Fusarium moniliforme Pitrefacción de tallo de Gibberella G. zeae G. saubinetti Marchitamiento de Stewart y Erwinia stewartii agostamiento de hojas Enfermedades de las hojas Agostamiento de hoja de maíz del norte Exserohilum turcicum Agostamiento de hoja de maíz del sur Bipolar is mayáis Mancha de hoja gris Cercospora zeae -maydi s C. sorghi var. mayáis Agostamiento de hoja de Anthracnose Colletotrichum graminicola Oxido común Puccinia sorghi P. maydi s Oxido del sur Puccinia poly s ora Dicaeoma polysorum Tizne de cabeza Sphacelotheca reiliana Tizne común Ustilago mayáis Mancha de hoja de Carbonum Heirmil thosporium carbonum Mancha de ojo Kabatiella zeae Mohos del amanecer Moho del amanecer de sorgo Pernosclerospora sorghi Moho del amanecer de franja castaña Sclerophthora rayssiae Moho del amanecer de caña de azúcar Peronosclerospora sacchari Moho del amanecer filipino Peronoscler. philippinensi Moho del amanecer de Java Peeronosclerospora mayáis Moho del amanecer espontáneo Peronoe cl erospora spon tan Moho del amanecer de Rajastán Peronoscl erospora he teropog Moho del amanecer Graminicola Sclerospora graminicola Óxidos Puccinia graminis f. sp. trit Puccinia recon?i ta f. tritici Puccinia striiformis Tiznes Tilletia tritici Tilletia controversa Tilletia in?ica Ustilago tri tici Urocys tis tri tic i Putrefacción de raíz, putrefa Gaeumannomyces graminis cciones y agostamientos de pies Pythium spp. Fusarium culmorum Fusarium graminaerum Fusarium avenaceum Drechslere tri tici - repent i Rhi zoc toni a spp . Coil eto tri chum graminicola Hel in thospori um spp . Microdochium nivale Pseudocercosporella herpotrichoid Mohos Erysiphe graminis f. sp. triti Sel roph thora ma crospora Enfermedades Fúngales Varias Septoria tri tici Septoria nodorum Las proteínas de la clase VIP3 son secretadas hacia el medio por Bacillus spp . en las etapas vegetativas del crecimiento. La VIP3A(a) es un miembro de una clase recién descubierta de proteínas que exhiben actividad insecticida contra un amplio espectro de insectos lepidópteros, incluyendo la oruga nocturna negra (Agrotis Ípsilon) , el gusano guerrero de otoño ( Spodoptera f ugiperda) , el gusano guerrero de remolacha (S. exigua) , El gusano guerrero de franjas amarillas (S. orni thogalli) , el barrenador de maíz suroccidental (Diatraea grandiosella) , el barrenador de caña de azúcar (D. saccharalis) , el gusano de mazorca de maíz (Helicoverpa zea) , el barrenador de maíz del mediterráneo ( Sesamia nonagroides) , la oruga de col ( Trichoplusia ni) , la oruga de frijol de terciopelo (Anticarsia gemmatalis) , la polilla de lomo de diamante (Plutella xylostella) , y el gusano de capullo de tabaco (Heliothis virescens) . Se ha demostrado que algunos de estos lepidópteros son muy resistentes a otras proteínas insecticidas, tales como d-endotoxina. Por ejemplo, la LC50 reportada para CrylA(c) , que es una de las d-endotoxinas más efectivas contra la oruga nocturna negra, es mayor de 6,000 nanogramos/centímetro cuadrado (Macintosh y colaboradores, J. Invertebr. Pathol. 56:258-266 (1990) ) . En contraste, se necesitan 260 veces menos de proteína VIP3A(a) para aniquilar el 50 por ciento de las larvas de la oruga nocturna negra. Por consiguiente, la proteína VIP3A(a) exhibe un espectro único de actividad insecticida.

La presente invención proporciona un nuevo miembro de la clase de proteínas VIP3, la proteína VIP3A(c) aislada a partir de la cepa AB51 (depositada con el número de acceso NRRL B-21675; todos los depósitos se hicieron de acuerdo con el Tratado de Budapest, al presentarse ante el Servicio de Investigación Agrícola, Colección de Cultivos de Patente (NRRL) , Northern Regional Research Center (Centro de Investigación Regional del Norte) , 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604, EUA) , como se da a conocer en las SEQ ID NOS: 5-6..

La secuencia de ADN que codifica para la proteína VIP3A(c) se identificó y se aisló mediante el uso de tecnología de reacción la cadena de la polimerasa. En particular, se pueden hacer secuencias cebadoras que reconozcan regiones conservadas o variables de la secuencia de codificación, y luego se utilizan para seleccionar las muestras de ADN obtenidas de cualesquiera cepas conocidas o desconocidas. Se reconoce que existen múltiples planteamientos para identificar y aislar homólogos dentro de la clase de proteínas VIP3 y las secuencias de ADN que las codifican, cuyos planteamientos son bien conocidos por los expertos en este campo. Las secuencias de ADN y de proteína para las proteínas VIP3A(a) y VIP3A(c) están alineadas en la Tabla 12.

Tabla 12 : Alineamiento de VIP3A(a) (Línea Superior) contra VIP3A(c) (Línea Inferior) 1 M imTKI.STRAIjPSFIDYraGIYGFATCI 50 SEQ ID NO: 2 1 MJSTKÍVTNAJ^STVALPSFIDYFNGIYGFATGI^ 50 SEQ ID NO: 6 51 ILKNQQLL DISGK IX3?mGS ]ro IAQG¡^^ 100 51 ILEN«2Q IjNDISGKLrX3-^GSIjjOT IAQGN ^ 100 101 NTJV I?LDAINTMJ^ LPKITSM SD MK^^ 150 ¡IIIMIMMIMMMIliilllMIIIMMMIIIIMIIMMIl 101 OTV NKIjDAIim-jIjRVY PKITSMLSD -^^ 150 151 DKLDIINV VTJINSTLTEITPAYQRIKYVNEKFEELTFATETGSSKVKKG^ 200 INI 151 DIOiDIIl"VNV INST TEITPAYQ.-ttK"?^^ 200 201 SPADIIJDELTELTElJ->iSVTKJrov8^ 250 Mili 201 SPADI-RDELSE TE-J-iKSVTQirovDGFEFT^^ 250 251 TASELITKENVT GSGSEVGNVYNFLIV TAI^ 300 251 TASELITKEJJVKTSGSEVGJWYNF IVLTA^ 300 301 ID TSIMNEHI?vIKJiaíE RVNI ?^-^SNTFSN^^ 350 MIMMMMMIIIMMMMMIMMMMMMIIIMIIMM 301 IDY SIMNEHLípvj3KEEFRV IL?>TLSNtFSNP^ 350 351 AKPGHALIGITEIS?roSITV-JVYEAIvI^ 400 MMMMMMIMMMMMMMMMIMIMMIIIMIMMI 351 AKPGHALIGFEISOTSITVLivVYEAKI?QOT 400 401 CPDQSEQIYY ^IVFP1«IEYVITKIDPGKKMCT 450 ] 11 i ] - 11 i ! 111 i ! 11 i 11 ! ti t i i I i 1 !! 11111111 i 1 ! 11111 i I ! 401 CPI)QSGQIY?TNNrvTPNEYVITKIDFTI2vlffi^ 450 451 DLNKKK ?SSEAEYRTLSAOTDGVYMPLG^ 500 11 ! 11111111111 ! i I M 1 í 1 i !! I i i 1 ! 11 i I ! i 111 li 1 ! 1111 i I i 451 DLl^KKKVESSEA)i^TvT^SAiroi 3VYMPLGVISE^ 500 501 R ITLTCKSY RE^IATDLS KETK IVPPSGFISNIV?aWSIEElJ LE 550 MillMMMMMMMMMIMIIMMIMMMIIIMMMM 501 R ITLTCKSYLRELLATDLSNKET^ 550 551 PWKANNKl^YVDHTGGVNGTKALYVHKDGGISQFIGDI^ 600 1 II I i ! 1 ti! 11 ! 111 i 11 i 1111 i 11 i 11111 i 111 i i t ii I ! 111 i! I 551 PWKANNKNAYVDHTGGVNGTKA^ 600 601 VKGKPSIH imENTGYIHYEyrN ^EDYQTI 650 11 M 11111 ¡ I i I M 111 i 11 M 111 M 11 M ! ! II ! 111 i 1111 i M I í 601 VKGKPSIH IOEÍ- GYIHYEDTNra-^^ 650 651 SQNGDEAWGDOTII.t^ISPSEKI^SPELIÍ-tNNVrcSTC^ 700 I i i 111111111 M 111 M I i 111 i 11 M 11 i 1111 E t i I ¡i I i i t i 1 i ! 651 SQNGDEATODOTIILEISPSEKLLSPELI T i^ 700 Dominios de Pollpéptido da la Claaa da Protaínaa VIP3 Se ha demostrado que la proteína VIP3A(a) sufre procesamiento proteolítico cuando se mezcla con los fluidos intestinales de las larvas de insecto. Cuando se mezclan fluidos intestinales aislados de oruga nocturna negra, con VIP3A(a) purificada, se pueden identificar cuatro productos proteolíticos mayores derivados a partir de VIP3A(a) que tienen un peso molecular de aproximadamente 66, 45, 33, y 22 kDa. La banda de 22 kDa comprende la porción N-terminal de la proteína VIP3A(a) desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 198 de la SEQ ID NO: 2. La banda de 66 kDa comprende el resto de la proteína VIP3A(a) desde el aminoácido 200 hasta el aminoácido 789 de la SEQ ID NO: 2. Ambas bandas de 45 y 33 kDa se derivan de la proteólisis desde la banda de 66 kDa, y constituyen desde el aminoácido 412 hasta el aminoácido 789, y desde el aminoácido 200 hasta el aminoácido 455, respectivamente, de la SEQ ID NO: 2. La banda de 33 kDa es el componente principal de la proteína VIP3A(a) que queda después de un período de incubación de más de 2 horas . Este dominio de "centro tóxico" de 33 kDa (aminoácidos 200 a 455 de la SEQ ID NO: 2) de la proteína VIP3A(a), retiene todas las propiedades insecticidas contra un amplio espectro de insectos lepidópteros. Se obtienen resultados similares cuando la VIP3A(a) se incuba con los fluidos intestinales aislados de gusano guerrero de otoño, otro insecto sensible a la VIP3A(a) . En adición al dominio del centro tóxico, la proteína VIP3A(a) posee un dominio estabilizante en el extremo C. El papel del dominio estabilizante se exploró utilizando mutantes de la proteína VIP3A(a) y la proteína V?P3A(c), ninguno de los cuales exhibe propiedades insecticidas cuando son ingeridos por los insectos que se sabe que son sensibles a la VIP3A(a) . Cuando se condujeron estudios similares dirigidos a la estabilidad en el fluido intestinal de la oruga nocturna negra con mutantes de VIP3A(a) , en particular con un mutante de la proteína VIP3A(a) que contiene tres mutaciones puntuales localizadas en el dominio carboxi-terminal (aminoácido 742 (E ? D) ; aminoácido 770 (S-P) ; y aminoácido 784 (Y-H) ) , se descubrió que la proteína se hidrolizaba completamente. Se obtuvieron resultados similares para la proteína VIP3A(c) (SEQ ID NO: 6) aislada a partir de AB51, que comparte una indentidad global del 96 por ciento con la proteína VIP3A(a), pero carece del dominio carboxi-terminal de VIP3A(a) . Tanto el mutante como la proteína VIP3A(c) , sin embargo, son activos contra la línea de células de insecto Sf-9. Estos resultados indican que la función del dominio carboxi-terminal de las proteínas de la clase VIP3 es proporcionar estabilidad a la proteína en el medio ambiente intestinal de los insectos susceptibles.

Toxinas Híbridas gue Comprenden una Región de VIP3 y una Región Heteróloga Las toxinas, las enzimas, los factores de transcripción, los anticuerpos, las fracciones de enlace celular, u otros dominios de proteína, se pueden enlazar operativamente con las proteínas novedosas de la presente invención, mediante la producción de fusiones genéticas dentro del marco que, cuando se traducen por los ribosomas, producirían una proteína de fusión con los atributos combinados de la VIP y el otro componente utilizado en la fusión. Además, si el dominio de proteína fusionada con la VIP tiene una afinidad para otra proteína, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, u otro producto químico o factor, entonces se puede formar un complejo de tres componentes. Este complejo tendrá los atributos de todos sus componentes. Se puede utilizar un razonamiento similar para producir complejos de cuatro o más componentes. Estos complejos son útiles como toxinas insecticidas, productos farmacéuticos, reactivos de laboratorio, y reactivos de diagnóstico, etcétera. Los ejemplos en donde estos complejos se utilizan actualmente, son toxinas de fusión para terapias potenciales de cáncer, reactivos en ensayos ELISA, y análisis de inmunoblot. Las toxinas híbridas de la invención incluyen proteínas quiméricas que tienen un dominio de centro tóxico que es heterólogo para el dominio estabilizante. Las toxinas híbridas también se crean mediante la combinación de un anticuerpo, o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, que reconozca inmunológicamente al receptor VIP3 con un dominio tóxico de otras proteínas . El dominio tóxico se obtiene de un número de proteínas citotóxicas. Estas incluyen, pero no se limitan a, toxinas de Bacillus, incluyendo endotoxinas y proteínas insecticidas vegetativas. Ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/037,057, presentada el 25 de marzo de 1993, y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 07/951,715, presentada el 25 de septiembre de 1992, incorporadas a la presente como referencia. Otras toxinas incluyen inactivadores de ribosoma catalíticos tales cono gelonina, éxotoxina A de Pseudomonas o fitolaccina (la estructura de la exotoxina de Pseudomonas se ha caracterizado bien en Chaudhary y colaboradores, J. Biol. Chem. 265:16303-16310 (1990)); interruptores del metabolismo celular, tales como ribonucleasa (ver, por ejemplo, Mariani y colaboradores, Nature 347:737-741 (1990) ) ; toxina Barnase (o PE-Bar) , una toxina quimérica derivada a partir de la exotoxina A de Pseudomonas y una ribonucleasa (ver, Prior y colaboradores, Cell 64:1017-1023 (1991)),- péptidos hidrofílicos que crean poros en las membranas (ver, Frohlich y Wells, Int . J. Peptide Protein Res . 37:2-6 (1991)).

Modo de Acción de VIP3A(a) Se ha demostrado «que la proteína VIP3A(a) es activa contra un amplio espectro de plagas de plantas. Por ejemplo, las observaciones histopatológicas indican «que la ingestión de VIP3A(a) por insectos susceptibles, tales como oruga nocturna negra (Agrotis ípsilon) y gusano guerrero de otoño (Spodoptera frugiperda) , ocasiona parálisis del intestino en concentraciones tan bajas como de 4 nanogramos/centímetro cuadrado de la dieta, con una lisis completa de las células epiteliales del intestino que da como resultado muerte larval en concentraciones mayores de 40 nanogramos/centímetro cuadrado. Los insectos menos susceptibles como el barrenador de maíz europeo ( Ostrinia nubilalis) no desarrollan patología alguna al ingerir VIP3A(a) . Aunque el procesamiento proteolítico de la proteína VIP3A(a) por los fluidos del intestino medio, obtenidos de insectos susceptibles y no susceptibles es comparable, los estudios de inmunolocalización en vivo demuestran que el enlace de VIP3A(a) se restringe a las células intestinales de los insectos susceptibles. Por consiguiente, el rango de insectos hospederos para la VIP3A(a) parece ser determinado por su capacidad de enlace a las células intestinales. Las observaciones histopatológicas indican que las células epiteliales del intestino medio de los insectos susceptibles, son el objetivo primario para la proteína insecticida VIP3A(a) y su lisis subsecuente es el mecanismo primario de letalidad. La muerte celular programada es un proceso activo de auto-destrucción que parece ser importante para el desarrollo y el mantenimiento de los organismos multicelulares (Clem, R.J. y colaboradores, Science 254: 1388-1390 (1991)). Las células que sufren apoptosis, que es una forma de muerte celular programada, generan cuerpos apoptóticos enlazados a membrana, y activan las nucleasas endógenas que disocian la cromatina en fragmentos separados. Las células de insecto SF-9 derivadas a partir de S . frugiperda expuestas a la proteína VIP3A(a) sufren una serie de cambios citológicos y moleculares, incluyendo protuberancias de membrana, profusa vacuolización, y endonucleólisis, que indican un tipo apoptótico de muerte celular programada. Los estudios histológicos han demostrado que la proteína VIP3A(a) dirige las células epiteliales del intestino medio de los insectos susceptibles, a iniciar una serie de cambios citológicos que comprenden una profusa vacuolización e hinchamiento antes de la lisis celular y de la muerte larval. Estas células del intestino medio también experimentaron un proceso de endonucleólisis cuando se expusieron a la proteína VIP3A(a), como fue revelado por la detección en el sitio de la fragmentación del ADN. Estos resultados indican que la VIP3A(a) ejerce sus propiedades insecticidas sobre las células de insecto susceptibles, al desencadenar un tipo apoptótico de muerte celular programada.

Se ha Aislado el Receptor para VIP3A(a) Los resultados inmunohistoquimicos proporcionados anteriormente, indican que la VIP3A(a) tiene la capacidad para enlazarse a las membranas apicales de las células epiteliales del intestino medio, y «que este enlace desencadena el proceso que eventualmente terminará con la lisis celular. Esto indica que existen una o más proteínas localizadas en la membrana apical «que reconocen y se enlazan a la VIP3A(a) actuando como un receptor.

Este receptor señala la interacción con VIP3A(a) y desencadena el proceso de apoptosis. Por consiguiente, el receptor mediará la respuesta de la célula del insecto a la VIP3A(a) . Para aislar este receptor, se seleccionó una biblioteca de ADNc que se hizo a partir de ARNm aislado del tejido del intestino medio de la oruga nocturna negra. El objetivo de la selección fue identificar y aislar secuencias de ADNc que codificaran para proteínas que interactuaran con la VIP3A(a) en el sistema de dos híbridos (ver Fields, S. y Song. O.-K. Nature 340:245-246 (1989)). Este planteamiento dio como resultado la identificación y el "aislamiento de un ADNc cuya proteína codificada interactuó fuertemente con la proteína VIP3A(a) . Este ADNc de 1.75 Kb de largo (SEQ ID NO : 8) codifica para una proteína de aproximadamente 48 kDa (396 aminoácidos; ver la SEQ ID NO: 9) . El ADNc clonado es de un tamaño similar al ARNm que codifica el ADNc analizado mediante la Técnica Northern. Puede estar faltando una porción de la secuencia de ADN que codifica los primeros 5 a 20 aminoácidos. Se pueden identificar las siguientes características en la proteína codificada por el ADNc (ver la Figura 1) : 1) contiene un péptido de señal; 2) contiene un dominio con homología al denominado dominio de muerte (Feinstein, E. y colaboradores, Trens in Biochem. 20:342-344 (1995)) ; y 3) contiene motivos o repeticiones de tipo EGF (Fantl, W.J. y colaboradores, Annu. Rev. Biochem. 62:453-481 (1993)). Una búsqueda de las bases de datos de proteínas que utilizan al receptor de VIP3A(a) mostró homología con una familia de glicoproteínas extracelulares conocidas como Tenascinas (Pearson, C.A. y colaboradores, EMBO J. 7:2677-2681 (1988)), o Hexabraquión (Nies, D.E. y colaboradores, J. Biol. Chem. 266:2818-2823 (1991) ) . Esta familia de proteínas contiene repeticiones de tipo EGF, interactúa con múltiples ligandos, y realiza un papel en la adhesión celular y/o en la señalización. La combinación de un dominio de muerte y motivos EGF repetidos, como se observa en el receptor VIP3 , es única entre los receptores de muerte celular programada. En adición, una porción del receptor VIP3A(a) comparte homología con el denominado "dominio de muerte" . El dominio de muerte es un motivo de 60 a 70 aminoácidos de largo «que está involucrado en la interacción de proteína a proteína, y es compartido por proteínas con diversas funciones celulares (Feinstein, E. y colaboradores, Trends in Biochem. 20:342-344 (1995) ) . Algunos de los miembros de la proteína que contienen motivos de dominio de muerte incluyen los receptores «que se sabe «que están asociados con los procesos apoptóticos. Algunos ejemplos incluyen al receptor Fas (Brakebush, C. y colaboradores, EMBO J. 11:943-950 (1992)), y el factor de necrosis tumoral (TNF) (Tartaglia, L.A. y colaboradores, Cell 74:845-853 (1993)). Los homólogos para el receptor VIP3A(a) se pueden identificar y aislar mediante diferentes medios, por ejemplo, mediante hibridación de ácido nucleico. Se puede realizar análisis Southern Blot sobre muestras de ADN tomadas de células de insectos o de células fúngales que se hayan restringido con enzimas, correr en agarosa, y pasar filtros de nitrocelulosa y/o nailon. El análisis Southern Blot se puede sondear con la longitud completa o parcial del ácido nucleico que codifica para el receptor de la proteína VIP3A(a) bajo hibridación de baja estringencia y condiciones de lavado. Los genes se pueden clonar y secuenciar fácilmente a partir de un ADNc o de la biblioteca genómica. También se puede obtener una biblioteca genómica de un tamaño seleccionado para facilitar la clonación de los genes de interés. Los protocolos técnicos para realizar los experimentos ilustrados anteriormente ya están disponibles (ver, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Volúmenes 1-3, Sambrook y colaboradores (editores), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), y la referencia en el mismo) .

