CN102633884B - 苏云金芽胞杆菌vip1like1、vip2like1基因组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“苏云金芽胞杆菌vip1like1、vip2like1基因组合及其应用”，属于生物防治技术领域。本发明人从出发菌株HBF-18中克隆得到vip1like1、vip2like1基因，其序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO 2。本发明发现，vip1like1、vip2like1基因之间，cry8Ga1与vip1like1、vip2like1基因之间存在相互的协同作用，表现出对鞘翅目害虫的高毒力，特别是对暗黑鳃金龟的杀虫效果非常好。该基因组合对主要地下害虫蛴螬的生物防治以及我国农业绿色可持续发展都有极其重要的意义，进一步为开发抗蛴螬的Bt工程菌株、转基因作物提供基因来源。

Description

苏云金芽胞杆菌vip1like1、vip2like1基因组合及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，特别是涉及苏云金芽胞杆菌vip1、vip2基因组合及其应用。

背景技术

蛴螬是金龟总科（Scarabaeoidea）幼虫的总称，属于鞘翅目，鳃金龟科，是地下害虫中种类最多，也是危害最大，造成植物损失最大的种类。金龟子总科种类繁多，世界上记载的有3万多种，目前我国已记录1800多种，这类害虫食性杂、分布广、生活隐蔽、适应性强、生活史长短不一，其中为害农林牧草的有100多种，防治十分困难。最主要的有暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）、华北大黑鳃金龟（Holotrichiaobeita）和铜绿丽金龟（Anomala carpulenta）等。

蛴螬生活习性复杂多样，危害虫态也各异，有的以成虫危害，有的以幼虫危害。蛴螬成虫喜食作物，林果木（杨，榆，柳，苹果，梨等）叶片、嫩茎和花蕾，果穗等，造成危害。蛴螬幼虫危害更为严重，幼虫栖居地下，取食萌发的种子咬断幼苗的根茎，蛀食根块茎等，造成轻则缺苗断垄，重则毁种绝收。幼虫不仅危害范围广，而且为害时间长，从春季到秋季，从播种到收获都有较大危害。蛴螬啃食地下块根、块茎，使作物生长衰弱，直接影响产量和品质，如花生、红薯、马铃薯、萝卜类春秋受害严重。蛴螬啃食后不仅影响产品的外观品质，还易招致病菌从伤口入侵，对冬菜贮藏带来很大不便。近年来随着城市发展，草皮绿化面积逐年加大，对绿化植被的维护已经成为城市发展中的一项重要工作。蛴螬幼虫咬食草皮根茎，以及进一步引起的病害入侵成为城市绿化草皮的主要危害之一。此外，蛴螬还是危害猪群的寄生虫病（猪巨吻棘头虫）中间宿主和传播媒介，棘头虫寄生于猪的小肠，粪肥施于田间，蛴螬是其中间寄主。因此，蛴螬是危害农业、林业、城市绿化的重要害虫。

蛴螬是国内外公认的难以防治的地下害虫，作物地下部分损失的86℅是由蛴螬造成的，据统计常年全国蛴螬发生面积约700万公顷，一般减产20%～30%。严重年份全国蛴螬发生面积曾达2000万公顷，减产达到50%以上(姜常松,姜福军,包信平.(2008)花生蛴螬播种期一次用药全生育期控制技术,现代农业科技,121-123.)，甚至绝产，成为目前最重要的地下害虫。花生因蛴螬为害一般情况造成减产20%～40%，严重时可减产70%～80%，甚至绝产，并使花生品质下降大大挫伤了群众种植花生的积极性(刘树森，李克斌，尹姣，曹雅忠（2008）蛴螬生物防治研究进展，中国生物防治，168-173。许婷婷,江晨,宫清轩,陈金凤,曲明静(2010)青岛市花生田蛴螬发生与无公害防治研究,花生学报,42-44。王振军,郭志刚,雷晓天,茹德平.(2010)花生田蛴螬发生原因与防治技术,农业科技通讯,198-200。张改霞,王永芳,魏改红(2010)夏花生田蛴螬的发生与防治,农家参谋,11)。2007年8月中下旬在山东省菏泽地区挖查，蛴螬虫口密度平均为8.7头/m2，最高达22头/m2(王爱东.(2008)农田蛴螬发生及综合防治技术,现代农业科技)。2003～2007年，在无棣县采取黑光灯诱集与春、夏、秋3季挖土调查相结合的方法。对大田作物进行了随机调查，大豆田、玉米田金龟子分别达5.63和3.00头/m2。大豆田金龟子发生的种类最多，为7种。其中中华弧丽金龟最多，占50.2%，铜绿丽金龟次之，占25.1%。华北大黑鳃金龟第3，占13.0%，其他种类较少。玉米田华北大黑鳃金龟最多，占38.7%，铜绿丽金龟次之，占29.5%，暗黑鳃金龟第3，占14.6%，其他种类较少(田方文,彭彦明,张伟华,崔少英(2008)山东省无棣县农田金龟子种类调查及发生规律研究,安徽农业科学,12322-12323)。目前，由于机械化作业的推广，农业生产的耕作制度的改变，比如免耕耕作制度、秸秆还田等技术的推广，给蛴螬带来了舒适的生存环境与丰富的食物，增加了单位面积的虫口数，使得蛴螬危害日益加重，特别是东北、华北和华中地区，给蛴螬的防治带来了困难(裴桂英，马赛飞，刘健，刘保才(2010)大豆田不同耕作模式对蛴螬发生及产量的影响,科学种养)。

筛选具有特异性杀虫谱的新Bt菌株始终是Bt研究最活跃的领域。90年代以来，人们在总结回顾Bt杀虫剂防治害虫的历史时发现，现有的Bt杀虫剂主要是用于防治地上的敏感性鳞翅目害虫，用于防治鞘翅目叶甲类害虫的很少。但是起主要杀虫活性作用的伴孢晶体蛋白和芽孢在阳光中的紫外线照射下很容易失活，丧失杀虫活性（初立良，郑桂玲，周洪旭，李长友，李国勋.两株杀鞘翅目害虫Bt菌株的生物活性及杀虫蛋白基因鉴定，华北农学报，2010（3））。应用Bt制剂防治蛴螬具有一定的优势，因为蛴螬生活环境隐蔽，避免了伴胞晶体和芽孢受紫外线的照射，能延长杀虫持效期，提高杀虫效果（刘树森，李克斌，尹姣，曹雅忠（2008）蛴螬生物防治研究进展，中国生物防治，168-173）。因此，一些Bt研究者将研究重点转向筛选对主要地下害虫——金龟子类幼虫具有杀虫活性的菌株上，并取得突破性进展。目前，已有不少报道关于对蛴螬有效的菌株与基因，1992年，Ohba等在世界上首次筛选出对铜绿丽金龟、日本弧丽金龟幼虫有特异杀虫活性的一株Bt新菌株（Bt.subsp.japonensis BuiBui），这是Bt首次用于对蛴螬的防治研究。Sato等于1994年从该菌株中克隆得到新的杀虫基因—cry8Ca1。1994年，美国Mycogen公司从Bt菌株PS50C分离的cry8Aa1和cry8Ba1对花金龟Cotinis sp有明显的杀虫活性。Shin-ichiro Asano等2003年发现的含有cry8Da的Bt菌株SDS-502对铜绿异丽金龟有高活性。

