JP2010207225A - シュードモナス菌及び近縁細菌における極限酵素遺伝子の過剰表現 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】シュードモナス菌及び近縁細菌が宿主細胞として使用される極限酵素過剰発現系、それらを使用するための方法及びキット並びにそれらから発現される極限酵素。前記宿主細胞が培地上で発現を可能にする条件下で成長させた場合に、少なくとも1g/Lの総生産性で前記極限酵素を生成するように、前記コード配列を過剰発現できることを特徴とする組換え細菌宿主細胞。
【選択図】なし
Description
2.澱粉の加水分解及び加工:例えばオリゴ糖、マルトース、グルコースシロップ、高フルクトースシロップのような製品を製造するための、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、アミロプルラナーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、グルコースイソメラーゼ及びキシロースイソメラーゼの使用;
3.化学合成:例えばエタノールの製造;サーモリシンによるアスパルテームの製造;医薬活性成分の合成のためのキラル中間体の製造;高温において又は有機溶媒中において高安定性を有する他のプロテアーゼ、リパーゼ及びグリコシダーゼの使用;
4.セルロース及びガムの分解並びに加工:例えばキシラナーゼによる紙及びパルプの漂白;セルロースの加水分解のためのセロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ及びβ−グルカナーゼ;油回収に使用される生物学的ガムを分解するための熱安定性セルラーゼ及びグルカナーゼ;
5.食品及び飼料の加工:例えばペクチナーゼ、セルラーゼ及びキチナーゼ;ラクトース加水分解用のガラクトシダーゼ;並びに高温加工時における動物飼料中のフィチン酸塩の脱ホスホリル化用フィターゼ;
6.薬物療法並びに診断装置及びキット:例えばペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、カルボキシラーゼ及びデヒドロゲナーゼ;
7.洗剤及び家庭用品:例えば好熱性プロテアーゼ、好アルカリ性プロテアーゼ;及びアルカリ性アミラーゼ;更に
8.他の工業的利用:例えば無機化合物のバイオマイニング及び生物浸出、バイオレメディエーション、放射性廃棄物の汚染除去、抗酸化系。
内部に動作可能な(operative)発現ベクターを含むように遺伝子操作された組換え細菌宿主細胞であって、前記発現ベクターが、制御配列に動作可能なように連結された外来性極限酵素コード配列を含む核酸を含み;前記宿主細胞が、培地上で発現を可能にする条件下で成長させられる場合に、少なくとも1g/Lの総生産性で前記極限酵素を生成するように、前記コード配列を過剰発現でき;前記細菌宿主細胞がシュードモナス菌及び近縁細菌から選ばれることを特徴とする組換え細菌宿主細胞。
用語解説
本明細書中及び添付した「特許請求の範囲」において使用する単数形は、前後関係からそうでないことが明白でない限り、単数及び複数の両方の対象を含む。従って、例えば、「1個の宿主細胞」への言及は事実上、単一の宿主細胞のみを使用する実施態様及び複数のこのような宿主細胞を使用する実施態様の両方を規定する。
増殖培地の使用による生物の成長に関して本明細書中で使用するように、生物は培地の「中(in)」又は「上(on)」で成長させると言うことができる。本発明の発現系において、培地は液体培地である。従って、これに関連して、この用語「中」及び「上」は、培地と接触している宿主細胞の成長及び一般には大量の培地内の宿主細胞の成長を示すのに互いに同義で使用するが、培地の表面における、表面中における又は表面上における若干の付随する細胞成長も考えられる。
本明細書中で使用する用語「含んでなる」は、その対象が、用語「含んでなる」に続いて列挙された要素とそのように列挙されていない他の全ての要素を含むことを意味する。この際、用語「含んでなる」は、広く且つ制限のない用語と解釈すべきであり;従って、列挙された要素を「含んでなる」対象についての、特許請求の範囲の請求項は、包括的に解釈すべきである、即ち、列挙された要素に限定されないものと解釈すべきである。従って、用語「含んでなる」は、例えば、「有する」、「含む」又は「包含する」のような用語と同義であると考えることができる。
ACAM−Australian Collection of Antarctic
Microorganisms,Cooperative Research Centre for Antarctic And Southern Ocean Environment,University of Tasmania,GPO Box 252C,Hobart,Tasmania 7001,Australia。
