CN102421792A - Axmi-001、axmi-002、axmi-030、axmi-035和axmi-045: 来自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白及其用法 - Google Patents

Abstract

本发明提供赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀病虫害活性的组合物和方法。提供包含δ-内毒素多肽的编码序列的组合物。该编码序列可以用于DNA构建体或表达盒中以在植物和细菌中转化和表达。组合物也包含转化了的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。本发明尤其提供了分离的δ-内毒素核酸分子。此外，本发明还涵盖该多核苷酸对应的氨基酸序列、以及特异地结合到这些氨基酸序列上的抗体。本发明尤其提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含编码SEQ ID NO：6-11所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或SEQ ID NO：1-5所示的核苷酸序列、以及它们的变体和片段。

Description

AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045: 来自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白及其用法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。本发明提供编码杀病虫害蛋白的新基因。这些蛋白质以及编码它们的核酸序列可以用于制备杀病虫害制剂和转基因抗病虫害植物的生产。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性产芽孢土壤细菌，其特征是能够产生晶状包涵体，该晶状包涵体对昆虫的某些目和种具有特异性毒性，但是对植物和其它非靶生物体无害。因此，包含苏云金芽孢杆菌菌株或其杀虫蛋白的组合物能够被用作环境可接受的杀虫剂，以控制农业昆虫害或多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)主要对鳞翅目(Lepidopteran)、双翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)昆虫的幼虫具有强效杀虫活性。这些蛋白对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨目(Acari)的害虫以及例如线形动物(Nemathelminthes)、扁形动物(Platyhelminthes)和肉足鞭毛动物(Sarcomastigorphora)等其它无脊椎动物目也显示出活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.In Advanced Engineered Pesticides，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)。这些蛋白起初主要根据其杀虫活性被分类为CryI至CryV。主要类别为鳞翅目特异的(I)、鳞翅目和双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)、以及线虫特异的(V)和(VI)。蛋白被进一步划分为亚家族；在每个家族中更为高度相关的蛋白被配给分部字母，例如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。在每一个分部中甚至更紧密相关的蛋白被命名为例如Cry1C1，Cry1C2等。

最近，提出了一个针对Cry基因的新的命名系统，该命名系统基于氨基酸序列的同源性而不是基于昆虫靶标的特异性(Crickmore等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。在新的分类系统中，每种毒素被指定一个唯一名称，该名称由第一等级(一个阿拉伯数字)、第二等级(一个大写字母)、第三等级(一个小写字母)和第四等级(另一个阿拉伯数字)合并而成。在新的分类系统中，以阿拉伯数字取代了罗马数字用于第一等级。序列一致性低于45％的蛋白质具有不同的第一等级，用于划分第二和第三等级的标准分别为78％和95％。

晶体蛋白在被昆虫吞食并在昆虫中肠中被溶解之前，不会显示出杀虫活性。被吞食的原毒素被昆虫消化道中的蛋白酶水解为活性毒素分子(

和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53：242-255)。该毒素结合到靶幼虫中肠中的顶端刷状缘受体上，并插入到顶端膜中形成离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。

δ-内毒素通常具有5个保守的序列区域和3个保守的结构域(见，例如de Maagd等(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构域由7个α螺旋组成，它涉及膜的插入和孔的形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的3个β折叠组成，结构域III由呈“果冻卷”形状的两个反平行β折叠组成(de Maagd等，2001，supra)。结构域II和III涉及受体的识别和结合，因此被认为是毒素特异性的决定因素。

除了δ-内毒素以外，还有7种其它已知的杀病虫害蛋白毒素类别。VIP1/VIP2毒素(见，例如美国专利5,770,696)是二元杀病虫害毒素，该毒素通过据认为涉及受体介导的内吞作用及随后的细胞毒性化的机制(这和其它二元(“A/B”)毒素的作用模式类似)，而对昆虫显示出强烈的活性。诸如VIP、C2、CDT、CST、或炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)水肿和致死毒素等A/B毒素最初通过“B”组分以单体形式的特异的、受体介导的结合，与靶细胞相互作用。这些单体随后形成同源七聚体。“B”七聚体-受体复合物随后起到一个对接平台的作用，该平台随后结合酶性“A”组分，并通过受体介导的内吞作用将“A”组分转移到细胞溶质中。一旦进入到细胞溶质中，“A”组分就会通过，例如G-肌动蛋白的ADP-核糖基化、或增加胞内环腺苷酸(cAMP)的水平，来抑制正常的细胞功能。见Barth等(2004)Microbiol Mol Biol Rev 68：373-402。

对基于苏云金芽孢杆菌的杀虫剂的密集应用已经导致在菜蛾(Plutellaxylostella)的田间种群中出现了抗性(Ferr é和Van Rie(2002)Annu.Rev.Entomol.47：501-533)。抗性最普遍的机制是毒素与其特异的中肠受体的结合减弱。这也可以赋予对共有相同受体的其它毒素的交叉抗性(Ferr é和Van Rie(2002))。

发明概述

本发明提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子抗病虫害抗性的组合物和方法。组合物包括编码δ-内毒素多肽序列的核酸分子、包含这些核酸分子的载体、以及包含这些载体的宿主细胞。组合物还包括该内毒素的多肽序列、以及抗该多肽的抗体。核苷酸序列可以被用于DNA构建体或表达盒中，用于在生物体(包括微生物和植物)中进行转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已经被设计成用于在生物体(包括，但不限于微生物或植物)中进行表达的合成序列。组合物也包括转化了的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。

本发明尤其提供了分离的、与δ-内毒素的核酸序列对应的核酸分子。此外，还包括该多核苷酸对应的氨基酸序列。本发明尤其提供了分离的核酸分子以及其变体和片段，其中该核酸分子包括编码SEQ ID NO：6-11之任一所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或SEQ ID NO：1-5或12-24之任一所示的核苷酸序列。本发明也包括与本发明的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或与本发明的序列杂交的核苷酸序列。

本发明的组合物和方法可以用于具有杀病虫害抗性的生物体(尤其是细菌和植物)的生产。这些生物体和来源于它们的组合物是农业上所需要的。本发明的组合物还可以用于产生改变了的或改进了的、具有杀病虫害活性的δ-内毒素蛋白，或用于检测产品或生物体中δ-内毒素蛋白或核酸的存在。

发明详述

本发明涉及用于调节生物体(尤其是植物或植物细胞)中的病害虫抗性的组合物和方法。该方法包括以编码本发明δ-内毒素蛋白的核苷酸序列转化生物体。尤其是，本发明的核苷酸序列可以用于产生具有杀病虫害活性的植物和微生物。因此，本发明提供了转化了的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物为苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素核酸和蛋白质。这些序列可以用于构建表达载体，用于随后转化目的生物体，作为探针用于分离其它δ-内毒素基因，以及用于通过本领域中已知的方法(例如结构域互换或DNA改组等)产生改变了的杀病虫害蛋白。这些蛋白可以用于控制或灭杀鳞翅类、鞘翅类、和线虫类害虫群体，以及用于生产具有杀病虫害活性的组合组。

“δ-内毒素”是指来源于苏云金芽孢杆菌的毒素蛋白或与该毒素蛋白具有同源性的蛋白，其中该毒素蛋白对一种或多种虫害具有有毒活性，所述虫害包括但不限于鳞翅目、双翅目和鞘翅目的成员或线形动物门的成员。在某些情况下，δ-内毒素蛋白已经从其它生物，包括双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)和日本甲虫芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)中被分离出来。δ-内毒素蛋白包括从本文公开的全长核苷酸序列推导出来的氨基酸序列、以及由于使用了可变下游起始位点或由于加工而比全长序列短的氨基酸序列，其中所述短氨基酸序列产生具有杀病虫害活性的较短蛋白。加工可以发生在表达该蛋白的生物体内，或发生在吞食了该蛋白的害虫体内。

在一些实施方案中，本文公开的序列与δ-内毒素蛋白具有同源性。δ-内毒素包括鉴别为cry1至cry53、cyt1和cyt2、以及Cyt样毒素的蛋白质。目前有超过250种已知的δ-内毒素，它们具有广泛的特异性和毒性。其扩展性列表见Crickmore等(1998)，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813，其定期的更新见Crickmore等(2003)“苏云金芽孢杆菌毒素命名系统”，www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index。

在其它实施方案中，本文涵盖的序列为MTX样序列。术语“MTX”在本领域中用于表示由球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)产生的一系列杀病虫害蛋白。这些蛋白中的第一个蛋白，在本领域通常被称为MTX1，是作为对蚊子具有毒性的伴孢晶体合成的。该晶体的主要成分为两个51和42kDa的蛋白。由于这两个蛋白的存在都是毒性所必需的，MTX1被视为“二元”毒素(Baumann等(1991)Microbiol.Rev.55：425-436)。

通过分析对不同球形芽孢杆菌菌株具有不同毒性，鉴别出了两类新MTX毒素。MTX2和MTX3代表两类独立但相关的显示杀病虫害活性的杀病虫害毒素。见，例如Baumann等(1991)Microbiol.Rev.55：425-436，就其全部内容并入本文作为参考。MTX2是100-kDa的毒素。最近，MTX3被鉴别为一种不同的毒素，尽管来源于球形芽孢杆菌的MTX3的氨基酸序列与球形芽孢杆菌SSII-1的MTX2毒素具有38％的相同性(Liu，等(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：2174-2176)。Mtx毒素可用于提高球形芽孢杆菌菌株的杀虫活性、以及控制蚊子群体中抗Bin毒素抗性的进化。