我国的相关基因发掘是2002年以后开始的。河北省农科院植保所筛选出多株对黄褐丽金龟（Anomala.exoleta）和铜绿丽金龟（Anomala..corpulenta）幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株（冯书亮,王容燕,范秀华,胡明峻.一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株[J].中国生物防治,2000（2）:74-76）。2004年，中国农业科学院植物保护研究所从菌株HBF-1中克隆得到对铜绿丽金龟高效的cry8Ca2基因，随后进行了突变研究，提高了对铜绿丽金龟的杀虫活性。2006年，中国农业科学院植物保护研究所又发现Bt菌株Bt185对暗黑鳃金龟具有较好杀虫活性，这是发现的第一株对暗黑鳃金龟有杀虫活性的基因，2008年从该菌株中克隆得到了模式基因cry8Fa1和对暗黑鳃金龟高活力的模式基因cry8Ea1。2009年，中国农业科学院植物保护研究所又发现了同时对暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟高杀虫活性的Bt菌株HBF-18，从该菌株中分离到对大黑鳃金龟与暗黑鳃金龟都有效的第二分类等级的新基因cry8Ga1。研究结果表明自然界中存在对蛴螬具有特异杀虫活性的菌株与基因，通过筛选高效杀虫菌株与基因，可以利用Bt来蛴螬进行有效的生物防治。目前发现对蛴螬有杀虫活性的Bt基因有cry3、cry8、cry23、cry18、cry37、cry43等类基因。研究较多的是cry8类基因，cry8类基因由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。这些菌株与基因的克隆为我国的蛴螬防治提供了优质菌株资源，也为进一步开发抗蛴螬转基因作物提供了基因资源。

除cry基因外，Bt还有其他编码杀虫蛋白的基因。营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidial protein,Vips)是在苏云金芽孢杆菌在细胞营养期发现的一种非晶体的新型胞外杀虫蛋白，Estruch和Warren等人于1996年和1998年分别从Bt菌株AB88和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)菌株AB78的上清液中发现了Vip杀虫蛋白(Estruch et al.1996)。该类蛋白从对数生长中期开始分泌，直到稳定前期达到最高峰；一般不形成伴孢晶体且与已知的ICPs没有序列相似性，最重要的是其杀虫作用机理与ICPs不同。该蛋白的发现使Bt在杀虫活性、杀虫范围方面得到很大突破，并在一定程度上克服了多种害虫对ICPs低敏感或不敏感的弊端。目前Vips命名规则分为4大类（Vip1，Vip2，Vip3和Vip4），其中Vip1与Vip2是一种二元毒素，两者需要协同作用，目前研究显示这类毒素对鞘翅目害虫具有杀虫活性（US5770696，US6656908，US6605701等专利）；Vip3类是一大类对鳞翅目高效的杀虫蛋白，特别是Vip3Aa类蛋白对草地滩夜蛾、小地老虎等害虫有较好杀虫活性，克服了Bt杀虫晶体蛋白对其不敏感的弱点(Estruch et al.1996)；Vip4类蛋白是新发现的一类营养期杀虫蛋白，其具体功能还不清楚。

20世纪90年代以后，随着化学农药的大规模应用而产生的问题越来越突出，我国逐渐限制了相关高毒农药的使用，从2007年1月1日起，已全面禁止了甲胺磷等高毒化学农药在农业生产中的应用。高毒化学农药的逐渐退场无疑给生物农药腾出了巨大的市场空间。依照我国农药行业确定的“十二五”规划，农药产业将继续深化高毒农药的替代工作，预计到2015年，高毒农药所占比重将由目前的20%降低到5%左右，而生物农药占所有农药的份额将由现在的不足10%增加到30%以上。为了获得最佳的社会、经济和生态效益，改善农业生态环境，实现我国农业经济的可持续发展，保障粮食、食品安全生产，增强我国农产品国际竞争力，研发和推广以生物防治为核心的蛴螬综合防治技术是目前主流趋势。

菌株HBF-18对大黑鳃金龟与暗黑鳃金龟有较好杀虫活性，本项目组从中分离到对暗黑鳃金龟与大黑鳃金龟都有活性的cry8Ga1基因。cry8Ga基因也是目前唯一报导的对大暗黑鳃金龟有活性的cry基因类型。然而，cry8Ga基因的表达产物与出发菌株（HBF-18）相比，有较大的差别，结果显示含有cry8Ga基因的无晶体突变株对大黑鳃金龟与暗鳃金龟的活性比出发菌株要低，其LC₅₀分别高出50倍与70倍（Shu etal.2009）（表1-1）。在申请人克隆的其他对蛴螬有活性的基因则没有这种现象。在转入cry8Ca、cry8Ea、cry8Ha与cry8Ia等基因的Bt无晶体突变株具与其出发菌株HBF-1、Bt185以及BtSU4有相当的杀虫效果(表1-2,1-3)。这些现象表明，菌株HBF-18中除了含有cry8Ga基因外，还含有一些其他新的杀虫基因。

表1-1.菌株HBF-18与HD8G（只有cry8Ga基因的表达表达菌株）对大黑鳃金龟与暗黑鳃金龟的杀虫活性比较

^a括号中是95%置信区间

^b平均值±标准误

表1-2.菌株HBF-1与HD8C（只有cry8Ca基因的表达表达菌株）对铜绿丽金龟的杀虫活性比较

^a括号中是95%置信区间      ^b平均值±标准误

表1-3.菌株Bt185与HD8E（只有cry8Ea基因的表达表达菌株）对暗黑鳃金龟的杀虫活性比较

^a括号中是95%置信区间.     ^b平均值±标准误.

本项目组研究还发现，多种基因的协同使用可以提高Bt对蛴螬的防治效果。闫贵欣等人研究结果显示，cry3Aa基因与cry8Ca基因共同表达可以提高对铜绿丽金龟的杀虫效果(表1-4)；刘晶晶等人研究结果表明，cry8Ea与cry8Ca协同表达可以显著提高菌株对暗黑鳃金龟的防治效果(表1-5)。这些研究结果表明采用多基因共同表达，可以提高杀虫效果。而含有cry8Ga基因的无晶体突变株对大黑鳃金龟与暗黑鳃金龟活性比出发菌株都要低50倍与70倍，说明HBF-18菌株中除了含有cry8Ga基因外，还可能含有一些其他新的杀虫基因。这些新的杀虫基因不能通过传统的鉴定方法鉴定出来，所以我们需要用到新的鉴定新基因的方法来鉴定这些基因。Solexa测序是一种新的、有效的鉴定新基因的方法。

表1-4.菌株HBF-1，Bt22与3A-HBF对马铃薯叶甲，大猿叶虫，铜绿丽金龟的杀虫活性比较

发明内容

本发明人从出发菌株中克隆得到了vip1like1、vip2like1基因，它们之间具有相互的协同作用，可以明显提高对鞘翅目害虫的毒性。

一种蛋白组合物，含有Vip1like1与Vip2like1的蛋白，所述Vip1like1的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，所述Vip2like1的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。