and Marine Bacteria,National Collections of Industrial,Food and Marine Bacteria,23 Machar Drive,Aberdeen,AB24 3RY,Scotland。
特に断らない限り、分子生物学の分野で知られた標準的な方法、ベクター、制御配列要素及び他の表現系要素を、核酸操作、形質転換及び発現に用いる。このような標準的な方法、ベクター及び要素は、例えば以下に記載されている。Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology(1995)(John Wiley & Sons);Sambrook,Fritsch,&Maniatis(eds.),Molecular Cloning(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY);Berger & Kimmel,Methods in Enzymology 152:Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)(Academic Press);及びBukhari et al.(eds.),DNA Insertion Elements,Plasmids and Episomes(1977)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)。
本明細書中で使用する用語「tcp」は「総細胞タンパク質」を意味し、培養液リットル当たりの発現細胞タンパク質のおおよその質量の尺度である。本明細書中で使用する用語「tcp%」は「総細胞タンパク質%」を意味し、細胞によって発現される所定のタンパク質の相対量を示す総細胞タンパク質の割合の尺度である。
用語「外来性」は所定の細胞又は分子「にとって外来の供給源から」を意味する。用語「異種性」は所定の細胞又は分子「とは異なる供給源から」を意味する。本明細書においては、当業界では一般的によく使用されるように、これら2つの用語は同義語として区別なく使用される。これらの用語は共に、所定の対象が細胞又は分子にとって外来であること、即ち自然状態では細胞中に見られない又は自然状態では分子と共に見られない若しくは分子に連結されていないことを示すのに用いる。
好極限性は、表Iに列挙したパラメーターの範囲に入る任意の条件と定義する。
本明細書中で使用する用語「酵素」は、以下のものを含む。
1.酸化還元酵素(IUBMB EC 1:例えばモノオキシゲナーゼ、シトクロム、ジオキシゲナーゼ、脱水素酵素、メタロレダクターゼ、フェレドキシン、チオレドキシンが挙げられる);
2.転移酵素(IUBMB EC2:例えばグリコシルトランスフェラーゼ、アルキルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、カルボキシルトランスフェラーゼ、脂肪アシル合成酵素、キナーゼ、RNA及びDNAポリメラーゼ、逆転写酵素、核酸インテグラーゼが挙げられる);
3.加水分解酵素(IUBMB EC3:例えばグリコシラーゼ、グリコシダーゼ、グルコヒドロラーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペプチダーゼ及びプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、核酸リコンビナーゼが挙げられる);
4.リアーゼ(IUBMB EC4:例えば脱炭酸酵素、RUBISCO、アデニル酸シクラーゼが挙げられる);
5.イソメラーゼ(IUBMB EC5:例えばラセマーゼ、エピメラーゼ、ムターゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼ、フォルダーゼが挙げられる);及び
6.リガーゼ(IUBMB EC6:例えばカルボキシラーゼ、アシルシンテターゼ、ペプチドシンテターゼ、核酸リガーゼが挙げられる)。
広範囲の極限酵素が当業界で知られている。例えば参考文献11〜20を参照されたい。本明細書中で使用する用語「極限酵素」は、表Iにおいて定義したような少なくとも1つの好極限性条件下で少なくとも1つの触媒特性の最適条件を示し且つ1)好極限性生物から得られる核酸又は2)好極限性生物から得られ、且つ更に突然変異誘発及び/又は以下に記載したような組換えによって改変させられた核酸によってコード化された酵素を意味する。好ましい実施態様において、好極限性生物は、好極限性Archaeon、好極限性細菌又は好極限性真核生物であろう。特に好ましい好極限性真核生物としては、好極限性真菌類及び好極限性酵母が挙げられる。特に好ましい実施態様において、生物は好極限性Archaeon又は好極限性細菌であろう。