Anticuerpos para VIP3A(a) y su Receptor Se proporcionan anticuerpos policlonales y monoclonales para una proteína VIP3 o su receptor, incluyendo sus fragmentos que reconocen inmunológicamente una porción de cualquier proteína. El anticuerpo y los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden preparar mediante la utilización de una proteína VIP3 o su receptor como el antígeno. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, así como fragmentos de los mismos, que retienen su capacidad para enlazar una proteína VIP3 o su receptor. Se dice que un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo, es capaz de enlazar una molécula, si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula, para enlazar de esta manera la molécula al anticuerpo, al anticuerpo monoclonal, o al fragmento del mismo. El término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) incluye las moléculas intactas, así como los fragmentos o las regiones de enlace o los dominios de las mismas (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab)2) que son capaces de enlazar el hapteno. Estos fragmentos típicamente son producidos mediante disociación proteolítica, utilizando enzimas digestivas tal como papaina o pepsina. De una manera alternativa, se pueden producir fragmentos de enlace de hapteno a través de la aplicación de tecnología de ADN recombinante, o a través de química sintética. En general se conocen en la técnica los métodos para la preparación de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, ver Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lañe (editores) , Cold Spring Laboratory, NY (1988) , así como las referencias citadas en el mismo. Los trabajos de referencia convencionales establecen los principios generales de la inmunología incluyen: Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, NY (1982) ; Dennett, R. y colaboradores, Monoclonal Antibodies, Mybridoma: A New Dimensión in Biological Analyses, Plenum Press, NY (1980) ; y Campbell, A. "Monoclonal Antibody Technology" , en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volumen 13, Burdon y colaboradores (editores) , Elsevier, Amsterdam (1984) . Ver también las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,609,893; 4,713,325; 4,714,681; 4,716,111; 4,716,117; y 4,720,459. Se reconoce que siguiendo los métodos descritos en la presente, se pueden generar anticuerpos específicos para una proteína VIP3 particular o su receptor. El subconjunto de líneas de anticuerpos monoclonales que procesan la especificidad de enlace deseada, se puede utilizar como una fuente de ARN mensajero para la clonación del ADNc para el anticuerpo monoclonal particular. Luego el ADN clonado se puede secuenciar mediante métodos conocidos en este campo. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) , volúmenes 1-3, y las referencias citadas en el mismo. A partir de la secuencia del ácido nucleico, se puede deducir la secuencia de la proteína de la región de enlace a partir del anticuerpo monoclonal seleccionado. Un uso de los anticuerpos y de los anticuerpos monoclonales de la invención incluye, pero no se limita a, la producción de moléculas de toxina híbrida. Es decir, cuando se enlaza, el fragmento monoclonal o el fragmento del anticuerpo retiene sus propiedades de enlace, y la fracción de toxina retiene sus propiedades citotóxicas. Se conocen diferentes métodos para obtener genes de anticuerpos. Un método es clonar una biblioteca aleatoria de genes de anticuerpo en un fago, y seleccionar la biblioteca por la capacidad para enlazarse a una proteína VIP3 o su receptor. Otro planteamiento disponible es generar anticuerpos monoclonales que se fijen a una proteína VIP3 o a su receptor, y luego clonar los genes del anticuerpo a partir de estas líneas. Para el presente ejemplo, se utiliza el segundo método. Se pueden clonar genes de anticuerpo a partir de células de hibridoma utilizando cebadores para las secuencias de ADN conservadas dentro de las regiones constantes y las regiones de estructura de las regiones variables, y se amplifican para la clonación utilizando la reacción en la cadena de la polimerasa (PCR) . Ver en general, Mullís y colaboradores, Meth. Enzymol . , 155:335-350 (1987); Erlich, (ed.), PCR Technology, Stockton Press (Nueva York 1989). Se ha utilizado con éxito una base de datos de secuencias de cadena pesada y de cadena ligera de ratón, compilada por Kabat y colaboradores, US Dept Health and Human Services, US Government Printing Offices (1991) , para generar tanto cebadores específicos del isotipo como degenerados para la clonación de genes de anticuerpos. (Jones y colaboradores, Bio/technology 9:88-89 (1991) ) . Adicionalmente, se conocen bien las técnicas para la clonación de fragmentos más pequeños de anticuerpos (Fab) que poseen las propiedades de enlace del anticuerpo original. Los anticuerpos completos son moléculas grandes (de 150 kDa) , pero se ha demostrado que los fragmentos de anticuerpo más pequeños, y los fragmentos de enlace de antígeno Fv (de 12 kDa a 50 kDa) retienen una afinidad de enlace completa. Se han utilizado con éxito fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) , en donde los dominios Vh y VI están enlazados por un péptido hidrofílico y flexible, para dirigir enzimas y toxinas a células específicas (Bird, Science 423:423-426 (1988); Huston, PNAS 85:5879-5883 (1988) ) . Los dominios Vh sencillos (Dabs) y las regiones determinantes complementarias sencillas tan pequeñas como de 20 aminoácidos de longitud, denominadas como unidades de reconocimiento mínimo (m.r.u.), también se han utilizado para el enlace del antígeno (Ward, Nature 341:544-546 (1989); Taub, J. Biol. Chem 264:259-265 (1989); Williams, PNAS 86:5537-5541 (1989) ) . Por consiguiente, es posible reducir el dominio de enlace específico para una VIP3 o su receptor hasta un tamaño muy pequeño . La tecnología de la reacción en la cadena de la polimerasa y los cebadores de oligonucleótídos específicos, se utilizan para clonar genes de inmunoglobulina o regiones a partir de genes de inmunoglobulina. Se seleccionaron cebadores de reacción en la cadena de la polimerasa específicos tanto para la cadena pesada como la cadena ligera de IgM y los tres isotipos IgG a partir de la base de datos de Kabat descrita anteriormente.

Se designaron cebadores para la región que codifica el extremo NH2-terminal de la región variable madura, para iniciar, en la primera región de la estructura, y se hicieron con alguna degeneración para permitir que se utilizaran como "cebadores universales". Los cebadores 3' utilizados para la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa específica de las regiones variables se diseñaron a partir de secuencias conservadas del primer dominio constante (CH1) de tanto la cadena ligera como la cadena pesada. Se utiliza un cebador 3' diferente para los isotipos de inmunoglobulina IgGl, IgG3 , e IgM. Los isotipos IgG2A e IgG2B se pueden amplificar con los mismos cebadores utilizados para IgGl . Las regiones variables del anticuerpo se clonan en un vector de expresión de cadena ligera y pesada que contiene un péptido de señal de retículo endoplásmico, y las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada de IgGl, respectivamente. Las secuencias cebadoras utilizadas para la clonación con la reacción en cadena de la polimerasa de las regiones variables ligera y pesada de inmunoglobulina de ratón están disponibles en la literatura publicada (Coloma y colaboradores, Bio/Techniques 11: 152-156 (1991); Jones y colaboradores, Bio/Technology 9:88-89 (1991)) . Se hicieron oligonucleótidos en un sintetizador de ADN Applied Biosystems 380B (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando condiciones convencionales, como se describe más adelante. Los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa incorporan sitios de restricción, y después de la amplificación y la digestión, se pueden clonar en un vector de expresión en planta bajo el control de un promotor que se puede expresar en planta. Se seleccionaron sitios de restricción que se sabía que estaban ausentes en los genes del anticuerpo secuenciados. Otro uso de los anticuerpos policlonales y/o monoclonales de la invención, incluye el estímulo de la apoptosis mediante la dirección del receptor a Vip3A con anticuerpos. La interacción de los anticuerpos criados contra proteínas localizadas en la superficie celular que están involucradas en el control del crecimiento celular, da como resultado la inducción de apoptosis al impedir «que el receptor se fije a su(s) ligando (s) natural (es) . Por ejemplo, el anticuerpo anti-APO-1 bloquea completamente la proliferación de las células de leucemia que llevan la proteína APO-1, y desencadenan la apoptosis en estas células (Trauth, B.C. y colaboradores, Science 245:301-305 (1989) ) . También, se imita la actividad resultante de la interacción entre un receptor dado y un ligando mediante la sustitución del ligando por anticuerpos criados contra el receptor. Por ejemplo, la adición de ciertos anticuerpos anti-Fas a las células que llevan el receptor Fas en sus superficies celulares, mediará la apoptosis de una manera similar a cuando se agrega el ligando del receptor Fas (Itoh, N. y colaboradores, Cell 66:233-243 (1991)). El receptor para Vip3A(a) aislada de oruga nocturna negra comparte homología con una familia de glicoproteínas extracelulares conocidas como Tenascinas, y en particular con Tenascina-X (Bristow, J. y colaboradores, J. Cell Biol. 122:265-278 (1993) ) . Se sabe que las Tenascinas-X están involucradas en la adhesión de célula a célula, y en la señalización. La falta de funcionalidad de la Tenascina-X, bien sea por mutación o por la remoción del gen, conduce a letalidad. Por consiguiente, los anticuerpos criados contra diferentes dominios del receptor para Vip3A(a) , bloquean efectivamente al receptor de su enlace a su(s) ligando (s) , o imitan la interacción de la proteína Vip3A(a) que desencadena la apoptosis. Este planteamiento se extiende hasta diferentes receptores con funciones biológicas similares. En este sentido, los anticuerpos criados contra receptores de células de insecto involucrados en el crecimiento celular crucial y en los procesos de interacción, conducen a la inducción de apoptosis, y se utilizan como una estrategia para controlar insectos.

Selección de Actividades Insecticidas Novedosas Cuyo Modo de Acción es la Apoptosis Los materiales descritos en esta invención se utilizan para seleccionar ligandos químicos que tienen propiedades plaguicidas que desencadenan las respuestas apoptóticas. Los ligandos químicos incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, y proteínas. En una modalidad de la invención, se utilizan líneas celulares de insecto como organismos modelo para insectos, con el fin de seleccionar compuestos que sean insecticidas como una consecuencia de su capacidad para inducir la apoptosis. Estas líneas celulares se manejan en un formato de selección de alta producción, en donde las células se cultivan en placas de múltiples cavidades, y se exponen a una variedad de compuestos. También se utiliza levadura como un organismo modelo. Empleando los procedimientos descritos en la presente o conocidos en la técnica, se realiza la determinación de si un compuesto es plaguicida como una consecuencia de la inducción de la apoptosis o no. Un medio mediante el cual se identifican los compuestos que desencadenan las respuestas apoptóticas a través de la interacción con un receptor conocido, es recurrir a receptores identificados involucrados en la trayectoria de transducción de señal desencadenada en las líneas celulares de insecto apoptóticas. Estos receptores se transforman en líneas celulares heterólogas, creando líneas isogénicas, conteniendo una de ellas un gen para la expresión de un receptor específico, y otro que no posee ni expresa dicho geri. Estas líneas celulares se manejan en un formato de selección de alta producción, en donde las líneas celulares transformadas que expresan el receptor tienen una respuesta diferencial contra los compuestos que desencadenan la apoptosis a través de su interacción específica con este receptor. La presente invención también abarca la caracterización de marcadores bioquímicos y/o moleculares que identifican específicamente una línea celular de insecto que sufre apoptosis. Por ejemplo, es posible aislar ADNcs específicos inducidos durante un proceso apoptótico en líneas celulares de insecto específicas. Aunque la trayectoria del centro de muerte parece estar filogenéticamente conservada (Nagata, S. Cell 88:355-365 81997) ) , la trayectoria de transducción de señal desde el receptor hasta la trayectoria del centro de muerte está sujeta a variación a través de los organismos. Los ARN mensajeros diferencialmente expresados en células de insecto que sufren apoptosis, son identificados mediante un número de técnicas fácilmente disponibles, tales como despliegue diferencial (Bauer, D. y colaboradores, Nucleic Acid Res. 21:4272-4280 (1993)), o bibliotecas sustractivas (Sommer, H. y colaboradores, EMBO J. 9:605-613 (1990)). Las proteínas codificadas por ADNc diferencialmente expresado, se utilizan como marcadores para la apoptosis en líneas celulares de insecto específicas.

Plantas Transgénicas que Comprenden una Secuencia de ADN que Codifica una Proteína de la Clase VIP3 Una planta hospedera que exprese cuando menos una de las secuencias de la invención, tiene una mejor resistencia al ataque por las plagas de plantas, y por consiguiente, está mejor equipada para soportar las pérdidas de cultivo asociadas con este ataque. Planta significa cualquier especie de planta que se pueda transformar genéticamente mediante los métodos conocidos en este campo. Los métodos conocidos en este campo para la transformación de plantas se discuten más adelante. Las plantas hospederas incluyen, pero no se limitan a, aquellas especies previamente mencionadas como cultivos objetivo.

CASETES DE EXPRESIÓN EN PLANTAS En la técnica se describen las metodologías para la construcción -de los casetes de expresión en plantas, así como la introducción de ADN extraño en plantas. Estos casetes de expresión pueden incluir promotores, terminadores, potenciadores, secuencias líder, intrones, y otras secuencias reguladoras operativamente enlazadas con la secuencia de codificación de proteína plaguicida. Además, se reconoce que se pueden utilizar promotores o terminadores de los genes VIP3 en los casetes de expresión. Los genes de toxina derivados de microorganismos también pueden diferir de los genes de plantas. Los genes de plantas difieren de los genes encontrados en los microorganismos, en que su ARN transcrito no posee una secuencia de sitio de enlace de ribosoma definida adyacente a la metionina iniciadora. En consecuencia, los genes microbianos se pueden mejorar mediante la inclusión de un iniciador de traducción en consenso eucariótico en ATG (Kozak, Cell 44:283-292 (1986)) . Clontech (catálogo 1993/1994, página 210) ha sugerido la secuencia GTCGACCAIGGTC (SEQ ID NO: ) como un iniciador de traducción en consenso para la expresión del gen ui A de E. coli en plantas. Además, Joshi (Nucleic Acids Res. 15: 6643-6653 (1987)) ha comparado muchas secuencias de plantas adyacentes a ATG, y sugiere el consenso TAAACAAIGGCT (SEQ ID NO : ) . En situaciones en donde se encuentren dificultades en la expresión de los marcos de lectura abierta microbianos en plantas, la inclusión de una de estas secuencias en el ATG de iniciación puede mejorar la traducción. En estos casos, los últimos tres nucleótidos del consenso pueden no ser apropiados para la inclusión en la secuencia modificada, debido a su modificación del segundo residuo de AA. Las secuencias preferidas adyacentes a la metionina de iniciación pueden diferir entre las distintas especies de plantas. Al estudiar la secuencia de los genes de maíz presentes en la base de datos GenBank/EMBL, se puede discernir cuales nucleótidos adyacentes a ATG deben modificarse para potenciar la traducción del gen de toxina introducido en maíz . En adición, se ha demostrado que la remoción de los sitios de empalme ilegítimos puede mejorar la expresión y la estabilidad de los genes introducidos. Los genes clonados a partir de fuentes que no sean plantas, y no optimizados para su expresión en plantas, pueden contener motivos que pueden ser reconocidos en plantas como sitios de empalme 5 ' ó 3 ' . En consecuencia, el proceso de transcripción se puede terminar prematuramente, generando ARNm truncado o suprimido. Se pueden diseñar genes de toxina para remover estos sitios de empalme ilegítimos utilizando múltiples técnicas. Por ejemplo, se pueden utilizar varios métodos disponibles para identificar los sitios de empalme potenciales en una secuencia de ADN. Primero se pueden identificar los sitios de empalme potenciales mediante análisis por computadora de la secuencia de ADN. Las secuencias en consenso que identifican los sitios de empalme son conocidas en este campo. Ver, por ejemplo, Goodall, G.J. y Filipowicz, W., EMBO J. 10, 2635-2644 (1991) y Brown, J.W.S., Nucleic Acids Research 14, 9549-9559. (1986) . De una manera alternativa, se pueden identificar los sitios de empalme realmente procesados por una planta, mediante la comparación del análisis de reacción en cadena de la polimerasa del ADNc derivado a partir del gen, con los productos genéticos reales . Los productos más cortos que los productos esperados indican empalme . Estos productos más pequeños se clonan entonces, y se secuencian, y se determina la localización exacta del empalme. También se reconoce que se puede utilizar una combinación de búsqueda por computadora y análisis de reacción en cadena de la polimerasa. Los genes de toxina novedosos de la presente invención, bien sea cómo su secuencia nativa o como secuencias sintéticas optimizadas, como se describieron anteriormente, se pueden fundir operativamente con una variedad de promotores para la expresión en plantas, incluyendo promotores constitutivos, inducibles, temporalmente regulados, regulados por el desarrollo, químicamente regulados, preferidos por el tejido, y específicos del tejido, para preparar moléculas de ADN recombinante, es decir, genes quiméricos. Los promotores constitutivos preferidos incluyen los promotores 35S y 19S de CaMV (Fraley y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,352,605, expedida el 4 de octubre de 1994) . Un promotor adicionalmente preferido se deriva a partir de cualquiera de varios genes de actina, que se sabe que expresan en la mayoría de los tipos de células. Los casetes de expresión del promotor descritos por McElroy y colaboradores (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991) ) se pueden modificar fácilmente para la expresión del gen de toxina novedoso, y son particularmente adecuados para utilizarse en hospederos monocotiledóneos . Todavía otro promotor constitutivo preferido se deriva a partir de ubiquitina, que es otro producto genético que se sabe que se acumula en muchos tipos de células. El promotor de ubiquitina se ha clonado a partir de varias especies, para utilizarse en plantas transgénicas (por ejemplo, girasol - Binet y colaboradores, Plant Science 79: 87-94 (1991), maíz Christensen y colaboradores, Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989) ) . El promotor de ubiquitina de maíz se ha desarrollado en sistemas monocotiledóneos transgénicos, y su secuencia y los vectores construidos para la transformación de monocotiledóneas se dan a conocer en la Publicación de Patente Europea Número EP-0-342,926. El promotor de ubiquitina es adecuado para la expresión del gen de toxina novedoso en plantas transgénicas, especialmente monocotiledóneas. Otros promotores útiles para la expresión del gen de toxina novedoso en plantas, particularmente maíz, son, por ejemplo promotores específicos del tejido o preferenciales del tejido, tales como aquellos dados a conocer en la Publicación Interacional Número WO 93/07278; promotores químicamente inducibles dados a conocer en la Patente Europea Número EP-A-0,332,104, incorporadas a la presente como referencia en su totalidad. En adición a los promotores, también están disponibles una variedad de terminadores de transcripción para utilizarse en la construcción del gen quimérico, utilizando el gen de toxina novedoso de la presente invención. Los terminadores de transcripción son responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgen y su poliadenilación correcta. Los terminadores de transcripción apropiados, y aquellos que se sabe que funcionan en plantas, incluyen al terminador 35S de CaMV, al terminador tml, al terminador de sintasa de nopalina, al terminador rbcS E9 de chícharo, y otros conocidos en la técnica. Estos se pueden utilizar tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. También se sabe «que un número de secuencias líder no traducidas derivadas a partir de virus, tales como aquellas reportadas en, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 96/10083, mejoran la expresión, y éstas son particularmente efectivas en células de dicotiledóneas. Específicamente, se ha demostrado «que las secuencias líder de Virus de Mosaico de Tabaco (TMV) , la "secuencia O") , Virus Moteado Clorótico de Maíz (MCMV) , y Virus de Mosaico de Alfalfa (AMV) son efectivas para mejorar la expresión (por ejemplo, Gallie y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski y colaboradores, Plant Molec . Biol. 15: 65-79 (1990)). Se ha demostrado «que diferentes secuencias de intrones mejoran la expresión cuando se agregan a la región reguladora 5' , particularmente en células monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha descubierto «que los intrones del gen Adhl de maíz mejoran de una manera significativa la expresión del gen de tipo silvestre bajo su promotor conocido cuando se introducen en células de maíz (Callis y colaboradores, Genes Develop. 1:1183-1200 (1987)).

OPTIMIZACION DE LOS GENES vip3 PARA LA EXPRESIÓN EN PLANTAS Los genes plaguicidas de la invención se pueden optimizar para una mejor expresión en plantas. Ver, por ejemplo, las Patentes Números EPA 035947; EPA 0385962; WO 91/16432; y, Perlak y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:3324-3328 (1991) . De esta manera, se pueden sintetizar las secuencias de codificación que se optimizan para la expresión en plantas. En una modalidad de la invención, la vip3A(a) se hace de acuerdo con el procedimiento dado a conocer en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 07/951,715, incorporada a la presente como referencia. En este procedimiento, se utilizan los codones preferidos de maíz, es decir, el único codón que codifica más frecuentemente este aminoácido en maíz . El codón preferido de maíz para un aminoácido particular se puede derivar, por ejemplo, a partir de secuencias genéticas conocidas de maíz. El uso del codón de maíz para 28 genes de plantas de maíz se encuentra en Murray y colaboradores, Nucleic Acids Research 17: 477-498 (1989), cuya divulgación se incorpora a la presente como referencia. Los ejemplos de las secuencias sintéticas hechas con codones optimizados de maíz se estipulan en la SEQ ID NO: 7 (VIP3A(a)), en la SEQ ID NO: 19 (VIP3A(c)), y en la SEQ ID NO: 20 (VIP3A(c)). De esta manera, se pueden optimizar las secuencias de nucleótidos para la expresión en cualquier planta. Se reconoce que toda o cualquier parte de la secuencia genética se puede optimizar o puede ser sintética. Es decir, también se pueden utilizar secuencias sintéticas o parcialmente optimizadas.

TRANSFORMACIÓN DE LA PLANTA Las moléculas de ADN recombinante se pueden introducir en la célula de la planta en un número de maneras reconocidas en este campo. Los expertos en la técnica apreciarán «que la elección del método podría depender del tipo de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación.

