JPH10506532A - 新規な有害生物防除性タンパク質および菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は有害生物防除性菌株およびタンパク質に関する。栄養増殖期の間に有害生物防除性タンパク質および補助的タンパク質を産生し得るバチラス菌株が提供される。精製されたタンパク質、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列および上記菌株、タンパク質および遺伝子を有害生物を防除するために使用する方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な有害生物防除性タンパク質および菌株 本発明は植物および非植物有害生物を防除するための方法および組成物に関す るものである。特に、バチラス(Bacillus)の栄養増殖期から単離され得る新規有 害生物性タンパク質が開示されている。バチラス菌株、タンパク質および該タン パク質をコードする遺伝子が提供されている。本発明の方法および組成物は植物 および非植物有害生物を防除するための種々の系において使用され得る。 有害昆虫は世界の経済的に重要な農業作物の損失における主な要因である。広 範囲スペクトルの化学的有害生物防除剤は農業上重要な有害生物を防除または根 絶するために広く使用されてきた。しかしながら、有効な別の有害生物防除剤の 開発に実質的な興味がある。 微生物の有害生物防除剤は化学的な有害生物防除に対する別法として重要な役 割を果たしてきた。最も広く使用される微生物製品はバクテリアであるバチラス ・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）をベースとしている。 Ｂｔは胞子形成の間に殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）を産生するグラム陽性の 胞子形成性バチラスである。 ２５を越える異なるが関連するＩＣＰを産生するＢｔの多くの変種が知られて いる。Ｂｔにより製造されるＩＣＰの大部分は鱗翅目、双翅目および甲虫目のあ る種の 昆虫の幼虫に対して毒性である。一般に、ＩＣＰは感受性の昆虫により摂取され る場合、上記結晶は溶解され、そして昆虫の消化管のプロテアーゼにより毒性部 分に変換される。甲虫目の幼虫、例えばコロラドハムシ〔レプチノタルサ・デセ ムリネアタ(Leptinotarsa decemlineata)〕またはチャイロコメノゴメムシダマ シ〔テネブリオ・モリトル(Tenebrio molitor)〕に対するＩＣＰ活性はジアブロ ティカ(Diabrotica)属の一員、特にジアブロティカ・ビルギフェラ・ビルギフェ ラ(Diabrotica virgifera virgifera)、西方ハムシモドキ（ＷＣＲＷ）またはジ アブロティカ・ロンギコルニス・バルベリ(Diabrotica longicornis barberi)、 北方ハムシモドキには顕著な効果を示さない。 バチラス・セレウス(Bacillus cereus)（Ｂｃ）はＢｔに密接に関連する。主 要な区別し得る特徴はＢｃにおける副芽胞結晶の不在である。Ｂｃは、通常土壌 中に見出され、そして様々な食物および薬剤から単離されている広範囲に分散し たバクテリアである。このような生物は食料の損傷に関連してきた。 Ｂｔは有害昆虫の防除に非常に有用であったが、強力な生物学的防除剤の数を 増やすことに対する要望がある。 本発明の範囲内で、植物有害生物を防除するための組成物および方法が提供さ れる。特に、バチラス菌株の栄養生殖期（増殖期）の間に産生される新規な有害 生物防除性タンパク質が提供される。該タンパク質は有害生物 防除剤として有用である。 より詳しくは、本発明は、栄養生殖期の間に有害生物防除性タンパク質を産生 する、バチラス・スファエリカス(B．sphaericus)ＳＳＩＩ−１ではない実質的 に精製されたバチラス菌株に関するものである。受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０ ５８を有するバチラス菌株および受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０６０を有するバ チラス・スリンギエンシス菌株が好ましい。また、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１ ２２４、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２５、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２６、ＮＲＲＬ Ｂ −２１２２７、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２８、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２９、ＮＲＲ Ｌ Ｂ−２１２３０およびＮＲＲＬ Ｂ−２１４３９から選択されるバチラス菌 株が好ましい。 本発明はさらに、バチラス種、好ましくはバチラス・スリンギエンシスおよび バチラス・セレウス菌株の栄養生殖期の間に単離され得る昆虫特異的タンパク質 およびそれらの一部であって、該タンパク質はバチラス・スファエリカスＳＳＩ Ｉ−１からの殺蚊性毒素ではないものに関する。本発明の昆虫特異的タンパク質 は好ましくは甲虫目および鱗翅目の昆虫に対して毒性であり、そして約３０ｋＤ ａまたはそれ以上、好ましくは約６０ないし約１００ｋＤａ、そしてさらに好ま しくは約８０ｋＤａの分子量を有する。 より詳しくは、本発明の昆虫特異的タンパク質はアグロチス(Agrotis)および ／またはスポドプテラ(Spodopt era)、好ましくはタマナヤガ〔アグロチス・イプシロン(Agrotis ipsilon)；Ｂ ＣＷ〕および／またはシロナヤガ〔スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fr ugiperda)〕および／またはシロイチモンジヨトウガ〔スポドプテラ・エキシグ ア(Spodoptera exigua)〕および／またはオオタバコガ(tobacco budworm)および ／またはオオタバコガ(corn earworm)〔ヘリコベルパ・ゼア(Helicoverpa zea) 〕活性に対する活性を包含する殺虫活性のスペクトルを有する。 本発明の昆虫特異的タンパク質は好ましくは例えば受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２ １０５８を有するバチラス菌株および受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０６０を有す るバチラス・スリンギエンシス菌株から単離され得る。 本発明の昆虫特異的タンパク質はまた好ましくは、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２ １２２４、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２５、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２６、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２７、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２８、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２９、ＮＲ ＲＬ Ｂ−２１２３０およびＮＲＲＬ Ｂ−２１４３９から選択されるバチラス 菌株から単離され得る。 本発明は特に、配列番号：５および配列番号：７からなる群から選択されるア ミノ酸配列を有する昆虫特異的タンパク質およびそれらに対する構造的および／ または機能的相同体であるあらゆるタンパク質を含む。 配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２９、 配列番号：３２および配列番号：２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有 する昆虫特異的タンパク質およびそれらに対する構造的および／または機能的相 同体であるあらゆるタンパク質がさらに好ましい。 特に好ましいのは、配列番号：２９および配列番号：３２からなる群から選択 されるアミノ酸配列を有する昆虫特異的タンパク質およびそれらに対する構造的 および／または機能的相同体であるあらゆるタンパク質である。 本発明のさらに好ましい態様は、分泌シグナルを示す配列が除去または不活性 化された本発明の昆虫特異的タンパク質を包含する。 本発明はさらに、昆虫特異的タンパク質の昆虫特異的活性を高める補助的タン パク質を包含する。該補助的タンパク質は好ましくは約５０ｋＤａの分子量を有 し、そして例えばバチラス・セレウス菌株、好ましくはバチラス・セレウスＡＢ ７８菌株の栄養増殖期から単離され得る。 本発明の好ましい態様は、分泌シグナルを示す配列が除去または不活性化され た補助的タンパク質に関するものである。 本発明はさらに、１より多いポリペプチド鎖を含む多重結合性有害生物防除タ ンパク質に関し、該ポリペプチド鎖の少なくとも１つは本発明の昆虫特異的タン パク質を示し、そして前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つは該昆虫特異的タン パク質の有害生物防除活性を活性化ま たは高める本発明の補助的タンパク質を示す。 本発明に係る多重結合性有害生物防タンパク質は好ましくは約５０ｋＤａない し約２００ｋＤａの分子量を有する。 本発明は特に、本発明の昆虫特異的タンパク質と該昆虫特異的タンパク質の有 害生物防除活性を活性化または高める本発明に係る補助的タンパク質とを含む多 重結合性有害生物防除タンパク質を包含する。 本発明はさらに、リボソームにより翻訳された場合に、本発明の昆虫特異的タ ンパク質および／または本発明に係る補助的タンパク質、そして場合によって融 合に使用されたその他の部分の併合された属性を少なくとも有する融合タンパク 質を製造するフレーム内遺伝子融合(in frame genetic fusion)により製造され る、本発明の昆虫特異的タンパク質および／または本発明に係る補助的タンパク 質を少なくとも包含するいくつかのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質に 関する。 本発明の特定の態様は、リボヌクレアーゼＳタンパク質、本発明の昆虫特異的 タンパク質および本発明に係る補助的タンパク質を含む融合タンパク質に関する 。 本発明のその他の特定の態様は、本発明に係る昆虫特異的タンパク質および本 発明に係る補助的タンパク質を含有する融合タンパク質で、該融合タンパク質の Ｎ末端に上記昆虫特異的タンパク質または補助的タンパク質を有する融合タンパ ク質に関する。 配列番号：２３で示されるタンパク質を生じる、配列番号：５で示される昆虫 特異的タンパク質と配列番号：２で示される補助的タンパク質を含む融合タンパ ク質およびそれらの構造的および／または機能的相同体が好ましい。 配列番号：５０で示されるタンパク質を生じる、配列番号：３５で示される昆 虫特異的タンパク質と配列番号：２７で示される補助的タンパク質を含む融合タ ンパク質およびそれらの構造的および／または機能的相同体もまた好ましい。 本発明はさらに、受容タンパク質とは異種起源であるシグナル配列、好ましく は分泌シグナル配列または特定のオルガネラまたは細胞画分に導入遺伝子産物を 導く標的化（ターゲッティング）配列に融合された本発明の昆虫特異的タンパク 質および／または本発明の補助的タンパク質を含む融合タンパク質に関する。 本発明内で特に好ましいのは、配列番号：４３または配列番号：４６で示され た配列を有する融合タンパク質およびそれらの構造的および／または機能的相同 体である。 本願において使用されるように、実質的な配列相同性はアミノ酸の配列間の密 接な構造的関連を意味する。例えば、実質的に相同なタンパク質は４０％相同で あり得、好ましくは５０％、そして最も好ましくは６０％もしくは８０％、また はそれ以上相同であり得る。相同性はま た、アミノ酸の１つまたはいくつかの部分配列が欠失しているか、または追加の アミノ酸を有する部分配列が挿入されている関係を包含する。 本発明の別の面は、バチラス種およびそれらの一部の栄養生殖期の間に単離さ れ得る昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子 であって、該タンパク質はバチラス・スファエリカスＳＳＩＩ−１からの殺蚊性 毒素ではない上記ＤＮＡ分子に関する。特に、本発明は、殺虫活性のスペクトル がアグロチスおよび／またはスポドプテラ、好ましくはタマナヤガ〔アグロチス ・イプシロン；ＢＣＷ〕および／またはシロナヤガ〔スポドプテラ・フルギペル ダ〕および／またはシロイチモンジヨトウガ〔スポドプテラ・エキシグア〕およ び／またはオオタバコガ(tobacco budworm)および／またはオオタバコガ(corn e arworm)〔ヘリコベルパ・ゼア〕活性に対する活性を包含する昆虫特異的タンパ ク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子に関する。 配列番号：４または配列番号：６で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ 分子、およびそれらに対する構造的および／または機能的相同体であるあらゆる ＤＮＡ分子が好ましい。 配列番号：１９、配列番号：２８、配列番号：３１または配列番号：１で示さ れるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子、およびそれらに対する構造的および ／また は機能的相同体であるあらゆるＤＮＡ分子もまた好ましい。 本発明はさらに、昆虫特異的タンパク質の昆虫特異的活性を高める本発明に係 る補助的タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子に関する 。 配列番号：１９で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子およびそれら に対する構造的および／または機能的相同体であるあらゆるＤＮＡ分子が好まし い。 本発明の別の態様は、バチラス種の栄養生殖期の間に単離され得る昆虫特異的 タンパク質およびそれらの一部をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分 子であって、該タンパク質はバチラス・スファエリカスＳＳＩＩ−１からの殺蚊 性毒素ではなく、ヌクレオチド配列は微生物または植物内での発現のために最適 化されている上記ＤＮＡ分子に関する。 配列番号：１７または配列番号：１８で示されるヌクレオチド配列からなるＤ ＮＡ分子およびそれらに対する構造的および／または機能的相同体であるあらゆ るＤＮＡ分子が好ましい。 配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２７または配列番号：３０で示 されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子およびそれらに対する構造的および ／または機能的相同体であるあらゆるＤＮＡ分子もまた好ましい。 本発明はさらに、１より多いポリペプチド鎖を含む多 重結合性有害生物防除タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ 分子に関し、該ポリペプチド鎖の少なくとも１つは本発明の昆虫特異的タンパク 質を示し、そして前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つは該昆虫特異的タンパク 質の有害生物防除活性を活性化または高める本発明の補助的タンパク質を示す。 本発明の昆虫特異的タンパク質および該昆虫特異的タンパク質の有害生物防除 活性を活性化または高める本発明に係る補助タンパク質をコードするヌクレオチ ド配列からなるＤＮＡ分子が好ましい。 特に好ましいのは、配列番号１または配列番号：１９で示されるヌクレオチド 配列または構造的および／または機能的相同体であるあらゆるヌクレオチド配列 からなるＤＮＡ分子が特に好ましい。本発明の別の態様は、リボソームにより翻 訳された場合に、本発明の昆虫特異的タンパク質および／または本発明に係る補 助的タンパク質、そして場合によって融合に使用されたその他の部分の併合され た属性を少なくとも有する融合タンパク質を製造するフレーム内遺伝子融合によ り製造される、本発明の昆虫特異的タンパク質および／または本発明に係る補助 的タンパク質を少なくとも包含するいくつかのタンパク質ドメインを含む融合タ ンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子に関する。 本発明の中で好ましいのは、本発明に係る昆虫特異的タンパク質および本発明 に係る補助的タンパク質を含有 する融合タンパク質で、該融合タンパク質のＮ末端に上記昆虫特異的タンパク質 または補助的タンパク質を有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列 からなるＤＮＡ分子である。特に好ましいのは、配列番号：２２で示されるヌク レオチド配列からなるＤＮＡ分子、および構造的および／または機能的相同体で あるあらゆるＤＮＡ分子である。 本発明はさらに、受容ＤＮＡとは異種起源であるシグナル配列、好ましくは分 泌シグナル配列または特定のオルガネラまたは細胞画分に導入遺伝子産物を導く 標的化（ターゲッティング）配列に融合された本発明の昆虫特異的タンパク質お よび／または本発明の補助的タンパク質を含有する融合タンパク質をコードする ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子に関する。 本発明はさらに、微生物または植物内での発現のために最適化されている本発 明に係る融合タンパク質または多重結合タンパク質をコードするヌクレオチド配 列からなるＤＮＡ分子を包含する。 配列番号：４２、配列番号：４５または配列番号：４９で示されたヌクレオチ ド配列からなる最適化ＤＮＡ分子、およびそれらの構造的および／または機能的 相同体であるあらゆるＤＮＡ分子が好ましい。 本発明はさらに、分泌シグナルをコードする配列が５’末端から除去された最 適化ＤＮＡ分子、特に配列番号：３５または配列番号：３９で示されるヌクレオ チド 配列からなる最適化ＤＮＡ分子、およびそれらの構造的および／または機能的相 同体であるあらゆるＤＮＡ分子に関する。 本願において使用されるように、実質的な配列相同性はヌクレオチドの配列間 の密接な構造的関連を意味する。例えば、実質的に相同なＤＮＡ分子は６０％相 同であり得、好ましくは８０％、そして最も好ましくは９０％もしくは９５％、 またはそれ以上相同であり得る。相同性はまた、ヌクレオチドまたはアミノ酸の １つまたはいくつかの部分配列が欠失しているか、または追加のヌクレオチドま たはアミノ酸を有する部分配列が挿入されている関係を包含する。 上記したように本発明に係るＤＮＡ分子とハイブリッド形成するＤＮＡ分子、 好ましくは温和な厳密性の条件下、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの前記昆 虫特異的タンパク質のコード配列の隣接部分を含む前記ＤＮＡ分子から得られる オリゴヌクレオチドプローブに関し、前記分子は昆虫特異的活性を有し、そして 前記昆虫特異的タンパク質は前記ＤＮＡ分子によりコードされる。 ハイブリッド形成が７％ＳＤＳおよび０．５Ｍリン酸ナトリウムからなる緩衝 液中６５℃で起こるＤＮＡ分子が好ましい。以下の工程からなる方法により得ら れる本発明に係る昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる ＤＮＡ分子が特に好ましい： （ａ）昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド 配列からなるＤＮＡ分子を得、そして （ｂ）配列番号：２８、配列番号：３０または配列番号：３１で示されるヌクレ オチド配列からなるＤＮＡ分子から得られる請求項１０７に係るオリゴヌクレオ チドプローブと前記ＤＮＡ分子をハイブリッド形成させ、そして （ｃ）前記のハイブリッド形成されたＤＮＡを単離する。 本発明はさらに、本発明に係るＤＮＡ分子によりコードされる昆虫特異的タン パク質に関する。 宿主有機体（生物）、好ましくは微生物または植物内での結合されたＤＮＡ構 築物の発現に必要な転写および翻訳制御シグナルおよび所望によりその他の制御 配列を包含する発現配列に操作可能に連結された本発明に係るＤＮＡ分子からな る発現カセットもまた本発明に包含される。 本発明はさらに、本発明に係る発現カセットを含むベクター分子に関する。 本発明に係る発現カセットおよび／またはベクター分子は好ましくは植物ゲノ ムの一部である。 本発明のその他の態様は本発明に係るＤＮＡ分子を含む宿主有機体、好ましく は植物および昆虫細胞、バクテリア、酵母、バキュロウイルス、原生動物、線虫 および藻類からなる群から選択される宿主有機体、該宿主有機体のゲノム中に安 定に組み込まれていることが好ましい前記ＤＮＡ分子を含む発現カセットまたは 該発現カセッ トを含むベクター分子に関する。 本発明はさらに、本発明に係るＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、好 ましくはトウモロコシ植物およびそれらの一部ならびにそれらの後代および種子 、該植物ゲノム中に安定に組み込まれていることが好ましい前記ＤＮＡ分子を含 む発現カセットまたは該発現カセットを含むベクター分子に関する。 本発明に係るＤＮＡ分子で安定に形質転換されたトランスジェニック植物およ びそれらの一部ならびにそれらの後代および種子、前記ＤＮＡ分子を含む発現カ セットまたは該発現カセットを含むベクター分子が好ましい。 本発明に係る昆虫特異的タンパク質を発現するトランスジェニック植物および その一部ならびにそれらの後代および種子もまた好ましい。 本発明はさらに、第２の明白な昆虫制御要素（原理）、好ましくはＢｔδ−エ ンドトキシン（内毒素）をさらに発現する上記したような本発明に係るトランス ジェニック植物、好ましくはトウモロコシ植物に関する。該植物は好ましくはハ イブリッド植物である。 トランスジェニック植物の一部は本発明内では、例えば本発明に係るＤＮＡ分 子で前もって形質転換されたトランスジェニック植物またはそれらの後代に由来 し、それ故にトランスジェニック細胞を少なくとも部分的に含有する植物細胞、 プロトプラスト、組織、カルス、胚ならびに花、茎、果実、葉、根を含むものと 理解され、そ れもまた本発明の対象である。 本発明はさらに、種子保護コーティングで処理される本発明に係る植物の植物 増殖材料に関する。 本発明はさらに、本発明に係るＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含む発現カセット または該発現カセットを含むベクター分子で形質転換された微生物を包含し、該 微生物は好ましくは植物上で増殖する微生物、より好ましくは根寄生性バクテリ アである。 本発明のその他の態様は本発明に係る昆虫特異的タンパク質を含む微生物から なるカプセル化された昆虫特異的タンパク質に関する。 本発明はまた、本発明の宿主有機体からなる殺虫組成物、好ましくは殺虫有効 量の精製されたバチラス菌株と適当な担体とからなる殺虫組成物に関する。 殺虫有効量の本発明に係る単離されたタンパク質分子を単独で、または本発明 の宿主有機体および／または本発明に係るカプセル化された昆虫特異的タンパク 質と組み合わせて、適当な担体と共に含有する殺虫組成物が本発明によりさらに 包含される。 本発明のその他の態様は本発明に係る精製された昆虫特異的タンパク質を獲得 する方法に関し、該方法は該昆虫特異的タンパク質を含有する溶液をＮＡＤカラ ムに注入し、そして結合されたタンパク質を溶離することからなる。 本発明に係る昆虫特異的タンパク質の昆虫活性を同定 する方法もまた含まれ、該方法は以下の工程からなる： バチラス菌株を培養液中で増殖させ、 該培液体から上澄みを得、 該上澄みを昆虫の幼虫に摂食させ、そして 死虫率を測定する。 本発明のもう一つの面は本発明に係る昆虫特異的タンパク質を単離する方法に 関し、該方法は以下の工程からなる： バチラス菌株を培養液中で増殖させ、 該培液体から上澄みを得、そして 該上澄みから上記昆虫特異的タンパク質を単離する。 本発明はまた、本発明に係るタンパク質の殺虫活性を示す昆虫特異的タンパク 質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を単離する方法を包含し、該 方法は以下の工程からなる： 昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子を得、 そして 該ＤＮＡ分子をバチラス種から得られるＤＮＡとハイブリッド形成し、そして 該ハイブリッド形成されたＤＮＡを単離する。 本発明はさらに、本発明に係る昆虫特異的タンパク質とは異なる少なくとも１ つの第２の殺虫性タンパク質、好ましくはＢｔδ−エンドトキシン、プロテアー ゼインヒビター、レクチン、α−アミラーゼおよびペルオキシダーゼからなる群 から選択される殺虫性タンパク質と組 み合わせた本発明に係る昆虫特異的タンパク質を用いることにより昆虫の標的範 囲を拡大する方法に関する。 本発明に係る昆虫特異的タンパク質とは異なる少なくとも１つの第２の殺虫性 タンパク質、好ましくはＢｔδ−エンドトキシン、プロテアーゼインヒビター、 レクチン、α−アミラーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される殺 虫性タンパク質と組み合わせた本発明に係る昆虫特異的タンパク質を植物内で発 現することにより植物内で昆虫の標的範囲を拡大する方法が好ましい。 植物または該植物の生育領域に本発明に係る殺虫組成物または毒素タンパク質 を施用することからなる、有害昆虫、好ましくはスポドプテラおよび／またはア グロチス種、そしてより好ましくはタマナヤガ〔アグロチス・イプシロン；ＢＣ Ｗ〕、シロナヤガ〔スポドプテラ・フルギペルダ〕、シロイチモンジヨトウガ〔 スポドプテラ・エキシグア〕、オオタバコガ(tobacco budworm)および／または オオタバコガ(corn earworm)〔ヘリコベルパ・ゼア〕により引き起こされる損傷 から植物を保護する方法もまた包含される。 本発明はさらに、本発明に係る昆虫特異的タンパク質を発現するトランスジェ ニック植物を有害昆虫が発生し得る領域内に植えることからなる、有害昆虫、好 ましくはスポドプテラおよび／またはアグロチス種、そしてより好ましくはタマ ナヤガ〔アグロチス・イプシロン；ＢＣＷ〕、シロナヤガ〔スポドプテラ・フル ギペルダ〕、 シロイチモンジヨトウガ〔スポドプテラ・エキシグア〕、オオタバコガ(tobacco budworm)および／またはオオタバコガ(corn earworm)〔ヘリコベルパ・ゼア〕 により引き起こされる損傷から植物を保護する方法に関する。 本発明はまた、本発明に係るＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含む発現カセットま たは該発現カセットを含むベクター分子で宿主有機体を形質転換することからな る、ゲノム内に安定に組み込まれた本発明に係るＤＮＡ分子を含み、そして本発 明に係る昆虫特異的タンパク質を好ましくは発現する宿主有機体の製造方法を包 含する。 本発明の別の態様は、本発明に係るＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含む発現カセ ットまたは該発現カセットを含むベクター分子で植物または植物細胞を形質転換 することからなる、植物ゲノム内に安定に組み込た本発明に係るＤＮＡ分子を含 み、そして本発明に係る昆虫特異的タンパク質を好ましくは発現するトランスジ ェニック植物または植物細胞の製造方法を包含する。 本発明はまた、殺虫有効量の本発明に係る単離されたバチラス菌株および／ま たは宿主有機体および／または単離されたタンパク質分子および／またはカプセ ル化されたタンパク質を適当な担体と混合することからなる殺虫組成物の製造方 法に関する。 本発明はまた、植物ゲノム内に安定に組み込まれた本発明に係る昆虫特異的タ ンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子を含むトランスジェ ニック 親植物のトランスジェニック後代を作出する方法であって、本発明に係るＤＮＡ 分子、該ＤＮＡ分子を含む発現カセットまたは該発現カセットを含むベクター分 子で親植物を形質転換し、そして公知育種技術等により前記トランスジェニック 親植物の後代に有害生物防除の形質を伝達することからなる上記方法を包含する 。 バチラス種の栄養生殖期の間に単離され得る昆虫特異的タンパク質およびそれ らの一部をコードするヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成するオリゴ ヌクレオチドプローブもまた本発明に包含され、該タンパク質はバチラス・スフ ァエリカスＳＳＩＩ−１からの殺蚊性毒素ではなく、該プローブは長さが少なく とも１０ヌクレオチドの前記昆虫特異的タンパク質のコード配列の隣接部分を含 み、昆虫特異的タンパク質が天然に存在するか、または特定の形質転換された有 機体が前記遺伝子を含むかを決定するためにあらゆるバチラス菌株またはその他 の有機体をスクリーニングするために上記オリゴヌクレオチドプローブを使用す る。 本発明は、有害生物防除タンパク質がバチラス菌株の栄養生殖期の間に産生さ れることを認識する。そのような類が存在することを認識して、本発明はバチラ ス・スファエリカスからの殺蚊性毒素を除く全ての栄養生殖殺虫性タンパク質（ 以下、ＶＩＰと記載する）を包含する。 本発明のＶＩＰは胞子形成の後に豊富ではなく、特に静止期の前の対数期の間 に発現される。本発明の目的の ために、栄養生殖期は胞子形成の開始前の期間として定義される。例えばＶＩＰ をコードする遺伝子は単離され、クローン化され、そして有害生物操作プログラ ムにおける使用のための種々の伝達ビヒクル中で形質転換され得る。 本発明の目的のために、有害生物は昆虫、菌類、バクテリア、線虫、ダニ(mit e)、マダニ(tick)、原生動物病原体、動物寄生肝吸虫等を包含するが、これらに 限定されない。