EC3.2内の酵素、即ち任意の好極限性グリコシラーゼの中から選ばれる。好ましい一実施態様において、極限酵素はIUBMB EC3.2.1内の酵素、即ち任意の好極限性グリコシダーゼの中から選ばれる。好ましい一実施態様において、極限酵素はIUBMB EC3.2.1内の以下の任意の酵素の中から選ばれる。アミラーゼ、アミログルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ;セルラーゼ、セロビオヒドラーゼ、エンドグルカナーゼ及びヘミセルラーゼ;並びにβ−グルコシダーゼ。好ましい一実施態様において、極限酵素はIUBMB EC3.2.1内の以下の任意の酵素の中から選ばれる。アミラーゼ及びセルラーゼ。好ましい一実施態様において、極限酵素はIUBMB EC3.2.1内のアミラーゼ、即ち任意の好極限性アミラーゼの中から選ばれる。好ましい一実施態様において、極限酵素はIUBMB EC3.2.1内のα−アミラーゼ(即ち、IUBMB EC3.2.1.1の酵素)、従って、任意の好極限性α−アミラーゼの中から選ばれる。
非常に多数の細菌ベクターが当業界でグラム陰性Proteobacteria中におけるタンパク質の発現に有用であることが知られており、これらは本発明に従って極限酵素の発現に使用できる。このようなベクターとしては、例えばプラスミド、コスミド、及びファージ発現ベクターが挙げられる。有用なプラスミドベクターの例としては、発現プラスミドpMB9、pBR312、pBR322、pML122、RK2、RK6及びRSF1010が挙げられる。このような有用なベクターの他の例としては、例えば、以下に記載されたものが挙げられる。N Hayase,Appl. Envir. Microbiol.60(9):3336〜42(Sep 1994);AA Lushnikov et al.,Basic Life Sci.30:657〜62(1985);S Graupner&W Wackernagel,Biomolec.Eng.17(1):11〜16.(Oct 2000);HP Schweizer,Curr.Opin.Biotech.12(5):439〜45(Oct 2001);M Bagdasarian & KN Timmis,Curr.Topics Microbiol.Immunol.96:47〜67(1982);T Ishii et al.,FEMS Microbiol.Lett.116(3):307〜13(May
1、1994);IN Olekhnovich & YK Fomichev,Gene 140(1):63〜65(Mar 11,1994);M Tsuda & T
Nakazawa,Gene 136(1〜2):257〜62(Dec 22,1993);C Nieto et al.,Gene 87(1):145〜49(Mar
1、1990);JD Jones & N Gutterson,Gene 61(3):299〜306(1987);M Bagdasarian et al.,Gene 16(1〜3):237〜47(Dec 1981);HP Schweizer et al.,Genet.Eng.(NY)23:69〜81(2001);P Mukhopadhyay et al.,J.Bact.172(1):477〜80(Jan 1990);DO Wood et al.,J.Bact.145(3):1448〜51(Mar 1981);及びR Holtwick et al.,Microbiology 147(Pt 2):337〜44(Feb 2001)。
用語「制御配列」(又は制御シーケンス)は、本明細書中では、本発明に従って宿主細胞中で極限酵素を発現させるために必要な全ての要素及び、場合によっては、そのために有利な他の要素の組と定義する。各制御配列要素は、極限酵素をコード化する核酸に固有であっても外来性であってもよいし、宿主細胞に固有であっても外来性であってもよい。このような制御配列要素としては、プロモーター;転写エンハンサー;リボソーム結合部位(「シャイン・ダルガルノ配列」とも称される);翻訳エンハンサー(例えば米国特許第5,232,840号(Olins)参照);リーダーペプチド−コード化配列(例えばターゲティングペプチド又は分泌シグナルペプチド用の)、プロペプチドコード配列;転写開始シグナル及び停止シグナル並びに翻訳開始シグナル及び停止シグナル、ポリアデニル化シグナル;更に転写ターミネーターが挙げられるがこれらに限定されない。
プロモーターは、最適な宿主中で転写活性を示す任意の核酸配列であることができ、天然、突然変異、切断型又はハイブリッドプロモーターであることができる。天然プロモーターは、宿主細胞に固有であるか異種性であるポリペプチドコード化遺伝子から得ることができる。所望ならば、プロモーターを含む核酸を、付着されていることがわかっているリボソーム結合部位に、及び場合によっては、それによって制御されるコード配列の少なくとも一部に(天然の配置においてみられるように)連結させたままにすることができる。(この天然コード配列又はその部分は、保持されるならば、極限酵素コード配列に付着され、最終的には極限酵素−融合タンパク質の発現にいたるであろう。)