所述的蛋白组合物，仅由Vip1like1与Vip2like1的蛋白组成。

所述的蛋白组合物，还含有Cry8Ga1蛋白。

上述蛋白组合物在抗鞘翅目害虫中的应用。

所述应用，是将蛋白组合物制成杀虫剂杀鞘翅目害虫。

所述应用，是将分别含有表达蛋白的基因载体转入同一植物或微生物中，使其表现抗鞘翅目害虫的特性。

所述含有表达蛋白的基因载体分别为pSTK vip2A，pSTKvip1B，pSTKvip8Ga1，其结构如图16所示。

所述表达Vip1like1蛋白的基因的序列如SEQ ID NO1所示，所述表达Vip2like1蛋白的基因序列如SEQID NO2所示，所述表达Cry8Ga1蛋白的基因序列如SEQ ID NO5所示。

所述微生物为苏云金芽胞杆菌无晶体突变株HD-73^-。

所述鞘翅目害虫为蛴螬。

本研究对分离的含有cry8Ga基因的Bt菌株HBF-18（cry8Ga1）进行研究。目标是从对大暗黑鳃金龟高活性的HBF-18菌株中分离到除cry8Ga1基因（发明专利申请号：200710118289.7，其基因序列如SEQID NO5）以外的新型杀虫基因，并分析新蛋白的功能。首先利用Solexa高通量测序技术测定菌株的基因组序列，预测所有编码基因，获得菌株可能的编码氨基酸序列，并利用现有报导的杀虫蛋白数据库进行序列比对，从HBF-18菌株中分离到除cry8Ga1基因以外的新型杀虫基因，其中包括Vip1like1和Vip2like1，并分析新蛋白的功能，获得对暗黑鳃金龟高活性的新基因或者基因组合（包括Vip1like1和Vip2like1组合，Cry8Ga1、Vip1like1和Vip2like1的组合）。该新基因组合对主要地下害虫蛴螬的生物防治以及我国农业绿色可持续发展都有极其重要的意义，进一步为开发抗蛴螬的Bt工程菌株、转基因作物提供基因来源。

附图说明

图1Vip1like1，Vip2like1序列分析，

图2Vip1like1信号肽预测，

图3Vip2like1信号肽预测，

图4候选基因在HBF-18菌株中的转录分析-Vip1like1RT-PCR结果

图5候选基因在HBF-18菌株中的转录分析-Vip2like1RT-PCR结果

图4、5中，M：BM2000分子量标准；1：HBF-183h cDNA；2：HBF-183h RNA；3：HBF-185h cDNA；4：HBF-185h RNA；5：HBF-188h cDNA；6：HBF-188h RNA；7：HBF-1812h cDNA；8：HBF-1812h RNA；9：HBF-1824h cDNA；10：HBF-1824h RNA；11：HBF-18基因组阳性对照；12：无模板阴性对照

图6vip1like1，vip2like1PCR产物，

M：λDNA/Eco130Ⅰ；1：vip1like1PCR产物；2：vip1like1阴性对照；3：vip2like1PCR产物；4：vip2like1阴性对照

图7菌液PCR鉴定，

M：λDNA/Eco130Ⅰ；1：vip1like1菌液PCR产物；2：vip1like1阳性对照；3：vip1like1阴性对照；4：vip2like1菌液PCR产物；5：vip2like1阳性对照；6：vip2like1阴性对照，

图8重组质粒构建流程图，

图9质粒酶切鉴定，

其中，M-λDNA/Eco130Ⅰ；1-vip1-pEB-JM109质粒酶切鉴定；2-vip2-pEB-JM109质粒酶切鉴定；3-vip21-pEB-JM109质粒酶切鉴定；M1-BM10000，

图10vip1like1，vip2like1，vip21表达产物可溶组分，

其中，M-High Molecular Protein Marker，1：ck可溶组分；2：vip1like1表达产物可溶组分；3：vip2like1表达产物可溶组分，4：vip21表达产物可溶组分

图11vip1like1，vip2like1，vip21表达产物不可溶组分，

其中，M-High Molecular Protein Marker，1：ck不可溶组分；2：vip1like1表达产物不可溶组分；3：vip2like1表达产物不可溶组分；4：vip21表达产物不可溶组分；

图12vip1like1，vip2like1加酶切位点PCR，

其中，M-λDNA/Eco130Ⅰ，vip1like1PCR产物，vip2like1PCR产物

图13穿梭载体pSTK双酶切产物

其中M-λDNA/Eco130Ⅰ，1-pSTK双酶切产物

图14vip1like1，vip2like1表达载体构建PCR鉴定

其中M：λDNA/Eco130Ⅰ，1：Vip1-pSTK-HD73-PCR鉴定，2：Vip2-pSTK-HD73-PCR鉴定，

图15质粒酶切鉴定，

其中，M：BM10000，1：vip1-pSTK-JM109质粒酶切鉴定，2：vip2-pSTK-JM109质粒酶切鉴定

图16表达载体pSTK构建

图17Vip1like1，Vip2like1分泌蛋白表达

其中M：High Molecular Protein Marker，1：HD73-分泌蛋白:2：Vip1like1分泌蛋白:3：Vip2like1分泌蛋白。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

1、实验材料

1.1菌株与质粒

所用菌株与质粒见表2-1，所述的出发菌株和载体，本实验室均有保藏，可以对公众发放。

表2-1菌株与质粒

1.2试剂

1.2.1培养基

液体LB培养基：0.5%yeast extract，1.0%trytone，1.0%NaCl，pH7.0，121℃灭菌20mim。

固体LB培养基：在液体LB培养基中加入1.3%琼脂粉，121℃灭菌20mim。

BH培养基：3.7%Brain and heart infusion broth，121℃灭菌20mim。

牛肉膏蛋白胨培养基：3g牛肉膏，5g大豆蛋白胨，蒸馏水溶解，NaOH调pH至7.2，定容至1000mL，121℃灭菌20min。

1.2.2抗生素

氨苄青霉素水溶液100mg/ml，-20℃保存，用时稀释1000倍；氯霉素无水乙醇溶液34mg/mL，-20℃保存，使用时稀释1000倍。卡那霉素水溶液50mg/ml，-20℃保存，用时稀释1000倍。

1.2.3酶与生化试剂

1）PCR扩增试剂购自北京博迈德科技发展有限公司和TaKaRa公司；

2）限制性内切酶及2x连接试剂盒购自TaKaRa公司；

3）质粒提取及DNA回收试剂盒购自Axygen公司；

4）用于qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统购自Invitrogen公司；

5）DNA标准分子量Marker购自北京博迈德科技发展有限公司；

6）抗生素购自北京鼎盛伟业生物科技有限公司。其它试剂均为市售国产或者进口分析纯或电泳级纯化学试剂。

7）PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列测定由中国农业科学院作物科学研究所农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程开放实验室完成。

8）蛋白分子量标准：Precision Plus Protein^TM Standards（kDa）：250、150、100、75、50、37、25、20、15、10。