有害昆虫は甲虫目、双翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目、ハ ジラミ類(Mallophaga)、同翅類(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthr optera)、アザミウマ目(Thysanoptera)、ハサミムシ目(Dermaptera)、シロアリ 目(Isoptera)、シラミ類(Anoplura)、シホナプテラ(Siphonaptera)、トビケラ目 (Trichoptera)、その他、特に甲虫目および鱗翅目から選択される昆虫を包含す る。 表１−１０は主要栽培植物と関連する有害生物およびヒトやその他の動物に重 要な有害生物の一覧である。そのような有害生物は本発明の範囲内に包含される 。 有害生物防除性タンパク質がバチラスの栄養生殖期から単離され得ることが認 識された今では、その他の菌株が標準的方法により単離され得、そして特定の植 物および非植物有害生物に対する活性が試験され得る。一般的に、バチラス菌株 は土壌、植物、昆虫、穀物倉庫粉塵およびその他の試料材料等のあらゆる環境の 試料から、当該分野で公知の方法により単離され得る。例えば、以下の文献参照 ：Travers 等（1987）Appl．Environ．Microbiol．53:1263-1266; Saleh 等（19 69）Can J．Microbiol．15:1101-1104; DeLucca 等（1981）Can J．Microbiol． 27:865-870; およびNorris等（1981）“The genera Bacillus and Sporolactoba cillus，”Starr 等（編），The Prokaryotes: A Handbook on Habitats，Isola tion，and Identification of Bacteria，Vol．II，Spriger-Verlag Berlin Hei delberg 所収。単離の後、菌株は栄養 生殖期の間に有害生物防除活性が試験され得る。このようにして、新規有害生物 防除性タンパク質および菌株は同定され得る。 本発明における用途を見出すそのようなバチラス微生物はバチラス・セレウス およびバチラス・スリンギエンシス、ならびに表１１に挙げたバチラス種を包含 する。 本発明に従って、栄養生殖期の間に産生される有害生物防除性タンパク質はバ チラスから単離され得る。一つの態様において、栄養生殖期の間に産生される殺 虫性タンパク質が単離され得る。タンパク質単離の方法は当業界で公知である。 一般に、タンパク質はゲル濾過、イオン交換およびイムノアフィニティクロマト グラフィーを包含する慣用のクロマトグラフィーにより、高性能液体クロマトグ ラフィー、例えば逆相高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換高性能液体ク ロマトグラフィー、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー、高性能等電点ク ロマトグラフィーおよび疎水的相互作用クロマトグラフィー等により、電気泳動 分離、例えば一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動等により精製され得る。 そのような方法は当業界で公知である。例えば、Current Protocols in Molecul ar Biology，Vols．1 and 2，Ausubel等（編），John Wiley & Sons，NY(1988) 参照。さらに、抗体はタンパク質の実質的に純粋な調製物に対して製造され得る 。例えば、Radka 等（1983）J．Immunol．128:2804; およびRadka 等（1984）Im munogenetics 19:63参照。方法のあらゆる組合せが有害生物防除性を有するタン パク質を精製するために利用されてもよい。プロトコルが作成されるので、有害 生物防除活性は各精製段階の後に決定される。 そのような精製段階は実質的に精製されたタンパク質画分を生じる。「実質的 に精製された」または「実質的 に純粋な」は、天然の状態にあるタンパク質と通常結合しているあらゆる化合物 が実質的にないタンパク質を意味する。タンパク質の「実質的に純粋な」調製物 は視覚で決定されるようなＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くその他の検出可能なタンパク 質バンドの不在により、またはデンシトメーター走査により評価され得る。また 、精製された調製物におけるその他のアミノ末端配列またはＮ末端残基の不在が 純度の程度を示し得る。純度はイオン交換、逆相またはキャピラリー電気泳動に よるその他のピークの不在を示す「純粋な」調製物の再クロマトグラフィーによ り証明され得る。「実質的に純粋な」または「実質的に精製された」という用語 はタンパク質とその他の化合物との人工的または合成的混合物を除外することを 意味しない。この用語はまた、タンパク質の生物学的活性を妨害せず、そして例 えば不完全な精製に起因して存在してもよい少量の不純物の存在を除外すること を意味しない。 精製タンパク質が単離されたら、該タンパク質またはそれが含まれるそのポリ ペプチドは当業界で公知の標準的方法により特徴づけおよび配列決定され得る。 例えば、前記精製タンパク質またはそれが含まれるそのポリペプチドは臭化シア ンまたはプロテアーゼ、例えばパパイン、キモトリプシン、トリプシン、リシル −Ｃエンドペプチダーゼ等で断片化され得る（Oike等（1982）J．Biol．Chem．2 57:9751-9758; Liu 等（1983）Int．J．Pept．Pr otein Res．21:209-2159）。得られたペプチドは好ましくはＨＰＬＣによるか、 またはゲルの分解およびＰＶＤＦ膜上でのエレクトロブロッティングにより分離 され、そしてアミノ酸配列決定に供される。この操作を完了するために、ペプチ ドは好ましくは自動化配列決定装置により分析される。Ｎ末端、Ｃ末端または内 部アミノ酸配列が決定され得ることが認識される。精製されたタンパク質のアミ ノ酸配列から、有害生物防除タンパク質をコードする遺伝子の単離を補助するた めのプローブとして使用され得るヌクレオチド配列が合成され得る。 有害生物防除タンパク質はオリゴマーであってもよく、そして分子量、プロト マーの数、成分ペプチド、特定の有害生物に対する活性およびその他の特徴にお いて変化し得ることが認識される。しかしながら、上記の方法により、様々な種 類の有害生物に対して活性なタンパク質が単離され、そして特徴づけられ得る。 精製されたタンパク質が単離され、そして特徴づけられたら、アミノ酸置換、 欠失、切除および挿入等の種々の方法で変更されてもよい。そのような操作の方 法は一般に当業界で公知である。例えば、有害生物防除タンパク質のアミノ酸配 列変形体はＤＮＡにおける突然変異により製造され得る。そのような変形体は所 望の有害生物防除活性を有する。明らかに、上記変形体をコードするＤＮＡにお いて起こる突然変異は読み枠の外に配列を置く必要はなく、そして好ましくは第 ２のｍＲＮＡ構造を 製造し得る相補性領域を創生しない。ＥＰ特許出願公開第７５４４４号参照。 このようにして、本発明は有害生物防除タンパク質ならびにそれらの成分（一 部）および断片を包含する。すなわち、有害生物防除活性を保持する上記タンパ ク質の成分プロモーター、ポリペプチドまたは断片が製造されることが認識され る。これらの断片は上記タンパク質の（先端）切除された配列ならびにＮ末端、 Ｃ末端、内部および内部切除アミノ酸配列を包含する。 タンパク質配列の多くの欠失、挿入および置換は有害生物防除タンパク質の特 徴における根本的な変化を生じることが予期されない。しかしながら、置換、欠 失または挿入の正確な影響をその実施前に予期することが困難である場合、当業 者はその影響が通常のスクリーニングアッセイにより評価されることを理解する 。 本明細書に記載されたタンパク質またはその他の成分ポリペプチドは単独また は組合せで使用され得る。すなわち、種々のタンパク質が異なる有害昆虫を防除 するために使用され得る。 いくつかのタンパク質は単一のポリペプチド鎖であるが、多くのタンパク質は １より多いポリペプチド鎖からなり、すなわちそれらはオリゴマーである。さら に、いくつのかＶＩＰはオリゴマーとして有害生物防除活性である。これらの例 において、追加のプロモーターは有害生物防除活性を昂進するため、または有害 生物防除タン パク質を活性化するために利用される。昂進または活性化するこれらのプロモー ターは補助的タンパク質と呼ばれる。補助的タンパク質は、有害生物防除タンパ ク質と相互作用して該補助的タンパク質の不在下で観察されるものに比べて昂進 した有害生物防除活性を有するオリゴマータンパク質を形成することにより、有 害生物防除タンパク質を活性化または昂進する。 補助的タンパク質は有害生物防除タンパク質、例えばＡＢ７８からのＶＩＰ１ タンパク質の活性を活性化または昂進する。そのような補助的タンパク質はＡＢ ７８からのＶＩＰ２タンパク質が例示されるが、それに限定されない。本明細書 の実施例の箇所に示されているように、補助的タンパク質は多くの有害生物防除 タンパク質を活性化し得る。従って、本発明の一態様において、親植物１は補助 的タンパク質で形質され得る。この親植物１は、その有害生物防除活性が補助的 タンパク質により活性化される１またはそれ以上の有害生物防除タンパク質で形 質転換された多くの親植物２と交雑され得る。 本発明の有害生物防除タンパク質の中で、昆虫特異的タンパク質の新規な種類 は本発明の範囲内で驚くべきことに同定され得る。本明細書全体でＶＩＰ３と表 記される上記タンパク質はバチラス菌株、好ましくはバチラス・スリンギエンシ ス菌株、そしてより好ましくはバチラス・スリンギエンシスＡＢ８８およびＡＢ ４２４菌株から得られ得る。上記ＶＩＰはＡＢ８８菌株において合計 で少なくとも７５％にのぼるバチラス培養体の上澄み中にほとんど存在する。Ｖ ＩＰ３タンパク質は、アグロチスおよび／またはスポドプテラ種、特にタマナヤ ガ〔ＢＣＷ〕および／またはシロナヤガおよび／またはシロイチモンジヨトウガ および／またはオオタバコガ(tobacco budworm)および／またはオオタバコガ(co rn earworm)活性に対する活性を包含する殺虫活性の独特なスペクトルによりさ らに特徴づけられる。 タマナヤガはδ−エンドトキシンに対して全く耐性な作物学的に重要な昆虫で ある。Maclntosh 等(1990)J．Invertebr Pathol 56，258-266は、δ−エンドト キシンＣｒｙＩＡ（ｂ）およびＣｒｙＩＡ（ｃ）がそれぞれ８０μｇおよび１８ μｇ／ｍｌ（食餌）を越えるＬＤ₅₀でもってＢＣＷに対する殺虫特性を有するこ とを報告している。本発明に係るＶＩＰ３Ａ殺虫性タンパク質は、丁度５０％の 死虫率を達成するために使用されるＣｒｙＩＡタンパク質の量に比べ少なくとも １０ないし５００倍、好ましくは５０ないし３５０倍、より好ましくは２００な いし３００倍少ない量で添加され場合に、＞５０％の死虫率を提示する。本発明 の範囲内で特に好ましいのは、丁度５０％の死虫率を達成するために使用される ＣｒｙＩＡタンパク質の量に比べ少なくとも２６０倍少ないタンパク質の量で添 加され場合に、１００％の死虫率を提示するＶＩＰ３Ａ殺虫性タンパク質である 。 本発明に係るＶＩＰ３Ａ殺虫性タンパク質は培養液の 上澄み中にほとんど存在し、そしてそれ故に、分泌されたタンパク質として分類 されるべきである。それらは好ましくはＮ末端配列にそれに疎水性コア領域が続 く多くの陽性に荷電した残基を含有し、そして移送の間にＮ末端がプロセシング を受けない。 本発明の範囲内でこれまで報告されたその他の有害生物防除タンパク質として 、ＶＩＰ３タンパク質はδ−エンドトキシン類に属するその他のタンパク質とは 明らかに異なり、胞子形成前の増殖期では検出され得ない。好ましくは、昆虫特 異的タンパク質の発現は対数中期の間に開始し、そして胞子形成の間継続する。 ＶＩＰ３タンパク質の高い安定性と組み合わせた特定の発現様式のために、大量 のＶＩＰ３タンパク質は胞子形成性培養液の上澄み中に見出され得る。特に好ま しいのは、配列番号：２９および配列番号：３２で示されるＶＩＰ３タンパク質 であり、そして該タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる相当するＤ ＮＡ分子、特に配列番号：２８、配列番号：３０および配列番号：３１に示され るヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子である。 本発明の有害生物防除タンパク質は昆虫標的範囲を広げるために、Ｂｔエンド トキシンまたはその他の殺虫性タンパク質と組み合わせて使用され得る。さらに 、Ｂｔδ−エンドトキシンまたは異なる性質のその他の殺虫要素と組み合わせた 本発明のＶＩＰの使用は昆虫耐性の防止および／または操作のために特別な用途 を有する。そ の他の殺虫要素はプロテアーゼ阻害剤（セリン型およびシステイン型の両方）、 レクチン、α−アミラーゼおよびパーオキシダーゼを包含する。一つの好ましい 態様において、トランスジェニック植物におけるＶＩＰの発現は１またはそれ以 上のＢｔδ−エンドトキシンの発現が付随する。同じトランスジェニック植物に おける１より多い殺虫原理の上記共発現は必要な全ての遺伝子を含み、そして発 現するために植物を遺伝子操作することにより行われ得る。また、親植物１はＶ ＩＰの発現のために遺伝子操作され得る。第２の親植物２はＢｔδ−エンドトキ シンの発現のために遺伝子操作され得る。親植物１を親植物２と交雑することに より、親植物１および２中に導入された全ての遺伝子を発現する後代植物が得ら れる。特に好ましいＢｔδ−エンドトキシンは参照により本明細書に編入される ＥＰ−Ａ０６１８９７６に開示されたものである。 全てではないが、実質的に多数の細胞毒性タンパク質は作用において二元であ る。二元毒素は、一方がＡドメインと呼ばれ、他方がＢドメインと呼ばれる２つ のタンパク質ドメインから典型的には構成される（Sourcebook of Bacterial Pr otein Toxins，J．B．Alouf およびJ．H．Freer 編(1991)Academic Press 参照 ）。Ａドメインは強力な細胞毒性活性を有する。Ｂドメインは内在化される前に 外部細胞表面受容体を結合する。典型的には、細胞毒性Ａドメインは移動ドメイ ンにより細胞質まで随 伴されなければならない。しばしばＡおよびＢドメインは別々のポリペプチドま たはプロモーターであり、タンパク質−タンパク質相互作用またはジスルフィド 結合により結合されている。しかしながら、毒素はシュードモナス外毒素Ａの場 合のように２つのドメインに細胞内でタンパク質加水分解される単一のポリペプ チドであってよい。要するに、二元毒素は３種の重要なドメイン、細胞毒性Ａド メイン、受容体結合性Ｂドメインおよび移動ドメインを典型的には有する。Ａお よびＢドメインはしばしばタンパク質−タンパク質相互作用ドメインにより結合 されている。 本発明の受容体結合性ドメインは本明細書に記載された二元毒素の受容体結合 性ドメインにより認識される受容体を有する標的昆虫内にいずれかのタンパク質 、毒素、酵素、転写因子，核酸、化学的またはあらゆるその他の因子を伝達する ために有用である。同様に、二元毒素はリン脂質二重膜を貫通し、そして該膜を 通して細胞毒素を随伴する移動ドメインを有するので、該移動ドメインはリン脂 質二重膜、例えば原形質膜または小胞膜を通していずれかのタンパク質、毒素、 酵素、転写因子，核酸、化学的またはあらゆるその他の因子を随伴するのに有用 であり得る。移動ドメインはそれ自体で膜を貫通し、その結果毒性または殺虫性 を有してもよい。さらに、全ての二元毒素は細胞毒性ドメインを有し、そのよう な細胞毒性ドメインは単独で、またはいずれかの方法によりい ずれかの標的細胞に伝達された場合に、致死タンパク質として有用であり得る。 最後に、２種類のポリペプチドから構成される二元毒素はしばしば複合体を形 成するので、本発明の二元毒素の成分内にタンパク質−タンパク質相互作用領域 があるようである。これらのタンパク質−タンパク質相互作用ドメインは毒素、 酵素、転写因子、核酸、抗体、細胞結合性部分、またはその他の化学物質、因子 、タンパク質またはタンパク質ドメインのあらゆる組合せ間に結合を形成するの に有用であり得る。 毒素、酵素、転写因子、抗体、細胞結合性部分、またはその他のタンパク質ド メインは、リボソームにより翻訳された場合に、融合において使用されるＶＩＰ およびその他の成分の一緒になった属性を有する融合タンパク質を製造するであ ろうフレーム内遺伝子融合において製造することにより有害生物防除または補助 的タンパク質に融合され得る。さらに、ＶＩＰに融合されたタンパク質ドメイン が別のタンパク質、核酸、炭水化物、脂肪またはその他の化学物質または因子に 対する親和性を有するならば、３成分複合体が形成され得る。この複合体はその 成分の全ての属性を有するであろう。同様の理論的解釈が４またはそれ以上の成 分複合体を製造するために使用され得る。これらの複合体は殺虫性の毒素、薬剤 、実験室用試薬および診断試薬その他として有用である。そのような複合体が市 場で使用される例はガン治療薬、 エリザアッセイおよび免疫ブロット分析の試薬のための融合毒素である。 有害生物防除性または補助的タンパク質を変更する１つの戦略は、該タンパク 質に１５アミノ酸「Ｓタグ」を、該タンパク質の昆虫細胞結合性ドメイン、移動 ドメインまたはタンパク質−タンパク質相互作用ドメインを破壊することなく融 合することである。ＳタグはそのＳタグに結合された場合に活性リボヌクレアー ゼを形成するリボヌクレアーゼＳタンパク質に対する高い親和性（Ｋ_d＝１０^-9 Ｍ）を有する（参照F．M．RichardsおよびH．W．Wyckoff(1971)，“The Bnzymes ”，Vol.IV（Boyer，P．D．編）pp.647-806，Academic Press，New York所収） 。融合は有害生物防除性または補助的タンパク質の細胞毒性活性を破壊または除 去するようになされ得、それによりＶＩＰ細胞毒性活性を新たな細胞毒性リボヌ クレアーゼ活性に置換する。最終的な毒素はＳプロテイン、有害生物防除タンパ ク質および補助的タンパク質からなり、有害生物防除タンパク質または補助的タ ンパク質のいずれかがＳタグとの翻訳融合体として製造される。同様の戦略が、 リボソーム不活性化タンパク質、昆虫ホルモン、ホルモン受容体、転写因子、プ ロテアーゼ、ホスファターゼ、シュードモナス外毒素Ａ、または細胞内に移送さ れた場合に致死性であるあらゆるその他のタンパク質もしくは化学的因子を包含 するが（それらに限定されない）有害生物防除性または補助的タンパク質にその 他の 可能性のある細胞毒素を融合するために使用され得る。同様に、タンパク質は致 死性ではないが、細胞の生化学または生理学を変更し得る細胞に移送され得る。 異なる種に対する毒性のスペクトルは、その他の種からの細胞表面受容体を認 識する有害生物防除性または補助的タンパク質にドメインを融合することにより 変更され得る。そのようなドメインは抗体、トランスフェリン、ホルモン、また は親和性選択性ライブラリーを示したファージから単離されたペプチド配列を包 含する（がこれらに限定されない）。また、栄養素、ビタミン、ホルモン、また は細胞中に移動されるその他の化学物質に結合されるペプチド配列は毒性のスペ クトルを変更するために使用され得る。同様に、細胞表面受容体または膜に結合 し、そして内在化され得るその他のタンパク質または化学物質がＶＩＰ１および ＶＩＰ２の活性のスペクトルを変更するために使用され得る。 本発明の有害生物防除タンパク質は特定の有害生物防除特性を付与するタンパ ク質である。上記タンパク質は分子量を変更し得、少なくとも３０ｋＤａまたは それ以上、好ましくは約５０ｋＤａまたはそれ以上の成分ポリペプチドを有する 本発明の補助的タンパク質は分子量を変更し得、約１５ｋＤａまたはそれ以上 、好ましくは約２０ｋＤａまたはそれ以上、より好ましくは約３０ｋＤａまたは それ以上の分子量を少なくとも有する。補助的タンパク質はそ れ自身成分ペプチドを有してもよい。 有害生物防除タンパク質および補助的タンパク質が多重結合の有害生物防除タ ンパク質の成分であり得ることが可能である。１またはそれ以上の成分ポリペプ チドとして補助的タンパク質を包含する上記有害生物防除タンパク質は分子量を 変更し得、少なくとも５０ｋＤａないし少なくとも２００ｋＤａ、好ましくは約 １００ｋＤａないし１５０ｋＤａを有する。 補助的タンパク質は本発明の有害生物防除タンパク質と組み合わせて使用され て、有害生物防除タンパク質の活性を昂進するか、または該タンパク質を活性化 してもよい。補助的タンパク質が活性に影響を及ぼすか否かを決定するために、 有害生物防除タンパク質は単独で、そして補助的タンパク質と組み合わせて評価 され、そしてそれぞれの活性が有害生物防除活性に対する摂食アッセイにおいて 比較される。 ある菌株を単独で、または補助的タンパク質と組み合わせてその活性を試験す ることにより可能性のある有害生物防除活性に対して菌株をスクリーニングする ことが有益であるかもしれない。いくつかの例において、菌株の天然のタンパク 質と組み合わせた補助的タンパク質により、補助的タンパク質の不在下で見られ ない有害生物防除活性が得られる。 補助的タンパク質は上記したように当業界で公知の種々の方法により変更され 得る。それ故に、本発明の目的 のために、「栄養生殖殺虫性タンパク質」（ＶＩＰ）という用語は、単独でまた は組み合わせて有害生物防除活性のために使用され得る栄養増殖期の間に産生さ れるタンパク質を意味する。これは有害生物防除タンパク質、補助的タンパク質 および該補助的タンパク質の存在下でのみ活性を示すタンパク質または該タンパ ク質のポリペプチド成分を包含する。 本発明のタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を得るために利用 可能である別の方法があると認識される。例えば、有害生物防除タンパク質をコ ードするヌクレオチド配列を得るために、有害生物防除タンパク質を発現するコ スミドクローンがゲノムライブラリーから単離され得る。より大きい活性コスミ ドクローンから、より小さいサブクローンが製造され、そして活性が試験され得 る。このようにして、活性な有害生物防除タンパク質を発現するクローンは配列 決定されて、遺伝子のヌクレオチド配列が決定され得る。次いで、アミノ酸配列 はそのタンパク質に対して予想され得る。一般的な分子方法のために、例えばMo lecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Vols．1-3，Sambroo k 等（編）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(19 89)およびその中で引用されている文献参照。 本発明はまた、ヌクレオチド配列が本発明のバチラスヌクレオチド配列とのハ イブリッド形成により単離され 得る、バチラス以外の有機体（生物）からのヌクレオチド配列を包含する。その ようなヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は有害生物防除活性に対 して試験され得る。本発明はまた、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパ ク質を包含する。さらに、本発明は、タンパク質が本発明のタンパク質に対して 生起された抗体と交差反応するバチラス以外の有機体から得られるタンパク質を 包含する。また、単離されたタンパク質は本明細書に開示された方法または当業 界で十分に公知なその他の方法により有害生物防除活性がアッセイされ得る。 本発明の有害生物防除タンパク質をコードするヌクレオチド配列が単離された ら、それらは操作され得、そして微生物および植物を包含するその他の有機体を 含む種々の宿主中にタンパク質を発現するために使用され得る。 本発明の有害生物防除性遺伝子は植物における高められた発現のために最適化 され得る。例えばＥＰ−Ａ０６１８９７６；ＥＰ−Ａ０３５９４７２；ＥＰ−Ａ ０３８５９６２；ＷＯ９１／１６４３２；Perlak等（1991）Proc．Natl．Acad． Sci．USA 88:3324-3328 およびMurray等（1989）Nucleic Acids Research 17:47 7-498 参照。このようにして、遺伝子は植物の好ましいコドンを利用して合成さ れ得る。すなわち、特定の宿主に対して好ましいコドンは宿主内でアミノ酸を最 も頻繁にコードする単一コドンである。例えば特定のアミノ酸に対するトウモロ コシの好ましいコドンはトウモロコシ由来の公知遺 伝子配列から誘導されてもよい。トウモロコシ植物からの２８遺伝子に対するト ウモロコシコドン利用性はMurray等(1989)，Nucleic Acids Research 17:477-49 8 に見出され、該文献の開示は参照により本明細書に編入される。合成遺伝子は 特定の宿主が特定のアミノ酸に対して使用するコドンの分散に基づいて製造され てもよい。 このようにしてヌクレオチド配列はあらゆる植物における発現のために最適化 され得る。遺伝子配列の全てまたは一部が最適化または合成されてもよいことは 認識される。すなわち、合成または部分最適化配列もまた使用され得る。 同様にして、ヌクレオチド配列はあらゆる微生物における発現のために最適化 され得る。バチラスの好ましいコドン利用性に関しては、例えば米国特許第５０ ２４８３７号およびJohanson等(1988)Gene 65:293-304参照。 植物発現カセットの構築ならびに外来ＤＮＡの植物中への導入のための方法論 は従来の文献に記載されている。そのような発現カセットはプロモーター、ター ミネーター、エンハンサー、リーダー配列、イントロンおよびその他の制御配列 を有害生物防除タンパク質コード配列に操作可能に結合されて包含してもよい。 ＶＩＰ遺伝子のプロモーターまたはターミネーターが発現カセットにおいて使用 され得ることがさらに認識される。 一般に、植物中への外来ＤＮＡの導入のために、Ｔｉプラスミドベクターは外 来ＤＮＡの移送ならびに直接Ｄ ＮＡ取込み、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション およびマイクロプロジェクタイルの使用のために利用されてきた。そのような方 法は当該分野で公開されている。例えば、Guerche 等，(1987)Plant Science 52 :111-116; Nuehause 等，(1987)Theoγ．Appl．Genet．75:30-36; Klein等，(19 87)Nature 327:70-73; Howell 等，(1980)Science 208:1256; Horsch 等，(1985 )Science 227:1229-1231; DeBlock 等，(1987)Plant Physiology 91:694-701; M ethods for Plant Molecular Biology（WeissbachおよびWeissbach編）Academic Press，Inc．(1988);およびMethods in Plant Molecular Biology（Schuler お よびZielinski 編）Academic Press，Inc．(1989)参照。また、参照により本明 細書に編入される米国特許出願第０８／００８３７４号参照。また、ＥＰ−Ａ０ １９３２５９およびＥＰ−Ａ０４５１８７８参照。形質転換の方法は形質転換さ れるべき植物細胞に依存するであろうと理解される。 発現カセットの成分が発現を高めるために変性され得ることがさらに理解され る。例えば、先端切除配列、ヌクレオチド置換またはその他の変性（修飾）が使 用され得る。例えば、Perlak（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3324-332 8; Murray 等（1989）Nucleic Acids Research 17:477-498 ；およびＷＯ９１／ １６４３２参照。 その構築はまた、あらゆるその他の制御因子、例えば ターミネーター（Guerineau 等(1991)，Mol．Gen．Genet.，226:141-144; Proud foot，(1991)，Cell，64:671-674; Sanfacon 等(1991)，Genes Dev.，5:141-149 ; Mogen 等(1990)，Plant Cell，2:1261-1272; Munroe等(1990)，Gene，91:151- 158; Ballas等（1989）Nucleic Acids Research 17:7891-7903; Joshi等（1987 ）Nucleic Acids Research 15:9627-9639 ；植物翻訳コンセンサス配列（Joshi ，C.P.,(1987)Nucleic Acids Research 15:6643-6653；イントロン(Leuhrsen お よびWalbot，(1991)，Mol．Gen．Genet.，225:81-93)等がヌクレオチド配列に操 作可能に結合されて包含し得る。発現カセット構築において５’リーダー配列を 包含することが有益であり得る。そのようなリーダー配列は翻訳を高めるために 作用し得る。翻訳リーダーは当業界で公知てあり、そして以下のものを包含する ： ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（エンセファロミオカル ジチス５’非コード領域）(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.,およびMoss，B．(1 989)PNAS USA 86:6126-6130)； ポチウイルスリーダ、例えばＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス，Tobacc o Etch Virus）（Allison 等，(1986)）；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシドゥ ウォルフモザイクウイルス，Maize Dwarf Mosaic Virus）（Virology，154:9-20 ）および ヒト免疫グロブリン重鎖結合性タンパク質（ＢｉＰ） （Macejak，D.G.,およびSarnow，P.，(1991)，Nature，353:90-94）； アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡからの非翻訳リ ーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ４）（Jobling，S.A.,およびGehrke，L.,(1987)，Natur e，325:622-625）； タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Gallie D.R.