al.,Annual Rev.Genet.23:311〜336(1989);Bourret et al.,Annual Rev.Biochem.60:401〜441(1991);並びにMekalanos,J.Bact.174:1〜7(1992)を参照されたい。
他の要素も、本発明に従って発現系内に包含させることができる。例えば、融合タンパク質として発現される極限酵素の同定、分離、精製又は単離を容易にするタグ配列は、極限酵素のコード配列に付着させられたコード配列によってコード化できる。本発明の好ましい実施態様において、タグ配列の使用が望ましい場合には、タグ配列はヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、極限酵素コード配列は、ヘキサ−ヒスチジンコード化配列に融合させる。同様に、極限酵素は、極限酵素のコード配列にウィルスコートタンパク質コード配列の全て又は一部を付着させることによって、ウィスル構造タンパクの全体又は一部分との融合タンパク質、例えば、ウィルス(又はファージ)コートタンパク質として発現させることができる。
天然型又は改変型のいずれであっても、極限酵素をコード化する核酸は、シュードモナス菌及び近縁細菌から得られた細菌性宿主細胞中で、本発明に従って過剰発現されるであろう。本明細書中で使用する「シュードモナス菌及び近縁細菌」は、本明細書中で「グラム陰性Proteobacteria亜群1」と定義される群と同じ広がりを持っている。「グラム陰性Proteobacteria亜群1」は、より詳細には、R.E.Buchanan and N.E.Gibbons(eds.),Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology,pp.217〜289(8th ed.、1974)(The Williams & Wilkins Co.,Baltimore,MD,USA)(以下、「Bergey(1974)」)によって、「グラム陰性好気性桿菌及び球菌(Gram−Negative Aerobic Rods and Cocci」と命名された分類学的「パート(Part)」の範囲に入ると記載された科及び/又は属に属するProteobacteriaの群と定義される。表Iは、分類学的「パート」中に列挙された生物の科及び属を示す。
faecails(ATCC8750);Bordetella pertussis(ATCC9797);Burkholderia cepacia(ATCC25416);Ralstonia pickettii(ATCC27511);Acidovorax facilis(ATCC11228);Hydrogenophaga flava(ATCC33667);Zoogloea ramigera(ATCC19544);Methylobacter luteus(ATCC49878);Methylocaldum gracile(NCIMB11912);Methylococcus capsulatus(ATCC19069);Methylomicrobium agile(ATCC35068);Methylomonas methanica(ATCC35067);methylosarcina fibrata(ATCC700909);Methylosphaera hansonii(ACAM549);Azomonas agilis(ATCC7494);Azorhizophilus paspali(ATCC23833);Azotobacter chroococcum(ATCC9043);Cellvibrio mixtus(UQM2601);Oligella urethralis(ATCC17960);Pseudomonas aeruginosa(ATCC10145)、Pseudomonas
fluorescens(ATCC35858);Francisella tularensis(ATCC6223);Stenotrophomonas maltophilia(ATCC13637);Xanthomonas campestris(ATCC33913);及びOceanimonas doudoroffii(ATCC27123)。
ベクターによる宿主細胞の形質転換は、当業界で知られた任意の形質転換方法を用いて実施でき、細菌宿主細胞は、無傷の細胞又はプロトプラスト(即ち細胞質を含む)として形質転換されることができる。代表的な形質転換方法としては、ポレーション法、例えば、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、細菌接合及び二価陽イオン処理、例えば、塩化カルシウム処理又はCaCl/Mg2+処理が挙げられる。