Los métodos de transformación de células de plantas adecuados se describen, por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales Números WO 96/10083 y WO 97/46105, respectivamente, incluyendo microinyección, electroporación, transformación mediada por Agrobacterium, transferencia genética directa, y aceleración de partículas balísticas, utilizando dispositivos disponibles en Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin, y Dupont, Inc., Wilmington, Delaware . Una modalidad preferida es el método de transformación de protoplasto para maíz, como se da a conocer en la Solicitud de Patente Europea Número EP-0-292, 435, así como en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,350,689, incorporadas a la presente como referencia en su totalidad. Un conjunto particularmente preferido de modalidades para la introducción de los casetes de expresión de la presente invención en trigo mediante bombardeo de microproyectiles, se puede encontrar en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,610,042, incorporada a la presente como referencia en su totalidad. La transformación de las plantas se puede emprender con una sola molécula de ADN, o con múltiples moléculas de ADN (es decir, co-transformación) , y ambas técnicas son adecuadas para utilizarse con los casetes de expresión de la presente invención. Hay numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación en plantas, y los casetes de expresión de esta invención se pueden utilizar en conjunto con cual«quiera de estos vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y de la especie blanco para la transformación. Hay muchos vectores disponibles para la transformación utilizando Agrobacterium tumefaci ens . Estos típicamente llevan cuando menos una secuencia límite de ADN-T, e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucí. Acids Res. (1984)) . En una modalidad preferida, el gen de toxina novedoso de la presente invención se puede insertar en cualquiera de los vectores binarios pCIB200 y pC?B2001 para utilizarse con Agróbacterium, cuya construcción se da a conocer, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 95/33818 (Ejemplo 35) (ver también la Patente Europea Número EP-0-332 , 104 , Ejemplo 19) . Un vector adicional útil para la transformación mediada por Agrobacterium, es el vector binario pCIBlO, que contiene un gen que codifica la resistencia a la kanamicina para la selección en plantas, secuencias" de límite derecho e izquierdo de ADN-T, e incorpora secuencias del plásmido de amplio rango de hospederos pRK252, que le permiten replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium . Su construcción es descrita por Rothstein y colaboradores (Gene 53: 153-161 (1987)). Se han construido diferentes derivados de pCIBlO que incorporan al gen para la higromicina B fosfotransferasa descrita por Gritz y colaboradores (Gene 25:179-188 (1983)) . Estos derivados hacen posible la selección dé células de plantas transgénicas sobre higromicina solamente (pCÍB743) , o higromicina y kanamicina (pCIB715, pCIB717) . Los métodos que utilizan bien sea una forma de transferencia genética directa o transferencia mediada por Agrobacterium, normalmente, pero no necesariamente, se emprenden con un marcador seleccionable que proporcione resistencia a un antibiótico (por ejemplo, kanamicina, higromicina, o metotrexato) , o a un herbicida (por ejemplo, fosfinotricina) . La elección del marcador seleccionable para la transformación en planta, sin embargo, no es crítica para la invención, a menos «que la expresión de esta resistencia y su actividad bioquímica interfiera con la elección de la protoxina para la conversión en toxina seleccionada para utilizarse en la creación de la fertilidad condicional. Para ciertas especies de plantas, se pueden preferir diferentes marcadores de selección de antibiótico o herbicida. Los marcadores de selección utilizados rutinariamente en la transformación incluyen al gen nptll que confiere resistencia a la kanamicina y a antibióticos relacionados (Messing y Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan y colaboradores, Nature 304:184-187 (1983) ) , el gen bar que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White y colaboradores, Nucí Acids Res 18:1062 (1990), Spencer y colaboradores, Theor Appl Genet 79:625-631 (1990) ) , el gen hph que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger y Diggelmann, Mol . Cell Biol 4:2929-2931) , el gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis y colaboradores, EMBO J. 2: 1099-1104 (1983)), el gen de fosfato de_mañosa isomerasa de, que permite la selección sobre mañosa como una fuente de carbono (Patentes Números EP 530,129 y WO 94/20627) . Un vector útil para las técnicas de transferencia genética directa en combinación con selección mediante el herbicida Basta (o fosfinotricina) es pCIB3064. Este vector se basa en el plásmido pCÍB246, que comprende al promotor 35S de CaMV en fusión operativa con el gen GUS de E. coli , y el terminador de transcripción CaMV 35S, y se describe en la Solicitud Publicada del TCP Número WO 93/07278, incorporada a la presente como referencia. Otro marcador seleccionable útil se obtiene mediante el enlace operable de un promotor de ubiquitina, un gen PAT sintético, y un terminador nos . Un ejemplo de un vector que comprende a este marcador, es el plásmido pCIB9804. Un vector de transformación adicional es el pSOG35, que utiliza a la dihidrofoJLato reductasa (DHFR) del gen de E. coli como un marcador seleccionable que confiere resistencia al metotrexato, y cuya construcción se describe, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 95/33818 (Ejemplo 35) . Otro vector de transformación es el vector pGL2 (Shimamoto y colaboradores, Nature 338, 274-276 (1989)), que contiene al gen de la higromicina fosfotransferasa (hpt) de Streptomyces operativamente enlazado con el promotor 35S y las secuencias termínadoras 35S. Las plantas transgénicas también se pueden identificar a través del uso de un marcador calificable. Los ejemplos de los marcadores calificables útiles en la invención son ß-glucuronidasa, proteína fluorescente verde, y los genes reguladores Cl y B-peru de la trayectoria de antocianina de maíz. En adición, las plantas transgénicas que expresan una proteína VIP3 se pueden identificar mediante su selección para determinar la actividad insecticida sin la necesidad de marcadores calificables o seleccionables. La transformación de maíz con una secuencia de ADN que codifica una prote?na de la clase VIP3, pero de preferencia una proteína VIP3A[c) , de acuerdo con cualquiera de los métodos anteriores, se puede lograr fácilmente mediante bombardeo de microproyectiles de embriones cigóticos inmaduros o de callo embriogénico Tipo I propagable en serie. Para la transformación utilizando embriones cigóticos inmaduros, las mazorcas se auto-polinizan, y se obtienen embriones cigóticos inmaduros aproximadamente 10 días después. Aproximadamente 800 embriones cigóticos inmaduros se dividen entre diferentes placas blanco que contienen un medio capaz de inducir y soportar la formación de callo embriogénico. Los embriones cigóticos inmaduros se transfieren inmediatamente al mismo medio, pero que contiene sacarosa al 12 por ciento. Después de 5 horas, los embriones cigóticos inmaduros se bombardean con un plásmido o plásmidos utilizando el dispositivo PDS-1000/He de BioRad. El plásmido o los plásmidos comprenden un marcador seleccionable, tal como un gen «que confiere resistencia a la fosfinotricina, o un marcador calificable, tal como proteína fluorescente verde, y un gen que codifica una proteína de la clase VIP3 preparado para aplicarse a, y expresarse en, maíz, de acuerdo con la descripción anterior. El plásmido o los plásmidos se precipitan sobre 1 microgramo de partículas de oro esencialmente de acuerdo con el procedimiento publicado de BioRad. Las partículas se aplican utilizando una presión de ráfaga de 108.5 kg/cm2. Cada placa blanco se dispara dos veces con el plásmido y la preparación de partículas de oro. Ya que, en una modalidad de la invención, el plásmido o los plásmidos comprenden un gen quimérico que codifica para la resistencia a la fosfinotricina, esta sustancia se podría utilizar para seleccionar células transformadas in vi tro. Si se utiliza, el agente de selección se aplica en 10 miligramos/litro el día de la aplicación del gen, y se incrementa a 40 miligramos/litro después de aproximadamente un mes. El callo embriogénico así obtenido se puede regenerar en la presencia del agente de selección fosfinotricina si se utiliza el marcador seleccionable. Las plantas se obtienen a partir de las líneas de callo embriogénico seleccionadas. Las plantas regeneradas se ensayan por la resistencia a un insecto susceptible. Todas las plantas que sean resistentes al insecto, también expresan el gen quimérico introducido que codifica una proteína o las proteínas de la clase VIP3 , como es evidenciado por la detección de la proteína VIP3 en la planta, utilizando un ensayo ELISA. Las plantas resistentes al insecto y que expresan la proteína VIP3 se transforman. Para la transformación de maíz utilizando callo embriogénico Tipo I, el callo se obtiene a partir de embriones cigóticos inmaduros, empleando técnicas de cultivo convencionales. Para la aplicación del gen, se preparan aproximadamente 300 miligramos del callo Tipo I, bien sea picando con una navaja de escalpelo, o subcultivando de 3 a 5 días antes de la aplicación del gen. Antes de la aplicación del gen, el callo preparado se coloca sobre un medio de cultivo semisólido conteniendo nuevamente sacarosa al 12 por ciento. Después de aproximadamente 4 horas, el tejido se bombardea utilizando el dispositivo PDS-1000/He Biolistic de BioRad. El plásmido o los plásmidos comprenden un marcador seleccionable, tal como un gen que confiere resistencia a la fosfinotricina, o un marcador calificable, tal como proteína fluorescente verde, y un gen que codifica una proteína de la clase VIP3 preparada para aplicarse a, y expresarse en, maíz, de acuerdo con la descripción anterior. Los plásmidos se precipitan sobre un microgramo de partículas de oro, utilizando esencialmente el protocolo convencional de BioRad. Aproximadamente 16 horas después de la aplicación del gen, el callo se transfiere a un medio de cultivo convencional que contiene sacarosa al 2 por ciento, y si se utiliza el marcador seleccionable, a un 1 miligramo/litro de fosfinotricina. El callo se subcultiva en selección durante 8 semanas, después de lo cual el callo sobreviviente y en crecimiento se transfiere a un medio de regeneración convencional para la producción de las plantas. Las plantas regeneradas se ensayan por la resistencia a un insecto susceptible. Todas las plantas que son resistentes al insecto también expresan el gen quimérico introducido que codifica una proteína de la clase VIP3, como es evidenciado por la detección de la proteína VIP3 en la planta, utilizando un ensayo ELISA. Las plantas resistentes al insecto y que expresan una proteína de la clase VIP3 se transforman.

PRINCIPIOS COMPLEMENTARIOS DE CONTROL DE INSECTOS Las proteínas plaguicidas de la invención se pueden utilizar en combinación con d-endotoxinas de Bt, u otras proteínas insecticidas, para incrementar el rango objetivo de insectos blanco. Además, el uso de las VIP de la presente invención, pero de preferencia de la proteína VIP3A(c), en combinación con las d-endotoxinas de Bt u otros principios insecticidas de una naturaleza distinta, tiene una utilidad particular para la prevención y/o el manejo de la resistencia a los insectos . Las diferentes proteínas de cristal insecticidas de Bacillus thuringi ensis se han clasificado basándose en su espectro de actividad y en su similitud de secuencia. La clasificación presentada por Hófte y Whiteley, Mícrobiol . Rev. 53:242-255 (1989), puso las proteínas de cristal insecticidas entonces conocidas en cuatro clases principales. En general, las principales clases se definen por el espectro de actividad, con las proteínas Cryl activas contra Lepidópteros, las proteínas Cry2 activas contra tanto Lepidópteros como Dípteros, las proteínas Cry3 activas contra Coleópteros, y las proteínas Cry4 activas contra Dípteros . Dentro de cada clase principal, las d-endotoxinas se agrupan de acuerdo con la similitud de secuencia. Las proteínas Cryl típicamente se producen como proteínas de protoxina de 130 a 140 kDa, «que se disocian proteolíticamente para producir proteínas de toxina activas de aproximadamente 60 a 70 kDa. La porción activa de la d-endotoxina reside en la porción NH2-terminal de la molécula de longitud completa. Hófte y Whiteley, supra, clasificaron las proteínas Cryl entonces conocidas en seis grupos, lAa, lAb, lAc, IB, ÍC, y ID. Desde entonces, también se han caracterizado las proteínas clasificadas como CrylEa, CrylFa, Cry9A, Cry9¿C, y Cry9B. El espectro de actividad insecticida de una d-endotoxina individual de Bacillus thuringiensis , tiende a ser muy estrecho, siendo una d-endotoxina dada activa contra solamente unos cuantos insectos. La especificidad es el resultado de la eficiencia de los diferentes pasos involucrados en la producción de una proteína de toxina activa, y su capacidad subsecuente para interactuar con las células epiteliales en el tracto digestivo del insecto. En una modalidad preferida, la expresión de las VIPs en una planta transgénica está acompañada por la expresión de una o más d-endotoxinas de Bt . Las d-endotoxinas de Bt particularmente preferidas, son aquellas dadas a conocer en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 07/951,715, incorporada a la presente como referencia. Se sabe bien que muchas proteínas de d-endotoxina de Bacillus thuringiensis se expresan realmente como protoxinas. Estas protoxinas se solubilizan en el medio ambiente alcalino del intestino del insecto, y se convierten proteolíticamente mediante las proteasas, en un fragmento de centro tóxico (Hófte y Whiteley, Microbiol. Rev. 53:242-255 (1989)). Para las proteínas de d-endotoxina de la alase Cryl, el fragmento de centro tóxico se localiza en la mitad N-terminal de la protoxina. Está dentro del alcance de la presente invención que los genes que codifican bien sea la forma de protoxina de longitud completa, o el fragmento de centro tóxico truncado de las proteínas de toxina novedosas, se pueden utilizar en vectores de transformación de plantas para conferir propiedades insecticidas a la planta hospedera . Otros principios insecticidas incluyen inhibidores de proteasa (tanto los tipos de serina como de cisteína) , lectinas, a-amilasa, peroxidasa, "y colesterol oxidasa. Otros genes de VIP, tales como víplA(a) y p2A(a) , como se dan a conocer en la Solicitud de Patente de los Estados Unidcs de Norteamérica con Número de Serie 08/463,483, e incorporada a la presente como referencia, también son útiles en la presente invención. Esta co-expresión de más de un principio insecticida en la misma planta transgénica se puede lograr mediante el diseño genético de una planta para contener y expresar todos los genes necesarios. De una manera alternativa, una planta, la Progenitora 1, se puede diseñar genéticamente para la expresión de las VIP. Una segunda planta, la Progenitora 2, se puede diseñar genéticamente para la expresión de un principio de control de insectos complementario. Al cruzar la Progenitora 1 con la Progenitora 2, se obtienen plantas de progenie que expresan todos los genes introducidos en las Progenitoras 1 y 2.

Microorganismos Recombinantes que Comprenden Genes y Proteínas de la Clase VIP3 Se reconoce que los genes aislados de la presente invención «que codifican una proteína de la clase VIP3, pero de preferencia una proteína VIP3A(c), se pueden transferir a cualquier hospedero microbiano, y conferir sus propiedades insecticidas en ese hospedero. Los hospederos alternativos para los genes novedosos de la presente invención se pueden seleccionar como adecuados para propósitos de clonación, para propósitos de caracterización de la forma y función del gen o de la proteína codificada, para utilizarse como un hospedero de fermentación para incrementar la producción de la proteína de toxina, para propósitos de aplicar cuando menos una de las proteínas de toxina más efectivamente a la plaga de insectos objetivo, o para la introducción del gen de toxina novedoso en los patógenos de insectos tales como baculovirus (un virus de polihedrosis nuclear, por ejemplo, Autographica caí fornica) , con el fin de mejorar su efectividad. Se prevé qué el hospedero alternativo se aplicaría al medio ambiente o a las plantas o a los animales para el control de insectos. Se pueden seleccionar hospederos de microorganismos que se sepa que ocupan la "fitoesfera" (filoplano, filoesfera, rizoesfera, y/o rizoplana) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de tal manera que sean capaces de competir con éxito en el medio ambiente particular con los microorganismos de tipo silvestre, proporcionar un mantenimiento estable y la expresión del gen que exprese el plaguicida del polipéptido, y deseablemente, proporcionar una mejor protección del plaguicida de la degradación e inactivación del medio ambiente. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas, y hongos. Son de un interés particular los microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo Bacillus, Caulobacte , Agmenellum, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces , Rhizobium, Rhodop seudomonas , Methylius, Agrobacterium, Acetobacte , Lactobacillus , Arthrobacte , Azoto acter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos, particularmente levadura, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptocccus, Kluyveromyces , Sporobolomyces , Rhodotorula, y Aureobasidium . Son de un interés particular las especies bacterianas de la fitoesfera tales como Bacillus spp . , Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactería, Rhodop seudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti , Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli , y Azotobacter vinlandii ; y las especies de levadura de la fitoesfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R . marina, R . aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii , Saccharomyces rosei , S. pretoriensis , S. cerevisíae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans . Son de un interés particular los microorganismos pigmentados. Las células hospederas adecuadas, en donde las células que contienen plaguicida se tratarán para prolongar la actividad de la toxina en la célula cuando se aplique la célula entonces tratada al medio ambiente de la(s) plaga (s) blanco, pueden incluir procariotes o eucariotes, limitándose normalmente a aquellas células que no produzcan sustancias tóxicas para organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, se podrían utilizar organismos que produzcan sustancias tóxicas para organismos superiores, en donde la toxina sea inestable, o el nivel de aplicación sea suficientemente bajo, para evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un hospedero mamífero. Como hospederos, serán de un interés particular los procariotes y los eucariotes inferiores, tales como hongos. Los procariotes ilustrativos, tanto Gram-negativos como Gram-positivos, incluyen jSnterojbacüeriaceae, tales como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tales como Rhizobium; Spinillaceae, tales como fotobacterias, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae, Pseudomonadaceae, tales como Pseu?omonas y Acetobacter; Azstahacteraceae y Ni trobacteraceae. Entre los eucariotes están los hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluyen levadura, tales como Saccharomyces y Schizosaccharromyces ; y levadura de Basidiomycetes , tales como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, y similares. Las características dé interés particular en la selección de una célula hospedera para propósitos de producción incluyen facilidad de introducir el gen de la proteína en el hospedero, disponibilidad de sistemas de expresión, eficiencia de expresión, estabilidad de la proteína en el hospedero, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para utilizarse como una microcápsula plaguicida incluyen las cualidades protectoras para el plaguicida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación, y empaque intracelular o formación de cuerpos de inclusión; afinidad de hojas; falta de toxicidad a mamíferos; atractivo para que lo ingieran las plagas; facilidad para aniquilar y enlazarse sin dañar la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen facilidad de formulación y manejo, economía, estabilidad al almacenamiento, y similares. Los organismos hospederos de un interés particular incluyen levadura, tal como Rhodotorula sp . , Aureobasidium sp . , Saccharomyces sp . , y Sporobolomyces sp. ; organismos fitoplanos tales como Pseudomonas sp. , Erwinia sp. , y Flavobacterium sp . ; u otros organismos tales como Escherichia, LactoBacillus sp. , Bacillus sp . , y similares. Los organismos específicos incluyen Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtili s, y similares. Hay un número de maneras disponibles para introducir un gen que exprese la proteína plaguicida en el microorganismo hospedero bajo condiciones que permitan el mantenimiento estable y la expresión del gen. Por ejemplo, se pueden construir casetes de expresión que incluyan las construcciones de ADN de interés operativamente enlazadas con las señales reguladoras de transcripción y de traducción, para la expresión de las construcciones del ADN, y una secuencia de ADN homologa con una secuencia del organismo hospedero, mediante lo cual se presentará integración y/o un sistema de réplica que sea funcional en el hospedero, mediante lo cual se presentará integración o un mantenimiento estable. Las señales reguladoras de transcripción y de traducción incluyen, pero no se limitan a, promotor, sitio de inicio de transcripción, operadores, activadores, potenciadores, otros elementos reguladores, sitios de enlace ribosomal, un codón de iniciación, señales de terminación, y similares. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,039,523; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,853,331; la Publicación Número EPO 0480762A2; Sambrook y colaboradores, supra; Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis y colaboradores (editores) , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) ; Advanced Bacterial Genetics, Davis y colaboradores (editores) , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980) ; y las referencias citadas en los mismos. Los genes novedosos o las formas recombinantes de los mismos, se pueden transformar en hospederos alternativos utilizando una variedad de métodos reconocidos en este campo. Un método preferido es la electroporación de células microbianas, como se describe, por ejemplo, mediante el método de Dower (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,186,800) .

Otro método preferido es el de Schurter y colaboradores (Mol . Gen. Genet. 218: 177-181 (1989)), que también se da a conocer en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 07/353,565, la cual se incorpora a la presente en su totalidad. Los genes «que codifican la clase VIP3 de proteínas, se pueden introducir en microorganismos que se multipliquen sobre las plantas (epífitos) , o adentro de las plantas (endófitos) , para aplicar las proteínas de la clase VIP3 a las plagas blanco potenciales. Muchas especies bacterianas son capaces de vivir en los tejidos vasculares de las plantas. La mayoría de estos endófitos y epífitos parecen tener poco impacto fisiológico sobre el crecimiento y la productividad de la planta. Por ejemplo, las bacterias colonizadoras de raíces se pueden aislar de la planta de interés mediante métodos conocidos en este campo. Específicamente, una cepa de Bacillus cereus que colonice las raíces, se podría aislar de las raíces de una planta (por ejemplo, ver J. Handelsman, S. Raffel, E. Mester, L.