等，(1989)，Molec ular Biology of RNA，237-256；および トウモロコシクロロティックモトルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Lommel， S.A.等，(1991)Virology，81:382-385）。Della-Cioppa等，(1987)，Plant Phys iology，84:965-968もまた参照。 植物ターミネーターは発現カセット内で利用されてもよい。Rosenberg 等，(1 987)，Gene，56:125: Guerineau 等，(1991)，Mol．Gen．Genet.，226:141-144; Proud foot，(1991)，Cell，64:671-674; Sanfacon等(1991)，Genes Dev.，5:1 41-149; Mogen 等(1990)，Plant Cell，2:1261-1272; Munroe等(1990)，Gene，9 1:151-158; Ballas等（1989）Nucleic Acids Research 17:7891-7903; Joshi等 （1987）Nucleic Acids Reseach 15:9627-9639 参照。 組織特異的発現のために、本発明のヌクレオチド配列は組織特異的プロモータ ーに操作可能に結合され得る。例えば参照で本明細書に編入されるEP-A-0618976 参照。 本発明に係る有害生物防除タンパク質を含有し、そして好ましくは発現する、 上記の方法により形質転換されたトランスジェニック植物、特にトランスジェニ ック稔性植物、およびそれらの無性および／または有性後代が本発明の範囲内に さらに包含される。特に好ましいのはハイブリッド植物である。 本発明に係るトランスジェニック植物は双子葉または単子葉植物であってよい 。ロリウム(Lolium)、ゼア(Zea)、トリチカム(Triticum)、トリチカレ(Tritical e)、ソルガム(Sorghum)、サッカラム(Saccharum)、ブロムス(Bromus)、オリザエ (Oryzae)、アベナ(Avena)、ホルデウム(Hordeum)、セカレ(Secale)およびセタリ ア(Setaria)植物を包含するイネ(Graminaceae)科の単子葉植物が好ましい。 特に好ましいのはトランスジェニックトウモロコシ、コムギ、オオムギ、モロ コシ、ライムギ、オートムギ、芝生草類およびイネである。 双子葉植物の中で、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、アブラナおよびヒマワ リが本明細書では特に好ましい。 「後代」という用語はトランスジェニック植物から「無性的に」および「有性 的に」作出された両方の後代を意味すると理解される。この定義はまた、公知方 法、例えば細胞融合または突然変異選択により得られる全ての突然変異体および 変種であって、形質転換された植物材料の全ての交雑および融合産物と共に最初 に形質転換 された親植物の特性を依然として示すものを包含することが意図されている。 本発明のもう一つの対象はトランスジェニック植物の増殖材料に関するもので ある。 トランスジェニック植物の増殖材料は本発明に関して生体内または試験管内で 有性的または無性的に増殖され得るあらゆる植物材料として定義される。本発明 の範囲内で特に好ましいのは、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種 子、胚、花粉、卵細胞、接合子、トランスジェニック植物から得られるあらゆる その他の増殖材料である。 植物の一部、例えば本発明の方法により前もって形質転換されたトランスジェ ニック植物またはその後代に由来する花、茎、果実、葉、根、そしてそれ故に少 なくとも一部がトランスジェニック細胞からなるなるものもまた、本発明の対象 である。 植物増殖材料〔花，塊茎，穀粒，種子〕、特に種子は商品として市販される前 に、所望の場合、製剤業界で慣用のその他の担体、界面活性剤または施用促進助 剤と共に、除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺バクテリア剤、殺線虫剤、軟体動物駆除 剤またはこれらの薬剤のいくつかの混合物からなる保護コーティングで慣用的に 処理されて、バクテリア、菌類または有害動物により引き起こされる損傷に対す る保護が与えられる。 種子を処理するために、保護コーティングは塊茎また は穀粒を液体配合剤に浸漬するか、またはそれらを一緒にした湿潤または乾燥配 合剤でコーティングすることにより種子に適用され得る。さらに、特別の場合に おいて、植物への施用のその他の方法は、例えば芽または果実に向けての処理が 可能である。 本発明に係る有害生物防除タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる ＤＮＡ分子を含有する本発明に係る植物種子は種子処理化合物、例えばカプタン 、カルボキシン、チラム（登録商標ＴＭＴＤ）、メタラキシル〔登録商標アプロ ン(Apron)〕およびピリミホス−メチル（登録商標アクテリック(Actellic)〕お よび種子処理に慣用のその他のものからなる種子保護コーティングで処理され得 る。本発明の範囲内で好ましいのは、本発明に係る殺虫性組成物を単独で、また は種子処理に慣用の種子保護コーティングの１種と組み合わせて含む種子保護コ ーティングである。 従って、上記の種子保護コーティングで処理される作物のための植物増殖材料 、特に植物種子の提供が本発明の別の目的である。 有害生物防除タンパク質をコードする遺伝子が昆虫病原性有機体を形質転換す るために使用される得ることが理解される。そのような有機体はバキュロウイル ス、菌類、原生動物、バクテリアおよび線虫を包含する。 本発明のバチラス菌株は農業上の作物および産物を有害生物から保護するため に使用され得る。また、有害生 物防除剤をコードする遺伝子は適当なベクターを介して微生物宿主中へ導入され 得、そして該宿主は環境または植物または動物に施用され得る。微生物宿主は１ またはそれ以上の当該作物の「植物領域(phytosphere)」〔葉平部(phylloplana) ，葉曲部(phyllosphere)，根曲部(rhizosphere)，および／または根平部(rhizop lana)〕を占領することが知られているものから選択され得る。これらの微生物 は野生型微生物と特定の環境を成功裏に競合し得るように選択され、ポリペプチ ド有害生物防除剤を発現する遺伝子の安定な保持および発現を提示し、そして望 ましくは環境による分解または不活性化から有害生物防除剤の改良された保護を 提示する。 そのような微生物はバクテリア、藻類および菌類を包含する。特に興味深いの は微生物、例としてバクテリア例えば、シュードモナス(Pseudomonas)、エルウ ィニア(Erwinia)、セラティア(Serratia)、クレブシエラ(Klebsiella)、キサン トモナス(Xanthomonas)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、リゾビウム(Rhiz obium)、ロードシュードモナス(Rhodopseudomonas)、メチリウス（Methlius）、 アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アセトバクター(Acetobacter)、ラクトバ チルス(Lactobacillus)、アルトロバクター(Arthrobacter)、アゾトバクター(Az otobacter)、ロイコノストック(Leuconostoc)およびアルカリゲネス(Alcaligene s)；菌類、特に酵母例えば、サッカロマイセス(Saccaharomyces)、クリ プトコッカス(Cryptococcus)、クルイヴェロマイセス(Kluyveromyces)、スポロ ボロマイセス(Sporobolomyces)、ロドトルラ(Rhodotrula)およびアウレオバシジ ウム(Aureobasidium)である。特に興味深いのは植物領域の種、例えばシュード モナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)、シュードモナス・フルオレセンス (Pseudomonas fluorescens)、セラティア・マルセスセンス(Serratia marcescen s)、アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum)、アグロバクテリア(Ag robacteria)、ロードシュードモナス・スフェロイデス(Rhodopseudomonas spher oides)、キサントモナス・カムペストリス(Xanthomonas campestris)、リゾビウ ム・メリオチ(Rhizobium melioti)、アルカリゲネス・エントロフス(Alcaligene s entorophus)、クラビバクテル・キシリ(Clavibacter xyli)およびアゾトバク テル・ビンランディ(Azotobacter vinlandii)、および植物領域の酵母種、例え ばロドトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra)、ロドトルラ・グルチニス(R．gluti nis)、ロドトルラ・マリナ(R．marina)、ロドトルラ・アウランチアカ(R．auran tiaca)、クリプトコッサス・アルビダス(Cryptococcus albidus)、クリプトコッ カス・ディフルエンス(C．diffluens)、クリプトコッカス・ラウレンチイ(C．la urentii)、サッカロマイシス・ロゼイ(Saccharomyces rosei)、サッカロマイセ ス・プレトリエンシス(S．Pretoriensis)、サッカロマイセス・セレビシエ(S．c ereviisiae)、スポロボ ロマイセス・ロスエス(Sporobolomyces rosues)、スポロボロマイセス・オドル ス(S．odorus)、クルイヴェロマイセス・ベロナ(Kluyveromyces veronae)、およ びアウレオバシディウム・ポルランス(Aureobasidium pollulans)である。色素 をもつ微生物（pigmented microorganisms）が特に興味深い。 遺伝子の安定な維持および発現を可能にする条件下で微生物宿主中に有害生物 防除タンパク質を発現する遺伝子を導入するために非常に多くの方法が利用可能 である。例えば、発現カセットが構築され得、ＤＮＡ構築体の発現のための転写 および翻訳制御シグナルに操作可能に結合された当該ＤＮＡ構築体、および宿主 有機体中の配列と相同なＤＮＡ配列（それにより組み込みが起こる）および／ま たは宿主内で機能的である複製系（それにより組み込みまたは安定な維持が起こ る）を包含する。 翻訳および転写制御シグナルはプロモーター、転写開始部位、オペレーター、 アクチベーター、エンハンサー、その他の制御要素、リボソーム結合部位、開始 コドン終結シグナル等を包含するが、それに限定されない。例えば米国特許第５ ０３９５２３号；米国特許第４８５３３３１号；ＥＰＯ０４８７６２Ａ２； Sam brook 等，同上； Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Maniatis 等（編 ）Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1982); Advanced Bacterial Genetics，Davis等（編）Cold Spring Harbor Laboratory，Col d Spring Harbor，NY(1980)およびその中で引用されている文献参照。 有害生物防除剤含有細胞が、その処理された細胞が標的有害生物の周囲に適用 された場合に、細胞中で毒素の活性を延長するために処理される適当な宿主細胞 は原核生物または真核生物のいずれかを包含し得、通常、高等生物、例えば哺乳 動物に毒性の物質を産生しない細胞に限定される。しかしながら、その毒素が不 安定であるか、または哺乳動物宿主に対する毒性の可能性を回避する程度に十分 に低い施用レベルである場合には、高等生物に毒性の物質を産生する生物が使用 され得る。宿主として特に興味深いのは、原核生物および下等な真核生物、例え ば菌類である。グラム陰性および陽性の真核生物の例はエンテロバクテリアセア エ(Enterobacteriaceae)、例えばエスケリッチア(Escherichia)、エルウィニア( Erwinia)、シゲラ(Shigella)、サルモネラ(Salmonella)およびプロテウス(Prote us)；バシラセアエ(Bacillaceae)；リゾビセアエ(Rhizobiceae)、例えばリゾビ ウム(Rhizobium)；スピリラセアエ(Spirillaceae)、例えばフォトバクテリウム( Photobacterium)、チモモナス(Zymomonas)、セラチア(Serratia)、アエロモナス (Aeromonas)、ビブリオ(Vibrio)、デスルフォビブリオ(Desulfovibrio)、スピリ ラム(Spirillum)；ラクトバチラセアエ(Lactobacillaceae)；シュードモナダセ アエ(Pseudomonadaceae)、例えばシュードモナス(Pseudomonas)および アセトバクテル(Acetobacter)；アゾトバクテラセアエ(Azotobacteraceae)およ びニトロバクテラセアエ(Nitrobacteraceae)を包含する。真核生物の中で、菌類 は例えば、フィコマイセテス(Phycomycetes)およびアスコマイセテス(Ascomycet es)であり、酵母、例えばサッカロマイセス(Saccharomyces)およびシゾサッカロ マイセス(Schizosaccharomyces)；およびバシドマイセテス(Basidomycetes)イー スト、例えばロードトルラ(Rhodotorula)、アウレオバシジウム(Aurerobasidium )、スポロボロマイセス(Spolobolomyces)等を包含する。 製造の目的のために宿主細胞を選択する際の特に興味深い特徴は、宿主中への タンパク質遺伝子の導入の容易性、発現系の利用性、発現の効率、宿主中でのタ ンパク質の安定性および補助的遺伝子能力の存在を包含する。有害生物防除剤マ イクロカプセルとして使用するために特に興味深い特徴は有害生物防除剤の保護 的性質、例えば厚い細胞壁、色素形成、および細胞間パッケージまたは封入体の 形成；葉親和性；哺乳動物毒性の欠如；摂食への有害生物の誘因性；毒素への損 傷なしに殺傷および固定の容易性；その他を包含する。その他、配合および操作 の容易性、経済性、貯蔵安定性等が含まれる。 特に興味深い宿主生物は酵母、例えばロードトルラ(Rhodotorula)種、アウレ オバシジウム(Aurerobasidium)種、サッカロマイセス(Saccharomyces)種および スポロボロマイセス(Spodobolomyces)種；葉平部(phylloplan e)生物、例えばシュードモナス(Pseudomonas)種、エルウィニア(Erwinia)種およ びフラボバクテリウム(Flavobacterium)種；またはその他の生物、例えばエスケ リッチア(Escherichia)、ラクトバチルス(Lactobacillus)種、バチルス(Bacillu s)種等を包含する。特定の生物はシュードモナス・アエウルギノサ(Pseudomonas aeurginosa)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cereviisiae)、バチラス・ス リンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、大腸菌(Escherichia coli)、バチラ ス・サブチリス(Bacillus subtilis)その他を包含する。 ＶＩＰ遺伝子は、可能性のある標的有害生物にＶＩＰタンパク質を伝達するた めに植物（着生植物）上で増殖する微生物中に導入され得る。着生植物は例えば グラム陽性またはグラム陰性バクテリアであってよい。 例えば根寄生バクテリアが当該分野で公知の方法により当該植物から単離され 得る。特に根に寄生するバチラス・セレウス(Bacillus cereus)菌株は植物の根 から単離され得る（例えばJ．Handelsman，S．Raffel，E．Mester，L．Wunderli chおよびC．Grau，Appl．Environ．Microbiol．56:713-718(1990)参照）。ＶＩ Ｐ１および／またはＶＩＰ２および／またはＶＩＰ３は当該分野で公知の標準的 方法により根寄生性バチラス・セレウス(Bacillus cereus)中に導入され得る。 特に、バチラス・セレウス(Bacillus cereus)ＡＢ７８菌株から誘導されたＶ ＩＰ１および／またはＶＩＰ２は標準的方法を用いる接合により根寄生性バチラ ス・セレウス中に導入され得る（J．Gonzalez，B．Brown およびB．Carlton，Pr oc．Natl．Acad．Sci．79:6951-6955(1982)）。 また、本発明のＶＩＰ１および／またはＶＩＰ２および／またはＶＩＰ３また はその他のＶＩＰは、電気的形質転換により根寄生性バチラス中に導入さ得る。 特に、ＶＩＰはシャトルベクター、例えば実施例１０に記載されるようなｐＨＴ ３１０１（Lereclus等，FEMS Microbiol．Letts.，60:211-218（1989））中にク ローン化され得る。特定のＶＩＰのためのコード配列を含むシャトルベクターｐ ＨＴ３１０１は次に電気的形質転換により根寄生性バチラス中に導入さ得る（D ．Lereclus 等，FEMS Microbiol．Letts.，60:211-218（1989））。 ＶＩＰタンパク質がグラム陰性細菌、例えば大腸菌の細胞質外に分泌されるよ うに発現系は設計され得る。ＶＩＰタンパク質を有する利点は（１）細胞質内に 発現されたＶＩＰタンパク質の強い毒性作用を回避し、そして（２）発現された ＶＩＰタンパク質のレベルを高め得、そして（３）ＶＩＰタンパク質の効率のよ い精製を補助し得ることである。 ＶＩＰタンパク質は、適当な大腸菌シグナルペプチドをＶＩＰシグナルペプチ ドのアミノ末端に融合すること によるか、またはＶＩＰシグナルペプチドを大腸菌シグナルペプチドで置換する ことにより、例えば大腸菌内に分泌されるようにできる。大腸菌により認識され るシグナルペプチドは大腸菌に分泌されることが公知のタンパク質中に見出され 得、例えばＯｍｐＡタンパク質（J．Ghrayeb，H．Kimura，M．Takahara，Y．Mas uiおよびM．Inoue，EMBO J.，3:2437-2442（1984））である。ＯｍｐＡは大腸菌 外膜の主要なタンパク質であり、従ってそのシグナルペプチドは移動工程に有効 であると考えられる。また、ＯｍｐＡシグナルペプチドは、その他のシグナルペ プチド、例えばリポタンパク質シグナルペプチド（G．Duffaud，P．Marchおよび M．Inoue，Methods in Enzymology，153:492（1987））の場合のようにプロセシ ングの前に修飾する必要はない。 特に、独特な（ユニークな）BamHI 制限部位はＶＩＰコード配列のアミノ末端 およびカルボキシル末端に当業界で公知の標準的方法を用いて導入され得る。こ れらのBamHI 断片はベクターｐＩＮ−III−ＯｍｐＡ１、Ａ２またはＡ３（J．Gh rayeb，H．Kimura，M．Takahara，Y．MasuiおよびM．Inoue，EMBO J.，3:2437-2 442（1984））中に読み枠内にクローン化され得、それによりペリプラスミック 空間内に分泌されるＯｍｐＡ：ＶＩＰ融合遺伝子を生成する。ｐＩＮ−III−Ｏ ｍｐＡのポリリンカー内のその他の制限部位は当業界で公知の標準的方法により 除去され得、その結果、ＶＩＰアミノ末端アミノ酸コー ド配列はＯｍｐＡシグナルペプチド切断部位の直後となる。従って、大腸菌にお ける分泌ＶＩＰ配列はこの場合、天然のＶＩＰ配列と同一である。 ＶＩＰ天然シグナルペプチドが成熟タンパク質の適当な折りたたみに必要とさ れないならば、該シグナル配列は除去されるか、またはＯｍｐＡシグナル配列で 置換され得る。独特な（ユニークな）BamHI 制限部位はＶＩＰのシグナルペプチ ドコード配列直後のプロタンパク質コード配列のアミノ末端およびＶＩＰコード 配列のカルボキシル末端に導入され得る。これらのBamHI 断片は次いで上記した ようにｐＩＮ−III−ＯｍｐＡベクター内にクローン化され得る。 有害生物防除またはその他の生物の操作において本発明の菌株を有害生物防除 剤として使用するための一般的方法は当業界で公知である。例えば米国特許第５ ０３９５２３号およびＥＰ０４８７６２Ａ２参照。 ＶＩＰはバクテリア宿主において発酵され得、そして得られるバクテリアは加 工され、そしてバチラス・スリンギエンシス菌株が殺虫スプレーとして使用され ているような方法で微生物スプレーとして使用され得る。バチラスから分泌され るＶＩＰの場合において、分泌シグナルは当業界で公知の方法を用いて除去また は突然変異されてもよい。そのような突然変異および／または欠失は発酵過程の 間に増殖培地中へのＶＩＰタンパク質の分泌を防止する。ＶＩＰは細胞内に保持 され、そして細胞は 次にカプセル化された（封入された）ＶＩＰを得るために処理される。あらゆる 適当な微生物がこの目的のために使用され得るシュードモナスはカプセル化され たタンパク質としてバチラス・スリンギエンシスエンドトキシンを発現するため に使用されており、そして得られる細胞は処理され、そして殺虫剤として噴霧さ れる。（H．Gaertner 等，1983，Engineered Pesticides，L．Kim 編，所収）。 バチラス・スリンギエンシスの種々の菌株がこのようにして使用される。その ようなＢｔ菌株はエンドドキシンタンパク質ならびにＶＩＰを産生する。また、 そのような菌株はＶＩＰのみを産生し得る。バチラス・サブチリスの胞子形成欠 失菌株はバチラス・スリンギエンシスからの高レベルのＣｒｙＩＩＩＡエンドト キシンを産生することが示されている（Agaisse，H．およびLereclus，D.，「バ チラス・スリンギエンシスＣｒｙＩＩＩＡ毒素遺伝子のバチラス・サブチリスに おける発現は胞子形成特異的シグマ因子に依存せず、そしてｓｐｏＯＡ突然変異 体において増加される」，J．Bacteriol.，176:4734-4741（1994））。類似のｓ ｐｏＯＡ突然変異体はバチラス・スリンギエンシスにおいて製造され得、そして 培地中に分泌されず細胞内に保持されるカプセル化されたＶＩＰを製造するため に使用され得る。 バチラス細胞内にＶＩＰを保持するために、シグナルペプチドは分泌シグナル としてもはや機能しないように 損傷されてもよい。特に、ＶＩＰ１に対する推定上のシグナルペプチドはこの配 列のＣ末端部分に推定上のコンセンサス切断部位Ala-X-Ala を有するタンパク質 の最初の３１アミノ酸を含み（G．von Heijne，J．Mol．Biol．184:99-105(1989 )）、そしてＶＩＰ２に対する推定上のシグナルペプチドはAla 40の後に推定上 の切断部位を有するタンパク質の最初の４０アミノ酸を含む。ＶＩＰ１またはＶ ＩＰ２のいずれかの切断部位は当業界で公知の方法で突然変異されて、切断部位 コンセンサス配列をシグナルペプチダーゼにより認識されない別のアミノ酸に置 換され得る。 また、本発明のＶＩＰ１、ＶＩＰ２および／またはその他のＶＩＰのシグナル ペプチドは配列から除去され得、それによりバチラスにおける分泌タンパク質と して認識させないようにする。特にメチオニン開始部位はAsp 32で開始するＶＩ Ｐ１またはGlu 41で開始するＶＩＰ２のプロタンパク質配列の前に当業界で公知 の方法により操作され得る。 ＶＩＰ遺伝子は可能性のある標的有害生物にＶＩＰタンパク質を伝達するため に植物（着生植物）上に増殖する微生物中に導入され得る。着生植物は例えばグ ラム陽性またはグラム陰性バクテリアであってよい。 有害生物防除性遺伝子およびタンパク質を含むように遺伝子改変された本発明 のバチラス菌株または微生物は農作物および産物を有害生物から保護するために 使用さ れ得る。本発明の一つの態様において、毒素（有害生物防除剤）産生生物の全体 、すなわち未溶解細胞は、該細胞が標的有害生物の周囲に施用された時、細胞内 で産生された毒素の活性を延長する試薬で処理される。 また、有害生物防除剤は細胞性宿主内に異種遺伝子を導入することにより製造 される。異種遺伝子の発現は細胞内産生および有害生物防除剤の保持を直接的ま たは間接的に生じる。これらの細胞は次に該細胞が標的有害生物の周囲に施用さ れた時、細胞内で産生された毒素の活性を延長する試薬で処理される。得られる 産物は毒素の毒性を保持する。これらの自然にカプセル化された有害生物防除剤 は次に標的有害生物が集まる環境、例えば土壌、水および植物の群葉への適用の ための慣用の技術に従って製剤化されてもよい。例えばＥＰＡ０１９２３１９お よびその中で引用されている文献参照。 本発明の活性（有効）成分は通常組成物の形態で施用され、そして処理される べき栽培地または植物に、その他の化合物と同時にまたは順次施用され得る。こ れらの化合物は肥料もしくは微量栄養付与剤または植物生長に影響を与えるその 他の製剤であってよい。それらはまた、選択的除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺バク テリア剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはこれら製剤のいくつかの混合物であ ってよく、所望するならば製剤業界で慣用であるその他の農学的に許容され得る 担体、界面活性剤または施用促進助剤と一緒に使用され得る。適当な担体およ び助剤は固体または液体であり製剤技術で慣用である通常の物質、例えば天然ま たは再生無機物質、溶媒、分散剤、湿展剤、粘着付与剤、結合剤または肥料が相 当する。 本発明の活性成分または本発明のバクテリア菌株により産生される昆虫特異的 タンパク質の少なくとも１種を含有する本発明の農薬組成物を施用する好ましい 方法は葉施用、種子粉衣および土壌施用である。施用の回数および施用率（量） は相当する有害生物により被害の大きさに依存する。 従って、本発明はさらに、有効成分として少なくとも１種の本発明に係る新規 な昆虫特異的タンパク質および／または新規な昆虫特異的タンパク質をコードす るヌクレオチド配列を組換え体の形態で含む少なくとも１種のＤＮＡ分子を有す る組換え微生物、特に組換えバチラス菌株、例えば新規な昆虫特異的タンパク質 をコードするヌクレオチド配列を組換え体の形態で含む少なくとも１種のＤＮＡ 分子を含むバチラス・セレウスまたはバチラス・スリンギエンシス、またはそれ らの誘導体もしくは突然変異体を農業用助剤、例えば担体、希釈剤、界面活性剤 または施用促進助剤と共に含有する殺虫性組成物を提供する。該組成物はまた別 の生物学的に活性のある化合物を含有してもよい。該化合物は、肥料または微量 栄養素付与剤または植物成長に影響を及ぼすその他の製剤であってもよい。それ らはまた、選択的除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺菌剤、殺バクテリア剤、殺線虫剤 、軟体動物 駆除剤またはそれらの製剤の数種の混合物であり、所望ならば、製剤技術におい て慣用的である農学的に許容される担体、界面活性剤または施用促進助剤とさら に一緒に使用してよい。適当な担体は固体または液体であり製剤技術で慣用であ る通常の物質、例えば天然または再生無機物質、溶媒、分散剤、湿展剤、粘着付 与剤、結合剤または肥料が相当する。 組成物は有効成分を０．１ないし９９重量％、固体または液体助剤を１ないし ９９．９重量％、そして界面活性剤を０ないし２５重量％含有し得る。本発明に 係る少なくとも１種の新規な昆虫特異的タンパク質または新規な昆虫特異的タン パク質をコードするヌクレオチド配列を組換え体の形態で含む少なくとも１種の ＤＮＡ分子を有する組換え微生物、特に組換えバチラス菌株、例えば新規な昆虫 特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を組換え体の形態で含む少なく とも１種のＤＮＡ分子を含むバチラス・セレウスまたはバチラス・スリンギエン シス、またはそれらの誘導体もしくは突然変異体を含む有効成分、または該有効 成分を含有する組成物は、保護されるべき植物または作物に、ある種のその他の 殺虫剤または化学薬品(1993 Crop Protection Chemicals Reference，Chemical and Pharmaceutical Press，Canada)と共に効力の損失なしに施用され得る。そ れは多くの慣用の農業用噴霧剤と共用できるが、極端にアルカリ性の噴霧溶液中 で使用するべきでない。それは、粉剤、 懸濁液、水和剤または農業的用途のために適当なあらゆる他の剤型で施用され得 る。 本発明はさらに、少なくとも１種の本発明に係る新規な昆虫特異的タンパク質 または該新規な昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む少な くとも１種のＤＮＡ分子を組換え体の形態で含有する組換え微生物を含む有効成 分または該有効成分を含有する組成物を（ａ）昆虫有害生物が発生するであろう 環境に、（ｂ）有害昆虫に起因する損傷から植物または植物の部位を保護するた めにその植物または植物の部位に、または（ｃ）種子からの生長する植物を有害 昆虫に起因する損傷から保護するために該種子に施用することにより、有害昆虫 を防除または阻害するための方法を提供する。 植物保護分野の施用の好ましい方法は植物の葉への施用（葉施用）であり、施 用の回数および施用率は保護されるべき植物および当該有害生物による被害の危 険性に依存する。しかしながら、有効成分はまた、液体製剤を植物の作地に含浸 させるか、あるいは固体の形態、例えば粒剤の形態で有効成分を植物の作地、例 えば土壌に物質を混入する場合に（土壌施用）、植物根系を介して植物に到達す ることも可能である（浸透作用）。水田でのイネ作物の場合、上記粒剤は水を浸 した水田に対して計量して施用されてもよい。 本発明による組成物はまた昆虫性有害生物に対する植物増殖材料、例えば果実 、塊茎もしくは穀粒等の種子ま たはさし木の保護にも適当である。増殖材料は植える前に製剤で処理でき、例え ば種子では播種の前に粉衣できる。