9）DNA标准分子量：

λDNA/Eco130Ⅰ（λ/E）：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421（bp）。

BM2000:2000、1000、750、500、250、100（bp）

BM5000:5000、3000、2000、1000、750、500、250、100（bp）

1.2.4常用溶液与缓冲液

1）Bt总DNA提取液

溶液I：0.3%蔗糖，25mmol/L Tris·Cl（pH8.0），25mmol/L EDTA（pH8.0），50mg/mL Lysozyme。

溶液II：0.1mol/L Nacl，0.1％SDS，0.1mol/L Tris·Cl（pH8.0）。

2）Bt蛋白提取试剂：

裂解液：50mM Na₂CO₃，50mM EDTA。配制方法：5.30g无水碳酸钠，18.61g EDTA超纯水定容至1000ml，121℃/20mim灭菌后，调pH至9.5，使用前加入终浓度为3%的β-巯基乙醇。

醋酸钠-醋酸缓冲液：4M无水NaAc。配制方法：65.61g无水醋酸钠用少量双蒸水溶解后再用HAc将pH调至4.5，再定容至200ml。

蛋白溶解缓冲液：50mM Na₂CO₃。配制方法：无水Na₂CO₃5.30g，超纯水定容至1000ml，pH9.51M NaCl：NaCl58.44g，超纯水定容至1000ml。

3）琼脂糖凝胶电泳缓冲液：

50×TAE Buffer（pH8.5）：242g Tris，Na₂EDTA·2H₂O37.2g，加800ml去离子水，充分搅拌溶解后，再加入57.1ml冰乙酸，充分搅拌后定容至1000ml，用时稀释50倍。

4）蛋白质电泳试剂与缓冲液：

3×上样缓冲液：Tris3.63g，溴酚蓝0.3g，SDS6.0g，甘油30.0ml，β-巯基乙醇15ml，调pH6.8，超纯水定容至100ml；

30%丙烯酰胺（Acr）/甲叉双丙烯酰胺（Bis）：丙烯酰胺29.2g，甲叉丙烯酰胺0.8g，超纯水定容至100ml；

10×电极缓冲液：Tris30.3g，甘氨酸144.1g，SDS10.0g，蒸馏水定容至1000ml，pH8.3，用时稀释10倍；

分离胶缓冲液：Tris27.23g，0.4%SDS，100ml超纯水溶解，HCl调pH至8.8，超纯水定容至150ml。

浓缩胶缓冲液：Tris6.0g，0.4%SDS，100ml超纯水溶解，HCl调pH至6.8，超纯水定容至150ml。

考马斯亮蓝R250染色法：SⅠ：50%乙醇、10%乙酸

SⅡ：5%乙醇、7.5%乙酸

SⅢ：0.25%考马斯亮蓝R250的95%乙醇溶液注：50ml溶液二加入200μl溶液三。

其它试剂：TEMED；10%Ammonium persulfate（新配）。

1.2.5其它试剂

1）1M Tris-HCl（PH8.0）：121.1gTris溶于800ml去离子水，充分搅拌溶解后调PH至8.0，定容至1L，高温高压灭菌。

2）0.5M EDTA（PH8.0）：186.1g Na₂EDTA·2H₂0，加入800ml去离子水，充分搅拌后，用NaOH调PH至8.0（约20gNaOH），去离子水定容至1L，高温高压灭菌。

3）TE缓冲液：1M Tris-HCl（PH8.0）10ml，0.5M EDTA（PH8.0）2ml，去离子水定容至1L。

4）PBS缓冲液：8.006g NaCl，0.201g KCl，1.540g Na₂HPO₄，0.191g KH₂PO₄，800ml双蒸水溶解，调pH至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌，储存于4℃。

5）石炭酸复红染液：碱性复红（Basic Fuchsine，）乙醇饱和液（约10%）10mL，石炭酸水溶液5%，100mL，两液相混，稀释10倍染色。

6）20mg/ml X-Gal：1g X-Gal，DMF（二甲基甲酰胺）定容至50ml，分装于1.5mlEp管后-20℃避光保存。

7）24mg/ml IPTG：IPTG1.2g，灭菌水定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于1.5mlEp管后-20℃保存。

8）0.1M CaCl₂:2.94g CaCl₂·2H₂O，蒸馏水定容至200ml，高温高压灭菌。

1.3供试昆虫

铜绿丽金龟（Anomala corpulenta）、华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）、暗黑鳃金龟（Holotrichiaparallela）由河北省沧州市农林科学院植物保护研究所提供；所述昆虫本申请人的实验室均有保藏，可以对公众发放。

1.4仪器设备

1）摇床D250：美国NBS公司；

2）高速立式离心机：美国杜邦公司，RC-5型；

3）台式离心机：德国Eppenddorf，5415C；

4）超声破碎仪：Noise Isolating Tamber，Ningbo Scientz Biotechnology

5）PCR仪：美国AmpGene4800。

6）蛋白电泳仪：美国Bio-Rad公司，Mini protein III。

7）凝胶成像系统：美国STRAGENE公司，Eagle EyeII System。

8）核酸电泳仪：DYY-5型，北京六一厂。

9）光学显微镜：日本OLYMPUS CX21。

10）电击转化仪：Bio-Rad Gene Pulser；

11）Beckman高速离心机Avanti J-26xp；

12）水浴锅：余姚长江温度仪表厂，DHW-420；

13）高压蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司；

14）电子天平：德国赛多利斯Sartorius BP310S；

15）紫外分光光度计UV-2100：尤尼柯（上海）仪器有限公司；

16:）超净工作台：苏州净化设备厂；

17）DNA浓度测定仪：Nanodrop分光光度计，美国Thermo Finnigan；

18）生化培养箱：光顶医疗器械厂，LRH-150B型。

19）恒温培养箱：上海实验仪器总厂，DHP120型。

20）DNA Dryer：美国Disco公司；

2研究方法

2.1Bt基因组的提取

1）将5mL培养菌液倒入EP管，12,000r/min离心2min。

2）加入200μL溶液I，加入20～25mg/10mL溶菌酶，混匀，37℃放置10min。

3）加入溶液Ⅱ300μL，再加苯酚100μL（4℃保存），混匀。70℃水浴一小时，每30min轻摇一次。

4）待温度冷却至室温后，加入氯仿100μL，混匀，12,000r/min离心5min。分为三层，取最上层上清。转移上清，用等体积异丙醇沉淀20min。12,000r/min离心8min，取沉淀。

5）经无水乙醇冲洗两遍后晾干，溶于50μL ddH₂O（含RNase）。

2.2大肠杆菌质粒DNA的提取

1）取在LB液体培养基中培养过夜的菌液1-4ml，12,000rpm离心1min，弃上清；

2）加入250μL含50mg/ml RNase A的Buffer S1，悬浮细菌沉淀；

3）向上述悬液中加250μL细菌裂解液Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次直至形成均匀透亮的溶液；