Wunderlich y C. Grau, Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718, (1990) ) . Los genes V?p3 también se pueden introducir en un Bacillus cereus que colonice las raíces mediante métodos convencionales conocidos en la técnica. Específicamente, se puede introducir un gen que codifique una proteína de la clase VIP3 derivada a partir de la cepa AB88 en un Bacillus cereus colonizador de raíz, por medio de conjugación, empleando métodos convencionales (J. González, B. Brown, y B. Carlton, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6951-6955, (1982)). También, los genes novedosos de la invención se pueden introducir en el Bacillus colonizador de raíz, por medio de electrotransformación. Por ejemplo, el v?p3A(a) se puede clonar en un vector de lanzamiento, por ejemplo, pHT3101 (D. Lereclus y colaboradores, FEMS Microbiol. Letts . , 50:211-218 (1989)). El vector de lanzamiento pHT3101, que contiene la secuencia de codificación, se puede transformar entonces en el Bacillus colonizador de raíz por medio de electroporación (D. Lereclus y colaboradores, 1989, FEMS Microbiol . Letts. 60:211-218). También es posible utilizar el Bacillus megaterium colonizador de algodón. Otro ejemplo es proporcionado por el endófito Clavibacter xyli , que es de un género/especie que se sabe que contiene bacterias fitopatogénicas que ocasionan el marchitamiento de la planta. Esta bacteria puede crecer hasta niveles muy altos en el sistema vascular las plantas. Se introdujo una d-endotoxina en este endófito, que, cuando se inoculó en una planta, proporcionó un buen control del barrenador de maíz. También se conocen otros endófitos. Se pueden diseñar sistemas de expresión, de tal manera que se secreten proteínas VIP3 hacia afuera del citoplasma de las bacterias Gram-negativas, por ejemplo, E. coli . Las ventajas de hacer que se secreten las proteínas VIP3 son: (1) que se puede incrementar el nivel de proteína VIP3 expresado, y (2) que puede ayudar a una purificación eficiente de la proteína VIP3. Se puede hacer que las proteínas VIP se secreten en E. coli , por ejemplo, fundiendo un péptido de señal de E. coli apropiado con el extremo amino-terminal del péptido de señal de VIP3, o reemplazando el péptido de señal de VIP3 con el péptido de señal de E. coli . Los péptidos de señal reconocidos por E. coli se pueden encontrar en las proteínas que ya se sepa que son secretadas en E. coli , por ejemplo, la proteína OmpA (J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, Y. Masui, y M. Inouye, EMBO J. , 3:2437-2442 (1984) ) . La OmpA es una proteína mayor de la membrana externa de E. coli, y por consiguiente, se piensa que su péptido de señal es eficiente en el proceso de translocación. También, el péptido de señal OmpA no necesita modificarse antes de procesarse, como puede ser el caso para otros péptidos de señal, por ejemplo el péptido de señal de lipoproteína (G. Duffaud, P. March y M. Inouye, Methods in Enzymology, 153:492 (1987)). Específicamente, se pueden introducir sitios de restricción BamHl únicos en los extremos amino-terminal y carboxi-terminal de las secuencias de codificación VIP, empleando métodos convencionales conocidos en este campo. Estos fragmentos Ba Hl se pueden clonar, adentro del marco, en el vector pIN-III-ompAl, A2, ó A3 (J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, H. Hsilung, Y. Masui, y M. Inouye, EMBO J. , 3:2437-2442 (1984)), creando de esta manera el gen de fusión ompA:VIP gue se secreta hacia el espacio periplásmico. Los otros sitios de restricción del polienlazador de pIN-III-ompA se pueden eliminar mediante métodos convencionales conocidos en este campo, de tal manera que la secuencia de codificación de aminoácidos amino-terminal de VIP3 salga directamente después del sitio de disociación del péptido de señal ompA. Por consiguiente, la secuencia de VIP3 secretada en E. coli, sería entonces idéntica a la secuencia de VIP3 nativa . Cuando no se necesite el péptido de señal nativo de VIP3 para un pliegue apropiado de la proteína madura, estas secuencias de señal se pueden remover, y pueden ser reemplazadas con la secuencia de señal ompA. Se pueden introducir sitios de restricción BamHl únicos en los extremos amino de las secuencias de codificación de la proteína directamente después de las secuencias de codificación del péptido de señal de VIP3 , y en los extremos carboxi de la secuencia de codificación de VIP3. Luego estos fragmentos de BamHl se pueden clonar en los vectores pIN-III-ompA como se describió anteriormente. En la técnica' se conocen métodos generales para emplear las cepas de la invención en el control plaguicida o en el diseño de otros Organismos como agentes plaguicidas. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,039,523 y la Patente Europea Número EP 0480762A2. La VIP3 se puede fermentar en un hospedero bacteriano, y la bacteria resultante se puede procesar y utilizar como una pulverización microbiana de la misma manera en que se han utilizado las cepas de Bacillus thuringiensis como pulverizaciones insecticidas. En el caso de una VIP3, que sea secretada de Bacillus, se remueve la señal de secreción o se muta empleando procedimientos conocidos en este campo. Estas mutaciones y/o supresiones previenen la secreción de las proteínas VIP3 hacia el medio de crecimiento durante el proceso de fermentación. Las proteínas VIP3 se retienen adentro de la célula, y luego las células se procesan para producir la proteína V?P3 encapsulada. Se puede utilizar cualquier microorganismo adecuado para este propósito. Se han utilizando Pseudomonas para expresar las endotoxinas de Bacillus thuringiensis como proteínas encapsuladas, y las células resultantes se han procesado y pulverizado como un insecticida. (H. Gaertner y colaboradores, 1993, en Advanced Engineered Pesticides, L. Kim ed.) . Se utilizan diferentes cepas de Bacillus thuringiensis 1*. de esta manera. Estas cepas de Bt producen proteínas de endotoxina, así como VIP3. De una manera alternativa, estas cepas pueden producir solamente VIP3. Se ha demostrado que una cepa deficiente en la esporulación de Bacillus subtilis produce altos niveles de la endotoxina Cry3A de Bacillus thuringiensis (Agaisse, H. y Lereclus, D., "Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis CrylIIA toxin gene is not dependent on a sporulation- specific sigma factor and is increased in a spoOA mutant", J. Bacteriol., 176:4734-4741 (1994)). Se puede preparar un mutante spoOA similar en Bacillus thuringiensis , y se puede utilizar para producir VIP3 encapsulada, que no se secreta hacia el medio, sino que se retiene adentro de la célula. Los cultivos blanco que se van a proteger dentro del alcance de la presente invención comprenden, por ejemplo, las siguientes especies de plantas: cereales (trigo, cebada, centeno, avena, arroz, sorgo, y cultivos relacionados) , remolacha (remolacha azucarera y remolacha forrajera) , pastos de forraje (pastos de huerto, pienso, y similares) , drupas, pomelos, y fruta blanda (manzanas, peras, ciruelas, duraznos, almendras, cerezas, fresas, frambuesas, y zarzamoras) , plantas leguminosas (frijoles, lentejas, chícharos, frijoles de soya) , plantas de aceite (colza, mostaza, amapola, olivo, girasol, coco, plantas de aceite de ricino, semilla de cacao, cacahuates) , plantas de coco (coco, calabacines, melones) , plantas de fibra (algodón, lino, cáñamo, yute) , fruta cítrica (naranjas, limones, toronjas, mandarinas) , verduras (espinaca, lechuga, espárrago, coles y otras Brassicae, cebollas, jitomates, papas, paprika), lauráceas (aguacates, zanahorias, canela, canfor) , árboles deciduos y coniferas (por ejemplo, árboles de tila, árboles de tejo, robles, alisos, álamos, abedules, abetos, alerces, pinos) , o plantas tales como maíz, tabaco, nueces, café, caña de azúcar, té, vides, lúpulos, plátanos, y plantas de hule natural, así como ornamentales (incluyendo compuestos) . Los microorganismos «que se han alterado genéticamente para contener al gen plaguicida y la proteína, se pueden utilizar para proteger cultivos y productos agrícolas de las plagas . En un aspecto de la invención, las células enteras, es decir, no lisadas, de un organismo productor de toxina (plaguicida) , se tratan con reactivos que prolonguen la actividad de la toxina producida en la célula, cuando se aplique la célula al medio ambiente de la plaga blanco. De una manera alternativa, los plaguicidas se producen mediante la introducción de un gen heterólogo en un hospedero celular. La expresión del gen heterólogo da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. Luego estas células se tratan bajo condiciones gue prolonguen la actividad de la toxina producida en la célula, cuando se aplique la célula al medio ambiente de la(s) plaga (s) blanco. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estos plaguicidas naturalmente encapsulados se pueden formular entonces de acuerdo con las técnicas convencionales para la aplicación al medio ambiente que aloje a una plaga blanco, por ejemplo la tierra, el agua, y el follaje de las plantas. Ver, por ejemplo, la Publicación Número EPA 0192319, y las referencias citadas en la misma. Los ingredientes activos de la presente invención normalmente se aplican en la forma de composiciones, y se pueden aplicar al área de cultivo o a la planta que se vaya a tratar, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser tanto fertilizantes como donadores de micronutrientes, u otras preparaciones que tengan influencia sobre el crecimiento de la planta. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con otros vehículos agrícolamente aceptables, tensoactivos, o auxiliares promotores de la aplicación empleados por costumbre en la técnica de la formulación. Los vehículos y auxiliares adecuados pueden ser sólidos o lí«quidos, y corresponden a las sustancias ordinariamente empleadas en la tecnología de la formulación, por ejemplo sustancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, viscosantes, aglutinantes, o fertilizantes. Los métodos preferidos para aplicar un ingrediente activo de la presente invención, o una composición agroquímica de la presente invención que contenga cuando menos una de las proteínas plaguicidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención, son aplicación a las hojas, recubrimiento de semillas, y aplicación a la tierra. El número de aplicaciones y la concentración la aplicación, dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

Composiciones E tomocidas que Comprenden vina Cepa de Bacillus thuringiensis Recombinante La presente invención proporciona además una composición entomocida que comprende una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante «que contiene cuando menos uno de los genes de toxina novedosos en forma recombinante, o derivados o mutantes del mismo, junto con un auxiliar agrícola tal como un vehículo, diluyente, tensoactivo, o auxiliar promotor de la aplicación. La composición también puede contener un compuesto biológicamente activo adicional seleccionado a partir de fertilizantes, donadores de micronutrientes, preparaciones de crecimiento de las plantas, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, y moluscicidas, y mezclas de los mismos. La composición puede comprender del 0.1 al 99 por ciento en peso de una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante «que contenga cuando menos uno de los genes novedosos en forma recombinante, o los derivados o mutantes de los mismos, del 1 al 99.9 por ciento en peso de un auxiliar sólido o líguido, y del 0 al 25 por ciento en peso de un tensoactivo. La cepa de Bacillus thuringiensis recombinante «que contiene cuando menos uno de los genes novedosos en forma recombinante, o la composición que lo contiene, puede administrarse a las plantas o a los cultivos que se vayan a proteger, junto con otros insecticidas o productos químicos (1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Canadá) , sin perder potencia. Es compatible con la mayoría de los otros materiales de pulverización agrícola comúnmente utilizados, pero no debe utilizarse en soluciones de pulverización extremadamente alcalinas. Se puede administrar como un polvo seco, una suspensión, un polvo humectable, o en cualquier otra forma de material adecuada para la aplicación agrícola. Una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante que contiene cuando menos uno de los genes novedosos en forma recombinante, normalmente se aplica en la forma de composiciones entomocidas, y se puede aplicar al área de cultivo o a la planta que se vaya a tratar, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos biológicamente activos. Estos compuestos pueden ser tanto fertilizantes como donadores de micronutrientes, u otras preparaciones que tengan influencia sobre el crecimiento de la planta. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea junto con otros vehículos, tensoactivos, o auxiliares promotores de la aplicación empleados por costumbre en la técnica de la formulación. Los vehículos y auxiliares adecuados pueden ser sólidos o líquidos, y corresponden a las sustancias ordinariamente empleadas en la tecnología de la formulación, por ejemplo sustancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, viscosantes, aglutinantes, o fertilizantes. Las formulaciones, es decir, las composiciones entomocidas, las preparaciones o mezclas que contienen a la cepa de Bacillus thuringiensis recombinante «que contienen al gen novedoso en forma recombinante como un ingrediente activo, o combinaciones del mismo con otros ingredientes activos, y en donde sea apropiado, un auxiliar sólido o líquido, se preparan de una manera conocida, por ejemplo mediante mezcla homogénea y/o molienda de los ingredientes activos con extensores, por ejemplo solventes, vehículos sólidos, y en algunos casos compuestos de actividad superficial (tensoactivos) .

Los solventes, vehículos, tensoactivos, compuestos de actividad superficial, etcétera, que se emplean por costumbre en la técnica de la formulación, y «que se pueden utilizar adecuadamente dentro de la presente invención, se dan a conocer, por ejemplo, en la Publicación Internacional Número WO 96/10083. Otra característica particularmente preferida de una composición ento ocida de la presente invención, es la persistencia del ingrediente activo cuando se aplica a las plantas y a la tierra. Las posibles causas de pérdida de actividad incluyen inactivación por luz ultravioleta, calor, exudados de las hojas, y pH. Por ejemplo, en un alto pH, particularmente en la presencia de un reductor, los cristales de d-endotoxina se solubilizan, y por consiguiente, llegan a ser más accesibles para la inactivación proteolítica. Un pH alto de las hojas también podría ser importante, particularmente en donde la superficie de la hoja pueda estar en la escala de un pH de 8 a 10. La formulación de una composición entomocida de la presente invención puede resolver estos problemas, bien sea incluyendo aditivos para ayudar a prevenir la pérdida del ingrediente activo, o encapsulando el material de tal manera «que se proteja al ingrediente activo de la inactivación. La encapsulación se puede realizar químicamente (McGuire y Shasha, 1992) , o biológicamente (Barnes y Cummings, 1986) . La encapsulación química involucra un proceso en donde el ingrediente activo se recubre con un polímero, mientras que la encapsulación biológica involucra la expresión de los genes de d-endotoxina en un microbio. Para la encapsulación biológica, se utiliza el microbio intacto que contiene a la proteína de d-endotoxina como el ingrediente activo en la formulación. La adición de protectores de ultravioleta podría reducir efectivamente el daño por irradiación. La inactivación debida al calor también se podría controlar mediante la inclusión de un aditivo apropiado. Las composiciones entomocidas normalmente contienen del 0.1 al 99 por ciento, de preferencia del 0.1 al 95 por ciento de una cepa de Bacillus thuringiensis recombinante que contenga cuando menos uno de los genes novedosos en forma recombinante, o una combinación del mismo con otros ingredientes activos, del 1 al 99.9 por ciento de un auxiliar sólido o líguido, y del 0 al 25 por ciento, de preferencia del 0.1 al 20 por ciento de un tensoactivo. Aunque los productos comerciales de preferencia se formulan como concentrados, el usuario final normalmente empleará formulaciones diluidas de una concentración sustancialmente más baja. Las composiciones entomocidas también pueden contener otros ingredientes, tales como estabilizantes, antiespumantes, reguladores de viscosidad, aglutinantes, viscosantes, así como fertilizantes u otros ingredientes activos, con el objeto de obtener efectos especiales .

Métodos para Controlar Insectos En vista de la descripción anterior de la invención, se puede ver que existe . diferentes métodos mediante los cuales se pueden controlar los insectos utilizando proteínas de la clave VIP3 como un principio insecticida, bien sea solas o en combinación con principios complementarios de control de insectos, tales como d-endotoxinas. Cual«quier método para aplicar una proteína VIP3 para ser ingerida por un insecto susceptible, dará como resultado el control de este insecto. En una modalidad de la invención, las plantas se transforman con un gen que codifique una proteína de la clase VIP3. La expresión de ía proteína puede presentarse en cualquier momento durante el crecimiento y el desarrollo de la planta, dependiendo de la naturaleza del insecto que se vaya a controlar. Por ejemplo, una proteína de la clase VIP3 , de acuerdo con la invención, se puede expresar en raíces, tallos, hojas, semillas, polen, etcétera. Esto proporciona la ventaja de expresar la proteína solamente en aquellas células o tejidos sobre los cuales se alimente el insecto blanco. La alimentación de las células o tejidos de una planta que exprese la proteína VIP3 para un insecto susceptible, dará como resultado el control de ese insecto. En una modalidad de la invención, se expresa una proteí?a VIP3 en el tallo de una planta, con el objeto de controlar la oruga nocturna negra. Las plantas se pueden cultivar bajo condiciones de campo o de invernadero. Las semillas que contienen una proteína VIP3 también se pueden proteger contra el daño de los insectos cuando están en almacenamiento.

EJEMPLOS Los Ejemplos 16 a 18 de las páginas 73 a 82 de la Publicación Internacional Número WO 96/10083, describen el aislamiento y la caracterización biológica de las cepas AB88 y AB424 de Bacillus thuringiensis, la purificación y caracterización de una proteína VIP3A(a), la clonación de los genes vip3A(a) y vip3A(b), y la identificación de nuevos genes vip mediante hibridación. Estos ejemplos se incorporan a la presente en su totalidad como referencia. Los siguientes ejemplos describen adicionalmente los materiales y los métodos utilizados para realizar la invención, y los resultados subsecuentes. Se ofrecen a manera de ilustración, y su redacción no debe considerarse como una limitación de la invención reivindicada.

Ejemplo 1 : Presencia de genes de tipo vip3 y proteína de tipo VIP3 en aislados de Bacillus Los aislados de Bacíllus diferentes del AB88, han demostrado una actividad insecticida contra las larvas de lepidópteros cuando se prueban sobrenadantes de cultivo gastados. Algunos aislados que fueron activos contra la oruga nocturna negra, se analizaron por la presencia de los genes de tipo víp3 , y por la producción de proteínas de tipo VIP3. Los utilizó un análisis de reacción en cadena de la polimerasa estándar para determinar si los aislados de Bacillus activos contra la oruga nocturna negra contenían un gen de tipo VIP3. Utilizando el par cebador de reacción en cadena de la polimerasa GW110 (5' -CGA TTA ATG TTG GCC TC-3 • ; SEQ ID NO: 17) y GW111 (5' -CAT TAG CAT CTC CGG ACÁ CAG-3 ' ; SEQ ID NO: 18) se determinó que todos los aislados activos contra la oruga nocturna negra produjeron un producto genético vip3 de 728 pares de bases, que era de igual tamaño al producido por el tipo de cepa AB88. Un aislado de Bacillus, AB51, que no era activo contra la oruga nocturna negra, produjo el producto vip3 del mismo tamaño. Ninguno de los otros aislados de Bacillus no activos contra la oruga nocturna negra produjo un producto de reacción en cadena de la polimerasa de vip3. El análisis de la producción de la proteína VIP3 se hizo utilizando un procedimiento Western Blot convencional. Se utilizaron anticuerpos contra la proteína VIP3A(a) descrita en el ejemplo anterior, para detectar proteínas inmunorreactivas . Se pasaron alícuotas de sobrenadantes de cultivo exentos de células a partir de cultivos esporulados sobre geles de SDS-PAGE, empleando los métodos convencionales. Luego se realizaron los procedimientos de Western Blot convencionales para determinar la presencia de las proteínas de tipo VIP3. Todos los aislados de Bacillus que tenían un producto de reacción en cadena de la polimerasa de 728 pares de bases, y que eran activos contra la oruga nocturna negra', produjeron una proteína de 80 kDa que era inmunorreactivá para el anticuerpo de VIP3A(a) . El aislado ABSl que tenía el producto de reacción en cadena de la polimerasa de VIP3 del tamaño correcto, pero que no era activo contra la oruga nocturna negra, produjo una proteína inmunorreactiva que estaba truncada, sugiriendo que esta puede ser la razón de que no se observara actividad biológica alguna contra la oruga nocturna negra.

Ejemplo 2 : Caracterización de la Cepa AB51 de Bacillus thurinaiensis pe contiene un gen de tipo vip3 Se Üemostró que una cepa de B . thuringiensis, designada como AB51, contiene proteínas de la clase VIP3 mediante análisis Western, utilizando anticuerpos anti-Vip3 (a) policlonales de conejo. El gen de tipo vip3 se clonó en pKS «que creó pCIB7112. A este gen se le dio la designación de vip3A(c) . La secuencia de ADN para vip3A(c) se da a conocer en la SEQ ID NO: 5, y la secuencia de la proteína codificada se da a conocer en la SEQ ID NO: 6. La proteína VIP3A(c) es de 746 aminoácidos de largo, 43 aminoácidos más corta que sus homólogos VIP3A(a) y VlP3A(b) .

Ejemplo 3 : Desarrollo de Anticuerpos para la Proteína VIP3A(a) Se produjo antisuero contra la proteína insecticida VIP3A(a) purificada en conejos y cabras. Para los conejos, se disolvió la proteína enlazada a nitrocelulosa (50 microgramos) en sulfóxido de dimetilo, emulsificada con auxiliar completo de Freund (Difco) , y se inyectó subcutáneamente dos veces al mes durante tres meses. Para las cabras, la proteína VIP3A pura soluble activa (300 microgramos) se inyectó intramuscularmente dos veces al mes durante tres meses. Se sangraron 10 días después de la segunda y tercera inyecciones, y el suero se recuperó de la muestra de sangre (Harlow, E. y Lañe, D. Antibodies : A Manual Laboratory, Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1988) . Los antisueros se fraccionaron entonces mediante cromatografía de afinidad, utilizando proteína A de estafilococo,* y la fracción de IgG resultante se purificó adicionalmente filtrando a través de una columna que contenía el lisado de E. coli inmovilizado (Yu, C.G. y colaboradores, Appl. Environ, Microbiol. 63:532-536 (1997) ) . Los antisuerós de conejo y cabra se caracterizaron analizando la proteína Vip3A(a) mediante Western Blot. Las proteínas se separaron mediante SDS/PAGE, y se transfirieron a nitrocelulosa. Las manchas de nitrocelulosa se bloquearon en Tris-HCl 20 mM, pH de 7.5/NaCl 0.15 M/NaN3 al 0.02 por ciento/leche seca descremada al 5 por ciento. Las manchas se revelaron utilizando anticuerpos anti-Vip3A (a) criados en conejo o criados en cabra, en una concentración de 200 nanogramos/mililitro, o de 100 nanogramos/mililitro, respectivamente. Se utilizaron anti-sueros de conejo contra cabra o IgG de cabra contra conejo conjugados con fosfatasa alcalina como los anticuerpos secundarios, en una concentración de 1 microgramo/mililitro (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). Se utilizaron fosfato de bromocloroindolilo y tetrazolio azul de nitro como el sustrato para la reacción de fosfatasa alcalina. Ambos anticuerpos anti-Vip3A(a) , criados en conejo y en cabra, son policlonales. Los anticuerpos anti-Vip3A(a) obtenidos de cabra tienen una titulación más alta que aquellos obtenidos de conejos. En el planteamiento experimental, se deben utilizar anticuerpos anti-Vip3A(a) de conejo en una dilución de 1/500 a partir del suero original (200 nanogramos/mililitro) . Como una comparación, los anticuerpos anti-Vip3A(a) obtenidos de cabra, se pueden diluir hasta 1/2000 (100 nanogramos/mililitro) a partir del suero original. Aunque los anticuerpos criados en conejo solamente reconocen la porción N-terminal de la proteína Vip3A(a), los anticuerpos obtenidos de cabras reaccionan con los epítopos presentes a través de toda la longitud de la proteína Vip3A(a) .

Ej mplo 4 : Construcción de Casetes de Expresión en Plantas Los casetes de expresión en plantas consisten en promotores que pueden impulsar la expresión de una secuencia de codificación, bien sea constitutivamente o de una manera específica del tejido, las secuencias de codificación «que se van a expresar, y las secuencias de terminación que permitan la poliadenilación del ARNm y su traducción apropiada. Los promotores seleccionados en las construcciones de ADN de la presente invención, incluyen promotores constitutivos tales como aquel del gen de ubiquitina de maíz (Christensen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989) (pCIB8029, Figura 4; pCIB8055, Figura 5; pCIB9806, Figura 6), y promotores específicos de tejido, tales como aquellos del gen de tipo de metalotioneína de maíz (de Framond, A. FEBS 290:103-106, 1991) (pCIB8030, Figura 7; pCIB8056, pCIB9805) , que proporciona una expresión preferida por la raíz, a partir del gen PEPC de maíz (Hudspeth, R.L. y Gruía, J.W. , Plant Mol . Biol. 12:579-589, 1989) (pCIB5535, Figura 8; pCIB9807) , que proporciona una expresión específica del tejido verde, y a partir de proteína de transferencia de lípidos no específica de cebada LTP4 (pCIB9819, Figura 9) (Molina, A. y Garcia-Olmedo, F. Plant J. 4:983-991, 1993), que proporciona una expresión preferida por el tallo. Todas las construcciones utilizadas en la presente invención contienen la secuencia terminadora derivada a partir del CaMV 35S, y el intrón 9 derivado a partir del gen PEPC de maíz, para propósitos de mejorar la expresión del gen. Los plásmidos pCIB8029, pCIB8055, y pCIB9806, contienen al intrón #1 del gen de ubiquitina de maíz colocado entre el promotor de ubiquitina de maíz y el gen víp3A(a) . La construcción que comprende la secuencia de codificación del gen vip3A(a), el intrón #9, y la secuencia terminadora 35S, se diseñaron en el plásmido receptor que llevaba los diferentes promotores como dobles digestiones de Ba Hl -EcoRI .