本発明の有効成分は、また穀粒を液体製剤に 含浸させるか、または固体製剤を塗布することにより、種子穀粒に施用できる（ コーティング）。増殖材料が生長した場合に、製剤は生育する地に施用でき例え ば播種の期間に種子の畦溝に施用できる。さらに本発明は植物増殖材料を処理す る方法およびこのように処理された植物増殖材料に関する。 有効成分として、組換体の中に新規な毒素遺伝子の少なくとも１種を含む組換 え微生物、特に組換体の中に新規な昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオ チド配列を含む少なくとも１種のＤＮＡ分子を含む組換えバチラス菌株、例えば バチラス・セレウスまたはバチラス・スリンギエンシス菌株、またはそれらの誘 導体または突然変異体を含む本発明による組成物は、細菌株による種子または土 壌の処理のためのいずれかの公知の方法により施用できる。例えば、米国特許第 ４８６３８６６号参照。この菌株は、微生物が生存していない場合においても生 物防除に有効である。しかし好ましいのは生存している微生物の施用である。 標的作物として適当なものは次のものである：特に、穀類（小麦、大麦、ライ 麦、オート麦、米、トウモロコシ、ソルガムおよび関連作物）；ビート（テンサ イおよび飼料ビート）；飼料用牧草（カモガヤ、ウシノゲグサ 類等）；核果、梨状果、および軟果実（リンゴ、梨、プラム、桃、アーモンド、 サクランボ、またはイチゴ、ラズベリーおよびブラックベリーのようなベリー類 ）；マメ科植物（ソラ豆、レンズ豆、エンドウ豆または大豆）；油用植物（アブ ラナ、マスタード、ポピー、オリーブ、サンフラワー、ココナッツ、ヒマシ油植 物、ココア豆または落花生）；ウリ科植物（カボチャ、キュウリまたはメロン） ；繊維植物（綿、亜麻、大麻または黄麻）；橙属植物（オレンジ、レモン、グレ ープフルーツまたはマンダリン）；野菜（ホウレンソウ、レタス、アスパラガス 、キャベツ、他のアブラナ科のもの、玉葱、トマト、馬鈴薯またはピーマン）； クスノキ科（アボガド、シナモンまたは樟脳）；落葉樹および針葉樹（例えばリ ンデン、イチイ、カシ、ハンノキ、ポプラ、カバノキ、モミ、カラマツ、マツ） および、タバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウの木、ホップ、バ ナナおよび天然ゴム植物、ならびに観賞植物（キク科植物を含む）。 新規な昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を組換え体の形態 で含む少なくとも１種のＤＮＡ分子を含む組換えバチラス菌株、例えばバチラス ・セレウスまたはバチラス・スリンギエンシス菌株は殺虫性組成物の形態で通常 施用され、そして作付地または処理されるべき植物に、その他の生物学的活性な 化合物と同時に、または順次施用され得る。これらの化合物は肥料または微量栄 養付与剤または植物成長に影響を及ぼすその 他の製剤であってもよい。それらはまた、選択性除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺バ クテリア剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはそれらの製剤の数種の混合物であ り、所望ならば、製剤技術において慣用である農学的に許容され得る担体、界面 活性剤または施用促進助剤と共に使用してよい。 本発明の有効成分はそのままでまたは他の適当な農業的に許容される担体とも に使用できる。このような担体は農薬製剤の分野で慣用に使用される補助剤であ り、従って公知の方法で、乳剤原液、塗布可能ペースト、直接噴霧可能な、また は希釈可能な溶液、希釈乳剤、水和剤、水溶剤、散剤、粉剤、粒剤または例えば 、ポリマー物質によるカプセル化剤に製剤化できる。組成物の性質と同様に施用 の方法、例えば噴霧、霧化、散粉、散水または注水が目的とする対象および使用 環境に応じて選ばれる、施用の有利な割合は１ヘクタール（「ｈａ」，約２．４ ７１エーカー）当たり有効成分(a.i.)約５０ｇないし約５ｋｇであり、好ましく は約１００ｇないし約２ｋｇ a.i./ha である。重要な施用割合は約２００ｇな いし１ｋｇ a.i./ha および２００ｇないし５００ｇ a.i./ha である。 種子粉衣のために有利な施用割合は種子１００ｋｇ当たり０．５ｇないし１０ ００ｇ a.i.、好ましくは種子１００ｋｇ当たり３ｇないし１００ｇ a.i.また は種子１００ｋｇ当たり１０ｇないし５０ｇ a.i.である。 適当な担体および補助剤は固体または液体であってよく、一般に製剤技術で使 用される物質に相当し、例えば天然または再生、無機物質、溶媒、分散剤、湿展 剤、粘着付与剤、結合剤または肥料である。製剤、すなわち有効成分として組換 え体の形態で新規な昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む 少なくとも１種のＤＮＡ分子を有する組換えバチラス菌株、例えばバチラス・セ レウスまたはバチラス・スリンギエンシス菌株を含有する殺虫性組成物、製剤ま たは混合物、またはその他の有効成分と、そして適当である場合には固体または 液体助剤との組成物は、公知の方法により、例えば有効成分を溶媒、固体担体お よび適当な場合には表面活性化合物（界面活性剤）のような増量剤と十分に混合 および／または摩砕することにより製造される。 適当な溶媒は次のものである：芳香族炭化水素、好ましくは炭素原子数８ない し１２の部分、例えばキシレン混合物または置換ナフタレン、ジブチルフタレー トまたはジオクチルフタレートのようなフタル酸エステル；パラフィンまたはシ クロヘキサンのような脂肪族炭化水素；エタノール、エチレングリコール、エチ レングリコールモノメチルエーテルまたはエチレングリコールモノエチルエーテ ルのようなアルコールおよびグリコール並びにそれらのエーテルおよびエステル ；シクロヘキサノンのようなケトン；Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルス ルホキシドまたはジメチルホルムアミドのような 強極性溶媒；ならびにエポキシ化または非エポキシ化植物油例えばエポキシ化コ コナッツ油または大豆油；または水。 例えば粉剤および分散性粉末に使用する固体担体は通常、方解石、タルク、カ オリン、モンモリロナイトまたはアタパルジャイトのような無機充填剤である。 物性を改良するため、高分散ケイ酸または高分散吸収性ポリマーを添加すること もできる。適当な粒剤、粒状化吸着性担体は多孔性型のもので、例えば、軽石、 破壊レンガ、セピオライトまたはベントナイトであり、ならびに適当な非吸収性 担体は例えば方解石または砂である。さらに広範囲の前もって粒状化した無機質 または有機質の物質、特にドロマイトまたは粉末化植物残骸が使用されうる。 製剤化される有効成分の性質に応じて、適する界面活性化合物は、良好な乳化 、分散および湿展性を有する非イオン性、陽イオン性および／または陰イオン性 界面活性剤である。「界面活性剤」という用語はまた界面活性剤の混合物も意味 するものと理解すべきである。適当なアニオン性界面活性剤はいわゆる水溶性石 ケンおよび水溶性合成界面活性成分はの両方である。 適当な石ケンは高級脂肪酸（Ｃ₁₀〜Ｃ₂₂）のアルカリ金属塩、アルカリ土類金 属塩または未置換もしくは置換のアンモニウム塩、例えばオレイン酸またはステ アリン酸、あるいは例えばココナッツ油または獣脂から得られる天然脂肪酸混合 物のナトリウムまたはカリウム塩であ る。脂肪酸メチルタウリン塩ならびに変性および未変性リン脂質もさらにその他 の適当な界面活性剤である。 しかし、いわゆる合成界面活性剤は、さらに頻繁には、特に脂肪アルコールス ルホネート、脂肪アルコールスルフェート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導 体またはアルキルアリールスルホネートが使用される。 脂肪スルホネートまたはスルフェートは通常、アルカリ金属塩、アルカリ土類 金属塩、または未置換または置換のアンモニウム塩の形態であり、アシル基のア ルキル部分をも含む炭素原子数８ないし２２のアルキル基を一般に含み、例えば 、リグノスルホン酸、ドデシルサルフェートまたは天然脂肪酸から得られる脂肪 アルコールサルフェートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩である。これ らの化合物はまた、硫酸エステルの塩、および脂肪酸アルコール／エチレンオキ シド付加物のスルホン酸の塩も含まれる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体 は、好ましくは二つのスルホン酸基と８ないし２２の炭素原子を含む一つの脂肪 酸基とを含む。アルキルアリールスルホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホ ン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸／ホルムアル デヒド縮合物のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノールアミン塩である。 対応するホスフェート、例えば、エチレンオキシド４ないし１４モルを持つｐ −ノニルフェノールの付加物のリン酸エステルの塩もまた適当である。 非イオン性界面活性剤は好ましくは主に、脂肪族または脂環式アルコール、ま たは飽和または不飽和脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエーテ ル誘導体であり、該誘導体は３ないし３０個のグリコールエーテル基、および（ 脂肪族）炭化水素基に８ないし２０個の炭素原子、そしてアルキルフェノールの アルキル部分に６ないし１８個の炭素原子を含み得る。 その他の非イオン性界面活性剤はポリプロピレングリコール、エチレンジアミ ノポリプロピレングリコールおよびアルキル鎖中に１ないし１０個の炭素原子を 含むアルキルポリプロピレングリコールとのポリエチレンオキシド水溶性付加物 であり、その付加物は２０ないし２５０個のエチレングリコールエーテル基、お よび１０ないし１００個のプロピレングリコールエーテル基を含む。上記の化合 物は通常、プロピレングリコール単位当たり１ないし５のエチレングリコール単 位を含む。 非イオン性界面活性剤の代表例は、ノニルフェノール−ポリエトキシエタノー ル、ヒマシ油ポリグリコール・エーテル、ポリプロピレン／ポリエチレン・オキ シド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレン・グ リコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。 ポリオキシエチレンソルビタントリオレートのようなポリオキシエチレンソル ビタンの脂肪酸エステルもさらに適当な非イオン性界面活性剤である。 カチオン性界面活性剤は、特にＮ−置換基として少なくとも一つの炭素原子数 ８ないし２２のアルキル基と、他の置換基として未置換のまたは低級ハロゲン化 アルキル基、ベンジル基または低級ヒドロキシアルキル基とを含む第四アンモニ ウム塩である。塩はハライド、メチルスルフェートまたはエチルスルフェート、 例えば、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリドまたはベンジルジ（２−ク ロロエチル）エチルアンモニウムブロマイドの形態が好ましい。 製剤業界で慣用の界面活性剤は例えば以下の刊行物に記載されている：「マク カッチャンズ デタージェンツ アンド エマルジファイアーズ アニュアル（ McCutcheon's Detergents and Bmulsifiers Annual）」，マック出版社、リッジ ウッド、ニュージャージー州（MC Publishing Corp．Ridgewood，N.J.），１９ ７９年；ヘルムト スタック(Dr．Helmut Stache)著，「テンシト−タッシェン ブーフ（Tensid-Taschenbuch）〔Surfactants Guide〕」、カール−ハンザー出 版社、ミュンヘン／ウイーン(Carl Hauser-Verlag，Munich/Vienna)。 本発明の殺昆虫性組成物の他の特に好ましい特徴は、植物および土壌に施用さ れる場合に有効成分の持続性である。活性の損失に対する起こりうる原因は、紫 外線、熱、葉の浸出作用（leaf exudate）およびｐＨによる不活性化を含む。例 えば、高いｐＨにおいて特に、還元剤の存在下で、δ−エンドトキシン（内毒素 ）結晶は可溶 となりそのためタンパク質加水分解による失活をより受けやすくなる。特に葉面 がｐＨ８−１０の範囲にあり得る場合、高い、葉のｐＨもまた重要となるであろ う。本発明の殺昆虫組成物の製剤化は、有効成分の損失の防止を助ける添加剤を 含むことまたは有効成分を失活から保護するような方法で材料を封入することの いずれかにより、これらの問題を扱うことができる。封入は化学的に(McGuire およびShasha,J Econ Entomol 85:1425-1433,1992)または生物学的に(Barnes お よびCummings，1986:EP-A-0192319)達成できる。 化学的封入は有効成分をポリマーによって被覆することを含むが、生物学的封 入はδ−エンドトキシン遺伝子を微生物中で発現させることを含む。生物学的封 入のため、δ−エンドトキシンタンパク質を含む完全な微生物が有効成分として 製剤に使用される。紫外線保護剤の添加は照射による損傷を有効に減少させるで あろう。熱による失活はまた適当な添加剤を含ませることにより調整できる。 本発明の適用の範囲で好ましいものは、利用可能であれば、有効成分として、 栄養細胞の形態でまたはより好ましくは胞子の形態のいずれかで生存する微生物 を含む製剤である。適当な製剤は、例えば、多価カチオンで架橋されそしてそれ ら微生物を含むポリマーゲルよりなっていてよい。これらは、例えば、ポリマー 材料としてアルギン酸に関して、D.R.Fravel et al．in Phytopathol ogy,Vol.75,No.7，774-777,1985 によって記載される。この文献からは、担体材 料がともに使用できることもわかる。これらの製剤は一般に天然起源のまたは合 成ゲル形態のポリマー、例えばアルギネートの溶液と、個々に小滴形態のような 多価金属イオンの水性塩溶液とを混合することにより製造され、微生物を上記２ つのうち１つまたは両方の反応溶液中に懸濁することも可能である。ゲル形成は 小滴形態中で混合することにより開始する。次いでこれらのゲル粒子の乾燥が可 能である。この方法はイオノトロピックゲル化（ionotropic gelling）と呼ばれ る。乾燥の程度により、多価カチオンにより構造的に架橋され、そして上記微生 物および主として均質な分配がなされて存在する担体を含むポリマーの圧縮およ び硬質粒子が形成される。粒子の大きさは５ｍｍまでが可能である。 微生物に加えて、例えば担体材料としての細かく分割したケイ酸を含むことも でき、Ｃａ⁺⁺によって架橋が行われる、部分的に架橋された多糖に基づく組成物 は、EP-A1-0097 571に記載されている。この組成物は０．３以下の水分活性(wat er activity)をもつ。W.J.Cornnik らは概説論文〔New Directions in Biologic al Control：Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases ,pages 345-372,Alan R.Inc.(1990)〕において、多様な製剤系、担体としてバー ミキュライトをもつ粒子および上述したイオノトロピックゲル化法により製 造された圧縮アルギニン酸ビーズを記載する。このような組成物はまた、D.R.Fr avelによってPesticide Formulations and Application Systems:llth Volume， ASTM STP 1112 American Society for Testing and Materials,Philadelpha,199 2,page 173-179に記載され、そして本発明による組換え微生物の製剤化に使用で きる。 本発明の殺虫性組成物は通常、有効成分約０．１ないし約９９％、好ましくは 約０．１ないし約９５％および最も好ましくは約３ないし約９０％；固体または 液体補助剤約１ないし約９９．９％、好ましくは約１ないし約９９％および最も 好ましくは約５ないし９５％；界面活性剤約０ないし約２５％、好ましくは約０ ．１ないし約２５％および最も好ましくは約０．１ないし約２０％を含む。 本発明の好ましい態様は、殺虫性組成物が通常、組換え体中に新規な昆虫特異 的タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子の少なくとも１ 種を含む組換えバチラス菌株、例えばバチラス・セレウスまたはバチラス・スリ ンギエンシス菌株、または他の有効成分とその組合せ０．１ないし９９％、好ま しくは０．１ないし９５％；固体または液体補助剤１ないし９９％および界面活 性剤０ないし２５％、好ましくは０．１ないし２０％を含む。 市販される製品は好ましくは原液として製剤化されるが、最終使用者は通常、 実質的により低い濃度の希釈製 剤を使用するであろう。殺虫性組成物はまた、他の成分、例えば安定剤、消泡剤 、粘度調節剤、結合剤、粘着付与剤ならびに肥料または特定の効果を得るための 他の有効成分をも含んでいてよい。 本発明の一つの態様において、ジアブロティカ・ビルギフェラ・ビルギフェラ (Diabrotica virgifera virgifera)およびジアブロティカ・ロンギコルニス・バ ルベリ(Diabrotica longicornis barberi)を殺すことができるバチラス・セレウ ス微生物が単離された。新規なバチラス・セレウスＡＢ７８菌株は米国イリノイ 州６１４０４，ペオリア，ノースユニバーシティストリート１８１５，ノーザー ン・リージョナル・リサーチ・センター，アグリカルチュラル・リサーチ・サー ビス，パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そして受 託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０５８が付与されている。 画分タンパク質はバチラス・セレウス菌株から実質的に精製された。タンパク 質のこの精製はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび生物学的活性により確認された。該タン パク質は約６０ｋＤａないし約１００ｋＤａ、特に約７０ｋＤａないし約９０ｋ Ｄａ、とりわけ約８０ｋＤａないし約８０ｋＤａの分子量を有し、以下ＶＩＰと 記載する。 アミノ末端配列決定により以下のＮ−末端アミノ酸配列が示された： NH₂-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro-（配 列番号：８）（Asx はAsp ま たはAsn のいずれかを意味する）。全体のアミノ酸配列は配列番号：７に示され ている。配列番号：７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は配列番号：６に 開示されている。 NH₂末端のアミノ酸３−９をコードする遺伝子の領域に対するオリゴヌクレオ チドプローブが生成された。該プローブはバチラス・スリンギエンシス（Ｂｔ） δ−エンドトキシン遺伝子のコドン利用性に基づいて合成された。サザンハイブ リダイゼーションのために使用されたオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチ ド配列は以下のとおりである： 5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT -3'（配列番号：９）（Ｎはいずれかの塩基を 意味する）。 さらに、本明細書に記載されたＢｃＡＢ７８ＶＩＰ１遺伝子のためのＤＮＡプ ローブは、ＶＩＰ１遺伝子（または関連遺伝子）が天然に存在するか否か、また は特定の形質転換された有機体がＶＩＰ１遺伝子を包含するか否かを決定するた めに、バチラス菌株またはその他の有機体のいずれかのスクリーニングを可能に する。 本発明をこれまで一般的に記載してきたけれども、当該本発明は、説明の目的 で提示され、そして特記しない限り本発明を制限することは意図されていない以 下の詳細な実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。 標準的な命名法が本発明により包含されるタンパク質 の配列同一性に基づいて開発された。以下の詳細な実施例のための遺伝子および タンパク質の名称および米国特許出願〔米国特許出願第３１４５９４／０８号〕 において使用された名称とのそれらの関係が下に示されている。 実施例 配合実施例 以下の配合実施例において使用される有効成分（活性 成分）は受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０５８を有するバチラス・セレウスＡＢ７ ８菌株；受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０６０、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２４、ＮＲ ＲＬ Ｂ−２１２２５、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２６、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２７ およびＮＲＲＬ Ｂ−２１４３９を有するバチラス・スリンギエンシス菌株；受 託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２８、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２９およびＮＲＲＬ Ｂ−２１２３０を有するバチラス種の菌株である。記載した全ての菌株は本発明 に係る昆虫特異的タンパク質を含有する天然の単離体である。 また、単離された昆虫特異的タンパク質は有効成分として単独で、または上記 のバチラス菌株と組み合わせて使用される。 A1．水和剤 胞子は添加剤と十分に混合し、混合物を適当なミルですっかり混合する。所望 の濃度の懸濁液を得るために、 水で希釈できる水和剤を得る。 A2．乳剤原液バチラス・スリンギエンシス 胞子 10％オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル 3％ （エチレンオキシド4-5モル）ドデシルベンゼンスルホン 酸カルシウム 3％ヒマシ 油ポリエチレングリコールエーテル 4％ （エチレンオキシド36モル） シクロヘキサノン 30％ キシレン混合物 50％ いずれかの必要な濃度の乳剤も、この原液を水で希釈することによって得られ る。 A3．粉剤 有効成分を担体と混合しそして適当なミルで混合物を粉砕することにより、す ぐに使用できる粉剤が得られる。 A4．押し出し粒剤バチラス・スリンギエンシス 胞子 10％ リグノスルホン酸ナトリウム 2％ カルボキシメチルセルロース 1％ カオリン 87％ 有効成分または組合せを混合し、補助剤と粉砕し、さ らに続いて水で湿らせる。混合物を押し出し、押出物を空気流で乾燥する。 A5．被覆粒剤バチラス・スリンギエンシス 胞子 3％ ポリエチレングリコール（分子量200） 3％ カオリン 94％ 有効成分または組合せをポリエチレングリコールで湿らせたカオリンに、ミキ サー中で均一に施用する。この方法で、非粉塵性の粉剤の被覆粒剤が得られる。 A6．懸濁原液バチラス・スリンギエンシス 胞子 40％ エチレングリコール 10％ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル 6％ （エチレンオキシド15モル） リグノスルホン酸ナトリウム 10％ カルボキシメチルセルロース 1％ 37％水性ホルムアルデヒド溶液 0.2％ 75％水性乳剤形態のシリコーン油 0.8％ 水 32％ 有効成分または組合せを補助剤と均一に混合する。この方法により水と希釈す ることによってあらゆる所望の濃度の懸濁液が作れる懸濁原液が得られる。 実施例１：ＡＢ７８単離および特徴づけ バチラス・セレウスＡＢ７８が平板汚染菌として実験室内でＴ３培地（リット ルあたり；３ｇトリプトン，２ｇトリプトース，１．５ｇ酵母抽出物，０．０５ Ｍリン酸ナトリウムおよび０．００５ｇＭｎＣｌ₂；Travers，R．S．1983）に単 離された。対数期の間に、ＡＢ７８ば西方ハムシモドキに対する顕著な活性を示 した。グラム陽性バチラス種に対する抗生物質活性もまた示された（表１２）。 ＡＢ７８の形態学的特徴は以下のとおりである： 直線状栄養桿体、長さ３．１−５．０ｍｍおよび幅０．５−２．０ｍｍ。端部が 丸い細胞で一重の短い鎖。細胞毎に形成される単一の端部近傍が円筒状卵形の内 生胞子。副芽胞結晶の形成なし。不透明で、凸凹で、ローブ状で（丸みを帯び） 、そして平坦なコロニー。色素の産生なし。細胞は運動性あり。鞭毛あり。 ＡＢ７８の増殖特徴は以下のとおりである： ２１−３０℃の最適増殖温度を有する通性嫌気性菌。１５，２０，２５，３０お よび３７℃でも増殖。４０℃を越える温度では増殖せず。５−７％ＮａＣｌ中で 増殖。 表１３にＡＢ７８の生化学的特徴を示す。 実施例２：細菌培養 ＢｃＡＢ７８菌株の予備的培養がＴＢブロスとして知られる以下の培地に接種 するために使用された： チロシン １２ ｇ／ｌ 酵母抽出物 ２４ ｇ／ｌ グリセロール ４ ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ ２．１ ｇ／ｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄ １４．７ ｇ／ｌ ｐＨ７．４ リン酸カリウムがオートクレーブ後のブロスを冷却し た後に添加された。フラスコを３０℃にてロータリーシェーカー上２５０ｒｐｍ で２４−３６時間保温すると、対数期の初期ないし中期を提示する。 上記の手順は当該分野で十分に公知の方法により大量発酵まで容易にスケール アップされ得る。 対数期の初期ないし中期を提示する栄養増殖期の間、通常培養開始２４−３６ 時間後、ＡＢ細菌は培養上澄みから遠心分離された。活性タンパク質を含有する 培養上澄みがバイオアッセイに使用された。 実施例３：昆虫バイオアッセイ バチラス・セレウスＡＢ７８菌株が下記のようにして種々の昆虫に対して試験 された。 西方、北方および南方ハムシモドキ、それぞれジアブロティカ・ビルギフェラ ・ビルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifera)、ジアブロティカ・ロンギコ ルニス・バルベリ(Diabrotica longicornis barberi)およびジアブロティカ・ウ ンデシムプンクタタ・ホワルジ(Diabrotica undecimpunctata howardi)：希釈物 は２４−３６時間増殖させたＡＢ７８培養上澄みから生成され、溶融人工食餌(M arrone等（1985）J．of Economic Entomology 78:290-293)と混合され、そして 固化させた。固化食餌は切断され、そして皿に置かれた。新生幼虫が食餌上に置 かれ、そして３０℃に保持された。死虫率が６日後記録された。 大腸菌クローンバイオアッセイ：大腸菌細胞を１００ μｇ／ｍｌアンピシリン含有ブロス中３７℃で一晩増殖された。培養液１０ｍｌ を３回各２０秒間超音波処理した。超音波処理した培養液５００μｌを溶融西方 ハムシモドキ食餌に添加した。 コロラドハムシ〔レプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemline ata）〕：トリトンＸ−１００中の希釈物（０．１％ＴＸ−１００の最終濃度を 得る）が２４−３６時間増殖させたＡＢ７８培養上澄みから作成された。５ｃｍ² のジャガイモ葉片が上記希釈物中に浸漬され、風乾され、そしてプラスチック 皿中湿らせた濾紙上に置いた。新生幼虫が葉片上に置かれ、そして３０℃に保持 された。死虫率が３−５日後記録された。 チャイロコメノゴメムシダマシ〔テネブリオ・モリトル(Tenebrio molitor)〕 ：希釈物が２４−３６時間増殖させたＡＢ７８培養上澄みから作成された。固化 させた食餌が切断され、そしてプラスチック皿中に置かれた。新生幼虫が食餌上 に置かれ、そして３０℃に保持された。死虫率が６−８日後記録された。 アワノメイガ(European corn borer)、タマナヤガ(black cutworm)、オオタバ コガ(tobacco budworm)、スズメガ(tobacco hornworm)およびシロイチモンジヨ トウガ(beet armyworm)：それぞれオストリニア・ヌビルアリス(Ostrinia nubil alis)、アグロチス・イプシロン(Agrotis ipsilon)、ヘリオチス・ビレッセンス (Heliothis virescens)、マンドゥカ・セスタ(Manduca sexta) およびスポドプテラ・エキシグア(Spodoptera exigua)：トリトンＸ−１００中 の希釈物（０．１％ＴＸ−１００の最終濃度を得る）が２４−３６時間増殖させ たＡＢ７８培養上澄みから作成された。１００μｌを固化人工食餌（Bioserv #F 9240）の１８ｃｍ²の表面にピペットで落とし、そして風乾させた。次いで新生 幼虫が食餌表面上に置かれ、そして３０℃に保持された。死虫率が３−６日後記 録された。 北方イエカ（Northern house mosquito）、クレックス・ピピエンス(Culex pi piens)：希釈物が２４−３６時間増殖させたＡＢ７８培養上澄みから作成された 。１００μｌを３０ｍｌのプラスチックカップ内の水１０ｍｌ中にピペットで落 とした。第３令の幼虫を上記の水に加え、そして室温に保持した。死虫率が２４ −４８時間後記録された。ＡＢ７８の殺虫角形のスペクトルが表１４に示されて いる。 新規に開発されたバチラス・セレウスＡＢ７８菌株はＢｔからの公知甲虫目活 性δエンドトキシンに比べ顕著に異なる殺虫スペクトルを示した。特にＡＢ７８ はジアブロティカ種に対して特異的に活性である点において公知甲虫目活性Ｂｔ 菌株に比べ甲虫類に対してより選択的な活性を示した。さらに詳しくは、それは ジアブロティカ・ビルギフェラ・ビルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifer a)およびジアブロティカ・ロンギコルニス・バルベリ(Diabrotica longicornis barberi)に対して最も活性であるが、ジアブロティカ・ウンデシムプンクタタ・ ホワルジ(Diabrotica undecimpunctata howardi)に対しては活性ではない。 