本发明提供了赋予杀病虫害活性的新的分离的核苷酸序列。还提供了δ-内毒素蛋白的氨基酸序列。来自该基因翻译的蛋白质允许细胞控制或杀死吞食它的病虫害。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明的一个方面涉及分离的或重组的核酸分子，它包括编码δ-内毒素蛋白和多肽或其生物学活性部分的核苷酸序列；以及涉及足以用作杂交探针来鉴别编码δ-内毒素的核酸的核酸分子。本文所使用的术语“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如，重组DNA、eDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)以及利用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选地为双链DNA。

本文所使用的“分离的”核酸序列(或DNA)是指不再存在于其天然环境中、而存在于例如体外或重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施方案中，“分离的”核酸不含在该核酸来源的生物体的基因组DNA中天然地位于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5′和3′端的序列)(优选地为蛋白质编码序列)。就本发明而言，“分离的”，当用于指核酸分子时，不包括分离的染色体。例如，在一些实施方案中，分离的编码δ-内毒素的核酸分子可以包含短于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的、在该核酸来源的细胞的基因组DNA中天然地位于该核酸分子侧翼的核苷酸序列。基本上不包含细胞物质的δ-内毒素蛋白包括其中非δ-内毒素蛋白(在本文中也被称为“污染蛋白质”)少于约30％、20％、10％或5％(以干重计算)的蛋白质制品。

编码本发明的蛋白质的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1-5所示的序列及其变体、片段和互补体。“互补体”是指与给定的核酸序列足够互补从而能够与该给定的核苷酸序列杂交而由此形成稳定的双链体的核酸序列。核苷酸序列编码的δ-内毒素蛋白的相应氨基酸序列如SEQ ID NO：6-11所示。

本发明也包括是编码δ-内毒素的核苷酸序列的片段的核酸分子。“片段”是指编码δ-内毒素蛋白的核苷酸序列的部分。核苷酸序列片段可编码δ-内毒素蛋白的生物学活性部分，或者它可以是能够在下面公开的方法中用作杂交探针或PCR引物的片段。为δ-内毒素核苷酸序列的片段的核酸分子可以包含至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350个连续核苷酸，或多达存在于本文所公开的编码δ-内毒素的全长核苷酸序列中的核苷酸数，这取决于预期的用途。“连续”核苷酸是指彼此紧邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段可以编码保留了δ-内毒素蛋白的生物学活性、并由此保留了杀病虫害活性的蛋白质片段。“保留活性”是指片段将具有δ-内毒素蛋白的至少30％、至少50％、至少70％、80％、90％、95％或更高的杀病虫害活性。确定杀病虫害活性的方法为本领域技术人员所熟知。见，例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；和Andrews等(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；和美国专利号5,743,477，所有文献就其全部内容并入本文作为参考。

编码本发明蛋白质的生物学活性部分的、编码δ-内毒素的核苷酸序列的片段将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100个连续氨基酸，或数目多达本发明的全长δ-内毒素蛋白中存在的氨基酸总数。在一些实施方案中，该片段是蛋白水解切割片段。例如，蛋白水解切割片段可以，与SEQ ID NO：6-11相比，在N-端或C-端有至少约100个氨基酸、约120、约130、约140、约150或约160个氨基酸被截去。在一些实施方案中，本文包括的片段缘于C-端结晶结构域的去除(例如，通过蛋白水解、或通过在编码序列中插入终止密码子)。

本发明优选的δ-内毒素蛋白由与SEQ ID NO：1-5的核苷酸序列足够相同的核苷酸序列编码。“足够相同”是指使用本文所描述的比对程序之一，采用标准参数，与参考序列相比较，具有至少约60％或65％的序列一致性、约70％或75％的序列一致性、约80％或85％的序列一致性、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员知道，考虑到密码子的简并性、氨基酸的相似性、阅读框的位置效应等，这些值可以被适当地调整，以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应的一致性。

为了确定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的百分比一致性，对序列进行比对以得到最佳的比较。两个序列之间的百分比一致性是序列所共有的相同位置的数量的函数(即，百分比一致性＝相同位置的数量/位置总数(例如，重叠的位置)×100)。在一个实施方案中，两个序列的长度相同。在另一个实施方案中，比较是跨参考序列的全长来进行的(例如，跨SEQ ID NO：1-5之一的全长，或跨SEQ ID NO：6-11之一的全长)。两个序列之间百分比一致性可以用与下面所描述的方法类似的方法来确定，其中可以允许或不允许空位。在计算百分比一致性时，典型地是计数精确匹配数。

可以使用数学算法来确定两个序列之间的百分比一致性。用于两个序列比较的数学算法的非限定性例子有Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法，该算法在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中改进。该算法被整合进Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLASTN和BLASTX程序中。可以采用BLASTN程序(分值＝100、字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以得到与本发明的δ-内毒素样核酸分子同源的核苷酸序列。可以采用BLASTX程序(分值＝50、字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以得到与本发明的δ-内毒素蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得空位比对以进行比较，可以采用Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所描述的GappedBLAST(在BLAST 2.0中)。可选择的是，可以采用PSI-Blast进行检测分子间距离关系的迭代搜索。见Altschul等(1997)同上引文。当采用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对也可以通过目测的方式人工进行。

另一个用于序列比较的数学算法的非限定性例子是ClustalW算法(Higgins等(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW比较序列并对氨基酸或DNA序列的整体进行比对，由此能提供关于整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法被用于几个可商业获取的DNA/氨基酸分析软件包中，例如Vector NTI程序包的ALIGNX模块(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。在利用ClustalW进行氨基酸序列比对后，可以评估氨基酸百分比一致性。一个用于分析ClustalW比对的软件程序的非限定性例子是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(Karl Nicholas)允许估计多个蛋白质之间氨基酸(或DNA)的相似性和一致性。另一个用于序列比较的数学算法的非限定性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS4：11-17的算法。该算法被整合进ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCGWisconsin遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)第10版(从Accelrys，Inc.，9685Scranton Rd.，San Diego，CA，USA获取)中的组件。当采用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120残基权重表、空位长度罚分为12、以及空位罚分为4来进行。

除非另有说明，使用GAP(版本10)(GAP(版本10)采用了Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3)：443-453中的算法)，采用如下参数，确定序列一致性或相似性：使用空位权重50、长度权重3、以及nwsgapdna.cmp打分矩阵来确定核苷酸序列的百分比一致性和相似性；使用空位权重8、长度权重2、以及BLOSUM62打分程序来确定氨基酸序列的百分比一致性或相似性。也可以使用与此相当的程序。“相当的程序”是指如下任何序列比较程序，该程序对于任何两个需进行比较的序列产生比对，该比对当与由GAP(版本10)产生的相应比对进行比较时具有相同的核苷酸残基匹配和相同的百分比序列一致性。本发明也包括变体核酸分子。编码δ-内毒素的核苷酸序列的“变体”包括编码本文公开的δ-内毒素蛋白但由于遗传密码简并性而存在保守差异的序列，以及如上所讨论的足够相同的序列。自然发生的等位基因变体可以利用熟知的分子生物学技术，例如以下所述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术，被鉴别出来。变体核苷酸序列也包括合成来源的核苷酸序列，该序列如下所讨论的通过例如采用定点诱变而产生，但仍然编码本发明公开的δ-内毒素蛋白。本发明包括的变体蛋白是具有生物学活性的，即，它们仍然拥有所需的天然蛋白的生物学活性，即，保留了杀病虫害活性。“保留活性”是指变体将具有天然蛋白的至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约80％的杀病虫害活性。用于测定杀病虫害活性的方法为本领域技术人员所熟知。见，例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；和Andrews等(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等(1985)J.of EconomicEntomology 78：290-293；以及美国专利号5,743,477，所有文献就其全部内容并入本文作为参考。

本领域技术人员还会理解，可以通过对本发明的核苷酸序列进行突变而引入改变，由此导致编码的δ-内毒素蛋白的氨基酸序列的改变，而不改变蛋白的生物学活性。因此，可以在本文公开的相应的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替换、添加或缺失，从而在编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸的替换、添加或缺失，由此产生分离的变体核酸分子。可以利用标准技术引入突变，这些技术例如定点诱变和PCR介导的诱变。本发明也包括这些变体核苷酸序列。

例如，可以对一个或多个预测的非必需氨基酸残基进行保守的氨基酸替换。“非必需”氨基酸残基是δ-内毒素蛋白的野生型序列中能够被改变而不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需要的。“保守的氨基酸替换”是指氨基酸残基被具有与其相似的侧链的氨基酸残基所取代。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

δ-内毒素通常具有5个保守的序列区域和3个保守的结构域(见例如，de Maagd等(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构域由7个α螺旋组成，它涉及膜的插入和孔的形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的3个β折叠组成，结构域III由呈“果冻卷”形状的两个反平行β折叠组成(de Maagd等，2001，同上引文)。结构域II和III涉及受体的识别和结合，因此被认为是毒素特异性的决定因素。

可以在非保守区域进行保留功能的氨基酸替换。通常，不对保守的氨基酸残基、或对位于保守基序(此处的残基对蛋白质活性是必需的)内的氨基酸残基进行此替换。保守的且可能为蛋白质活性所必需的残基的例子包括，例如，在本发明的氨基酸序列与已知的δ-内毒素序列的比对中在包含的所有蛋白质之间相同的残基。保守的但是可以允许保守氨基酸替换而仍然保留活性的残基的例子包括，例如，在本发明的氨基酸序列与已知的δ-内毒素序列的比对中在包括的所有蛋白质之间只具有保守替换的残基。然而，本领域技术人员将理解，具有功能的变体可以在保守残基中具有微小的保守或非保守的改变。