Los casetes de expresión en plantas se utilizaron como tales en los experimentos de transformación de plantas, o se linearizaron utilizando enzimas de restricción que cortan en el gen AmpR del plásmido de la estructura base. En algunos experimentos, se aislaron fragmentos que comprendían al promotor, al gen de interés, al intrón, y al terminador, a partir del resto de la estructura base del plásmido, mediante digestión de restricción y purificación del fragmento. En estos casos, la purificación del fragmento procedió como sigue: se digieren 500 mícrogramos de ADN con la enzima apropiada, y se separan sobre un gel de agarosa al 0.8 por ciento. Se identifica el fragmento de interés, se corta del gel, y se purifica utilizando un filtro Durapore Millipore (de 0.45 mieras) . El filtrado que contiene al fragmento se precipita con acetato de sodio y etanol. El fragmento se vuelve a suspender en TE, y se utiliza en los experimentos de transformación. Ej mplo 5 : Actividad Insecticida = Plantas de Maíz que Expresan VIP3A(a) Se probaron plantas de maíz que expresaban la proteína VIP3A(a) por los efectos insecticidas sobre las especies de insectos mencionadas en la siguiente tabla, mediante el siguiente procedimiento. Se cortaron de una a cuatro secciones de 4 centímetros de las hojas de plantas de maíz transgénicas y de control. Cada ^pedazo de hoja se colocó sobre un disco de filtro humedecido en una caja Petp de 50 x 9 milímetros. Se colocaron 5 neonatos de la especie que se estuviera probando sobre cada pedazo de hoja, dando un total de 5 a 20 larvas probadas por cada planta. Las cajas de Petri se incubaron a 30°C en la oscuridad. La mortalidad se calificó después de 48 a 72 horas. Los resultados se muestran en la Tabla 16. Tabla 16 Porcentaje de mortali Especie de insecto probada VIP3A(a) Control Plagas de M í Oruga nocturna negra (Agroti s ípsilon) 100 0 Gusano guerrero de otoño (Spodoptera frugiperda) 100 0 Barrenador de caña de azúcar (Diatrea saccharalis) 10 Q 0 Barrenador de maíz del suroeste 100 0 (Dia trea grandiosella) Gusano de mazorca de maíz (Helicoverpa zea) 100 10 Barrenador de maíz del mediterráneo 100 15 ( Sesamía nonagroides) Otras plagas Lepidópteras Gusano guerrero de remolacha (S. exigua) 100 0 Gusano guerrero e franjas amarillas 100 0 (S. orni thogalli) Oruga de col ( Trichoplusia ni ) 100 20 Ejemplo 6: Expresión de vip3A(a) en Plantas de Maíz La transformación de las líneas endógamas de Ciba CG00526 y 2154 de élite de maíz con el gen Vip3 , se logró utilizando bombardeo de partículas de tejido de callo Tipo I. Para la transformación utilizando callo embriogénico Tipo I, el callo se obtuvo de los embriones cigóticos, utilizando técnicas de cultivo convencionales, y se subcultivaron de 1 a 2 días antes del bombardeo. El tejido de callo se preparó para el bombardeo colocando aproximadamente 20 piezas de un diámetro de 3 a 5 milímetros arregladas en una forma de anillo sobre el medio de cultivo «que contenía sacarosa al 12 por ciento. El tejido de callo se colocó sobre este medio durante 4 horas antes del bombardeo. El ADN utilizado para la transformación de callo de maíz fue el ADN del plásmido circular, el ADN del plásmido lineal, o los fracjmentos de ADN purificados «que contenían al gen Víp3 bajo el control de diferentes promotores de plantas. En los experimentos en donde se utilizó un agente seleccionable, el gen permitió la resistencia a la fosfinotricina, o permitió el crecimiento en la presencia de mañosa. Los plásmidos o los fragmentos de ADN aislados por filtración, se precipitaron sobre partículas de oro de 0.3 mieras de acuerdo con los procedimientos publicados de BioRad Laboratories, Hercules, CA. Las partículas de oro se ap?icaron utilizando una presión de ráfaga de 45.5 kg/cm2 de helio. Cada placa objetivo se disparó dos veces con las partículas recubiertas con ADN. De 16 a 20 horas después del bombardeo, el callo de CG00526 se transfirió a un medio de mantenimiento de cultivo convencional . Siete días después del bombardeo, el tejido se transfirió a un medio que contenía al agente de selección, Basta, en una concentración de 100 miligramos/litro. Basta es una formulación comercial de glucosinato de amonio producida por Hoechst. El callo del 2154 se mantuvo sobre sacarosa al 12 por ciento durante 1 a 7 días después del bombardeo, y se transfirió a un medio de convencional que contenía de 20 a 30 miligramos/litro de Basta en el día 7. El callo 2154 y CG00526 se subcultivó en la presencia de 30 ó de 100 miligramos/litro de Basta, respectivamente, durante 8 semanas. Los tejidos que sobrevivieron a la selección se subcultivaron sobre niveles más bajos de Basta (de 5 a 40 miligramos/litro) durante un período de aproximadamente 5 a 10 semanas, para permitir la acumulación de tejido, y luego se transfirieron a un medio de regeneración convencional sin selección para la producción de plantas. Comúnmente, el 12 por ciento de las piezas de callo bombardeadas produjeron callo transformado que sobrevivió a la selección con Basta. Los callos transformados individuales típicamente se regenerarían para producir de 20 a 30 plantas . Se generaron eventos a partir de experimentos en donde no se utilizó selección. En estos experimentos, el callo se cultivó durante un período de 9 a 10 semanas sobre un medio de mantenimiento, antes de transferirse a un medio de regeneración. El evento 1337 es un ejemplo de un evento de VIP3 transformada derivada a partir de un experimento de transformación sin marcador seleccionable o calificable, mediante la selección de plantas por la actividad insecticida.

También se generaron callos transformados a partir de experimentos en donde se utilizó selección con mañosa. En estas transformaciones, el gen de fosfomanosa isomerasa bajo el control del promotor de ubiquitina de maíz de pCIB9818, se bombardeó con el gen Vip3. Se incluyó mañosa al 0.5-1.5 por ciento en el medio de mantenimiento durante un período de 12 semanas, y no se incluyó en el medio e regeneración.

Las plantas transgénicas se evaluaron para determinar la expresión de proteína VIP3A(a) mediante bioensayo de insectos y ensayo ELISA. Se removieron pedazos de hojas de las plantas en la etapa de 2 a 4 hojas para la evaluación, utilizando bioensayos tanto de oruga nocturna negra como de gusano guerrero de otoño. Los bioensayos se hicieron utilizando 10 larvas recién salidas del cascaron colocadas en platos con pedazos de hojas. Se calculó el porcentaje de mortalidad a las 72 horas. Los tejidos de las plantas transgénicas también se ensayaron mediante ELISA, utilizando protocolos convencionales para cuantificar los niveles de proteína Vip3 en diferentes tejidos de planta. El tejido de planta se extrajo, y la Tabla 17 proporciona eventos representativos generados, y sus resultados del bioensayo de insectos correspondientes.

Las plantas de maíz transgénicas se transformaron con diferentes plásmidos «que contenían al gen Vip3 bajo el control de diferentes promotores, tales como el promotor de carboxilasa PEP PEP de maíz (PEPC) , el promotor de ubiquitina de maíz (Ubi) , y el promotor de tipo de metalotioneína de maíz (MTL) . El gen marcador seleccionable fue el gen PAT bajo el control del promotor de ubiquitina de maíz en pUBIAC. Los eventos representativos mencionados en la Tabla 17 muestran los eventos producidos con diferentes plásmídos o fragmentos de ADN derivados de plásmidos. Los fragmentos de ADN se generaron utilizando digestiones con enzima de restricción, y se fraccionaron los tamaños utilizando electroforesis en geles de agarosa al 0.8 por ciento. Los fragmentos de ADN se ' cortaron de geles, se congelaron, se trituraron y se purificaron por filtración a través de filtros Durapore Millipore de 0.45 mieras, seguido por precipitación en etanol. Los eventos de maíz transformado se generaron con el ADN del plásmido circular de pCIB5535 que contenía al gen Vip3 bajo el control del promotor PEPC de maíz. Los eventos también se transformaron con ADN del plásmido lineal de pCIB5535 y pCIB8029 que contenía al gen Vip3 bajo el control del promotor de ubiquitina de maíz. Se produjeron eventos adicionales mediante el bombardeo de los fragmentos de la enzima de restricción del ADN purificado que contenían justamente el gen Vip3 con el promotor. Los fragmentos correspondientes al gen Vip3 incluyen: un fragmento EcoRI/HindIII de 4,906 pares de bases a partir de pCIB5535 con el promotor PEPC de maíz; un fragmento Kpnl/HindIII de 5,142 pares de bases a partir de pCIB8030 con el promotor MTL; un fragmento Kpnl/HindIII de 4,597 pares de bases a partir de pCIB8029 con el promotor de ubiquitina de maíz; un fragmento HindIII de 4,818 pares de bases a partir de pCIB8055 con el promotor de ubiquitina de maíz; un fragmento HindIII de 5,364 pares de bases a partir de pCIB8056 con el promotor MTL; un fragmento AscI de 5,964 pares de bases a partir de pCIB9805 con el promotor MTL; un fragmento AscI de 5,418 pares de bases a partir de pCIB9806 con el promotor de ubiquitina de maíz; y un fragmento AscI de 5,727 pares de bases a partir de pCIB9807 con el promotor PEPC de maíz.

Tabla 17 Evento No. Plásmido Gen quimérico Mortalidad (%) utilizado Gusano Oruga guerrero nocturna de otoño negra 891 pCIB5535 PEPC:vip3A(a) 100 100 906 pCIB5535 y PEPC: vip3A(a) 100 100 pCIB8029 y Ubi: vip3A(a) 946 pCIB5535 y PEPC : vip3A(a) 100 100 pCIB8030 y MTL: vip3A(a) Ej mplo 7: Actividad Insecticida de Plantas de Maíz que Contienen Vip3 v 5-endotoxinas de Bt La Vip3A(a) tiene poca actividad contra el gusano barrenador de maíz europeo (ECB) . Para hacer plantas con un control de lepidópteros de amplio espectro, las plantas de maíz que contenían un gen vip3A(a) se cruzaron con plantas de maíz que contenían un crylB, que es activo contra ECB. La progenie de las cruzas se ensayaron contra ECB y gusano guerrero de otoño (FAW) como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 18. Aproximadamente el 34 por ciento de la progenie no fue activa contra cualquier especie, el 15.4 por ciento fue activa solamente sobre ECB, el 23.1 por ciento fue activa solamente sobre gusano guerrero de otoño, y el 27.9 por ciento fue activa contra ambas especies. Las plantas activas contra ambas especies contenían tanto la proteína VIP3A(a) como CrylB. Se obtienen resultados similares utilizando otras d-endotoxinas de Bt, particularmente CrylAb ó Cry9C.

Tabla 18 Cruza % activas % activas % activas % no contra ECB contra FA contra ECB y FAW activas VIP3A(a) 15.4 23.1 27.9 34.6 X CrylB.

Ejemplo 8 : La VIP3A(a) Lisa las Células Epiteliales del Intestino Medio de los Insectos Susceptibles Estudios de alimentación y tolerancia del intestino. Se registró la secuencia temporal de los síntomas en seguida de la ingestión de una dieta que contenía VIP3A(a) , por las larvas de oruga nocturna negra (BCW) en la segunda muda, un insecto susceptible, desde el momento de la administración inicial hasta la muerte larval. Las larvas expuestas a la dieta de control mostraron una alimentación activa, seguida por parastalsis del intestino ininterrumpida. En contraste, la adición de la proteína VIP3A(a) en la dieta, tuvo un efecto significativo sobre el comportamiento de la alimentación. Cuando se agregaron en concentraciones tan bajas como de 4 nanogramos por centímetro cuadrado, las larvas se alimentaron y se dejaron de alimentar durante períodos de 10 a 20 minutos. La presencia del color azul en sus intestinos indicó la alimentación, pero la tolerancia del contenido del intestino fue afectada dramáticamente, como fue juzgado por el menor número de polvillos. Con 4 nanogramos de VIP3A(a) por centímetro cuadrado agregados a la dieta, el desarrollo larval fue significativamente perjudicado después de un período de incubación de 48 horas, pero no se observó mortalidad. En concentraciones de 40 nanogramos de VIP3A(a) por centímetro cuadrado, las larvas sufrieron parálisis del intestino después de la ingestión de cantidades diminutas de dieta, y no se pudo ver polvillo, indicando una carencia casi completa de tolerancia del intestino. Bajo esta condición, se registró una mortalidad de aproximadamente el 50 por ciento después de 48 horas. Cuando se utilizaron concentraciones más altas de 40 nanogramos de VIP3A(a) por centímetro cuadrado, las larvas estaban moribundas después de solamente unas cuantas mordidas, sin polvillo, y los índices de mortalidad se aproximaron al 100 por ciento. Cuando se condujeron experimentos similares con gusano guerrero de otoño, también un insecto susceptible, se observaron patrones de comportamiento similares. En contraste, el gusano barrenador de maíz europeo no alteró su comportamiento de alimentación cuando se agregó la proteína VIP3A(a) a la dieta, inclusive en concentraciones tan altas como de 400 nanogramos de VIP3A(a) por centímetro cuadrado. Observaciones histológicas de los efectos de la proteína Vip3A(a) . Se condujeron observaciones histopatológicas sobre los efectos de la proteína VIP3A(a) sobre oruga nocturna negra, sobre larvas en la segunda y tercera mudas «que se habían alimentado con una dieta que contenía Vip3A(a) . El análisis de las secciones transversales del intestino de la oruga nocturna negra mostró un extenso daño al epitelio del intestino medio, indicando que el tejido del intestino medio es un sitio de acción primario de la proteína VIP3A(a) . No se pudo discernir daño alguno en el intestino delantero y en el intestino oculto. Las células epiteliales del intestino medio de las larvas no tratadas estaban estrechamente asociadas unas con otras, no mostrando evidencia de daño. Las secciones de las larvas que se habían alimentado durante 24 horas con dieta que contenía VIP3A(a) , mostraron que los extremos distales de las células columnares del epitelio se habían distendido y estaban bulbosos. Aunque las células de cráter exhibieron algunas alteraciones morfológicas, no mostraron signos de daño en esta etapa. La degeneración de las células columnares del epitelio continuó, de tal manera que, después de 48 horas de ingerir la dieta que contenía Vip3A(a) , el lumen se había llenado con desecho de células alteradas . Las células de cráter también exhibieron signos de daño después de 48 horas, pero ambos tipos de células todavía estaban unidas a la membrana base. Las larvas de oruga nocturna negra murieron a las 72 horas, y la descamación de la capa epitelial era completa. Aunque se observó una histopatología similar para el gusano guerrero de otoño, el gusano barrenador de maíz europeo no exhibió daño al tejido bajo condiciones experimentales similares. Inmunización en vivo de la proteína Vip3A(a) . Se utilizaron larvas en la tercera muda de oruga nocturna negra y de gusano barrenador de maíz europeo alimentados con dieta artificial complementada con 100 a 200 nanogramos de VIP3A(a) por centímetro cuadrado, para la caracterización inmunocitoquímica del enlace de VIP3A(a) a las secciones del intestino medio. La VIP3A(a) enlazada se visualizó utilizando anticuerpos de conejo anti-VIP3A(a) previamente purificados a través de sefarosa de proteína A y columnas inmovilizadas de E. coli (Yu, C.G. y colaboradores, Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536, 1997). El enlace de VIP3A(a) se detectó en el epitelio del intestino medio de la oruga nocturna negra, mientras que no mostró enlace a los intestinos medios del gusano barrenador de maíz europeo. Las secciones del intestino medio de larvas de oruga negra nocturna alimentadas con la dieta de control, no mostraron enlace de VIP3A(a) . El enlace de VIP3A(a) parece estar específicamente asociada con los microvilos apicales, y está en su mayor parte asociada con las células columnares, sin señal detectable alguna en las células de cráter.

Ej mplo 9: Las VIP3A(a) y VIP3A(b) Inducen Apoptosis en Células de Insectos Se demostró que las VIP3A(a) y VIP3A(b) son una proteína inductora de apoptosis que se presenta por la caracterización de sus efectos insecticidas hacia una línea celular de insectos (Sf-9) derivada a partir de Spodoptera frugiperda, un insecto susceptible a VIP3A(a) . La VIP3A(a) mostró una actividad insecticida hacia la línea celular del insecto cuando se mantuvo presente a través de todo el experimento. Cuando se expusieron transitoriamente las células de insecto SF-9 a VIP3A(a) y VIP3A(b) , se redujo de una manera significativa su viabilidad celular, inclusive con tiempos de exposición tan cortos como de 5 minutos. Una vez que el tiempo de incubación excedió de 10 minutos, los efectos de la VIP3A(a) y VIP3A(b) sobre la viabilidad de la célula de insecto durante un período de 6 horas fueron máximos, mostrando una reducción del 90 por ciento en la viabilidad celular. Los cambios citológicos que se presentaron en las células SF-9 transitoriamente expuestas a VIP3A(a) se supervisaron mediante microscopio. Aparecieron pequeñas protuberancias sobre la superficie de las células tratadas en algún momento entre 10 y 15 minutos después de su exposición a la proteína VIP3A(a) . En esta etapa, las mitocondrias de las células permanecieron funcionalmente intactas, como fue revelado por el teñido con rodamina 123, un tinte que se acumula en las mitocondrias con un potencial de membrana activo (Johson, L.V. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:990-994, 1990). Estas protuberancias desaparecieron eventualmente, y las células entraron a una fase de vacuolización profusa que duró de 30 a 60 minutos adicionales. Durante las etapas finales, se ve que las células del insecto se hinchan antes de la desintegración. Para una célula individual, todo el proceso requirió de 1 a 2 horas . Todos estos eventos celulares son consistentes con los estudios anteriores sobre células que sufren apoptosis, considerando particularmente que la muerte celular programada durante la metamorfosis de ciertos insectos, está acompañada por vacuolización celular e hinchamiento (Schwartz, L.M. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:980-984 (1993) ) . Los estudios recientes han demostrado que la distribución de fosfolípidos en la membrana del plasma, es afectada en las etapas muy tempranas de las células animales «que sufren apoptosis (Martin, S. J. y colaboradores, J. Exp. Med.: 182, 1545-1556, 1995), particularmente la externalización de la fosfatidilserina (PS) . Este proceso se puede visualizar utilizando Anexina V, una proteína anticoagulante con una alta afinidad para la fosfatidilserina (PS) . Cuando las células SF-9 tratadas con VIP3A(a) se incubaron con Anexina V, se reveló una externalización de fosfatidilserina en membranas celulares de insecto tan pronto como de 5 a 10 minutos después de la exposición a la VIP3A(a), marcando probablemente el establecimiento de la apoptosis. Ono de los eventos moleculares clave, es decir, la marca de la apoptosis, es la endonucleólisis «que da como resultado un rompimiento del ADN de doble cadena, liberando a fra«gmentos de tamaño de oligonucleosoma de 200 pares de bases y sus múltiplos. Examinamos la presentación de la endonucleólisis en células SF-9 tratadas con VIP3A(a) utilizando un método de detección en el sitio, y analizando el ADN mediante electroforesis en gel de agarosa. Basándose en la capacidad de la enzima Klenow para incorporar los nucleótidos modificados utilizando los extremos de ADN generados por la fragmentación del ADN, las células de insecto SF-9 mostraron signos de endonucleólisis tan pronto como 30 minutos después de su exposición a la prote?na VIP3A(a) . Esta etapa coincidirá con la aparición de los cuerpos apoptóticos subcelulares enlazados a la membrana visualizados en las observaciones microscópicas. Estas indicaciones tempranas de actividad endonucleolítica, se confirmaron mediante la detección de los fragmentos de ADN en geles de agarosa, característicos de una escala de cromatina ligeramente después en el proceso. Estos resultados corroboraron las indicaciones obtenidas de las observaciones citológicas, que las células SF-9 inician un cipo apoptótico de muerte celular programada cuando se exponen a la proteína VIP3A(a) . Las proteínas VIP3A(a) y VIP3A(b) se descubrieron en base a sus propiedades insecticidas contra algunos insectos lepidópteros. Por consiguiente, estábamos interesados en saber si la proteína VIP3A(a) induciría una trayectoria apoptótica en células de insecto, de los insectos susceptibles, después de su ingestión, y por consiguiente, podría ejercer sus propiedades insecticidas al desencadenar un proceso activo de muerte celular. Los estudios histológicos e histoquímicos han demostrado que la proteína VIP3A(a) dirige específicamente las células columnares del epitelio del intestino medio de los insectos susceptibles, provocando cambios celulares caracterizados por protuberancias de membrana y extensa vacuolización «que conduce a la muerte celular. Estos cambios citológicos inducidos por la VIP3A(a) en células de intestino de insecto, se parecen a aquellos descritos anteriormente para las células SF-9. Entonces, examinamos si las células del epitelio del intestino medio de los insectos susceptibles sufren endonucleólisis al ingerir dieta que contiene VIP3A(a) mediante detección en el sitio (Cuvillier, O., y colaboradores, Nature 381:800-803 (1996)) de la fragmentación del ADN. Cuando se estudiaron secciones de tejido del intestino medio de larvas de oruga negra nocturna alimentadas con dieta que contenía VIP3A(a) o dieta de control, el teñido de los núcleos que indicaba la fragmentación del ADN, solamente se pudo detectar en las células columnares del epitelio del intestino medio expuestas a la proteína VIP3A(a) . Este resultado indica que la proteína VIP3A(a) induce un proceso de endonucleólisis en las células del epitelio del intestino medio, concurrentemente con los cambios citológicos reportados previamente. Es nuestra conclusión que la proteína VIP3A(a) posiblemente ejerce sus propiedades insecticidas mediante la activación de un tipo apoptótico de muerte celular programada de las células del epitelio del intestino medio de los insectos susceptibles.

Ejemplo 10 : Aislamiento del Receptor para VIP3A(a) a partir de Oruga Negra -NocJturna La oruga negra nocturna es sensible a VIP3A(a) , y por consiguiente, se utilizó este insecto para el aislamiento del receptor de VIP3A(a) . Se recolectaron intestinos medios de larvas de oruga negra nocturna en la tercera muda, mediante disección, y su congelación inmediata en nitrógeno líquido. Se utilizó 1 gramo de tejido de intestino medio para aislar el ARNm, siguiendo el protocolo descrito en el estuche de construcción de la biblioteca de ADNc de dos híbridos proporcionado por Clontech (1997) . Se utilizaron 10 microgramos de ARN poli A+ como el material de partida. "En la síntesis de la primera cadena, se utilizaron cebadores tanto aleatorios como de plataforma asegurada oligo (dT) ^d (A/C/G) en la síntesis separada con transcriptasa inversa MML. La segunda cadena del ADNc se logró mediante una proporción óptima de polimerasa de ADN a la actividad de ARNsa H en el coctel enzimático de la segunda cadena. Luego el ADNc de doble cadena recién sintetizado se liga en los adaptadores EcoRI -Notl -Salí . Los ADNc se ligaron en pGADlO (Vijaychander, S. y colaboradores, CLONTECHniques IX-3.-8-10, 1994) que proporciona el dominio de activación. El gen VIP3A(a) se diseñó en el sitio del polienlazador del plásmido pGBT9 adentro del marco, con el dominio de enlace de ADN-GAL4 (Bartel, P.L. y colaboradores, Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, páginas 153-179, Oxford University Press, 1993). El pGBT9- vi?3A (a) recombinante se transformó en la cepa de levadura GGY1::171 (Gilí, G. y Ptashne, M., Cell 51:121-126, ^1987) mediante electroporación (Estruch, J.J. y colaboradores, BioTechniques 16:610-612, 1994). La levadura transformada se seleccionó en medio mínimo sin triptófano (Bartel, P.L. y colaboradores, Cellular Interactions in Development: A Práctical Approach, páginas 153-179, Oxford University Press, 1993) . La expresión de la proteína VIP3A(a) en la levadura recombinante se confirmó mediante análisis Western. La cepa de levadura GGY1 : : 171-VIP3A (a) se transformó con la biblioteca de ADNc de oruga negra nocturna representada en pGADlO. GGY1::171 posee el marcador HIS3 bajo el control de los sitios de reconocimiento GAL4. El gen HIS3 permite una selección de crecimiento positiva para los clones que se transforman mediante dos construcciones híbridas interactuantes . Después de recubrir más de 200,000 clones recombinantes, solamente uno pudo crecer en el medio mínimo sin histidina. El ADN del plásmido de la colonia de levadura positiva se aisló mediante el método de regulador de lisis .de levadura (Kaiser, P. y Auer, B. BíoTechniques 14:552 (1993)), y se electroporó en E. coli . El inserto que contenía el ADNc se subclonó en el sitio EcoRI del pBluescript (Stratagene) , y se secuenció mediante el método de terminación de . didesoxi de Sanger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 74:5463-5467 (1977), utilizando los Estuches de Secuención de Ciclo de Terminador de Desoxi de Tinte de Reacción Listo PRISM, y el Estuche de Secuenciación de ADN de Doble Cadena de Termínador PRISM SequenaseR, y se analizó en un secuenciador automático ABl 373. U planteamiento alternativo para identificar clones que codifican proteína (s) que interactúa (n) con Vip3A, consistió en recubrir levadura transformada con la biblioteca de ADNc de la oruga negra nocturna representada en pGADlO. Después de transferir la población de levadura transformada a filtros de nitrocelulosa, se sele?cionaron con una proteína Vip3A marcada con biotina, seguido por una incubación con una solución que contenía estreptavidin. acoplada con fosfatasa alcalina (AP) . Después de extensos lavados, se visualizó el clon o los clones que expresaban una proteína con la capacidad para enlazarse con Vip3A mediante la utilización del sustrato de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3 -indolilo (BCIP) en combinación con tetrazolio azul nitro (NBT) . La fosfatasa alcalina cataliza la formación de precipitados insolubles que se desarrollaron en manchas oscuras sobre los filtros de nitrocelulosa. Los procedimientos experimentales son descritos con detalle por Sambrook, J. y colaboradores en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, páginas 12-21-12.24, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Después de volver a cultivar las placas de levadura durante la noche, las manchas desarrolladas en los filtros se acoplaron con las colonias de levadura en las placas originales . Estas colonias se cultivaron, se aislaron sus plásmidos, y se caracterizaron sus insertos como se describe anteriormente.