本明細書中で使用する用語「発酵」は、文字通りの発酵を用いる実施態様と、他の非発酵性培養方式を用いる実施態様を共に包含する。発酵は任意の規模で実施できる。好ましい実施態様において、発酵培地は、濃厚培地、最少培地及び無機塩培地の中から選ぶことができ;濃厚培地は使用できるが、避けるのが好ましい。好ましい一実施態様においては、最少培地又は無機塩培地を選ぶ。好ましい一実施態様においては、最少培地を選ぶ。好ましい一実施態様においては、無機塩培地を選ぶ。無機塩培地が特に好ましい。
発現後、極限酵素は次に、当業界で知られた任意のタンパク質回収及び/又はタンパク質精製方法を用いて、分離、単離及び/又は精製することができる。例えば極限酵素が細胞内で発現される場合には、宿主細胞は、標準的な物理、化学又は酵素手段によって細胞溶解させることができ(例えば、P.Prave et al.(eds.),Fundamentals of Biotechnology(1987)(VCH Publishers,New York)(特にSection 8.3)を参照されたい)、それに続いて、精密濾過、限外濾過、ゲル濾過、ゲル精製(例えばPAGEによる)、アフィニティー精製、クロマトグラフィー(例えばLC、HPLC、FPLC)などによってタンパク質を分離できる。あるいは、これらのよく知られているタンパク質回収及びタンパク質精製法の、これらの酵素の特異的性質を利用する変法も使用できる。例えば他の細胞タンパク質及び材料を沈殿させながら極限酵素を再懸濁させる加熱によって、超好熱性酵素を細胞材料から容易に分離できることが報告されており;この方法は本発明において超好熱性酵素に関して使用するの特に好ましい。
Lilie, In vitro folding of inclusion body proteins,FASEB J.10:49〜56(1996);B Fischer et al.,Biotechnol.Bioeng.41:3〜13(1993)(E.coliにおいて発現された真核生物タンパク質のリフォールディング);G.Dong et al.,Appl.Envir.Microbiol.63(9):3569〜3576(Sep 1997)(好極限性アミラーゼ酵素のリフォールディング);A Yamagata et al.,Nucl.Acids Res.,29(22):4617〜24(Nov 15,2001)(異種性、好熱性RecJエキソヌクレアーゼを可溶化するための尿素変性と、それに続く、活性酵素を得るためのリフォールディング);並びにC Pire et al.,FEMS Microbiol.Lett.200(2):221〜27(Jun 25,2001)(E.coliにおいて発現された古細菌好塩性グルコールデヒドロゲナーゼのリフォールディング)。
本発明に係る発現系は、tcp5%又はそれ以上のレベルで極限酵素を発現する。好ましい一実施態様において、発現レベルはtcp8%又はそれ以上であろう。好ましい一実施態様において、発現レベルはtcp10%又はそれ以上であろう。好ましい一実施態様において、発現レベルはtcp15%又はそれ以上であろう。好ましい一実施態様において、発現レベルはtcp20%又はそれ以上であろう。好ましい一実施態様において、発現レベルはtcp25%又はそれ以上であろう。好ましい一実施態様において、発現レベルはtcp30%又はそれ以上であろう。好ましい一実施態様において、発現レベルはtcp40%又はそれ以上であろう。好ましい一実施態様において、発現レベルはtcp50%又はそれ以上であろう。
本発明に係る発現系は、少なくとも約20g/L(無機塩培地上で成長させる場合でさえ)の細胞密度、即ち、最大細胞密度を実現し;同様に、本発明に係る発現系は、容量当たりのバイオマス(バイオマスは乾燥細胞重量として測定される)に換算して表す場合、少なくとも約70g/Lの細胞密度を実現する。
本発明に係る発現系において、総生産性、即ち、極限酵素の総生産性は少なくとも1g/Lである。細胞密度及び発現レベルの因子はそれに応じて選ばれる。好ましい一実施態様において、総生産性は少なくとも2g/Lであろう。好ましい一実施態様において、総生産性は少なくとも3g/Lであろう。好ましい一実施態様において、総生産性は少なくとも4g/Lであろう。好ましい一実施態様において、総生産性は少なくとも5g/Lであろう。好ましい一実施態様において、総生産性は少なくとも6g/Lであろう。好ましい一実施態様において、総生産性は少なくとも7g/Lであろう。好ましい一実施態様において、総生産性は少なくとも8g/Lであろう。好ましい一実施態様において、総生産性は少なくとも9g/Lであろう。好ましい一実施態様において、総生産性は少なくとも10g/Lであろう。