多くのバチラス菌株は西方ハムシモドキに対して栄養増殖期（表１５）の間の 活性がバイオアッセイされた。西方ハムシモドキに対する活性が一般的現象では ない点においてＡＢ７８が独特であることを上記結果は示している。 西方ハムシモドキに対するＡＢ７８の特異的活性が表１６に示されている。 ＬＤ₅₀は西方ハムシモドキ食餌ｍｌあたり培養上澄み６．２μｌであると計算 された。 細胞ペレットはまたバイオアッセイされ、そしてＷＣＲＷに対する活性を持た なかった。従って、上澄みのみの活性の存在はＶＩＰがエキソトキシン（外毒素 ）であることを示す。 実施例４：ＡＢ７８からのハムシモドキ活性タンパク質の単離および精製 細胞および有機堆積物のない培養培地を固体硫酸アンモニウム（４７２ｇ／Ｌ ）の添加により７０％飽和とした。溶解は室温そして氷浴中で冷却してなされ、 そして１００００×ｇで３０分間遠心分離して沈澱タンパク質を落としペレット 化した。上澄みを捨て、そしてペレットをｐＨ７．５の２０ｍＭトリスＨＣｌの １／１０初期容量中に溶解させた。溶解したペレットを２０ｍＭトリスＨＣｌ（ ｐＨ７．５）中での透析または脱塩カラム中の通過のいずれかにより脱塩した。 脱塩した物質を２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）を用いてｐＨ３． ５まで滴定した。３０分の室温保温後、溶液を３０００×ｇで１０分間遠心分離 した。この段階の上澄みが最大量の活性タンパク質を含んでいた。 ｐＨ７．０の中和に続いて、上澄みを２０ｍＭトリス ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑアニオン交換カラムに３００ｍ Ｌ／分の流速で流した。カラムを２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の４０ ０ｍＭ ＮａＣｌを用いて段階的に、そして直線的勾配で展開した。 カラム画分のバイオアッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が活性画分を確認す るために使用された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は生物学的に活性なタンパク質を分 子量約８０ｋＤａおよび５０ｋＤａの範囲の成分を有するものとして同定した。 実施例５：ハムシモドキ活性タンパク質の配列分析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単離された８０ｋＤａ成分をＰＶＤＦ膜に転写し、そ してＡＢＩ４７９パルスリキッドシーケンサー上での反復エドマンサイクルによ り行われるアミノ末端配列分析に供した。転写は１０％メタノールを有する１０ ｍＭＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１．０）中で以下のように行われた： 電気泳動に続くゲルの保温は転写緩衝液中５分間行われた。プロブロット(Pro Blott)ＰＶＤＦ膜は１００％ＭｅＯＨで短時間湿らせ、次に転写緩衝液中で平衡 化した。サンドイッチはフォームスポンジと矩形濾紙との間に配置され、陰極− ゲル−膜−陽極の配置を有する。 転写は７０Ｖの定電圧で１時間行われた。 転写に続いて、膜を水ですすぎ、そして５０％ＭｅＯＨ中の０．２５％クマー シーブルーＲ−２５０で２分間 染色した。 脱染色が５０％ＭｅＯＨ ４０％水 １０％酢酸で数回すすいで行われた。 脱染色に続いて、配列分析のためのバンドの切除に先立って、膜を風乾した。 ブロットカートリッジ(BlottCartridge)および適当なサイクルが最大効率および 収率を得るために利用された。データ分析は、各配列決定サイクルのためのＰＴ Ｈ−アミノ酸誘導体を同定および定量するためにモデル６１０シーケンス・アナ リシス(Sequence Analysis)ソフトウエアを用いて行われた。 Ｎ末端配列は以下のとおり決定された： NH₂-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro-（配 列番号：８）（Asx はAsp またはAsn のいずれかを意味する）。８０ｋＤａ成分 に対する完全なアミノ酸配列は配列番号：７に示されている。配列番号：７をコ ードするＤＮＡ配列は配列番号：６に開示されている。 実施例６：ＤＮＡプローブの構築 Ｎ末端配列（実施例５）のアミノ酸３−９をコードする遺伝子の領域に対する オリゴヌクレオチドプローブが生成された。該プローブはバチラス・スリンギエ ンシス（Ｂｔ）δ−エンドトキシン遺伝子のコドン利用性に基づいて合成された 。このヌクレオチド配列： 5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3'（配列番号：９）はサザンハイブリダイゼ ーションにおけるプローブとし て使用された。オリゴヌクレオチドは標準的方法および装置を用いて合成された 。 実施例７：ハムシモドキ活性タンパク質の等電点測定 精製工程の段階５からの精製タンパク質がファストゲル電気泳動システム（フ ァルマシア）を用いる３−９ｐ１等電点電気泳動ゲル上で分析された。この装置 のための標準的操作手順が分離および銀染色現像工程に対して続けられた。ｐ１ は約４．９に近接した。 実施例８：ＡＢ７８に関するＰＣＲデータ ＰＣＲ分析（例えば米国特許出願第０８／００８００６；およびCarozzi 等（ 1991）Appl．Environ．Microbiol．57(11):3057-3061参照，参照によりこれらの 文献は本明細書に編入）は、バチラス・セレウスＡＢ７８菌株がバチラス・スリ ンギエンシスまたはバチラス・スファエリクスのいずれかの殺虫性結晶タンパク 質遺伝子を含まないことを証明するために使用された（表１７）。 実施例９：バチラス・セレウスＡＢ７８菌株からの全ＤＮＡのコスミドクローニ ング 以下のようにＶＩＰ１Ａ（ａ）遺伝子がＡＢ７８菌株から調製された全ＤＮＡ からクローン化された： ＡＢ７８ＤＮＡの単離は以下のように行われた： １．細菌を１０ｍｌＬ−ブロス中で一晩増殖させる（５０ｍｌの殺菌遠心管を使 用）。 ２．新鮮なＬ−ブロス２５ｍｌおよびアンピシリン（３０μｇ／ｍｌ）を添加す る。 ３．細胞を３０℃で２−６時間震盪して増殖させる。 ４．ＩＥＣ卓上臨床用遠心分離機を用い５０ｍｌのポリプロピレンオレンジキャ ップチューブにて３／４速度で細胞を回転させる。 ５．細胞ペレットを１０ｍｌＴＥＳ（ＴＥＳ＝５０ｍＭトリスｐＨ８．０，１０ ０ｍＭ ＥＤＴＡ，１５ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁する。 ６．リゾチーム３０ｍｇを添加し、そして３７℃で２時間保温する。 ７．２０％ＳＤＳ２００μｌおよびプロテイナーゼＫストック（２０ｍｇ／ｍｌ ）４００μｌを添加する。３７℃で保温する。 ８．新鮮なプロテイナーゼＫ２００μｌを添加する。５５℃で１時間保温する。 ＴＥＳ５ｍｌを添加し、最終容 量を１５ｍｌとする。 ９．フェノール抽出を２回行う（１０ｍｌフェノール，ＩＥＣ卓上臨床用遠心分 離機を用い室温にて３／４速度で回転）。上澄み（上層）を清浄なチューブに広 口ピペットを用いて移す。 １０．１：１（容量）フェノール：クロロホルム／イソアミルアルコール（２４ ：１比率）で１回抽出する。 １１．ＤＮＡを等量の冷イソプロパノールで沈澱させ；ＤＮＡをペレット化する ために遠心分離する。 １２．５ｍｌＴＥ中でペレットを再懸濁する。 １３．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）０．５ｍｌおよび９５％エタノール１１ ｍｌでＤＮＡを沈澱させる。−２０℃で２時間保存する。 １４．チューブからのＤＮＡをプラスチックループで「フック」し、微量遠心チ ューブに移し、回転し、過剰なエタノールをピペットで吸い、真空中で乾燥させ る。 １５．ＴＥ０．５ｍｌ中に再懸濁させる。６５℃で９０分保温して得られたＤＮ Ａを溶液に戻す。 １６．標準的方法を用いて濃度を決定する。 ＡＢ７８のコスミドクローニング 特記しない限り全ての操作はストラタジーン・プロトコル，スーパーコス１・ インストラクション・マニュアル(Stratagene Protocol，Supercos 1 Instructi on Manual)，カタログ番号２５１３０１に従って行われた。 一般に工程は以下のとおりである： Ａ．ＡＢ７８ＤＮＡのＳａｕ３Ａ部分消化 Ｂ．ベクターＤＮＡの調製 Ｃ．ＤＮＡの連結および封入 Ｄ．コスミドライブラリーの滴定 １．０．２％マルトースを有するＴＢ５ｍｌ中に一晩培養液５０ｍｌを入れ ることによりＨＢ１０１細胞の培養を開始する。３７℃で３．５時間保温する。 ２．細胞を回転して落とし、そして１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄０．５ｍｌ中に再 懸濁する。 ３．細胞 １００ｌ 希釈された封入混合物 １００ｌ １０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ １００ｌ ＴＢ ３０ｌ を一緒に添加する。 ４．震盪せずに室温で３０分間吸収させる。 ５．ＴＢ１ｍｌを添加し、そしてゆっくり混合する。３７℃で３０分間保温 する。 ６．Ｌ−ａｍｐプレート上に２００ｌをプレーティングする。３７℃で一晩 保温する。 少なくとも４００のコスミドクローンが無作為に選択され、そして実施例３に 記載されたようにハムシモドキに対する活性がスクリーニングされた。５つの活 性クローンと５つの非活性クローンからのＤＮＡがサザンハイブリダイゼーショ ンにおいて使用された。結果は、上記のオリゴヌクレオチドプローブを用いるハ イブリダイゼ ーションが西方ハムシモドキ活性と相関関係を有することを示した（表１８）。 コスミドクローンＰ３−１２およびＰ５−４はアグリカルチュラル・リサーチ ・サービス・パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そ してそれぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０６１およびＮＲＲＬ Ｂ−２１０５ ９が付与されている。 実施例１０：西方ハムシモドキに対して活性な６ｋＢ領域の同定 Ｐ３−１２からのＤＮＡを制限酵素Sau 3Aで部分的に消化し、そして大腸菌ベ クターｐＵＣ１９中に連結し、 そして大腸菌に形質転換した。８０ｋＤａのＶＩＰ１Ａ（ａ）タンパク質に特異 的なＤＮＡプローブがＰ３−１２の一部のＰＣＲ増幅により合成された。ＶＩＰ １Ａ（ａ）の一部とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドＭＫ１１３および ＭＫ１１７が８０ｋＤａタンパク質の部分的アミノ酸配列を用いて合成された。 プラスミドサブクローンがＰＣＲ生成プローブへのコロニーハイブリダイゼーシ ョンにより同定され、そして西方ハムシモドキに対する活性が試験された。１つ のそのようなクローンＰＬ２がＰＣＲ生成断片にハイブリッド形成し、そして上 記のアッセイにおいて西方ハムシモドキに対して活性だった。 ｐＬ２からの６ｋｂ ＣｌａＩ制限断片が大腸菌−バチラスシャトルベクター ｐＨＴ３１０１（Lereclus，D.等，FEMS Microbiology Letters 60:211-218（19 88））のSmaI部位にクローン化され、ｐＣＩＢ６２０１を得た。この構築物はい ずれかの配向でバチラスおよび大腸菌の両方に対して西方ハムシモドキ抵抗活性 を付与する。ｐＣＩＢ６２０１はｐブルースクリプト(pBluescript)ＳＫ（＋） （ストラタジーン）における同じ６ｋｂCla I断片を含有し、同等なＶＩＰ１Ａ （ａ）タンパク質を産生し（ウエスタンブロットによる）、そしてまた西方ハム シモドキに対して活性である。 ｐＣＩＢ６２０１のヌクレオチド配列はSanger等，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，74:5463-5467（1977）のジ デオキシ連鎖停止法により、ＰＲＩＳＭレディ・リアクション・ダイ・デオキシ ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キット(PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit)およびＰＲＩＳ erminator Double-Stranded DNA Sequencing Kit)を用いて決定され、そしてＡ ＢＩ３７３自動シーケンサーで分析された。配列は配列番号：１に示されている 。６ｋｂ断片は配列番号：１に記載される読み枠により示されるようにＶＩＰ１ Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）の両方をコードする。ｐＣＩＢ６２０１に見出 された６ｋｂ内のＶＩＰ１Ａ（ａ）とＶＩＰ２Ａ（ａ）との関係は表１９に示さ れている。ｐＣＩＢ６２０１は米国イリノイ州６１４０４，ペオリア，ノースユ ニバーシティストリート１８１５，ノーザーン・リージョナル・リサーチ・セン ター，アグリカルチュラル・リサーチ・サービス，パテント・カルチャー・コレ クション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そして受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２２が 付与されている。 実施例１１：ＶＩＰ１Ａ（ａ）ＤＮＡ領域の機能分析 ＶＩＰ１Ａ（ａ）の読み枠（ＯＲＦ）が殺虫活性に必要であることを確認する ために、翻訳フレームシフト突然変異が遺伝子内に創生される。制限酵素BglII はＶＩＰ１Ａ（ａ）のコード領域内の８５７ｂｐに位置するユ ニーク部位を認識する。ｐＣＩＢ６２０１はBglII で消化され、そして一本鎖が ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片）およびｄＮＴＰＳで充填された。プラスミ ドを再び連結し、そして大腸菌内に形質転換した。得られたプラスミドｐＣＩＢ ６２０３は４ヌクレオチド挿入部をＶＩＰ１Ａ（ａ）のコード領域内に含む。ｐ ＣＩＢ６２０３はＷＣＲＷ殺虫活性を付与せず、西方ハムシモドキ活性の実質的 成分であることが確認された。 ＶＩＰ１Ａ（ａ）をコードするために必要な領域を規定するために、ＶＩＰ１ Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）（補助的タンパク質）領域のサブクローンが構 築され、そしてｐＣＩＢ６２０３における突然変異を補足する能力が試験された 。ｐＣＩＢ６２０３はｐブルースクリプト(pBluescript)ＳＫ（＋）（ストラタ ジーン）内に３．７ｋｂXbaI−BcoRV 断片を含有する。ウエスタンブロット分析 はクローンＰＬ２およびｐＣＩＢ６２０２と同じ大きさおよび性質のＶＩＰ１Ａ （ａ）タンパク質を産生することを示す。ｐＣＩＢ６２０３は８０ｋＤタンパク 質をコードする全体の遺伝子を含有する。ｐＣＩＢ６２０３は米国イリノイ州６ １４０４，ペオリア，ノースユニバーシティストリート１８１５，ノーザーン・ リージョナル・リサーチ・センター，アグリカルチュラル・リサーチ・サービス ，パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そして受託番 号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２２が付与されている。 ｐＣＩＢ６０２３、ｐＣＩＢ６２０６およびｐＣＩＢ６２０３は個々に試験し た場合に検出し得る西方ハムシモドキ活性を生しない。ｐＣＩＢ６２０３（ＶＩ Ｐ１Ａ（ａ）突然変異，＋ＶＩＰ２Ａ（ａ））を含有する細胞とｐＣＩＢ６０２ ３（ＶＩＰ１Ａ（ａ）のみ）を含有する細胞との混合物は西方ハムシモドキに対 する高い活性を示す。同様に、ｐＣＩＢ６２０６を含有する細胞とｐＣＩＢ６０ ２３を含有する細胞との混合物は西方ハムシモドキに対する高い活性を示す。 ＶＩＰ２Ａ（ａ）の境界をさらに決定するために、ＶＩＰ２Ａ（ａ）の全体を 含有するが、ＶＩＰ１Ａ（ａ）コード領域のほとんどを欠失するｐＣＩＢ６０２ ４を構築した。ｐＣＩＢ６０２４はｐＣＩＢ６０２２から２．２ｋｂClaI−ScaI 制限断片をゲル精製し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片）およびｄＮＴＰＳ で一本鎖末端を充填し、そしてこの断片を酵素BcoRV で消化したｐブルースクリ プト(pBluescript)ＳＫ（＋）（ストラタジーン）内に連結する。ｐＣＩＢ６０ ２４を含有する細胞は西方ハムシモドキに対して活性を示さなかった。しかしな がら、ｐＣＩＢ６０２４を含有する細胞とｐＣＩＢ６０２３を含有する細胞との 混合物は西方ハムシモドキに対する高い活性を示す（表１９参照）。 従って、ｐＣＩＢ６０２３およびｐＣＩＢ６２０６は機能的なＶＩＰ１Ａ（ａ ）遺伝子産物を産生し、そしてｐＣＩＢ６２０３およびｐＣＩＢ６０２４は機能 的なＶ ＩＰ２Ａ（ａ）遺伝子産物を産生する。これらの結果は、西方ハムシモドキ活性 を最大限に付与するために、ＶＩＰ１Ａ（ａ）と組み合わせてＶＩＰ２Ａ（ａ） 領域からの遺伝子産物の必要性を示唆する。（表１９参照）。 四角で囲まれた領域はＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）の範囲を示す。 白い四角はバチラスに観察された８０ｋＤａペプチドをコードするＶＩＰ１の部 分を示す。黒い四角はＤＮＡ分析により予測されるＶＩＰ１Ａ（ａ）のＮ末端の 「プロペプチド」を示す斑点で示す四角はＶＩＰ２Ａ（ａ）コード領域を示す。 大文字「Ｘ」はＶＩＰ１Ａ（ａ）中に導入されたフレームシフト突然変異の位置 を示す。矢印はベーターガラクトシダーゼにより転写される構築物を示す。 実施例１２：ＡＢ７８抗体製造 抗体製造が２匹のルイスラットにおいて開始されて、両方がハイブリドーマ細 胞系の産生に移動することを可能にし、そしてゲノムＤＮＡライブラリーの限定 されたスクリーニングのための十分な血清を製造することを可能にする。もう１ つの因子は利用できる抗原の非常に限られた量であり、そしてＰＡＧＥおよびニ トロセルロースへの引き続く電気的転写により精製物まで製造され得るのみであ るという事実である。 ニトロセルロース上での抗原の限られた利用可能性のために、該ニトロセルロ ースはＤＭＳＯ中に乳化され、そして膝窩リンパ節のわずか上流にＢ細胞産生を 誘導するために動物の後脚に注射した。第１の産生採血でのウエスタンブロット 分析により判断されるように、強力な反応性血清が製造された。何回かの引き続 く注射および採血により十分な血清が産生され、必要なスクリーニングの全てを 完了した。 一方のラットでのハイブリドーマ産生が次に開始された。膝窩リンパ節が切除 され、破砕し、そして得られる細胞をマウスミエローマＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５ ３と融合した。次の細胞スクリーニングは下記のように行われた。限界希釈クロ ーニングに移されるべき最高の乳化抗原反応を示した４つの開始ウエルが選択さ れた。追加の１０ウエルが増量および冷凍保存のために選択された。 エリザスクリーニングのためにＤＭＳＯ中のニトロセルロース上にＡＢ７８を乳 化するための操作 ＰＡＧＥ上を流したＡＢ７８試料をニトロセルロースに電気的転写した後、反 転可能な菌株ポンセアウＳ(Ponceau S)が転写された全てのタンパク質を可視化 するために使用された。前もって同定され、そしてＮ末端が配列決定されたＡＢ ７８毒素に相当するバンドが同定され、そしてニトロセルロースから切除された 。各バンドは乳化したニトロセルロースの量を最小限とするために、約１ｍｍ× ５ｍｍの大きさである。１つのバンドをＤＭＳＯ２５０μｌと共に微量遠心チュ ーブに入れ、そしてプラスチック製乳棒（コンテス，ニュージャージー州バイン ランド）を用いて破砕した。乳化を助けるために、ＤＭＳＯ混合物を３７−４５ ℃で２−３分間加熱する。さらにいくぶんかの破砕が加熱に続いて必要であるか もしれないが、ニトロセルロースの全てが乳化されるべきである。ＡＢ７８試料 が乳化したら、氷上に置く。乳化抗原でのマイクロタイターコーティングのため の準備において、試料はホウ酸緩衝化食塩水中に下記のように希釈されなけばな らない：１：５，１：１０，１：１５，１：２０，１：３０，１：５０，１：１ ００および０。コーティング抗原は使用直前に調製されなければならない。 エリザプロトコル １．ＢＳ中のＡＢ７８／ＤＭＳＯでコーティングする。 ４℃で一晩保温する。 ２．１×エリザ洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。 ３．室温で３０分間阻害する（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび０．０５％ツイー ン２０）。 ４．１×エリザ洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。 ５．ラットの血清を添加する。３７℃で１．５時間保温する。 ６．１×エリザ洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。 ７．ヤギ抗ラットをエリザ希釈剤中に２μｇ／ｍｌの濃度で添加する。３７℃ で１時間保温する。 ８．１×エリザ洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。 ９．ウサギ抗ヤギアルカリホスファターゼをエリザ希釈剤中に２μｇ／ｍｌの 濃度で添加する。３７℃で１時間保温する。 １０．１×エリザ洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。 １１．基質を添加する。室温で３０分間保温する。 １２．３Ｎ ＮａＯＨで３０分間停止する。 ＶＩＰ２Ａ（ａ）抗血清の調製 部分的に精製したＡＢ７８培養上澄みを不連続ＳＤＳ ＰＡＧＥ（ノベックス ）により製造業者の指示に従って分離した。分離したタンパク質をTowbin等（19 79）により記載されるようにニトロセルロース（Ｓ＆Ｓ＃２１６４０）に電気泳 動した。ニトロセルロースをポンセアウＳで染色し、そしてＶＩＰ２Ａ（ａ）バ ンドが同定さ れた。ＶＩＰ２Ａ（ａ）バンドは切除され、注射直前にＤＭＳＯ中に乳化された 。フロイントの完全アジュバントとほぼ１：１に混合した乳化ＶＩＰ２Ａ（ａ） で４ヵ所の異なる部位への筋肉内注射によりウサギが第１の免疫感作が行われた 。続く免疫感作は４週間隔で行われ、そしてフロイントの不完全アジュバントを 用いたことを除いて第１の免疫感作と同様だった。免疫感作に続いて集めた１回 目の血清がＶＩＰ２Ａ（ａ）タンパク質と反応した。この抗血清を用いたＡＢ７ ８培養上澄みのウエスタンブロット分析により、ほぼ全長のＶＩＰ２Ａ（ａ）タ ンパク質が同定される。 実施例１３：ＡＢ７８ＶＩＰクローンでの非活性Ｂｔ菌株の殺虫性の活性化 Ｂｔ菌株ＧＣ９１からの２４時間培養（初期ないし中期対数期）上澄みと共に ｐＣＩＢ６２０３を添加すると、ジアブロティカ・ビルギフェラ・ビルギフェラ (Diabrotica virgifera virgifera)において１００％死虫率を示す。ｐＣＩＢ６ ２０３もＧＣ９１もそれ自体ではジアブロティカ・ビルギフェラ・ビルギフェラ に対して活性ではない。データは下に示されている： 実施例１４：バチラス・セレウスＡＢ８１の単離および 生物学的活性 ＡＢ８１と表記される第２のバチラス・セレウス菌株が標準的方法論により穀 物貯蔵所塵埃から単離された。ＡＢ８１の継代培養物を増殖させ、そして実施例 ２に記載されるようにバイオアッセイのために調製された。生物学的活性が実施 例３に記載されたように評価された。結果は下記のとおりである： 実施例１５：バチラス・スリンギエンシスＡＢ６の単離および生物学的活性 ＡＢ６と表記されるバチラス・スリンギエンシス菌株が当業界で公知の標準的 方法論により穀物貯蔵所塵埃から単離された。ＡＢ６の継代培養物を増殖させ、 そして実施例２に記載されるようにバイオアッセイのために調製された。試料の 半分がβ−エキソトキシンの存在に対して試験するために１５分間オートクレー ブ処理された。 生物学的活性が実施例３に記載されたように評価された。結果は下記のとおり である： オートクレーブ処理により培養上澄みの殺虫活性が著しく低下したことは、活 性原理がβ−エキソトキシンではないことを示す。 ＡＢ６菌株が米国イリノイ州６１４０４，ペオリア，ノースユニバーシティス トリート１８１５，ノーザーン・リージョナル・リサーチ・センター，アグリカ ルチュラル・リサーチ・サービス，パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲ ＲＬ）に寄託され、そして受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０６０が付与されている 。 実施例１６：：バチラス・スリンギエンシスＡＢ８８の単離および生物学的活性 ＡＢ８８と表記されるＢｔ菌株が標準的方法論により穀物貯蔵所塵埃から単離 された。ＡＢ８８の継代培養物を増殖させ、そして実施例２に記載されるように バイオアッセイのために調製された。試料の半分がβ−エキソトキシンの存在に 対して試験するために１５分間オートクレーブ処理された。生物学的活性が実施 例３に記載されたように評価された。結果は下記のとおりである： オートクレーブ処理により培養上澄みの殺虫活性が著しく低下したことは、活 性原理がβ−エキソトキシンではないことを示す。 δ−エンドトキシン結晶は標準的方法論によりＡＢ８８菌株から精製された。 アグロチス・イプシロン(Agrotis ipsilon)に対してバイオアッセイされた場合 に純粋な結晶からの活性は観察されなかった。 実施例１７：ＡＢ８８菌株からのＶＩＰの精製 細菌液体培養物をＴＢ培地中３０℃で一晩〔１２時間〕増殖させた。細胞を５ ０００×ｇで２０分間遠心分離し、そして上澄みを保存する。上澄みに存在する タンパク質を硫酸アンモニウム（７０％飽和）で沈澱させ、遠心分離し（５００ ０×ｇで１５分間）、そしてペレットを保存する。ペレットを２０ｍＭトリス（ ｐＨ７．５）の初期容量中に再けんだくし、そして同じ緩衝液に対して４℃で一 晩透析する。ＡＢ８８透析物はＡＢ７８からの対応物に比べ、より混濁していた 。２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）を用いて該透析物をｐＨ４．５ま で滴定し、そして室温で３０分間保温した後、 溶液を３０００×ｇで１０分間遠心分離した。タンパク質ペレットを２０ｍＭビ ストリスープロパン（ｐＨ９．０）中に再懸濁した。 ＡＢ８８タンパク質は等電点電気泳動（ロトフォル，バイオラッド，カリフォ ルニア州ヘルクレス）、ｐＨ４．５での沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、 サイズ排除クロマトグラフィーおよび超遠心分離等の精製のためのいくつかの異 なる種類により分離された。タンパク質はポロスＨＱ／Ｎ陰イオン交換カラム（ パーセプティブ・バイオシステムズ，マサチューセッツ州ケンブリッジ）にて２ ０ｍＭビス−トリスプロパン（ｐＨ９．０）中の０ないし５００ｍＭ ＮａＣｌ の線状勾配を用いて４ｍｌ／分の流速で分離された。殺虫性タンパク質は２５０ ｍＭ ＮａＣｌで溶離した。 アワノメイガ（ＥＣＢ）活性タンパク質が透析物のｐＨ４．５沈澱により得ら れたペレット中に存在した。調製ＩＥＦがｐＨ３−１０両性電解質を用いて透析 物に対して行われた場合、ＥＣＢ殺虫活性がｐＨ７またはそれ以上の全ての画分 に見出された。これら画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析はＭＷ〜６０ｋＤａおよび〜 ８０ｋＤａのタンパク質バンドを示した。６０ｋＤａおよび８０ｋＤａバンドは パロス−Ｑカラム（パーセプティブ・バイオシステムズ，マサチューセッツ州ケ ンブリッジ）上での陰イオン交換ＨＰＬＣにより分離された。Ｎ末端配列がわず かに異なるＭＷのタンパク質を含有する２つの画分 から得られたが、大きさは両方とも約６０ｋＤａだった。得られた配列は互いに 類似しており、そしていくつかのδ−エンドトキシンに類似していた。 陰イオン交換画分２３（より小さい）： ｘＥＰＦＶＳＡｘｘｘＱｘｘｘ（配列番号：１０） 陰イオン交換酉分２８（より大きい）： ｘＥＹＥＮＶＥＰＦＶＳＡｘ（配列番号：１１） ＥＣＢ活性ｐＨ４．５ペレットがパロス−Ｑカラム上での陰イオン交換により 分離された場合、活性は〜６０ｋＤａの主要バンドを含有する画分にのみ見出さ れた。 タマナヤガ活性タンパク質もまた、ＡＢ８８透析物がｐＨ４．５で沈澱された 場合のペレット中に存在した。ｐＨ３−１０両性電解質を用いる調製ＩＥＦにお いて、ＥＣＢ活性ＩＥＦ画分に活性が見出されなかったが、ｐＨ４．５−５．０ の画分において最大であった。その主な成分は〜３５および〜８０ｋＤａの分子 量を有する。 ｐＨ４．５ペレットは陰イオン交換ＨＰＬＣにより分離されて３５ｋＤａ物質 のみを含む画分と３５ｋＤａおよび８０ｋＤａの両方を含む画分とが得られた。 実施例１８：ＡＢ８８ＶＩＰの特徴づけ 種々の鱗翅目活性栄養増殖期タンパク質を含む画分が実施例１７に記載される ように生成された。殺虫活性を有する画分は８ないし１６％ＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル中で分離され、そしてＰＶＤＦ膜〔LeGendre等，(1989)：A Practi cal Guide to Protein and Peptide P urification for Microsequencing，Matsudaira PT編（Academic Press Inc，Ne w York）所収〕に転写された。画分の生物学的分析は、異なるＶＩＰが異なる鱗 翅目種の活性に関連することを示した。 アグロチス・イプシロン(Agrotis ipsilon)活性は単独で移送されるか、また は組み合わされた８０ｋＤａおよび／または３５ｋＤａタンパク質に起因してい る。これらのタンパク質は公知Ｂｔδ−エンドトキシン配列の配列相同性の欠如 により示されるようにＢｔからのいずれかのδ−エンドトキシンと関連しない。 ＡＢ８８菌株からのＶＩＰ３Ａ（ａ）殺虫タンパク質はＡＢ８８培養液の上澄み 中にほとんど（全体の少なくとも７５％）存在している。 また、これらのタンパク質はＡＢ８８δ−エンドトキシン結晶中に見出されな い。