4）再加入350μL中和液Buffer S3，温和并充分地上下翻转6-8次。12,000rpm离心10min；

5）吸取步骤4中的上清并转移到制备管中（置于2ml离心管中），12,000rpm离心1min，弃滤液；

6）制备管置回离心管中，加入500μL洗涤液BufferW₁，12,000rpm离心1min，弃滤液；

7）制备管置回离心管中，加入700μL去盐液Buffer W₂，12,000rpm离心1min，弃滤液。重复一次；

8）将制备管置回2ml离心管中，12,000r/min离心1min。

9）制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备膜中央加60-80μL去离子水（加热到65℃能提高洗脱效率），静置1min，12,000rpm离心1min。

2.3获得HBF-18基因组DNA序列

提取HBF-18菌株的基因组，利用Solexa高通量测序系统进行基因组测序，利用测序仪器随机软件进行序列拼接，最终获得菌株的基因组信息。

2.4获得新杀虫蛋白基因-基因推测

将HBF-18基因组序列利用Genemark软件包进行编码基因推测，获得上述菌株所有编码的蛋白序列。

通过基因组序列与项目组的杀虫基因本地数据库(包含目前报道的所有Bt杀虫基因信息)进行BlastX比对，程序将获得的基因组所有序列（包含编码与非编码序列）与杀虫基因本地数据库进行蛋白质级别比对。比对将获得菌株中所有与杀虫基因编码蛋白有相似性的DNA序列，这些序列可能包含沉默基因与进化过程中产生的基因碎片。

通过Genemark推测基因的菌株基因组编码的蛋白序列与项目组的杀虫基因本地数据库(包含目前报道的所有Bt杀虫蛋白氨基酸序列信息)进行BlastP比对，比对将获得菌株基因组编码的与杀虫蛋白有相似性的蛋白序列，进一步获得相应的编码基因。这些序列可能包含沉默基因。

2.5新基因的序列分析

基因及其两端序列用软件Vector NTI Suite9(Invitr(Yan,Song et al.2009)ogen,Carlsbad,CA,USA)及在线生物信息学软件进行分析。用ExPASy软件SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对Vip1like1和Vip2like1信号肽序列进行预测。

2.6RNA的提取与纯化

HBF-18菌株用LB液体培养基于30°C，230rpm培养3.5h、5h、8h、12h、24h分别取样，用Trizol试剂提取总RNA，RNA提取过程如下：

1)取2ml菌液置于RNase free的2ml Eppendorf（EP）管，，12,000rpm离心1min收集菌体；

2)菌体中加入500μl Trizol试剂，石英砂一勺，细胞破碎仪破碎1min；

3)破碎后样品中加入500μl Trizol试剂，振荡混匀，室温放置5min；

4)加入1/5体积氯仿（约200μl），剧烈振荡，室温放置5min，4℃，12000rpm离心10min；

5)取最上层上清，加入等体积异丙醇混匀，室温沉淀10min；

6)4℃，12,000rpm离心10min，弃上清；

7)75％预冷乙醇洗涤管壁及沉淀，弃上清；

8)沉淀自然干燥后，加入20μl DEPC水，-70℃保存备用。

RNA样品中DNA的去除：

1)提取的RNA中残留的DNA用Ferment试剂盒中的RNase-free 的DNase I处理。

DNA的去除体系（50μl）：

2)37°C处理30min后向，上述体系中加入2μlEDTA（试剂盒提供），70°C处理10min。

3)RNA的纯度和浓度用分光光度计来测定。

2.7RT-PCR

根据Superscript Ш reverse transcriptase说明书提供的方法，取1ng-5μg RNA作为模板，oligo（dT）为引物，利用M-MLV 反转录酶合成cDNA链。

1)cDNA第一链合成反应体系（20μl）如下：

取1ng-5μg纯化的RNA，加入1μl oligo（dT），混匀，70℃保温4min，然后按下述体系加入反应物

混匀后，冰上放置2min。42℃孵育1h；-20℃保存备用。

2)RT-PCR：取2μl该cDNA作为模板，以cry8Ga1，cry8like，vip1，vip2基因特异的引物及16S rRNA特异的引物16S rRNA-F/16S rRNA-R进行PCR扩增。PCR扩增循环如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸40s，30个循环；72℃终延伸10min。其中16S rRNA-F与16SrRNA-R扩增的16S rDNA为内标，HBF-18菌株基因组DNA作为阳性对照，用未进行反转录的RNA作为阴性对照，保证RT-PCR反应不是由于DNA的污染造成的，另外设一个不加模板的阴性对照。

2.8新基因在大肠杆菌中的克隆

2.8.1PCR引物及序列

根据已知的新基因全长序列，设计了如下全长引物对（表2-2），从HBF-18野生菌株中扩增候选基因。

表2-2引物序列

2.8.2PCR反应体系及条件

反应体系：

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，30个循环，最后72℃终延伸10分钟。

2.8.3DNA的回收

1）在长波紫外灯下切下含目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用纸巾洗尽凝胶表面液体，置于2mLEppendorf Tube中，计算凝胶重量（提前称取管重），该重量作为一个凝胶体积。

2）加入3倍凝胶体积的Buffer ED-A，混匀，75℃水浴加热，其间混合几次，至凝胶完全融化；

3）加入0.5个Buffer ED-A体积的Buffer ED-B，混匀；

4）步骤3中的混合液转移到DNA制备管，离心12,000rpm离心1min，弃滤液；

5）制备管置于2ml离心管中，加入500μL洗脱缓冲液，离心12,000rpm离心30s，弃滤液；

6）制备管置回2ml离心管，加入700μL洗脱缓冲液W₂，12000rpm离心30s，弃滤液。重复一次；

7）将制备管置回2ml离心管，12000rpm离心1min；

8）将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25-30μL去离子水，静置1min。12,000rpm离心1min，洗脱DNA。

2.8.4质粒载体酶切体系

按照以下标准配制pEB载体酶切体系200μL，37℃保温1h。

用0.7％琼脂糖进行电泳检测分析，120V电压，以1×TAE为电泳缓冲液，电泳30min。

2.8.5连接反应

    载体DNA                            0.1～0.2μg

目的片段DNA                            0.5～1.0μg

连接试剂盒SolutionⅠ                        5μL

用ddH₂O补足体积到10μL，充分混匀，16℃连接4h或4℃连接过夜。

2.8.6大肠杆菌感受态细胞的制备

1）挑取新鲜的E.Coli单菌落接于5mL LB液体培养基中，37℃,220rpm震荡培养过夜；

2）按1%接种量转接于装有100mL液体LB培养基的三角瓶中，37℃，220rpm震荡培养2～3h，使OD₆₀₀的值达到0.4～0.6之间；

3）4℃，5,000rpm离心10min；

4）弃上清，加入1/2体积（50mL）冰预冷的0.1MCaCl₂溶液悬浮细胞，置于冰上30min以上；

5）4℃，5,000rpm离心10min，回收细胞；

6）用2～4mL冰预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞，加入1/2体积50%的甘油，分装成200μL/1.5mL离心管中，于-70℃保存备用。