Ejemplo 11 : Las Células de Insecto Transformadas con el Gen para él Receptor Exhiben Apoptosis Cuando se Exponen a la Proteína VIP3A(a) El receptor de las células de intestino medio de oruga negra nocturna para la proteína VIP3A(a) se clonó en el sitio XhoI-BamHI del vector cósmido Smart 2 (Speek, M. y colaboradores, Gene 64:173-177 (1988)), y se utilizó la construcción recombinante para transformar la línea celular de Drosophila Schneider 2 (S2) , utilizando el método de coprecipitación en fosfato de calcio (Clem, R.J. y Miller, L.K. Mol. Cel. Biol. 14: 5212-5222 (1994) ) . Smart 2 lleva el marcador seleccionable tet (tetraciclina) para la transformación bacteriana, y el neo (neomicina) para la transformación de las células de Drosophila . El marcador seleccionable neo se expresa bajo el control del promotor hsp70 de Drosophila . Las células S2 transformadas se seleccionaron en un medio de S2 Drosophila complementado con el 10 por ciento de Albúmina de Suero Fetal, y con G418 (1 miligramo/mililitro) a 30°C (ver el catálogo GIBCO 1997) . Se establecieron varias líneas celulares S2 establemente transformadas después de 45 días de selección en el medio descrito anteriormente . Se probó la sensibilidad de las células transformadas S2 a la VIP3A(a) mediante la adición de la proteína VIP3A(a) (en una concentración final de 1.7 microgramos por mililitro) al medio que contenía las células S2 transformadas, que se habían chocado previamente con calor a 42°C durante 30 minutos. La inducción de apoptosis en las células S2 transformadas se confirmó mediante tanto observaciones microscópicas como mediante el Estuche TACS, y el Estuche de Detección de Apoptosis en el Sitio (para una descripción detallada, ver el catálogo Trevigen 1996) .

Ejemplo 12: Aislamiento de Homólogos para el Receptor a partir de Otros Insectos Las células del epitelio del intestino medio de las larvas de oruga negra nocturna poseen un receptor que es reconocido por la proteína VIP3A(a) . Se aislaron receptores a partir de otros insectos que se sabe que son susceptibles a VIP3A(a) , mediante la identificación de las secuencias de ADN en análisis Southern. Se prepara el ADN, se restringe por la enzima, se pasa en geles de agarosa, y se pasa a filtros de nitrocelulosa y/o nailon. Estos filtros se sondean con el ADNc que codifica el receptor de oruga nocturna negra, utilizando condiciones de baja estringencia de hibridación y lavado. Se identificaron los genes con una similitud al receptor de la oruga negra nocturna para VIP3A(a) menor del 50 por ciento. El análisis Southern también se puede sondear contra secuencias parciales del ADNc que codifican dominios específicos , ""tales como el dominio de muerte o los motivos de tipo EGF, con la intención de aislar genes que contengan dominios similares, inclusive cuando sean funcionalmente diferentes del receptor de oruga nocturna negra para VIP3A(a) . El aislamiento de homólogos para el receptor de oruga nocturna negra para VIP3A(a) se va a realizar mediante el sistema de dos híbridos descrito en Fields, S. y Song, O.-K. Nature 340:245-246 (1989) . El ARNm aislado se obtiene de un organismo de interés, se sintetizan los ADNc, y se clonan en pGADlO o en plásmidos eguivalentes. La biblioteca del ADNc se co-transforma con el gen v?p3A(a) que lleva pGB9 (u homólogos de este gen) , y se rescatan los receptores putativos en levadura por medio de activación "de un marcador, basándose en la interacción de proteína-proteina entre? la proteína víp3A(a) (o sus homólogos) y el receptor putativo. Los homólogos al receptor de oruga nocturna negra para VIP3A(a) se aislan mediante la expresión de bibliotecas de ADNc aisladas de organismos de interés, se clonan en los vectores de expresión apropiados, y se transforman en células hospederas, tales como células de "levadura o de insecto, que se sepa que no tienen la capacidad para enlazarse y/o ser sensibles a VIP3A(a) . Las células transformadas se seleccionan basándose en su propiedad obtenida de enlace de VIP3A(a) , o que sufran respuestas apoptóticas cuando se incuben con VIP3A(a) . En este caso, se utiliza la proteína' VlP3A(a) como sonda, y se supervisará su enlace bien sea por los anticuerpos contra VIP3A(a) o por marcas tales como biotina unida a VIP3A(a) . Ej emplo 13 : Selección de. Compuestos Novedosos ?ju= Inducen Apoptosis en Células de Insecto Se utilizan líneas de células modelo para diferentes órdenes de insectos (algunos ejemplos incluyen células Sf-9 para lepidópteros, escarabajo de papa de Colorado para coleópteros, S2 de Drosophila para dípteros) , con el fin de seleccionar los compuestos novedosos, cuyo modo de acción es la inducción de apoptosis. Las células se cultivan en placas de múltiples cavidades qué se utilizan para un ensayo de alta producción que selecciona miles de compuestos (tanto de peso molecular grande como pequeño) . Los compuestos se agregan como un solo componente o como mezclas. Se identifica (n) el (los) compuesto (s) que induce (n) apoptosis como sigue: 1) las protuberancias de membrana son visibles en la membrana celular, 2) se puede detectar una reorganización de los lípidos de membrana que contienen fosfatidilserina, mediante la utilización de proteínas específicas con una alta afinidad para la fosfatidilserina, tal como Anexina V enlazada con un marcador visual, 3) es visible el ampollamiento citoplásmico en el citoplasma celular, 4) se pueden visualizar mitocondrias activas mediante la utilización de tintes vitales tales como rodamina 123 «que se acumula en las mitocondrias, 5) se detecta fragmentación del ADN bien sea mediante análisis del ADN en geles de agarosa, mediante detección ELISA de la liberación nucleosomal, o mediante la detección en vivo del corte del ADN. Todas estas características citológicas y moleculares indican apoptosis. El receptor de oruga nocturna negra para VIP3A(a) se transforma en la línea celular S2. Por consi«guiente, las líneas S2 isogénicas están disponibles con y sin este receptor. Estas líneas celulares se utilizan para seleccionar compuestos que proporcionen una respuesta diferencial debido a la presencia de dicho receptor. Las células S2 transformadas que sufren apoptosis después de su exposición a ciertos compuestos, se identifican como se indicó anteriormente. La respuesta diferencial de la célula transformada contra la célula no transformada, indica que la acción del compuesto es mediada por el receptor clonado. Se emprenden planteamientos celulares con células de insecto transformadas con receptores homólogos a'l receptor de oruga nocturna negra para VIP3A(a) .

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva, indican el nivel de capacidad de los expertos en el campo al que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan a la presente como referencia, hasta el mismo grado en que lo harían si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada como incorporada como referencia.

Aun«que la invención anterior se ha descrito con al«gún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE : NOVARTIS AG (B) CALLE : Schwarzwaldallee 215 (C) CIUDAD: Basilea (E) PAÍS: Suiza (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 4058 (G) TELEFONO: +4161 324 11 11 (H) TELEFAX: +4161 322 75 32 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Una Clase Novedosa de Proteínas el Control de Plagas de Plantas (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 20 (iv) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2378 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) r (iii) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACION: 9..2375 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "secuencia de ADN nativa codifica la proteína VIP3A(a) a partir de AB88, como está contenid pCIB7104" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : AGATGAAC ATG AAC AAG AAT AAT ACT AAA TTA AGC ACÁ AGA GCC TTA CCA Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro 1 5 10 AGT TTT ATT GAT TAT TTT AAT GGC ATT TAT GGA TTT "GCC ACT GGT ATC Ser Phe lie Asp Tyr Phe Asn Gly lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie 20 25 30 AAA GAC ATT ATG ÁAC ATG ATT TTT AAA ACG GAT ACÁ GGT GGT GAT CTA Lys Asp lie Met Asn Met lie Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu 35 40 45 ACC CTA GAC GAA ATT TTA AAG AAT CAG CAG TTA CTA AAT GAT ATT TCT Thr Leu Asp Glu lie Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp lie Ser 50 55 60 GGT AAA TTG GAT GGG GTG AAT GGA AGC TTA AAT GAT CTT ATC GCA CAG Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu lie Ala Gln 65 70 75 GGA AAC TTA AAT ACÁ GAA TTA TCT AAG GAA ATA TTA AAA ATT GCA AAT Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu lie Leu Lys lie Ala Asn 80 85 90 GAA CAÁ AAT CAÁ GTT TTA AAT GAT GTT AAT AAC AAA CTC GAT GCG ATA Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala lie 95 100 105 110 AAT ACG ATG CTT ' CGG GTA TAT CTA CCT AAA ATT ACC TCT ATG TTG AGT Asn Thr Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys lie Thr Ser Met Leu Ser 115 ? 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ATT GTA CAT lie Glu Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro lie Val His 770 775 780 TTT TAC GAT GTC TCT ATT AAG TAA Phe Tyr Asp Val Ser lie Lys 785 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 789 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 lie Asp Tyr Phe Asn Gly lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie Lys Asp 20 25 30 lie Met Asn Met lie Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu 35 ' 40 45 Asp Glu lie Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp lie Ser Gly Lys 50 55 60 Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu lie Ala Gln Gly Asn 65 70 75 80 Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu lie Leu Lys lie Ala Asn Glu Gln 85 90 95 Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala lie Asn Thr 100 105 110 Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys lie Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 115 120 125 Met Lys Gln Asn Tyr 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Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met lie Val Glu Ala Lys 340 345 350 Pro Gly His Ala Leu lie Gly Phe Glu lie Ser Asn Asp Ser lie Thr 355 360 365 Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp 370 375 380 Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val lie Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu 385 390 395 400 Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln lie Tyr Tyr Thr Asn Asn lie Val Phe 405 410 415 Pro Asn Glu Tyr Val lie Thr Lys lie Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys 420 425 430 Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 435 440 445 Glu lie Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val 465 470 475 480 lie Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro lie Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala 485 490 495 Asp Glu Asn Ser Arg Leu lie Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg 500 505 510 Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu lie 515 520 525 Val Pro Pro Ser Gly Phe lie Ser Asn lie Val Glu Asn Gly Ser lie 530 535 540 Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560 Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His 565 570 575 Lys Asp Gly Gly lie Ser Gln Phe lie Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys 580 585 590 Thr Glu Tyr Val lie Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser lie His 595 600 605 Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr lie His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 610 615 620 Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr lie Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 625 630 635 640 Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu lie Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu 645 650 655 Ala Trp Gly Asp Asn Phe lie lie Leu Glu lie Ser Pro Ser Glu Lys 660 665 670 Leu Leu Ser Pro Glu Leu lie Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly 675 680 685 Ser Thr Asn lie Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg 690 695 700 Gly lie Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 705 710 715 720 Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg lie Arg Asn Ser 725 730 735 Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val 740 745 750 Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr lie Glu 755 760 765 Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro lie Val His Phe Tyr 770 775 780 Asp Val Ser lie Lys 785 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2612 aminoácidos (B) T?PO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACION: 118..2484 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia de ADN nativa codifica VIP3A(b) a partir de AB424" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: ATTGAAATTG ATAAAAAGTT ATGAGTGTTT AATAATCAGT AATTACCAAT AAAGAATTAA GAATACAAGT TTACAAGAAA TAAGTGTTAC AAAAAATAGC TGAAAAGGAA GATGAAC ATG AAC AAG AAT AAT ACT AAA TTA AGC ACÁ AGA GCC TTA CCA AGT TTT Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe 790 795 800 805 ATT GAT TAT TTC AAT GGC ATT TAT GGA TTT GCC ACT GGT ATC AAA GAC lie Asp Tyr Phe Asn Gly lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie Lys Asp 810 815 820 ATT ATG AAC ATG ATT TTT AAA ACG GAT ACÁ GGT GGT GAT CTA ACC CTA lie Met Asn Met lie Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu 825 830 835 GAC GAA ATT TTA AAG AAT CAG CAG CTA CTA AAT GAT ATT TCT GGT AAA Asp Glu lie Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp lie Ser Gly Lys 840 " 845 850 TTG GAT GGG GTG AAT GGA AGC TTA AAT GAT CTT ATC GCA CAG GGA AAC Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu lie Ala Gln Gly Asn 855 860 865 TTA AAT ACÁ GAA TTA TCT AAG GAA ATA TTA AAA ATT GCA AAT GAA CAÁ Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu lie Leu Lys lie Ala Asn Glu Gln 870 875 880 885 AAT CAÁ GTT TTA AAT GAT GTT AAT AAC AAA CTC GAT GCG ATA AAT ACG Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala lie Asn Thr 890 895 900 ATG CTT CGG GTA TAT CTA CCT AAA ATT ACC TCT ATG TTG AGT GAT GTA Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys lie Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 905 910 915 ATG AAA CAÁ AAT TAT GCG CTA AGT CTG CAÁ ATA GAA TAC TTA AGT AAA Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln lie Glu Tyr Leu Ser Lys 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1040 1045 ACT AAA GAA AAT GTG AAÁ ACÁ AGT GGC AGT GAG GTC GGA AAT GTT TAT Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr 1050 1055 1060 AAC TTC CTA ATT GTA TTA ACÁ GCT CTG CAÁ GCA AAA GCT TTT CTT ACT Asn Phe Leu lie Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr 1065 1070 1075 TTA ACÁ CCA TGC CGA AAA TTA TTA GGC TTA GCA GAT ATT GAT TAT ACT Leu Thr Pro Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp lie Asp Tyr Thr 1080 1085 1090 TCT ATT ATG AAT GAA CAT TTA AAT AAG GAA AAA GAG GAA TTT AGA GTA Ser lie Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val 1095 1100 1105 AAC ATC CTC CCT ACÁ CTT TCT AAT ACT TTT TCT AAT CCT AAT TAT GCA Asn lie Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala 1110 1115 1120 1125 AAA GTT AAA GGA AGT GAT GAA GAT GCA AAG ATG ATT GTG GAA GCT AAA Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met lie Val Glu Ala Lys 1130 1135 1140 CCA GGA CAT GCA TTG ATT GGG TTT GAA ATT AGT AAT GAT TCA ATT ACÁ Pro Gly His Ala Leu lie Gly Phe Glu lie Ser Asn Asp Ser lie Thr 1145 1150 1155 GTA TTA AAA GTA TAT GAG GCT AAG CTA AAA CAÁ AAT TAT CAÁ GTC GAT Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp 1160 1165 1170 AAG GAT TCC TTA TCG GAA GTT ATT TAT GGC GAT ATG GAT AAA TTA TTG Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val lie Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu 1175 1180 1185 TGC CCA GAT CAÁ TCT GGA CAÁ ATC TAT TAT ACÁ AAT AAC ATA GTA TTT Cys Pro Asp Gln Ser Gly Gln lie Tyr Tyr Thr Asn Asn lie Val Phe 1190 1195 1200 1205 CCA AAT GAA TAT GTA ATT ACT AAA ATT GAT TTC ACT AAA AAA ATG AAA Pro Asn Glu Tyr Val lie Thr Lys lie Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys 1210 1215 1220 ACT TTA AGA TAT GAG GTA ACÁ GCG AAT TTT TAT GAT TCT TCT ACÁ GGA Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 1225 1230 1235 GAA ATT GAC TTA AAT AAG AAA AAA GTA GAA TCA AGT GAA GCG GAG TAT Glu lie Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 1240 1245 1250 AGA ACG TTA AGT GCT AAT GAT GAT GGG GTG TAT ATG CCG TTA GGT GTC Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val 1255 1260 1265 ATC AGT GAA ACÁ TTT TTG ACT CCG ATT AAT GGG TTT GGC CTC CAÁ GCT lie Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro lie Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala 1270 1275 1280 1285 GAT GAA AAT TCA AGA TTA ATT ACT TTA ACÁ TGT AAA TCA TAT TTA AGA Asp Glu Asn Ser Arg Leu lie Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg 1290 1295 1300 GAA CTA CTG CTA GCA ACÁ GAC TTA AGC AAT AAA GAA ACT AAA TTG ATC Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu lie 1305 1310 1315 GTC CCG CCA AGT GGT TTT ATT AGC AAT ATT GTA GAG AAC GGG TCC ATA Val Pro Pro Ser Gly Phe lie Ser Asn lie Val Glu Asn Gly Ser lie 1320 1325 1330 GAA GAG GAC AAT TTA GAG CCG TGG AAA GCA AAT AAT AAG AAT GCG TAT Glu Glu Asp Asn Leu Glü Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 1335 1340 1345 GTA GAT CAT ACÁ GGC GG GTG AAT GGA ACT AAA GCT TTA TAT GTT CAT Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His 1350 1355 1360 1365 AAG GAC GGA GGA ATT TCA CAÁ TTT ATT GGA GAT AAG TTA AAA CCG AAA Lys Asp Gly Gly lie Ser Gln Phe lie Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys 1370 1375 1380 ACT GAG TAT 'GTA ATC CAÁ TAT ACT GTT AAA GGA AAA CCT TCT ATT CAT 1 Thr Glu Tyr Val lie Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser lie His 1385 1390 1395 TTA AAA GAT GAA AAT ACT GGA TAT ATT CAT TAT GAA GAT ACÁ AAT AAT 1 Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr lie His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 1400 1405 1410 AAT TTA GAA GAT TAT CAÁ ACT ATT AAT AAA CGT TTT ACT ACÁ GGA ACT 2 Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr lie Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 1415 1420 1425 GAT TTA AAG GGA GTG TAT TTA ATT TTA AAA AGT CAÁ AAT GGA GAT GAA 2 Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu lie Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu 1430 1435 1440 1445 GCT TGG GGA GAT AAC TTT ATT ATT TTG GAA ATT AGT CCT TCT GAA AAG 2 Ala Trp Gly Asp Asn Phe lie lie Leu Glu lie Ser Pro Ser Glu Lys 1450 1455 1460 TTA TTA AGT CCA GAA TTA ATT AAT ACÁ AAT AAT TGG ACG AGT ACG GGA 2 Leu Leu Ser Pro Glu Leu lie Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly 1465 1470 1475 TCA ACT AAT ATT AGC GGT AAT ACÁ CTC ACT CTT TAT CAG GGA GGA CGA Ser Thr Asn lie Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg 1480 1485 1490 GGG ATT CTA AAA CAÁ AAC CTT CAÁ TTA GAT AGT TTT TCA ACT TAT AGA Gly lie Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 1495 " 1500 1505 GTG TAT TTC TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA AGG ATT AGA AAT TCT Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg lie Arg Asn Ser 1510 1515 1520 1525 AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC GGT GCT AAA GAT GTT Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val 1530 1535 1540 TCT GAA ATG TTC ACT AC AAA TTT GAG AAA GAT AAC TTC TAT ATA GAG Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr lie Glu 1545 1550 1555 CTT TCT CAÁ GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT ATT GTA CAT TTT TAC Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro lie Val His Phe Tyr 1560- 1565 1570 GAT GTC TCT ATT AAG TAAGATCGGG ATCTAATATT AACAGTTTTT AGAAGCTAAT Asp Val Ser lie Lys 1575 TCTTGTATAA TGTCCTTGAT TATGGAAAAA CACAATTTTG TTTGCTAAGA TGTATATATA GCTCACTCAT TAAAAGGCAA TCAAGCTT (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 789 aminoácidos r (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 4: Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 lie Asp Tyr Phe Asn G?y lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie Lys Asp 20 25 30 lie Met Asn Met lie Pne Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu 35 40 45 Asp Glu lie Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp lie Ser Gly Lys 50 55 60 i Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu lie Ala Gln Gly Asn 65 70 75 80 Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu lie Leu Lys lie Ala Asn Glu Gln 85 90 95 Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala lie Asn Thr 100 105 110 Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys lie Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 115 120 125 Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln lie Glu Tyr Leu Ser Lys 130 135 140 Gln Leu Gln Glu lie Ser Asp Lys Leu Asp lie lie Asn Val Asn Val 145 150 155 160 Leu lie Asn Ser Thr Leu Thr Glu lie Thr Pro Ala Tyr Gln 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Val Asp 370 375 380 Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val lie Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu 385 390 395 400 Cys Pro Asp Gln Ser Gly Gln lie Tyr Tyr Thr Asn Asn lie Val Phe 405 410 415 Pro Asn Glu Tyr Val lie Thr Lys lie Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys 420 425 430 Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 435 * 440 445 Glu lie Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val 465 470 475 480 lie Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro lie Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala 485 490 495 Asp Glu Asn Ser Arg Leu lie Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg 500 505 510 Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu lie 515 520 525 Val Pro Pro Ser Gly Phe lie Ser Asn lie Val Glu Asn Gly Ser lie 530 535 540 Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560 Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His 565 570 575 Lys Asp Gly Gly lie Ser Gln Phe lie Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys 580 585 590 Thr Glu Tyr Val lie Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser lie His 595 600 605 Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr lie His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 610 ( 615 620 Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr lie Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 625 630 635 640 Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu lie Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu 645 650 655 Ala Trp Gly Asp Asn Phe lie lie Leu Glu lie Ser Pro Ser Glu Lys 660 665 670 Leu Leu Ser Pro Glu Leu lie Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly 675 680 685 Ser Thr Asn lie Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg 690 695 700 Gly lie Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 705 710 715 720 Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg lie Arg Asn Ser 725 730 735 Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val 740 745 750 Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr lie Glu 755 760 765 Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro lie Val His Phe Tyr 770 775 780 Asp Val Ser lie Lys 785 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2364 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACION: 56..2295 (D) OTRA INFORMACIÓN: /producto= "proteína VIP3A(c)" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: AATACAATTT ACGAGGGATA ÁGTGTTACAA AGAATAGCTG AGGAGGGAGA TGAAC ATG * * Met AAC AAG AAT AAT GCT AAA TTA AGC ACÁ AGA GCC TTA CCA AGT TTT ATT Asn Lys Asn Asn Ala Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe lie 5 10 15 GAT TAT TTC AAT GGC ATT TAT GGA TTT GCC ACT GGT ATC AAA GAC ATT Asp Tyr Phe Asn Gly lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie Lys Asp lie 20 25 30 ATG AAC ATG ATT TTT AAA ACG GAT ACÁ GGT GGT GAT CTA GCC CTA GAC Met Asn Met lie Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Ala Leu Asp 35 40 45 GAA ATT TTA GAG AAT CAG CAG CTA CTA AAT GAT ATT TCT GGT AAA TTG Glu lie Leu Glu Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp lie Ser Gly Lys Leu 50 55 60 65 GAT GGG GTG AAT GGA AGC TTA AAT GAT CTT ATC GCA CAG GGA AAC TTA Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu lie Ala Gln Gly Asn Leu 70 75 80 AAT ACÁ GAA TTA TCT AAG GAA ATA TTA AAA ATT GCA AAT GAA CAÁ AAT Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu lie Leu Lys lie Ala Asn Glu Gln Asn 85 90 95 CAÁ GTT TTA AAT GAT GTT AAT AAC AAA CTC GAT GCG ATA AAT ACG ATG Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala lie Asn Thr Met 100 105 110 CTT CGG GTA TAT CTA CCT AAA ATT ACC TCT ATG TTG AGT GAT GTA ATG Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys lie Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met 115 120 125 AAA CAÁ AAT TAT GCG CTA AGT CTG CAÁ ATA GAA TAC TTA AGT AAA CAÁ Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln lie Glu Tyr Leu Ser Lys Gln 130 135 140 145 TTG CAÁ GAG ATT TCT GAT AAG TTG GAT ATT ATT AAT GTA AAT GTA CTT Leu Gln Glu lie Ser Asp Lys Leu Asp lie lie Asn Val Asn Val Leu 150 155 160 ATT AAC TCT ACÁ CTT ACT GAA ATT ACÁ CCT GCG TAT CAÁ AGG ATT AAA lie Asn Ser Thr Leu Thr Glu lie Thr Pro Ala Tyr Gln Arg lie Lys 165 170 175 TAT GTG AAC GAA AAA TTT GAG GAA TTA ACT TTT GCT ACÁ GAA ACT AGT Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr Ser 180 185 190 TCA AAA GTA AAA AAG GAT GGC TCT CCT GCA GAT ATT CGT GAT GAG TTA Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp lie Arg Asp Glu Leu 195 200 205 AGT GAG TTA ACT GAA CTA GCG AAA AGT GTA ACÁ CAÁ AAT GAT GTG GAT Ser Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Gln Asn Asp Val Asp 210 215 220 225 GGT TTT GAA TTT TAC CTT AAT ACÁ TTC CAC GAT GTA ATG GTA GGA AAT Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn 230 235 240 AAT TTA TTC GGG CGT TCA GCT TTA AAA ACT GCA TCG GAA TTA ATT ACT Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu lie Thr 245 250 255 AAA GAA AAT GTG AAA ACÁ AGT GGC AGT GAG GTC GGA AAT GTT TAT AAC Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn 260 265 270 TTC CTA ATT GTA TTA ACÁ GCT CTG CAÁ GCA CAÁ GCT TTT CTT ACT TTA Phe Leu lie Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr Leu 275 280 285 ACÁ CCA TGC CGA AAA TTA TTA GGC TTA GCA GAT ATT GAT TAT ACT TCT Thr Pro Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp lie Asp Tyr Thr Ser 290 295 , 300 305 ATT ATG AAT GAA CAT TTA AAT AAG GAA AAA GAG GAA TTT AGA GTA AAC 1 lie Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn 310 * 315 320 ATC CTC CCT ACÁ CTT TCT AAT ACT TTT TCT AAT CCT AAT TAT GCA AAA 1 lie Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys 325 330 335 GTT AAA GGA AGT GAT GAA GAT GCA AAG ATG ATT GTG GAA GCT AAA CCA Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met lie Val Glu Ala Lys Pro 340 345 350* GGA CAT GCA TTG ATT GGG TTT GAA ATT AGT AAT GAT TCA ATT ACÁ GTA 1 Gly His Ala Leu lie Gly Phe Glu lie Ser Asn Asp Ser lie Thr Val 355 360 365 TTA AAA GTA TAT GAG GCT AAG CTA AAA CAÁ AAT TAT CAÁ GTC GAT AAG 1 Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys 370 375 380 385 a.