可选择的是，可以通过在全部或部分编码序列中随机地引入突变(例如通过饱和突变)来产生变体核酸序列，可以针对赋予δ-内毒素活性的能力来筛选所得的突变体，以鉴别保留了活性的突变体。进行突变以后，可以对所编码的蛋白质进行重组表达，并可采用标准的分析技术确定蛋白质的活性。

采用例如PCR、杂交等方法，可以鉴别出相应的δ-内毒素序列，该序列与本发明的序列具有实质上的一致性。见，例如Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)以及Innis，等(1990)PCRProtocols：A Guide to Methods和Applications(Academic Press，NY)。

在杂交方法中，可以用δ-内毒素核苷酸序列的全部或部分筛选cDNA或基因组文库。构建这种cDNA和基因组文库的方法在本领域中广为所知，并在Sambrook和Russell，2001，supra中得到了公开。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，可以利用例如32P等可检测的基团对其进行标记，或利用例如其它放射性同位素、荧光化合物、酶、或酶的辅助因子等任何其它可检测的标记物对其进行标记。用于杂交的探针可以根据本文所公开的已知的δ-内毒素编码核苷酸序列，通过标记合成的寡核苷酸来制备。还可以使用基于核苷酸序列或编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计的简并引物。探针典型地包含一个核苷酸序列区域，该核苷酸序列区域在严紧条件下，与本发明编码δ-内毒素的核苷酸序列或其片段或其变体中至少约12个、至少约25个、至少约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、或400个连续的核苷酸杂交。制备用于杂交的探针的方法在本领域中广为所知，并在Sambrook和Russell，2001，supra中得到了公开，在此并入本文作为参考。

例如，本文公开的整个δ-内毒素序列或其一个或多个部分可以被用作能够特异地与相应的δ-内毒素样序列和信使RNA杂交的探针。为了在各种条件下实现特异性杂交，探针包括独特的、优选地至少长约10个核苷酸、或至少约20个核苷酸的序列。探针可以被用于从所选择的生物体中以PCR扩增出相应的δ-内毒素序列。该技术可以被用于从期望的生物体中分离额外的编码序列，或用作诊断分析来确定一个生物体中编码序列的存在。杂交技术包括对涂板的DNA文库(噬菌斑或集落)的杂交筛选；见例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

序列的杂交可以在严紧条件下进行。“严紧条件”或“严紧杂交条件”是指在该条件下，探针与其靶序列杂交比与其它序列杂交具有可检测的更大程度(例如，至少2倍于背景)。严紧条件是序列依赖的且将随环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严紧性，与探针百分之百互补的靶序列可以被鉴别出来(同源探测)。可选择的是，可以对严紧条件进行调整以允许序列中一些错配，这样可以检测较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针在长度上不超过约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

典型地，严紧条件是：在pH值7.0至8.3、盐浓度低于约1.5M钠离子、典型地为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)、以及针对短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少约30℃和针对长探针(例如，多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严紧条件也可以通过添加诸如甲酰胺等去稳定剂来获得。示例性的低严紧条件包括用含有30％至35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液在37℃杂交，以及用1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)在50至55℃洗涤。示例性的中等严紧条件包括在40％至45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃杂交，以及在0.5X至1X SSC中在55至60℃洗涤。示例性的高严紧条件包括在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃杂交，以及在0.1X SSC中在60至65℃洗涤。可选择的是，洗涤缓冲液可以含有约0.1％至约1％的SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常约4至约12小时。

特异性典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可以根据Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284中的等式估计Tm值：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交液中甲酰胺的百分比，L为以碱基对计的杂交体的长度。Tm为50％的互补靶序列和完全匹配的探针杂交时的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配，Tm值减去约1℃；因此，为和具有期望的一致性的序列杂交，可以调整Tm、杂交和/或洗涤条件。例如，如果要寻找一致性≥90％的序列，Tm可以降低10℃。通常，严紧条件被选择为：对特定的序列及其互补序列，在规定的离子强度和pH值下，比热熔点(Tm)低约5℃。然而，严格的严紧条件可以采用在低于热熔点(Tm)1、2、3或4℃进行杂交和/或洗涤；中等严紧条件可以采用在低于热熔点(Tm)6、7、8、9或10℃下进行杂交和/或洗涤；低严紧条件可以采用在低于热熔点(Tm)11、12、13、14、15或20℃下进行杂交和/或洗涤。利用该公式、杂交和洗涤的组成以及期望的Tm，普通技术人员将理解，杂交和/或洗涤溶液的严紧性的变化是被固有地描述的。如果期望的错配程度导致Tm值低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC的浓度，借此可以使用较高的温度。关于核酸杂交的详尽指导见Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry和Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)；以及Ausubel等，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Chapter2(Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York)。见Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

分离的蛋白质及其变体和片段

本发明也包括δ-内毒素蛋白。“δ-内毒素蛋白”是指具有如SEQ IDNO：6-11所示的氨基酸序列的蛋白质。本发明也提供其片段、生物学活性部分、和变体，它们可以用于实施本发明的方法。“分离的蛋白质”用于指不再在其天然环境中存在的蛋白质，例如存在于体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。

“片段”或“生物学活性部分”包括包含与SEQ ID NO：6-11之任一所示的氨基酸序列足够相同的氨基酸序列并显示出杀病虫害活性的肽片段。δ-内毒素蛋白的生物学活性部分可以是例如长10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。该生物学活性部分可以通过重组技术来制备，并对其杀病虫害活性进行评估。用于测定杀病虫害活性的方法为本领域技术人员所熟知。见例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；和Andrews等(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等(1985)J.ofEconomic Entomology 78：290-293；以及美国专利号5,743,477，所有文献就其全部内容并入本文进行参考。如此所用，片段包含SEQ ID NO：6-11的至少8个连续氨基酸。然而，本发明还包括其它片段，例如蛋白质中长度大于约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300个氨基酸的任何片段。

“变体”是指该蛋白质或多肽具有与SEQ ID NO：6-11之任一的氨基酸序列约60％、65％、约70％、75％、约80％、85％、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。变体也包括在严紧条件下与SEQ ID NO：1-5所示的核酸分子或其互补体杂交的核酸分子所编码的多肽。变体包括由于突变而导致氨基酸序列不同的多肽。本发明包括的变体蛋白具有生物学活性，即它们仍然拥有所需的天然蛋白的生物学活性，即保留了杀病虫害活性。在一些实施方案中，变体具有改进的活性。用于测定杀病虫害活性的方法为本领域技术人员所熟知。见例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等(1985)J.of EconomicEntomology 78：290-293；以及美国专利号5,743,477，所有文献就其全部内容并入本文进行参考。

细菌基因，例如本发明的axmi基因，在开放阅读框起点附近往往具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始导致功能性蛋白质产生。这些起始密码子包括ATG密码子。然而，诸如芽孢杆菌等细菌也将密码子GTG识别为起始密码子，在GTG密码子起始翻译的蛋白质的第一个氨基酸为甲硫氨酸。此外，这些密码子中的哪个会被细菌天然利用，常不是先验确定的。因此，可以理解，可选甲硫氨酸密码子之一的使用也可能导致产生编码杀病虫害活性的δ-内毒素蛋白。这些δ-内毒素蛋白包含在本发明中并可以被用于本发明的方法中。

本发明也包括本发明的多肽或其变体或片段的抗体。制备抗体的方法为本领域技术人员所熟知(见例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY；美国专利号4,196,265)。

改变的或改进的变体

公认的，可以利用各种方法改变δ-内毒素的DNA序列，这些改变可以导致DNA序列编码的蛋白质具有的氨基酸序列异于本发明的δ-内毒素编码的氨基酸序列。蛋白质可以用各种方法进行改变，包括对SEQ IDNO：6-11所示的一个或多个氨基酸进行氨基酸的替换、缺失、截去和插入，包括多达约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约100个、约105个、约110个、约115个、约120个、约125个、约130或更多个氨基酸的替换、缺失或插入。

这种操作方法在本领域广为所知。例如，δ-内毒素蛋白的氨基酸序列变体可以通过DNA的突变而制备。也可以通过几种诱变形式之一和/或定向进化来实现。在某些方面，编码在氨基酸序列中的改变不实质性地影响蛋白的功能。这种变体将拥有期望的杀病虫害活性。然而，可以理解，δ-内毒素赋予杀病虫害活性的能力可以通过将此类技术应用于本发明的组合物上而得到提高。例如，可以在诸如XL-1Red(Stratagene)等在DNA复制过程中表现出高比率碱基错误掺入的宿主细胞中，表达δ-内毒素。在该菌株增殖后，可以分离δ-内毒素DNA(例如，通过提取质粒DNA、或通过PCR扩增以及将所得PCR片段克隆到载体中)，在非诱变菌株中培养δ-内毒素突变，并鉴定具有杀病虫害活性的突变了的δ-内毒素基因，例如通过进行测试杀病虫害活性的试验。通常，蛋白质被混合并用于饲喂试验。见例如，Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293。该试验包括使植物与一种或多种病虫害接触并测定植物存活和/或造成病虫害死亡的能力。导致毒性增加的突变的例子见Schnepf等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：775-806。

可选择的是，可以对许多蛋白质的蛋白序列在其氨基或羧基端进行序列变更而不实质性地影响活性。这可以包括利用现代分子方法引入的插入、缺失、或变更，这些方法例如PCR，包括通过在用于PCR扩增的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列来改变或延长蛋白质的编码序列的PCR扩增。可选择的是，添加的蛋白质序列可以包括整个蛋白编码序列，例如在本领域经常被用于产生蛋白质融合物的那些序列。这样的融合蛋白通常被用于(1)增强目的蛋白的表达)；(2)引入结合结构域、酶活性、或表位以利于蛋白纯化、蛋白检测、或本领域已知的其它实验用途；(3)引导蛋白质分泌或翻译到亚细胞器中，例如革兰氏阴性菌的周质间隙、或真核细胞的内质网，其中后一种情况通常会导致蛋白质的糖基化。

