KR20010099680A - 살충성 단백질 - Google Patents

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마크 크누쓰
마이클알. 폴라드
가이에이. 카디노
조지이. 슈왑
트레이시엘리스 마이클스
스테이시 핀스태드리
파울라 다이엘
조안나 도질로
리사 스탬프
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칼튼 제이. 에이블
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Abstract

본 발명은 새로운 클래스의 살충성 단백질 및 이러한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에 있어서, 이러한 살충성 단백질은 약 40-50kDa 및 약 10-15kDa의 분자량을 갖는다.

Description

살충성 단백질{Pesticidal proteins}
초시류(Coleopterans)는 해마다 농작물에 상당한 손실을 입히는 중요한 농경 해충 무리이다. 초시류 해충의 예에는 옥수수 뿌리벌레(corn rootworm))와 자주개자리 바구미(alfalfa weevil)가 포함된다.
자주개자리 바구미하이페라 포스티카(Hypera postica), 및 그와 밀접하게 연관된 이집트 자주개자리 바구미하이페라 브룬나이펜니스(Hypera brunneipennis)는 미국에서 서식하는 가장 중요한 자주개자리 해충으로, 1984년에는 2백 9십만 에이커가 피해를 입었다. 연간 총 2천만 달러가 이들 해충을 구제하는데 사용된다. 이집트 자주개자리 바구미는 미국 남서부에서 우세한 종으로, 무더운 여름철 동안에는 하면(夏眠)에 들어간다. 모든 다른 측면에 있어서, 이는 미국의 나머지 지역에 걸쳐 창궐하는 자주개자리 바구미에 있어서도 동일하다.
유충 단계는 바구미의 일생 주기에 있어서 가장 위험하다. 유충은 자주개자리 식물의 생장점을 섭취함으로써, 잎의 뼈대만 남기고, 식물의 발육을 저해하며, 궁극적으로는 수확율의 감소를 초래한다. 심각한 만연은 전체 건초 더미를 망칠 수도 있다. 성충 또한 잎을 섭취하지만, 덜 심각한 손실을 입힌다.
미국 옥수수밭의 약 천만 에이커가 해마다 다양한 종의 옥수수 뿌리벌레(corn rootworm)에 의해 피해를 입는다. 이러한 옥수수 뿌리벌레 종에는 노던 옥수수 뿌리벌레디아브로티카 바베리(Diabrotica barberi), 서던 옥수수 뿌리벌레디.운데심펑크타타 하워디(D. undecimpunctata howardi), 및 웨스턴 옥수수 뿌리벌레디.버지페라 버지페라(D. vergifera vergifera)가 포함된다. 토양에서 서식하는 이들 디아브로티카 종의 유충은 옥수수 나무의 뿌리를 섭취함으로써 뿌리를 점령한다. 점령은 결국 옥수수 수확율을 감소시키고, 종종 식물의 사멸을 초래한다. 성충은 옥수수 수염을 섭취함으로써 수분(受粉)을 감소시키고, 따라서 옥수수 수확율에 손실을 입힌다. 또한,디아브로티카종의 성충 및 유충은 상업적으로 재배되는 것 뿐만 아니라 가정에서 재배하는 호리병박 작물(오이, 메론, 호박 등), 많은 채소, 및 들농사 작물에 피해를 입힌다.
옥수수 뿌리벌레의 구제는 윤작, 및 부정근의 생장을 촉진하기 위한 고농도질소의 적용과 같은 경작 방법에 의해 부분적으로 해결되어 왔다. 그러나, 원하는 수준의 구제를 보장하기 위해서는 주로 화학적인 살충제에 의존한다. 살충제는 토양에 결합하거나 또는 침투된다. 몇몇 화학적 살충제의 사용과 결부된 문제점은 환경 오염, 및 처리된 곤충 집단에서의 내성의 발현이다.
토양 미생물바실러스 슈린지엔시스(Bacillus thuringiensis, "B.t.")는 부포자 단백질 봉입체(parasporal protein inclusions)에 의해 특징지어지는 그람-양성의 포자-형성 세균으로, 상기 단백질 봉입체는 뚜렷한 형태를 갖춘 결정체로서 현미경으로 관찰 가능하다. 특정B.t. 균주는 특정 종류의 해충에 독성을 나타내는 단백질을 생산한다. 특정B.t. 독소 유전자가 분리 및 서열분석되었으며, 재조합 DNA에 기초한B.t. 산물이 생산되어 사용을 승인받았다. 또한, 유전공학 기술을 사용하여 이러한B.t. 내독소를 농경 환경에 전달하기 위한 새로운 접근방법들이 개발 중에 있으며, 이러한 방법에는 곤충에 대하여 내성을 가지도록 내독소 유전자로 유전적으로 조작된 식물을 사용하는 방법, 및 안정화된 완전한 미생물 세포를B.t. 내독소 전달체로서 사용하는 방법 등이 포함된다(Gaertner, F.H., L. Kim [1988] TIBTECH 6:S4-S7). 따라서, 분리된B.t. 내독소 유전자는 상업적으로 가치있어 지고 있다.
B.t. 살충제의 상업적 사용은 원래 협소한 범위의 인시류(lepidopteran, 모충(毛蟲, caterpillar)) 해충에 제한되어 있었다.비.슈린지엔시스의 아종쿠르스타키(kurstaki)의 포자 및 결정체 제조물(preparations)은 상업적인 인시류 해충용 살충제로서 수년간 사용되어 왔다. 예를 들면,비.슈린지엔시스변이주쿠르스타키HD-1은, 다수의 인시류 곤충에 독성을 나타내는 결정성 δ-내독소를 생산한다.
그러나 최근에, 연구자들은 훨씬 더 넓은 범위의 해충에 대하여 특이성을 지닌B.t. 살충제를 발견하여 왔다. 예를 들면, 다른B.t. 종, 즉이스라엘렌시스(israelenis) 및테네브리오니스(tenebrionis)(a.k.a.B.t.M-7, a.k.a.B.t. san diego)는 각각 쌍시류와 초시류 목의 곤충을 구제하는데 상업적으로 사용되어 왔다(Gaertner, F.H. [1989] "Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-living Microorganisms," inControlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, ed., Taylor and Francis, New York and London, 1990, pp. 245-255). 또한, Couch, T.L. (1980) "Mosquito Pathogenecity ofBacillus thuringiensisvar. israelensis,"Developments in Industrial Microbiology22:61-76; Beegle, C.C. (1978) "Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems,"Developments in Industrial Microbiology20:97-104를 참조하라. Krieg, A., A.M. Huger, G.A. Langenbruch, W. Schnetter (1983)Z. ang. Ent.96:500-508는바실러스 슈린지엔시스변이주테네브리오니스를 개시하고 있는데, 이것은 초시류 목의 두 가지 딱정벌레에 대하여 활성을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다. 이들 두 가지 딱정벌레는 콜로라도 감자 딱정벌레(Colorado potato beetle)렙티노타르사 디셈라인아타(Leptinotarsa decemlineata) 및아젤라스티카 알니(Agelastica alni)이다.
최근, 새로운B.t. 아종이 동정되었으며, 활성 δ-내독소 단백질의 유전자가 분리되었다(Hofte, H., H.R. Whiteley [1989]Microbiological Reviews52(2):242-255). Hofte 및 Whiteley는B.t. 결정성 단백질 유전자를 네개의 주요 클래스로분류하였다. 상기 클래스는 CryI(인시류-특이적), CryII(인시류- 및 쌍시류-특이적), CryIII(초시류-특이적), 및 CryIV(쌍시류-특이적)이다. 다른 해충들에 대하여 특이적으로 독성을 나타내는 균주의 발견이 보고되어 왔다(Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992]Bio/Technology10:271-275).
Hofte 및 Whiteley가 1989년에 발표한 결정성 단백질의 명명법 및 분류법은 유추된(deduced) 아미노산 서열 및 그 독소의 숙주 범위에 근거한 것이다. 이러한 체계는 다섯개의 주요 클래스로 나뉘어지는 14가지 상이한 유형의 독소 유전자를 포괄하도록 되어 있다. 보다 많은 독소 유전자가 발견됨에 따라, 유사한 서열의 유전자들이 확연히 다른 살충 특이성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌기 때문에, 그러한 체계는 쓸모가 없어지게 되었다. 오로지 아미노산 상동성에만 근거를 둔 수정된 명명법이 제안되었다(Crickmoreet al. [1996] Society for InvertebratePathology, 29th Annual Meeting, 3rd International Colloquium onBacillus thuringiensis, University of Cordoba, Cordoba, Spain, September 1-6, abstract). 연상기호 "cry"는 별개의 클래스로 남아 있는 cytA 및 cytB를 제외한 모든 독소 유전자들에 적용된다. 1순위의 아라비아 숫자는 로마자로 바뀌었고, 4순위의 삽입구는 삭제되었다. 현재의 경계는 약 95%(4순위), 75%(2순위), 및 48%(1순위)의 서열 상동성을 나타낸다. 다수가 재분류되었을 지라도, 표시된 예외가 있긴 하나 원래의 이름 중 다수가 그대로 남아있다. 또한, N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean (1998), "Revisions of the Nomenclature for theBacillus thuringiensisPesticidal Crystal proteins,"Microbiology and Molecular Biology RiviewsVol. 62:807-813; 및 Crickmore, Zeigler, Feitelson, Schnepf, Van Rie, Lereclus, Baum, and Dean, "Bacillus thuringiensistoxin nomenclature" (1990) http://www.biols.susx.ac.UK/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html을 참조하라. 그러한 체계는 무료로 입수가능한 소프트웨어 응용프로그램 CLUSTAL W 및 PHYLIP를 를 사용한다. PHYLIP 패키지 내의 NEIGHBOR 응용프로그램은 산술 평균(UPGMA) 알고리즘을 사용한다.
에세리히아 콜라이(Escherichia coli) 내에서의B.t. 결정성 단백질 유전자의 클로닝 및 발현은 간행물에 개제되어 왔다(Schnepf, H.E., H.R. Whiteley [1981]Proc. Natl. Acad. Sci. USA78:2893-2897). 미국특허 제 4,448,885호 및 미국특허 제 4,467,036호는이.콜라이내에서의B.t. 결정성 단백질의 발현을 개시하고 있다.
미국특허 제 4,797,276호 및 제 4,853,331호는 다양한 환경에서 초시류 해충을 구제하는데 사용될 수 있는비.슈린지엔시스균주테네브리오니스(a.k.a. M-7, a.k.a.B.t.San diego)를 개시하고 있다. 미국특허 제 4,918,066호는 쌍시류에 대하여 활성을 갖는B.t. 독소를 개시하고 있다. 미국특허 제 4,849,217호는 자주개나무 바구미에 대하여 활성을 갖는B.t. 분리주를 개시하고 있다. 미국특허 제 5,208,077호는 초시류에 대하여 활성을 갖는바실러스 슈린지엔시스분리주를 개시하고 있다. 미국특허 제 5,632,987호는 옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성을 갖는, PS80JJ1 유래의 130kDa 독소를 개지하고 있다. 본원과 연관된 국제공개 제94/40162호는 옥수수 뿌리벌레에 대하여 독성을 나타내는 새로운 클래스의 단백질을 개시하고 있다. 미국특허 제 5,151,363호 및 미국특허 제 4,948,734호는 선충(nematodes)에 대하여 활성을 갖는B.t. 분리주를 개시하고 있다.
미국특허 제 6,083,499호 및 국제공개 제 97/40162호는 "이원성 독소(binary toxins)"를 개시하고 있다. 본 발명은바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus)에 의해 생산되는 모기살충성 독소와는 구별된다. 유럽특허 제 454 485 호; Davidsonet al. (1990), "Interaction of theBacillus sphaericusmosquito larvicidal proteins,"Can. J. Microbiol. 36(12)870-8; Baumannet al. (1988), "Sequence analysis of the mosquitocidal toxin genes encoding 51.4- and 41.9-kilodalton proteins fromBacillus sphaericus2362 and 2297,"J. Bacteriol. 170:2045-2050; Oeiet al., (1992), "Binding of purifiedBacillus sphaericusbinary toxin and its deletion derivatives toCulex quinquefaciatusgut: elucidation of functional binding domains,"Journal of General Microbiology138(7):1515-26을 참조하라.
[발명의 간단한 요약]
본 발명은 비포유동물 해충을 구제하기 위한 신규의 물질 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 초시류 해충을 구제하기 위한 물질 및 방법을 제공한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 물질 및 방법은 옥수수 뿌리벌레-가장 바람직하게는 웨스턴 옥수수 뿌리벌레(western corn rootworm)를 구제하는데 사용된다. 인시류 해충(유럽 옥수수 나무좀(European corn borer) 및헬리코베르파 지아(Helicoverpa zea)를 포함하는) 또한 본 발명의 살충성 단백질에 의해 구제될 수 있다.
본 발명은 유리하게 폴리뉴클레오티드 및 그 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 살충성 단백질을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 40-50kDa 단백질 및 10-15kDa 단백질이 함께 사용되는데, 이들 단백질은 연합하여 살충성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 두 클래스의 단백질은 "이원성 독소(binary toxins)"라 일컬을 수 있다. 본원에서 사용될 때, "독소(toxin)" 또는 "살충성 단백질(pesticidal protein)"은 이들 단백질 중 어느 한 클래스를 포함한다. 40-50kDa 단백질과 10-15kDa 단백질을 함께 사용하는 하는 것이 바람직하나, 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열들 중 한 클래스는 약 40-50kDa의 전장(full-length) 분자량을 갖는 단백질들을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 이들 단백질은 약 43-47kDa의 분자량을 가지고 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 두번째 클래스는 약 10-15kDa의 살충성 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 이들 단백질은 약 13-14kDa의 분자량을 가지고 있다. 각 유형의 독소/유전자는 본 발명의 한 측면임이 명백하여야 한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 40-50kDa 단백질은 10-15kDa 단백질과 조합하여 사용된다. 따라서, 본 발명의 단백질은 다른 단백질 독소의 활성을 증대 및/또는 촉진시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 40-50kDa 또는 10-15kDa 독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (바람직하게는 조합하여 사용될 때) 살충 활성을 보유한 전장 독소의 일부 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 두 가지 유형의 독소 양자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 융합 단백질(함께 융합된 40-50kDa 단백질 및 10-15kDa 단백질)의 신규한 예 및 그들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 본원에 개시된다.
몇몇 실시양태에 있어서, 본 발명에 따라 유용한B.t. 독소는 본원에 개시된 신규의B.t. 분리주로부터 얻을 수 있는 독소를 포함한다. 예를 들면 40-50kDa 및 10-15kDa 독소가 함께 사용될 때, 한 유형의 독소는 한 분리주로부터 얻을 수 있고, 나머지 다른 한 유형의 독소는 다른 분리주로부터 얻을 수 있음이 명백하여야 한다.
본 발명은 또한 특별히 예시된B.t. 분리주 및 독소와 실질적으로 동일한 초시류-활성을 가지고 있는, 예시된B.t. 분리주 및 독소의 변종(variants)의 사용을 포함한다. 그러한 변종 분리주는, 예를 들면, 돌연변이주(mutants)를 포함한다. 돌연변이주를 만들기 위한 과정은 미생물학 분야에 공지되어 있다. 자외선, 및 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine)과 같은 화학적 돌연변이유발물질이 이러한 목적으로 활발히 사용된다.
바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드를 적어도 하나 보유하고 있는 식물 및 식물 세포에 관계된다. 바람직하게, 그러한 형질전환(transgenic) 식물 세포는 타겟 해충에 의해 섭취되는 조직 내에서 살충성 독소를 발현한다.
이와 달리, 본 발명의B.t. 분리주, 또는 본원에 기술된 독소를 발현하는 재조합 미생물이 해충 구제에 사용될 수도 있다. 이러한 측면에서, 본 발명은 실질적으로 완전한B.t. 세포, 및/또는 발현된 본 발명의 독소를 함유한 재조합 세포의 처리를 포함하는데, 그러한 처리는 실질적으로 완전한 세포가 타겟 해충의 서식처에 적용될 때 살충 활성을 지속시키기 위한 것이다. 처리된 세포는 살충성 독소를 위한 보호 코팅으로 작용한다.
본 발명의 독소는 타겟 해충에 의해 소화될 때 그 해충의 중장(中腸) 세포에 영향을 미치는 경구 마취제이다. 따라서, 예를 들면 독소를 발현하는 재조합 숙주 세포를 섭취함으로써, 타겟 해충은 그 해충에 독성을 나타내는 본 발명의 단백질과 접촉하게 된다. 이는 타겟 해충의 구제를 초래한다.
본원은 1999년 8월 20일자로 출원된 미국특허출원 제 09/378,088호의 일부계속출원이다.
본 발명은 비포유동물 해충을 구제하기 위한 신규의 물질 및 방법에 관한 것이다.
도 1은 세 가지 예시적인 43-47kDa 살충성 독소 및 이들 살충성 독소의 공통서열(consensus sequence)을 도시한 것이다.
도 2는 PS80JJ1의 14kDa 및 45kDa 서열(서열 31 및 서열 10) 간의 관계를 도시한 것이다.
도 3은 실시예 23의 혼합 시험(mixing study)으로부터 얻은 LC50값을 비교 도시한 것이다.
도 4는 51kDa 및 42kDa바실러스 스파에리쿠스독소와 유전자 및 45kDa 149B1 독소와 유전자의 단백질 정렬(alignment)을 도시한 것이다.
도 5는 51kDa 및 42kDa바실러스 스파에리쿠스독소와 유전자 및 45kDa 149B1 독소와 유전자의 뉴클레오티드 서열 정렬(alignment)을 도시한 것이다.
[서열의 간단한 설명]
서열 1은 80JJ1의 약 45kDa 독소의 5-아미노산 N-말단 서열이다.
서열 2는 80JJ1의 약 45kDa 독소의 25-아미노산 N-말단 서열이다.
서열 3은 80JJ1의 약 14kDa 독소의 24-아미노산 N-말단 서열이다.
서열 4는 149B1 유래의 약 47kDa 독소의 N-말단 서열이다.
서열 5는 PS149B1 유래의 정제된 약 14kDa 단백질의 50-아미노산 N-말단 아미노산 서열이다.
서열 6은 167H2 유래의 약 47kDa 독소의 N-말단 서열이다.
서열 7은 PS167H2 유래의 정제된 약 14kDa 단백질의 25-아미노산 N-말단 서열이다.
서열 8은 본 발명에 따라 사용된, PS80JJ1 44.3kDa 독소를 코딩하는 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브 및 PS149B1과 PS167H2에 대한 정방향 프라이머이다.
서열 9는 본 발명에 따라 사용된 PS149B1 및 PS167H2에 대한 역방향 프라이머이다.
서열 10은 약 45kDa PS80JJ1 독소를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 11은 약 45kDa PS80JJ1 독소의 아미노산 서열이다.
서열 12는 약 44kDa PS149B1 독소를 코딩하는 유전자의 일부 뉴클레오티드 서열이다.
서열 13은 약 44kDa PS149B1 독소의 일부 아미노산 서열이다.
서열 14는 약 44kDa PS167H2 독소를 코딩하는 유전자의 일부 뉴클레오티드 서열이다.
서열 15는 약 44kDa PS167H2 독소의 일부 아미노산 서열이다.
서열 16은 본 발명에 따른 프라이머 고안에 사용된 펩티드 서열이다.
서열 17은 본 발명에 따른 프라이머 고안에 사용된 펩티드 서열이다.
서열 18은 본 발명에 따른 프라이머 고안에 사용된 펩티드 서열이다.
서열 19는 본 발명에 따른 프라이머 고안에 사용된 펩티드 서열이다.
서열 20은 서열 16의 펩티드에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 21은 서열 17의 펩티드에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 22는 서열 18의 펩티드에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 23은 서열 19의 펩티드에 상응하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 24는 서열 22의 역방향 상보체(complement)에 근거한 역방향 프라이머이다.
서열 25는 서열 23의 역방향 상보체(complement)에 근거한 역방향 프라이머이다.
서열 26은 PS80JJ1 44.3kDa 독소에 근거한 정방향 프라이머이다.
서열 27은 PS80JJ1 44.3kDa 독소에 근거한 역방향 프라이머이다.
서열 28은 본 발명에 따른 새로운 클래스의 독소를 나타내는 일반적인 서열이다.
서열 29는 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
서열 30은 14kDa 및 45kDa PS80JJ1 독소의 전사해독프레임(open reading frame) 및 측접한(flanking) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 유전자좌(遺傳子座, genetic locus)의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 31은 PS80JJ1 14kDa 독소의 전사해독프레임의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 32는 PS80JJ1 14kDa 독소의 유추된 아미노산 서열이다.
서열 33은 본 발명에 따라 사용된 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머이다.
서열 34는 14kDa 및 44kDa PS167H2 독소의 전사해독프레임 및 측접한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 유전자좌의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 35는 약 14kDa PS167H2 독소를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 36은 약 14kDa PS167H2 독소의 아미노산 서열이다.
서열 37은 약 44kDa PS167H2 독소를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 38은 약 44kDa PS167H2 독소의 아미노산 서열이다.
서열 39는 14kDa 및 44kDa PS149B1 독소의 전사해독프레임 및 측접한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 유전자좌의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 40은 약 14kDa PS149B1 독소를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 41은 약 14kDa PS149B1 독소의 아미노산 서열이다.
서열 42는 약 44kDa PS149B1 독소를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 43은 약 44kDa PS149B1 독소의 아미노산 서열이다.
서열 44는 80JJ1의 약 14kDa 독소를 코딩하는 옥수수용으로 최적화된 (maize-optimized) 유전자 서열이다.
서열 45는 80JJ1의 약 44kDa 독소를 코딩하는 옥수수용으로 최적화된(maize-optimized) 유전자 서열이다.
서열 46은 하기 실시예 15에 사용된 역방향 프라이머의 DNA 서열이다.
서열 47은 정방향 프라이머의 DNA 서열이다(참조: 실시예 16).
서열 48은 역방향 프라이머의 DNA 서열이다(참조: 실시예 16).
서열 49는 정방향 프라이머의 DNA 서열이다(참조: 실시예 16).
서열 50은 역방향 프라이머의 DNA 서열이다(참조: 실시예 16).
서열 51은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS131W2 유래의 DNA 서열이다.
서열 52는 PS131W2의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 53은 PS131W2의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 54는 PS131W2의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 55는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS158T3 유래의 DNA 서열이다.
서열 56은 PS158T3의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 57은 PS158T3의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 58은 PS158T3의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 59는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS158X10 유래의 DNA 서열이다.
서열 60은 PS158X10의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 61은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS185FF 유래의 DNA 서열이다.
서열 62는 PS185FF의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 63은 PS185FF의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 64는 PS185FF의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 65는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS185GG 유래의 DNA 서열이다.
서열 66은 PS185GG의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 67은 PS185GG의 44kDa 단백질에 대한 DNA 서열이다.
서열 68은 PS185GG의 44kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 69는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS185L12 유래의 DNA 서열이다.
서열 70은 PS185L12의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 71은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS185W3 유래의 DNA 서열이다.
서열 72는 PS185W3의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 73은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS186FF 유래의 DNA 서열이다.
서열 74는 PS186FF의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 75는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS187F3 유래의 DNA 서열이다.
서열 76은 PS187F3의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 77은 PS187F3의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 78은 PS187F3의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 79는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS187G1 유래의 DNA 서열이다.
서열 80은 PS187G1의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 81은 PS187G1의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 82는 PS187G1의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 83은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS187L14 유래의 DNA 서열이다.
서열 84는 PS187L14의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 85는 PS187L14의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 86은 PS187L14의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 87은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS187Y2 유래의 DNA 서열이다.
서열 88은 PS187Y2의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 89는 PS187Y2의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 90은 PS187Y2의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 91은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS201G 유래의 DNA 서열이다.
서열 92는 PS201G의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 93은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS201HH 유래의 DNA 서열이다.
서열 94는 PS201HH의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 95는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS201L3 유래의 DNA 서열이다.
서열 96은 PS201L3의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 97은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS204C3 유래의 DNA 서열이다.
서열 98은 PS204C3의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 99는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS204G4 유래의 DNA 서열이다.
서열 100은 PS204G4의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 101은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS204I11 유래의 DNA 서열이다.
서열 102는 PS204I11의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 103은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS204J7 유래의 DNA 서열이다.
서열 104는 PS204J7의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 105는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS236B6 유래의 DNA 서열이다.
서열 106은 PS236B6의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 107은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS242K10 유래의 DNA 서열이다.