主要なδ−エンドトキシンタンパク質のＮ末端配列は８０ｋＤａおよび３５ ｋＤａＶＩＰのＮ末端配列と比較されたが、配列相同性を示さなかった。ＶＩＰ ３Ａ（ａ）殺虫タンパク質のＮ末端配列は多くの正に荷電した残基（Ａｓｎ２か らＡｓｎ７まで）、それに続く疎水性コア領域（Ｔｈｒ８からＩｌｅ３４まで） を有している。多くの公知分泌タンパク質と異なり、ＡＢ８８からのＶＩＰ３Ａ （ａ）殺虫タンパク質は移送の間にＮ末端がプロセシングされない。 結果の要約は以下のとおりである： オストリニア・ヌビルアリス(Ostrinia nubilalis)活性は６０ｋＤａＶＩＰに 起因し、そしてスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)活性は大 きさ未知のＶＩＰに起因している。 バチラス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)ＡＢ８８菌株は米国イ リノイ州６１６０４，ペオリア，ノース ユニバーシティ ストリート１８１５ のアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー・コレクシ ョン（ＮＲＲＬ）に寄託され、そしてそれぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２ ５が付与されている。 実施例１８Ａ：バチラス・スリンギエンシスＡＢ４２４の単離および生物学的活 性 ＡＢ４２４と表記されるバチラス・スリンギエンシス菌株が当該分野で公知の 標準的方法によりコケ被覆松かさ試料から単離された。ＡＢ４２４の継代培養物 を増殖 させ、そして実施例２に記載されるようにバイオアッセイのために調製された。 生物学的活性が実施例３に記載されたように評価された。結果は下記のとおりで ある： ＡＢ４２４菌株は米国イリノイ州６１６０４，ペオリア，ノース ユニバーシ ティ ストリート１８１５のアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテン ト・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そしてそれぞれ受託番 号ＮＲＲＬ Ｂ−２１４３９が付与されている。 実施例１８Ｂ：タマナヤガに対して活性なタンパク質をコードするＶＩＰ３Ａ（ ａ）およびＶＩＰ３Ａ（ｂ）遺伝子のクローニング 単離体ＡＢ８８およびＡＢ４２４からの全ＤＮＡが単離され〔Ausubel 等(198 8)：Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，NY)〕、そ してそれぞれ制限酵素XbaI〔バチラス・スリンギエンシスＡＢ８８ＤＮＡの４． ０ないし５．０ｋｂの大きさに分画されたXbaI断片のライブラリー〕およびBcoR I〔バチラス・スリンギエンシスＡＢ４２４ＤＮＡの４．５ないし６．０ｋｂの 大きさに分画されたBcoRI 断片のライブラリ ー〕で消化され、そして予め同じ制限酵素での線状化および脱ホスホリル化され たｐブルースクリプトベクター内に連結され、そして大腸菌ＤＨ５α菌株中に形 質転換された。組換えクローンはニトロセルロースフィルター上にブロット化さ れ、それは引続きアグロチス・イプシロン（タマナヤガ）に対して活性な８０ｋ Ｄａタンパク質の１１Ｎ末端アミノ酸に相当する³²Ｐ標識３３塩基長のオリゴヌ クレオチドでプローブされた。ハイブリッド形成は２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ （１×ＳＳＣ＝０．１５ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ ７．４）中４２℃で５分間、そして１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中５０℃にて１ ０分間で２回行われた。４００個の組換えクローンのうち４個が陽性であった。 陽性の組換え体の昆虫バイオアッセイはＡＢ８８またはＡＢ４２４上澄みのもの に比較し得るタマナヤガ幼虫に対する毒性を示した。 プラスミドｐＣＩＢ７１０４はＡＢ８８ＤＮＡの４．５ｋｂXbaI断片を含有す る。継代培養は殺虫正タンパク質のコード領域を確定するために行われた。 大腸菌ｐＣＩＢ７１０５はｐＣＩＢ７１０の３．５ｋｂXbaI−AccI断片をｐブ ルースクリプトベクター内にクローニングすることにより構築された。 プラスミドｐＣＩＢ７１０６はＡＢ４２４ＤＮＡの５．０ｋｂEcoRI 断片を含 有していた。この断片はさらにHincIIで消化され、２．８ｋｂEcoRI−HincII挿 入体（ｐ ＣＩＢ７１０７）が付与されたが、これは依然として機能的殺虫性タンパク質を コードする。 ｐＣＩＢ７１０４、ＡＢ８８からの陽性組換えクローンおよびｐＣＩＢ７１０ ７、ＡＢ４２４からの陽性組換えクローンのヌクレオチド配列はSanger等，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，74:5463-5467（1977）のジデオキシ連鎖停止法により 、ＰＲＩＳＭレディ・リアクション・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイク ル・シーケンシング・キット(PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cyc le Sequencing Kit)およびＰＲＩＳＭシーケ r Double-Stranded DNA Sequencing Kit)を用いて決定され、そしてＡＢＩ３７ ３自動シーケンサーで分析された。 クローンｐＣＩＢ７１０４はコード領域が配列番号：２８に開示されているＶ ＩＰ３Ａ（ａ）遺伝子を含有し、そしてコードされたタンパク質配列は配列番号 ：２９に開示されている。トウモロコシにおいて高度に発現されるように設計さ れたコード領域の合成体は配列番号：３０で示されている。多数の合成遺伝子が 配列２９で示されたアミノ酸配列に基づいて設計され得る。 クローンｐＣＩＢ７１０７はコード領域が配列番号：３１に開示されているＶ ＩＰ３Ａ（ｂ）遺伝子を含有し、そしてコードされたタンパク質配列は配列番号 ：３２に 開示されている。ｐＣＩＢ７１０４およびｐＣＩＢ７１０７の両方は米国イリノ イ州６１４０４，ペオリア，ノースユニバーシティストリート１８１５，ノーザ ーン・リージョナル・リサーチ・センター，アグリカルチュラル・リサーチ・サ ービス，パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そして それぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１４２２およびＢ−２１４２３が付与されて いる。 ＶＩＰ３Ａ（ａ）遺伝子はヌクレオチド７３２から３１０５に伸長する読み枠 （ＯＲＦ）を含む。このＯＲＦは分子量８８５００ガルトンに相当する７９１ア ミノ酸からなペプチドをコードする。シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列は最初 のメチオニンの前６塩基に位置しており、そしてその配列は強力なバチラスに対 するＳＤを同定する。 ＶＩＰ３Ａ（ｂ）遺伝子はＶＩＰ３Ａ（ａ）に対して９８％同一である。 ＡＢ８８バチラス・スリンギエンシス細胞から単離された全ＤＮＡのブロスト (blost)がＶＩＰ３Ａ殺虫性タンパク質のＮ末端領域に広がる３３塩基断片でプ ローブされた場合、単一のバンドが異なる制限消化物中に観察され得る。この結 果は遺伝子のコード領域に及ぶより大きいプローブを用いることにより確認され た。ゲンバンク(GenBank)データの探索により公知タンパク質に対する相同性は 示さなかった。 実施例１８Ｃ：ＶＩＰ３Ａ殺虫性タンパク質の発現 ＶＩＰ３Ａ（ａ）殺虫性タンパク質の発現に対する時間経過がウエスタンブロ ットにより分析された。バチラス・スリンギエンシスＡＢ８８培養物からの試料 がその増殖曲線および胞子形成の全体から採取された。ＶＩＰ３Ａ（ａ）殺虫性 タンパク質は対数期の間、培養開始１５時間後、ＡＢ８８培養物の上澄みに検出 され得る。それは定常期の初期段階で最大レベルに達し、そして胞子形成および 間および後に高いレベルを維持した。同様の結果が、ＡＢ４２４バチラス・セレ ウス培養物の上澄みが使用された場合に得られた。ＶＩＰ３Ａ（ａ）殺虫性タン パク質のレベルはノーザンブロットにより測定されるようなＶＩＰ３Ａ（ａ）遺 伝子の発現を反映していた。胞子形成の開始は直接顕微鏡観察により、そして細 胞ペレット中のδ−エンドトキシンの存在を分析することにより決定された。Ｃ ｒｙ−Ｉタンパク質は定常期後期胞子形成の間および後には検出されなかった。 実施例１８Ｄ：ハイブリダイゼーションによる新規ＶＩＰ様遺伝子の同定 単離体ＡＢ８８からのＶＩＰ３Ａ（ａ）に関連する遺伝子を含有するバチラス を同定するために、バチラス単離体の収集物がハイブリダイゼーションによりス クリーニングされた。４６３のバチラス菌株の培養物をマイクロタイターウエル 中で胞子形成まで増殖させた。９６ピンコロニースタンペル(96-pin colony sta mpel)がＬア ガー含有の１５０ｍｍプレートに培養物を移すために使用された。接種されたプ レートを３０℃で１０時間、次いで４℃で一晩保持した。コロニーをナイロンフ ィルターにブロット化し、そして断片から誘導された１．２ｋｂHindIII ＶＩＰ ３Ａ（ａ）でプローブした。ハイブリダイゼーションはManiatis等 Molecular C loning: A Laboratory Manual(1982)のハイブリダイゼーション条件を用いて６ ２℃で一晩行われた。フィルターを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６２℃にて洗 浄し、そしてＸ線フィルムに暴露した。 スクリーニングされた４６３のバチラス菌株のうち、６０がハイブリダイゼー ションにより検出され得るＶＩＰ様遺伝子を含有する。これらのうちのいくつか （ＡＢ６およびＡＢ４２６）のさらなる特徴づけは、それらの上澄みがタマナヤ ガに対して活性であるＶＩＰ３タンパク質に類似のＢＣＷ殺虫性タンパク質を含 有することを示した。 実施例１８Ｅ：潜在ＶＩＰ３様遺伝子を含有するバチラス・スリンギエンシスＭ ２１９４菌株の特徴づけ Ｍ２１９４と表記されるバチラス・スリンギエンシス菌株は、実施例１８Ｃに 記載されるようにコロニーハイブリダイゼーションによりＶＩＰ３様遺伝子を含 有することが示された。ＡＢ８８から単離されるＶＩＰ３Ａ（ａ）タンパク質に 対して生起されたポリクローナル抗体を用いるイムノブロット分析または実施例 ３に記載さ れるようなバイオアッセイによりバクテリアの増殖期間を通じて発現が検出され 得ないので、Ｍ２１９４ＶＩＰ３様遺伝子は潜在的（クリプティック）であると 見なされる。 精製ＶＩＰ３Ａ（ａ）殺虫性タンパク質に対する抗血清がウサギにおいて産生 された。ニトロセルロース結合タンパク質（５０μｇ）がＤＭＳＯに溶解され、 そしてフロイントの完全アジュバント（ディフコ）と乳化された。２匹のウサギ が３ヵ月間毎月皮下注射された。それらは２回目および３回目の注射の１０日後 に採血され、そして血清が採血試料から回収された〔Harlow等(1988): Antibodi es: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lah Press，Plainview，NY)所収 〕。 Ｍ２１９４ＶＩＰ３様遺伝子は実施例９に記載されたプロトコルに従ってｐＫ Ｓ中にクローン化され、ｐＣＩＢ７１０８を創生した。Ｍ２１９４ＶＩＰ３遺伝 子を含むｐＣＩＢ７１０８を含有する大腸菌はタマナヤガに対して活性であり、 該遺伝子は殺虫活性を有する機能的タンパク質をコードする。プラスミドｐＣＩ Ｂ７１０８はアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー ・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そして受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１４ ３８が付与されている。 実施例１８Ｆ：ＶＩＰ３Ａの殺虫活性 ＶＩＰ３Ａ殺虫性タンパク質の活性スペクトルは、Ｖ ＩＰ^*Ａ遺伝子を有する組換え大腸菌が幼虫に供される昆虫バイオアッセイにお いて定性的に測定された。このアッセイにおいて、ＶＩＰ３Ａ（ａ）およびＶＩ Ｐ３Ａ（ｂ）遺伝子を有する細胞はアグロチス・イプシロン(Agrotis ipsilon) 、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、スポドプテラ・エキ シグア(Spodoptera exigua)、ヘリオチス・ビレッセンス(Heliothis virescens) およびヘリコベルパ・ゼア(Helicoverpa zea)に対して殺虫性だった。同じ実験 条件下で、ＶＩＰ３Ａタンパク質を含有する細菌抽出物はオストリニア・ヌビル アリス（Ostrinia nubilalis)に対して何ら活性を示さなかった。 アグロチス・イプシロン幼虫に対するＶＩＰ^*Ａ殺虫性タンパク質の効果 鱗翅目昆虫の幼虫に対するＶＩＰ３Ａ殺虫性タンパク質効果 実施例１９：その他のバチラス種の単離および生物学的活性 栄養増殖期の間に殺虫活性を有するタンパク質を産生するその他のバチラス種 が単離された。これらの菌株は標準的方法論により周囲の試料から単離された。 単離体はバイオアッセイのために調製され、そしてそれぞれ実施例２および３に 記載したようにアッセイされた。栄養増殖期の間にバイオアッセイにおいてアグ ロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon〕に対して活性を有する殺虫性タンパク 質を産生した単離体が以下のように表にまとめられる。δ−エンドトキシン結晶 と栄養増殖期の殺虫性タンパク質産生との間に相関関係は観察されなかった。 単離体ＡＢ２８９、ＡＢ２９４およびＡＢ３５９は米国イリノイ州６１４０４ ，ペオリア，ノースユニバーシティストリート１８１５，ノーザーン・リージョ ナル・リサーチ・センター，アグリカルチュラル・リサーチ・ サービス・パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そし てそれぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２９およびＮＲＲＬ Ｂ−２１２２６ が付与されている。 栄養増殖期の間にジアブロティカ・ビルギフェラ・ビルギフェラ(Diabrotica virgifera virgifera)に対する活性を有する殺虫性タンパク質を産生するバチラ ス単離体は以下のように表にまとめられる。 単離体ＡＢ５９およびＡＢ２５６は米国イリノイ州６１４０４，ペオリア，ノ ースユニバーシティストリート１８１５，ノーザーン・リージョナル・リサーチ ・センター，アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー ・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そしてそれぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ −２１２２８およびＮＲＲＬ Ｂ−２１２３０が付与されている。 実施例２０：ハイブリダイゼーションにより新規ＶＩＰ１／ＶＩＰ２様遺伝子の 同定 ＡＢ７８のＶＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）領域に見出された遺伝子に関 連する遺伝子を含有する菌株を 同定するために、バチラス菌株のコレクションがハイブリダイゼーションにより スクリーニングされた。４６３のバチラス菌株の独立した培養物を９６ウエルマ イクロタイター皿（全部で５枚の皿）のウエル中で培養物が胞子形成するまで増 殖させた。試験された菌株の中で、δ−エンドトキシン結晶の存在または不在に 基づいて２８８種がバチラス・スリンギエンシスとして分類され、そして１７５ 種がその他のバチラス種として分類された。各マイクロタイター皿に対して、９ ６ピンコロニースタンパー(96-pin colony stamper)がＬアガー含有の２枚の１ ５０ｍｍプレートに胞子培養物約１０μｌを移すために使用された。接種された プレートを３０℃で４−８時間、次いで４℃まで冷却した。コロニーをナイロン フィルターに転写し、そして当該分野で公知の標準的方法により細胞を溶解させ た。ＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）の両方のＤＮＡ配列を含有するＤ ＮＡ断片から生成したＤＮＡプローブにフィルターをハイブリダイゼーションさ せた。ハイブリダイゼーションはChurchおよびGilbert のハイブリダイゼーショ ン条件(Church，G．M.およびGilbert，PNAS，81: 1991-1995(1984))を用いて６ ５℃で一晩行われた。０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣで６２℃にてフィル ターを洗浄し、そしてＸ線フィルムに暴露した。 スクリーニングされた４６３のバチラス菌株のうち、５５がＶＩＰ１Ａ（ａ） ／ＶＩＰ２Ａ（ａ）プローブに ハイブリッド形成することが同定された。ＤＮＡが２２の上記菌株から単離され 、そしてプローブとしてＶＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）ＤＮＡとのサザン ブロットを用いて分析された。これらの菌株はそれらのサザンブロットパターン に基づいて８群に分けられた。各群はＡＢ７８からのサザンブロットパターンが 異なっていた。１つの群はバチラス・スリンギエンシス・テネブリオニス変種(B acillus thuringiensis var tenebrionis)(下記参照)からのＶＩＰ１Ａ（ａ）／ ＶＩＰ２Ａ（ａ）相同体のパターンと同一パターンを有していた。２２の菌株の 各々は西方ハムシモドキ（ＷＣＲＷ）に対する活性が試験された。３つの菌株Ａ Ｂ４３３、ＡＢ４３４およびＡＢ４３５はＷＣＲＷに対して活性であることが見 出された。ＶＩＰ２Ａ（ａ）抗血清を用いるウエスタンブロット分析は、菌株Ａ Ｂ６、ＡＢ４３３、ＡＢ４３４、ＡＢ４３５、ＡＢ４４４およびＡＢ４４５がＶ ＩＰ２Ａ（ａ）と同じ大きさのタンパク質を産生することを示した。 同定された菌株の中で顕著であったのは、実施例１５に記載されたようなタマ ナヤガ〔アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）〕に対して活性なＶＩＰ を産生するバチラス・スリンギエンシスＡＢ６菌株（ＮＲＲＬ Ｂ−２１０６０ ）である。ＶＩＰ２Ａ（ａ）に対するポリクローナル抗血清およびＶＩＰ１Ａ（ ａ）に対するポリクローナル抗血清とのウエスタンブロット分析は、Ｖ ＩＰ２Ａ（ａ）およびＶＩＰ１Ａ（ａ）に類似のタンパク質を産生する。従って 、ＡＢ６はＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）に類似のＶＩＰを含有し得 るが、殺虫活性の異なるスペクトルを有する。 実施例２１：バチラス・スリンギエンシス・テネブリオニス変種からのＶＩＰ１ Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）のクローニング いくつかの以前に特徴づけられたバチラス菌株がサザンブロット分析によりＶ ＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）に類似のＤＮＡの存在に対して試験された。 バチラス菌株ＡＢ７８、ＡＢ８８、ＧＣ９１、ＨＤ−１およびＡＴＣＣ１０８７ ６からのＤＮＡがＶＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）に類似の配列の存在に対 して分析された。Ｂｔ菌株ＧＣ９１およびＨＤ−１、およびＢｃ菌株ＡＴＣＣ１ ０８７６からのＤＮＡはＶＩＰ２Ａ（ａ）／ＶＩＰ１Ａ（ａ）ＤＮＡに対してハ イブリッド形成せず、それらがＶＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）遺伝子に類 似のＤＮＡ配列を欠失していることを示す。同様に、殺虫性菌株ＡＢ８８（実施 例１６）からのＤＮＡはＶＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）ＤＮＡ領域にハイ ブリッド形成せず、この菌株により産生されるＶＩＰ活性がＶＩＰ１Ａ（ａ）／ ＶＩＰ２Ａ（ａ）相同体から得られないことを示唆する。一方、バチラス・スリ ンギエンシス・テネブリオニス変種（Ｂｔｔ）はＶＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ （ａ）領域にハイブリッド形成する 配列を有していた。その他の分析により、ＢｔｔがＶＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２ Ａ（ａ）に類似の配列を含むことが確認された。 ＶＩＰ２Ａ（ａ）およびＶＩＰ１Ａ（ａ）のＢｔｔ相同体を特徴づけるために 、これらのタンパク質をコードする遺伝子がクローン化された。サザンブロット 分析により、同様に相同体に対するコード領域を含む９．５ｋｂEcoRI 制限断片 が同定された。ゲノムＤＮＡをEcoRI で消化し、そして長さ約９．５ｋｂのＤＮ Ａ断片がゲル精製された。このＤＮＡをEcoRI で消化したｐブルースクリプトＳ Ｋ（＋）中に結合され、そして大腸菌中に形質転換されてプラスミドライブラリ ーを生成した。約１００００のコロニーがＶＩＰ２Ａ（ａ）相同配列の存在に対 してコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングされた。２８の陽性 コロニーが同定された。２８の全てのコロニーが同定され、そしてＶＩＰ１Ａ（ ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）相同体を含む。クローンｐＣＩＢ７１００は米国イリノ イ州６１４０４，ペオリア，ノースユニバーシティストリート１８１５，ノーザ ーン・リージョナル・リサーチ・センター，アグリカルチュラル・リサーチ・サ ービス，パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託され、そして 受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１３２２が付与されている。いくつかのサブクローン がｐＣＩＢ７１００から構築された。ｐＣＩＢ７１００からの３．８ｋｂXbaI断 片はｐブルースクリ プトＳＫ（＋）中にクローン化されてｐＣＩＢ７１０１を得た。ｐＣＩＢ７１０ ０からの１．８ｋｂHindIII 断片および１．４ｋｂHindIII 断片はｐブルースク リプトＳＫ（＋）中にクローン化されてそれぞれｐＣＩＢ７１０２およびｐＣＩ Ｂ７１０３を得た。サブクローンｐＣＩＢ７１０１、ｐＣＩＢ７１０２およびｐ ＣＩＢ７１０３は米国イリノイ州６１４０４，ペオリア，ノースユニバーシティ ストリート１８１５，ノーザーン・リージョナル・リサーチ・センター，アグリ カルチュラル・リサーチ・サービス，パテント・カルチャー・コレクション（Ｎ ＲＲＬ）に寄託され、そしてそれぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１３２３、ＮＲ ＲＬ Ｂ−２１３２４およびＮＲＲＬ Ｂ−２１３２５が付与されている。 ＶＩＰ２Ａ（ａ）／ＶＩＰ１Ａ（ａ）相同体を含有するｐＣＩＢ７１００の領 域のＤＮＡ配列はジデオキシ連鎖停止法（Sanger等，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，74:5463-5467（1977））により決定された。反応はＰＲＩＳＭレディ・リア クション・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キッ ト(PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencin ー・ダブルストランド・ＤＮＡシーケンシング・キット Sequencing Kit)を用いて決定され、そしてＡＢＩ３７３自動シーケンサーで分 析された。慣用のオリゴヌクレ オチドが特定領域のＤＮＡ配列を決定するためのプライマーとして使用された。 この領域のＤＮＡ配列は配列番号：１９に示されている。 配列番号：１９に示される４ｋｂ領域は、菌株ＡＢ７８からのＶＩＰ１Ａ（ａ ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）に高い類似度を有するタンパク質をコードする２つの 読み枠を含む。標準的な命名法を用いてＶＩＰ２Ａ（ｂ）と表記されるＶＩＰ２ Ａ（ａ）相同体のアミノ酸配列は配列番号：２０に見出され、そして標準的な命 名法を用いてＶＩＰ１Ａ（ｂ）と表記されるＶＩＰ１Ａ（ａ）相同体のアミノ酸 配列は配列番号：２１に見出される。ＶＩＰ２Ａ（ｂ）タンパク質はＡＢ７８か らのＶＩＰ２Ａ（ａ）に対して９１％のアミノ酸同一性を示す。２種のＶＩＰ２ タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントは表２０に与えられている。上記２ 種のＶＩＰ１タンパク質ののアラインメントは表２１に与えられている。表２１ に示されるアラインメントはＡＢ７８からのＶＩＰ１Ａ（ｂ）とＶＩＰ１Ａ（ａ ）との類似性を開示する。このアラインメントは、２種のＶＩＰ１タンパク質の アミノ末端領域がカルボキシル末端領域におけるよりもアミノ末端領域において より高いアミノ酸同一性を有することを示す。実際、２種のタンパク質のアミノ 末端の３分の２（表２１に示されるＶＩＰ１Ａ（ｂ）配列のａａ６１８まで）が ９１％同一性を示し、カルボキシル末端の３分の１（ＶＩＰ１Ａ（ｂ）のａａ６ １９−８３３）が３５％のみの 同一性を示す。 ウエスタンブロット分析は、バチラス・スリンギエンシス・テネブリオニス変 種（Ｂｔｔ）がＶＩＰ１Ａ（ａ）類似およびＶＩＰ２Ａ（ａ）類似タンパク質の 両方を産生することを示した。しかしながら、これらのタンパク質は西方ハムシ モドキに対する活性を有するように見えない。西方ハムシモドキに対する活性の バイオアッセイはＢｔｔからの２４時間培養上澄みまたは大腸菌クローンｐＣＩ Ｂ７１００（ＶＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）相同体を含有する）を用いて 行われた。いずれの場合においても西方ハムシモドキに対する活性は検出されな かった。 ＢｔｔおよびＡＢ７８からのＶＩＰ２タンパク質間の類似性が与えられると、 ＡＢ７８からのＶＩＰ２Ａ（ａ）を置換するためのＢｔｔからのＶＩＰ２Ａ（ｂ ）の能力が試験された。ｐＣＩＢ６２０６を含有する細胞（ＡＢ７８ＶＩＰ１Ａ （ａ）タンパク質を産生するが、ＶＩＰ２Ａ（ａ）を産生しない）はＢｔｔ培養 上澄みと混合され、そして西方ハムシモドキに対する活性が試験された。Ｂｔｔ 培養上澄みもｐＣＩＢ６２０６を含有する細胞もＷＣＲＷに対する活性を持たな かったが、ＢｔｔおよびｐＣＩＢ６２０６の混合物はＷＣＲＷに対する高い活性 を与えた。さらに、追加のバイオアッセイは、大腸菌中にＶＩＰ１Ａ（ｂ）／Ｖ ＩＰ２Ａ（ｂ）遺伝子を含むＢｔｔクローンｐＣＩＢ７１００もまたｐＣＩＢ ６２０６と混合された場合にＷＣＲＷに対する活性を付与することを示した。従 って、Ｂｔｔにより産生されるＶＩＰ２Ａ（ｂ）タンパク質はＡＢ７８により産 生されるＶＩＰ２Ａ（ａ）タンパク質に機能的に同等である。 このように、ハイブリダイゼーションプローブとしてＶＩＰ ＤＮＡを用いる ことによる殺虫活性を有する新規菌株を同定するための能力は示された。さらに 、ＶＩＰ１Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）類似配列を含むバチラス菌株はＶＩＰ１ Ａ（ａ）／ＶＩＰ２Ａ（ａ）類似タンパク質を産生し、異なる有害昆虫に対する 毒性を依然として示す。類似の方法はＶＩＰ１／ＶＩＰ２ファミリーのより多数 の構成員を同定し得る。さらに、類似の方法の使用はＶＩＰのその他の変種の相 同体を同定し得る（例えばＡＢ８８からのＶＩＰ）。 実施例２２：単一ポリペプチドを製造するためのＶＩＰタンパク質の融合 ＶＩＰタンパク質は単一のポリペプチドとして、または２もしくはそれ以上の 相互作用するポリペプチドとして天然に生じ得る。活性ＶＩＰが２もしくはそれ 以上の相互作用するタンパク質鎖からなる場合、これらのタンパク質鎖は２の（ またはそれ以上の）ＶＩＰコード領域の融合から得られる遺伝子からの単一のポ リペプチド鎖として産生され得る。２本の鎖をコードする遺伝子は該遺伝子のコ ード領域を併合することにより融合されて、両方のＶＩＰポリペプチドをコード する単一の読み枠を製造する。複合ポリペプチドは融合されて融合タンパク質の ＮＨ₂末端としてのより小さいポリペプチドを製造するか、またはそれらは融合 されて融合タンパク質のＮＨ₂末端としてのより大きいポリペプチドを製造する 。リンカー領域は場合によっては２つのポリペプチドドメイン間に使用され得る 。そのようなリンカーは当該分野では公知である。このリンカーは、単一の融合 ポリペプチドが標的昆虫により消化されたら、リンカー領域において切断され活 性ＶＩＰ分子の２つのポリペプチド成分を遊離するようにプロテアーゼ切断部位 を含有するように設計されてもよい。 バチラス・セレウスＡＢ７８菌株からのＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ ａ）は融合されて、それらのコード領域を融合することによる単一ポリペプチド を製 造する。得られるＤＮＡは配列番号：２３で示されるコード化タンパク質を有す る配列番号：２２で示される配列からなる。同様にしてその他の融合タンパク質 が製造され得る。 ＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）をコードする遺伝子の融合は分子生 物学の標準的方法を用いて行われる。ＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ） コード領域の間で欠失されるヌクレオチドは公知の突然変異誘発を用いて欠失さ れるか、またはコード領域はＰＣＲ法を用いて融合される。 融合されたＶＩＰポリペプチドは別の宿主内での発現のために最適化された合 成遺伝子または部分的な合成遺伝子を用いてその他の生物中に発現され得る。