本发明的变体核苷酸和氨基酸序列也包括来自诱变和重组程序例如DNA改组的序列。在该程序中，一个或多个不同的δ-内毒素蛋白编码区可以被用于产生具有所需特性的新的δ-内毒素蛋白。采用该方式，可以从一群相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸文库，其中该群相关序列多核苷酸包含具有实质性序列一致性并可以进行体外或体内同源重组的序列区域。例如，利用该方法，可以对编码目的结构域的序列基序在本发明的δ-内毒素基因和其它已知的δ-内毒素基因之间进行改组，以得到编码具有改进目的性状(例如增强的杀虫活性)的蛋白质的新基因。用于该DNA改组的策略为本领域技术人员所知。见例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri等(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是另一种产生改变的δ-内毒素蛋白的机制。可以在δ-内毒素蛋白之间进行结构域II和III的交换，从而产生具有改良的杀病虫害活性或靶谱的杂合体或嵌合体毒素。产生重组蛋白以及对其进行杀病虫害活性测试的方法为本领域技术人员所熟知(见例如，Naimov等(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：5328-5330；de Maagd等(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：1537-1543；Ge等(1991)J.Biol.Chem.266：17954-17958；Schnepf等(1990)J.Biol.Chem.265：20923-20930；Rang等91999)Appl.Environ.Microbiol.65：2918-2925)。

载体

本发明的δ-内毒素序列可以以用于在目的植物中进行表达的表达盒形式提供。“植物表达盒”是指可以在植物细胞中导致蛋白质从开放阅读框表达的DNA构建体。典型地，其包含启动子和编码序列。通常，该构建体也将包含3’非翻译区。该构建体可以包含“信号序列”或“引导序列”以便利于肽的共翻译或翻译后转运到某些细胞内结构中，例如转运到叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体中。

“信号序列”是指已知或被猜测可以导致共翻译或翻译后跨细胞膜的肽转运的序列。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体中，和由此发生的一些糖基化。“引导序列”是指其翻译后产生的氨基酸序列足以引起肽链的共翻译转运至亚细胞器中的任何序列。因此，它包括通过运至内质网中、运至液泡、质体(包括叶绿体、线粒体等)而导致靶向转运和/或糖基化的引导序列。

“植物转化载体”是指有效转化植物细胞所必需的DNA分子。该分子可以由一个或多个植物表达盒组成，并可以组织成不止一个“载体”DNA分子。例如，双元载体是植物转化载体，它利用两个非连续的DNA载体来编码植物细胞转化所必需的所有顺式和反式功能(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。“载体”指被设计用于在不同宿主细胞之间实现转移的核酸构建体。“表达载体”指能够在外源细胞中掺入、整合和表达异源DNA序列或片段的载体。表达盒可以包括可操作地连接到本发明序列上的5′和3′调控序列。“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导该第二序列所对应的DNA序列的转录。通常，可操作地连接是指，所连接的核酸序列成为连续的，并且在需要连接两个蛋白编码序列时，是连续且在相同的阅读框中的。表达盒还可以包括至少一个待共转化到生物体中的额外基因。可选择的是，该额外基因可以在多个表达盒中提供。

“启动子”指起着指导下游编码序列转录的作用的核酸序列。启动子和其它转录与翻译调控核酸序列(也被称为“控制序列”)一起为目的DNA序列的表达所必需。

表达盒可以提供有多个限制性位点用于将δ-内毒素序列插入以置于调控区域的转录调控之下。

表达盒可以以5′至3′转录方向包括转录和翻译起始区(即启动子)、本发明的DNA序列、以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止子区域)。启动子可以相对植物宿主和/或本发明的DNA序列来说是天生的或同源的、或外来的或异源的。此外，启动子既可以是天然序列也可以是合成序列。启动子相对于植物宿主来说是“天生的”或“同源的”，意思是启动子存在于其待导入的该天然植物中。启动子相对本发明的DNA序列来说是“外来的”或“异源的”，意思是启动子对于该可操作地连接的本发明DNA序列不是天生的或天然存在的启动子。

终止区可以是天生与转录起始区一起的，可以是天生与该可操作地连接的目的DNA序列一起的，可以是植物宿主天生的、或可以源于其它来源(即，相对于启动子、目的DNA序列、植物宿主、或其任何组合来说是外来或异源的)。方便的终止区可以获自根癌农杆菌的Ti质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶的终止区。也见Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等(1990)Gene 91：151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

基因可以酌情被优化以增强其在转化的宿主细胞中的表达。即，可以使用宿主细胞偏好的密码子合成基因以提高其表达，或可以以宿主偏好密码子使用频率来使用密码子进行基因合成。通常基因的GC含量将会增加。宿主偏好密码子使用的讨论见例如，Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11。在本领域中可以获得合成植物偏好的基因的方法。见例如，美国专利号5,380,831，和5,436,391，以及Murray等(1989)NucleicAcids Res.17：477-498，在此引入本文作为参考。

在一个实施方案中，δ-内毒素靶向叶绿体进行表达。以该方式，当δ-内毒素不直接插入到叶绿体中时，表达盒可以额外包含编码转运肽的核酸，以引导δ-内毒素达到叶绿体。这类转运肽为本领域所知。见例如，VonHeijne等(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等(1986)Science 233：478-481。

可以根据植物细胞核和叶绿体细胞器之间在密码子使用上的差异，对待定位到叶绿体的δ-内毒素基因进行优化以在叶绿体中表达。在该方法中，可以使用叶绿体偏好密码子合成目的核酸。见例如，美国专利号5,380,831，在此引入作为参考。

植物转化

本发明的方法涉及将核苷酸构建体导入到植物中。“导入”是指以核苷酸构建体可以进入植物细胞内部的方式向植物呈送核苷酸构建体。本发明的方法不需要使用向植物导入核苷酸构建体的特殊方法，只需要核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部。用于向植物导入核苷酸构建体的方法为本领域所熟知，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、和病毒介导的方法。

“植物”是指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指，该植物已经在植物细胞中掺入或整合了外来核酸序列或DNA片段。该核酸序列包括外源的或在未转化植物细胞中不存在的核酸序列，以及可以是内源的或存在于未转化植物细胞中的核酸序列。“异源的”通常是指核酸序列并非包含其的细胞或天然基因组的一部分所内生的、其是通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微粒发射等而已经加入到细胞中的。

本发明的转基因植物表达本文公开的一个或多个杀病虫害序列。在各实施方案中，转基因植物还包含一个或多个额外的抗虫基因，例如，一个或多个控制鞘翅目昆虫、鳞翅目昆虫、异翅目昆虫、或线虫类害虫的额外基因。本领域技术人员可以理解，转基因植物可以包含赋予感兴趣的农艺性状的任何基因。

可以利用本领域几种已知的技术之一进行植物细胞的转化。可以对本发明的δ-内毒素基因进行修饰以获得或增强在植物细胞中的表达。典型地，表达该蛋白的构建体包含驱动基因转录的启动子、以及允许转录终止和多聚腺苷酸化的3′非翻译区。组装这类构建体的方法为本领域所熟知。在某些情况下，可能有用的是，对基因进行改造以使所得肽是可以分泌的，或以其它方式在植物细胞中靶向。例如，可以对基因进行改造使其包含促进肽向内质网转移的信号肽。也可以优选地对植物表达盒进行改造使其包含内含子，以便内含子的mRNA加工为表达所需。

典型地，“植物表达盒”将被插入到“植物转化载体”中。该植物转化载体可以由一个或多个实现植物转化所需的DNA载体组成。例如，在本领域中的常规实践是利用由一个以上的连续DNA片段构成的植物转化载体。在本领域中这些载体通常被称为“双元载体”。双元载体以及载体和辅助质粒被最常用于农杆菌介导的转化，其中需要实现有效转化的DNA区段非常长、复杂性非常高，因而，使功能分开在分开的不同DNA分子上是有利的。双元载体典型地包含：含有T-DNA转移所需的顺式作用序列(例如左边界和右边界)、选择标记(经工程化后能够在植物细胞中表达)、以及“目的基因”(经工程化后能够在需要由其产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)的质粒载体。该质粒载体上也存在细菌复制所需的序列。顺式作用序列以允许向植物细胞中有效转移并在植物中表达的方式被排布。例如，将选择标记基因和δ-内毒素置于左右边界之间。通常，第二质粒载体包含介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。该质粒通常包含毒力功能(Vir基因)，这允许农杆菌感染植物细胞、并通过在边界序列进行切割和vir介导的DNA转移而实现DNA的转移，如在本领域所知的(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science5：446-451)。有几类农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以被用于植物转化。在采用例如微粒发射、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等其它方法进行植物转化时，不需要该第二质粒载体。

通常，植物转化方法包括将异源DNA转移到靶植物细胞(例如，未成熟或成熟胚、悬浮培养物、未分化愈伤组织、原生质体等)中去，随后进行最大阈值水平的合适选择(取决于选择标记基因)，以从未转化的细胞群体中回收转化了的植物细胞。外植体通常被转移到新鲜提供的相同培养基上按常规方法培养。其后，转化的细胞在添加有最大阈值水平的筛选试剂的再生培养基上分化成芽。然后将芽转移到选择性生根培养基，使其再生成带根的芽或小植株。转基因小植株随后生长至成熟植株并产生可育的种子(例如Hiei等(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等(1996)Nature Biotechnology 14：745-750)。外植体通常被转移到新鲜提供的相同培养基上按常规方法培养。用于产生转基因植物的技术和方法的一般说明见Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13：219-239和Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120。由于转化的材料包含许多细胞；转化的和未转化的细胞都存在于任何一块受试目标愈伤组织或组织或细胞团中。杀死非转化细胞并允许转化的细胞增殖的能力将导致转化的植物培养物。常常，除去非转化细胞的能力是快速回收转化的植物细胞和成功再生转基因植株中的限制因素。