서열 108은 PS242K10의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 109는 PS242K10의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 110은 PS242K10의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 111은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS246P42 유래의 DNA 서열이다.
서열 112는 PS246P42의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 113은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS69Q 유래의 DNA 서열이다.
서열 114는 PS69Q의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 115는 PS69Q의 44kDa 단백질에 대한 DNA 서열이다.
서열 116은 PS69Q의 44kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 117은 14kDa 단백질을 코딩하는 KB54 유래의 DNA 서열이다.
서열 118은 KB54의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 119는 14kDa 단백질을 코딩하는 KR1209 유래의 DNA 서열이다.
서열 120은 KR1209의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 121은 14kDa 단백질을 코딩하는 KR1369 유래의 DNA 서열이다.
서열 122는 KR1369의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 123은 14kDa 단백질을 코딩하는 KR589 유래의 DNA 서열이다.
서열 124는 KR589의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 125는 KR589의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 126은 KR589의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 127은지아 메이스(Zea mays)에서의 발현을 위하여 최적화된 '149B1-15-PO'라 명명된 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 이 유전자는 국제공개 제 97/40162호에 개시된 PS149B1으로부터 수득가능한 약 15kDa 독소를 코딩한다.
서열 128은지아 메이스(Zea mays)에서의 발현을 위하여 최적화된 '149B1-45-PO'라 명명된 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 이 유전자는 국제공개 제 97/40162호에 개시된 PS149B1으로부터 수득가능한 약 45kDa 독소를 코딩한다.
서열 129는 옥수수에서의 발현을 위하여 최적화된 '80JJ1-15-PO7'이라 명명된 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 이 유전자는 약 15kDa 독소를 코딩하는 대체 유전자(alternative gene)이다.
서열 130은 '80JJ1-15-PO7'이라 명명된 유전자에 의해 코딩되는 독소의 아미노산 서열이다.
서열 131은 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머(15kfor1)이다(참조: 실시예 20).
서열 132는 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머(45krev6)이다(참조: 실시예 20).
서열 133은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS201L3 유래의 DNA 서열이다.
서열 134는 PS201L3의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 135는 PS201L3의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 136은 PS201L3의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 137은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS187G1 유래의 DNA 서열이다.
서열 138은 PS187G1의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 139는 44kDa 단백질을 코딩하는 PS187G1 유래의 DNA 서열이다.
서열 140은 PS187G1의 44kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 141은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS201HH2 유래의 DNA 서열이다.
서열 142는 PS201HH2의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 143은 PS201HH2의 44kDa 단백질에 대한 일부 DNA 서열이다.
서열 144는 PS201HH2의 44kDa 단백질의 일부 아미노산 서열이다.
서열 145는 14kDa 단백질을 코딩하는 KR1369 유래의 DNA 서열이다.
서열 146은 KR1369의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 147은 44kDa 단백질을 코딩하는 KR1369 유래의 DNA 서열이다.
서열 148은 KR1369의 44kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 149는 14kDa 단백질을 코딩하는 PS137A 유래의 DNA 서열이다.
서열 150은 PS137A의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 151은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS201V2 유래의 DNA 서열이다.
서열 152는 PS201V2의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 153은 14kDa 단백질을 코딩하는 PS207C3 유래의 DNA 서열이다.
서열 154는 PS207C3의 14kDa 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 155는 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머(F1new)이다(참조: 실시예 22).
서열 156은 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머(R1new)이다(참조: 실시예 22).
서열 157은 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머(F2new)이다(참조: 실시예 22).
서열 158은 본 발명에 따라 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머(R2new)이다(참조: 실시예 22).
서열 159는 약 58kDa 융합 단백질이다.
서열 160은 서열 159의 단백질을 코딩하는 융합 유전자이다.
서열 161은 본 발명에 따라 사용된 프라이머 45kD5'이다(참조: 실시예 27).
서열 162는 본 발명에 따라 사용된 프라이머 45kD3'rc이다(참조: 실시예27).
서열 163은 본 발명에 따라 사용된 프라이머 45kD5'01이다(참조: 실시예 27).
서열 164는 본 발명에 따라 사용된 프라이머 45kD5'02이다(참조: 실시예 27).
서열 165는 본 발명에 따라 사용된 프라이머 45kD3'03이다(참조: 실시예 27).
서열 166은 본 발명에 따라 사용된 프라이머 45kD3'04이다(참조: 실시예 27).
본 발명은 두 가지 새로운 클래스의 폴리뉴클레오티드 서열 및 이들 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 신규의 살충성 단백질에 관한 것이다. 일실시양태에 있어서, 상기 단백질은 약 40-50kDa의 전장(full-length) 분자량을 갖는다. 본원에 예시된 특정 실시양태에 있어서, 이들 단백질은 약 43-47kDa의 분자량을 갖는다. 두번째 실시양태에 있어서, 살충성 단백질은 약 10-15kDa의 분자량을 갖는다. 본원에 예시된 특정 실시양태에 있어서, 이들 단백질은 약 13-14kDa의 분자량을 갖는다.
바람직한 실시양태에 있어서, 40-50kDa 단백질과 10-15kDa 단백질은 함께 사용되며, 이들 단백질은 연합하여 살충성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 두 가지클래스의 단백질을 "이원성 독소(binary toxins)"라 일컬을 수 있다. 본원에서 사용될 때, "독소(toxin)"라는 용어는 어느 한 클래스의 살충성 단백질을 포함한다. 본 발명은 40-50kDa 또는 10-15kDa 독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 조합하여 사용될 때 살충 활성을 나타내는 전장 독소의 일부 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 두 가지 유형의 독소 양자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에 있어서, 이들 독소는 초시류 해충, 보다 바람직하게는 옥수수 뿌리벌레, 가장 바람직하게는 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성을 갖는다. 인시류 해충 또한 타겟이 될 수 있다.
특정 독소는 본원에 예시되어 있다. 공지의 아미노산 서열을 갖는 독소에 대해서는 분자량 또한 공지되어 있다. 당업계에서 통상의 지식을 가진 자는 겔 전기영동에 의해 결정된 단백질의 가시적인 분자량이 때로는 실제 분자량과 다를 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 예를 들면 45kDa 단백질 또는 14kDa 단백질에 대한 참조는 실제 분자량은 다소 다르더라도 대략 그 정도 크기의 단백질을 언급하는 것으로 이해된다.
본 발명은 이들 클래스의 독소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 그 독소를 발현하는 재조합 숙주를 생산하기 위한 이들 폴리뉴클레오티드의 사용에도 관계된다. 다른 측면에서, 본 발명은 옥수수 뿌리벌레와 같은 초시류를 포함한 해충을 매우 효과적으로 구제하기 위하여, 본 발명의 약 40-50kDa 독소와 본 발명의 약 10-15kDa 독소를 조합하여 사용하는 것에 관계된다. 예를 들면, 한 식물의 뿌리는 두 가지 유형의 독소를 동시에 발현할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 분리주, 독소 및 유전자를 사용한 해충 구제는 당업계의 숙련가에게 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들면,B.t. 분리주의 해충(또는 그들의 서식처)에의 적용, 재조합 미생물의 해충(또는 그들의 서식처)에의 적용, 및 본 발명의 살충성 독소를 코딩하는 유전자에 의한 식물의 형질변환(transformation)을 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 미생물은, 예를 들면,B.t.,이.콜라이, 및/또는슈도모나스(Pseudomonas)일 수 있다. 재조합 숙주는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 형질변환에 필요한 재료는 본원에 개시되어 있거나, 그렇지 않으면 숙련가라면 즉시 입수가능하다. 곤충, 및 선충류와 진드기 같은 다른 해충의 구제 또한 본원에 제공되는 가르침과 표준 기술을 함께 사용함으로써 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 달성될 수 있다.
본원에 제공되는 새로운 클래스의 독소 및 폴리뉴클레오티드 서열은 몇 가지 파라미터들에 의하여 규정된다. 본원에 기술된 독소의 한 가지 중요한 특징은 살충 활성이다. 특정 실시양태에 있어서, 이들 독소는 초시류 해충에 대하여 활성을 갖는다. 항-인시류-활성 독소 또한 포함된다. 본 발명의 독소 및 유전자는 그들의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 의하여 더 규정될 수 있다. 각 신규 클래스 내의 분자들의 서열은 특정 예시 서열에 대한 그들의 유사성 또는 상동성의 측면에서 뿐만 아니라, 특정 예시 프로브 및 프라이머와 혼성화하거나 그에 의해 증폭될 수 있는 능력 측면에서 동정 및 규정될 수 있다. 본원에 제공되는 독소 클래스는 또한 특정 항체와의 면역반응성 및 일반적인 구조식의 고수(adherence)에 근거하여동정될 수도 있다.
본 발명에 따른 살충성 독소를 코딩하는 유전자가 몇 가지 수단에 의해 수득될 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 분명할 것이다. 본원에 예시된 특정 유전자는 본원에 기술된 배양균 기탁소에 기탁된 분리주로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 이러한 유전자 및 독소는 또한 합성적으로, 예를 들면, 유전자 합성기를 사용하여 제조될 수 있다.
세 가지 예시적인 45kDa 독소의 서열이 서열 11, 43 및 38로서 제공된다. 바람직한 실시양태에 있어서, 이 클래스의 독소는 서열 28로서 제공되는 일반 서열(generic sequence)에 일치하는 서열을 가지고 있다. 바람직한 실시양태에 있어서, 이 클래스의 독소는 도 1에 도시된 공통 서열(consensus sequence)과 일치할 것이다.
본원에서 제공되는 가르침에 따라, 당업계의 숙련가는 본원에 기술된 신규 클래스의 다양한 독소 및 폴리뉴클레오티드 서열을 용이하게 생산하고 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 따라 유용한 미생물은 농업 연구 배양균 기탁소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)의 영구적인 콜렉션(permanent collection)에 기탁되었다. 기탁된 균주의 수탁번호는 하기와 같다:
배양주 수탁번호 기탁일
B.t.균주 PS80JJ1 NRRL B-18679 1990. 7. 17.
B.t.균주 PS149B1 NRRL B-21553 1996. 3. 28.
B.t.균주 PS167H2 NRRL B-21554 1996. 3. 28.
이. 콜라이 NM522(pMYC2365) NRRL B-21170 1994. 1. 5.
이. 콜라이 NM522(pMYC2382) NRRL B-21329 1994. 9. 28.
이. 콜라이 NM522(pMYC2379) NRRL B-21155 1993. 11. 3.
이. 콜라이 NM522(pMYC2421) NRRL B-21555 1996. 3. 28.
이. 콜라이 NM522(pMYC2427) NRRL B-21672 1997. 3. 26.
이. 콜라이 NM522(pMYC2429) NRRL B-21673 1997. 3. 26.
이. 콜라이 NM522(pMYC2426) NRRL B-21671 1997. 3. 26.
B.t.균주 PS185GG NRRL B-30181 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS187G1 NRRL B-30185 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS187Y2 NRRL B-30187 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS201G NRRL B-30188 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS201HH2 NRRL B-30190 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS242K10 NRRL B-30195 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS69Q NRRL B-30175 1999. 8. 19.
B.t.균주 KB54A1-6 NRRL B-30197 1999. 8. 19.
B.t.균주 KR589 NRRL B-30198 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS185L12 NRRL B-30179 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS185W3 NRRL B-30180 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS187L14 NRRL B-30186 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS186FF NRRL B-30183 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS131W2 NRRL B-30176 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS158T3 NRRL B-30177 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS158X10 NRRL B-30178 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS185FF NRRL B-30182 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS187F3 NRRL B-30184 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS201L3 NRRL B-30189 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS204C3 NRRL B-30191 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS204G4 NRRL B-18685 1990. 7. 17.
B.t.균주 PS204I11 NRRL B-30192 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS204J7 NRRL B-30193 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS236B6 NRRL B-30194 1999. 8. 19.
B.t.균주 PS246P42 NRRL B-30196 1999. 8. 19.
B.t.균주 KR1209 NRRL B-30199 1999. 8. 19.
B.t.균주 KR1369 NRRL B-30200 1999. 8. 19.
B.t.균주 MR1506 NRRL B-30298 2000. 6. 1.
B.t.균주 MR1509 NRRL B-30330 2000. 8. 8.
B.t.균주 MR1510 NRRL B-30331 2000. 8. 8.
B.t.균주 MR1607 NRRL B-30332 2000. 8. 8.
PS80JJ1 분리주는 미국특허 제 5,151,363호 및 다른 특허가 등록됨에 따라 공중에게 이용가능하다.
본 발명의 다른 측면은 신규의 분리주 및 이들 분리주로부터 얻을 수 있는 독소 및 유전자에 관계된다. 신규의 분리주들은 기탁되었으며, 상기 목록에 포함되어 있다. 이들 분리주는 본 특허출원이 계류중인 동안 특허상표청장에 의하여 37 CFR 1.14 및 35 U.S.C. 122 하에 자격이 부여된 것으로 결정된 사람에게는 상기 배양주에 대한 접근이 가능함을 보장하는 조건하에 기탁되었다. 상기 기탁주는 본 출원의 대응출원(counterpart) 또는 그의 자출원(progeny)이 출원된 국가에서 외국 특허법에 의해 요구될 때 이용가능하다. 그러나, 기탁주의 이용가능성이 정부의 결정에 의하여 보장된 특허권을 훼손하는 방식으로 본 발명을 실행하여도 좋다는 인허를 구성하지는 않음을 이해하여야만 한다.
또한, 본 배양균 기탁주는 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 공중에게 이용가능할 것이다. 즉, 그들은 기탁주의 표본 분양에 대한 가장 최근의 요구 이후 적어도 5년 동안, 그리고 어떤 경우에든 기탁일 이후 최소 30년 동안 또는 상기 배양주의 개시를 공포하는 임의의 특허의 유효기간 동안, 그들을 살아있는 상태로 그리고 오염되지 않은 상태로 유지하는데 필요한 모든 주의를 가지고 보관될 것이다. 기탁자들은 기탁주(들)의 상태 때문에 수탁자가 요구받았을 때 표본을 분양할 수 없는 경우, 기탁주(들)을 대체하여야 하는 의무를 양지하고 있다. 본 배양균 기탁주의 공중에 의한 이용가능성에 대한 모든 제한은 그들을 개시하고 있는 특허의 등록시 비가역적으로 제거될 것이다.
다음은 본 발명에 따라 유용한 특정B.t. 분리주의 특징을 제공하는 표이다.
초시류에 독성을 나타내는B.t. 균주
배양주 결정 대략적인 분자량(kDa) 혈청형 NRRL 수탁번호 수탁일
PS80JJ1 다수개 부착 130, 90, 47, 37, 14 4a4b, sotto B-18679 7-17-90
PS149B1 130, 47, 14 B-21553 3-28-96
PS167H2 70, 47, 14 B-23554 3-28-96
본 발명의 다른 분리주 또한 독소 봉입체(toxin inclusions)의 형태 및 위치에 따라 특징지어질 수 있다.
독소, 유전자, 및 프로브. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 원하는 숙주 세포 내에 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 완전한 "유전자"를 형성하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 숙련가라면 즉시 알아차릴 수 있듯이, 첨부된 서열목록에 있는 폴리뉴클레오티드 중 몇몇은 종지 코돈(stop codon) 없이 도시되어 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 당업계에 이미 공지되어 있듯이, 관심있는 숙주 내의 프로모터의 조절하에 적절하게 놓일 수 있다.
숙련가라면 쉽게 알 수 있듯이, DNA는 전형적으로 이중가닥 형태로 존재한다. 이러한 배열에 있어서, 한 가닥은 다른 하나의 가닥에 대하여 상보적이고, 그 역관계도 성립한다. DNA가 (예를 들면) 식물 내에서 복제될 때, 추가의 상보적인 DNA 가닥이 생산된다. "코딩 가닥(coding strand)"이란 용어는 종종 당업계에서 안티-센스 가닥(anti-sense strand)과 결합하는 가닥을 언급하기 위해 사용된다. mRNA는 DNA의 "안티-센스" 가닥으로부터 전사된다. "센스" 또는 "코딩" 가닥은, 전사해독프레임(open reading frame, "ORF")으로 읽혀 관심있는 단백질 또는 펩티드를 형성할 수 있는 일련의 코돈(코돈이란 한번에 세개가 읽혀 하나의 특정 아미노산을 낳을 수 있는 세 개의 뉴클레오티드임)을 가지고 있다. 생체내(in vivo)에서 단백질을 발현하기 위하여, 하나의 DNA 가닥은 전형적으로, 단백질의 주형으로사용될 수 있는 상보적인 mRNA 가닥으로 전사된다. 따라서, 본 발명은 첨부된 서열목록에 도시된 예시된 폴리뉴클레오티드 및/또는 상보성 가닥의 사용을 포함한다. 예시된 DNA와 기능적으로 동등한 RNA 및 PNA(peptide nucleic acids)는 본 발명에 포함된다.
본 발명의 독소 및 유전자는, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 동정 및 수득될 수 있다. 이들 프로브는 적절한 표지에 의해 검출될 수 있거나, 또는 국제공개 제 93/16094호에 기술된 바와 같이 내재적으로 형광을 내도록 만들어질 수 있는 검출가능한 뉴클레오티드 서열이다. 상기 프로브(및 본 발명의 폴리뉴클레오티드)는 DNA, RNA 또는 PNA 일 수 있다. 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U: RNA 분자의 경우)에 더하여, 본 발명의 합성 프로브(및 폴리뉴클레오티드)는 이노신(네 가지 염기 모두와 짝을 이룰 수 있는 중성 염기; 종종 합성 프로브 내에서 네 가지 염기의 혼합물 대신에 사용됨)을 가지고 있을 수도 있다. 따라서, 합성된 변성(degenerate) 올리고뉴클레오티드가 본원에서 언급되고, "n"이 포괄적으로 사용되는 경우, "n"은 G,A,T,C 또는 이노신일 수 있다. 본원에서 사용된 다의(多義, ambiguity) 코드는 본원 출원시의 표준 IUPAC 명명 협정에 따른 것이다(예를 들면, R은 A 또는 G를 의미하고, Y는 C 또는 T를 의미한다).
당업계에 공지되어 있듯이, 만일 프로브 분자와 핵산 시료가 그 두 분자간에 강력한 결합을 형성함으로써 혼성화된다면, 상기 프로브와 시료는 실질적인 상동성(homology)/유사성(similarity)/동일성(identity)을 가지고 있는 것으로 가정하는 것이 타당하다. 바람직하게는, 혼성화는, 예를 들면, Keller, G.H., M.M. Manak (1987)DNA Probes, Stockton Press, New York, NY., pp. 169-170 에 기술되어 있는 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 사용하여 가혹한 조건하에서 수행된다. 예를 들면, 거기에 기술된 바와 같이, 높은 가혹도 조건(high stringency condition)은 실온에서 15분 동안 2X SSC(Standard Saline Citrate)/0.1% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)로 일차 세척함으로써 달성될 수 있다. 전형적으로 두차례의 세척이 수행된다. 보다 높은 가혹도는 염 농도를 낮추고/낮추거나 온도를 높임으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 상술한 세척 이후에, 실온에서 15분 동안 0.1X SSC/0.1% SDS로 2회 세척한 다음, 이어서 55℃에서 30분 동안 0.1X SSC/0.1% SDS로 세척할 수 있다. 이러한 온도 조건은 본원에 기술되어 있고 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있는 다른 혼성화 및 세척 방법에도 적용될 수 있다(예를 들면, SSC 대신에 SSPE가 염으로서 사용될 수 있다). 2X SSC/0.1% SDS는 50㎖의 2X SSC와 5㎖의 10% SDS를 445㎖의 물에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 20X SSC는 NaCl(175.3g/0.150M), 시트르산 나트륨(88.2g/0.015M) 및 물을 최종 부피가 1리터가 되도록 합하고, 10N NaOH로 pH를 7.0으로 맞춤으로써 제조될 수 있다. 10% SDS는 SDS 10g을 50㎖의 멸균수에 용해시키고, 100㎖로 희석한 후 분주함으로써 제조될 수 있다.
프로브의 검출은 혼성화가 일어났는지 여부를 공지된 방식으로 결정하기 위한 수단을 제공한다. 그러한 프로브 분석은 본 발명의 독소-코딩 유전자를 동정하기 위한 신속한 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 프로브로 사용되는 뉴클레오티드 분절(segment)은 DNA 합성기 및 표준 과정을 사용하여 합성될 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열은 또한 본 발명의 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로도 사용될 수 있다.
한 분자의 혼성화 특성은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 규정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 예시된 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 서열 46 내지 166에 포함된 DNA 서열)와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드(및/또는 그들의 상보체, 바람직하게는 그들의 전체 상보체)를 포함한다.
본원에 사용될 때, "가혹한(stringent)" 혼성화 조건이란 본 출원인에 의해 사용된 조건에서와 같은 정도 또는 거의 같은 정도의 혼성화 특이성을 달성할 수 있는 조건을 의미한다. 특히, 서던 블랏 상에 고정된 DNA와32P로 표지된 유전자-특이적 프로브의 혼성화는 표준 방법에 의해 수행된다(Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook [1982]Molecular Cloning; A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). 일반적으로, 혼성화 및 뒤이은 세척은 타겟 서열(예를 들면, PS80JJ1 독소 유전자에 대한 상동성을 가지고 있는)의 검출을 위하여 허용되는 가혹한 조건하에서 수행되었다. 이중-가닥 DNA 유전자 프로브의 경우, 혼성화는 6X SSPE, 5X 덴하르트 용액, 0.1% SDS, 0.1mg/㎖ 변성 DNA 내에서 DNA 혼성체(hybrid)의 용융 온도(melting temperature, "Tm")로부터 20-25℃ 미만에서 밤새 수행되었다. 용융 온도는 다음 공식에 의해 설명된다(Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas, and F.C.Kafatos [1983]Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman and K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285):
Tm=81.5℃+16.6 Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(%포름아미드)-600/이중가닥의 염기쌍 길이
세척은 전형적으로 다음과 같이 수행된다:
(1) 1X SSPE, 0.1% SDS 내에서 15분 동안 실온에서 2회(낮은 가혹도 세척)
(2) 0.2X SSPE, 0.1% SDS 내에서 15분 동안 Tm-20℃에서 1회(중간 가혹도 세척).
올리고뉴클레오티드 프로브의 경우, 혼성화는 6X SSPE, 5X 덴하르트 용액, 0.1% SDS, 0.1㎎/㎖ 변성 DNA 내에서 혼성체의 용융 온도(Tm)로부터 10-20℃ 미만에서 밤새 수행되었다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 Tm은 다음의 공식에 의하여 결정되었다:
Tm(℃)=2(T/A 염기쌍의 수)+4(G/C 염기쌍의 수)
(Suggs, S.V., T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura, and R.B. Wallace [1981]ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D.D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693).
세척은 전형적으로 다음과 같이 수행되었다:
(1) 1X SSPE, 0.1% SDS 내에서 15분 동안 실온에서 2회(낮은 가혹도 세척)
(2) 1X SSPE, 0.1% SDS 내에서 15분 동안 혼성화 온도에서 1회(중간 가혹도 세척).
분리주 PS149B1, PS167H2, 및 PS80JJ1으로부터 수득할 수 있는 독소는 다음의 특징들 중 적어도 하나를 가지고 있는 것으로 확인되었다(본 발명의 신규 독소는 이러한 동정 정보 및 본원에 개시된 다른 동정 정보에 의해 유사하게 특징지어질 수 있다).