GAT TCC TTA TCG GAA GTT ATT TAT GGC GAT ATG GAT AAA TTA TTG TGC 1 Asp Ser Leu Ser Glu Val lie Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu Cys 390 395 400 CCA GAT CAÁ TCT GGA CAÁ ATC TAT TAT ACÁ AAT AAC ATA GTA TTT CCA 1 Pro Asp Gln Ser Gly Gln lie Tyr Tyr Thr Asn Asn lie Val Phe Pro 405 410 415 AAT GAA TAT GTA ATT ACT AAA ATT GAT TTC ACT AAA AAA ATG AAA ACT 1 Asn Glu Tyr Val lie Thr Lys lie Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr 420 425 430 TTA AGA TAT GAG GTA ACÁ GCG AAT TTT TAT GAT TCT TCT ACÁ GGA GAA 1 Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu 435 440 445 ATT GAC TTA AAT AAG AAA AAA GTA GAA TCA AGT GAA GCG GAG TAT AGA 1 lie Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg 450 455 460 465 ACG TTA AGT GCT AAT GAT GAT GGG GTG TAT ATG CCG TTA GGT GTC ATC 1 Thr Leu Ser Ala Asn Ásp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val lie 470 " 475 480 AGT GAA ACÁ TTT TTG ACT CCG ATT AAT GGG TTT GGC CTC CAÁ GCT GAT 1 Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro lie Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp 485 490 495 GAA AAT TCA AGA TTA ATT ACT TTA ACÁ TGT AAA TCA TAT TTA AGA GAA 1 Glu Asn Ser Arg Leu lie Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu 500 505 510 CTA CTG CTA GCA ACÁ GAC TTA AGC AAT AAA GAA ACT AAA TTG ATC GTC 1 Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu lie Val 515 520 525 CCG CCA AGT GGT TTT ATT AGC AAT ATT GTA GAG AAC GGG TCC ATA GAA Pro Pro Ser Gly Phe lie Ser Asn lie Val Glu Asn Gly Ser lie Glu 530 535 540 545 GAG GAC AAT TTA GAG CCG TGG AAA GCA AAT AAT AAG AAT GCG TAT GTA Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val 550 555 560 GAT CAT ACÁ GGC GGA GTG AAT GGA ACT AAA GCT TTA TAT GTT CAT AAG 1 Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His Lys 565 570 575 GAC GGA GGA ATT TCA CAÁ TTT ATT GGA GAT AAG TTA AAA CCG AAA ACT 1 Asp Gly Gly lie Ser Gln Phe lie Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys Thr 580 585 590 GAG TAT GTA ATC CAÁ TAT ACT GTT AAA GGA AAA CCT TCT ATT CAT TTA 1 Glu Tyr Val lie Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser lie His Leu 595 600 605 AAA GAT GAA AAT ACT GGA TAT ATT CAT TAT GAA GAT ACÁ AAT AAT AAT 1 Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr lie His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asn 610 615 620 625 TTA GAA GAT TAT CAÁ ACT ATT AAT AAA CGT TTT ACT ACÁ GGA ACT GAT 1 Leu Glu Asp Tyr Gln Thr lie Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr Asp 630 635 640 TTA AAG GGA GTG TAT TTA ATT TTA AAA AGT CAÁ AAT GGA GAT GAA GCT 2 Leu Lys Gly Val Tyr Leu lie Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu Ala 645 650 655 TGG GGA GAT AAC TTT ATT ATT TTG GAA ATT AGT CCT TCT GAA AAG TTA 2 Trp Gly Asp Asn Phe lie lie Leu Glu lie Ser Pro Ser Glu Lys Leu 660 665 670 TTA AGT CCA GAA TTA ATT AAT ACÁ AAT AAT TGG ACG AGT ACG GGA TCA 2 Leu Ser Pro Glu Leu lie Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly Ser 675 680 685 ACT AAT ATT AGC GGT AAT ACÁ CTC ACT CTT TAT CAG GGA GGA CGA GGG 2 Thr Asn lie Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg Gly 690 695 700 705 ATT CTA AAA CAÁ AAC CTT CAÁ TTA GAT AGT TTT TCA ACT TAT AGA GTG 2 lie Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg Val 710 715 720 TAT TTC TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA AGG ATT AGA AAT TCT AGG 2 Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg lie Arg Asn Ser Arg 725 730 735 GAA GTG TTA TTT GAA AAA AAG GAT ATA TGA GC GGCGCTAAAG ATGTTTCTGA Glu Val Leu Phe Glu Lys Lys Asp lie 740 745 AATGTTCACT ACAAAATTGA AAGATAACTT CTATATAGAG CTTTCT (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 747 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: Met Asn Lys Asn Asn Ala Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 lie Asp Tyr Phe Asn Gly lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie Lys Asp 20 25 30 lie Met Asn Met lie Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Ala Leu 35 40 45 Asp Glu lie Leu Glu Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp lie Ser Gly Lys 50 55 60 Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu lie Ala Gln Gly Asn 65 70 75 80 Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu lie Leu Lys lie Ala Asn Glu Gln 85 90 95 Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala lie Asn Thr 100 105 110 Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys lie Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 115 120 125 Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln lie Glu Tyr Leu Ser Lys 130 * 135 140 Gln Leu Gln Glu lie Ser Asp Lys Leu Asp lie lie Asn Val Asn Val 145 150 155 160 Leu lie Asn Ser Thr Leu Thr Glu lie Thr Pro Ala Tyr Gln Arg lie 165 170 175 Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr 180 185 190 Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp lie Arg Asp Glu 195 200 , 205 Leu Ser Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Gln Asn Asp Val 210 215 220 Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly 225 230 235 240 Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu lie 245 250 255 Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr 260 265 270 Asn Phe Leu lie Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Pro Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp lie Asp Tyr Thr 290 295 300 Ser lie Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val 305 310 315 320 Asn lie Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala 325 330 335 Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met lie Val Glu Ala Lys 340 345 350 Pro Gly His Ala Leu lie Gly Phe Glu lie Ser Asn Asp Ser lie Thr 355 360 365 Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp 370 375 380 Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val lie Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu 385 390 395 400 Cys Pro Asp Gln Ser Gly Gln lie Tyr Tyr Thr Asn Asn lie Val Phe 405 410 415 Pro Asn Glu Tyr Val lie Thr Lys lie Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys 420 425 430 Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 435 440 445 Glu lie Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val 465 470 475 480 lie Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro lie Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala ,485 490 495 Asp Glu Asn Ser Arg Leu lie Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg 500 505 510 Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu lie 515 520 525 Val Pro Pro Ser Gly Phe lie Ser Asn lie Val Glu Asn Gly Ser lie 530 535 540 Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560 Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His 565 570 575 Lys Asp Gly Gly lie Ser Gln Phe lie Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys 580 585 590 Thr Glu Tyr Val lie Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser lie His 595 600 605 Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr lie His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 610 615 620 Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr lie Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 625 630 635 640 Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu lie Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu 645 650 655 Ala Trp Gly Asp Asn Phe lie lie Leu Glu lie Ser Pro Ser Glu Lys 660 665 670 Leu Leu Ser Pro Glu Leu lie Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly 675 680 685 Ser Thr Asn lie Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg 690 695 700 Gly lie Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 705 710* 715 720 Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg lie Arg Asn Ser "725 730 735 Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Lys Asp lie 740 * 745 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2403 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético" (iii) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 11..2389 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia de ADN optimizad maíz «que codifica VIP3A(a) " (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: GGATCCACCA ATGAACATGA ACAAGAACAA CACCAAGCTG AGCACCCGCG CCCTGCCGAG CTTCATCGAC TACTTCAACG GCATCTACGG CTTCGCCACC GGCATCAAGG ACATCATGAA CATGATCTTC AAGACCGACA CCGGCGGCGA CCTGACCCTG GACGAGATCC TGAAGAACCA GCAGCTGCTG AACGACATCA GCGGCAAGCT GGACGGCGTG AACGGCAGCC TGAACGACCT GATCGCCCAG GGCAACCTGA ACACCGAGCT GAGCAAGGAG ATCCTTAAGA TCGCCAACGA GCAGAACCAG GTGCTGAACG ACGTGAACAA CAAGCTGGAC GCCATCAACA CCATGCTGCG CGTGTACCTG CCGAAGATCA CCAGCATGCT GAGCGACGTG ATGAAGCAGA ACTACGCCCT GAGCCTGCAG ATCGAGTACC TGAGCAAGCA GCTGCAGGAG ATCAGCGACA AGCTGGACAT CATCAACGTG AACGTCCTGA TCAACAGCAC CCTGACCGAG ATCACCCCGG CCTACCAGCG CATCAAGTAC GTGAACGAGA AGTTCGAAGA GCTGACCTTC GCCACCGAGA CCAGCAGCAA GGTGAAGAAG GACGGCAGCC CGGCCGACAT CCTGGACGAG CTGACCGAGC TGACCGAGCT GGCCAAGAGC GTGACCAAGA ACGACGTGGA CGGCTTCGAG TTCTACCTGA ACACCTTCCA CGACGTGATG GTGGGCAACA ACCTGTTCGG CCGCAGCGCC CTGAAGACCG CCAGCGAGCT GATCACCAAG GAGAACGTGA AGACCAGCGG CAGCGAGGTG GGCAACGTGT ACAACTTCCT GATCGTGCTG ACCGCCCTGC AGGCCCAGGC CTTCCTGACC CTGACCACCT GTCGCAAGCT GCTGGGCCTG GCCGACATCG ÁCTACACCAG CATCATGAAC GAGCACTTGA ACAAGGAGAA GGAGGAGTTC CGCGTGAACA fCCTGCCGAC CCTGAGCAAC ACCTTCAGCA ACCCGAACTA 1 CGCCAAGGTG AAGGGCAGCG ACGAGGACGC CAAGATGATC GTGGAGGCTA AGCCGGGCCA 1 CGCGTTGATC GGCTTCGAGA TCAGCAACGA CAGCATCACC GTGCTGAAGG TGTACGAGGC 1 CAAGCTGAAG CAGAACTACC ÁGGTGGACAA GGACAGCTTG AGCGAGGTGA TCTACGGCGA 1 CATGGACAAG CTGCTGTGTC CGGACCAGAG CGAGCAAATC TACTACACCA ACAACATCGT 1 GTTCCCGAAC GAGTACGTGA TCACCAAGAT CGACTTCACC AAGAAGATGA AGACCCTGCG CTACGAGGTG ACCGCCAACT TCTACGACAG CAGCACCGGC GAGATCGACC TGAACAAGAA GAAGGTGGAG AGCAGCGAGG CCGAGTACCG CACCCTGAGC GCGAACGACG ACGGCGTCTA CATGCCACTG GGCGTGATCA GCGAGACCTT CCTGACCCCG ATCAACGGCT TTGGCCTGCA GGCCGACGAG AACAGCCGCC TGATCACCCT GACCTGTAAG AGCTACCTGC GCGAGCTGCT GCTAGCCACC GACCTGAGCA ACAAGGAGAC CAAGCTGATC GTGCCACCGA GCGGCTTCAT CAGCAACATC GTGGAGAACG GCAGCATCGA GGAGGACAAC CTGGAGCCGT GGAAGGCCAA CAACAAGAAC GCCTACGTGG ACCACACCGG CGGCGTGAAC GGCACCAAGG CCCTGTACGT GCACAAGGAC GGCGGCATCA GCCAGTTCAT CGGCGACAAG CTGAAGCCGA AGACCGAGTA CGTGATCCAG TACACCGTGA AGGGCAAGCC ATCGATTCAC CTGAAGGACG AGAACACCGG CTACATCCAC TACGAGGACA 'CCAACAACAA CCTGGAGGAC TACCAGACCA TCAACAAGCG CTTCACCACC GGCACCGACC TGAAGGGCGT GTACCTGATC CTGAAGAGCC AGAACGGCGA CGAGGCCTGG GGCGACAACT TCATCATCCT GGAGATCAGC CCGAGCGAGA AGCTGCTGAG CCCGGAGCTG ATCAACACCA ACAACTGGAC CAGCACCGGC AGCACCAACA TCAGCGGCAA CACCCTGACC CTGTACCAGG GCGGCCGCGG CATCCTGAAG CAGAACCTGC AGCTGGACAG CTTCAGCACC TACCGCGTGT ACTTCAGCGT GAGCGGCGAC GCCAACGTGC GCATCCGCAA CAGCCGCGAG GTGCTGTTCG AGAAGAGGTA CATGAGCGGC GCCAAGGACG TGAGCGAGAT GTTCACCACC AAGTTCGAGA AGGACAACTT CTACATCGAG CTGAGCCAGG GCAACAACCT GTACGGCGGC CCGATCGTGC ACTTCTACGA CGTGAGCATC AAGTTAACGT AGAGCTCAGA TCT (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1638 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACION: 44..1191 (D) OTRA INFORMACIÓN: /producto= "Traducción de ADNc codifica el receptor de VIP3A(a) " (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 8: T AGT GGA TCC CCC GGG CTG CAG GAA TTC GCG GCC GCG TCG ACC ATG Met 1 5 10 15 TAC TCT AGA ATA TTT TTC CTC CTT GTG ATA GTG TGT GCT GTT AAG GCT Tyr Ser Arg lie Phe Phe Leu Leu Val lie Val Cys Ala Val Lys Ala 20 25 30 TCT CTG TTT ACT GTA AAT GTG TAT GAT GAT AAC CCC GAA ACT GAA ATT Ser Leu *Phe Thr Val Asn Val Tyr Asp Asp Asn Pro Glu Thr Glu lie 35 40 45 GCG AGT AGT CTA AAA GGC TGT AAC CCC CAÁ GAG TGT GAC CAG CGG TGT Ala Ser Ser Leu Lys Gly Cys Asn Pro Gln Glu Cys Asp Gln Arg Cys 50 55 60 CGT AGA CTG AAG TTT CCC GGT GGC GCC TGT GTC AAT GGT CGC TGC AAG Arg Arg Leu Lys Phe Pro Gly Gly Ala Cys Val Asn Gly Arg Cys Lys 65 *' * 70 75 TGT GAC AAC TTC CTC AG ' GTA AAA GAT GAC GTG TCT GTT GAA GAG CCT Cys Asp Asn Phe Leu Ser Val Lys Asp Asp Val Ser Val Glu Glu Pro 80 85 90 95 GCG ATT CTC AAA GAT TTG GTG TCA TTA GAA GCT GAA CAG GCA GCG AAA Ala lie Leu Lys Asp Leu Val Ser Leu Glu Ala Glu Gln Ala Ala Lys 100 105 110 AGT AGA TGC AGA AAC AGA GTG TGT GAC GCG GTG TGC CGT GCC CTA CAC Ser Arg Cys Arg Asn Arg Val Cys Asp Ala Val Cys Arg Ala Leu His 115 * 120 125 AAC ACC AGT GGT GCC TGT GTT GAT GGA CAÁ TGC AAG TGT ACT AAT AAG Asn Thr Ser Gly Ala Cys Val Asp Gly Gln Cys Lys Cys Thr Asn Lys 130 135 140 ATC AGT GCA GGA GAT ATT GTG TCT GAT CCT GCT GAA TCG CTA CGC ACT lie Ser Ala Gly Asp lie Val Ser Asp Pro Ala Glu Ser Leu Arg Thr 145 150 155 TGT AAC CCT ATA AGG TGT GAC GAA CAÁ TGT AGA AGA AAT GGC CAT GAA Cys Asn Pro lie Arg Cys Asp Glu Gln Cys Arg Arg Asn Gly His Glu 160 165 170 175 TTT GGT GTT TGC TTC AAA GGA CAÁ TGC AAG TGT GAT TAC TTC CTC AAG Phe Gly Val Cys Phe Lys Gly Gln Cys Lys Cys Asp Tyr Phe Leu Lys 180 185 190 GAA GAA GTC GAT GAA CCT GAA GTT ACÁ AGC CTT CCA AAA AAC TGC AAC Glu Glu Val Asp Glu Pro Glu Val Thr Ser Leu Pro Lys Asn Cys Asn 195 200 205 CCC CAÁ GAG TGT GAC CAG CGT TGT CGT AGA CTG AAG TTC CCC GGT GGC Pro Gln Glu Cys Asp Gln Arg Cys Arg Arg Leu Lys Phe Pro Gly Gly 210 ' 215 220 GCC TGT GTC AAC GGG CGC TGC AAG TGT GAC AAC TTC TTC AGT GCA GGA Ala Cys Val Asn Gly Arg Cys Lys Cys Asp Asn Phe Phe Ser Ala Gly 225 230 235 GAT ATT GTG TCT GAT CCT GCC GAA TCG CTA CGC TCT TGT AAC CCT ATA Asp lie Val Ser Asp Pro Ala Glu Ser Leu Arg Ser Cys Asn Pro lie 240 245 250 255 AGG TGT GAC GAA CAÁ TGT AGA AGA AAT GGC CAT GAA TTT GGT GTT TGC Arg Cys Asp Glu Gln Cys Arg Arg Asn Gly His Glu Phe Gly Val Cys 260 265 270 TTC AAA GGA CAÁ TGC AAG TGT GAT TAC TTC CTC AAC TCA GAA GTA GAC Phe Lys Gly Gln Cys Lys Cys Asp Tyr Phe Leu Asn Ser Glu Val Asp 275 280 285 GCT GTT AAT GAG TTT CCT CAÁ GCG GGC TCA AAA CGC TAC TGC AAC TTA Ala Val Asn Glu Phe Pro Gln Ala Gly Ser Lys Arg Tyr Cys Asn Leu 290 295 300 ACG CAÁ TGC AAC CAG ACG TGC GCC AAT CGT TTC TAT GAT AGT GCT AGA fe Thr Gln Cys Asn Gln Thr Cys Ala Asn Arg Phe Tyr Asp Ser Ala Arg 305 310 315 GTG ATC CAC GGC TGG TGC AAA TGC TAC AGT AAG ATG GAA AGA CAG GAT Val lie His Gly Trp Cys* Lys Cys Tyr Ser Lys Met Glu Arg Gln Asp 320 325 330 335 GCA TCT CCA TTA AAC GAT GTG ACT GAG GAT GAA AAT GAA GTT TCT AAC ? Ala Ser Pro Leu Asn Asp Val Thr Glu Asp Glu Asn Glu Val Ser Asn 340 345 350 GAT ATC CTG AGG ACT GTT GCA GAG GAG CTG TCT GAT GTG TCA CCT AGG Asp lie Leu Arg Thr Val Ala Glu Glu Leu Ser Asp Val Ser Pro Arg 355 360 365 GCC TGC AAA TCA GCG AGC TGC AAT CAÁ GCA TGT CGC GCC TTC TAC TTT 1 Ala Cys Lys Ser Ala Ser Cys Asn Gln Ala Cys Arg Ala Phe Tyr Phe 370 ' * 375 380 AAA GGA GGG TGG TGT CGC TTT GGA CGA TGC CAÁ TGC TTC TA 1 Lys Gly Gly Trp Cys Arg Phe Gly Arg Cys Gln Cys Phe 385 - 390 395 AAATTAGTAT GATATATGAA TTTTGTATTA TTCGGTTAAT TGTGTTATGT TTAAAAAACA 1 TAATGTCTTC ATTTTAGAAA AAGTACCTT CACTAAAGCG CAACAATTAA CTAGTAGTTA 1 ATTATTAACT AGTAGTTAAA TTATTGATGA TTATGATTAT CTTAGTAGTA GTTAATTATA 1 ATCATCAACT ATTAACTAGT AGTTAATTAT TAACTAGTAG TTAAATTATT GATGATTATG 1 ATTATCTTAG TAGTAGTTAA TTATTGTTTC TTATAATAAT CTAGTATGTT GGTAGGTACT 1 TAATAATAAC GCTTCTGACA AAAAATTTAA AATTAAATAA TTCTATCAAA CATAAATAAT 1 AACTGAAATA AAAATTTATA AGAGAAAAAA AAAAAGTCGA CGCGGCCGCG AATTCGATAT 1 CAAGCTTATC GATACCGTCG ACCTCGA 1 (2) INFORMACIÓN PARA IJA SEQ ID NO : 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 396 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína ( i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: Ser Gly Ser Pro Gly Leu Gln Glu Phe Ala Ala Ala Ser Thr Met Tyr 1 5 10 15 Ser Arg lie Phe Phe Leu Leu Val lie Val Cys Ala Val Lys Ala Ser 20 25 30 Leu Phe Thr Val Ásn Val Tyr Asp Asp Asn Pro Glu Thr Glu lie Ala 35 40 45 Ser Ser Leu Lys Gly Cys Asn Pro Gln Glu Cys Asp Gln Arg Cys Arg 50 " > 55 60 Arg Leu Lys Phe Pro Gly Gly Ala Cys Val Asn Gly Arg Cys Lys Cys 65 " 70 75 80 Asp Asn Phe Leu Ser Val Lys Asp Asp Val Ser Val Glu Glu Pro Ala 85 90 95 lie Leu Lys Asp Leu Val Ser Leu Glu Ala Glu Gln Ala Ala Lys Ser 100 105 110 Arg Cys Arg Asn Arg Val Cys Asp Ala Val Cys Arg Ala Leu His Asn 115 120 125 Thr Ser Gly Ala Cys Val Asp Gly Gln Cys Lys Cys Thr Asn Lys lie 130 135 140 Ser Ala Gly Asp lie Val' Ser Asp Pro Ala Glu Ser Leu Arg Thr Cys 145 150 155 160 Asn Pro lie Arg Cys Asp Glu Gln Cys Arg Arg Asn Gly His Glu Phe 165 170 175 Gly Val Cys Phe Lys Gly Gln Cys Lys Cys Asp Tyr Phe Leu Lys Glu 180 185 190 Glu Val Asp Glu Pro Glu Val Thr Ser Leu Pro Lys Asn Cys Asn Pro 195 200 205 Gln Glu Cys Asp Gln Arg Cys Arg Arg Leu Lys Phe Pro Gly Gly Ala 210 215 220 Cys Val Asn Gly Arg Cys Lys Cys Asp Asn Phe Phe Ser Ala Gly Asp 225 230 235 240 lie Val Ser Asp Pro Ala Glu Ser Leu Arg Ser Cys Asn Pro lie Arg 245 250 255 Cys Asp Glu Gln Cys Arg Arg Asn Gly His Glu Phe Gly Val Cys Phe 260 265 270 Lys Gly Gln Cys Lys Cys Asp Tyr Phe Leu Asn Ser Glu Val Asp Ala 275 280 285 Val Asn Glu Phe Pro Gln Ala Gly Ser Lys Arg Tyr Cys Asn Leu Thr 290 295 300 Gln Cys Asn Gln Thr Cys Ala Asn Arg Phe Tyr Asp Ser Ala Arg Val 305 310 315 320 lie His Gly Trp Cys Lys Cys Tyr Ser Lys Met Glu Arg Gln Asp Ala 325 330 335 Ser Pro Leu Asn Asp Val Thr Glu Asp Glu Asn Glu Val Ser Asn Asp 340 345 350 lie Leu Arg Thr Val Ala Glu Glu Leu Ser Asp Val Ser Pro Arg Ala 355, 360 365 Cys Lys Ser Ala Ser Cys Asn Gln Ala Cys Arg Ala Phe Tyr Phe Lys 370 375 380 Gly Gly Trp Cys Arg Phe Gly Arg Cys Gln Cys Phe 385 390 395 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO : Bacillus thuringiensis (B) CEPA: AB88 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACION: 1..14 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia de aminoácidos terminal de la proteína conocida como la fracción de intercambio aniones 23 (más pe«queña) " (xi) DESCRIPCIÓN DÉ LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: Xaa Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO : Bacillus thuringiensis (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: Xaa Glu Tyr Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Bacillus thuringiensis (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Pro Thr Arg Ala Leu Pro 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 13 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD : 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO : Baciílus thuringiensis (B) CEPA: AB88 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : péptido (B) LOCALIZACION: 1..15 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia de aminoácidos terminal de VIP de 35 kDa activa contra Agrotis Ípsilon" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: Ala Leu Ser Glu Asn Thr Gly Lys Asp Gly Gly Tyr lie Val Pro 1 ' 5 10 15 (2 ) INFORMACIÓN " PARA LA SEQ ID NO : 14 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO : Bacillus thuringiensis (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: Met Asp Asn Asn Pro Asn lie Asn Glu 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACION: 1..9 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia N-terminal de del endotoxina de 80 kDa" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15 Met Asp Asn Asn Pro Asn lie Asn Glu 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido . (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Bacillus thuringiensis (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido (B) LOCALIZACION: 1..11 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia N-terminal a par de delta-endotoxína de 60 kDa" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: Met Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr lie 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 17 pares de bases (B) TÍPO: ácido nucleico (C) TÍPO DÉ CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "secuencia de cebador" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: CGATTAATGT TGGCCTC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: 'i (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DÉ MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "secuencia de cebador" (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18 CATTAGCATC TCCGGACACA G~ (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 2370 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN : /desc = "ADN sintético que codifica VIP3A ( ( iii) HIPOTÉTICO : NO (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 19 : ATGAACAAGA ACAACACCAA GCTGAGCACC CGCGCCCTGC CGAGCTTCAT CGACTACTTC AACGGCATCT ACGGCTTCGC CACCGGCATC AAGGACATCA TGAACATGAT CTTCAAGACC GACACCGGCG GCGACCTGAC CCTGGACGAG ATCCTGAAGA ACCAGCAGCT GCTGAACGAC ATCAGCGGCA AGCTGGACGG CGTGAACGGC AGCCTGAACG ACCTGATCGC CCAGGGCAAC CTGAACACCG AGCTGAGCAA GGAGATCCTT AAGATCGCCA ACGAGCAGAA CCAGGTGCTG AACGACGTGA ACAACAAGCT GGACGCCATC AACACCATGC TGCGCGTGTA CCTGCCGAAG ATCACCAGCA TGCTGAGCGA CGTGATGAAG CAGAACTACG CCCTGAGCCT GCAGATCGAG TACCTGAGCA AGCAGCTGCA GGAGATCAGC GACAAGCTGG ACATCATCAA CGTGAACGTC CTGATCAACA GCACCCTGAC CGAGATCACC CCGGCCTACC AGCGCATCAA GTACGTGAAC GAGAAGTTCG AAGAGCTGAC CTTCGCCACC GAGACCAGCA GCAAGGTGAA GAAGGACGGC AGCCCGGCCG ACATCCTGGA CGAGCTGACC GAGCTGACCG AGCTGGCGAA GAGCGTGACC AAGAACGACG TGGACGGCTT CGAGTTCTAC CTGAACACCT TCCACGACGT GATGGTGGGC AACAACCTGT TCGGCCGCAG CGCCCTGAAG ACCGCCAGCG AGCTGATCAC CAAGGAGAAC GTGAAGACCA GCGGCAGCGA GGTGGGCAAC GTGTACAACT TCCTGATCGT GCTGACCGCC CTGCAGGCCA AGGCCTTCCT GACCCTGACC CCCTGTCGCA AGCTGCTGGG CCTGGCCGAC ATCGACTACA CCAGCATCAT GAACGAGCAC TTGAACAAGG AGAAGGAGGA GTTCCGCGTG AACATCCTGC CGACCCTGAG CAACACCTTC AGCAACCCGA ACTACGCCAA GGTGAAGGGC 1 AGCGACGAGG ACGCCAAGAT GATCGTGGAG GCTAAGCCGG GCCACGCGTT GATCGGCTTC 1 GAGATCAGCA ACGACAGCAT CACCGTGCTG AAGGTGTACG AGGCCAAGCT GAAGCAGAAC 1 TACCAGGTGG ACAAGGACAG CTTGAGCGAG GTGATCTACG GCGACATGGA CAAGCTGCTG 1 TGTCCGGACC AGAGCGGGCA AATCTACTAC ACCAACAACA TCGTGTTCCC GAACGAGTAC 1 GTGATCACCA AGATCGACTT CACCAAGAAG ATGAAGACCC TGCGCTACGA GGTGACCGCC 1 AACTTCTACG ACAGCAGCAC CGGCGAGATC GACCTGAACA AGAAGAAGGT GGAGAGCAGC 1 GAGGCCGAGT ACCGCACCCT GAGCGCGAAC GACGACGGCG TCTACATGCC ACTGGGCGTG 1 ATCAGCGAGA CCTTCCTGAC CCCGATCAAC GGCTTTGGCC TGCAGGCCGA CGAGAACAGC 1 CGCCTGATCA CCCTGACCTG TAAGAGCTAC CTGCGCGAGC TGCTGCTAGC CACCGACCTG 1 AGCAACAAGG AGACCAAGCT GATCGTGCCA CCGAGCGGCT TCATCAGCAA CATCGTGGAG 1 AACGGCAGCA TCGAGGAGGA CAACCTGGAG CCGTGGAAGG CCAACAACAA GAACGCCTAC 1 GTGGACCACA CCGGCGGCGT GAACGGCACC AAGGCCCTGT ACGTGCACAA GGACGGCGGC 1 ATCAGCCAGT TCATCGGCGA CAAGCTGAAG CCGAAGACCG AGTACGTGAT CCAGTACACC 1 GTGAAGGGCA AGCCATCGAT TCACCTGAAG GACGAGAACA CCGGCTACAT CCACTACGAG 1 GACACCAACA ACAACCTGGA GGACTACCAG ACCATCAACA AGCGCTTCAC CACCGGCACC 1 GACCTGAAGG GCGTGTACCT GATCCTGAAG AGCCAGAACG GCGACGAGGC CTGGGGCGAC 1 AACTTCATCA TCCTGGAGAT CAGCCCGAGC GAGAAGCTGC TGAGCCCGGA GCTGATCAAC 2 ACCAACAACT GGACCAGCAC CGGCAGCACC AACATCAGCG GCAACACCCT GACCCTGTAC 2 CAGGGCGGCC GCGGCATCCT GAAGCAGAAC CTGCAGCTGG ACAGCTTCAG CACCTACCGC 2 GTGTACTTCA GCGTGAGCGG CGACGCCAAC GTGCGCATCC GCAACTCCCG CGAGGTGCTG 2 TTCAAGAAGA GGTACATGAG CGGCGCCAAG GACGTGAGCG AGATGTTCAC CACCAAGTTC 2 GAGAAGGACA ACTTCTACAT CGAGCTGAGC CAGGGCAACA ACCTGTACGG CGGCCCGATC 2 GTGCACTTCT ACGACGTGAG CATCAAGTAG 2 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2241 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético que codifica VIP3A( (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 20: ATGAACAAGA ACAACGCCAA GCTGAGCACC CGCGCCCTGC CGAGCTTCAT CGACTACTTC AACGGCATCT ACGGCTTCGC CACCGGCATC AAGGACATCA TGAACATGAT CTTCAAGACC GACACCGGCG GCGACCTGGC CCTGGACGAG ATCCTGGAGA ACCAGCAGCT GCTGAACGAC ATCAGCGGCA AGCTGGACGG CGTGAACGGC AGCCTGAACG ACCTGATCGC CCAGGGCAAC CTGAACACCG AGCTGÁGCAA GGAGATCCTT AAGATCGCCA ACGAGCAGAA CCAGGTGCTG AACGACGTGA ACAACAAGCT GGACGCCATC AACACCATGC TGCGCGTGTA CCTGCCGAAG # ATCACCAGCA TGCTGAGCGA CGTGATGAAG CAGAACTACG CCCTGAGCCT GCAGATCGAG TACCTGAGCA AGCAGCTGCA GGAGATCAGC GACAAGCTGG ACATCATCAA CGTGAACGTC CTGATCAACA GCACCCTGAC CGAGATCACC CCGGCCTACC AGCGCATCAA GTACGTGAAC GAGAAGTTCG AAGAGCTGAC CTTCGCCACC GAGACCAGCA GCAAGGTGAA GAAGGACGGC AGCCCGGCCG ACATCCGGGA CGAGCTGAGC GAGCTGACCG AGCTGGCGAA GAGCGTGACC CAGAACGACG TGGÁCGGCTT CGAGTTCTAC CTGAACACCT TCCACGACGT GATGGTGGGC AACAACCTGT TCGGCCGCAG CGCCCTGAAG ACCGCCAGCG AGCTGATCAC CAAGGAGAAC GTGAAGACCA GCGGCAGCGA GGTGGGCAAC GTGTACAACT TCCTGATCGT GCTGACCGCC CTGCAGGCCC AGGCCTTCCT GACCCTGACC CCCTGTCGCA AGCTGCTGGG CCTGGCCGAC ATCGACTACA CCAGCATCAT GAACGAGCAC TTGAACAAGG AGAAGGAGGA GTTCCGCGTG AACATCCTGC CGACCCTGAG CAACACCTTC AGCAACCCGA ACTACGCCAA GGTGAAGGGC 1 AGCGACGAGG ACGCCAAGAT GATCGTGGAG GCTAAGCCGG GCCACGCGTT GATCGGCTTC 1 * GAGATCAGCA ACGACAGCAT CACCGTGCTG AAGGTGTACG AGGCCAAGCT GAAGCAGAAC 1 TACCAGGTGG ACAAGGACAG CTTGAGCGAG GTGATCTACG GCGACATGGA CAAGCTGCTG 1 TGTCCGGACC AGAGCGGGCA AATCTACTAC ACCAACAACA TCGTGTTCCC GAACGAGTAC 1 GTGATCACCA AGATCGACTT CACCAAGAAG ATGAAGACCC TGCGCTACGA GGTGACCGCC 1 AACTTCTACG ACAGCAGCAC CGGCGAGATC GACCTGAACA AGAAGAAGGT GGAGAGCAGC 1 GAGGCCGAGT ACCGCACCCT GAGCGCGAAC GACGACGGCG TCTACATGCC ACTGGGCGTG 1 ATCAGCGAGA CCTTCCTGAC CCCGATCAAC GGCTTTGGCC TGCAGGCCGA CGAGAACAGC 1 CGCCTGATCA CCCTGACCTG TAAGAGCTAC CTGCGCGAGC TGCTGCTAGC CACCGACCTG 1 AGCAACAAGG AGACCAAGCT GATCGTGCCA CCGAGCGGCT TCATCAGCAA CATCGTGGAG 1 AACGGCAGCA TCGAGGAGGA CÁACCTGGAG CCGTGGAAGG CCAACAACAA GAACGCCTAC 1 GTGGACCACA CCGGCGGCGT GAACGGCACC AAGGCCCTGT ACGTGCACAA GGACGGCGGC 1 ATCAGCCAGT TCATCGGCGA CAAGCTGAAG CCGAAGACCG AGTACGTGAT CCAGTACACC 1 GTGAAGGGCA AGCCATCGAT TCACCTGAAG GACGAGAACA CCGGCTACAT CCACTACGAG 1 GACACCAACA ACAACCTGGA GGACTACCAG ACCATCAACA AGCGCTTCAC CACCGGCACC 1 GACCTGAAGG GCGTGTACCT GATCCTGAAG AGCCAGAACG GCGACGAGGC CTGGGGCGAC 1 AACTTCATCA TCCTGGAGAT CAGCCCGAGC GAGAAGCTGC TGAGCCCGGA GCTGATCAAC 2 ACCAACAACT GGACCAGCAC CGGCAGCACC AACATCAGCG GCAACACCCT GACCCTGTAC 2 CAGGGCGGCC GCGGCATCCT GAAGCAGAAC CTGCAGCTGG ACAGCTTCAG CACCTACCGC 2 GTGTACTTCA GCGTGAGCGG CGACGCCAAC GTGCGCATCC GCAACTCCCG CGAGGTGCTG 2 TTCGAGAAGA AGGACAAGTA G 2