转化的程序及用于将核苷酸序列导入植物中的程序可因转化所靶向的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而不同。转基因植物的产生可以用以下几种方法之一来进行，包括但不限于：显微注射、电穿孔、直接基因转移、利用农杆菌向植物细胞中导入异源DNA(农杆菌介导的转化)、以附着于微粒上的异源外来DNA轰击植物细胞、弹道微粒加速、气溶胶束转化(美国公布申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公布号WO 91/00915；美国公布申请号2002015066)、Lec1转化、以及各种其它非粒子直接介导的转移DNA的方法。

叶绿体转化方法为本领域所知。见例如，Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。该方法依赖基因枪递送包含选择标记的DNA以及通过同源重组使该DNA靶向质体的基因组。此外，质体转化可以通过组织偏好地表达核编码的质体定向的RNA聚合酶来反式激活质粒所携带的沉默的转基因而进行。该系统已于McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中被报道。

在异源的外来DNA整合进植物细胞中以后，在培养基中应用最大阈值水平的适当筛选杀死未转化细胞、分离并通过定期向新鲜培养基进行转移来增殖在该筛选处理下存活的推定转化了的细胞。通过继续传代和施加适当的筛选进行攻击，从而鉴别并增殖转化有质粒载体的细胞。然后，可以利用分子和生物学方法确认目的异源基因已经整合到转基因植物的基因组中。

可以按照常规方法将转化了的细胞培养成植株。见例如，McCormick等(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可以对这些植株进行种植，以相同的转化株或不同株系进行授粉，并鉴别组成型表达该期望表型特征的杂交种。可以生长两代或更多代以保证该期望表型特征的表达得到稳定的维持和遗传，随后收获种子以确保已经获得了期望表型特征的表达。通过该方法，本发明提供转化的种子(也被称为“转基因种子”)，该种子含有稳定整合到其基因组中的本发明的核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)。

植物转化的评估

在异源的外来DNA导入到植物细胞中后，可以用各种方法对异源基因的转化和在植物基因组中的整合进行验证，这些方法例如对与整合基因相关的核酸、蛋白质和代谢物的分析。

PCR分析是在移栽至土壤中前在较早期筛选存在整合基因的转化的细胞、组织或芽的一种快速方法(Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。使用对目的基因或农杆菌载体背景等特异的寡核苷酸引物进行PCR。

植物转化可以通过对基因组DNA的southern印迹分析来进行验证(Sambrook和Russell，2001，supra)。通常，从转化体中提取总DNA，以合适的限制性酶进行消化，以琼脂糖凝胶进行分级分离后向硝酸纤维素膜或尼龙膜进行转移。然后按照标准技术(Sambrook和Russell，2001，supra)，膜或“印迹”用例如放射性同位素32P标记的目标DNA片段探测，从而对所导入的基因在植物基因组中的整合进行验证。

在Northern印迹分析中，按照本领域常规使用的标准程序(Sambrook和Russell，2001，supra)，从转化体的特定组织提取RNA，以甲醛琼脂糖凝胶进行分级分离，并印迹到尼龙滤膜上。以本领域已知的方法(Sambrook和Russell，2001，supra)，通过将滤膜与来源于δ-内毒素的放射性探针杂交，对δ-内毒素编码RNA的表达进行检测。

可以对转基因植物进行Western印迹、生物化学分析等，利用与存在于δ-内毒素蛋白中的一个或多个表位相结合的抗体，按照标准的程序(Sambrook和Russell，2001，supra)来确认δ-内毒素基因编码的蛋白质的存在。

在植物中的杀病虫害活性

在本发明的另一方面，可以产生表达具有杀病虫害活性的δ-内毒素的转基因植物。例如上述方法可以用于产生转基因植物，然而产生转基因植物细胞的方法不是本发明的关键所在。例如农杆菌介导的转化、生物轰击转化、以及非粒子介导的方法等在本领域已知或被描述的方法都可以被实验者任意选择使用。可以利用例如愈伤组织的转化、筛选转化了的愈伤组织、以及从转基因愈伤组织再生可育植株等本领域所描述的普通方法，分离表达δ-内毒素的植株。在此过程中，可以利用任何基因作为选择标记，只要其在植物细胞中的表达可以赋予鉴别或选择转化了的细胞的能力。

许多标记已经被开发用于植物细胞，例如对氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等的抗性。其它所编码的产物涉及叶绿体新陈代谢的基因也可以被用作选择标记。例如，对草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮等植物除草剂提供抗性的基因可以特别有用。这些基因已被报道(Stalker等(1985)J.Biol.Chem.263：6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；以及Sathasivan等(1990)Nucl.Acids Res.18：2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。此外，本文所公开的基因可被用作评估细菌或植物细胞转化的标记。检测植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、以及胚或其后代中转基因的存在的方法为本领域技术人员所熟知。在一个实施方案中，通过测试杀病虫害活性来检测转基因的存在。

可以对表达δ-内毒素的可育植株进行杀病虫害活性的测试，选择表现最佳活性的植株用于进一步的繁殖。在本领域可以获得分析对病虫害的活性的方法。通常，将蛋白质混合并用于饲喂试验中。见例如Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293。

本发明可被用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的例子包括但不限于：玉米、高粱、小麦、向日葵、西红柿、十字花科植物、辣椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜、芸薹属植物、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括但不限于：西红柿、莴苣、青豆、利马豆、豌豆，以及黄瓜、哈密瓜和甜瓜等甜瓜属(Curcumis)的植物。观赏植物包括但不限于：杜鹃花、绣球属植物、木槿、玫瑰、郁金香、黄水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选地，本发明的植物为作物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、西红柿、十字花科植物、辣椒、土豆、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等)。

在病虫害控制中的应用

利用包含本发明的核苷酸序列或其变体的株系进行杀病虫害控制或将其它生物体改造为杀病虫害剂的常规方法为本领域所知。见例如美国专利号5,039,523和EP 0480762A2。

包含本发明的核苷酸序列或其变体的芽孢杆菌菌株、或经遗传修饰后包含杀病虫害基因和蛋白的微生物可以被用于防止农作物和其产品遭受病虫害。在本发明的一个方面，产毒素(杀病虫害剂)的生物体的完整(即未裂解的)细胞，用在细胞被施用到目标病害虫环境中时能够延长细胞中产生的毒素的活性的试剂，进行处理。

可选择的是，通过向细胞宿主中导入δ-内毒素基因来产生杀病虫害剂。δ-内毒素基因的表达直接或间接地导致细胞内杀病虫害剂的产生和维持。在本发明的一个方面，随后于在细胞被施用到目标病害虫环境中时能够延长细胞中产生的毒素的活性的条件下，处理这些细胞。所得到的产物保持毒素的毒性。可以将这些自然囊化的杀病虫害剂按照常规技术制剂化，以施用于目标病害虫栖息的环境中，例如土壤、水以及植物的叶片。见例如EPA 0192319及其中引用的参考文献。可选择的是，可以将表达本发明的基因的细胞制剂化以允许所获得的材料可被用作杀病虫害剂。

杀病虫害组合物

本发明的活性成分通常以组合物的形式来施用，并可以联合其它化合物同时地或依次地被施用到需要进行处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀病虫害皂、休眠油、高分子材料、和/或允许在单次施用制剂后实现向目标区域的长期给药的缓释或可生物降解的载体制剂。它们也可以是选择性除草剂、化学杀病虫害剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀害虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中的几种的混合物，如果需要的话，联合在制剂领域中通常使用的其它农用可接受的载体、表面活性剂或促进施用的辅助剂。合适的载体和辅助剂可以是固态的或液态的，对应于通常用于制剂工艺中的物质，例如，自然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、黏合剂或肥料。同样，这些制剂也可以被制作成可食用的“诱饵”或被制作成病害虫的“诱捕器”以使杀病虫害制剂可以被目标病害虫进食或摄食。

本发明的活性组分或包含至少一种本发明细菌菌株所产生的杀病虫害蛋白的本发明农用化学组合物的施用方法包括，叶施用、种衣和土壤施用。施用次数和施用频率取决于相应害虫的侵袭强度。

组合物可以被配制成粉(powder)、粉末(dust)、小球(pellete)、颗粒(granule)、喷剂、乳剂、胶体、溶液等，并可以通过常规方法例如脱水、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉淀、或浓缩，处理包含多肽的细胞的培养物来制备。在所有这类包含至少一种该杀病虫害多肽的组合物中，多肽可以以按重量计约1％到约99％的浓度存在。

使用本发明的方法可以在给定区域内杀灭杀鳞翅目、鞘翅目或线虫类病虫害或减少病虫害的数量，或者可以预防性应用到环境区域以防止易感病虫害的侵袭。优选地，病虫害吞食或接触杀病虫害有效量的多肽。“杀病虫害有效量”是指能够导致至少一种病虫害死亡或明显降低病害虫的生长、摄食或正常的生理发育的杀病虫害剂的量。该量是变化的，取决于因素例如需被控制的具体目标病虫害，需进行处理的具体环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件，具杀病虫害效应的多肽组合物的施用方法、频率、浓度、稳定性和量。制剂也可依气候条件、环境因素、和/或施用频率和/或病害虫侵袭的严重度的不同而变化。