(a) 상기 독소는 가혹한 조건하에서 하기의 DNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다: 서열 2를 코딩하는 DNA, 서열 4를 코딩하는 DNA, 서열 6, 서열 8, 서열 10을 코딩하는 DNA, 서열 11, 서열 12를 코딩하는 DNA, 서열 13, 서열 14를 코딩하는 DNA, 서열 15를 코딩하는 DNA, 서열 16을 코딩하는 DNA, 서열 17을 코딩하는 DNA, 서열 18을 코딩하는 DNA, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27을 코딩하는 DNA, 서열 28의 살충성 영역, 서열 37을 코딩하는 DNA, 서열 38, 서열 42를 코딩하는 DNA, 및 서열 43을 코딩하는 DNA;
(b) 상기 독소는 하기의 분리주로 구성된 그룹으로부터 선택되는바실러스 슈린지엔시스분리주 유래의 약 40-50kDa 살충성 독소 또는 그의 단편에 대한 항체와 면역반응한다: NRRL B-18679의 동정 특성(identifying characteristics)을 가진 PS80JJ1, NRRL B-21553의 동정 특성을 가진 PS149B1, 및 NRRL B-21554의 동정 특성을 가진 PS167H2;
(c) 상기 독소는 하기의 프라이머 쌍으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 그의 일부 영역이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다: 약 495bp 단편을 생산하기 위한 서열 20 및 24, 약 594bp단편을 생산하기 위한 서열 20 및 25, 약 471bp 단편을 생산하기 위한 서열 21 및 24, 및 약 580bp 단편을 생산하기 위한 서열 21 및 25;
(d) 상기 독소는 서열 28에 도시된 아미노산 서열의 살충성 영역을 포함한다;
(e) 상기 독소는 하기의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열의 살충성 영역과 적어도 약 60%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 38, 및 서열 43;
(f) 상기 독소는 가혹한 조건하에서 하기의 DNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다: 서열 3을 코딩하는 DNA, 서열 5를 코딩하는 DNA, 서열 7을 코딩하는 DNA, 서열 32를 코딩하는 DNA, 서열 36을 코딩하는 DNA, 및 서열 41을 코딩하는 DNA;
(g) 상기 독소는 하기의 분리주로 구성된 그룹으로부터 선택되는바실러스 슈린지엔시스분리주 유래의 약 10-15kDa 살충성 독소 또는 그의 단편에 대한 항체와 면역반응한다: NRRL B-18679의 동정 특성(identifying characteristics)을 가진 PS80JJ1, NRRL B-21553의 동정 특성을 가진 PS149B1, 및 NRRL B-21554의 동정 특성을 가진 PS167H2;
(h) 상기 독소는 서열 29 및 서열 33의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 그의 일부 영역이 증폭될 수 있는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다; 및
(i) 상기 독소는 하기의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 60%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 3,서열 5, 서열 7, 서열 32의 살충성 영역, 서열 36의 살충성 영역, 및 서열 41의 살충성 영역.
유전자 및 독소의 변형(modification). 본 발명에 따라 유용한 유전자 및 독소는 특이적으로 증폭된 전장 서열(full-length sequences)뿐만 아니라, (전장 분자에 비하여 내부 및/또는 말단 결실을 포함한) 이들 서열의 일부영역(portions) 및/또는 단편(fragments), 그의 변이체(variants), 돌연변이체(mutants), 키메라(chimerics), 및 융합체(fusions)를 포함한다. 본 발명의 단백질은 본원에 특별히 예시된 단백질의 특징적인 살충 활성을 보유하고 있는 한, 치환된 아미노산을 가질 수 있다. "변이체(variant)" 유전자는 동일한 독소를 코딩하거나 또는 예시된 단백질과 동등한 살충 활성을 가진 독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가지고 있다. 본원에 사용될 때, "동등한 독소(equivalent toxin)"라는 용어는 타겟 해충에 대하여 예시된 독소와 동일하거나 또는 근본적으로 동일한 생물학적 활성을 가진 독소를 의미한다. 본원에 사용될 때, "근본적으로 동일한(essentially the same)" 서열이란 살충 활성에 크게 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 삽입을 가지고 있는 서열을 의미한다. 살충 활성을 보유한 단편 또한 이러한 정의에 포함된다. 예시된 독소의 살충 활성을 보유한 단편 및 등가물은 본 발명의 범위 내에 있다.
이러한 동등한 독소를 코딩하는 동등한 독소 및/또는 유전자는 본원에 제공된 가르침을 사용하여, 야생형(wild-type) 또는 재조합B.t. 분리주로부터 및/또는 다른 야생형 또는 재조합 생물체로부터 유래될 수 있다. 다른바실러스종이, 예를 들면, 소스 분리주로 사용될 수 있다.
유전자의 변이(variation)는, 예를 들면, 점 돌연변이(point mutation)를 만들기 위한 표준 기술을 사용하여 용이하게 형성될 수 있다. 또한, 예를 들면, 미국특허 제 5,605,793호는 무작위 단편화(random fragmentation) 이후에 DNA를 재조립(reassembly) 함으로써 추가적인 분자 다양성을 생성하는 방법을 기술하고 있다. 변이 유전자들은 변이 단백질들을 생산하는데 사용될 수 있다; 재조합 숙주가 그러한 변이 단백질들을 생산하는데 사용될 수 있다. 전장 유전자의 단편은 상업적으로 입수가능한 엑소뉴클라아제 또는 엔도뉴클라아제를 사용하여 표준 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면,Bal31과 같은 효소 또는 부위-특이적 돌연변이유발법(site-directed mutagenesis)은 이들 유전자의 말단으로부터 뉴클레오티드를 체계적으로 절단해내는데 사용될 수 있다. 또한, 활성 단편을 코딩하는 유전자는 다양한 제한효소를 사용하여 수득될 수 있다. 프로테아제는 이들 독소의 활성 단편을 직접적으로 수득하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 살충성 독소를 수득하기 위한 다수의 방법이 있다. 예를 들면, 본원에 개시되고 청구된 살충성 독소에 대한 항체는 단백질 혼합물로부터 다른 독소를 동정하고 분리해내는데 사용될 수 있다. 특히, 항체는 독소의 부위 중 가장 항구적이고 다른B.t. 독소들과 가장 잘 구별되는 부위에 대하여 만들어질 수 있다. 이러한 항체들은 이어서 면역침강법, 효소결합 면역흡착 검정법(ELISA), 또는 웨스턴 블랏팅으로 특징적인 활성을 가지고 있는 동등한 독소(equivalent toxin)를 특이적으로 동정하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 독소 또는 동등한 독소 또는 이들 독소의 단편에 대한 항체는 표준 방법을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 이어서, 소스 미생물로부터 이들 독소를 코딩하는 유전자를 수득할 수 있다.
유전자 코드의 중복성(redundancy) 때문에, 다양한 상이한 DNA 서열이 본원에 개시된 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 동일한 또는 근본적으로 동일한 독소를 코딩하는 이러한 대체 DNA 서열을 생산하는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자의 기술 내에 있다. 이들 변이 DNA 서열은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 특정 독소들은 본원에 특별히 예시되어 있다. 이들 독소는 단지 본 발명 독소의 예이기 때문에, 본 발명은 예시된 독소와 동일하거나 또는 유사한 살충 활성을 가진 변이 독소들 또는 동등한 독소들(및 동등한 독소들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열들)을 포함한다는 사실이 명백할 것이다. 동등한 독소는 예시된 독소와 아미노산 유사성(및/또는 상동성)을 가질 것이다. 아미노산 상동성은 전형적으로 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상일 것이며, 95% 이상일 수 있다. 본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드 및 단백질은 또한 보다 특정한 상동성 및/또는 유사성 범위의 측면에서 정의될 수 있다. 예를 들면, 상동성 및/또는 유사성은 본원에 예시된 서열과 비교하여 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%일 수 있다. 달리 한정되지 않으면, 본원에 사용된 두 핵산 간의 퍼센트 서열 상동성 및/또는 유사성은 Karlin and Altschul (1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:5873-5877에서처럼 변형된 Karlin and Altschul (1990),Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:2264-2268의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 그러한 알고리즘은 Altschulet al. (1990),J. Mol. Biol.215:402-410의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내로 통합된다. 원하는 퍼센트 서열 상동성을 가진 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해, BLAST 뉴클레오티드 서치가 NBLAST 프로그램(score=100, wordlength=12)를 사용하여 수행된다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬(gapped alignments)을 얻기 위해, Gapped BLAST가 Altschulet al. (1997),Nucl. Acids Res.25:3389-3402에 기술된 바와 같이 사용된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램(NBLAST 및 XBLAST)의 디폴트 파라미터(default parameters)가 사용된다. http://www.ncbi.nih.gov를 참조하라. 스코어는 또한 상기 배경기술 항목에 기술된 Crickmoreet al.의 방법 및 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다.
아미노산 상동성은 생물학적 활성에 책임이 있거나, 또는 궁극적으로 생물학적 활성에 책임이 있는 3차원 형상의 결정에 관여하는 독소의 중요 영역 내에서 가장 높을 것이다. 이러한 측면에서, 만일 어떤 아미노산 치환이 활성에 중요하지 않은 영역 내에 있거나 또는 분자의 3차원 형상에 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환이라면, 이러한 아미노산 치환은 허용가능하며 기대될 수 있다. 예를 들면, 아미노산은 다음의 클래스에 속할 수 있다: 비극성, 전하를 띠지 않은 극성, 염기성, 및 산성. 한 클래스의 아미노산이 동일한 종류의 다른 아미노산으로 치환되는 보존적 치환(conservative substitution)은, 그러한 치환이 화합물의 생물학적 활성을 심하게 변화시키지 않는 한, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 표 2는 각클래스에 속하는 아미노산 예의 목록이다.
아미노산 클래스 아미노산 예
비극성 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
전하를 띠지 않은 극성 Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
산성 Asp, Glu
염기성 Lys, Arg, His
몇몇 경우에, 비보존적 치환 또한 만들어질 수 있다. 중요한 인자는 이러한 치환이 독소의 생물학적 활성을 심각하게 손상시키지 않아야 한다는 것이다.
본원에서 사용될 때, "분리된(isolated)" 폴리뉴클레오티드 및/또는 "정제된(purified)" 독소는 이들이 자연계에서 발견될 당시에 함께 발견되곤 하는 다른 분자들과 결합되어 있지 않을 때의 분자를 의미한다; 이러한 용어는 그들의 식물에서의 사용을 포함한다. 따라서, "분리된" 및/또는 "정제된"이란 용어는 본원에 기술된 "인간의 손(hand of man)"의 개입을 의미한다.
본 발명의 독소와 기능적으로 동등한 합성 유전자 또한 숙주를 형질변환시키는데 사용될 수 있다. 합성 유전자를 생산하기 위한 방법은, 예를 들면, 미국특허 제 5,380,831호에서 찾아볼 수 있다.
형질전환 숙주. 본 발명의 독소-코딩 유전자는 매우 다양한 미생물 또는 식물 숙주 내로 도입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 독소 유전자의 발현은 직접적으로 또는 간접적으로 살충성 단백질의 세포내 생산 및 유지를 초래한다. 형질전환(transgenic)/재조합(recombinant)/형질변환(transformed) 숙주 세포가 해충에 의해 섭취될 때, 그 해충은 독소를 섭취하게 될 것이다. 이것은 해충과 독소를 접촉시키기 위한 바람직한 방법이다. 그 결과는 해충의 구제(말살 또는 병들게함)이다. 이와 달리, 적절한 미생물 숙주, 예를 들면,피.플루오레슨스(P. fluorescens)와 같은슈도모나스(Pseudomonas)가 해충의 서식처에 적용될 수 있고, 그곳에서 상기 미생물 숙주의 일부가 증식할 수 있으며 결국 타겟 해충에 의해 섭취된다. 독소 유전자를 보유하고 있는 미생물은 독소의 활성을 지속시키고 세포를 안정화하는 조건 하에서 처리될 수 있다. 독성 활성을 보유하고 있는 처리된 세포는 이어서 타겟 해충의 서식처에 적용될 수 있다.
바람직한 실시양태에 있어서, 재조합 식물세포 및 식물이 사용될 수 있다. 바람직한 식물(및 식물세포)는 옥수수(corn) 및/또는 인디안 옥수수(maize)이다.
B.t. 독소 유전자가 적절한 벡터를 통해 미생물 숙주 내로 도입되고, 상기 숙주가 살아있는 상태로 해충의 서식처에 적용되는 경우, 특정 숙주 미생물이 사용되어야 한다. 관심있는 하나 또는 그 이상의 농작물의 "피토스피어(phytosphere)"(phylloplane, phyllosphere, rhizosphere, 및/또는 rhizoplane)를 차지하는 것으로 알려진 미생물 숙주가 선택된다. 이들 미생물은 특정 환경(농작물 및 기타 다른 곤충 서식처)에서 야생형 미생물과 성공적으로 경쟁할 수 있고, 폴리펩티드 살충제를 발현하는 유전자의 안정적인 유지 및 발현을 제공하며, 바람직하게는, 상기 살충제를 환경적인 분해 및 불활성화로부터 보다 효과적으로 보호하도록 선택된다.
다수의 미생물이 매우 다양한 중요 농작물의 필로플레인(식물 잎의 표면) 및/또는 리조스피어(식물 뿌리 주위의 토양)에 서식하는 것으로 알려져 있다. 이러한 미생물에는 박테리아, 조류(algae), 및 진균류(fungi)가 포함된다. 특히 중요한 미생물은 박테리아, 예를 들면, 슈도모나스(Pseudomonas), 어위니아(Erwinia), 세라티아(Serratia), 클렙시엘라(Klebsiella), 크산토모나스(Xanthomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 리조비움(Rhizobium), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 메틸로필러스(Methylophilus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아세토박터(Acetobacter), 락토바실러스(Lactobacillus), 아트로박터(Arthrobacter), 아조토박터(Azotobacter), 류코노스톡(Leuconostoc), 및 알칼리제네스(Alcaligenes) 속(屬); 및, 진균류, 특히 효모, 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces), 크립토코커스(Cryptococcus), 클류버로마이세스(Kluyveromyces), 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces), 로도토룰라(Rhodotorula), 및 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속(屬)이다. 슈도모나스 시린재(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens), 아세토박터 자일리눔(Acetobacter xylinum), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 로도슈도모나스 스페로이데스(Rhodopseudomonas spheroides), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 리조비움 멜리오티(Rhizobium melioti), 알칼리제네스 엔트로퍼스(Alcaligenes entrophus), 및 아조토박터 빈란디(Azobacter vinlandii)와 같은 피토스피어 박테리아 종; 및 로도토룰라 루브라(Rhodotorula Rubra), 로도토룰라 글루티니스(R. glutinis), 로도토룰라 마리나(R. marina), 로도토룰라 아우란티아카(R. aurantiaca), 크립토코커스 알비더스(Cryptococcus albidus), 크립토코커스 디풀루엔스(C. diffluens), 크립토코커스 라우렌티(C. laurentti), 사카로마이세스 로자이(Saccharomyces rosei), 사카로마이세스 프레토리엔시스(S. pretoriensis), 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 스포로볼로마이세스 로제우스(Sporobolomyces roseus), 스포로볼로마이세스 오도루스(S. odorus), 클류버로마이세스 베로내(Kluyveromyces veronae), 및 아우레오바시디움 폴루란스(Aureobasidium pollulans)와 같은 피토스피어 효모 종이 특히 중요하다. 색소를 함유한 미생물이 특히 중요하다.
독소를 코딩하는B.t.유전자를 그 유전자의 안정적인 유지 및 발현을 허용하는 조건하에서 타겟 숙주 내로 도입하기 위하여 다양한 방법이 이용가능하다. 이러한 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 본원에 참고자료로 포함된 미국특허 제 5,135,867호에 기술되어 있다.
세포 처리. 상기에서 언급한 같이,B.t. 또는B.t. 독소를 발현하는 재조합 세포는 독소 활성을 지속시키고 세포를 안정화하도록 처리될 수 있다. 형성된 살충제 마이크로캡슐은, 안정화되었으며 상기 마이크로캡슐이 타겟 해충이 있는 환경에 적용될 때 독소를 보호해줄 세포 구조물 내에 있는B.t. 독소를 포함한다. 적절한 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포를 포함할 수 있으나, 일반적으로 포유동물과 같이 보다 고등한 생물에 유해한 물질을 생산하지 않는 세포들에 제한된다. 그러나, 그 유해한 물질이 불안정하거나 또는 적용 수준이 포유동물 숙주에 대해 독성을 나타낼 임의의 가능성을 피하기에 충분할 정도로 낮은 경우에는, 고등한 생물에 유해한 물질을 생산하는 개체가 사용될 수도 있다. 숙주로서, 원핵세포 및진균류와 같은 하등한 진핵세포가 특히 중요할 것이다.
세포는 일반적으로 완전하며, 어떤 경우에는 포자가 사용되기도 하지만, 처리될 때 포자형보다는 대체로 증식형으로 존재할 것이다.
미생물 세포, 예를 들면B.t. 독소 유전자를 포함하는 미생물의 처리는, 처리기술이 독소의 특성을 파괴하거나 독소를 보호하는 세포의 능력을 감소시키지 않는 한, 화학적 또는 물리적 수단에 의해, 또는 화학적 및/또는 물리적 수단의 조합에 의해 이루어질 수 있다. 화학적 시약의 예는 할로겐화제, 특히 원자번호 17-80의 할로겐이다. 보다 상세하게, 요오드는 순한 조건(mild condition) 하에서 원하는 결과를 달성하기에 충분한 시간 동안 사용될 수 있다. 다른 적절한 기술은 글루타르알데히드와 같은 알데히드; 제피란 클로라이드(zephiran chloride) 및 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride)와 같은 항-감염제; 이소프로필 및 에탄올과 같은 알코올; Lugol 요오드, Bouin's 고정제, 다양한 산 및 Helly's 고정제와 같은 다양한 조직학용 고정제(참조: Humason, Gretchen L.,Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967); 또는 세포가 숙주 환경에 적용되었을 때 그 세포 내에서 생산되는 독소의 활성을 보존하고 지속시키는 물리적(열) 및 화학적 제제의 조합에 의한 처리를 포함한다. 물리적 수단의 예는 감마-방사 및 X-방사와 같은 단파장 방사, 냉동, UV 조사, 동결건조 등이다. 미생물 세포의 처리 방법은 본원에 참고자료로 삽입된 미국특허 제 4,695,455호 및 제 4,695,462호에 개시되어 있다.
상기 세포들은 일반적으로, 환경 조건에 대한 저항성을 증대시켜줄 증강된구조적 안정성을 가질 것이다. 살충제가 전구체 형태(proform)로 존재하는 경우, 세포 처리방법은 그 전구체가 타겟 해충 병원체에 의해 성숙형으로 프로세싱되는 것을 저해하지 않도록 선택되어야 한다. 예를 들면, 포름알데히드는 단백질을 교차결합시킴으로써 폴리펩티드 살충제의 전구체가 프로세싱되는 것을 저해할 수 있다. 처리방법은 최소한 독소의 생물학적 유용성(bio-availability) 또는 생활성에 실질적인 부위를 유지해야만 한다.
생산 목적으로 숙주 세포를 선별하는데 있어서 특히 중요한 특징은B.t. 유전자의 숙주 내로의 도입의 용이함, 발현 시스템의 활용가능성, 발현 효율, 숙주 내에서 살충제의 안정성, 및 보조 유전적 능력의 존재를 포함한다. 살충제 마이크로캡슐로서 사용하기 위한 중요한 특징은 두터운 세포벽, 착색(pigmentation), 및 세포내 패키징 또는 봉입체 형성과 같은 살충제 보호 특성; 수성 환경에서의 생존; 포유동물 독성의 결여; 살충제를 섭취하도록 해충 유인; 독소에 손상을 주지 않는 사멸 및 고정의 용이함 등을 포함한다. 다른 고려사항은 조성물화(formulation) 및 취급의 용이함, 경제성, 저장 안정성 등을 포함한다.
세포 성장.B.t. 살충성 유전자를 함유한 세포 숙주는, 실질적으로 모든 또는 모든 세포들이B.t. 유전자를 보유하도록 선별 배지를 제공하면서, 바람직하게는 DNA 구조물이 선별의 유리함을 제공하는 임의의 편리한 영양배지에서 생육될 수 있다. 이러한 세포들은 이어서 통상의 방법에 따라 회수된다. 이와 달리, 세포들은 회수 이전에 처리될 수도 있다.
본 발명의B.t. 세포는 표준 배지 및 발효 기술을 사용하여 배양될 수 있다.발효 주기가 완료되자마자, 우선B.t. 포자 및 결정을 당업계에서 공지된 수단에 의해 발효 브로쓰로부터 분리함으로써 세균이 회수될 수 있다. 회수된B.t. 포자 및 결정은 계면활성제, 분산제, 불활성 담체, 및 특정 타겟 해충의 취급 및 그에의 적용을 용이하게 하는 다른 성분을 첨가함으로써, 적실 수 있는 분말(wettable powder), 액상 농축물, 과립 또는 기타 다른 조성물로 제조될 수 있다. 이러한 조성물 및 적용 과정은 당업계에 공지되어 있다.
조성물(formulations). 유인물질(attractant) 및B.t. 분리주의 포자 및 결정을 포함하는 조성물화된 먹이 과립, 또는 본원에 개시된B.t. 분리주로부터 수득가능한 유전자를 포함하는 재조합 미생물이 토양에 적용될 수 있다. 조성물화된 제품은 또한 경작 주기의 후기 단계에서 종자-코팅제, 뿌리 처리제, 또는 전체 식물 처리제로서 적용될 수 있다.B.t. 세포로 된 식물 및 토양 처리제는 유기 미네랄(필로실리케이트, 카보네이트, 설페이트, 포스페이트 등) 또는 식물성 물질(분말화된 옥수수 속대, 쌀겨, 호두 껍질 등)과 같은 다양한 불활성 물질과 혼합함으로써, 적실 수 있는 파우더, 과립 또는 분말로서 사용될 수 있다. 상기 조성물은 분무기-스티커 매질(adjuvant), 안정화제, 기타 다른 살충성 첨가제, 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 액상 조성물은 수성계 또는 비수성계일 수 있으며, 거품, 젤, 현탁액, 유상액화 될 수 있는 농축물 등으로서 사용될 수 있다. 유동성 제제(rheological agents), 계면활성제, 유상액화제, 분산제, 또는 중합체가 성분으로 포함될 수도 있다.
당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하고 있듯이, 살충성 농도는 특정조성물의 성질, 특히 그 조성물이 농축물인지 또는 직접 사용될 것인지의 여부에 따라 크게 달라질 수 있다. 상기 살충제는 적어도 1 중량%로 존재할 것이며, 100 중량%일 수도 있다. 액상 조성물은 일반적으로 액체상 중에 고형성분을 약 1 내지 60 중량% 포함하는 것에 반하여, 건조한 조성물은 살충제를 약 1 내지 95 중량% 포함할 것이다. 세포를 함유하는 조성물은 일반적으로 약 102내지 약 104세포/㎎를 포함할 것이다. 이러한 조성물들은 헥타르 당 약 50㎎(액상 조성물 또는 건조한 조성물) 내지 1㎏ 또는 그 이상의 양으로 적용될 수 있다.
상기 조성물은 분무, 살포, 흩뿌림 등에 의해 해충의 서식처, 예를 들면 토양 및 잎에 적용될 수 있다.
돌연변이주. 본 발명의 분리주의 돌연변이주는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 무포자 돌연변이주는 분리주의 에틸메탄 술포네이트(EMS) 돌연변이유발법을 통해 수득될 수 있다. 돌연변이주는 당업계에 공지된 과정에 따라 자외선 및 니크로소구아니딘을 사용하여 제조될 수 있다.
무포자 돌연변이주의 보다 적은 퍼센티지는 연장된 발효기간 동안 완전하게 남아있을 것이며 용균되지 않을 것이다; 이들 균주는 용균 마이너스(-)로 지정된다. 용균 마이너스 균주는 진탕 플라스크 배지 내에서 무포자 돌연변이주를 검색(screening)하고, 발효 종료 시점에 여전히 완전하게 남아있으며 독소 결정을 함유하고 있는 돌연변이주들을 선별함으로써 동정될 수 있다. 용균 마이너스 균주는 보호받는 캡슐화된 독소 단백질을 생산하게 될 세포 처리 공정에 적합하다.
상기 무포자 돌연변이주의 파아지-저항성 변이체를 제조하기 위하여, 파아지 용해질의 분취량을 영양 아가 상에 도말하고 건조시킨다. 이어서, 파아지-감수성 박테리아 균주의 분취량을 건조된 용해질 상에 직접 도말하고 건조시킨다. 상기 플레이트를 30℃에서 인큐베이션한다. 상기 플레이트는 2일 동안 인큐베이션되는데, 그때 다수의 콜로니가 아가 상에서 자라는 것을 볼 수 있다. 이들 콜로니 중 몇개를 찍어, 영양 아가 플레이트 상으로 계대배양한다. 이러한 분명한 저항성 배양균들은 파아지 용해질과 교차 획선(cross streaking)을 그어봄으로써 저항성에 대하여 검사된다. 파아지 용해질을 하나의 선으로 플레이트 상에 획선을 긋고 건조시킨다. 이어서, 상기 추정적 저항성 배양균을 상기 파아지 선과 교차하여 획선을 긋는다. 저항성 박테리아 배양균은 30℃에서 밤새 인큐베이션된 후에 상기 파아지 선과 교차하는 획선의 어느 부위에서도 용균 현상을 보이지 않는다. 파아지에 대한 저항성은 이어서 상기 저항성 배양균을 영양 아가 플레이트 상에 도말함으로써 재확인된다. 감수성 균주도 양성 대조구로 사용하기 위해 동일한 방법으로 도말된다. 건조 후에, 파아지 용해질 한방울을 상기 플레이트의 중심에 떨어뜨리고, 건조시킨다. 저항성 배양균은 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션된 후에 파아지 용해질을 떨어뜨린 영역 내에서 용해 현상을 전혀 보이지 않는다.