2.8.7大肠杆菌的热激转化

1）将1μg要转化的质粒DNA或5μL连接产物加入到200μL感受态细胞中，混匀；

2）冰浴30min后42℃热击90s，立即拿出冰浴3min；

3）加入800μL液体LB培养基37℃培养1h；

4）取200μL涂布具有相应抗性的LB固体平板，根据需要加入IPTG4μL，X-Gal40μL。

5）37℃培养16h后筛选阳性转化子。

2.8.8阳性转化子的筛选

2.8.8.1PCR鉴定

用无菌牙签将白斑转移到新的固体平板同时接入LB试管，37℃培养8h，以出发菌株基因组为阳性对照，筛选阳性克隆。以载体表达区正向引物pEBF和全长基因反向引物进行PCR鉴定，筛选出方向正确的阳性转化子。

反应体系：

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，30个循环，最后72℃延伸10分钟。取3μl扩增产物进行琼脂糖电泳检测（120V，30min）。

2.8.8.2酶切鉴定

方向正确的阳性转化子提取质粒DNA（Axygen质粒提取试剂盒，操作过程见说明说），再用插入位点上下游酶切位点SalⅠ和SmaⅠ进行酶切鉴定。

反应体系：

反应条件：反应体系混匀后置于37℃酶切2-4h，取5μl酶切产物电泳检测。

2.8.9序列测定及分析

鉴定正确的阳性转化子由中国农业科学院重大科学工程楼测序。DNA序列分析是使用DNAMAN及Invitrogen的Vector NTI Suite9软件包。

2.9新基因在大肠杆菌中的表达研究

2.9.1基因表达载体的构建

利用高保真DNA聚合酶扩增基因全长片段，回收后与表达载体pEB经Ecl136Ⅱ酶切产生的平末端连接，转化大肠杆菌感受态JM109，以载体表达区正向引物pEBF和全长基因反向引物进行PCR鉴定，筛选出方向正确的阳性转化子，提取质粒，进行酶切鉴定。鉴定正确的阳性转化子提取质粒，转化大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株。经菌落PCR、酶切鉴定正确后进行蛋白的诱导表达。

2.9.2新基因在大肠杆菌中的诱导表达

1)挑取E.coli单菌落于5mlLB液体培养基中，37℃、220rpm活化12h；

2)按1%接种量接种于200mL液体LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养约2小时至OD₆₀₀=0.6；

3)加入100μL1MIPTG至终浓度为0.5mM；

4)18℃，150rpm振荡培养，低温诱导蛋白表达。

5)8000rpm离心10min收集菌体，悬浮于20mL20mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中；

6)超声破碎菌体10min；

7)4℃，12000rpm离心20min，分别收集上清及沉淀；

8)沉淀用20mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶解，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳检测。

2.9.3表达蛋白的SDS-PAGE检测

聚丙烯酰胺凝胶配置见表2-3。

电泳：取20uL样品加10uL3x上样buffer，沸水煮10min，12000rpm离心，取5μL上清上样，80V预电泳10min，120V恒压电泳1h。

染色：电泳后小心取下凝胶，加入50mLSI微波炉加热30s，60rpm振荡10min后倒掉，加入50mL含200μL SIII的SII，微波炉加热30s，60rpm振荡1h。

表2-3SDS聚丙烯酰氨凝胶的制备

2.10新基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的表达

2.10.1PCR引物及序列

根据已知的新基因全长序列，设计了表2-4中引物对，其中S8E5/S8E3、Svip1F/Svip1R、Svip2F/Svip2R引物两端分别引入SacI、SalI酶切位点，从HBF-18野生菌株中进行vip1like1，vip2like1基因的扩增。

表2-4引物和序列

2.10.2DNA的回收同2.2.8.3

2.10.3酶切体系

1）pSTK载体酶切体系

按照以下标准配制酶切体系50μL，37℃保温1h。

利用0.7％琼脂糖进行电泳检测分析，电压6V/厘米，1×TAE，电泳1h。

2）PCR产物酶切体系：

按照以下标准配制酶切体系30μL，37℃保温1h。

利用2.0％琼脂糖进行电泳检测分析，电压6V/厘米，1×TAE，电泳1h。

2.10.4连接反应

同2.8.5

2.10.5大肠杆菌的热激转化同2.8.7

2.10.6Bt电击感受态细胞的制备与电击转化

1)挑取Bt单菌落于5ml的LB液体培养基中，30℃，230rpm振荡培养过夜；

2)按1%接种量转接于100ml的BH液体培养基中，30℃，230 rpm培养约4h至OD₆₀₀=2.0；

3)4℃，8,000rpm离心10min，收集菌体；

4)弃上清，控干多余液体。加入5-10mL预冷的超纯水漂洗一次，注意不要把菌体悬起；

5)加入100mL的灭菌超纯水将菌体悬起；

6)4℃，8,000rpm，8min离心收集菌体，控干多余液体；

7)加入1ml预冷的40%的PEG悬浮细胞，并分装成100μL/1.5mL离心管的小份，于-70℃保存。

电击转化：在100μL感受态细胞中加入1μg质粒DNA，混匀，置于0℃冰浴的电击杯中，电击参数设置：2200V，1000Ω，25μF，电击后转于1.5ml Ep管中，加入800μL的LB液体培养基，30℃温箱培养2h；取200μL涂布含卡那霉素的LB固体平板，30℃培养过夜；

2.10.7苏云金芽胞杆菌表达载体的构建

将引入酶切位点的全长PCR产物和穿梭表达载体pSTK用SacI、SalI双酶切，连接后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经菌落PCR、酶切鉴定正确后测序，测序正确后提取质粒再转入大肠杆菌SCS110感受态去甲基化，最后提取去甲基化的质粒转入Bt感受态细胞。

2.10.8阳性转化子的筛选

用无菌牙签将白斑转移到新平板，编号并接入LB试管，每管接种5个白斑，37℃培养8小时，取300μl培养液离心，200μl超纯水悬浮菌体，100℃煮10分钟，离心取上清作为PCR模板，用相应鉴定引物进行PCR检测，以出发菌株质粒为阳性对照，筛选阳性克隆。并通过SDS-PAGE鉴定阳性重组子。

2.10.9晶体形态观察

Bt菌株接种于1/2LB培养基中，30℃培养约48h，在载玻片上滴5μl灭菌水，挑取少许菌体在水中涂布均匀，烘干固定，用10μl石炭酸复红染液染色5min，清水冲洗多余染料，滴一滴香柏油，100倍油镜进行镜检。显微镜观察芽胞晶体释放后，刮取培养物用蒸馏水洗3-4遍，悬浮于1mL无菌水中，孢晶混合液滴于盖玻片上，涂布均匀，干燥，离子溅射喷金（2nm），扫描电镜观察拍照。电镜（HITACHI S-4800）分析由中国科学院植物研究所标本馆完成。