例 えば、トウモロコシにおいて上記の融合ＶＩＰポリペプチドを発現するために、 各アミノ酸に対してトウモロコシに好ましいコドンを用いて合成遺伝子を作成す る。例えば参照により本明細書に編入されるＥＰ−Ａ０６１８９７６参照。これ らの方法に従って創生される合成ＤＮＡ配列は配列番号：１７（１００ｋｂＶＩ Ｐコード配列のトウモロコシに最適なもの）、配列番号：１８（８０ｋｂＶＩＰ コード配列のトウモロコシに最適なもの）および配列番号：２４（ＶＩＰ２Ａ（ ａ）コード配列のトウモロコシに最適なもの）に開示されている。 トウモロコシにおける発現に対して最適化された合成ＶＩＰ１およびＶＩＰ２ 遺伝子はＰＣＲ法を用いて融合 され得るか、または合成遺伝子は共通の制限部位で融合されるように設計され得 る。また、合成融合遺伝子はＶＩＰ１およびＶＩＰ２ドメインの両方からなる単 一ポリペプチドをコードするように設計され得る。 融合タンパク質のＶＩＰ１およびＶＩＰ２ドメイン間のペプチドリンカーの付 加はＰＣＲ突然変異誘発、リンカーペプチドをコードする合成ＤＮＡリンカーの 使用、または当該分野で公知のその他の方法により行われ得る。 融合されたＶＩＰポリペプチドは１またはそれ以上の結合性ドメインから構成 され得る。１より多い結合性ドメインが融合に使用されるならば、多数の標的有 害生物はそのような融合を用いて防除される。その他の結合性ドメインはその他 のＶＩＰの全てまたは一部；バチラス・スリンギエンシスエンドトキシン、また はその一部；または標的有害生物に結合し得るその他のタンパク質または該結合 性タンパク質から誘導される適当な結合性ドメインを用いることにより得られ得 る。 Ｎ末端にＶＩＰ２Ａ（ａ）およびＣ末端にＶＩＰ１Ａ（ａ）を有する単一ポリ ペプチド鎖融合をコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列を含む融合構築の１ つの例はｐＣＩＢ５５３１により提示される。ペプチド配列PSTPPTPSPSTPPTPS（ 配列番号：４７）を有するリンカーをコードするＤＮＡ配列は２つのコード領域 間に挿入されている。このリンカーおよび関連するクローニング部位をコードす る配列は5'-CCC GGG CCT TCT ACT CCC CCA A CT CCC TCT CCT AGC ACG CCT CCG ACA CCT AGC GAT ATC GGA TCC-3'（配列番号 ：４８）である。オリゴヌクレオチドは上流および下流の鎖を表現するように合 成され、そして標準法を用いるハイブリダイゼーションおよびホスホリル化に続 いてｐＵＣベクター内にクローン化される。ＶＩＰ２Ａ（ａ）における停止コド ンはＰＣＲを用いて除去され、そしてSmaI部位を有するBglII 制限部位により置 換された。翻訳融合はｐＣＩＢ５５２２からのＶＩＰ２Ａ（ａ）遺伝子のBamHI ／PstI断片（実施例２４参照）、ＶＩＰ２Ａ（ａ）遺伝子のPstI末端断片を含む ＰＣＲ断片（ｐＣＩＢ５５２２を構築するために使用されたものと同一）、５’ 末端にブラント部位で、そして３’末端にBamHI で連結される端部を有する合成 リンカー、および下記のｐＣＩＢ５５２６からの修飾合成ＶＩＰ１Ａ（ａ）遺伝 子（配列番号：３５）を連結することにより製造された。この融合は４方向連結 により得られ、翻訳停止コドンがなく、リンカーがあり、バチラス分泌シグナル のないＶＩＰ１Ａ（ａ）コード領域があるＶＩＰ２Ａ（ａ）遺伝子を含むプラス ミドを生じた。この構築のためのＤＮＡ配列は配列番号：４９に開示されており 、これは配列番号：５０に開示された融合タンパク質をコードする。ＶＩＰ１Ａ （ａ）がＮ末端にあり、そしてＶＩＰ２Ａ（ａ）がＣ末端にある単一ポリペプチ ド融合体が同様の方法で製造され得る。さらに、一方または両方の遺伝子は５’ または３’末端のいずれかにリ ンカーを含むか、または含まない翻訳融合体をその他の分子状毒素コード性遺伝 子またはリポーター遺伝子に連結され得る。 実施例２３：植物オルガネラへのＶＩＰ２の標的化 遺伝子産物を標的化するための種々の機構が植物に存在することが知られてお り、そしてこれらの機構の機能を制御する配列がいくらか詳細に特徴づけられて いる。例えば葉緑体への遺伝子産物の標的化は種々のタンパク質のアミノ末端に 見出されたシグナル配列により制御される。このシグナルは葉緑体移送の間に切 断され、成熟タンパク質が得られる(例えばComai 等，J．Biol．Chem．263:1510 4-15109(1988))。これらのシグナル配列は葉緑体中へのそれらの産物を移送させ るように異種遺伝子産物に融合され得る(van den Broeck等，Nature 31 3:358-3 63(1985))。適当なシグナル配列をコードするＤＮＡは葉緑体に局在しているこ とが公知であるＲＵＢＩＳＣＯタンパク質、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰシンタ ーゼ酵素、ＧＳ２タンパク質および多くのその他のタンパク質をコードするｃＤ ＮＡの５’末端から単離され得る。 その他の遺伝子産物はその他のオルガネラ、例えばミトコンドリアおよびペル オキシソームに局在している（例えばUnger 等，Plant Molec，Biol．13:411-41 8(1989)）。これらの遺伝子産物をコードするｃＤＮＡはまた、異種遺伝子産物 、例えばＶＩＰ２の上記オルガネラ への標的化を行うように操作されてもよい。そのような配列の例は核コード化Ａ ＴＰアーゼおよびミトコンドリアのための特異的なアスパラギン酸アミノトラン スフェラーゼアイソフォームである。同様に、細胞タンパク質体への標的化はRo gers等により記載されている(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:6512-6516(1985) )。 当該コード配列、例えばＶＩＰ２への上記の適当な標的化配列の融合により、 導入遺伝子産物をあらゆるオルガネラまたは細胞画分に導くことが可能である。 葉緑体標的化のために、例えばＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、ＣＡＢ遺伝子、ＥＰＳＰ シンターゼ遺伝子またはＧＳ２遺伝子からの葉緑体シグナル配列は導入遺伝子の アミノ末端ＡＴＧに正しい読み枠で（フレーム内に）融合される。選択されたシ グナル配列は公知切断部位を包含すべきであり、そして構築された融合体は切断 に要求される切断部位後のあらゆるアミノ酸を考慮にいれるべきである。いくつ の場合において、その要求は切断部位と開始コドンＡＴＧの間の少数のアミノ酸 の付加、またはコード配列内のいくつかのアミノ酸の置換により充填され得る。 葉緑体移送のために構築された融合体は試験管内転写構築物の試験管内翻訳、続 いて以下に記載の方法（Bartlett等，Edelmann等（編）Methods in Chloroplast Molecular Biology，Blsevier．pp 1081-1091(1982); Wasmann等，Mol．Gen．G enet．205:446-453(1986)）を用いる試験管内葉緑体取込みにより、葉緑体取込 みの効率が試 験され得る。これらの構築方法は当該分野で十分に公知であり、そしてミトコン ドリアおよびペルオキシソームに対して同様に適用可能である。 細胞標的化のための上記機構は同族プロモーターとの組合せだけでなく、異種 プロモーターとの組合せで、標的化シグナルが誘導されるプロモーターのものと は異なる発現パターンを有するプロモーターの転写制御下で特定の細胞を標的目 標に向かわせるために、利用され得る。 分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列が天然のＶＩＰ２遺伝子に存在する。こ のシグナルはＬＫＩＴＤＫＶＥＤＦのＮ末端配列（配列番号：２のアミノ酸残基 ５７ないし６６）を有する成熟タンパク質には存在しない。植物細胞の外への分 泌または亜細胞性オルガネラ、例えば小胞体、液胞、ミトコンドリアまたは葉緑 体を含むプラスチドに標的化が行われるようにＶＩＰ２を操作することが可能で ある。マーカー遺伝子への分泌シグナルペプチドの融合により製造されるハイブ リッドタンパク質は分泌経路中に成功裏に標的化されている（Itirriaga G.等， The Plant Cell，1:381-390(1989)，Denecke 等，The Plant Cell，2:51-59(199 0)）。ＥＲ、アポプラスト、アリューロン細胞からの細胞外分泌への標的化に関 連するアミノ末端配列が同定されている（Koehler & Ho,Plant Cell 2:769-783 （1990））。 追加シグナルの存在は小胞体または液胞に保持されるべきタンパク質のために 要求される。タンパク質のカル ボキシル末端にあるペプチド配列ＫＤＥＬ／ＨＤＥＬが小胞体中にその保持のた めに要求される(Pelham，Annual Review Cell Biol.，5:1-23(1989))。液胞にお けるタンパク質の保持のためのシグナルもまた特徴づけられている。液胞標的化 シグナルは標的化タンパク質のアミノ末端部分に存在しても（Holwerda等，The Plant Cell，4:307-318(1992)，Nakamura等，Plant Physiol.，101:1-5(1993)） 、標的化タンパク質のカルボキシル末端または内部配列に存在してもよい（Tagu e 等，The Plant Cell，4:307-318(1992)，Saalbach等，The Plant Cell，3:695 -708(1991)）。また、カルボキシ末端配列と組み合わせたアミノ末端は遺伝子産 物の液胞標的化に関連する（Shinshi 等，Plant Molec．Biol．14:357-368(1990 )）。同様に、タンパク質は特定のカルボキシ末端シグナルペプチド融合（Heijn e 等，Eur．J．Biochem.，180:535-545(1989)，ArcherおよびKeegstra，Plant M olec．Biol．23:1105-1115(1993)）を用いてミトコンドリアまたはプラスチドに 標的化され得る。 分泌または種々の亜細胞オルガネラへ向けてのいずれかをＶＩＰ２を標的化す るために、公知シグナルペプチドをコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列が 要求されるような遺伝子の５’または３’末端に向けられてもよい。細胞からＶ ＩＰ２を分泌するために、ＰＣＴ出願第ＩＢ９５／００４９７からの真核生物分 泌シグナルペプチドＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＡＡＧＶＨＣＬ（配 列番号：２５）をコードするＤＮＡ配列または文献（Itirriaga G.等，The Plan t Cell，1:381-390(1989)，Denecke 等，The Plant Cell，2;51-59(1990)）に記 載されたその他のものは完全ＶＩＰ２遺伝子配列または成熟タンパク質をコード する先端切除配列もしくはヌクレオチド２８６まで切除された遺伝子もしくはア ミノ酸残基９４（メチオニン）で始まるタンパク質をコードする遺伝子のいずれ かの５’末端に付加されてもよい。小胞体に保持されるようにＶＩＰ２を標的化 するために、ＥＲシグナルペプチドＫＤＥＬ／ＨＤＥＬが分泌シグナルの他に遺 伝子の３’末端に付加され得る。液胞標的化のために、シグナルペプチドＳＳＳ ＳＦＡＤＳＮＰＩＲＶＴＤＲＡＡＳＴ（配列番号：３；Holwerda 等，The Plant Cell，4:307-318(1992)）をコードするＤＮＡ配列は分泌シグナルまたはDombro wski等，The Plant Cell，5:587-597(1993)により記載されるようなカルボキシ ルシグナルペプチドをコードする配列に隣接するように設計され得るか、または 機能的変形体は遺伝子の３’末端に挿入され得る。同様に、ＶＩＰ２は、要求さ れる標的化シグナルをコードする上記のＶＩＰ２配列において配列を挿入するこ とにより、ミトコンドリアまたは葉緑体を包含するプラスチドのいずれかに標的 化されるように設計され得る。ＶＩＰ２に存在するバクテリア分泌シグナルは保 持され得るか、または最終的な構築物から除去され得る。 ＶＩＰのためのコード配列に融合された真核生物分泌シグナルを包含する構築 の一例はｐＣＩＢ５２２８により与えられている。配列番号：２５の分泌シグナ ルペプチドをコードする配列の上流および下流の鎖の両方に相当するオリゴヌク レオチドが合成され、そして配列5'-GGATCCACC ATG GGC TGG AGC TGG ATC TTC C TG TTC CTG CTG AGC GGC GCC GCG GGC GTG CAC TGC CTGCAG-3'（配列番号：４ １）を有する。ハイブリッド形成した場合、分泌シグナルの５’末端は制限部位 BamHI およびPstIに相当する「粘着端」に類似していた。オリゴヌクレオチドは ハイブリッド形成され、そしてホスホリル化され、そして標準法を用いてBamHI ／PstIで消化されたｐＣＩＢ５５２７（実施例２３Ａに記載された構築物）中に 連結された。得られるトウモロコシ最適化コード配列は配列番号：４２に開示さ れており、これは配列番号：４３に開示されたタンパク質をコードする。このコ ードされたタンパク質はバチラス分泌シグナルの適所に真核生物分泌シグナルを 含む。 ＶＩＰのコード配列に融合された液胞標的化シグナルを含む構築の一例はｐＣ ＩＢ５５３３により与えられる。配列番号：３の液胞標的化ペプチドをコードす る配列の上流および下流の鎖の両方に相当するオリゴヌクレオチドが合成され、 そして配列5'-CCG CGG GCG TGC ACT GCC TCA GCA GCA GCA GCT TCG CCG ACA GCA ACC CCA TCC GCG TGA CCG ACC GCG CCG CCA GCA CCC TGC AG-3'（配 列番号：４４）を有する。ハイブリッド形成した場合、液胞標的化シグナルの５ ’末端は制限部位SacIおよびPstIに相当する「粘着端」に類似していた。オリゴ ヌクレオチドはハイブリッド形成され、そしてホスホリル化され、そして標準法 を用いてSacI／PstIで消化されたｐＣＩＢ５５２８（上記の構築物）中に連結さ れた。得られるトウモロコシ最適化コード配列は配列番号：４５に開示されてお り、これは配列番号：４６に開示されたタンパク質をコードする。このコードさ れたタンパク質は真核生物分泌シグナルの他に液胞標的化シグナルを含む。 ＶＩＰ１遺伝子はまた、類似の方法により分泌されるように、または亜細胞オ ルガネラに標的化されるように設計され得る。 実施例２３Ａ：ＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）からバチラス分泌シグ ナルの除去 ＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）はＡＢ７８菌株の増殖の間に分泌さ れる。分泌シグナルとして作用するペプチド配列の性質は文献（Simonen および Palva，Microbiological reviews，pg．109-137(1993)）に記載されている。こ の文献の情報に従って、推定分泌シグナルは両方の遺伝子において同定された 。ＶＩＰ１Ａ（ａ）において、このシグナルはアミノ酸１−３３からなる（配列 番号：５参照）。分泌シグナルのプロセシングはおそらくアミノ酸３３のセリン の後ろで生じる。ＶＩＰ２Ａ（ａ）における分泌シグナルはアミノ酸１−４ ９に同定された（配列番号：２参照）。分泌された成熟ＶＩＰ２Ａ（ａ）タンパ ク質のＮ末端ペプチド分析はＮ末端配列ＬＫＩＴＤＫＶＥＤＦＫＥＤＫを示した 。この配列は配列番号：２のアミノ酸５７から始まることが見出される。これら のタンパク質をコードする遺伝子はバチラス分泌シグナルの除去により変性され た。 最初の３３個のアミノ酸をコードする配列、すなわち分泌シグナルが５’末端 から除去されたトウモロコシ最適化ＶＩＰ１Ａ（ａ）コード領域が構築された。 この変性は、ヌクレオチド１００位にトウモロコシ最適化遺伝子（配列番号：２ ６）とハイブリッド形成する配列5'-GGA TCC ACC ATG AAG ACC AAC CAG ATC AGC -3'（配列番号：３３）を含む前進プライマーを用いてＰＣＲにより得られ、そ してBamHI 制限部位および開始コドンを含む真核生物翻訳開始部位コンセンサス を添加した。配列5'-AAG CTT CAG CTC CTT G-3'（配列番号：３４）を含む逆プ ライマー（リバースプライマー）はヌクレオチド５０７位で相補的鎖にハイブリ ッド形成する。５’末端に制限部位BamHI および３’末端にHindIII を含有する ５２７ｂｐ増幅産物が得られた。該増幅産物はＴ−ベクター（下の実施例２４に 記載）中にクローン化され、そして正しいＤＮＡ配列を確認するために配列決定 された。BamHI／HindIII 断片は次に制限消化により得られ、そして根指向プロ モーターカセット内にトウモロコシ最適化ＶＩＰ１Ａ（ａ）遺伝子のBamHI／Hin dIII 断片を置 換するために使用された。得られる構築物はｐＣＩＢ５５２６と表記された。バ チラス分泌シグナルが除去されたＶＩＰ１Ａ（ａ）のトウモロコシ最適化コード 領域は配列番号：３５として開示され、そしてコードされたタンパク質は配列番 号：３６として開示される。 ＶＩＰ２Ａ（ａ）のプロセシング体をコードする遺伝子、すなわち分泌シグナ ルが除去されたコード領域は上記のＶＩＰ１Ａ（ａ）のプロセシング体を構築す るための上記のものと類似の方法により構築された。前進プライマー5'-GGA TCC ACC ATG CTG CAG AAC CTG AAG ATC AC-3'（配列番号：３７）を用いてＰＣＲに より得られた。このプライマーはトウモロコシ最適化ＶＩＰ２Ａ（ａ）遺伝子（ 配列番号：２７）のヌクレオチド１５０位でハイブリッド形成する。PstI制限部 位を得るためにこのプライマーのヌクレオチド１５位にサイレント突然変異が挿 入された。逆プライマーは配列5'-AAG CTT CCA CTC CTT CTC-3'（配列番号：３ ８）を有する。２５９ｂｐ産物は３’末端にHindIII 制限部位を有して得られた 。増幅産物はＴ−ベクター中にクローン化され、配列決定され、そしてトウモロ コシ最適化ＶＩＰ２Ａ（ａ）を含むBamHI／HindIII 消化根指向プロモーターカ セット内に連結された。得られた構築物はｐＣＩＢ５５２７と表記された。バチ ラス分泌シグナルが除去されたＶＩＰ２Ａ（ａ）のトウモロコシ最適化コード領 域は配列番号：３９として開示され、そしてコードされたタンパク質は配列番号 ：４０として開示される。 実施例２４：ＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）トウモロコシ最適化遺伝 子の構築およびクローニング設計 ：トウモロコシ最適化遺伝子は、トウモロコシにおいて最も頻繁に使用され るコドンを用いて天然のＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）タンパク質配 列の逆翻訳により設計された（Murray等，Nucleic Acid Research，17:477-498( 1989)）。クローニングを容易にするために、ＤＮＡ配列はさらに変性されて、 ２００−３６０ヌクレオチド間隔で独特な制限部位を挿入した。ＶＩＰ１Ａ（ａ ）は１１のそのような断片においてクローン化されるべく設計され、そしてＶＩ Ｐ２Ａ（ａ）は５断片においてクローン化された。個々の断片のクローニングの 後に、隣接断片は両方の断片に共通の制限部位を用いて結合されて完全遺伝子を 得た。各断片をクローン化するために、オリゴヌクレオチド（５０−８５ヌクレ オチド）はＤＮＡの上流および下流の鎖を表現すべく設計された。第１のオリゴ 対の上流オリゴは、当該断片内の種々のオリゴの配向および配列を導く次のオリ ゴ対のより下流の鎖の類似の一本鎖に相同である３’末端に１５ｂｐ一本鎖領域 を有するように設計された。オリゴはまた、断片を表現するオリゴ全てがハイブ リッド形成される場合に末端が形成されるべき特定の制限部位に相当する一本鎖 領域を有するように設計される。各オリゴマーの構造はＮＢＩ社からのＯＬＩＧ Ｏプログラムを用いて適当な二次構造、例えばヘアピンループが調べられた。 必要であればいつでも、ヌクレオチドは変更されて、タンパク質のアミノ酸配列 を変更することなしに二次構造の安定性を低下させた。植物リボソーム結合部位 コンセンサス配列ＴＡＡＡＣＡＡＴＧ（Joshi 等，Nucleic Acid Res.，15:6643 -6653(1987)）または真核生物リボソーム結合部位コンセンサス配列ＣＣＡＣＣＡＴＧ （Kozak 等，Nucleic Acid Res.，12:857-872(1984)）は遺伝子の翻訳開 始コドンに挿入された。クローニング ：オリゴがＩＤＴ社により合成され、そして凍結乾燥粉末として供 給された。それらを２００μＭの濃度で再懸濁した。各オリゴに３０μｌにホル ムアミドを２５−５０％の最終濃度で添加し、そしてノベックスから入手した既 に調製された１０％ポリアクリルアミド／尿素ゲル上での分離に先立って試料を ２分間煮沸した。電気泳動の後、ケイ光指示剤を含むＴＬＣプレート上にゲルを 乗せ、そしてＵＶ線に暴露することによるＵＶシャドウイングによりオリゴを検 出した。正確な大きさのＤＮＡを含有する領域を切除し、そして０．４ＭＬｉＣ ｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液中での細く切ったゲル断片の一昼夜 保存によりポリアクリルアミドゲルから抽出した。ミリポアＵＦＭＣフィルター を通す遠心分離によりゲル残渣からＤＮＡを分離した。抽出したＤＮＡを無水ア ルコール２容量の添加によりエタノール沈澱させた。遠心分離の後、沈澱をｄＨ₂ Ｏ中に２．５μＭの濃度で再懸濁した。オリゴのハイブリダ イゼーションおよび適当なベクターとの連結によるか、または鋳型としての特定 断片のための全てのオリゴおよび末端特異的ＰＣＲプライマーの等モル混合物を 用いるハイブリダイゼーション断片の増幅により断片がクローン化された。ハイブリダイゼーションおよび連結によるクローニング ： 同種の二本鎖オリゴ対が各オリゴの上流および下流オリゴ５μｌを１×ポリヌ クレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）緩衝液（７０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）） 、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭ Ｋ Ｃｌおよび５％ホルムアミドを含有する最終容量５０μｌの緩衝液と混合するこ とにより得られた。オリゴは１０分間煮沸され、そして３７℃または室温まで徐 々に冷却した。１０μｌをＴＡＥ緩衝液系〔メタフォア（登録商標）；ＦＭＣ〕 中の４％アガロース上での分析のために除去した。各ハイブリダイゼーションオ リゴ対がＡＴＰを最終濃度１ｍＭ、ＢＳＡを最終濃度１００μｇ／ｍｌおよびポ リヌクレオチドキナーゼ２００単位および１０μｌの容量中に１０×１ＰＮＫ緩 衝液１μｌの添加によりリン酸化された。ハイブリダイゼーションおよびホスホ リル化に続いて、反応物は３７℃で２時間ないし一晩保温された。特定の断片に 対するオリゴ対の各々１０μｌが５０μｌの最終容量中に混合された。オリゴ対 は８０℃で１０分間の加熱および３７ ℃までの徐冷却によりハイブリダイゼーションさせた。オリゴ２μｌが適当なベ クター約１００ｎｇと混合され、そして５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰを含有する緩衝液を 用いて連結された。反応物は室温で２時間ないし一晩保温され、そして標準法を 用いて１００μｇ／ｍｌの濃度でアンピシリンを含有するＬ−プレート上にプレ ーティングされた大腸菌のＤＨ５α菌株内に形質転換された。陽性クローンがさ らに特徴づけられ、そしてプライマーとして汎用プライマー「リバース」および Ｍ１３「−２０」を用いてＥＰ−Ａ０６１８９７６に詳記されたＰＣＲミニスク リーンにより確認された。陽性クローンは適当な酵素でのＤＮＡの消化、それに 続く配列決定により同定された。予期されたＤＮＡ配列を有する組換え体がさら なる操作のために次に選択された。ＰＣＲ増幅およびＴ−ベクター内でのクローニング ： 鋳型として特定の断片の上流および下流鎖を表現する全てのオリゴマー（最終 濃度各々５ｍＭ）、該特定の断片のための特異的末端プライマー（最終濃度２μ Ｍ）、各ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを２００μＭ、１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０ ．０１％ゼラチンおよびＴａｑポリメラーゼ５単位を含有する混合物を最終容量 ５０μｌで用いることによりＰＣＲ増幅が行われた。増幅反応はパーキン・エル マー・サーモサイク ラー９６００において９５℃で１分間（１サイクル）、次に９５℃で４５秒間、 ５０℃で４５秒間、７２℃で３０秒間を２０サイクル行われた。最後に、反応物 は生成物の分析前に７２℃で５分間保温された。反応物１０μｌがＴＡＥ緩衝液 系中の２．５％ヌシーブ（ＦＭＣ）アガロースゲル上で分析された。正しい大き さの断片がゲル精製され、そしてＰＣＲクローニングベクターまたはＴ−ベクタ ー内へのクローニングのために使用された。Ｔ−ベクター構築はMarchuk 等，Nu cleic Acid Research，19:1154（1991）に記載されるように行われた。ｐブルー スクリプトＳＫ（＋）〔ストラタジーン（登録商標），カリフォルニア〕が親ベ クターとして使用された。正しいクローンの形質転換および同定が上記のように 行われた。 ＶＩＰ１Ａ（ａ）の断片１、３、４、５、６、８および９、およびＶＩＰ２Ａ （ａ）の断片２および４はＰＣＲ増幅産物のクローニングにより得られた。一方 、ＶＩＰ１Ａ（ａ）の断片２、７、１０および１１、およびＶＩＰ２Ａ（ａ）の 断片１、３および５はハイブリダイゼーション／連結により得られた。 所望の配列を有する断片が一旦得られたら、完全遺伝子は隣接断片とのクロー ニングにより集められた。完全遺伝子は、それを根指向プロモーター（参照によ り本明細書に編入される米国特許出願第０８／０１７２０９号）およびイネアク チンプロモーターを含む植物発現ベ クター中に移す前に、再び配列決定され、そしてＷＣＲＷに対する活性が試験さ れた。 そのような植物発現ベクターの１種がｐＣＩＢ５５２１である。トウモロコシ 最適化ＶＩＰ１Ａ（ａ）コード領域（配列番号：２６）は３’末端に３５Ｓター ミネーターが続くＰＥＰカルボキシラーゼイントロン＃９を有する遺伝子の５’ に根指向プロモーターを含む植物発現ベクター中にクローン化された。プラスミ ドはまた、プラスミドｐＵＣ１９からのアンピシリン耐性に対する配列を含む。 別の植物発現ベクターはｐＣＩＢ５５２２であり、３’末端に３５Ｓターミネー ターが続くＰＥＰカルボキシラーゼイントロン＃９を有する遺伝子の５’に根指 向プロモーターに融合されたトウモロコシ最適化ＶＩＰ２Ａ（ａ）コード領域（ 配列番号：２７）を含有する。 実施例２５：ＮＡＤ親和性クロマトグラフィー 精製戦略は基質ＮＡＤに対するＶＩＰ２の親和性に基づいたものが用いられた 。実施例４に記載されたｐＨ３．５クエン酸ナトリウム緩衝液処理からの上澄み が２０ｍＭトリスｐＨ７．５中で一晩の透析された。中和した上澄みが等容量の 洗浄ＮＡＤアガロースに添加され、そして４℃で一晩ゆるく震盪しながら保温し た。樹脂およびタンパク質溶液が１０ｍｌの使い捨てポリプロピレンカラムに添 加され、そしてタンパク質溶液が流された。カラムを５倍のカラム容量の２０ｍ ＭトリスｐＨ７．５で、 次いで２−５倍のカラム容量の２０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣ ｌで、そして２−５倍のカラム容量の２０ｍＭトリスｐＨ７．５で洗浄した。Ｖ ＩＰタンパク質は５ｍＭ ＮＡＤを補足した２０ｍＭトリスｐＨ７．５中に溶離 された。約３倍のカラム容量の溶離液が集められ、そしてセントリコン−１０中 で濃縮した。収量は典型的には約７−１５μｇである（樹脂ｍｌあたりのタンパ ク質量）。 精製されたタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて銀染色により分析される場 合、２つのポリペプチドが目で確認でき、一方がＭｒ約８００００であり、他方 がＭｒ約４５０００である。Ｎ末端配列分析は、Ｍｒ８００００のタンパク質が ＶＩＰ１Ａ（ａ）のタンパク質分解によるプロセシングを受けた形態に相当し、 そしてＭｒ４５０００の方がＶＩＰ２Ａ（ａ）のタンパク質分解によるプロセシ ングを受けた形態に相当することを示した。ＶＩＰ１Ａ（ａ）のＶＩＰ２Ａ（ａ ）との共精製は、２つのタンパク質がおそらく複合体（コンプレックス）を形成 し、そしてタンパク質−タンパク質相互作用領域を有することを示す。このよう にして精製されたＶＩＰ１Ａ（ａ）のＶＩＰ２Ａ（ａ）タンパク質は西方ハムシ モドキに対して生物学的活性であった。 実施例２６：トウモロコシ最適化ＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）の発 現 ＶＩＰ遺伝子からなる異なるプラスミドを含む大腸菌 菌株はＶＩＰの発現に対してアッセイされた。個々のプラスミドを含有する大腸 菌菌株をＬブロス中で一晩増殖させ、そして上の実施例３に記載したように発現 したタンパク質を培養液から抽出した。タンパク質発現が上の実施例１２に記載 したものと同様の当該分野で公知の標準法により生成した抗体を用いてウエスタ ンブロット分析によりアッセイされた。発現されたタンパク質の殺虫活性が上の 実施例３における方法に従って西方ハムシモドキに対して試験された。大腸菌発 現アッセイの結果を下に記載する。 大腸菌におけるＶＩＰの発現 これらのプラスミドからのＤＮＡがトウモロコシ最適化プロトプラスト発現系 においてＶＩＰを一時的に発現するために使用された。プロトプラストは適当な 緩衝液中のセルラーゼＲＳおよびマセラーゼＲ１０を使用する細胞壁の消化によ りトウモロコシ２７１７系６懸濁培養物から単離された。プロトプラストは篩分 けおよび遠心分離により回収された。プロトプラストは約７５ｇのプラスミドＤ ＮＡおよびＰＥＧ−４０を用いる標準直接遺伝子導入法により形質転換された。 処理されたプロトプラストは暗所中室温で一晩保温された。ＶＩＰ発現の分析は 大腸菌における発現に対して上記したようにウエスタンブロット分析および西方 ハムシモドキに対する殺虫活性によりプロトプラスト外植片に関して行われた。 