하기는 본 발명을 수행하기 위한 과정을 설명하는 실시예이다. 이들 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 %는 중량%이며, 모든 용매 혼합비는 부피비이다.
실시예 1 - 본 발명의 B . t . 분리주의 배양
B.t. 분리주의 계대배양주 또는 그의 돌연변이주가 하기의 배지, 펩톤, 포도당, 염 배지를 접종하는데 사용될 수 있다.
박토 펩톤 7.5 g/ℓ
포도당 1.0 g/ℓ
KH2PO43.4 g/ℓ
K2HPO44.35 g/ℓ
염 용액 5.0㎖/ℓ
CaCl2용액 5.0㎖/ℓ
pH 7.2
염 용액(100㎖)
MgSO4·7H2O 2.46g
MnSO4·H2O 0.04g
ZnSO4·7H2O 0.28g
FeSO4·7H2O 0.40g
CaCl2용액(100㎖)
CaCl2·2H2O 3.66g
상기 염 용액과 CaCl2용액은 필터로 멸균화된 다음, 접종 시에 압열멸균후 조리된 브로쓰에 첨가된다. 플라스크는 30℃ 회전 진탕기에서 200rpm으로 64시간 동안 배양된다.
상기 과정은 당업계에서 공지된 방법에 의하여 대량 발효조로 용이하게 규모를 늘릴 수 있다.
상기 발효에서 수득된B.t. 포자 및/또는 결정은 당업계에서 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 자주 사용되는 방법은 회수된 발효 브로쓰를 분리 기술, 예를 들면, 원심분리에 적용하는 것이다.
실시예 2 - 포자화된 바실러스 슈린지엔시스 배양주의 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성
PS80JJ1, PS149B1 또는 PS167H2의 액체 배양균을 진탕 플라스크 내에서 포자화 될 때까지 배양하고, 원심분리로 펠렛화하였다. 배양균 펠렛을 물에 재현탁하고, 상술한 탑-로드 바이오어세이법(top load bioassay)으로 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성을 검정하였다. 배양균 펠렛 내에 존재하는 14kDa 및 44.3kDa 단백질의 양을 농도계측법(densitometry)으로 측정하여, LC50로 표현되는 특이적 활성을 계산하는데 사용하였다. 각각의 천연비.슈린지엔시스균주의 활성을 표 3에 나타내었다(B.t. 균주의 WCRW 탑-로드 바이오어세이).
B.t. 균주의 WCRW 탑-로드 바이오어세이
B.t. 균주 LC50(μg/cm2)* 95% CL 경사도
PS80JJ1 6 4-8 1.5
PS167H2 6 4-9 1.6
PS149B1 8 4-12 1.8
CryB 세포 블랭크 4% N/A N/A
물 블랭크 4% N/A N/A
*대조구에 대해서는 가장 높은 처리량(top dose)에서의 % 치사율이 제공된다.
실시예 3 - 45kDa 80JJ1 단백질을 위한 단백질 정제
80JJ1의 동결건조된 분말 1g을 80mM Tris-HCl pH 7.8, 5mM EDTA, 100μM PMSF, 0.5㎍/㎖ 류펩틴(Leupeptin), 0.7㎍/㎖ 펩스타틴(Pepstatin) 및 40㎍/㎖ 베스타틴(Bestatin)이 함유된 완충액 40㎖에 현탁하였다. 상기 현탁액을 원심분리하고, 그 상등액을 버렸다. 펠렛을 매회 상기 완충액 35-40㎖을 사용하여 5회 세척하였다. 세척된 펠렛을 40% NaBr, 5mM EDTA, 100μM PMSF, 0.5㎍/㎖ 류펩틴, 0.7㎍/㎖ 펩스타틴 및 40㎍/㎖ 베스타틴이 함유된 용액 10㎖에 재현탁한 후, 로커 플랫폼(rocker platform) 위에 75분 동안 놓아두었다. 상기 NaBr 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 제거한 다음, 펠렛을 40% NaBr, 5mM EDTA, 100μM PMSF, 0.5㎍/㎖류펩틴, 0.7㎍/㎖ 펩스타틴 및 40㎍/㎖ 베스타틴이 함유된 용액으로 상기와 같이 2회 처리하였다. 상등액(40% NaBr 용해성)을 취합하여, 10mM CAPS pH 10.0, 1mM EDTA에 대하여 4℃에서 투석하였다. 투석된 추출물을 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 펠렛(40% NaBr 투석 펠렛)을 물 5㎖에 현탁하고, 원심분리하였다. 상등액을 버렸다. 세척된 펠렛을 물 10㎖로 2회 세척하고, 상기와 같이 원심분리하였다. 세척된 펠렛은 물 1.5㎖에 현탁되었으며, SDS-PAGE 분석시 약 47kDa, 45kDa 및 15kDa의 가시적인 이동성을 가진 세 개의 단백질 밴드를 주로 포함하고 있었다. 정제의 이 단계에서, 현탁된 40% NaBr 투석 펠렛은 로우리 어세이(Lowry assay)상 약 21㎎/㎖의 단백질을 함유하고 있었다.
펠렛 현탁액 내의 단백질을 15% 아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE(Laemlli, U.K. [1970]Nature227:680)로 분리하였다. 분리된 단백질은 이어서 10mM CAPS pH 11.0, 10% MeOH 내에서 100V 정전압으로 PVDF 막(Millipore Corp.)으로 전기적으로 블로팅되었다. 1시간 후에 상기 PVDF 막을 물 속에서 짧게 세척하고, 3분 동안 0.25% 쿠마시 블루(Coomassie blue) R-250, 50% 메탄올, 5% 아세트산에 담가두었다. 염색된 막을 40% 메탄올, 5% 아세트산 내에서 탈색하였다. 탈색된 막을 실온에서 공기중에서 건조시켰다(LeGendreet al. [1989] InA Practical Guide to Protein Purifiction For Microsequencing, P. Matsudaira, ed., Academic Press, New York, NY). 상기 막을 자동화된 기체상 에드만법(Edman degradation)을 사용하여 서열분석하였다(Hunkapillar, M.W., R.M. Hewick, W.L. Dreyer, L.E. Hood [1983]Meth.Enzymol. 91:399).
상기 아미노산 서열 분석은 상기 45kDa 밴드의 N-말단 서열이 다음과 같음을 밝혔다: Met-Leu-Asp-Thr-Asn(서열 1).
상기 47kDa 밴드도 분석되었으며, 그의 N-말단 서열은 서열 1과 동일한 5-아미노산 서열인 것으로 결정되었다. 즉, 47kDa 펩티드와 45kDa 펩티드의 N-말단 아미노산 서열은 동일하였다.
이러한 아미노산 서열은 또한 PS80JJ1 포자/결정 분말로부터 다른 정제 방법을 사용하여 수득한 45kDa 펩티드로부터 얻은 서열과도 일치하며, 그 N-말단 서열은 다음과 같다: Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-Leu-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr-Thr-Ser-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(서열 2).
실시예 4 - PS80JJ1의 14kDa 펩티드의 정제
47kDa, 45kDa 및 15kDa 펩티드가 함유된 백색의 투석 현탁액(약 21㎎/㎖) 0.8㎖을 40% NaBr 10㎖에 용해시키고, 100mM EDTA 0.5㎖을 첨가하였다. 약 18시간(밤새) 후에, 백색의 불투명한 현탁액을 수득하였다. 이것을 원심분리로 회수하고 버렸다. 상기 현탁액을 Centricon-30(Amicon Corporation)을 사용하여 최종 부피가 약 15㎖이 되도록 농축하였다. 여과된 농축액을 필터 투석법으로 물로 세척하고, 얼음 상에서 인큐베이션 하여, 최종적으로 우윳빛의 백색 현탁액을 형성시켰다. 상기 현탁액을 원심분리한 후, 펠렛과 상등액을 분리하여 저장하였다. 이어서, 상기 펠렛을 물 1.0㎖에 현탁하였다(약 6㎎/㎖). 상기 펠렛은 SDS-PAGE로 분석한 결과 실질상 순수한 15kDa 단백질을 함유하고 있었다.
N-말단 아미노산 서열은 다음과 같이 결정되었다: Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Glu-Ile-Asn-Asn-Thr-Arg-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Ala-Lys-Thr-Lys-Leu(서열 3).
실시예 5 - 단백질 바이오어세이
47kDa, 45kDa 및 15kDa 펩티드를 함유하고 있는 투석된 80JJ1의 NaBr 추출물로부터의 불용성 분획(fraction) 제조물을 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대하여 바이오어세이한 결과, 상당한 독성 활성을 시현하는 것으로 확인되었다.
실시예 6 - 단백질 정제 및 PS149B1 45kDa 단백질의 특성규명
P1 펠렛을 단위 젖은 중량(unit wet weight) 당 2배 부피의 증류수로 재현탁하고, 여기에 9배 부피의 40%(w/w) 수성 브롬화 나트륨을 첨가하였다. 이러한 작업 및 뒤이은 모든 작업은 얼음 상에서 또는 4-6℃에서 수행되었다. 30분 후에, 현탁액을 36배 부피의 냉각된 물로 희석하고, 25,000×g에서 30분 동안 원심분리하여, 펠렛 및 상등액을 얻었다.
상기 펠렛을 1-2배 부피의 물에 재현탁하여, 20-40%(w/w) 브롬화 나트륨 농도구배 상에 층상으로 쌓고, 8,000×g에서 100분 동안 원심분리하였다. 약 32%(w/w) 브롬화 나트륨에서 띠를 이루는 층("inclusions", INC)을 회수하여, 6-8kDa의 분자량 한계(MW cut-off)를 갖는 투석막을 사용하여 물에 대해 밤새 투석하였다. 미립 물질을 25,000×g에서 원심분리로 회수하여, 물에 재현탁한 다음, 분취하여 로우리법 및 SDS-PAGE로 단백질 분석을 하였다.
상기 상등액을 Centricon-10 농축기(concentrator)를 사용하여 3-4배 농축하고, 6-8kDa의 분자량 한계를 갖는 투석막을 사용하여 물에 대해 밤새 투석하였다. 미립 물질을 25,000×g에서 원심분리로 회수하여, 물에 재현탁한 다음, 분취하여 로우리법 및 SDS-PAGE로 단백질 분석을 하였다. 이 분획을 'P1.P2'라 명명하였다.
상기 펠렛 현탁액 내의 펩티드들을 15% 아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE(Laemlli, U.K.,supra)로 분리하였다. 분리된 단백질들은 이어서 10mM CAPS pH 11.0, 10% MeOH 내에서 100V 정전압으로 PVDF 막(Millipore Corp.)으로 전기적으로 블로팅되었다. 1시간 후에 상기 PVDF 막을 물 속에서 짧게 세척하고, 3분 동안 0.25% 쿠마시 블루(Coomassie blue) R-250, 50% 메탄올, 5% 아세트산에 담가두었다. 염색된 막을 40% 메탄올, 5% 아세트산 내에서 탈색하였다. 탈색된 막을 실온에서 공기중에서 건조시켰다(LeGendreet al.,supra). 상기 막을 자동화된 기체상 에드만법(Edman degradation)을 사용하여 서열분석하였다(Hunkapillaret al.,supra).
단백질 분석 결과 각각 47kDa과 14kDa의 분자량을 갖는 두 개의 주요 폴리펩티드가 있음이 확인되었다. 분자량은 분자량을 알고 있는 표준 폴리펩티드를 기준으로 측정되었다. 이러한 과정으로부터는 단지 진짜 분자량을 어림짐작할 수 있을 뿐이다. PS149B1 유래의 47kDa 단백질은 SDS-PAGE 상에서 PS80JJ1의 47kDa 단백질과 구별되지 않는 방식으로 이동하였다. 이와 마찬가지로, PS149B1 유래의 14kDa 단백질은 SDS-PAGE 상에서 PS167H2 및 PS80JJ1의 14kDa 단백질과 구별되지 않는 방식으로 이동하였다. 각각 쿠마시로 염색된 물질의 25-35%(47kDa)와 35-55%(15kDa)를 차지하는 이들 두 폴리펩티드로부터 떨어진 곳에, 46kDa, 130kDa 및 70kDa의 추정 분자량을 갖는 밴드를 포함하여 몇몇 중요치 않은 밴드가 있을 수 있다.
단백질 분석은 INC 분획이 47kDa의 분자량을 갖는 단일 폴리펩티드를 함유하고 있고, P1.P2 분획은 14kDa의 분자량을 갖는 단일 폴리펩티드를 함유하고 있음을 제시하였다. 이들 폴리펩티드는 P1으로부터 50% 이상의 수율로 회수되었다.
PS149B1 유래의 정제된 47kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 다음과 같다: Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-His-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr-Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(서열 4).
PS149B1 유래의 정제된 14kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 다음과 같다: Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu-Asp-Gly-Gly-Arg-Trp-Arg-Thr-Ser-Pro-Xaa-Asn-Val-Ala-Asn-Asp-Gln-Ile-Lys-Thr-Phe-Val-Ala-Glu-Ser-Asn(서열 5).
실시예 7 - PS167H2의 45kDa 및 14kDa 독소의 아미노산 서열
PS167H2 유래의 정제된 45kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 다음과 같다: Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Ile-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-Tyr-Ala-Asn-Gly-Leu-His-Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(서열 6).
PS167H2 유래의 정제된 14kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 다음과 같다: Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu(서열 7).
이들 아미노산 서열은 서열 1의 N-말단 서열을 가지고 있는 80JJ1 포자/결정 분말로부터 수득된 47kDa 펩티드의 서열 및 서열 3의 N-말단 서열을 가지고 있는 80JJ1 포자/결정 분말로부터 수득된 14kDa 펩티드의 서열과 비교될 수 있다.
분명히, 상기 45-47kDa 단백질들은 밀접하게 연관되어 있으며, 14kDa 단백질들도 밀접하게 연관되어 있다.
실시예 8 - 단백질 바이오어세이
PS149B1 유래의 정제된 단백질 분획들을 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대하여 바이오어세이한 결과, 조합되었을 때 상당한 독성 활성을 시현하는 것으로 밝혀졌다. 사실상, 그러한 조합은 원래의 제조물(P1)에서 관찰된 활성에 필적하는 활성을 회복시킨다. 하기의 바이오어세이 데이터 셋트는 % 치사율을 나타내며, 이러한 효과를 주장한다.
농도(㎍/㎠) P1 INC P1.P2 INC+P1.P2
300 88, 100, 94 19 13 100
100 94, 50, 63 31 38 94
33.3 19, 19, 44 38 13 50
11.1 13, 56, 25 12 31 13
3.7 0, 50, 0 0 31 13
1.2 13, 43, 12 0 12 19
0.4 6, 12, 6 25 19 6
실시예 9 - 바실러스 슈린지엔시스 균주 PS80JJ1 유래의 신규 δ-내독소 유전자의 클로닝, 발현, 및 DNA 서열 분석
600nm에서의 흡광도가 1.0이 될 때까지 배양된바실러스 슈린지엔시스세포로부터 총 세포 DNA를 제조하였다. 세포를 원심분리로 펠렛화하고, 원형질 완충액(0.3M 수크로오스 내의 20mg/㎖ 리소자임, 25mM Tris-Cl [pH 8.0], 25mM EDTA)에 재현탁하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 냉동 및 해동 주기를 2회 반복하여 원형질(protoplasts)을 용해시켰다. 9배 부피의 0.1M NaCl, 0.1% SDS, 0.1M Tris-Cl을 첨가하여 완전히 용해시켰다. 투명해진 용해질을 페놀:클로로포름(1:1)으로 2회 추출하였다. 핵산을 2배 부피의 에탄올로 침강시킨 후, 원심분리로 펠렛화하였다. 상기 펠렛을 TE 완충액에 재현탁하고, RNase를 최종 농도가 50㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 상기 용액을 페놀:클로로포름(1:1) 및 TE로 포화된 클로로포름으로 각각 1회씩 추출하였다. 1/10 부피의 3M NaOAc 및 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 수성상으로부터 DNA를 침강시켰다. DNA를 원심분리로 펠렛화하고, 70% 에탄올로 세척한 다음, 건조시키고 TE 완충액에 재현탁하였다.
PS80JJ1 45kDa 독소를 코딩하는 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브를 N-말단 펩티드 서열 데이터로부터 고안하였다. 29-염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 서열은 다음과 같다: 5'-ATG YTW GAT ACW AAT AAA GTW TAT GAA AT-3'(서열 8).
이 올리고뉴클레오티드는 도시된 네개 위치에서 혼합되어 있다. 이 프로브를32P로 방사성 표지한 후, 다양한 제한효소로 처리된 PS80JJ1 총 세포 DNA 서던블롯의 표준 조건 혼성화에 사용하였다. 이러한 실험으로부터 얻은, 서열 8의 44.3kDa 독소 유전자 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 서열 상동성을 가지고 있는 DNA 제한효소 단편의 크기를 보여주는 대표적인 자동방사선 사진술(autoradiography) 데이터를 표 5에 나타내었다.
표준 조건하에서 44.3kDa 독소 유전자 올리고뉴클레오티드 프로브(서열 8)와 혼성화한 서던 블롯 상의 PS80JJ1 세포 DNA 단편들의 RFLP
제한효소 대략적인 단편 크기(kbp)
EcoRI 6.0
HindIII 8.3
KpnI 7.4
PstI 11.5
XbaI 9.1
이러한 분석에서 확인된 이들 DNA 단편은 PS80JJ1 45kDa 독소 유전자의 전체 또는 분절(segment)을 포함하고 있다. 표 5에 나타낸 혼성화하는 DNA 단편들의 대략적인 크기는, 예측한 바와 같이, 별개의 시험에서 사용된 PS80JJ1 45kDa 독소 서브유전자 프로브와 혼성화하는 PS80JJ1 단편들의 아집단의 크기와 합리적으로 일치한다(참조: 표 6).
Sau3AI으로 부분적으로 절단된 PS80JJ1 DNA로부터 유전자 라이브러리를 제조하였다. 부분적인 제한효소 절단물들을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하였다. 크기가 9.3 내지 23kbp인 DNA 단편들을 겔로부터 도려내어, 겔 절편으로부터 전기용출(electroelution)한 다음, Elutip-D 이온 교환 컬럼(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 상에서 정제하고, 에탄올 침강법으로 회수하였다.Sau3AI삽입편(insert)을BamHI으로 처리된 LambdaGem-11(Promega, Madison, WI) 내로 리게이션(ligation)시켰다. 재조합 파아지를 패키징하여이.콜라이(E. coli) KW251 세포 상에 도말하였다. 상술한 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 혼성화에 의해 플라크들을 검색(screening)하였다. 혼성화한 파아지를 플라크 정제(plaque-purification)하여, 표준 방법(Maniatiset al.,supra)에 의한 DNA 분리를 위한 목적으로이.콜라이KW251 세포의 액상 배양균을 감염시키는데 사용하였다.
서던 블롯 분석 결과, 재조합 파아지 분리주 중의 하나가 PS80JJ1 독소 유전자 프로브와 혼성화하는 약 4.8kbpXbaI-SacI 밴드를 포함하고 있음이 밝혀졌다. PS80JJ1 독소 유전자에 측접한SacI 부위는 파아지 벡터 클로닝 부위인 반면, 측접한XbaI 부위는 PS80JJ1 DNA 삽입편 내에 위치한다. 서열분석을 위해, 상기 DNA 제한효소 단편을 표준 방법에 따라 pBluescript S/K(Stratagene, San Diego, CA)내로 서브클로닝하였다. 이로부터 얻어진 플라스미드는 'pMYC2421'이라 명명되었다. 또한, 상기 DNA 삽입편을 pHTBlueII(pBluescript S/K[Stratagene, San Diego, CA] 및 정주(定住, resident)B.t. 플라스미드 유래의 복제기점[D. Lerecluset al. (1989)FEMS Microbiology Letters60:211-218]으로 구성된이.콜라이/바실러스 슈린지엔시스셔틀 벡터) 내로 서브클로닝하여, pMYC2420을 얻었다.
N-말단 펩디드 서열 데이터로부터 PS80JJ1 14kDa 독소를 코딩하는 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안하였다. 28-염기 올리고뉴클레오티드 프로브의 서열은 다음과 같다: 5'-GW GAA GTW CAT ATW GAA ATW AAT AAT AC-3'(서열 29). 이 올리고뉴클레오티드는 도시된 네개 위치에서 혼합되어 있다. 상기 프로브를32P로 방사성 표지하여, 다양한 제한효소로 처리된 PS80JJ1의 총 세포 DNA 및 pMYC2421 DNA의 서던 블롯의 표준 조건 혼성화에 사용하였다. 이러한 RFLP 지도화 실험은 14kDa 독소를 코딩하는 유전자가 44.3kDa 독소의 N-말단 코딩 서열을 포함하고 있는 동일한 게놈EcoRI 단편 상에 위치함을 제시하였다.
B.t. 내에서의 PS80JJ1 독소 유전자의 발현을 시험하기 위해, 일렉트로포레이션(electroporation)으로 pMYC2420을 무결정성(acrystalliferous(Cry-))B.t. 숙주 CryB(A. Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN)내로 형질변환시켰다. SDS-PAGE 분석 결과, pMYC2420에 의해 코딩되는 약 14kDa 및 44.3kDa PS80JJ1 독소 양자의 발현이 확인되었다. 재조합 CryB[pMYC2420] 균주 MR536으로부터의 독소 결정 제조물을 검정한 결과, 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다.
pMYC2421에 의하여 코딩되는 PS80JJ1 독소 유전자를 ABI373 자동 서열분석 시스템 및 관련 소프트 웨어를 사용하여 서열을 분석하였다. 전사해독프레임 및 측접한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전체 유전자좌(genetic locus)의 서열이 서열 30에 도시되어 있다. 14kDa 독소 유전자의 종지 코돈은 44.3kDa 독소 유전자의 개시 코돈으로부터 121bp 상류(5')에 있다(참조: 도 2). PS80JJ1 14kDa 독소 전사해독프레임 뉴클레오티드 서열(서열 31), 44.3kDa 독소 전사해독프레임 뉴클레오티드 서열(서열 10), 및 각각의 유추된 아미노산 서열(서열 32 및 서열 11)은 살충성 단백질을 코딩하는 다른 독소 유전자와 비교하여 신규하다.
따라서, PS80JJ1의 14kDa 독소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 31에 도시되어 있다. PS80JJ1의 14kDa 독소의 유추된 아미노산 서열은 서열 32에 도시되어 있다. PS80JJ1의 14kDa 및 45kDa 독소 양자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 측접한 서열은 서열 30에 도시되어 있다. 이들 서열 간의 관계를 도 2에 도시하였다.
플라스미드 pMYC2421을 포함하는이.콜라이NM522의 계대배양주를 농업 연구 배양균 기탁소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)의 영구적인 콜렉션(permanent collection)에 1996년 3월 28일자로 기탁하였다. 수탁번호는 NRRL B-21555이다.
실시예 10 - 바실러스 슈린지엔시스 균주 PS149B1 및 PS167H2 유래의 추가적인 신규 δ-내독소 유전자의 RFLP 및 PCR 분석
옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성을 가진 두 개의 추가적인 균주 PS149B1 및 PS167H2 또한 약 14 및 45kDa 크기의 폴리펩티드를 포함하는 부포자(parasporal) 단백질 결정을 생산한다. 서던 혼성화 및 부분적인 DNA 서열 분석이 이들 독소의 80JJ1 독소에 대한 연관성을 검사하는데 사용되었다. 상술한 바와 같이 이들B.t. 균주로부터 DNA를 추출하고, 14kDa 독소 올리고뉴클레오티드 프로브(서열 29) 및 80JJ1 44.3kDa 독소 유전자-코딩 서열의 약 800bp PCR 단편을 사용하여 표준 서던 혼성화를 수행하였다. 44.3kDa 독소에 대하여 서열 상동성을 갖는 DNA 제한효소단편의 크기를 보여주는, 이러한 실험들로부터 얻은 RFLP 데이터를 표 6에 나타내었다. 약 14kDa 독소에 대하여 서열 상동성을 갖는 DNA 제한효소 단편의 크기를 보여주는, 이러한 실험들로부터 얻은 RFLP 데이터를 표 7에 나타내었다.