所描述的杀病虫害组合物可以通过用期望的农业可接受的载体配制细菌细胞、晶体和/或孢子悬液、或分离的蛋白质组分而制成。可以在施用前以适当的方法配制组合物，例如冻干、冷冻干燥、脱水，或于水性载体、介质、或合适稀释剂如盐水或其它缓冲液中。所配制的组合物的形式可以是粉末或粒状材料、或悬浮于油(植物油或矿物油)或水或油/水乳状液中、或是可湿性粉剂、或与任何其它适于农用的载体材料组合。合适的农用载体可以是固态或液体的，为本领域所熟知。术语“农业可接受的载体”包括常用于杀病虫害制剂技术中的所有辅助剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、黏合剂等；这些都为杀病虫害制剂领域的技术人员所熟知。制剂可以和一种或多种固体或液体辅助剂混合，可以用各种方法来进行制备，例如用常规的配制技术，将杀病虫害组合物和合适的辅助剂均匀地混合、掺混和/或研磨。合适的制剂和施用方法见美国专利号6,468,523，在此并入本文作为参考。

也可以用一种或多种化学组合物处理植物，包括一种或多种除草剂、杀虫剂或杀真菌剂。代表性的化学组合物包括：水果/蔬菜除草剂：阿特拉津(Atrazine)、除草定(Bromacil)、敌草隆(Diuron)、草甘膦(Glyphosate)、利谷隆(Linuron)、嗪草酮(Metribuzin)、西玛津(Simazine)、氟乐灵(Trifluralin)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、草铵膦(Glufosinate)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron，Gowan)、百草枯(Paraquat)、戊炔草胺(Propyzamide)、稀禾定(Sethoxydim)、氟丙嘧草酯(Butafenacil)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron)、Indaziflam；水果/蔬菜杀虫剂：涕灭威(Aldicarb)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuriengiensis)、甲奈威(Carbaryl)、克百威(Carbofuran)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、二嗪农(Diazinon)、马拉硫磷(Malathion)、阿维菌素(Abamectin)、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯(Cyfluthrin/beta-cyfluthrin)、高氰戊菊酯(Esfenvalerate)、λ-氯氟氰菊酯(Lambda-cyhalothrin)、灭螨醌(Acequinocyl)、联苯肼酯(Bifenazate)、甲氧苯酰肼(Methoxyfenozide)、双苯氟脲(Novaluron)、环虫酰肼(Chromafenozide)、噻虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinotefuran)、嘧螨酯(Fluacrypyrim)、唑虫酰胺(Tolfenpyrad)、噻虫胺(Clothianidin)、螺螨酯(Spirodiclofen)、γ-氯氟氰菊酯(Gamma-cyhalothrin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、艾克敌(Spinosad)、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、Cyazypyr、Spinoteram、杀铃脲(Triflumuron)、螺虫乙酯(Spirotetramat)、吡虫啉(Imidacloprid)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、硫双威(Thiodicarb)、氰氟虫腙(Metaflumizone)、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)、丁氟螨酯(Cyflumetofen)、Cyanopyrafen、吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、Spinotoram、硫双威(Thiodicarb)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、甲硫威(Methiocarb)、因灭汀(Emamectin-benzoate)、茚虫威(Indoxacarb)、Fozthiazate、克线磷(Fenamiphos)、硫线磷(Cadusaphos)、吡丙醚(Pyriproxifen)、杀螨锡(Fenbutatin-oxid)、噻螨酮(Hexthiazox)、灭多威(Methomyl)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；水果 /蔬菜杀真菌剂：多菌灵(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、EBDCs、硫磺(Sulphur)、甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、霜脲氰(Cymoxanil)、氟啶胺(Fluazinam)、乙磷铝(Fosetyl)、异菌脲(Iprodione)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、甲霜灵(Metalaxyl/mefenoxam)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、噻唑菌胺(Ethaboxam)、异丙菌威(Iprovalicarb)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、环酰菌胺(Fenhexamid)、恶咪唑延胡索酸酯(Oxpoconazole fumarate)、氰霜唑(Cyazofamid)、咪唑菌酮(Fenamidone)、苯酰菌胺(Zoxamide)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、唑菌胺酯(Pyraclostrobin)、环菌胺(Cyflufenamid)、吡菌酰胺(Boscalid))；谷类作物除草剂：异丙隆(Isoproturon)、溴苯腈(Bromoxynil)、碘草腈(Ioxynil)、Phenoxies、氯磺隆(Chlorsulfuron)、炔草酯(Clodinafop)、禾草灵(Diclofop)、吡氟草胺(Diflufenican)、精恶唑禾草灵(Fenoxaprop)、双氟磺草胺(Florasulam)、氯氟吡氧乙酸(Fluroxypyr)、甲磺隆(Metsulfuron)、醚苯磺隆(Triasulfuron)、氟酮磺隆(Flucarbazone)、碘甲磺隆(Iodosulfuron)、丙苯磺隆(Propoxycarbazone)、氟吡草胺(Picolinafen)、甲磺胺磺隆(Mesosulfuron)、氟丁酰草胺(Beflubutamid)、草吡唑(Pinoxaden)、酰嘧磺隆(Amidosulfuron)、甲噻磺隆(Thifensulfuron)、苯磺隆(Tribenuron)、氟啶嘧磺隆(Flupyrsulfuron)、磺酰磺隆(Sulfosulfuron)、磺酰草吡唑(Pyrasulfotole)、甲氧磺草胺(Pyroxsulam)、氟噻草胺(Flufenacet)、肟草酮(Tralkoxydim)、Pyroxasulfon；谷类 作物杀真菌剂：多菌灵(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、环唑醇(Cyproconazole)、嘧菌环胺(Cyprodinil)、丁苯吗啉(Fenpropimorph)、氟环唑(Epoxiconazole)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、喹氧灵(Quinoxyfen)、戊唑醇(Tebuconazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、硅氟唑(Simeconazole)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、唑菌胺酯(Pyraclostrobin)、甲氧菌平(Dimoxystrobin)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、氟嘧菌酯(Fluoxastrobin)；谷类作物杀 虫剂：乐果(Dimethoate)、λ-氯氟氰菊酯(Lambda-cyhalothrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、α-氯氰菊酯(alpha-Cypermethrin)、β-氟氯氰菊酯(β-cyfluthrin)、联苯菊酯(Bifenthrin)、吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、Clorphyriphos、甲胺磷(Metamidophos)、亚砜吸磷(Oxidemethon-methyl)、抗蚜威(Pirimicarb)、甲硫威(Methiocarb)；玉米除草剂：阿特拉津(Atrazine)、甲草胺(Alachlor)、溴苯睛(Bromoxynil)、乙草胺(Acetochlor)、麦草畏(Dicamba)、氯草啶(Clopyralid)、S-噻吩草胺(S-Dimethenamid)、草铵膦(Glufosinate)、草甘膦(Glyphosate)、异恶唑草酮(Isoxaflutole)、精异丙甲草胺(S-Metolachlor)、甲基磺草酮(Mesotrione)、烟嘧磺隆(Nicosulfuron)、氟嘧磺隆(Primisulfuron)、玉嘧磺隆(Rimsulfuron)、磺草酮(Sulcotrione)、甲酰胺磺隆(Foramsulfuron)、吡草磺(Topramezone)、Tembotrione、嘧啶肟草醚(Saflufenacil)、酮脲磺草吩酯(Thiencarbazone)、氟噻草胺(Flufenacet)、Pyroxasulfon；玉米 杀虫剂：克百威(Carbofuran)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、联苯菊酯(Bifenthrin)、氟虫腈(Fipronil)、吡虫啉(Imidacloprid)、λ-氯氟氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、七氟菊酯(Tefluthrin)、特丁硫磷(Terbufos)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、可尼丁(Clothianidin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、杀铃脲(Triflumuron)、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、硫双威(Thiodicarb)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、联苯菊酯(Bifenthrin)、虱螨脲(Lufenuron)、杀铃脲(Triflumoron)、七氟菊酯(Tefluthrin)、丁基嘧啶磷(Tebupirimphos)、乙虫清(Ethiprole)、Cyazypyr、噻虫啉(Thiacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、阿维菌素(Avermectin)、甲硫威(Methiocarb)、螺螨酯(Spirodiclofen)、螺虫乙酯(Spirotetramat)；玉米杀真菌剂：种衣酯(Fenitropan)、福美双(Thiram)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、戊唑醇(Tebuconazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin))；水稻除草剂：丁草胺(Butachlor)、敌稗(Propanil)、四唑嘧磺隆(Azimsulfuron)、苄嘧磺隆(Bensulfuron)、氰氟草酯(Cyhalofop)、香草隆(Daimuron)、四唑酰草胺(Fentrazamide)、唑吡嘧磺隆(Imazosulfuron)、苯噻草胺(Mefenacet)、去稗安(Oxaziclomefone)、吡嘧磺隆(Pyrazosulfuron)、稗草畏(Pyributicarb)、二氯喹啉酸(Quinclorac)、杀草丹(Thiobencarb)、茚草酮(Indanofan)、氟噻草胺(Flufenacet)、四唑酰草胺(Fentrazamide)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron)、去稗安(Oxaziclomefone)、苯并双环酮(Benzobicyclon)、环酯草醚(Pyriftalid)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、双草醚(Bispyribac)、炔恶草酮(Oxadiargyl)、乙氧磺隆(Ethoxysulfuron)、丙草胺(Pretilachlor)、甲基磺草酮(Mesotrione)、Tefuryltrione、恶草酮(Oxadiazone)、精恶唑禾草灵(Fenoxaprop)、Pyrimisulfan；水 稻杀虫剂：二嗪农(Diazinon)、杀螟硫磷(Fenitrothion)、仲丁威(Fenobucarb)、久效磷(Monocrotophos)、丙硫克百威(Benfuracarb)、噻嗪酮(Buprofezin)、呋虫胺(Dinotefuran)、氟虫腈(Fipronil)、吡虫啉(Imidacloprid)、异丙威(Isoprocarb)、噻虫啉(Thiacloprid)、环虫酰肼(Chromafenozide)、噻虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinotefuran)、可尼丁(Clothianidin)、乙虫清(Ethiprole)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、啶虫脒(Acetamiprid)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、Cyazypyr、艾克敌(Spinosad)、Spinotoram、因灭汀(Emamectin-Benzoate)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、毒死蜱(Chlorpyriphos)、杀螟丹(Cartap)、甲胺磷(Methamidophos)、醚菊酯(Etofenprox)、三唑磷(Triazophos)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威(Carbofuran)、丙硫克百威(Benfuracarb)；水稻杀真菌剂：甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、环丙酰菌胺(Carpropamid)、敌瘟磷(Edifenphos)、嘧菌腙(Ferimzone)、异稻瘟净(Iprobenfos)、稻瘟灵(Isoprothiolane)、戊菌隆(Pencycuron)、噻菌灵(Probenazole)、咯喹酮(Pyroquilon)、三环唑(Tricyclazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、双氯氰菌胺(Diclocymet)、氰菌胺(Fenoxanil)、硅氟唑(Simeconazole)、噻酰菌胺(Tiadinil)；棉花除草剂：敌草隆(Diuron)、伏草隆(Fluometuron)、甲基胂酸钠(MSMA)、乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)、扑草净(Prometryn)、氟乐灵(Trifluralin)、氟唑草酮(Carfentrazone)、烯草酮(Clethodim)、丁基吡氟禾草灵(Fluazifop-butyl)、草甘膦(Glyphosate)、氟草敏(Norflurazon)、二甲戊乐灵(Pendimethalin)、嘧草硫醚(Pyrithiobac-sodium)、三氟啶磺隆(Trifloxysulfuron)、得杀草(Tepraloxydim)、草铵膦(Glufosinate)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、赛苯隆(Thidiazuron)；棉花杀虫剂：乙酰甲胺磷(Acephate)、涕灭威(Aldicarb)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、马拉硫磷(Malathion)、久效磷(Monocrotophos)、阿维菌素(Abamectin)、啶虫脒(Acetamiprid)、因灭汀(EmamectinBenzoate)、吡虫啉(Imidacloprid)、茚虫威(Indoxacarb)、λ氯氟氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、艾克敌(Spinosad)、硫双威(Thiodicarb)、γ氟氯氰菊酯(Gamma-Cyhalothrin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、啶虫丙醚(Pyridalyl)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、杀铃脲(Triflumuron)、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、β氟氯氰菊酯(Beta-Cyfluthrin)、螺虫乙酯(Spirotetramat)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、Cyazypyr、艾克敌(Spinosad)、Spinotoram、γ氟氯氰菊酯(gamma Cyhalothrin)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威(Thiodicarb)、阿维菌素(Avermectin)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、啶虫丙醚(Pyridalyl)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)、丙溴磷(Profenophos)、三唑磷(Thriazophos)、硫丹(Endosulfan))；棉花杀真菌剂：氯唑灵(Etridiazole)、甲霜灵(Metalaxyl)、五氯硝基苯(Quintozene))；大豆除草剂：甲草胺(Alachlor)、灭草松(Bentazone)、氟乐灵(Trifluralin)、氯嘧磺隆(Chlorimuron-Ethyl)、氯酯磺草胺(Cloransulam-Methyl)、精恶唑禾草灵(Fenoxaprop)、氟黄胺草醚(Fomesafen)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、草甘膦(Glyphosate)、甲氧咪(Imazamox)、灭草喹(Imazaquin)、咪草烟(Imazethapyr)、精异丙甲草胺(S-Metolachlor)、嗪草酮(Metribuzin)、二甲戊乐灵(Pendimethalin)、得杀草(Tepraloxydim)、草铵膦(Glufosinate)；大豆杀虫剂：λ氯氟氰菊酯(Lambda-cyhalothrin)、灭多威(Methomyl)、对硫磷(Parathion)、硫双灭多威(Thiocarb)、吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、Cyazypyr、艾克敌(Spinosad)、Spinotoram、因灭汀(Emamectin-Benzoate)、氟虫腈(Fipronil)、乙虫清(Ethiprole)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、β氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、γ-和λ-氟氯氰菊酯(gamma and lambda Cyhalothrin)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯(Spirotetramat)、螺螨酯(Spinodiclofen)、杀铃脲(Triflumuron)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、硫双威(Thiodicarb)、β-氟氯氰菊酯(beta-Cyfluthrin))；大豆杀真菌 剂：嘧菌酯(Azoxystrobin)、环唑醇(Cyproconazole)、氟环唑(Epoxiconazole)、粉唑醇(Flutriafol)、唑菌胺酯(Pyraclostrobin)、戊唑醇(Tebuconazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、氟醚唑(Tetraconazole))；甜菜除草剂：氯草敏(Chloridazon)、甜菜安(Desmedipham)、乙氧呋草黄(Ethofumesate)、甜安宁(Phenmedipham)、野麦畏(Triallate)、氯草啶(Clopyralid)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、环草定(Lenacil)、苯嗪草酮(Metamitron)、氯甲喹啉酸(Quinmerac)、噻草酮(Cycloxydim)、氟胺磺隆(Triflusulfuron)、得杀草(Tepraloxydim)、精喹禾灵(Quizalofop)；甜菜杀虫剂：吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、溴氰菊脂(Deltamethrin)、β氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、γ/λ三氟氯氰菊酯(gamma/lambda Cyhalothrin)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯(Tefluthrin)、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、Cyaxypyr、氟虫腈(Fipronil)、克百威(Carbofuran)；油菜除草剂：二氯吡啶酸(Clopyralid)、禾草灵(Diclofop)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、草铵膦(Glufosinate)、草甘膦(Glyphosate)、氯吡草胺(Metazachlor)、氟乐灵(Trifluralin)、胺苯磺隆(Ethametsulfuron)、氯甲喹啉酸(Quinmerac)、精喹禾灵(Quizalofop)、烯草酮(Clethodim)、得杀草(Tepraloxydim))；油 菜杀真菌剂：嘧菌酯(Azoxystrobin)、多菌灵(Carbendazim)、咯菌腈(Fludioxonil)、异菌脲(Iprodione)、咪鲜安(Prochloraz)、乙烯菌核利(Vinclozolin))；油菜杀虫剂：克百威(Carbofuran)、有机磷酸酯(Organophosphates)、拟除虫菊酯(Pyrethroids)、噻虫啉(Thiacloprid)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、吡虫啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、β-氟氯氰菊酯(ββ-Cyfluthrin)、γ/λ三氟氯氰菊酯、氟胺氰菊酯(tau-Fluvaleriate)、乙虫清(Ethiprole)、艾克敌(Spinosad)、Spinotoram、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、氯虫酰胺(Rynaxypyr)、Cyazypyr、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