トウモロコシプロトプラスト発現アッセイの結果は下に示される。 植物プロトプラストにおけるＶＩＰの発現 大腸菌およびトウモロコシプロトプラストで得られた発現データは、トウモロ コシ最適化ＶＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）遺伝子がそれぞれ天然のＶ ＩＰ１Ａ（ａ）およびＶＩＰ２Ａ（ａ）遺伝子と同じタンパク質を作ること、お よびトウモロコシ最適化遺伝子によりコードされるタンパク質が天然遺伝子によ りコードされるタンパク質と機能的に同等であることを示す。 本明細書に記載した全ての刊行物および特許文献は本発明が属する分野の通常 の知識を有する者のレベルを示すものである。全ての刊行物および特許文献は参 照により本明細書に編入されるが、それは各々個々の刊行物お よび特許文献が参照により本明細書に編入されるべきことが特に、そして個々に 示されているのと同じ範囲までである。 以下の寄託が米国イリノイ州６１４０４，ペオリア，ノースユニバーシティス トリート１８１５，ノーザーン・リージョナル・リサーチ・センター，アグリカ ルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲ ＲＬ）になされている： 理解を明確にするために、これまで本発明を説明および実施例によりある程度 詳細に記載してきたけれども、ある種の変形および変更が添付の請求の範囲の範 囲で実施され得ることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/12 Ｃ１２Ｎ 1/12 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 7/00 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07 1:19 1:085 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ムリンズ，マルタ アリス アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27511 キャリー スターリングダイル ドライブ 101 (72)発明者 ナイ，ゴードン ジェームス アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27606 レライ ディーアビュー ドライ ブ 6329 (72)発明者 カール，ブライアン アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27511 キャリー リーワード コート 113 (72)発明者 デサイ，ナリニ モノー アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27511 キャリー シルバーウッド レー ン 107 (72)発明者 コスチクカ，クリスチィ アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27713 ダーラム ワインベリー ドライ ブ 5017 (72)発明者 ダック，ニコラス ブレンダン アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27511 キャリー ゲートハウス ドライ ブ 1215 (72)発明者 エストルック，フアン ホセ アメリカ合衆国 ノースカロライナ 27713 ダーラム バインブリッジ ドラ イブ 2911−イー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．栄養増殖期の間に有害生物防除性タンパク質を産生する、バチラス・スファ エリカスＳＳＩＩ−１ではない実質的に精製されたバチラス菌株。 ２．受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０５８を有するバチラス・セレウスである栄養 増殖期の間に有害生物防除性タンパク質を産生するバチラス菌株。 ３．受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０６０を有するバチラス・スリンギエンシスで ある栄養増殖期の間に有害生物防除性タンパク質を産生するバチラス菌株。 ４．受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２４、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２５、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２６、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２７、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２８、Ｎ ＲＲＬ Ｂ−２１２２９、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２３０およびＮＲＲＬ Ｂ−２１ ４３９から選択されるバチラスである栄養増殖期の間に有害生物防除性タンパク 質を産生するバチラス菌株。 ５．バチラス・スファエリカスＳＳＩＩ−１からの殺蚊性毒素ではない、バチラ ス種の栄養生殖期の間に単離され得る昆虫特異的タンパク質およびその部分。 ６．前記バチラス種がバチラス・スリンギエンシスおよびバチラス・セレウスか ら選択される請求項５記載の昆虫特異的タンパク質。 ７．前記タンパク質が甲虫目または鱗翅目に対して毒性である請求項５記載の昆 虫特異的タンパク質。 ８．殺虫活性のスペクトルがアグロチスおよび／またはスポドプテラ種、好まし くはタマナヤガ〔アグロチス・イプシロン；ＢＣＷ〕および／またはシロナヤガ 〔スポドプテラ・フルギペルダ〕および／またはシロイチモンジヨトウガ〔スポ ドプテラ・エキシグア〕および／またはオオタバコガ(tobacco budworm)および ／またはオオタバコガ(corn earworm)〔ヘリコベルパ・ゼア〕活性に対する活性 を包含する請求項５記載の昆虫特異的タンパク質。 ９．前記バチラスが受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０５８を有するバチラス・セレ ウスである請求項５記載の昆虫特異的タンパク質。 １０．前記バチラスが受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１０６０を有するバチラス・ス リンギエンシスである請求項５記載の昆虫特異的タンパク質。 １１．前記バチラスが受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２４、ＮＲＲＬ Ｂ−２１ ２２５、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２６、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２７、ＮＲＲＬ Ｂ −２１２２８、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２２９、ＮＲＲＬ Ｂ−２１２３０およびＮ ＲＲＬ Ｂ−２１４３９から選択されるバチラスである請求項５記載の昆虫特異 的タンパク質。 １２．前記タンパク質が約３０ｋＤａまたはそれ以上の分子量を有する請求項５ 記載の昆虫特異的タンパク質。 １３．前記タンパク質が約６０ないし約１００ｋＤａの分子量を有する請求項１ ２記載の昆虫特異的タンパク質。 １４．前記タンパク質が約８０ｋＤａの分子量を有する請求項１３記載の昆虫特 異的タンパク質。 １５．前記タンパク質が配列番号：２、配列番号：５、配列番号：７、およびそ れらの相同体からなる群から選択される配列を含む請求項５記載の昆虫特異的タ ンパク質。 １６．前記タンパク質が配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２９、配 列番号：３２および配列番号：２、およびそれらの相同体からなる群から選択さ れる配列を有する請求項５記載の昆虫特異的タンパク質。 １７．前記タンパク質が配列番号：２９および配列番号：３２、およびそれらの 相同体からなる群から選択される配列を有する請求項８記載の昆虫特異的タンパ ク質。 １８．分泌シグナルを提示する配列が除去または不活性化されている請求項５な いし１５のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質。 １９．昆虫特異的タンパク質の昆虫特異的活性を高める補助的タンパク質。 ２０．約５０ｋＤａの分子量を有する請求項１９記載の補助的タンパク質。 ２１．バチラス・セレウス由来のものである請求項１９記載の補助的タンパク質 。 ２２．前記補助的タンパク質ならびに前記昆虫特異的タンパク質の両方がＡＢ７ ８菌株由来のものである請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載の補助的タ ンパク 質。 ２３．分泌シグナルを提示する配列が除去または不活性化されている請求項１９ ないし２２のいずれか１項に記載の補助的タンパク質。 ２４．１より多いポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖の少なくとも１つは 請求項５ないし１８のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質を提示し、そ して前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つは該昆虫特異的タンパク質の有害生物 防除活性を活性化するか、または高める請求項１９ないし２３のいずれか１項に 記載の補助的タンパク質を提示する多重結合有害生物防除性タンパク質。 ２５．約５０ｋＤａないし約２００ｋＤａの分子量を有する請求項２４記載の多 重結合有害生物防除性タンパク質。 ２６．請求項５ないし１８のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質と、該 昆虫特異的タンパク質の有害生物防除活性を活性化するか、または高める請求項 １９ないし２３のいずれか１項に記載の補助的タンパク質とを含む請求項２５記 載の多重結合有害生物防除性タンパク質。 ２７．リボソームにより翻訳された場合に、請求項５ないし１８のいずれか１項 に記載の昆虫特異的タンパク質および／または請求項１９ないし２３のいずれか １項に記載の補助的タンパク質、そして場合によって融合に使 用されたその他の部分の併合された属性を少なくとも有する融合タンパク質を製 造するフレーム内遺伝子融合により製造される、請求項５ないし１８のいずれか １項に記載の昆虫特異的タンパク質および／または請求項１９ないし２３のいず れか１項に記載の補助的タンパク質を少なくとも包含するいくつかのタンパク質 ドメインからなる融合タンパク質。 ２８．リボヌクレアーゼＳタンパク質、請求項５ないし１８のいずれか１項に記 載の昆虫特異的タンパク質および請求項１９ないし２３のいずれか１項に記載の 補助的タンパク質からなる請求項２７記載の融合タンパク質。 ２９．前記融合タンパク質のＮ末端に昆虫特異的タンパク質または補助的タンパ ク質のいずれかを有する請求項５記載の昆虫特異的タンパク質および請求項１９ 記載の補助的タンパク質からなる請求項２７記載の融合タンパク質。 ３０．配列番号：２３で示されるタンパク質またはそれらの相同体を生じる、配 列番号：５で示される昆虫特異的タンパク質と、配列番号：２で示される補助的 タンパク質とからなる請求項２９記載の融合タンパク質。 ３１．配列番号：５０で示されるタンパク質またはそれらの相同体を生じる、配 列番号：３５で示される昆虫特異的タンパク質と、配列番号：２７で示される補 助的タンパク質とからなる請求項２９記載の融合タンパク質。 ３２．受容タンパク質とは異種起源であるシグナル配列 に融合された請求項５ないし１８のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質 および／または請求項１９ないし２３のいずれか１項に記載の補助的タンパク質 からなる請求項２８記載の融合タンパク質。 ３３．前記シグナル配列が分泌シグナルである請求項３２記載の融合タンパク質 。 ３４．前記シグナル配列が特定のオルガネラまたは細胞画分に導入遺伝子産生物 を導く標的化配列である請求項３２記載の融合タンパク質。 ３５．前記タンパク質が配列番号：４３で示される配列またはその相同体を有す る請求項３３記載の融合タンパク質。 ３６．前記タンパク質が配列番号：４６で示される配列またはその相同体を有す る請求項３４記載の融合タンパク質。 ３７．請求項５ないし７、９、１０、１２ないし１５および１９ないし２２のい ずれか１項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分 子。 ３８．請求項８、１１、１６ないし１８および２３ないし３６のいずれか１項に 記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子。 ３９．バチラス・スファエリカスＳＳＩＩ−１からの殺蚊性毒素ではない、バチ ラス種の栄養増殖期の間に単離され得る昆虫特異的タンパク質およびその部分を コードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子。 ４０．配列番号：４または配列番号：６で示されるヌクレオチド配列またはその 相同体からなる請求項３９記載のＤＮＡ分子。 ４１．配列番号：１９、配列番号：２８、配列番号：３１または配列番号：１で 示されるヌクレオチド配列またはその相同体からなる請求項３９記載のＤＮＡ分 子。 ４２．昆虫特異的タンパク質の昆虫特異的活性を高める補助的タンパク質をコー ドするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子。 ４３．配列番号：１９で示されるヌクレオチド配列またはその相同体からなる請 求項４２記載のＤＮＡ分子。 ４４．微生物における発現に対して最適化されたヌクレオチド配列からなる請求 項３７、３９、４０または４２のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。 ４５．植物における発現に対して最適化されたヌクレオチド配列からなる請求項 ３７、３９、４０または４２のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。 ４６．微生物における発現に対して全体的または部分的に最適化されたヌクレオ チド配列からなる請求項３８、４１または４３のいずれか１項に記載のＤＮＡ分 子。 ４７．植物における発現に対して最適化されたヌクレオチド配列からなる請求項 ３８、４１または４３のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。 ４８．配列番号：１７または配列番号：１８で示されるヌクレオチド配列または その相同体からなる請求項４５ 記載のＤＮＡ分子。 ４９．配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２７または配列番号：３０ で示されるヌクレオチド配列またはその相同体からなる請求項４７記載のＤＮＡ 分子。 ５０．１より多いポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖の少なくとも１つは 請求項５ないし１８のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質を提示し、そ して前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つは該昆虫特異的タンパク質の有害生物 防除活性を活性化するか、または高める請求項１９ないし２３のいずれか１項に 記載の補助的タンパク質を提示する多重結合有害生物防除性タンパク質をコード するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子。 ５１．請求項５ないし１８のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質および 該昆虫特異的タンパク質の有害生物防除活性を活性化するか、または高める請求 項１９ないし２３のいずれか１項に記載の補助的タンパク質をコードするヌクレ オチド配列からなる請求項５０記載のＤＮＡ分子。 ５２．配列番号：１または配列番号：１９で示されるヌクレオチド配列またはそ の相同体からなる請求項５１記載のＤＮＡ分子。 ５３．リボソームにより翻訳された場合に、請求項５ないし１８のいずれか１項 に記載の昆虫特異的タンパク質および／または請求項１９ないし２３のいずれか １項に記載の補助的タンパク質、そして場合によって融合に使 用されたその他の部分の併合された属性を少なくとも有する融合タンパク質を製 造するフレーム内遺伝子融合により製造される、請求項５ないし１８のいずれか １項に記載の昆虫特異的タンパク質および／または請求項１９ないし２３のいず れか１項に記載の補助的タンパク質を少なくとも包含するいくつかのタンパク質 ドメインからなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子。 ５４．前記融合タンパク質のＮ末端に昆虫特異的タンパク質または補助的タンパ ク質のいずれかを有する請求項５記載の昆虫特異的タンパク質および請求項１９ 記載の補助的タンパク質からなる融合タンパク質をコードする請求項５３記載の ＤＮＡ分子。 ５５．配列番号：２２で示されるヌクレオチド配列またはその相同体からなる請 求項５３記載のＤＮＡ分子。 ５６．受容ＤＮＡとは異種起源であるシグナル配列に融合された請求項５ないし １８のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質および／または請求項１９な いし２３のいずれか１項に記載の補助的タンパク質からなる融合タンパク質をコ ードする請求項５３記載のＤＮＡ分子。 ５７．前記シグナル配列が分泌シグナルである請求項５６記載のＤＮＡ分子。 ５８．前記シグナル配列が特定のオルガネラまたは細胞画分に導入遺伝子産生物 を導く標的化配列である請求項５６記載のＤＮＡ分子。 ５９．その成分配列の少なくとも１つが微生物における 発現に対して最適化されたヌクレオチド配列からなる請求項５３ないし５８のい ずれか１項に記載のＤＮＡ分子。 ６０．その成分配列の少なくとも１つが植物における発現に対して最適化された ヌクレオチド配列からなる請求項５３ないし５８のいずれか１項に記載のＤＮＡ 分子。 ６１．配列番号：４２、配列番号：４５または配列番号：４９で示されるヌクレ オチド配列またはその相同体からなる請求項６０記載のＤＮＡ分子。 ６２．分泌シグナルをコードする配列がその５’末端から除去されている請求項 ４５記載のＤＮＡ分子。 ６３．配列番号：３５または配列番号：３９で示されるヌクレオチド配列または その相同体からなる請求項６２記載のＤＮＡ分子。 ６４．温和な厳密性の条件下で請求項３７ないし６３のいずれか１項に記載のＤ ＮＡ分子とハイブリッド形成し、そして昆虫特異的活性を有するＤＮＡ分子。 ６５．ハイブリッド形成が７％ＳＤＳおよび０．５Ｍリン酸ナトリウムを含有す る緩衝液中６５℃で起こる請求項６４記載のＤＮＡ分子。 ６６．請求項６４または６５記載のＤＮＡ分子によりコードされる昆虫特異的タ ンパク質。 ６７．宿主生物内での結合されたＤＮＡ構築物の発現に必要な転写および翻訳制 御シグナルおよび所望によりその他の制御配列を包含する植物発現配列に操作可 能に連結された請求項３７、３９、４０、４２、４４、４５ま たは４８のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子を含有する発現カセット。 ６８．宿主生物内での結合されたＤＮＡ構築物の発現に必要な転写および翻訳制 御シグナルおよび所望によりその他の制御配列を包含する植物発現配列に操作可 能に連結された請求項３８、４１、４３、４６、４７または４９ないし６５のい ずれか１項に記載のＤＮＡ分子を含有する発現カセット。 ６９．前記宿主生物が植物である請求項６７記載の発現カセット。 ７０．前記宿主生物が植物である請求項６８記載の発現カセット。 ７１．請求項６７または６９記載の発現カセットを含有するベクター分子。 ７２．請求項６８または７０記載の発現カセットを含有するベクター分子。 ７３．植物ゲノムの一部である、請求項６９または７０記載の発現カセットまた は請求項７１または７３記載のベクター分子。 ７４．請求項３７、３９、４０、４２、４４、４５または４８のいずれか１項に 記載のＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含有する発現カセットまたは該発現カセット を含有するベクター分子を好ましくは宿主生物のゲノム内に安定に組み込まれて 含む宿主生物。 ７５．請求項３８、４１、４３、４６、４７または４９ ないし６５のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含有する発現カ セットまたは該発現カセットを含有するベクター分子を好ましくは宿主生物のゲ ノム内に安定に組み込まれて含む宿主生物。 ７６．植物および昆虫細胞、バクテリア、酵母、バキュロウイルス、原生動物、 線虫および藻類からなる群から選択される請求項７４または７５記載の宿主生物 。 ７７．請求項３７、３９、４０、４２、４４、４５または４８のいずれか１項に 記載のＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含有する発現カセットまたは該発現カセット を含有するベクター分子を好ましくは植物ゲノム内に安定に組み込まれて含むト ランスジェニック植物およびその一部ならびにそれらの後代および種子。 ７８．請求項３８、４１、４３、４６、４７または４９ないし６５のいずれか１ 項に記載のＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含有する発現カセットまたは該発現カセ ットを含有するベクター分子を好ましくは植物ゲノム内に安定に組み込まれて含 むトランスジェニック植物およびその一部ならびにそれらの後代および種子。 ７９．請求項３８、４１、４３、４６、４７または４９ないし６５のいずれか１ 項に記載のＤＮＡ分子で安定に形質転換されたトランスジェニック植物およびそ の一部ならびにそれらの後代および種子。 ８０．請求項５、７、９、１０、１２ないし１５または１９ないし２２のいずれ か１項に記載の昆虫特異的タン パク質を発現するトランスジェニック植物およびその一部ならびにそれらの後代 および種子。 ８１．請求項８、１１、１６ないし１８、２３ないし３６または６６のいずれか １項に記載の昆虫特異的タンパク質を発現するトランスジェニック植物およびそ の一部ならびにそれらの後代および種子。 ８２．第２の明白な昆虫制御要素をさらに発現する請求項８０または８１記載の トランスジェニック植物。 ８３．第２の昆虫制御要素がＢｔδ−エンドトキシンである請求項８２記載のト ランスジェニック植物。 ８４．トウモロコシ植物である請求項７７ないし８３のいずれか１項に記載のト ランスジェニック植物。 ８５．ハイブリッド植物である請求項７７ないし８４のいずれか１項に記載のト ランスジェニック植物。 ８６．種子保護コーティングで処理された請求項７７ないし８４のいずれか１項 に記載の植物の植物増殖材料。 ８７．請求項６７ないし７０のいずれか１項に記載の発現カセットおよび／また は請求項７１または７２記載のベクター分子で形質転換され、植物上で増殖する 微生物であることが好ましい微生物。 ８８．根寄生性バクテリアである請求項８７記載の微生物。 ８９．請求項１８または２３記載の昆虫特異的タンパク質を含有する請求項８７ または８８記載の微生物を含有する封入された昆虫特異的タンパク質。 ９０．殺虫有効量で請求項７４ないし７６のいずれか１項に記載の宿主生物を適 当な担体と共に含有する殺虫性組成物。 ９１．殺虫有効量で請求項１ないし４のいずれか１項に記載の精製されたバチラ ス菌株を適当な担体と共に含有する殺虫性組成物。 ９２．請求項５ないし３６および６６のいずれか１項に記載の単離されたタンパ ク質分子を単独で、または請求項７４ないし７６のいずれか１項に記載の宿主生 物および／または請求項８９記載の封入された昆虫特異的タンパク質と組み合わ せて殺虫有効量で、適当な担体と共に含有する殺虫性組成物。 ９３．ＮＡＤカラムに請求項５ないし３６のいずれか１項に記載の昆虫特異的タ ンパク質を含有する溶液を注入し、そして結合したタンパク質を溶離することか らなる請求項５ないし３６のいずれか１項に記載の精製された昆虫特異的タンパ ク質を得る方法。 ９４．以下の工程： （ａ）培養液中でバチラス菌株を増殖させ、 （ｂ）該培養液から上澄みを得、 （ｃ）該上澄みを有する食餌を昆虫の幼虫に摂食させ、そして （ｄ）死虫率を測定する からなる請求項５ないし３６のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質の昆 虫活性を同定する方法。 ９５．以下の工程： （ａ）培養液中でバチラス菌株を増殖させ、 （ｂ）該培養液から上澄みを得、そして （ｃ）該上澄みから昆虫特異的タンパク質を単離する、 からなる請求項５ないし３６のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質を単 離する方法。 ９６．以下の工程： （ａ）昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子 を得、そして （ｂ）該ＤＮＡ分子をバチラス種から得られるＤＮＡとハイブリッド形成させ、 そして （ｃ）ハイブリッド形成されたＤＮＡを単離する からなる請求項５ないし３６のいずれか１項に記載のタンパク質の殺虫活性を示 す昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子を単 離する方法。 ９７．請求項５ないし３６のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質とは異 なる少なくとも１種の第２の殺虫性タンパク質と組み合わせて請求項５ないし３ ６のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質を用いることにより昆虫標的範 囲を拡大する方法。 ９８．請求項５ないし３６のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質が請求 項５ないし３６のいずれか１項に記載の昆虫特異的タンパク質とは異なる少なく とも１種の第２の殺虫性タンパク質と共に植物内に発現される 昆虫標的範囲を拡大する方法。 ９９．第２の殺虫性タンパク質がＢｔδ−エンドトキシン、プロテアーゼインヒ ビター、レクチン、α−アミラーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択 される請求項９７または９８記載の方法。 １００．請求項９０ないし９２のいずれか１項に記載の殺虫性組成物を植物また は該植物の生育地に適用することからなる有害昆虫により引き起こされる損傷か ら植物を保護する方法。 １０１．請求項５ないし３６のいずれか１項に記載の毒素タンパク質を植物に適 用することからなる有害昆虫により引き起こされる損傷から植物を保護する方法 。 １０２．有害昆虫が発生し得る領域に請求項５ないし３６のいずれか１項に記載 の昆虫特異的タンパク質を発現するトランスジェニック植物を植えることからな る有害昆虫により引き起こされる損傷から植物を保護する方法。 １０３．宿主生物を請求項６７ないし７０および７３のいずれか１項に記載のＤ ＮＡ分子または請求項７１または７２記載のベクター分子で形質転換することか らなる請求項７４ないし７６のいずれか１項に記載の宿主生物を製造する方法。 １０４．植物および植物細胞を、それぞれ請求項７０または７３のいずれか１項 に記載の発現カセットまたは請求項７２記載のベクター分子で形質転換すること からなるトランスジェニック植物または植物細胞を作出する方 法。 １０５．請求項１ないし４のいずれか１項に記載のバチラス菌株および／または 請求項７４ないし７６のいずれか１項に記載の宿主生物および／または請求項５ ないし３６および６６のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質分子および ／または請求項８９記載の封入されたタンパク質を殺虫有効量で、適当な担体と 混合することからなる請求項９０ないし９２のいずれか１項に記載の殺虫性組成 物を製造する方法。 １０６．親植物を請求項７０ないし７３のいずれか１項に記載の発現カセットま たは請求項７２記載のベクター分子で形質転換し、そして公知の植物育種技術を 用いて該トランスジェニック親植物の後代に有害生物防除の形質を伝達すること からなる請求項５ないし３６および６６のいずれか１項に記載の昆虫特異的タン パク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子を植物ゲノム内に安定 に組み込まれて含むトランスジェニック親植物のトランスジェニック後代を作出 する方法。 １０７．バチラス・スファエリカスＳＳＩＩ−１からの殺蚊性毒素ではない、バ チラス種の栄養増殖期の間に単離され得る昆虫特異的タンパク質およびその部分 をコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成し得、長さが少なく とも１０ヌクレオチドの昆虫特異的タンパク質のためのコード配列の隣接部分を 含むオリゴヌクレオチドプローブ。 １０８．昆虫特異的タンパク質が天然に存在するか、または特定の形質転換され た生物が上記遺伝子を包含するかを決定するために、バチラス菌株またはその他 の生物をスクリーニングするためにオリゴヌクレオチドプローブを使用する方法 。 １０９．以下の工程： （ａ）昆虫特異的タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子 を得、そして （ｂ）配列番号：２８、配列番号：３０または配列番号：３１で示されるヌクレ オチド配列からなるＤＮＡ分子から得られる請求項１０７記載のオリゴヌクレオ チドプローブと前記ＤＮＡ分子とをハイブリッド形成させ、そして （ｃ）前記ハイブリッド形成したＤＮＡを単離する から得られる、請求項８、１１、１６ないし１８および２３ないし３６のいずれ か１項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。