2.10.11Bt菌株分泌蛋白的提取和检测

1）挑取新鲜的Bt单菌落于5mL含相应抗性的液体LB培养基中，30℃230rpm震荡培养12h；

2）按1%的接菌量转接到含200ml LB液体培养基的1L三角瓶中，30℃，230rpm，震荡培养约12h；

3）8000rpm离心10min，取上清。

4）上清用60％饱和度的硫酸铵（100mL菌液加36.1g固体硫酸铵）沉淀，4℃过夜。

5）4℃，12000rpm离心10min，弃上清。用2mL的PBS缓冲液悬浮沉淀。

6）以PBS为缓冲液，利用分子筛进行脱盐，产物进行SDS-PAGE检测。

2.10.12蛋白的SDS-PAGE检测

同2.9.3

2.11Bt菌株杀虫活性的测定

暗黑鳃金龟（H.parallela）、大黑鳃金龟（H.oblita）及铜绿丽金龟的生物活性测定

菌株接种于LB固体培养基上培养，至晶体产生后，刮取菌体悬浮于10mL灭菌ddH₂O中，将菌悬液按照2倍等比级差梯度浓度稀释，菌液浸泡均匀粗细土豆丝，剩余菌液与灭菌细土搅拌均匀，待土豆丝晾干后将土豆丝与土混匀，以5-7日龄健康、个体均匀的铜绿丽金龟幼虫及暗黑鳃金龟幼虫作为供试虫种，接种于6孔板内，每孔接虫1头，每个处理接虫30头，重复两次，以加入清水的处理作为空白对照，在25℃人工气候箱中饲养，于7天、14天检查死活虫数，计算校正死亡率与LC₅₀。

2.12数据分析处理

采用“POLO”程序计算死亡率、校正死亡率、LC₅₀和95％置信区间。协同毒力指数采用公式法计算(B ETabashnik,1993)。协同毒力指数：以LC₅₀值来评价混剂联合毒力。先用下式计算混剂预期的LC₅₀值。

将计算出的混剂预期LC₅₀值与实测的LC₅₀值进行比较，如果两值相等，表明属相加作用，前者小于后者，属拮抗作用；大于后者属增效作用。由于试验误差和供试生物等未被觉察到的不一致性，一般认为，预期LC₅₀实测LC₅₀的毒力比值在0.5-2.6之间属相加作用，大于2.6属增效作用，小于0.5时属拮抗作用。

基因和浓度差异显著性检验选用SAS9.2软件GLM过程，多重比较选用Fisher’LSD法，固定模型为：y=μ+Gi+Gj+eijk，其中，y为表型值即校正死亡率；μ为整体均值；Gi为基因效应；Gj为浓度效应；eitk为随机误差效应。

3结果

3.1获得新的杀虫蛋白基因序列

通过BlastX和BlastP比对，最终获得了如下基因序列（表3-1）

表3-1新的杀虫基因序列

3.2序列分析

利用软件Vector NTI Suite9(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)及Weblab在线软件对vip1，vip2基因及其两端序列进行了分析，结果如图1。

3.2.1vip1，vip2基因序列分析

                                SigG

1CATTTAAGTG TCGAAGAATT TTTCACTTAA ACAGTATGAT TACAGTTATT TAATAAATAT

                               SigB

61ATGTTAAATT TTATATTATG ATTAACAGTT TTAATAGAAA GGGGGAATTA GGAAAAAATC

………………………………………………………………………………………………………………

421TTTTATGTAT GATTGTATAT TACTTTCAGT TTTCCCTTTA GAAAATAATT TCATAAATGA

………………………………………………………………………………………………………………

1801TAACAGAAGT AGTCATTAAA GGTGTTAAAC GATATGTAAT TGATGCAACA TTATTAACAA

1861AATAAGGAGA TGAAAAGTAT GAAGAAAAAA CTAGCAAGTG TTGTAACCTG CACGTTATTA

………………………………………………………………………………………………………………

4441AATCTTAAAA TTCAAGCTAT TGCAAATGAT GGGAGAAAGA TTGAAGTGTT TAACAAAATA

4501TTTTAAGAGT TAAACAAATC CTAATAATCT ATAATATTTC GATACGAAGT CTCTCAAAAC

                                        Inverted repeat

4561ATTTATTTCC TAAAACAAAA ATTTTTAAAA AAGAAACGAA GTCAATTTGA CTTCGTTTCT

4621TCAGGCTATG GAGAAAGTCT TTTTATGTGT CAACACTGAT AAAAAAGAGG AAAAGGAGAG

………………………………………………………………………………………………………………

分析结果表明，vip2like1基因在vip1like1基因上游，二者之间仅间隔7个碱基。在vip2like1基因上游存在SigG及SigB转录因子，在vip1like1下游存在一个反向重复序列。

3.2.3Vip1like1，Vip2like1蛋白信号肽预测

用ExPASy软件SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对Vip1like1和Vip2like1信号肽序列进行预测，结果如图2、3所示：

图中各符号所代表的意思：

S值：每个氨基酸对应1个S值，在结果显示的图表中有一个曲线显示S值的变化趋势，（在full模式中可以看见具体数值），信号肽区域的S值较高。

C值：剪切位点值。每个氨基酸会有一个C值，在剪切位点处C值是最高的。

Y值：Y-max综合考虑S值和C值的一个参数，其比单独考虑C值要更精确。因为在一条系列中C值可能有不止一个较高的位点，但是剪切位点只有一个；此时的剪切位点就由Y-max值来推测的，为S值是陡峭的位置和具有高C值的位点。

S-mean是从N端氨基酸开始到剪切位点处各氨基酸的平均S值。

D值是S-mean和Y-max的平均值，对区分是否为分泌蛋白具有重要作用。

由图可知Vip1N端含有信号肽序列，其N端1-31位氨基酸为N端信号肽序列（图2）。而Vip2like1的信号肽信号不是十分强烈（图3），预测其可能的切割位点在第30位氨基酸之后，即其N端1-30位氨基酸是其信号肽序列。这两个营养期杀虫蛋白都具有信号肽序列，我们所用的穿梭表达载体pSTK含有cry3A类启动子，此启动子属于营养期表达的启动子，可以保证营养期杀虫蛋白的表达，并且Vip1like1和Vip2like1都含有N端信号肽序列，故可以分泌到细胞外。

3.2.4新基因在HBF-18菌株中的转录分析

采用Trizol一步提取法提取HBF-18菌株的RNA，RNA中残留的基因组DNA用RNase-free的DNaseI处理去除。通过两步法进行RT-PCR的扩增，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上分离。结果表明，各培养时间的HBF-18菌株的RNA样品都能够扩增出与vip1like1、vip2like1阳性对照同样大小的目的条带；而未进行反转录的RNA样品作为阴性对照，不能扩增出目的条带，表明PCR扩增出的条带不是由于DNA的污染造成的。因此，本实验的结果表明，vip1like1、vip2like1基因在HBF-18菌株中能够正常的转录出相应的mRNA（图4、5），表明候选基因在野生菌株中是表达的。

3.3新基因在大肠杆菌中的克隆及表达

3.3.1新基因的PCR扩增

利用设计的全长表达引物对vip1F/vip1R，vip2F/vip2R，以HBF-18基因组DNA为模板，利用高保真DNA聚合酶分别扩增基因全长片段，分别扩增出了2634bp的vip1like1基因，1386bp的vip2like1基因（图6）。

3.3.2新基因异源表达载体的构建

将上述扩增到的全长基因回收后分别插入到pEB的表达框的Ecl136II位点，得到各个基因的表达载体，表达载体构建见图8。转化大肠杆菌JM109感受态细胞，以载体表达区正向引物pEBF和全长基因反向引物进行PCR鉴定，筛选出方向正确的阳性转化子（图7）。阳性克隆接种至LB培养基中，37℃，230rpm培养过夜，提取质粒，酶切鉴定正确后（图9），测序确定阳性克隆。转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞。经PCR、酶切鉴定正确后诱导表达。