“病虫害”(pest)包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫害包括选自以下目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鞘翅目(Coleoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)。

鞘翅目(Coleoptera)包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目(Adephaga)包括步甲总科(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)，多食亚目(Polyphaga)包括水龟甲总科(Hydrophiloidea)、隐翅甲总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公甲总科(Cleroidea)、叩甲总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芫菁总科(Meloidea)、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步甲总科(Tenebrionoidea)、长蠢总科(Bostrichoidea)、金龟子总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)、和象甲总科(Curculionoidea)。步甲总科(Caraboidea)包括虎甲科(Cicindelidae)，步甲科(Carabidae)和龙虱科(Dytiscidae)。豉甲总科(Gyrinoidea)包括豉虫科(Gyrinidae)。水龟甲总科(Hydrophiloidea)包括水龟甲科(Hydrophilidae)。隐翅甲总科(Staphylinoidea)包括葬甲科(Silphidae)和隐翅甲科(Staphylinidae)。花萤总科(Cantharoidea)包括花萤科(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)。郭公甲总科(Cleroidea)包括郭公甲科(Cleridae)和皮蠢科(Dermestidae)。叩甲总科(Elateroidea)包括叩甲科(Elateridae)和吉丁甲科(Buprestidae)。扁甲总科(Cucujoidea)包括瓢虫科(Coccinellidae)。芫菁总科(Meloidea)包括芫菁科(Meloidae)。拟步甲总科(Tenebrionoidea)包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟子总科(Scarabaeoidea)包括黑蜣科(Passalidae)和金龟子科(Scarabaeidae)。天牛总科(Cerambycoidea)包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科(Chrysomeloidea)包括叶甲科(Chrysomelidae)。象甲总科(Curculionoidea)包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。

双翅目(Diptera)包括长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)和环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目(Nematocera)包括大蚊科(Tipulidae)、蛾蚋科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚋科(Bibionidae)和瘿蚋科(Cecidomyiidae)。短角亚目(Brachycera)包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟蜂虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目(Cyclorrhapha)包括无缝组(Aschiza)和有缝组(Schizophora)。无缝组(Aschiza)包括蚤蝇科(Phoridae)、食蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组(Schizophora)包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类(Acalyptratae)包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)和果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类(Calyptratae)包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、家蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)和肉蝇科(Sarcophagidae)。

鳞翅目(Lepidoptera)包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、大蚕蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾科(Tineidae)。