표준 조건하에서 약 800bp PS80JJ1 44.3kDa 독소 서브유전자 프로브와 혼성화한 서던 블롯 상의 PS80JJ1, PS149B1, 및 PS167H2 세포 DNA 단편들의 RFLP
균주
PS80JJ1 PS149B1 PS167H2
제한효소 대략적인 단편 크기(kbp)
EcoRI 6.4 5.7 2.6
1.3 2.8
0.6
HindIII 8.2 6.2 4.4
KpnI 7.8 10.0 11.5
PstI 12.0 9.2 9.2
8.2
XbaI 9.4 10.9 10.9
SacI 17.5 15.5 11.1
13.1 10.5 6.3
상기 세 가지 균주 각각은 독특한 RFLP 패턴을 시현하였다. PS149B1 또는 PS167H2 유래의 혼성화하는 DNA 단편은 PS80JJ1 44.3kDa 독소에 대하여 서열 상동성을 갖는 독소 유전자의 전체 또는 일부를 포함한다.
표준 조건하에서 PS80JJ1 14kDa 독소 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화한 서던 블롯 상의 PS80JJ1, PS149B1, 및 PS167H2 세포 DNA 단편들의 RFLP
균주
PS80JJ1 PS149B1 PS167H2
제한효소 대략적인 단편 크기(kbp)
EcoRI 5.6 2.7 2.7
HindIII 7.1 6.0 4.7
XbaI 8.4 11.2 11.2
상기 세 가지 균주 각각은 독특한 RFLP 패턴을 시현하였다. PS149B1 또는PS167H2 유래의 혼성화하는 DNA 단편은 PS80JJ1 14kDa 독소에 대하여 서열 상동성을 갖는 독소 유전자의 전체 또는 일부를 포함한다.
PS149B1 또는 PS167H2 내의 독소 유전자의 일부를 PS80JJ1 44.3kDa 독소 유전자 서열에 근거하여 고안된 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. PS149B1의 경우에는 하기의 프라이머 쌍이 사용되었다:
정방향:
5'-ATG YTW GAT ACW AAT AAA GTW TAT GAA AT-3'(서열 8)
역방향:
5'-GGA TTA TCT ATC TCT GAG TGT TCT TG-3'(서열 9)
PS167H2의 경우에도 동일한 프라이머 쌍이 사용되었다. PCR로부터 얻은 단편들을 ABI373 자동 서열 분석 시스템 및 관련 소프트웨어를 사용하여 서열분석 하였다. 이로부터 얻은 부분적인 유전자 및 펩티드 서열들을 서열 12-15에 도시하였다. 이들 서열은B.t. 균주 PS149B1 또는 PS167H2 내에 있는 신규의 옥수수 뿌리벌레-활성 독소에 대한 뉴클레오티드 코딩 서열 및 펩티드 서열의 일부를 포함한다.
실시예 11 - 바실러스 슈린지엔시스 균주 PS149B1 및 PS167H2 유래의 신규 δ-내독소 유전자의 클로닝 및 DNA 서열 분석
PS80JJ1의 경우와 마찬가지로, PS149B1 및 PS167H2로부터 총 세포 DNA를 추출하였다. 전술한 바와 같이, 각 균주마다 크기별로 분획된Sau3A 부분적 제한효소 단편들의 유전자 라이브러리를 Lambda-Gem11 내에 제조하였다. 재조합 파아지를 패키징하여이.콜라이KW251 세포 상에 도말하였다. 플라크들을 44kDa 독소 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 혼성화에 의해 검색하였다. 혼성화하는 파아지들을 플라크-정제하여, 표준 방법(Maniatiset al.,supra)에 의한 DNA 분리를 위한 목적으로이.콜라이KW251 세포의 액상 배양균을 감염시키는데 사용하였다.
PS167H2의 경우, 서던 블롯 분석 결과, 재조합 파아지 분리주 중 하나가 PS80JJ1 44kDa 독소 유전자 5' 올리고뉴클레오티드 프로브(서열 8)와 혼성화하는 약 4.0 내지 4.4kbpHindIII 밴드를 포함하고 있음이 밝혀졌다. 이 DNA 제한효소 단편을 서열분석을 위해 표준방법에 따라 pBluescript S/K(Stratagene, San Diego, CA) 내로 서브클로닝하였다. 상기 단편은 또한바실러스 슈린지엔시스내에서의 발현 분석(하기 참조)을 위해, 높은 카피수의 셔틀 벡터인 pHT370(Arantes, O., D. Lereclus [1991]Gene108:115-119) 내로 서브클로닝 되었다. 이로부터 얻은 높은 카피수의 두 가지 기능을 가진 재조합 플라스미드를 'pMYC2427'이라 명명하였다.
pMYC2427에 의해 코딩되는 PS167H2 독소 유전자를 ABI 자동 서열 분석 시스템 및 관련 소프트웨어를 사용하여 서열분석하였다. 전사해독프레임 및 측접하는 서열을 포함하는 전체 유전자좌의 서열이 서열 34에 도시되어 있다. 14kDa 독소 유전자의 종지 코돈은 44kDa 독소 유전자의 개시 코돈으로부터 107bp 상류(5')에 있다. PS167H2 14kDa 독소 코딩 서열(서열 35), 44kDa 독소 코딩 서열(서열 37)및 각각의 유추된 아미노산 서열(서열 36 및 서열 38)들은 살충성 단백질을 코딩하는 다른 공지의 독소 유전자와 비교하여 신규하다. 상기 독소 유전자들은 PS80JJ1의 14kDa 및 44kDa 독소와 유사한 방식으로 배열되어 있으며, 약간의 서열 상동성을 갖는다.
플라스미드 pMYC2427을 포함하는이.콜라이NM522의 계대배양주를 농업 연구 배양균 기탁소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)의 영구적인 콜렉션(permanent collection)에 1997년 3월 26일자로 기탁하였다. 수탁번호는 NRRL B-21672이다.
PS149B1의 경우, PS80JJ1 44kDa 올리고뉴클레오티드 5' 프로브(서열 8)를 사용한 서던 블롯 분석 결과, 약 5.9kbpClaI DNA 단편의 혼성화가 관찰되었다. PS149B1 게놈 DNA의 완전한ClaI 절단물(digests)을 아가로오스 겔 상에서 크기별로 분리하고, pHTBlueII 내에 클로닝하였다. 상기 단편은 또한바실러스 슈린지엔시스내에서의 발현 분석을 위해, 높은 카피수의 셔틀 벡터인 pHT370(Arantes, O., D. Lereclus [1991]Gene108:115-119) 내로 서브클로닝 되었다. 이로부터 얻은 높은 카피수의 두 가지 기능을 가진 재조합 플라스미드를 'pMYC2429'라 명명하였다.
pMYC2429에 의해 코딩되는 PS149B1 독소 유전자를 ABI 자동 서열 분석 시스템 및 관련 소프트웨어를 사용하여 서열분석하였다. 전사해독프레임 및 측접하는 서열을 포함하는 전체 유전자좌의 서열이 서열 39에 도시되어 있다. 14kDa 독소유전자의 종지 코돈은 44kDa 독소 유전자의 개시 코돈으로부터 108bp 상류(5')에 있다. PS149B1 14kDa 독소 코딩 서열(서열 40), 44kDa 독소 코딩 서열(서열 42) 및 각각의 유추된 아미노산 서열(서열 41 및 서열 43)들은 살충성 단백질을 코딩하는 다른 공지의 독소 유전자와 비교하여 신규하다. 상기 독소 유전자들은 PS80JJ1 및 PS167H2의 14kDa 및 44kDa 독소와 유사한 방식으로 배열되어 있으며, 약간의 서열 상동성을 갖는다. 이들 세 가지 독소 오페론은 살충성 독소의 새로운 패밀리를 이룬다.
플라스미드 pMYC2429를 포함하는이.콜라이NM522의 계대배양주를 농업 연구 배양균 기탁소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)의 영구적인 콜렉션(permanent collection)에 1997년 3월 26일자로 기탁하였다. 수탁번호는 NRRL B-21673이다.
실시예 12 - 신규의 옥수수 뿌리벌레-활성 독소의 동정 및 클로닝을 위한 PCR 증폭
PS80JJ1, PS149B1 및 PS167H2 유래의 세 가지 신규한 약 45kDa 옥수수 뿌리벌레-활성 독소들의 DNA 및 펩티드 서열들(서열 12-15)을 갭 웨이트(gap weight) 3.00 및 갭 렝쓰 웨이트(gap length weight) 0.10을 사용하는 Genetics Computer Group 서열 분석 프로그램 Pielup으로 정렬시켰다. 상기 서열 정렬은 이들 신규한 독소 패밀리의 일원을 코딩하는 유전자와 혼성화할 것 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안할 때 기준이 된 보존적 펩티드 서열을 동정하는데 사용되었다. 그러한 프라이머들은 이들 독소 유전자 및 연관된 독소 유전자 진단용의 DNA 단편들을 증폭하기 위한 PCR에 사용될 수 있다. 다양한 서열에 대하여 다수의 프라이머 고안이 가능하며, 그들 중 넷을 예를 들기 위해 본원에 기술한다. 이들 펩티드 서열은 다음과 같다:
Asp-Ile-Asp-Asp-Tyr-Asn-Leu(서열 16)
Trp-Phe-Leu-Phe-Pro-Ile-Asp(서열 17)
Gln-Ile-Lys-Thr-Thr-Pro-Tyr-Tyr(서열 18)
Tyr-Glu-Trp-Gly-Thr-Glu(서열 19)
상응하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
5'-GATATWGATGAYTAYAAYTTR-3'(서열 20)
5'-TGGTTTTTRTTTCCWATWGAY-3'(서열 21)
5'-CAAATHAAAACWACWCCATATTAT-3'(서열 22)
5'-TAYGARTGGGGHACAGAA-3'(서열 23)
PCR용 정방향 프라이머는 서열 20 및 21에 근거하여 고안되었다.
역방향 프라이머는 서열 22 및 23의 역방향 상보체에 근거하여 고안되었다:
5'-ATAATATGGWGTWGTTTTDATTTG-3'(서열 24)
5'-TTCTGTDCCCCAYTCRTA-3'(서열 25)
이들 프라이머는 신규한 옥수수 뿌리벌레-활성 독소를 코딩하는 유전자를 동정하는 다음과 같은 크기(참조: 표 8)를 가진 DNA 단편들을 증폭하기 위해 조합하여 사용될 수 있다.
신규한 옥수수 뿌리벌레-활성 독소에 특이적인 프라이머들로 증폭가능한 진단용 DNA 단편들의 예상 크기(bp)
프라이머 쌍(서열 번호) DNA 단편 크기(bp)
20+24 495
20+25 594
21+24 471
21+25 580
유사하게, 전사해독프레임에 측접한 DNA 서열에 근거하여 고안된 프라이머를 사용하는 PCR 반응에 의해 신규한 옥수수 뿌리벌레-활성 독소를 코딩하는 전체 유전자를 분리할 수 있다. PS80JJ1 44.3kDa 독소의 경우, 그러한 프라이머를 고안하여 합성한 후, 전체 독소 코딩 서열을 포함하는 진단용 1613bp DNA 단편을 증폭하는데 사용하였다. 이들 프라이머는 다음과 같다:
정방향: 5'-CTCAAAGCGGATCAGGAG-3'(서열 26)
역방향: 5'-GAGTATTCGGATATGCTTGG-3'(서열 27)
PS80JJ1 14kDa 독소를 PCR 증폭하는 경우, N-말단 펩티드 서열(서열 29)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드가 PS80JJ1 독소 유전자좌 내의 서열에 근거한 다양한 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머와 조합하여 사용될 수 있다. 그러한 역방향 프라이머 중 하나는 다음과 같은 서열을 가지고 있다:
5'-CATGAGATTTATCTCCTGATCCGC-3'(서열 33).
표준 PCR 반응에 사용될 때, 이러한 프라이머 쌍은 전체 14kDa 독소 코딩 서열, 및 121bp 크기의 유전자간 스페이서(intergenic spacer) 및 44.3kDa 독소 유전자의 일부에 해당하는 약간의 3' 측접 서열들을 포함하는 진단용 1390bp DNA 단편을 증폭시킨다. 14kDa 정방향 프라이머와 조합하여 사용될 때, PCR은 진단용 322bp DNA 단편을 생산할 것이다.
실시예 13 - 클론 처리량-의존성 바이오어세이
PS149B1 및 PS167H2로부터 클론된 재조합 독소들과 생활성을 직접적으로 비교해 보고자, PS80JJ1 독소 오페론을 pMYC2421로부터 pHT370 내로 서브클로닝하엿다. 이로부터 얻어진 높은 카피수의 두 가지 기능을 가진 재조합 플라스미드를 'pMYC2426'이라 명명하였다.
플라스미드 pMYC2426을 포함하는이.콜라이NM522의 계대배양주를 농업 연구 배양균 기탁소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)의 영구적인 콜렉션(permanent collection)에 1997년 3월 26일자로 기탁하였다. 수탁번호는 NRRL B-21671이다.
B.t. 내에서의 PS80JJ1, PS149B1 및 PS167H2 독소 유전자의 발현을 시험하기 위해, 일렉트로포레이션(electroporation)으로 pMYC2426, pMYC2427 및 pMYC2429를 각각 무결정성(Cry-)B.t. 숙주 CryB(A. Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN)내로 형질변환시켰다. 상기 재조합 균주들은 각각 MR543(CryB [pMYC2426]), MR544(CryB [pMYC2427]) 및 MR546(CryB [pMYC2429])라 명명되었다. 각 재조합 균주별 SDS-PAGE 분석 결과, 약 14kDa 및 44kDa 독소 양자의 발현이 확인되었다.
상기 재조합 균주로부터의 독소 결정 제조물을 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대하여 검정하였다. 그들의 식이는 소르빈산(sorbic acid) 및 SIGMA pen-strep-ampho-B로 보충되었다. 상기 물질을 ㎠ 식이 표면적당 현탁액 50㎕의 비율로 탑-로딩하였다. 바이오어세이는 신생 웨스턴 옥수수 뿌리벌레 유충을 사용하여 약 25℃에서 4일 동안 수행되었다. 상기 클론들(펠렛들)에 대한 % 치사율 및 탑-로드 LC50평가결과를 표 9에 나타내었다. dH2O 대조구는 7%의 치사율을 나타내었다.
주어진 단백질 농도에서의 % 치사율(㎍/㎠)
시료 50㎍/㎠ 5㎍/㎠ 0.5㎍/㎠
MR543 펠렛 44% 19% 9%
MR544 펠렛 72% 32% 21%
MR546 펠렛 52% 32% 21%
결정 제조물 내에 존재하는 14kDa 및 44.3kDa 단백질의 양을 농도계측법(densitometry)으로 측정하여, LC50로 표현되는 특이적 활성을 계산하는데 사용하였다. 상기 클론들(펠렛들)에 대한 LC50평가결과를 표 10에 나타내었다(B.t. 클론의 WCRW 탑-로드 바이오어세이).
B.t. 클론의 WCRW 탑-로드 바이오어세이
B.t. 클론 B.t. 모균주 LC50(㎍/㎠)* 95% CL 경사도
MR543 PS80JJ1 37 17-366* 0.79
MR544 PS167H2 10 6-14 1.6
MR546 PS149B1 8 4-12 1.5
N/A CryB 세포 블랭크 4% N/A N/A
N/A 물 블랭크 4% N/A N/A
*대조구에 대해서는 가장 높은 처리량에서의 % 치사율이 제공된다.
* *90% CL
실시예 14 - PS80JJ1 이원성 독소 오페론 내의 14kDa 및 44kDa 폴리펩티드의 돌연변이 분석
전형적으로 본 발명의 이원성(binary) 독소 유전자는 야생형 상태에서 14kDa 단백질 유전자가 먼저 전사된 후 45kDa 단백질 유전자가 전사되는 한 오페론 내에 있다. 이들 유전자는 비교적 짧은 비코딩 영역(non-coding region)에 의해 분리되어 있다. 대표적인 ORF들을 서열 30, 서열 34 및 서열 39에 도시하였다.
14kDa 및 44.3kDa 결정성 단백질 각각의 옥수수 뿌리벌레-활성에 대한 기여도를 조사하기 위해, 별개의 실험에서 PS80JJ1 오페론 내의 각 유전자를 어느 한 단백질이 발현되지 않도록 변이시켰다. 이어서, 완전한 유전자를B.t. 내에서 발현시킨 다음, 재조합 단백질의 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성을 시험하였다.
우선, pMYC2421 상에서 코딩되는 44.3kDa 유전자를 전사해독프레임의 387번 염기 위치에 있는EcoRI 부위에서 절두(truncation)하여 변이시켰다. 이러한 절두 및 뒤이은 다양한 서열과의 리게이션은 약 24kDa의 가정적인 융합 단백질을 코딩하는 전사해독프레임을 생성하였다. 이로부터 얻어진, 완전한 14kDa 유전자 및 절두된 45kDa 유전자를 코딩하는 오페론을바실러스 슈린지엔시스내에서의 발현 분석을 위해 높은 카피수의 셔틀 벡터인 pHT370(Arantes, O., D. Lereclus [1991] Gene108:115-119) 내로 서브클로닝 하였다. 이로부터 얻은 플라스미드 pMYC2424를 일렉트로포레이션(electroporation)으로 무결정성(Cry-)B.t. 숙주 CryB(A. Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN)내로 형질변환시켰다. 결과되는 재조합 균주를 'MR541'이라 명명하였다. 포자화된 MR541 배양균을 SDS-PAGE 분석한 결과, 오로지 14kDa PS80JJ1 단백질만이 검출되었다. 옥수수 뿌리벌레에 대한 탑-로드 바이오어세이에서 오로지 14kDa PS80JJ1 단백질만을 발현하는 MR541의 제조물에서는 치사가 관찰되지 않았다.
다음으로, pMYC2421 상에서 코딩되는 14kDa 유전자를, 모든 가능한 해독프레임 내의 종지 코돈들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 링커를 전사해독프레임의 11번 염기 위치에 있는Nrul부위에 삽입함으로써 변이시켰다. 이러한 링커의 서열은 5'-TGAGTAACTAGATCTATTCAATTA-3'이다. 상기 링커는BglII 제한효소 처리에 의한 삽입 여부의 확인을 위해BglII 부위를 도입한다. 상기 돌연변이유발성(mutagenic) 링커를 포함하는 플라스미드 클론들은BglII로 동정되고, 확인을 위해 서열분석되었다. 14kDa 난센스 돌연변이(nonsense mutation)를 코딩하는 오페론 삽입편을 pHT370 내로 서브클로닝하여, 플라스미드 pMYC2425를 얻었다. 이 플라스미드를 일렉트로포레이션에 의해 CryB 내로 형질변환시켜, 재조합B.t. 균주 MR542를 얻었다. SDS-PAGE 분석에서 확인된 바와 같이, MR542의 포자화된 배양균 내에서는 오로지 44.3kDa PS80JJ1 단백질만이 발현되었다. 44.3kDa PS80JJ1 단백질만을 발현하는 MR542의 제조물에서는 옥수수 뿌리벌레의 치사가 관찰되지 않았다.
실시예 15 - 슈도모나스 플루오레슨스 내에서의 PS149B1 유래 14 및 44.3kDa 폴리펩티드의 단일 유전자 비정형(heterologous) 발현, 정제 및 바이오어세이
PS149B1 유래의 14kDa 및 44.3kDa 폴리펩티드 유전자를 각각 표준 DNA 클로닝 방법에 의해 플라스미드 벡터 내로 개별적으로 클로닝한 후,슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 내로 형질변환시켰다. PS149B1 14kDa 유전자만을 발현하는 재조합슈도모나스 플루오레슨스균주는 'MR1253'이라 명명되었다. PS149B1 44.3kDa 유전자만을 발현하는 재조합슈도모나스 플루오레슨스균주는 'MR1256'이라 명명되었다.
각자 두 개의 이원성 단백질 중 하나만을 발현하는 MR1253 및 MR1256을 1L 발효조에서 배양하였다. 각 배양균의 일부를 원심분리로 펠렛화하고, 리소자임으로 용균시킨 다음, DNAse I으로 처리하여 반정제된(semi-pure) 단백질 봉입체를 얻었다. 상기 봉입체를 4℃에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 50mM 시트르산 나트륨(pH 3.3)에 용해시켰다. 14kDa 단백질은 이 완충액에 쉽게 용해되는 반면, 44.3kDa 단백질은 일부만 용해되었다. 용해된 분획을 15,000g×g에서 20분 동안 원심분리한 후, 상등액을 보존하였다.
상기 14kDa 단백질은 이온-교환 크로마토그래피로 더 정제되었다. 즉, 용해된 14kDa 단백질을 Econo-S 컬럼에 결합시킨 후, 0-1M의 염화나트륨 농도구배로 용출시켰다.
크로마토그래로 정제된 순수한 MR1253(14kDa 단백질) 및 시트르산 나트륨(pH3.3)에 용해된 MR1256(45kDa 단백질) 제조물을 개별적으로 또는 1:10(45kDa 단백질:14kDa 단백질)의 몰비로 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성을 시험하였다. 각각의 단백질 단독에 대하여 관찰된 치사율은 기본 수준(물/대조구 시료의)을 넘지 않았으나, 그들을 상기 비율로 혼합하여 사용한 경우에는 87%의 치사율이 관찰되었다(참조: 표 11).
몰비(45kDa:14kDa) 로딩 부피 ㎍ 45kDa/웰 ㎍ 14kDa/웰 총 ㎍ 단백질 CRW 치사율
0:1 100㎕ 0 260 260 13
1:0 200㎕ 260 0 260 9
1:10 100㎕ 65 195 260 87
물 100㎕ 0 0 0 11
실시예 16 - 총 B . t . 게놈 DNA의 혼성화 및 RFLP에 의한 추가적인 신규 14kDa 및 44.3kDa 독소 유전자의 동정
각 분리주로부터의 총 게놈 DNA를 Qiagen DNEasy 96웰 조직 킷트를 사용하여 제조하였다. 96-웰 플레이트 내의 DNA는 블롯팅하기에 앞서 각 DNA 시료 10㎕와 4M NaOH 10㎕를 멸균된 증류수 80㎕에 가함으로써 변성되었다. 시료들을 70℃에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 20×SSC 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 94개 시료로 이루어진 각 셋트마다 PS149B1 총 게놈 DNA를 양성 혼성화 대조구로서, cryB- 총 게놈 DNA를 음성 혼성화 대조구로서 포함시켰다. 96개 시료로 이루어진 각 셋트를 2개의 48웰 슬롯 블롯 매니폴드(Hoefer Scientific)를 사용하여 Magnacharge 나일론 막 상으로 옮기고, 10×SSC로 2회 세척하였다. 상기 나일론 막을 80℃에서 1시간 동안 구운 후, 사용할 때까지 건조한 상태로 보관하였다. 막을 42℃에서 표준 포름아미드 용액(50% 포름아미드, 5×SSPE, 5×덴하르트 용액, 2% SDS, 100㎍/㎖ 단일가닥 DNA) 내에서 전혼성화 및 혼성화시켰다. 막을 다음의 두 가지 조건하에서 세척하였다: 2×SSC/0.1% SDS, 42℃(낮은 가혹도), 0.2×SSC/0.1% SDS, 65℃(중간 내지 높은 가혹도). 정방향 프라이머 서열 8과 5'-GTAGAAGCAGAACAAGAAGGTATT-3'의 서열을 가지고 있는 역방향 프라이머(서열 46)를 사용하여 pMYC2429로부터 증폭된 PS149B1 44.3kDa 유전자의 약 1.3kbp PCR 단편으로 상기 막을 프로브화하였다. 상기프로브는 Prime-it II 킷트(Stratagene) 및32P-dCTP를 사용하여 방사성 표지하고, Sephadex 컬럼 상에서 정제한 후 94℃에서 변성시켜 신선한 혼성화 용액에 첨가되었다. 상기 PS149B1 프로브에 상동성을 가진 유전자를 포함하고 있는 균주는 상기 막을 X-선 필름에 노출시킴으로써 동정되었다.