好極限性セルラーゼ
実施例1A−Thermotoga maritima及びPyrococcus furiosusセルラーゼを発現するPseudomonas fluorescens菌株の作成
方法
分子生物学の技術はAusubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology(1995)(John
Wiley & Sons);Sambrook,Fritsch,& Maniatis(eds.),Molecular Cloning(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)に記載された通りとした。
親プラスミドpMYC1803は、テトラサイクリン耐性調節マーカー並びにRSF1010プラスミドからの複製及び動態化座位を保有するpTJS260の誘導体(米国特許第5,169,760号(Wilcox)参照)である。(pMYC1803は、本発明に係る極限酵素の発現において有用な多くの誘導体プラスミドの源である。ほとんどのこのような誘導体は、異なる外来性遺伝子のクローニングに都合の良い制限部位を導入するために、主としてORFの周囲がpMYC1803とは異なる。)
MB214は、lacプロモーターの誘導体がラクトース又はIPTGによって調節されることができる宿主基礎環境を形成するためにlacIZYAオペロン(lacZプロモーター領域が除去された)を染色体に組み込むという手法によって誘導されたMB101(野生型原栄養体P.fluorescens菌株)の誘導体である。MB101はLac-であるが、MB214はLac+である。しかし、MB101は、プラスミド上のE.coli lacI遺伝子を菌株中に導入することによってLac+にすることができる。
種培養体を以下のようにして作成した。P.fluorescens MB214形質転換体を、15mlのFalconチューブ中において、15μg/mLのテトラサイクリンHClが補足されたLuria−Bertani Broth(「LB」)2〜5mLに接種し、32℃、300rpmにおいて16〜20時間成長させた。種培養体1mL(lLB中)を、250mLのボトムバッフル付き振盪フラスコ中の、15μg/mLテトラサイクリンHClが補足されたTerrific Broth(TB)培地(表IV参照)50mL中に入れ、32℃、300rpmにおいて5時間インキュベートした。誘導は、IPTGを最終濃度0.5mMまで添加することによって行った。サンプルを、インキュベーションの16〜24時間後に採取した。
好極限性アミラーゼ
実施例1と同様にして、Thermococcus及びSulfolobus solfataricus源からのα−アミラーゼ遺伝子を、図1に示したような、テトラサイクリン耐性マーカーも保有するRSF1010に基づくベクター中にPtacプロモーターを含む制御配列に動作可能なように連結されるように、PCR増幅させ、pMYC1803上にクローン化させた。得られた作成物を、LacI+P.fluorescens MB101に形質転換させた。得られた組換え宿主細胞を10L発酵槽で無機塩培地(テトラサイクリンが補足され且つグルコース又はグリセロールが供給される)中において成長させることによって培養した。形質転換体をフェドバッチ発酵培養において、最終的には約20g/L〜70g/L超(乾燥細胞重量)の範囲内のバイオマスを生成する細胞密度まで成長させた。Ptacプロモーターの無償性インデューサー、IPTGを、発現を誘導するために加えた。その結果、アミラーゼが、tcp約5%〜約30%超の範囲内のレベルまで発現された(即ち、過剰発現された)。従って、総生産性は、約2g/L〜10g/L超の範囲であり、単一の10Lバッチから100g超の極限酵素の収量が得られた。宿主細胞の細胞溶解後、極限酵素を、精密濾過とそれに続く限外濾過によって精製した。得られた酵素を特徴付けし、更に澱粉液化活性に関して試験したところ、それらは活性で、超好熱性で且つ好酸性であることがわかった。
好極限性プロテアーゼ
Pyrococcus furiosus及びSulfolobus acidocaldariusプロテアーゼ遺伝子はそれぞれ、115℃及びpH6.5〜10.5において活性なセリンプロテアーゼであるピロリシン(IUBMB EC 3.4.21.−)、90℃及びpH2.0において最適に動作する酸プロテアーゼであるサーモプシン(IUBMB EC3.4.23.42)をコード化する。実施例1と同様にして、これらの遺伝子を、図1に示したような、テトラサイクリン耐性マーカーも保有するRSF1010に基づくベクター中にPtacプロモーターを含む制御配列に動作可能なように連結されるように、PCR増幅させ、pMYC1803上にクローン化させた。得られた作成物を、LacI+P.fluorescens MB214に形質転換させた。得られた組換え宿主細胞を10L発酵槽で無機塩培地(テトラサイクリンが補足され且つグルコース又はグリセロールが供給される)中において成長させることによって培養した。形質転換体をフェドバッチ発酵培養において、最終的には約20g/L〜70g/L超(乾燥細胞重量)の範囲内のバイオマスを生成する細胞密度まで成長させた。IPTGによる誘導後、プロテアーゼが、tcp約5%〜約30%超の範囲内のレベルまで発現された。従って、総生産性は、約1g/L〜10g/L超の範囲であり、単一の10Lバッチから100g超の極限酵素の収量が得られた。