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una proteína de la clase VIP3 que es VIP3A(a), y homólogos a la misma. .
2. Una proteína en donde la secuencia de aminoácidos comprende un dominio tóxico de una proteína de la clase VIP3.
3. La proteína de la reivindicación 2 , en donde el dominio tóxico es el dominio tóxico de una proteína VIP3A(a) .
4. Una planta transgénica que comprende una secuencia de ADN que codifica par'a una proteína de la clase VIP3.
5. La planta transgénica de la reivindicación 4, en donde la secuencia de ADN codifica para una proteína VIP3A(a) .
6. La planta transgénica de la reivindicación 5, en donde la secuencia de ADN codifica para una proteína VIP3A(c) .
7. La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde esta planta se selecciona a partir del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, girasol, jitomate, cultivos de col, algodón, arroz, frijol de soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza de semilla de aceite.
8. La planta transgénica de la reivindicación 7, en donde esta planta es una planta de maíz.
9. La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, la cual comprende además una segunda secuencia de ADN que codifica para una segunda proteína insecticida.
10. La planta transgénica de la reivindicación 9, en donde la segunda secuencia de ADN codifica para una d-endotoxina, otra proteína de la clase VIP3, una proteína de la clase VIP1, o una proteína de la clase VIP2.
11. La planta transgénica de la reivindicación 10, en donde la segunda secuencia de ADN es una d-endotoxina.
12. Un microorganismo que comprende una secuencia de ADN heteróloga, en donde la secuencia de ADN codifica una proteína VIP3A(a) .
13. El microorganismo de la reivindicación 12, en donde la secuencia de ADN codifica para una proteína VIP3A(c) .
14. El microorganismo de las reivindicaciones 12 ó 13 , en donde dicho microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en bacterias, baculovirus, algas, y hongos.
15. El microorganismo de la reivindicación 14, en donde dicho microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter, y Rhizobium.
16- El microorganismo de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, el cual comprende además una segunda secuencia de ADN que codifica para una segunda proteína insecticida.
17. El microorganismo de la reivindicación 16, en donde la segunda secuencia de ADN codifica para una d-endotoxina, -otra proteína de la clase VIP3, una proteína de la clase VIP1, o una proteína de la clase VIP2.
18. El microorganismo de la reivindicación 17, en donde la segunda secuencia de ADN es una d-endotoxina.
19. Una composición entomocida que comprende microorganismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18.
20. Un método para controlar insectos mediante el contacto de los insectos con una cantidad insecticida de un ligando químico para un receptor de la clase de proteínas VIP3, o un anticuerpo para un receptor de la clase de proteínas VIP3.
21. El método de la reivindicación 20, en donde los insectos se ponen en contacto con una planta transgénica que comprende una secuencia de ADN que expresa una proteína de la clase VIP3, de preferencia una proteína VIP3A(c) .
22. El método de la reivindicación 20, en donde los insectos se ponen en contacto con una composición entomocida que comprende un microorganismo que además comprende una secuencia de ADN heteróloga capaz de expresar una proteína de la clase VIP3, de preferencia una proteína VIP3A(c) .
23. Una secuencia de ADN recombinante que codifica para una proteína VIP3A(c) y sus homólogos.
24. La secuencia de ADN recombinante de la reivindica-ción 23, en donde la secuencia de ADN es una secuencia sintética que se ha diseñado para su expresión óptima en una planta.
25. La secuencia de ADN recombinante de la reivindicación 24, en donde la planta es una planta de maíz.
26. Un cásete de expresión que comprende un promotor heterólogo operativamente enlazado con una secuencia de ADN que codifica uña proteína VIP3A(c) .
27. El cásete de expresión de la reivindicación 26, en donde este promotor funciona en plantas, y se selecciona a partir del grupo que consiste en promotores inducibles, constitutivos, preferidos por el tejido, y específicos del tejido.
28. El cásete de expresión de la reivindicación 27, en donde el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste en los promotores de uhiquitina, carboxilasa PEP, LPT, y MTL.
29. Un receptor para una proteína de la clase VIP3.
30. Una secuencia de ADN que codifica para un receptor de la clase VIP3.
31. El receptor de la reivindicación 29, el cual comprende un dominio de muerte y un motivo EGF repetido.
32. El receptor de la reivindicación 31, que tiene la secuencia estipulada en la SEQ ID NO: 9.
33. La secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 30, como se estipula en la SEQ ID NO: 8.
34. Anticuerpos para un receptor de la clase de proteínas VIP3.
35. Un método para identificar y aislar homólogos de un receptor para una proteína de la clase VIP3, o de una secuencia de ADN que codifica para un receptor para una proteína de la clase VIP3, el cual comprende obtener: (a) una secuencia de ADN que codifique para un receptor para una proteína de la clase VIP3, hibridar esta secuencia de ADN con el ADN obtenido de un organismo de prueba, detectar la hibridación para el ADN de dicho organismo, y aislar este homólogo a partir de este organismo; (b) una muestra de ADN a partir de un organismo, utilizando cebadores para una secuencia de ADN que codifique para un receptor para una proteína de la clase VIP3, obteniendo un producto de reacción, luego se aisla una secuencia de ADN que codifique para un receptor para una proteína de la clase VIP3 a partir de este organismo. (c) una muestra de proteína a partir de un organismo de prueba, obtener un anticuerpo para un receptor para una proteína de la clase VIP3, hacer reaccionar este anticuerpo con la muestra de proteína, y detectar y aislar homólogos mediante la detección de la presencia de una reacción inmunológica.
36. Un método para identificar un compuesto como un ligando químico de receptor de VIP3 que tiene actividad plaguicida, el cual comprende exponer al receptor de VIP3 a un compuesto de prueba, y ensayar la interacción entre el receptor y el compuesto de prueba.
37. El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el receptor de VIP3 se expresa celularmente, y la interacción ensayada es la muerte celular programada.
38. El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde la interacción ensayada es el enlace específico entre el receptor V?P3 y el compuesto de prueba.