다음 균주들이 양성 혼성화 반응에 의해 동정되었다: PS184M2, PS185GG, PS187G1, PS187Y2, PS201G, PS201HH2, PS242K10, PS69Q, KB54A1-6, KR136, KR589, PS185L12, PS185W3, PS185Z11, PS186L9, PS187L14, PS186FF, PS131W2, PS147U2, PS158T3, PS158X10, PS185FF, PS187F3, PS198H3, PS201H2, PS201L3, PS203G2, PS203J1, PS204C3, PS204G4, PS204I11, PS204J7, PS210B, PS213E8, PS223L2, PS224F2, PS236B6, PS246P42, PS247C16, KR200, KR331, KR625, KR707, KR959, KR1209, KR1369, KB2C-4, KB10H-5, KB456, KB42C17-13, KB45A43-3, KB54A33-1, KB58A10-3, KB59A54-4, KB59A54-5, KB53B7-8, KB53B7-2, KB60F5-7, KB60F5-11,KB59A58-4, KB60F5-15, KB61A18-1, KB65A15-2, KB65A15-3, KB65A15-7, KB65A15-8, KB65A15-12, KB65A14-1, KB3F-3, T25, KB53A71-6, KB65A11-2, KB68B57-1, KB63A5-3, 및 KB71A118-6.
총 게놈 DNA 제조물 내의 신규한 독소 유전자의 추가적인 동정 및 분류는 본 실시예에서 상술한32P-표지 프로브 및 혼성화 조건을 사용하여 수행되었다. 총 게놈 DNA는 상술한 바와 같이 제조되거나, 또는 Qiagen Genomic-Tip 20/G를 사용하여 제조되었으며, 그람 양성 세균용 프로토콜에 따른 Genomic DNA Buffer Set(Qiagen Inc.; Valencia, CA)가 서던 분석에 사용되었다. 서던 블롯을 위해, 슬롯 블롯 분석에 의해 동정된 각 균주로부터의 총 게놈 DNA 약 1-2㎍을DraI 및NdeI 효소로 처리하고, 0.8% 아가로오스 겔 상에서 전기영동한 다음, 표준 방법(Maniatiset al.)에 따라 지지된 나일론 막 상에 고정시켰다. 혼성화 후에, 막을 낮은 가혹도 조건(2×SSC/0.1% SDS, 42℃) 하에서 세척하고 필름에 노출시켰다. DNA 단편 크기를 BioRad Chemidoc system 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 사용하여 44kDa 독소를 코딩하는 유전자들을 (임의로) 분류하였다. 이러한 분류를 표 12에 나타내었다.
RFLP 클래스(45 & 14kDa) 분리주명
A 149B1
A' KR331, KR1209, KR1369
B 167H2, 242K10
C 184M2, 201G, 201HH2
D 185GG, 187Y2, 185FF1, 187F3
E 187G1
F 80JJ1, 186FF, 246P42
G 69Q
H KB54A1-6
I KR136
J KR589
K 185L12, 185W3, 185Z11, 186L9, 187L14
L 147U2, 210B, KB10H-5, KB58A10-3, KB59A54-4, KB59A54-5, KB59A58-4, KB65A14-1
M 158T3, 158X10
N 201H2, 201L3, 203G2, 203J1, 204C3, 204G4, 204I11, 204J7, 236B6
P 223L2, 224F2
P' 247C16, KB45A43-3, KB53B7-8, KB53B7-2, KB61A18-1, KB3F-3, KB53A71-6, KB65A11-2, KB68B57-1, KB63A5-3, KB71A118-6
Q 213E8, KB60F5-11, KB60F5-15
R KR959
S KB2C-4, KB46, KB42C17-13
T KB54A33-1, KB60F5-7
U T25
V KB65A15-2, KB65A15-3, KB65A15-7, KB65A15-8, KB65A15-12
실시예 17 - 추가적인 이원성 독소 유전자의 DNA 서열분석
상술한 149B1 PCR 산물과의 혼성화에 의해 동정된B.t. 균주 유래의 14 및 44.3kDa 유전자의 전체 또는 일부를 증폭하기 위해 변성 올리고뉴클레오티드(degenerate oligonucleotides)가 사용되었다. 상기 올리고뉴클레오티드는 PS149B1, PS167H2 및 PS80JJ1 유래의 14kDa 또는 44.3kDa 유전자들의 정렬(alignment)에 의해 확인된 보존적 서열 블록에 대해 고안되었다. 두 유전자에 대한 정방향 프라이머는 ATG 개시 코돈에서 시작되도록 고안되었다. 역방향 프라이머는 각 유전자의 3' 말단에 가능한 가깝게 고안되었다.
14kDa 유전자를 증폭하기 위해 고안된 프라이머는 다음과 같다:
149DEG1(정방향): 5'-ATG TCA GCW CGY GAA GTW CAY ATT G-3'(서열 47)
149DEG2(역방향): 5'-GTY TGA ATH GTA TAH GTH ACA TG-3'(서열 48)
이들 프라이머는 약 340bp 크기의 산물을 증폭시킨다.
44.3kDa 유전자를 증폭하기 위해 고안된 프라이머는 다음과 같다:
149DEG3(정방향): 5'-ATG TTA GAT ACW AAT AAA RTW TAT G-3'(서열 49)
149DEG4(역방향): 5'-GTW ATT TCT TCW ACT TCT TCA TAH GAA G-3'(서열 50)
이들 프라이머는 약 1,100bp 크기의 산물을 증폭시킨다.
유전자 산물을 증폭시키기 위해 사용된 PCR 조건은 다음과 같다:
95℃, 1분, 1주기
95℃, 1분
50℃, 2분, 35주기 반복
72℃, 2분
72℃, 10분, 1주기
PCR 산물은 1% 아가로오스 겔 상에서 분리되었으며, Qiaexll 킷트(Qiagen)를 사용하여 겔로부터 정제되었다. 이로부터 얻은 정제된 단편을 TOPO TA 클로닝 킷트(Invitrogen)를 사용하여 pCR-TOPO 클로닝 벡터 내로 리게이션시켰다. 리게이션 후에, 리게이션 반응물의 절반을 XL10 Gold Ultracompetent 세포(Stratagene) 내로 형질변환시켰다. 형질변환주들을 벡터 프라이머 1212 및 1233을 사용해 PCR로 검색하였다. Qiagen 플라스미드 DNA 미니프렙 킷트(Qiagen)를 사용하여 플라스미드를 제조하기 위해, 삽입편을 포함하고 있는 클론들을LB/카르베니실린(carbenicillin) 배지 상에서 배양하였다. 이어서, 클로닝된 PCR-유래 단편들을 Applied Biosystems의 자동 서열 분석 시스템 및 관련 소프트웨어를 사용하여 서열분석 하였다. PS80JJ1 및 PS149B1 유래의 홀로타입(holotype) 14 및 44.3kDa 독소와 연관된 추가적인 신규 이원성 독소 유전자 및 폴리펩티드의 서열이 서열 51-126에 도시되어 있다. 상기 "서열의 간단한 설명" 항목에 이들 서열에 대한 추가적인 설명이 기술되어 있다.
세 개의 추가적인B.t. 균주 PS137A, PS201V2 및 PS207C3 유래의 14kDa형 독소 및 유전자 역시 상기와 동일한 방법에 따라(하기에 표시된 차이점을 제외하고) 서열분석 되었다. 149DEG1(정방향) 및 149DEG2(역방향) 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이들 프라이머는 약 340bp의 산물을 증폭시킨다. PCR은 하기의 조건으로 수행되었다:
1. 95℃, 3분
2. 94℃, 1분
3. 42℃, 2분
4. 72℃, 3분 + 5초/주기
5. 2 내지 4 단계를 29회 반복
PCR 산물을 QiaQuick gel extraction 킷트(Qiagen)를 사용하여 겔로부터 정제하고, 정제된 단편을 TOPO TA 클로닝 킷트(Invitrogen)를 사용하여 pCR-TOPO 클로닝 벡터 내로 리게이션시킨 다음, XL10 Gold Ultracompetent이.콜라이세포(Stratagene) 내로 형질변환시켰다. 형질변환 DNA의 제조는 상술한 바와 같다. 세 가지 새로운 균주 각각의 14kDa 독소 유전자의 서열 역시 상기와 같은 방법으로 분석되었다. 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 다음과 같이 첨부된 서열목록에 제공된다: PS137A(서열 149 및 150), PS201V2(서열 151 및 152), 및 PS207C3(서열 153 및 154).
실시예 18 - PS149B1 독소 트란스젠(transgene) 및 식물 형질변환
14 및 44.3kDa 독소 양자에 대하여 각각 옥수수 코돈 활용도(codon usage)에 맞추어 최적화된 합성 트란스젠을 고안하였다. 상기 합성 트란스젠은 구아닌 및 시토신 코돈 바이어스(codon bias)를 식물 DNA에서 보다 전형적인 수준으로 변경하도록 고안되었다. 식물용으로 최적화된 바람직한 트란스젠이 서열 127-128에 도시되어 있다. 상기 두 가지 트란스젠 양자의 발현용으로 사용된 프로모터 영역은지아 메이스(Zea mays) 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 +지.메이스엑손 1 및지.메이스인트론 1(Christensen, A.H.et al. (1992)Plant Mol. Biol.18:675-689)이다. 두 트란스젠에 사용된 전사 종결자는 감자 프로테인아제 저해자 II(proteinase inhibitor II, "PinII") 종결자(An, G.et al. (1989) Plant Cell 1:115-22)이다.
포스피노트리신 아세틸트란스퍼라아제(phosphinothricin acetyltransferase, "PAT")가 식물 형질변환의 선별 마커로 사용되었다. 포스피노트리신 아세틸트란스퍼라아제 유전자(pat)는스트렙토마이세스 비리도크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터 분리되었다(Eckes P.et al., 1989). PAT 단백질은 포스피노트리신 또는 그의 전구체인 탈메틸포스피노트리신(demethylphosphinothricin)을 아세틸화하여, 제초제인 글루포시네이트-암모늄(glufosinate-ammonium)과 같은 화학적으로 합성된 포스피노트리신에 대한 내성을 부여한다. 아세틸화는 포스피노트리신을 옥수수 나무에 대하여 더 이상 독성을 갖지 않는 불활성형으로 변환시킨다. 글루포시네이트 암모늄은 광범위한 스펙트럼을 가진 비-전신성(non-systemic), 비-선택적(non-selective) 제초제이다. 글루포시네이트 암모늄 제초제에 대하여 내성을 가진 재생된 옥수수 조직 또는 개개의 옥수수 나무는 PAT를 재생 배지에 첨가함으로써 또는 상기 제초제를 잎에 분무함으로써 쉽게 동정될 수 있다.
합성pat유전자는 구아닌 및 시토신 코돈 바이어스를 식물 DNA에서 보다 전형적인 수준으로 변경하도록 생산되었다.pat유전자용 프로모터는 콜리플라워 모자이크 바이러스 유래의 35S 전사체의 CaMV 프로모터(Pietrzaket al., 1986)이다. 전사 종결자는 CaMV 35S 종결자이다.
옥수수 조직의 형질변환을 위하여, PS149B1 14kDa, 44.3kDa 및pat선별마커 코딩 서열과 발현에 필요한 조절인자를 포함하는 선형 DNA 영역을 완전한 플라스미드로부터 절단해내었다. 이러한 선형 DNA 영역은 '삽입편(insert)'이라 불리우며, 형질변환 과정에 사용되었다.
PS149B1 14kDa 및 44.3kDa 트란스젠을 포함하는 옥수수 식물은, 기본적으로는 Kleinet al.(1987)에 기술된 바와 같이, Bio-Rad 社가 제조한 Biolistics?OPDS-100He 파티클 건(particle gun)을 사용하여 마이크로젝타일 충격(microjectile bombardment)에 의해 수득되었다. 수분한 후 약 15일째에 수확된 옥수수 열매로부터 얻은 미숙한 배(embryos)를 칼루스 개시 배지(callus initiation medium)에서 3 내지 8일 동안 배양하였다. 형질변환일에, 초미세 텅스텐 입자를 정제된 DNA로 코팅하고 배양된 배 내로 가속화시켜, 삽입편 DNA가 세포 염색체 내에 삽입되도록 하였다. 충격 후 6일째에, 충격을 받은 배를 선별제로서 글루포시네이트(Bialaphos)를 함유하는 칼루스 개시 배지로 옮겼다. 건강한 저항성 칼루스 조직을 수득하여, 약 12주 동안 신선한 선별 배지로 반복적으로 옮겨 주었다. 식물이 재생되었으며, 이를 온실로 옮겼다. 총 436개의 식물체가 얻어졌다. PCR로 트란스젠의 존재를 확인하고 ELISA로 외인성 단백질의 발현을 확인하는 분자수준의 분석을 행하고자 잎 견본을 취하였다. 이어서, 웨스턴 옥수수 뿌리벌레를 사용하여 전체 식물 바이오어세이를 행하였다. 양성 식물체를 근친 교배시켜, 최초 형질전환 식물체의 종자를 수득하였다. 이들 식물체는 온실 및 들판에서 옥수수 뿌리벌레에 의한 손상에 내성을 지니고 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 19 - 추가 바이오어세이
실시예 16에서 동정된 균주로부터 얻은 단백질 제조물의 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성을 실시예 13에 기술된 기본적인 탑-로드 어세이법으로 검정하였다. 그 결과를 표 13에 나타내었다.
균주 LC50(㎍/㎠) 95% Cl
KB45A43-3 9.48 6.58-15.27
213'E'8 10.24 7.50-19.87
KR707 11.17 8.27-22.54#
185GG 11.53 7.51-16.81
187Y2 13.82 11.08-17.67
149B1 14.77 4.91-27.34
69Q 27.52 117.28-114.77#
167H2 31.38 19.35-47.60
KB54A33-10 32.62 24.76-83.85
185Z11 34.47 ND
KB60F5-7 34.67 19.15-124.29
242K10 34.73 21.08-58.25
201G 34.90 13.20-355.18#
204J7 38.57 29.83-48.82
KB60F5-15 38.62 15.00-2.59E03
80JJ1 41.96 27.35-139.43
203J1 43.85 23.18-69.51
KR589 47.28 29.83-230.71#
201HH2 49.94 23.83-351.77
KB60F5-11 51.84 19.38-1313.75#
158X10 52.25 43.13-77.84#
KB58A10-3 53.77 ND
201L3 55.01 41.01-78.96
158T3 58.07 39.59-211.13
184M2 60.54 26.57-411.88
204G4 69.09 52.32-93.83
KB59A58-4 70.35 48.90-144.90
201H2 71.11 52.40-130.35
203G2 81.93 57.13-226.33
KB59A54-4 82.03 38.50-1.63E03
204I11 88.41 62.48-173.07
236B6 89.33 64.16-158.96
KR1369 93.25 71.97-205.04#
KB63A5-3 94.52 51.56-542.46
204C3 125.45 85.26-427.67#
KR1209 128.14 91.57-294.56
185W3 130.61 ND
KR625 160.36 ND
210B 201.26 48.51-0.14E+O6#
KB10H-5 214.25 87.97-8.22E+03
KB68B57-1 264.30 48.51-8.95E+04#
223L2 3.81E+02 ND
KR136 7.83E+02 -
T25 1.30E+03 ND
KB61A18-1 2.58E+03 ND
147U2 3.67E+03 ND
KR200 2.14E+05 ND
KB59A54-5 3.32E+05 ND
KB3F-3 4.07E+05 ND
187G1(bs) 3.50E+07 ND
MR559 20%** n/a
KB42C17-13 26%** n/a
224F2 33%** n/a
KR959 41%** n/a
KB2C-4 42%** n/a
198H3 46%** n/a
KR331 47%** n/a
KB46 55%** n/a
KB71A118-6 71%** n/a
KB53B7-2 84%** n/a
187Y2 ND n/a
185L12 ND ND
186L9 ND n/a
KB54A1-6 ND n/a
187L14 ND n/a
187G1(b) nt nt
187G1(s) nt nt
실시예 20 - 바실러스 슈린지엔시스 균주 PS201L3 유래의 신규 이원성 내독소 유전자의 클로닝, 발현 및 DNA 서열분석
PS201L3의 게놈 DNA를 진탕 플라스크 배양기 내에서 자란 세포로부터 Qiagen Genomic-tip 500/G 킷트 및 그람 양성 세균용 프로토콜에 따른 Genomic DNA Buffer Set(Qiagen Inc.; Valencia, CA)를 사용하여 제조하였다.Sau3AI으로 부분적으로 절단된 PS201L3 DNA로부터 유전자 라이브러리를 제조하였다. 부분적인 제한효소 절단물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리하였다. 크기가 9.3 내지 23kbp인 DNA 단편들을 겔로부터 잘라내어, 겔 절편으로부터 전기용출하고, Elutip-D 이온 교환 컬럼(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 상에서 정제한 다음, 에탄올 침강법으로 회수하였다. 상기Sau3AI 삽입편을BamHI으로 처리된 LambdaGem-11(Promega,Madison, WI) 내로 리게이션시켰다. Gigapack III XL Packaging Extract(Stratagene, La Jolla, CA.)를 사용하여 재조합 파아지를 패키징하고,이.콜라이KW251 세포 상에 도말하였다. 플라크를 Nytran Nylon Transfer Membranes(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 상으로 옮긴 후, 이원성 독소 코딩 서열에 대한32P-dCTP로 표지된 유전자 프로브로 프로브화하였다. 이 유전자 프로브는 PS201L3 게놈 DNA 주형 및 올리고뉴클레오티드 "15kfor1" 및 "45krev6"를 사용하여 증폭된 약 1.0kbp 크기의 PCR 산물이다.
PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
15kfor1 (서열 131) ATGTCAGCTCGCGAAGTACAC
45krev6 (서열 132) GTCCATCCCATTAATTGAGGAG
상기 나일론 막을 65℃에서 밤새 상기 프로브와 함께 혼성화시킨 후, 1×SSPE 및 0.1% SDS로 3회 세척하였다. 13개 플라크가 자동방사선사진술로 확인되었다. 이들 플라크를 피킹하여, SM 완충액 1㎖ + CHCl310㎕ 내에 밤새 담가두었다. KW251 숙주세포 상에서의 전면용균(confluent lysis)을 위해 파아지를 도말하였다. 6개의 전면용균된 플레이트를 SM에 담가, 대량 파아지 DNA 제조에 사용하였다. 정제된 파아지 DNA를 다양한 제한효소로 처리하고, 0.7% 아가로오스 겔 상에서 전기영동하였다. 상기 겔을 서던 블롯팅에 의해 Nytran 막으로 옮기고, 상기와 동일한 PCR-증폭된 DNA 단편으로 프로브화하였다. 약 6.0kbp의 혼성화하는XbaI 밴드가 동정되었으며, 이를이.콜라이/바실러스 슈린지엔시스셔틀 벡터인pHT370(Arantes, O., D. Lereclus [1991]Gene108:115-119) 내로 서브클로닝하여, pMYC2476을 얻었다. pMYC2476으로 형질변환된 XL10 Gold Ultracompetent이.콜라이세포(Stratagene)를 'MR1506'이라 명명하였다. pMYC2476은 이어서 일렉트로포레이션 및 30℃ DM3+ 에리트로마이신(20㎍/㎖) 플레이트 상에서의 선별에 의해 무결정성 CryB 세포 내로 형질변환되었다. 재조합 CryB[pMYC2476]은 'MR561'이라 명명되었다.
MR1506의 계대배양주를 농업 연구 배양균 기탁소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)의 영구적인 콜렉션(permanent collection)에 2000년 6월 1일자로 기탁하였다. 수탁번호는 NRRL B-30298이다.
B.t. 균주 MR561의 PS201L3 이원성 독소 단백질의 발현 여부를 면역블롯팅으로 검사하였다. 세포는 액상 NYS-CAA 배지 + 에리트로마이신(10㎍/㎖) 내에서 30℃에서 밤새 배양되었다. 상기 배양균을 원심분리로 펠렛화하고, 세포 펠렛의 일부를 재현탁한 후 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동하였다. 각각 PS149B1 14kDa 또는 44kDa 독소에 특이적인 항체를 프로브로 사용한 웨스턴 블롯 분석 결과, 14kDa 및 44kDa 단백질 양자가 뚜렷이 관찰되었다.
pMYC2476 상에서 코딩되는 독소 유전자의 DNA 서열분석은 ABI377 자동 서열분석기를 사용하여 수행되었다. PS201L3 14kDa 유전자의 DNA 서열은 서열 133에 도시되어 있다. PS2013 14kDa 독소의 유추된 펩티드 서열은 서열 134에 도시되어있다. PS201L3 44kDa 유전자의 DNA 서열은 서열 135에 도시되어 있다. PS201L3 44kDa 독소의 유추된 펩티드 서열은 서열 136에 도시되어 있다.
하기 표는 201L3 및 149B1 유래의 이원성 유전자 및 단백질의 서열 유사성(similarity) 및 상동성(identity)을 보여준다. 이러한 비교에는 BESTFIT(GCG 소프트웨어 패키지의 일부) 프로그램이 사용되었다. BESTFIT는 Smith와 Waterman의 국부적 상동성 알고리즘(Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981))을 사용한다.
201L3 vs. 149B1 % 유사성 % 상동성
14kDa 뉴클레오티드 서열 - 71.1
14kDa 펩티드 서열 63.9 54.1
45kDa 뉴클레오티드 서열 - 76.1
45kDa 펩티드 서열 70.9 62.7
실시예 21 - 바실러스 슈린지엔시스 균주 PS187G1, PS201HH2 및 KR1369 유래의 신규 δ-내독소 유전자의 클로닝 및 DNA 서열분석
Luria Bertani(LB) 브로쓰 내에서 600nm 가시광선에서의 흡광도가 0.5-1.0에 이를 때까지 배양된바실러스 슈린지엔시스균주 PS187G1, PS201HH2 및 KR1369로부터 총 세포 DNA를 제조하였다. DNA는 Qiagen Genomic-tip 500/G 킷트 및 그람 양성 세균용 프로토콜에 따른 Genomic DNA Buffer Set(Qiagen Inc.; Valencia, CA)를 사용하여 제조되었다. 각각NdeII로 부분적으로 절단된 PS187G1, PS201HH2 및 KR1369 총 세포 DNA 삽입편을 사용하여, PS187G1, PS201HH2 및 KR1369 코스미드 라이브러리를 SuperCos1 벡터(Stratagene) 내에 제조하였다. XL1-Blue MR세포(Stratagene)를 패키징된 코스미드로 형질감염(transfection)시켜, 카르베니실린(carbenicillin) 및 카나마이신(kanamycin)에 대하여 내성을 가진 클론들을 수득하였다. 각 균주에 대하여, 576개의 코스미드 콜로니를 96-웰 블록에서 1㎖ LB + 카르베니실린(100㎍/㎖) + 카나마이신(50㎍/㎖) 내에서 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 혼성화에 의한 검색을 위해 나일론 필터 상으로 평판복사(replica plating)하였다.
PS187G1, PS201HH2 또는 KR1369의 14kDa 및 44kDa 독소 오페론의 약 1000bp를 포함하는 PCR 앰플리콘(amplicon)을 이원성 상동물(homologs)을 증폭하도록 고안된 하기의 프라이머를 사용하여 PS187G1, PS201HH2 또는 KR1369 게놈 DNA로부터 증폭하였다:
15kfor1: 5'-ATG TCA GCT CGC GAA GTA CAC-3' (서열 131)
45krev6: 5'-GTC CAT CCC ATT AAT TGA GGA G-3' (서열 132)
상기 DNA 단편을 QiaQuick extraction 킷트(Qiagen)를 사용하여 겔로부터 정제하였다. 상기 프로브를 Prime-It II 킷트(Stratagene)를 사용하여32P-dCTP로 방사성 표지한 후, 수성 혼성화 용액(6×SSPE, 5×덴하르트 용액, 0.1% SDS, 0.1㎎/㎖ 변성 DNA) 내에서 콜로니 리프트 필터와 함께 65℃에서 16시간 동안 혼성화시켰다. 상기 콜로니 리프트 필터를 실온에서 0.5×SSC/0.1% SDS 내에서 1회 짧게 세척하고, 65℃에서 0.5×SSC/0.1% SDS 내에서 10분 동안 2회 더 세척하였다. 이어서, 상기 필터를 X-선 필름에 20분(PS187G1 및 PS201HH2) 또는 1시간(KR1369) 동안노출시켰다. 추후 분석을 위하여, 각 균주마다 상기 프로브에 강하게 혼성화한 코스미드 클론 하나씩을 선별하였다. 이들 코스미드 클론은 상술한 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 약 1000bp 14kDa 및 44kDa 독소 유전자 타겟을 포함하고 있음이 확인되었다. PS187G1의 코스미드 클론은 'pMYC3106'이라 명명되었다; pMYC3106을 포함하고 있는 재조합이.콜라이XL1-Blue MR 세포는 'MR1508'이라 명명되었다. PS201HH2의 코스미드 클론은 'pMYC3107'이라 명명되었다; pMYC3107을 포함하고 있는 재조합이.콜라이XL1-Blue MR 세포는 'MR1509'라 명명되었다. KR1369의 코스미드 클론은 'pMYC3108'이라 명명되었다; pMYC3108을 포함하고 있는 재조합이.콜라이XL1-Blue MR 세포는 'MR1510'이라 명명되었다. MR1509 및 MR1510의 계대배양주를 농업 연구 배양균 기탁소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)의 영구적인 콜렉션(permanent collection)에 2000년 8월 8일자로 기탁하였다. 수탁번호는 각각 NRRL B-30330 및 NRRL B-30331이다.