3.3.3新基因在大肠杆菌中的表达

将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株，IPTG诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果发现转入重组质粒的Rosetta（DE3）菌株，在可溶性组分中检测到98kD的Vip1like1蛋白（图10），在不可溶性组份中检测到52kDa的Vip2like1目的蛋白条带（图11），与推导的蛋白大小一致。以空质粒pEB转入Rosetta(DE3)菌株为阴性对照，在可溶性组份和不可溶性组份中均未发现表达的98或52kDa蛋白，以上结果说明在大肠杆菌中成功表达了上述蛋白。

3.4新基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的克隆与表达

3.4.1新基因在大肠杆菌中的克隆

利用设计的引物对Svip1F/Svip1R、Svip2F/Svip2R在基因两端分别引入SacI、SalI酶切位点，为分别构建其穿梭表达载体做准备，以质粒pEBvip1B，pEBvip2A为模板，用高保真DNA聚合酶，分别扩增出了2634bp的vip1like1基因，1386bp的vip2like1基因（图12）。

用SacⅠ、SalⅠ双酶切全长PCR产物和穿梭表达载体pSTK（图13），将全长基因克隆至该载体，载体构建流程见图16，对阳性克隆进行鉴定，PCR扩增分别得到约2.6kb，1.4kb的vip1like1，vip2like1片段（图14），SacⅠ和SalⅠ双酶切质粒，得到8.5kb的空载体和2.6kb，1.4kb的vip1like1，vip2like1目的基因片段（图15），表明载体构建正确，该质粒分别命名为pSTKvip1B、pSTKvip2A。

3.4.3硫酸铵沉淀法提取Vip1，Vip2分泌蛋白

采用硫酸铵沉淀法，提取Vip1like1，Vip2like1的分泌蛋白，在分泌组分中可以检测到约80kD的Vip1like1和约50kD的Vip2like1蛋白条带，比推导的条带要小，说明vip1like1、vip2like1可能在苏云金芽胞杆菌中完成了信号肽的切割后分泌到胞外。蛋白电泳图如图17所示。

3.5新基因的序列及分析

将含有不同重组质粒的阳性克隆进行了核酸序列的测定，得到了新基因的核苷酸序列，并推测其氨基酸序列。

结果表明，克隆的新基因vip1like1大小为2634bp，蛋白由878个氨基酸组成，见SEQ ID NO3，分子量为98.1kD。该蛋白的氨基酸组成含量由高到低分别是赖氨酸（10.48%），丝氨酸（8.43%），天冬酰胺（8.20%），苏氨酸（7.74%），异亮氨酸（7.06%），天冬氨酸（6.72%），亮氨酸（6.49%），甘氨酸（6.38%）（见表3-2）；该蛋白等电点为pH6.67，为弱酸性蛋白，如表3-2所示。氨基酸序列相似性分析，表明与Vip1Ba蛋白相似性76%，说明是一种新型（holotype）的vip1类基因，命名为vip1like1，是第2等级的新基因。

vip1like1基因序列如SEQ ID NO1。

克隆的新基因vip2like1大小为1386bp，蛋白由462个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示，分子量为52.6kD。该蛋白的氨基酸组成含量由高到低分别是赖氨酸（13.64%），亮氨酸（8.87%），谷氨酸（8.01%），丝氨酸（7.58%），异亮氨酸（7.14%），天冬氨酸（6.49%），天冬酰胺（6.28%），甘氨酸（6.06%）（见表3-2）；该蛋白等电点为pH9.34，为弱碱性蛋白，如表3-3所示。氨基酸序列相似性分析，表明与Vip2Ac蛋白相似性88%，说明是一种新型（holotype）的vip2类基因，命名为vip2like1，是第3等级的新基因。

vip2like1基因序列如SEQ ID NO2。

3.6Bt菌株杀虫活性测定结果

3.6.1不同菌株及组合对暗黑鳃金龟生物活性测定结果及分析

3.6.1.1生物活性测定结果

表3-4菌株HBF-18生物活性测定结果

表3-5菌株HD8G生物活性测定结果

表3-6菌株HDVip1-HDVip2生物活性测定结果

表3-7菌株HD8G-HDVip1-HDVip2生物活性测定结果

3.6.1.2协同毒力评价

协同毒力指数：以LC₅₀值来评价混剂联合毒力。

协同毒力指数=试验所得LC₅₀/预期LC₅₀*100

由于试验误差和供试生物等未被觉察到的不一致性。一般认为,预期LC₅₀实测LC₅₀的毒力比值在0.5-2.6之间属相加作用，大于2.6属增效作用，小于0.5时属拮抗作用。（Finney,D.J.,Ed.(1952).ProbitAnalysis.）

表3-14不同组合杀虫效果表

由表3-15可以看出HD8G与Vip1，Vip2之间的组合预期LC₅₀与实测LC₅₀的毒力比值大于2.6属于增效作用。

为了检验HD8G与Vip1like1、Vip2like1之间的增效作用效果，选用SAS9.2软件GLM过程对基因和浓度进行差异显著性检验，多重比较选用Fisher’LSD法，固定模型为：y=μ+Gi+Gj+ejik，其中，y为表型值即校正死亡率；μ为整体均值；Gi为基因效应；Gj为浓度效应；eijk为随机误差效应。

表3-15均值及标准差

菌株HBF-18对暗黑鳃金龟的杀虫效果最好，与HD8G-Vip1-Vip2杀虫效果其差异不显著，与其它菌株或组合差异均显著。

由生测结果可以得出如下结论：

Vip1like1，Vip2like1组合对暗黑鳃金龟有杀虫活性，与HBF-18达到显著差异水平，跟HD8G达到协

同增效作用，增效后杀虫活性与HBF-18差异不显著。

Claims (9)

1.一种蛋白组合物，含有Vip1like1与Vip2like1的蛋白，所述Vip1like1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，所述Vip2like1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。 

2.根据权利要求1所述的蛋白组合物，仅由Vip1like1与Vip2like1的蛋白组成。 

3.根据权利要求1所述的蛋白组合物，还含有Cry8Ga1蛋白。 

4.权利要求1-3任一所述的蛋白组合物在抗鞘翅目害虫中的应用。 

5.根据权利要求4所述的应用，是将蛋白组合物制成杀虫剂杀鞘翅目害虫。 

6.根据权利要求4所述的应用，是将分别含有表达蛋白的基因载体转入同一植物或微生物中，使其表现抗鞘翅目害虫的特性。 

7.根据权利要求6所述的应用，其中表达Vip1like1蛋白的基因的序列如SEQ ID NO1所示，表达Vip2like1蛋白的基因序列如SEQ ID NO2所示，表达Cry8Ga1蛋白的基因序列如SEQ ID NO5所示。 

8.根据权利要求6所述的应用，所述微生物为苏云金芽胞杆菌无晶体突变株HD-73^-。 

9.根据权利要求4-8任一所述的应用，所述鞘翅目害虫为蛴螬。 

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