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Claims (40)
- 内部に動作可能な発現ベクターを含むように遺伝子操作された組換え細菌宿主細胞であって、
前記発現ベクターが制御配列に動作可能なように連結された外来性極限酵素コード配列を含む核酸を含み;前記宿主細胞が培地上で発現を可能にする条件下で成長させた場合に、少なくとも1g/Lの総生産性で前記極限酵素を生成するように、前記コード配列を過剰発現でき;前記細菌宿主細胞がシュードモナス菌及び近縁細菌から選ばれることを特徴とする組換え細菌宿主細胞。 - 組換え細菌宿主細胞及び制御配列に動作可能なように連結された外来性極限酵素コード配列を含む核酸を含む、前記宿主細胞中において有効な発現ベクターを有する極限酵素過剰発現系であって
前記過剰発現系が、培地上で発現を可能にする条件下で成長させた場合に、少なくとも1g/Lの総生産性で前記極限酵素を生成するように、前記コード配列を過剰発現でき;前記細菌宿主細胞がシュードモナス菌及び近縁細菌から選ばれることを特徴とする極限酵素過剰発現系。 - 少なくとも1g/Lの総生産性で極限酵素を過剰発現する方法であって、
(1)(a)シュードモナス菌及び近縁細菌から選ばれる細菌宿主細胞、
(b)制御配列に動作可能なように連結された外来性極限酵素コード配列を含む核酸を含む、前記宿主細胞中において動作可能な発現ベクター、並びに
(c)培地
を用意し;
(2)前記発現ベクターを前記細菌宿主細胞に形質転換させて、組換え細菌宿主細胞を形成し;そして
(3)培地上で発現を可能にする条件下で組換え細菌宿主細胞を成長させる
工程を含んでなる極限酸素の過剰発現方法。 - (1)制御配列に動作可能なように連結された外来性極限酵素コード配列を含む核酸を含む発現ベクターを、シュードモナス菌及び近縁細菌から選ばれた細菌宿主細胞に形質転換させて、組換え細菌宿主細胞を形成し;そして
(2)前記組換え細菌宿主細胞を培地上で発現を可能にする条件下で成長させる
ことを含んでなる、少なくとも1g/Lの総生産性で極限酵素を過剰発現させる方法。 - 培地上で発現を可能にする条件下で組換え細菌宿主細胞から少なくとも1g/Lの総生産性で極限酵素を過剰発現させる方法における、シュードモナス菌及び近縁細菌から選ばれた組換え細菌宿主細胞の使用。
- (1)シュードモナス菌及び近縁細菌から選ばれた、或る量の細菌宿主細胞;
(2)前記宿主細胞中で動作可能であり且つ制御配列を含む、或る量の発現ベクター;
(3)制御配列にコード配列を動作可能なように連結させ、それによって発現ベクターが調製されるように、外来性極限酵素コード配列を含む核酸を前記発現ベクターに挿入する指令;
(4)組換え細菌宿主細胞を形成するために、続いて前記細菌宿主細胞に前記発現ベクターを形質転換する指令;並びに
(5)培地上で発現を可能にする条件下で前記組換え細菌宿主細胞を成長させる指令;更に
(6)場合によっては、或る量の前記培地;更に
(7)場合によっては、前記制御配列が調節プロモーターを使用する場合には、調節プロモーターのための或る量のインデューサー
を含んでなる、少なくとも1g/Lの総生産性で極限酵素を過剰発現するための商用キット。 - (1)シュードモナス菌及び近縁細菌から選ばれた、或る量の細菌宿主細胞;
(2)前記宿主細胞中で有効であり且つ制御配列と前記制御配列に動作可能なように連結された外来性極限酵素コード配列を含む、或る量の発現ベクター;
(3)組換え細菌宿主細胞を形成するために、前記細菌宿主細胞に前記発現ベクターを形質転換する指令;並びに
(4)培地上で発現を可能にする条件下で前記組換え細菌宿主細胞を成長させる指令;更に
(5)場合によっては、或る量の前記培地;更に
(6)場合によっては、前記制御配列が調節プロモーターを使用する場合には、調節プロモーターのための或る量のインデューサー
を含んでなる、少なくとも1g/Lの総生産性で極限酵素を過剰発現するための商用キット。 - 前記極限酵素が分類IUBMB EC2〜6のいずれかの中から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の極限酵素。