각각 pMYC3106, pMYC3107 및 pMYC3108에 의해 코딩되는 PS187G1, PS201HH2 및 KR1369의 14kDa 및 44kDa 독소 유전자들을 ABI377 자동 서열분석 시스템 및 관련 소프트웨어를 사용하여 서열분석하였다.
PS187G1 14kDa 및 44kDa 뉴클레오티드 서열 및 유추된 폴리펩티드 서열은 서열 137-140에 도시되어 있다. 14kDa 및 44kDa 독소 유전자 서열 양자 모두 완전한 전사해독프레임이다. PS187G1 14kDa 독소의 전사해독프레임 뉴클레오티드 서열,44kDa 독소의 전사해독프레임 뉴클레오티드 서열, 및 각각의 유추된 아미노산 서열은 살충성 단백질을 코딩하는 다른 독소 유전자와 비교하여 신규하다.
PS201HH2 14kDa 및 44kDa 뉴클레오티드 서열 및 유추된 폴리펩티드 서열은 서열 141-144에 도시되어 있다. 14kDa 독소 유전자 서열은 완전한 전사해독프레임이다. 44kDa 독소 유전자 서열은 그 유전자의 일부 서열이다. PS201HH2 14kDa 독소의 전사해독프레임 뉴클레오티드 서열, 44kDa 독소의 일부 전사해독프레임 뉴클레오티드 서열, 및 각각의 유추된 아미노산 서열은 살충성 단백질을 코딩하는 다른 독소 유전자와 비교하여 신규하다.
KR1369 14kDa 및 44kDa 뉴클레오티드 서열 및 유추된 폴리펩티드 서열은 서열 145-148에 도시되어 있다. 14kDa 및 44kDa 독소 유전자 서열은 양자 모두 완전한 전사해독프레임이다. KR1369 14kDa 독소의 전사해독프레임 뉴클레오티드 서열, 44kDa 독소의 전사해독프레임 뉴클레오티드 서열, 및 각각의 유추된 아미노산 서열은 살충성 단백질을 코딩하는 다른 독소 유전자와 비교하여 신규하다.
실시예 22 - PS149B1 14kDa 및 44kDa 이원성 독소 유전자를 포함하는 하이브리드 융합 유전자의 제조 및 발현
PS149B1 유래의 14kDa 및 44kDa 유전자 양자의 5' 및 3' 말단에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 SOE-PCR("Gene Splicing By Overlap Extension: Tailor-made Genes Using PCR,"Biotechniques8:528-535, May 1990)에 의해 융합 유전자를 생산하도록 고안되었다. 상기 두 유전자는 천연 이원성 독소 오페론에서 발견되는 것과 반대방향으로 융합되었다(즉, 44kDa 유전자가 먼저 오고 그 다음에 14kDa 유전자가 옴).
SOE-PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
F1new: AAATATTATTTTATGTCAGCACGTGAAGTACACATTG (서열 155)
R1new: tctctGGTACCttaTTAtgatttatgcccatatcgtgagg (서열 156)
F2new: agagaACTAGTaaaaaggagataaccATGttagatactaataaag (서열 157)
R2new: CGTGCTGACATAAAATAATATTTTTTTAATTTTTTTAGTGTACTTT (서열 158)
올리고 "F1new"는 14kDa 유전자의 5' 말단으로부터의 증폭을 지향하고, 44kDa 유전자의 3' 말단에 혼성화하도록 고안되었다. 올리고 "R1new"는 14kDa 유전자의 3' 말단으로부터의 증폭을 지향하도록 고안되었다. 이 프라이머는 해독의 종결을 보장하기 위해 두 개의 종지코돈을 구비하도록 고안되었다. 그것은 또한슈도모나스 플루오레슨스용 플라스미드 발현 벡터 내로의 방향성 클로닝을 위한KpnI 부위를 가지도록 고안되었다. 올리고 "F2new"는 44kDa 유전자의 5' 말단으로부터의 증폭을 지향하도록 고안되었다. 그것은 또한 리보좀 결합 부위 및SpeI 클로닝 부위를 포함한다. 올리고 "R2new"는 44kDa 유전자의 3' 말단으로부터의 증폭을 지향하고, 14kDa 유전자의 5' 말단에 혼성화하도록 고안되었다.
상기 두 유전자는 우선 PS149B1 게놈 DNA로부터 독립적으로 증폭되었다; 이때, 14kDa 유전자는 "F1new" 및 "R1new"를 사용하여, 그리고 44kDa 유전자는 "F2new" 및 "R2new"를 사용하여 증폭되었다. 증폭 산물을 하나의 PCR 튜브 내에 취합한 다음, "R1new" 및 "F2new"를 사용하여 함께 증폭되었다. 이때, 융합 유전자를 포함하는 ~1.5kbp DNA 단편을 증폭하기 위해, 48℃의 서냉복원(annealing) 온도에서 HerculaseTMEnhanced Polymerase Blend(Stratagene, La Jolla, CA)가 사용되었다. 이 DNA 절편을KpnI 및SpeI을 사용하여 절단하고, 아가로오스 겔 상에서 전기영동 한 후, 전기용출로 정제하였다. 플라스미드 벡터 또한KpnI 및SpeI을 사용하여 절단하고, 아가로오스 겔 상에서 전기영동 한 후, 전기용출로 정제한 다음, 포스파타아제로 처리하였다. 성기 벡터 및 삽입편을 14℃에서 밤새 리게이션시켰다. 리게이션된 DNA 단편을 일렉트로포레이션 및 LB+테트라싸이클린(30㎍/㎖) 플레이트 상에서의 밤샘 선별을 통해 MB214P.f. 세포 내로 형질변환시켰다. 융합 유전자를 포함하고 있는 균주를 진단성 PCR로 동정하고, 성공적인 유전자 스플라이싱의 확인을 위해 서열분석 하였다. 클로닝된 융합 유전자를 포함하는 하나의 대표적인 균주를 'MR1607'이라 명명하였다; 상기 재조합 플라스미드는 'pMYC2475'라 명명되었다.
MR1607의 계대배양주는 농업 연구 배양균 기탁소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA)의 영구적인 콜렉션(permanent collection)에 2000년 8월 8일자로 기탁되었다. 수탁번호는 NRRL B-30332이다. MR 1607을 배양하여, 단백질 산물을 SDS-PAGE 및 면역 블롯팅으로 확인하였다. 14kDa 독소 또는 44kDa 독소에 특이적인 항체를 프로브로 사용한 웨스턴 블롯팅 결과, 44kDa+14kDa 융합 산물을 의미하는 ~58kDa 단백질 밴드가확인되었다.
58kDa 융합 단백질의 서열은 서열 159에 도시되어 있다. 상기 융합 유전자의 DNA 서열은 서열 160에 도시되어 있다.
실시예 23 - 이원성 상동물 혼합 연구
상동 균주(homologue strains)의 성장
각 주요 이원성 독소 패밀리 즉, 149B1, 80JJ1, 201L3 및 167H2로부터 하나씩 모두 네개의 균주를 선별하였다. 각 독소 유전자를 정제하는데 드는 시간을 절약하기 위해, 대신 다음과 같은슈도모나스 플루오레슨스(P.f.) 클론들을 배양하였다: MR1253(149B1의 14kDa) 및 MR1256(149B1의 44kDa). 마찬가지로,B.t. 클론 MR541(80JJ1의 14kDa) 및 MR542(80JJ1의 44kDa)가 사용되었다.B.t. 균주들은 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배양되었다. 펠렛은 물로 3회 세척 후, 필요할 때까지 -20℃에 저장되었다.P.f. 균주들은 Biolafitte 발효기 내에서 표준방법에 따라 10L 배치(batch)로 배양되었다. 펠렛은 필요할 때까지 -80℃에 저장되었다.
독소의 추출 및 정제
167H2, MR541, MR542 및 201L3의 정제 . 세포 펠렛의 추출은 pH 3.5-5.5 범위의 100mM 시트르산 나트륨 완충액을 사용하여 이루어졌다. 전형적인 추출시, 펠렛은 원래 배양액 부피의 1/10 내지 1/3 부피의 완충액으로 추출된다. 펠렛을 상기 완충액 내에 현탁한 다음, 2.5시간 내지 밤새 4℃에서 로킹 플랫폼 상에 놓아두었다. 추출물을 원심분리한 다음, 상등액을 보존하였다. 이러한 과정을 약 10mg의 각 단백질이 얻어질 때까지 각 균주에 대하여 반복하였다. NuPAGE Bis/Tris 겔 시스템(Invitrogen)을 사용한 SDS-PAGE에 의해, 추출물 내의 단백질 독소 유무 여부를 확인하였다. 제조자의 지시에 따라 시료를 준비하여 4-12% 겔 상에 로딩하고, 전기영동상(electrophoretograms)을 MES 전개 완충액(running buffer)으로 현상하였다. 이러한 과정에 있어서, 201L3 시료의 제조시에는 예외가 있었다. 201L3 시료는 BioRad's Laemmli 샘플 버퍼로 1/2로 희석 후, 95℃에서 4분 동안 가열함으로써 제조되었다. 단백질 정량은 BAS를 표준물질로 사용하여 레이져 스캐닝 겔 농도계측법(Molecular Dynamics Personal Densitometer SI)으로 수행되었다. 추출물은 0.2㎛ 막 필터를 통한 여과에 의해 정화되었으며, 4℃에 보관되었다.
MR1253 및 MR1256의 정제. 각각 149B1의 14 및 44kDa 단백질에 해당하는 재조합 단백질 MR1253 및 MR1256은 용해된 봉입체로서 제조되었다. 봉입체는 표준방법에 따라 제조되었으며, 1mM EDTA, 50mM 시트르산 나트륨, pH 3.5 내에 용해되었다.
167H2 및 201L3 독소의 정제. 14kDa 또는 44kDa, 또는 양자를 모두 포함하는 것으로 알려진 모든 추출물들을 취합하였다. 이와 같이 취합된 추출물을 100mM 시트르산 나트륨, 150mM NaCl, pH 7.4에 대하여 투석하였다. 투석 튜브(Snakeskin 10k MWCO)는 Pierce社로부터 구입하였다. 시료는 통상 약 6시간 동안 투석 후, 다시 신선한 완충액 내에서 밤새 투석되었다.
이어서, 추출물을 Centriprep 10 또는 Centricon Plus-20(Biomax-5, 5000NMWL) 원심분리 여과 장치(Millipore)로 농축 후, 14kDa 단백질 및 44kDa 단백질을 정량하고, 겔 여과 크로마토그래피에 적용하였다.
크로마토그래피를 위한 준비시에, 모든 시료 및 완충액은 0.2㎛ 필터로 여과 후 가스가 제거되었다. 이어서, 2 베드 부피(bed volume)의 분리 완충액(100mM 시트르산 나트륨, 150mM NaCl, pH 4.0)으로 평형된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 겔 여과 컬럼에 시료를 적용하였다. 시료 부피는 5-10㎖이었다. AKTA purifier 100FPLC 시스템(Amersham Pharmacia)으로 크로마토그래피 과정을 제어하였다. 크로마토그래피는 상온에서 수행되었다. 크로마토그래피를 실행하는 동안 컬럼을 통과하는 완충액의 유속은 0.7㎖/min으로 유지되었다. 단백질은 280nm에서의 UV 흡광도를 모니터함으로써 검출되었다. 분획들을 회수하여 4℃에 저장하였다. 14 또는 44kDa 단백질을 함유한 분획을 모아, 상술한 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 순도를 조사하였다.
167H2 시료의 경우, 두 개의 큰 피크가 검출되었으며, 이들 피크는 기저선(baseline)에서 서로 로부터 잘 분리되어 있었다. 분획들을 SDS-PAGE 분석한 결과, 각 피크는 두 개의 단백질 독소들 중 어느 하나를 나타내는 것으로 판명되었다.
201L3 시료의 경우, 세개의 뚜렷한 피크 및 하나의 쇼울더(shoulder) 피크가 검출되었다. SDS-PAGE 분석 결과는 첫번째 피크가 100kDa 단백질+80kDa 단백질을 나타냄을 밝혔다. 두번째 피크는 44kDa 단백질을 나타내는 반면, 쇼율더 피크는 40kDa 단백질이었다. 세번째 피크는 14kDa 단백질이었다. 167H2 시료 및 201L3시료 양자로부터의 44kDa 단백질 분획끼리, 그리고 14kDa 단백질 분획끼리 취합하였다.
149B1 단백질은 P.f. 클론 MR1253 및 MR1256으로부터 개별적으로 수득되었으며, 따라서 더 정제할 필요가 없었다. 이와 마찬가지로, 80JJ1 재조합균주, MR541 및 MR542는 각각 14 및 44kDa 단백질을 생산하며, 따라서 더 이상의 정제가 필요없었다.
wCRW LC 50 바이오어세이용 시료 제조
투석. 각각의 이원성 독소 단백질 시료를 20mM 시트르산 나트륨, pH 4.0 6L에 대하여 투석하였다. 일차 투석은 수 시간 동안 진행되었으며, 시료를 신선한 완충액으로 옮긴 후 밤새 투석하였다. 최종적으로, 시료를 신선한 완충액으로 옮긴 후 수 시간 더 투석하였다. 단백질 시료원은 수집된 겔-여과 분획(167H2, 201L3)이거나, 펠렛 추출물(MR541, MR542)이거나, 또는 봉입체 펠렛 추출물(MR1253, MR1256)이었다. 모든 시료는 멸균을 위해 0.2㎛ 막을 통해 여과되었다.
농축. 시료는 Centricon Plus-20(Biomax-5, 5000 NMWL) 원심분리 여과 장치(Millipore)로 농축되었다.
정량. 상술한 바와 같이 시료내 단백질을 정량하였다. LC50바이오어세이의 요구사항을 충족시키기 위해서는, 각 독소 단백질 최소 6.3㎎이 0.316-1.36㎎/㎖ 농도 범위로 다양한 조합으로 필요하였다. 필요한 경우, 시료는 상기와 같이 농축되거나 또는 완충액(20mM 시트르산 나트륨, pH 4.0)으로 희석 후, 재정량 될 수도 있다.
이원성 독소의 혼합/ LC 50 바이오어세이. 네 가지 균주 각각에 대하여, 14kDa 단백질을 44kDa 단백질과 1/1의 질량비로 혼합하였다. 최고 처리량은 50㎍ 혼합물/㎠ 이었으나, 203J1의 14kDa 단백질이 함유된 혼합물의 경우는 예외였다. 이 단백질을 함유한 혼합물의 최고 처리량은 겨우 44㎍/㎠ 이었다. 대조구로서, 각각의 단백질과 추출 완충액(20mM 시트르산 나트륨, pH 4.0)을 사용하였다. 천연 조합(즉, 149B1의 14kDa+44kDa) 또한 시험되었다. 모든 독소 조합 및 완충액 대조구는 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대한 바이오어세이법으로 3회 평가된 반면, 개개의 독소는 1회만 평가되었다.
그 결과를 하기 표 15(독소 조합의 LC50결과) 및 표 16(149B1에 대한 균주들의 효능 비교)에 나타내었다.
독소 조합 탑-로딩(㎕/웰) LC50(㎍/㎠)
80JJ1 14 + 80JJ1 44 96 28 (19-44 C.I.)
167H2 44 159 >최고 처리량
201L3 44 172 No dose response
149B1 44 78 No dose response
167H2 14 + 167H2 44 161 19 (13-27 C.I.)
80JJ1 44 97 No dose response
201L3 44 174 14 (10-22 C.I.)
149B1 44 80 No dose response
201L3 14 + 201L3 44 193 No dose response
80JJ1 44 116 No dose response
167H2 44 180 No dose response
149B1 44 99 No dose response
149B1 14 + 149B1 44 45 10 (7-15 C.I.)
80JJ1 44 63 11 (8-16 C.I.)
167H2 44 126 8 (6-11 C.I.)
201L3 44 139 18 (13-27 C.I.)
독소 조합 상대적 효능
149B1 14 + 149B1 44 기준
149B1 14 + 80JJ1 44 0.9
149B1 14 + 167H2 44 1.3
149B1 14 + 201L3 44 0.5
80JJ1 14 + 80JJ1 44 0.4
167H2 14 + 167H2 44 0.5
167H2 14 + 201L3 44 0.7
상기 결과들은 도 3에 그래프로도 도시되어 있다.
천연 조합은 201L3을 제외하고는 모두 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대하여 매우 높은 활성을 나타내었다. 그러나, 201L3의 44kDa 단백질은 167H2 또는 149B1의 14kDa 단백질과 조합되었을 때 활성을 보였다. 다른 활성 조합은 149B1 14kDa과 80JJ1 또는 167H2 44kDa 간의 조합으로, 특히 167H2 44kDa과의 조합은 천연 149B1 혼합물보다 더 높은 활성을 나타내었다. 각각의 개별적인 단백질, 또는 완충액 및 물 대조구에서는 처리량 의존성(dose response)이 관찰되지 않았다.
실시예 24 - PS149B1 14kDa 단백질에 의한 서던 옥수수 뿌리벌레의 구제
바실러스 슈린지엔시스균주 PS149B1에서 처음 발견된 14kDa δ-내독소를 약 50%(wt/wt) 포함하는 분말을 재조합슈도모나스 플루오레슨스균주(MR1253)으로부터 분리하였다. 하기의 방법에 따라 이 분말의 살충 활성을 평가하였다.
인공 곤충 먹이(R.I. Rose and J.M. McCabe (1973), "Laboratory rearing techniques for rearing corn rootworm,"J. Econ. Entomol.66(2):398-400)를 128-웰 바이오어세이 트레이(C-D International, Pitman, NJ)에 웰당 약 0.5㎖의 양으로 분주하여 표면적이 ~1.5㎠가 되도록 하였다. 상기 14kDa 단백질 분말의 완충액(10mM 인산칼륨, pH 7.5) 현탁액을 상기 인공 곤충 먹이 표면에 50㎕/웰의 양으로 가하고, 먹이 표면이 건조되도록 하였다. 각 시험마다 완충액 대조구를 포함시켰다. 신생 서던 옥수수 뿌리벌레디아브로티카 운데심펑크타타 하워디(Diabrotica undecimpunctata howardi) 한 마리를 각 웰에 놓고, 트레이와 함께 제공되는 뚜껑으로 웰을 밀봉하였다. 바이오어세이는 28℃에서 6일 동안 계속되었으며, 그 후에 살아있는 유충을 각 처리 그룹별로 무게를 달았다. 대조구의 살아있는 곤충 무게에서 각 처리 그룹의 살아있는 곤충 무게를 빼고, 대조구의 무게로 나눈 다음, 100을 곱하여 % 성장 저해율을 구하였다. 처리군당 16마리의 곤충으로 이루어진 5번의 시험 각각의 성장 저해율을 계산한 후, 시험 전체에 걸친 평균 성장 저해율을 구하였다.
그 결과, 14kDa 단백질은 농도-의존적 방식으로 서던 옥수수 뿌리벌레의 성장을 저해하는 것으로 확인되었다. 표 17은 PS149B1 14kDa 단백질에 의한 서던 옥수수 뿌리벌레의 성장 저해를 보여준다.
처리 농도(㎍ ai/㎠) % 성장 저해율
14kDa 단백질 1 32
14kDa 단백질 3 55
14kDa 단백질 9 78
ai = active ingredient
실시예 25 - PS149B1 이원성 독소에 의한 유럽 옥수수 나무좀 및 옥수수 이삭벌레의 구제
바실러스 슈린지엔시스균주 PS149B1에서 처음 발견된 14kDa δ-내독소 54%가 함유된 분말 및 44kDa δ-내독소 37%가 함유된 다른 분말을 각각 재조합슈도모나스 플루오레슨스균주 MR1253 및 MR1256으로부터 분리하였다. 하기의 방법에 따라 이들 분말의 혼합물의 살충 활성을 평가하였다.
인공 곤충 먹이(R.I. Rose and J.M. McCabe (1973), "Laboratory rearing techniques for rearing corn rootworm,"J. Econ. Entomol.66(2):398-400)를 128-웰 바이오어세이 트레이(C-D International, Pitman, NJ)에 웰당 약 0.5㎖의 양으로 분주하여 표면적이 ~1.5㎠가 되도록 하였다. 상기 단백질 분말의 완충액(10mM 인산칼륨, pH 7.5) 현탁액을 혼합하여, 상기 인공 곤충 먹이 표면에 50㎕/웰의 양으로 가하고, 먹이 표면이 건조되도록 하였다. 각 시험마다 완충액 대조구를 포함시켰다. 신생 유충 한 마리를 각 웰에 놓고, 트레이와 함께 제공되는 뚜껑으로 웰을 밀봉하였다. 시험은 유럽 옥수수 나무좀(European corn borer)오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis) 및 옥수수 이삭벌레(corn earworm)헬리코베르파 지아(Helicoverpa zea)를 사용하여 수행되었다(둘다 인시류임). 바이오어세이는 28℃에서 6일 동안 계속되었으며, 그 후에 살아있는 유충을 각 처리 그룹별로 무게를 달았다. 대조구의 살아있는 곤충 무게에서 각 처리 그룹의 살아있는 곤충 무게를 빼고, 대조구의 무게로 나눈 다음, 100을 곱하여 % 성장 저해율을 구하였다. 처리군당 14-16 마리의 곤충으로 이루어진 4번의 시험 각각의 성장 저해율을 계산한 후, 시험 전체에 걸친 평균 성장 저해율을 구하였다.
그 결과, 14kDa 단백질은 농도-의존적 방식으로 유럽 옥수수 나무좀 및 옥수수 이삭벌레의 성장을 저해하는 것으로 확인되었다. 표 18은 PS149B1 단백질 혼합물에 의한 옥수수 이삭 벌레(CEW) 및 유럽 옥수수 나무좀(ECB)의 성장 저해를 보여준다.
% 성장 저해율
14kDa 단백질 + 44kDa 단백질 농도(㎍ ai/㎠) CEW ECB
3.7+11 42 59
11+33 57 77
33+100 61 89
ai = active ingredient
실시예 26 - 45kDa 단백질의 추가 분석 및 추가적인 폴리뉴클레오티드 및 단백질을 동정하기 위한 프라이머 고안
본 발명은 예시된 특정 서열만을 포함하는 것은 아니다. 본 발명의 유전자 및 독소의 일부 영역은 다른 관련 유전자 및 독소를 동정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 예를 들면, 첨부된 서열목록에 포함되어 있으며 본원에 기술된 임의의 이원성 단백질 또는 폴리펩티드의 적어도 10개의 연속적인 아미노산을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태는, 예를 들면, 본원에 예시된 단백질의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100개의 연속적인 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다; 이 숫자는 또한 예시된 폴리뉴클레오티드의 연속적인 뉴클레오티드에도 마찬가지로 적용된다. 그러한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질은 본 발명에 포함된다. 이와 마찬가지로, 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드(이러한 대략적인 크기의 펩티드를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는)도 본 발명에 포함된다.
매우 다르기는 하지만, 본 발명의 독소에 "가장 가까운(closest)" 독소는바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus)의 51 및 42kDa 모기살충성 단백질이라고 믿어진다. 51 및 42kDa스파에리쿠스독소 및 유전자와 45kDa 149B1 독소 및 유전자의 단백질 정렬(alignment) 및 뉴클레오티드 서열 정렬이 도 4 및 도 5로서 첨부되어 있다.
상기 뉴클레오티드 정렬에서 강조된 두 구역(block)은 그에 대하여 프라이머가 고안될 수 있는 서열이다. 예시적인 PCR 프라이머 쌍이 하기에 5'→3' 방향으로 개시되어 있다(45kD3'rc는 상보체로서 도시된 것이다). 이들 프라이머는 45kDa 이원성 패밀리의 추가적인 일원을 동정하는데 성공적으로 사용되었다. 완전히 중복되는(redundant) 서열 및 예언적인(prophetic) 쌍 또한 하기에 개시되어 있다.
45kD5': GAT RAT RAT CAA TAT ATT ATT AC (서열 161)
45kD3'rc: CAA GGT ART AAT GTC CAT CC (서열 162)
상기 서열들은 쓰여진 서열 그대로 또는 그의 역방향 상보체의 형태로 유용할 것이다(03 및 04는 예시된 역방향 프라이머인 45kD3'rc에 상보적이다).
45kD5'01: GAT GATGrTmrAk wwATTATTrC A (서열 163)
45kD5'02: GAT GATGrTmrAT ATATTATTrC A (서열 164)
45kD3'03: GGAwG krCdyTwdTm CCwTGTAT (서열 165)
45kD3'04: GGAwG kACryTAdTA CCTTGTAT (서열 166)
상기스파에리쿠스독소가 동정된 방식과 관련하여, 발견된 149B1 45kDa 단백질을 사용한 BLAST(Altschul et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs,"Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) 데이터베이스 검색은 42kDa비.스파에리쿠스결정성 봉입체 단백질 (예상 스코어 3*10-14) 및 51kDa비.스파에리쿠스결정성 봉입체 단백질(예상 스코어 3*10-9)과 일치한다.
45kDa 149B1 펩티드 서열을 42kDa비.스파에리쿠스결정성 봉입체 단백질에대하여 정렬한 결과, 325개 잔기에 걸쳐 26%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 그러한 정렬 스코어는 100개의 무작위 정렬의 평균 스코어 보다 27.2sd 만큼 더 높은 것이다. 이와 유사하게, 45kDa 149B1 펩티드 서열을 42kDa비.스파에리쿠스결정성 봉입체 단백질에 대하여 정렬한 결과, 229개 잔기에 걸쳐 29%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 그러한 정렬 스코어는 100개의 무작위 정렬의 평균 스코어 보다 23.4sd 만큼 더 높은 것이다. 무작위 정렬의 평균보다 >10sd 더 높은 정렬 스코어는 의미있는 것으로 간주되어 왔다(Lipman, D.J. and Pearson, W.R. (1985), "Rapid and sensitive similarity searches,"Science227:1435-1441; Doolittle, R.F. (1987),Of URFs and ORFs: a primer on how to analyze derived amino acid sequences,University Science Books, Mill Valley, CA).
참고를 위해, 구조적으로 유사한 Cry1Aa, Cry2Aa 및 Cry3Aa 단백질 서열들이동일한 방식으로 비교되었다. Cry2Aa 대 Cry1Aa, 및 Cry2Aa 대 Cry3Aa는 각각 214 및 213 잔기에 걸쳐 29% 및 27%의 상동성을 공유하며, 정렬 스코어는 100개의 무작위 정렬의 평균 스코어 보다 32.2sd 및 29.5sd 만큼 더 높았다. 149B1 45kDa 단백질 서열 및 Cry2Aa 단백질 서열의 정렬 결과, 100개의 무작위 정렬의 평균값의 1sd 이내의 정렬 스코어가 얻어졌다.
하기의 비교 또한 주목된다:
비교 질 길이 비율 갭 % 유사성 % 상동성 평균 질*
ps149b1-45.pep x s07712 189 325 0.612 12 35.135 26.351 39.4±5.5
ps149b1-45.pep x 07711 161 229 0.742 9 36.019 28.910 39.3±5.2
cry2aa1.pep x cry1aa1.pep 182 214 0.888 6 37.688 28.643 43.5±4.3
cry3aa1.pep x cry2aa1.pep 187 213 0.926 6 40.500 27.000 42.3±4.9
ps149b1-45.pep x cry2aa1.pep 40 28 1.429 0 42.857 35.714 41.6±5.6
*100개의 무작위화(randomization)에 근거한 것임
추가적인 비교 목적 및 서열 고안을 위해 하기의 참고자료가 주목된다:
Oeiet al.(1992), "Binding of purifiedBacillus Sphaericusbinary toxin and its deletion derivatives toCulex quinquefasciatusgut: elucidation of functional binding domains,"Journal of General Microbiology138(7):1515-26.
51kDa의 경우: 35-448은 활성을 띰; 45-448은 활성을 띠지 않음; 4-396은 활성을 띰; 4-392는 활성을 띠지 않음
42kDa의 경우: 18-370은 활성을 띰; 35-370은 활성을 띠지 않음; 4-358은 활성을 띰; 4-349는 활성을 띠지 않음
상기 작업은 정제 후 트롬빈으로 절단된 GST 융합체를 사용하여 수행되었다. 모든 절두체는 다른 완전한 서브유닛과 함께 검정되었다. 모든 결실체는 약간의 활성 손실을 가지고 있었다. P51델타C56은 42에 결합하나 내화(內化)하지는 않는다. P51델타N45는 결합하지 않는다. 오로지 42kDa + 51kDa 만이 내화된다. N-말단 및 C-말단 비독성 42kDa 단백질 양자는 51kDa 단백질 또는 51kDa-수용체 복합체에 결합하는데 실패하였다.
Davidsonet al. (1990), "Interaction of theBacillus sphaericusmosquito larvicidal proteins,"Can. J. Microbiol.36(12):870-8.비.스파에리쿠스로부터 수득된 SDS-PAGE로 정제된 단백질의 N-말단. 68-74 kDa 복합체(환원되지 않은) 내의 51kDa의 S29 및 N31 및 42kDa의 S9. 51kDa 밴드(환원되지 않은)로부터의 51의 S9 및 S29 및 42의 N31. 환원 겔에서, 45kDa 밴드는 51kDa의 S29 및 N31을 포함하고 있었으며, 39kDa 밴드는 42kDa 단백질의 S9을 포함하고 있었다.
Baumannet al. (1988), "Sequence analysis of the mosquitocidal toxin genes encoding 51.4- and 41.9-kilodalton proteins fromBacillus sphaericus2362 and 2297,"J. Bacteriol.17:2045-2050.비.스파에리쿠스프로테아제 유래의 D5 및 키모트립신 유래의 I11에 있는 41.9kDa의 N-말단; 트립신에 의한 R349 뒤에 오는 C-말단. 상기 영역 중 다수에 해당하는 증가된 유사성을 가진 영역이 동정되었다. 51 및 42kDa 단백질 간의 유사 서열 블록 A 내지 D.
요약하자면, 상술한스파에리쿠스독소는 본 발명의 범주 내에 포함되지 않는다(사실상, 그들은 특별히 배제된다). 이러한 측면에서, 상술한 정렬(도 4 및 도 5)에 예시된 다변하는 연속 서열은, 본원에서 제안되었으나 특별히 예시되지 않은 독특한 독소를 동정하기 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. 하지만, 상기 정렬에 도시된 보존적 연속 서열 또한 추가적인 신규 15/45kDa-형 이원성 독소(옥수수 뿌리벌레 및 다른 해충에 대하여 활성을 가진)를 동정하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
실시예 27 - 독소 유전자의 식물 내로의 삽입 및 발현
본 발명의 한 측면은 본 발명의 단백질을 발현하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 식물을 형질변환시키는 것이다. 형질변환된 식물은 타겟 해충에 의한 공격에 대하여 내성을 가진다.
본원에 기술된 신규한 옥수수 뿌리벌레-활성 유전자는 다른 생물에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 예를 들면, 14 및 44kDa PS80JJ1 독소를 코딩하는, 옥수수에 최적화된 유전자 서열이 각각 서열 44 및 45에 도시되어 있다.
본원에 기술된 살충성 독소를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들면,이.콜라이의 복제 시스템 및 형질변환된 세포의 선별을 가능케 하는 마커를 포함하는 다수의 클로닝 벡터가 외부 유전자를 고등 식물 내로 도입하기 위한 준비에 이용될 수 있다. 상기 벡터에는, 예를 들면, pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184 등이 포함된다. 따라서,B.t. 독소를 코딩하는 서열은 적절한 제한효소 부위에서 상기 벡터내로 삽입될 수 있다. 이로부터 얻어진 플라스미드는이.콜라이를 형질변환시키는데 사용된다. 상기이.콜라이세포는 적절한 영양 배지 내에서 배양된 후, 수확되어 용균된다. 상기 플라스미드는 회수된다. 서열 분석, 제한효소 분석, 전기영동, 및 다른 생화학적-분자적 생물학적 방법이 분석방법으로서 일반적으로 수행된다. 각 조작 후에, 사용된 DNA 서열은 절단되어 다음 DNA 서열에 연결될 수 있다. 각 플라스미드 서열은 동일한 또는 다른 플라스미드 내에 클로닝될 수 있다. 원하는 유전자를 식물 내로 삽입하기 위한 방법에 따라, 다른 DNA 서열이 필요할 수도 있다. 만일, 예를 들면, Ti 또는 Ri 플라스미드가 식물 세포 형질변환에 사용된다면, Ti 또는 Ri 플라스미드 T-DNA의 적어도 오른쪽 경계(border), 보다 바람직하게는 오른쪽 및 왼쪽 경계가 삽입될 유전자의 측접 영역으로서 연결되어야 한다.
식물 세포의 형질변환을 위한 T-DNA의 사용은 활발히 연구되어 왔으며, EP 120 516; Hoekema (1985) In:The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter 5; Fraleyet al., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46; 및 Anet al. (1985)EMBO J. 4:277-287에 충분히 기술되어 있다.
일단 삽입된 DNA가 게놈 내에 통합되면, 그것은 거기에서 비교적 안정하며, 대체로 다시 빠져나오지 않는다. 그것은 보통 형질변환된 식물 세포에 특히 카나마이신, G418, 벨로마이신, 하이그로마이신 또는 클로람페니콜과 같은 생물치사제(biocide) 또는 항생제에 대한 내성을 부여하는 선별 마커를 포함하고 있다. 따라서, 개별적으로 사용된 마커는 삽입된 DNA를 포함하고 있지 않은 세포보다는 오히려 형질변환된 세포의 선별을 허용하여야 한다.
DNA를 식물 숙주 세포 내로 도입하는 데에는 다수의 기술이 이용가능하다. 그러한 기술에는아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)를 형질변환제로 사용하는 T-DNA에 의한 형질변환(transformation), 융합(fusion), 주입(injection), 바이오리스틱스(미세입자 충격법) 또는 일렉트로포레이션 뿐만 아니라 기타 다른 가능한 방법들이 포함된다. 만일 형질변환을 위해 아그로박테리아가 사용된다면, 삽입될 DNA는 특별한 플라스미드, 즉 매개 벡터(intermediate vector) 또는 이원성 벡터(binary vector) 내로 클로닝되어야 한다. 매개 벡터는 T-DNA 내의 서열에 상동적인 서열 때문에, 상동 재조합(homologous recombination)을 통해 Ti 또는 Ri 플라스미드 내로 통합될 수 있다. Ti 또는 Ri 플라스미드 또한 T-DNA의 전달에 필요한 vir 영역을 포함한다. 매개 벡터는 아그로박테리아 내에서 스스로 복제할 수 없다. 매개 벡터는 헬퍼 플라스미드에 의해아그로박테리움 투메파시엔스내로 전달된다(conjugation, 접합). 이원성 벡터는이.콜라이및 아그로박테리아 내에서 스스로 복제할 수 있다. 그들은 선별 마커 유전자, 및 오른쪽 및 왼쪽 T-DNA 경계 영역에 의해 구획된 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 그들은 아그로박테리아 내로 직접 형질변환될 수 있다(Holsterset al. [1978]Mol. Gen. Genet.163:181-187). 숙주 세포로 사용되는아그로박테리움은 vir 영역을 지닌 플라스미드를 포함하여야 한다. vir 영역은 T-DNA를 식물 세포 내로 전달하는데 필요하다. 추가적인 T-DNA가 포함될 수도 있다. 그렇게 형질변환된 박테리아는 식물 세포를 형질변환시키는데 사용된다. 식물 외식편(explants)은 DNA를 식물 세포 내로 전달하기 위해아그로박테리움 투메파시엔스또는아그로박테리움 리조게네스와 함께 유리하게 재배될 수 있다. 이어서, 전체 식물은 선별을 위한 항생제 또는 생물치사제를 포함할 수도 있는 적절한 배지 내에서 감염된 식물 재료(예를 들면, 잎 조각, 줄기 조각, 뿌리, 원형질, 또는 현탁 배양된 세포)로부터 재생될 수 있다. 그와 같이 수득된 식물은 삽입 DNA의 존재 여부에 대하여 검사된다. 주입 및 일렉트로포레이션의 경우에는 플라스미드에 대한 특별한 요구 사항은 없다. 예를 들면 pUC 유도체와 같은 통상의 플라스미드를 사용하는 것이 가능하다.
형질변환된 세포는 식물 내에서 보통의 방식으로 성장한다. 그들은 생식세포(germ cell)를 형성하고, 형질변환된 형질(들)을 자손 식물로 전달할 수 있다. 그러한 식물은 보통의 방식으로 생육될 수 있으며, 동일한 형질변환된 유전 인자 또는 다른 유전 인자를 가지고 있는 식물과 교배될 수 있다. 그로부터 얻어지는 잡종 개체는 상응하는 표현형적 특징을 가지고 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 식물은 식물에 대하여 코돈 활용도가 최적화된 유전자로 형질변환될 것이다. 예를 들면, 본원에 참고자료로 첨부된 미국특허 제 5,380,831호를 참조하라. 또한, 유리하게는, 절두된 독소를 코딩하는 식물이 사용될 것이다. 절두된 독소는 전형적으로 전장(full length) 독소의 약 55% 내지 약 80%를 코딩할 것이다. 식물에서 사용하기 위한 합성B.t. 유전자를 생산하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
실시예 28 - 곤충 바이러스 내로의 B . t . 유전자의 클로닝
다양한 바이러스들이 곤충을 감염시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 바이러스에는, 예를 들면, 배큘로바이러스(vaculovirus) 및 엔토모폭스바이러스(entomopoxvirus)가 포함된다. 본 발명의 일실시양태에 있어서, 본원에 기술된 살충성 독소를 코딩하는 유전자는 곤충 바이러스의 게놈 내에 놓임으로써 그 바이러스의 병원성을 증가시킬 수 있다.B.t. 독소 유전자를 포함하는 곤충 바이러스를 제조하는 방법은 공지되어 있으며, 당업계의 숙련가에 의해 이미 실행되고 있다. 이러한 방법은, 예를 들면, Merryweatheret al.(Merryweather, A.T., U. Weyer, M.P.G. Harris, M. Hirst, T. Booth, R.D. Possee (1990)J. Gen. Virol.71:1535-1544) 및 Martenset al.(Martens, J.W.M., G. Honee, D. Zuidema, J.W.M. van Lent, B. Visser, J.M. Vlak (1990)Appl. Environmental Microbiol.56(9):2764-2770)에 기술되어 있다.
본원에서 언급하거나 인용된 모든 특허, 특허출원, 가출원 및 간행물은 본 명세서의 명백한 가르침과 일치하는 한 전문 그대로 참고자료로서 첨부된다.
본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 오로지 설명의 목적을 위한 것으로, 그러한 측면에서 다양한 변형 또는 변화가 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 제안될 것이며, 본원의 정신과 권한 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되어야 함이 이해되어야 한다.
본 발명의 살충성 단백질 및/또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하면, 농작물에 피해를 주는 초시류 해충 및 인시류 해충을 용이하게 구제할 수 있다.

Claims (21)

  1. 살충성 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 단백질은 하기의 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드: 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 서열 70, 서열 72, 서열 74, 서열 76, 서열 78, 서열 80, 서열 82, 서열 84, 서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96, 서열 98, 서열 100, 서열 102, 서열 104, 서열 106, 서열 108, 서열 110, 서열 112, 서열 114, 서열 116, 서열 118, 서열 120, 서열 122, 서열 124, 서열 126, 서열 134, 서열 136, 서열 138, 서열 140, 서열 142, 서열 144, 서열 146, 서열 148, 서열 150, 서열 152, 서열 154, 서열 159, 및 그들의 변이체(variants).
  2. 살충성 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드의 상보체(complement)는 하기의 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드: 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 53, 서열 55, 서열 57, 서열 59, 서열 61, 서열 63, 서열 65, 서열 67, 서열 69, 서열 71, 서열 73, 서열 75, 서열 77, 서열 79, 서열 81, 서열 83, 서열 85, 서열 87, 서열 89, 서열 91, 서열 93, 서열 95, 서열 97, 서열 99, 서열 101, 서열 103, 서열 105, 서열 107, 서열 109, 서열 111, 서열 113, 서열 115, 서열 117, 서열 119, 서열 121, 서열 123, 서열125, 서열 131, 서열 132, 서열 133, 서열 135, 서열 137, 서열 139, 서열 141, 서열 143, 서열 145, 서열 147, 서열 149, 서열 151, 서열 153, 서열 155, 서열 156, 서열 157, 서열 158, 서열 160, 서열 161, 서열 162, 서열 163, 서열 164, 서열 165, 및 서열 166.
  3. 분리된 살충성 단백질로서, 상기 단백질은 하기의 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질: 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 서열 70, 서열 72, 서열 74, 서열 76, 서열 78, 서열 80, 서열 82, 서열 84, 서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96, 서열 98, 서열 100, 서열 102, 서열 104, 서열 106, 서열 108, 서열 110, 서열 112, 서열 114, 서열 116, 서열 118, 서열 120, 서열 122, 서열 124, 서열 126, 서열 134, 서열 136, 서열 138, 서열 140, 서열 142, 서열 144, 서열 146, 서열 148, 서열 150, 서열 152, 서열 154, 서열 159, 및 그들의 변이체(variants).
  4. 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 숙주 세포로서, 상기 세포는 식물 세포 또는 미생물 세포이고, 상기 단백질은 하기의 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 숙주세포: 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 서열 70, 서열 72, 서열 74, 서열 76, 서열 78, 서열 80, 서열 82, 서열 84,서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96, 서열 98, 서열 100, 서열 102, 서열 104, 서열 106, 서열 108, 서열 110, 서열 112, 서열 114, 서열 116, 서열 118, 서열 120, 서열 122, 서열 124, 서열 126, 서열 134, 서열 136, 서열 138, 서열 140, 서열 142, 서열 144, 서열 146, 서열 148, 서열 150, 서열 152, 서열 154, 서열 159, 및 그들의 변이체(variants).
  5. 제 4항에 있어서, 상기 세포는 분리된 약 10-15kDa 살충성 단백질 및 분리된 약 40-50kDa 살충성 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 숙주 세포.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 숙주 세포는 식물 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 숙주 세포.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 숙주 세포는 옥수수 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 숙주 세포.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 숙주 세포는 옥수수 뿌리 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 숙주 세포.
  9. 제 4항에 있어서, 상기 숙주 세포는 미생물 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 숙주 세포.
  10. 비포유동물 해충을 구제하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 해충을 분리된 살충성 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단백질은 하기의 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 서열 70, 서열 72, 서열 74, 서열 76, 서열 78, 서열 80, 서열 82, 서열 84, 서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96, 서열 98, 서열 100, 서열 102, 서열 104, 서열 106, 서열 108, 서열 110, 서열 112, 서열 114, 서열 116, 서열 118, 서열 120, 서열 122, 서열 124, 서열 126, 서열 134, 서열 136, 서열 138, 서열 140, 서열 142, 서열 144, 서열 146, 서열 148, 서열 150, 서열 152, 서열 154, 서열 159, 및 그들의 변이체(variants).
  11. 제 10항에 있어서, 상기 방법은 해충을 약 10-15kDa 살충성 단백질 및 40-50kDa 살충성 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단백질들 중 적어도 하나는 하기의 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 서열 70, 서열 72, 서열 74, 서열 76, 서열 78, 서열 80, 서열 82, 서열 84, 서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96, 서열 98, 서열 100, 서열 102, 서열 104, 서열 106, 서열 108, 서열 110, 서열 112, 서열 114, 서열 116, 서열 118, 서열 120, 서열 122, 서열 124, 서열 126, 서열 134, 서열 136, 서열 138, 서열 140, 서열 142, 서열 144, 서열 146, 서열 148, 서열 150, 서열 152, 서열 154, 서열 159, 및 그들의 변이체(variants).
  12. 제 10항에 있어서, 상기 해충은 초시류 해충인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 해충은 옥수수 뿌리벌레(corn rootworm)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 상기 해충은 웨스턴 옥수수 뿌리벌레(western corn rootworm)인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10항에 있어서, 상기 해충은 인시류 해충인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 분리된 살충성 단백질로서, 상기 단백질은 하기의 분리주로 구성된 그룹으로부터 선택되는바실러스 슈린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 분리주로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 단백질: PS185GG, PS187G1, PS187Y2, PS201G, PS201HH2, PS242K10, PS69Q, KB54A1-6, KR589, PS185L12, PS185W3, PS187L14, PS186FF, PS131W2, PS158T3, PS158X10, PS185FF, PS187F3, PS201H2, PS201L3, PS203G2, PS203J1, PS204C3, PS204G4, PS204I11, PS204J7, PS236B6, PS246P42, KR1209, 및 KR1369.
  17. 살충성 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 단백질은 하기의 분리주로 구성된 그룹으로부터 선택되는바실러스 슈린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 분리주로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드: PS185GG, PS187G1, PS187Y2, PS201G, PS201HH2, PS242K10, PS69Q, KB54A1-6, KR589, PS185L12, PS185W3, PS187L14, PS186FF, PS131W2, PS158T3, PS158X10, PS185FF, PS187F3, PS201H2, PS201L3, PS203G2, PS203J1, PS204C3, PS204G4, PS204I11, PS204J7, PS236B6, PS246P42, KR1209, 및 KR1369.
  18. 하기의 분리주로 구성된 그룹으로부터 선택되는바실러스 슈린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 분리주의 생물학적으로 순수한 배양주: PS185GG, PS187G1, PS187Y2, PS201G, PS201HH2, PS242K10, PS69Q, KB54A1-6, KR589, PS185L12, PS185W3, PS187L14, PS186FF, PS131W2, PS158T3, PS158X10, PS185FF, PS187F3, PS201H2, PS201L3, PS203G2, PS203J1, PS204C3, PS204G4, PS204I11, PS204J7, PS236B6, PS246P42, KR1209, 및 KR1369.
  19. 살충성 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 단백질은 하기의 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 적어도 10개의 연속적인 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드: 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 서열 70,서열 72, 서열 74, 서열 76, 서열 78, 서열 80, 서열 82, 서열 84, 서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96, 서열 98, 서열 100, 서열 102, 서열 104, 서열 106, 서열 108, 서열 110, 서열 112, 서열 114, 서열 116, 서열 118, 서열 120, 서열 122, 서열 124, 서열 126, 서열 134, 서열 136, 서열 138, 서열 140, 서열 142, 서열 144, 서열 146, 서열 148, 서열 150, 서열 152, 서열 154, 및 서열 159.
  20. 살충성 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기의 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 중 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드: 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 53, 서열 55, 서열 57, 서열 59, 서열 61, 서열 63, 서열 65, 서열 67, 서열 69, 서열 71, 서열 73, 서열 75, 서열 77, 서열 79, 서열 81, 서열 83, 서열 85, 서열 87, 서열 89, 서열 91, 서열 93, 서열 95, 서열 97, 서열 99, 서열 101, 서열 103, 서열 105, 서열 107, 서열 109, 서열 111, 서열 113, 서열 115, 서열 117, 서열 119, 서열 121, 서열 123, 서열 125, 서열 131, 서열 132, 서열 133, 서열 135, 서열 137, 서열 139, 서열 141, 서열 143, 서열 145, 서열 147, 서열 149, 서열 151, 서열 153, 서열 155, 서열 156, 서열 157, 서열 158, 서열 160, 서열 161, 서열 162, 서열 163, 서열 164, 서열 165, 및 서열 166.
  21. 분리된 살충성 단백질로서, 상기 단백질은 하기의 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 적어도 10개의 연속적인 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질: 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58, 서열 60, 서열 62, 서열 64, 서열 66, 서열 68, 서열 70, 서열 72, 서열 74, 서열 76, 서열 78, 서열 80, 서열 82, 서열 84, 서열 86, 서열 88, 서열 90, 서열 92, 서열 94, 서열 96, 서열 98, 서열 100, 서열 102, 서열 104, 서열 106, 서열 108, 서열 110, 서열 112, 서열 114, 서열 116, 서열 118, 서열 120, 서열 122, 서열 124, 서열 126, 서열 134, 서열 136, 서열 138, 서열 140, 서열 142, 서열 144, 서열 146, 서열 148, 서열 150, 서열 152, 서열 154, 및 서열 159.
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US09/378,088 US6372480B1 (en) 1996-04-19 1999-08-20 Pesticidal proteins
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