- 分類IUBMB EC2〜5のいずれかの範囲内の好極限性酵素のいずれかから選ばれる請求項8に記載の極限酵素。
- 分類IUBMB EC2〜3のいずれかの範囲内の好極限性酵素のいずれかから選ばれる請求項9に記載の極限酵素。
- 分類IUBMB EC3の範囲内の好極限性酵素のいずれかから選ばれる請求項10に記載の極限酵素。
- IUBMB EC3.1〜3.8の範囲内の好極限性酵素のいずれかから選ばれる請求項11に記載の極限酵素。
- IUBMB EC3.1〜3.2又は3.4の範囲内の好極限性酵素のいずれかから選ばれる請求項12に記載の極限酵素。
- IUBMB EC3.2又は3.4の範囲内の好極限性酵素のいずれかから選ばれる請求項13に記載の極限酵素。
- IUBMB EC3.2.1、3.4.21又は3.4.23の範囲内の好極限性酵素のいずれかから選ばれる請求項14に記載の極限酵素。
- セルラーゼ、アミラーゼ、セリンエンドペプチダーゼ及びアスパラギン酸エンドペプチダーゼから選ばれる請求項15に記載の極限酵素。
- アミラーゼ、セリンエンドペプチダーゼ及びアスパラギン酸エンドペプチダーゼから選ばれる請求項16に記載の極限酵素。
- α−アミラーゼ、ピロリシン及びサーモプシンから選ばれる請求項17に記載の極限酵素。
- 前記細菌宿主細胞がグラム陰性Proteobacteria亜群1から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞がグラム陰性Proteobacteria亜群2から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞がグラム陰性Proteobacteria亜群3から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞がグラム陰性Proteobacteria亜群5から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞がグラム陰性Proteobacteria亜群7から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞がグラム陰性Proteobacteria亜群12から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞がグラム陰性Proteobacteria亜群15から選ばれる請求項1〜7、16及び18のいずれか1項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞がグラム陰性Proteobacteria亜群17から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞がグラム陰性Proteobacteria亜群18から選ばれる請求項1〜7、16及び18のいずれか1項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記発現ベクターがRSF1010及びその誘導体から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の発現ベクター。
- 前記制御配列が調節プロモーターを含む請求項1〜7のいずれか1項に記載の制御配列。
- 負の調節がされるプロモーターである請求項29に記載の調節プロモーター。
- Ptacである請求項30に記載の負に調節されるプロモーター。
- 前記成長が、10リットル規模又はそれ以上で実施される請求項1〜7のいずれか1項に記載の成長。
- 発現を可能にする条件下における前記成長が、動作可能なように極限酵素コード配列に連結された調節プロモーターを含む組換え細菌宿主細胞の、前記調節プロモーター用のインデューサーの不存在下における増殖と、その後の、系への前記調節プロモーター用のインデューサーの添加を含んでなる請求項1〜7のいずれか1項に記載の成長。
- 前記培地が最少培地及び炭素源補足無機塩培地から選ばれる請求項1〜7のいずれか1項に記載の培地。
- 炭素源補足無機塩培地である請求項34に記載の培地。
- 更に、制限酵素を分離、単離又は精製することを含んでなる請求項3〜4のいずれか1項。
- 請求項1〜7のいずれか1項に従って発現された極限酵素。
- 請求項1〜7のいずれか1項に従って発現された制限酵素の生体触媒プロセスへの使用。
- 前記極限酵素が、細菌宿主細胞内の封入体中で発現され且つ前記封入体がその後に可溶化される請求項1〜7のいずれか1項に記載の極限酵素。
- 制限酵素のリフォールディングにリフォールディング工程を用いる請求項1〜7及び39のいずれか1項に記載の制限酵素。
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