线虫类包括例如根结、胞囊、和根腐线虫等寄生线虫，包括异皮线虫属(Heterodera spp.)、根结线虫属(Meloidogyne spp.)、和球异皮线虫属(Globodera spp.)；尤其是各种胞囊类线虫成员，包括但不限于大豆异皮线虫(Heterodera glycines，大豆胞囊线虫soybean cyst nematode)、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii，甜菜胞囊线虫beet cyst nematode)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae，燕麦胞囊线虫cereal cyst nematode)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globoderapailida，potato cyst nematodes)。根腐线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)。

针对主要作物的本发明昆虫害包括：玉米：欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis，European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon，blackcutworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea，corn earworm)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；西南玉米杆草螟(Diatraeagrandiosella，southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus，lesser cornstalk borer)；小蔗螟(Diatraea saccharalis，surgarcane borer)；西部玉米根虫(Diabrotica virgifera，western cornrootworm)；北部玉米根虫(Diabrotica longicornis barberi，northern cornrootworm)；南部玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi，southerncorn rootworm)；梳爪叩头虫(Melanotus spp.，wireworms)；北方圆头犀金龟(蛴螬)(Cyclocephala borealis，northern masked chafer)(whitegrub)；南方圆头犀金龟(蛴螬)(Cyclocephala immaculata，southernmasked chafer)(white grub)；日本丽金龟(Popillia japonica，Japanesebeetle)；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria，corn flea beetle)；玉米谷象(Sphenophorus maidis，maize billbug)；玉米缢管蚜(Rhopalosiphummaidis，corn leaf aphid)；玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis，corn rootaphid)；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；赤脚蚱蜢(Melanoplus femurrubrum，redlegged grasshopper)；迁移蚱蜢(Melanoplus sanguinipes，migratory grasshopper)；玉米种蝇(Hylemyaplatura，seedcorn maggot)；玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis，corn blotleafminer)；玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus，grass thrips)；窃蚁(Solenopsis milesta，thief ant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；高粱：(斑禾草螟(Chilo partellus，sorghumborer)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea，corn earworm)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus，lesser cornstalk borer)；粒肤地老虎(Feltia subterranea，granulate cutworm)；蛴螬(Phyllophaga crinita，white grub)；Eleodes、Conoderus、和Aeolus spp.(wireworms)；橙足负泥虫(Oulema melanopus，cereal leaf beetle)；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria，corn flea beetle)；玉米谷象(Sphenophorus maidis，maize billbug)；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis，corn leaf aphid)；蔗黄伪毛蚜(Sipha flava，yellow sugarcane aphid)；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus，chinchbug)；高梁瘿蚊(Contarinia sorghicola，sorghum midge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus，carmine spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；小麦：粘虫(Pseudaletiaunipunctata，army worm)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，fallarmyworm)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus，lesser cornstalkborer)；Agrotis orthogonia，western cutworm；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus，lesser cornstalk borer)；橙足负泥虫(Oulemamelanopus，cereal leaf beetle)；车轴草叶象虫(Hypera punctata，cloverleaf weevil)；南部玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi，southern corn rootworm)；俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid)；麦二岔蚜(Schizaphis graminum，greenbug)；麦长管蚜(Macrosiphumavenae，English grain aphid)；赤脚蚱蜢(Melanoplus femurrubrum，redlegged grasshopper)；长额负蝗(Melanoplus differentialis，differentialgrasshopper)；迁移蚱蜢(Melanoplus sanguinipes，migratorygrasshopper)；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor，Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana，wheat midge)；美洲麦秆蝇(Meromyzaamericana，wheat stem maggot)；冬作种蝇(Hylemya coarctata，wheatbulb fly)；烟草蓟马(Frankliniella fusca，tobacco thrips)；麦茎蜂(Cephuscinctus，wheat stem sawfly)；郁金香瘤瘿螨(Aceria tulipae，wheat curlmite)；向日葵：Suleima helianthana，sunflower bud moth；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum，sunflower moth)；向日葵叶甲(zygogrammaexclamationis，sunflower beetle)；胡萝卜金龟(Bothyrus gibbosus，carrotbeetle)；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana，sunflower seedmidge)；棉花：烟芽夜蛾(Heliothis virescens，cotton budworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea，cotton bollworm)；甜菜夜蛾(Spodopteraexigua，beet armyworm)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella，pinkbollworm)；棉铃象甲(Anthonomus grandis，boll weevil)；棉蚜(Aphisgossypii，cotton aphid)；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus，cottonfleahopper)；结翅粉虱(Trialeurodes abutilonea，bandedwinged whitefly)；牧草盲蝽(Lygus lineolaris，tarnished plant bug)；赤脚蚱蜢(Melanoplusfemurrubrum，redlegged grasshopper)；长额负蝗(Melanoplusdifferentialis，differential grasshopper)；棉蓟马(Thrips tabaci，onionthrips)；烟草蓟马(Franklinkiella fusca，tobacco thrips)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus，carmine spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；水稻：小蔗螟(Diatraeasaccharalis，sugarcane borer)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，fallarmyworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea，corn earworm)；葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea，grape colaspis)；稻象甲(Lissorhoptrusoryzophilus，rice water weevil)；米象(Sitophilus oryzae，rice weevil)；黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus，rice leafhopper)；麦长蝽(Blissusleucopterus leucopterus，chinch bug)；喜绿椿(Acrosternum hilare，greenstink bug)；大豆：大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens，soybean looper)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis，velvet bean caterpillar)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra，green cloverworm)；欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua，beet armyworm)；烟芽夜蛾(Heliothisvirescens，cotton budworm)；美洲棉铃虫(Helicoverpa zea，cottonbollworm)；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis，Mexican bean beetle)；桃蚜(Myzus persicae，green peach aphid)；蚕豆小绿叶蝉(Empoascafabae，potato leafhopper)；喜绿椿(Acrosternum hilare，green stink bug)；赤脚蚱蜢(Melanoplus femurrubrum，redlegged grasshopper)；长额负蝗(Melanoplus differentialis，differential grasshopper)；玉米种蝇(Hylemya platura，seedcorn maggot)；大豆蓟马(Sericothrips variabilis，soybean thrips)；烟草蓟马(Thrips tabaci，onion thrips)；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani，strawberry spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；大麦：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)；麦二岔蚜(Schizaphis graminum，greenbug)；麦长蝽(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；喜绿椿(Acrosternumhilare，green stink bug)；褐臭蝽(Euschistus servus，brown stink bug)；灰地种蝇(Delia platura，seedcorn maggot)；黑森瘿蚊(Mayetioladestructor，Hessian fly)；麦岩螨(Petrobia latens，brown wheat mite)；油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae，cabbage aphid)；萝卜菜跳甲(Phyllotreta cruciferae，Flea beetle)；披肩粘虫(Mamestra configurata，Bertha armyworm)；小菜蛾(Plutella xylostella，Diamond-back moth)；根蛆(Root maggots)，地种蝇属(Delia ssp.)。

用于提高植物产量的方法

本发明提供了用于提高植物产量的方法。该方法包括提供表达编码本文公开的杀病虫害多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞，以及在受病虫害侵袭的田地中种植该植物或其种子，其中所述多肽对所述病害虫具有杀病虫害活性。在一些实施方案中，多肽具有抗鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目、或线虫类害虫的杀病虫害活性，且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫类害虫侵袭。

本文所定义的植物的“产量”是指植物所生产的生物质的质量和/或数量。“生物质”是指任何测量的植物产物。生物质生产的增加是在所测量的植物产物的产量上的任何提高。提高植物产量具有几种商业用途。例如，增加植物叶生物质可以提高用于人类或动物食用的叶类蔬菜的产量。此外，增加植物叶生物质可以被用于提高植物来源的医药或工业产品的产量。产量的提高可以包括任何统计上显著的增加，包括但不限于，比不表达该杀病虫害序列的植物，产量增加至少1％、至少3％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更多。

在特定的方法中，由于表达本文所公开的杀病虫害蛋白的植物的病害虫抗性增强而使植物的产量得到了提高。杀病虫害蛋白的表达导致病害虫侵袭或采食植物的能力降低，因此提高了植物的产量。

本文提供了以下实施例，这些实施例旨在对本发明进行举例说明而不是旨在对其进行限制。

实施例

实施例1、新基因的鉴别

使用诸如以下的方法，丛描述的细菌菌株中鉴定新的杀病虫害基因。

方法一

-从包含典型地携带δ-内毒素基因的质粒的菌株中制备染色体外DNA

-机械切割染色体外DNA以产生不同大小分布的片段

-克隆约2Kb至约10Kb的染色体外DNA片段

-生长出该染色体外DNA的约1500个克隆

-使用对克隆载体特异的引物，对该1500个克隆进行部分测序(末端读序(end reads))

-采用MiDAS方法(如美国专利公布号20040014091中所描述，就其全部内容并入本文作为参考)，通过同源性分析鉴别推定的毒素基因

-对包含推定的目的毒素基因片段的克隆进行序列的完善(步行)

方法二

-从菌株中制备染色体外DNA(其包含以下物质的几种或全部的混合物：各种不同大小的质粒；噬菌体染色体；未通过纯化程序分离的基因组DNA片段；其它未表征的染色体外分子)

-机械切割或酶切染色体外DNA以产生不同大小分布的片段

-采用高通量焦磷酸测序方法，对片段化的DNA进行测序

-通过同源性和/或其它计算机分析方法，鉴别推定的毒素基因

-采用几种PCR或克隆策略之一(例如TAIL-PCR)，对目的基因进行序列的完善

采用本领域已知的方法对每个克隆的DNA序列进行分析，鉴别出与已知的δ-内毒素基因具有同源性的开放阅读框。这些新基因的每个的命名列于表1。

表1、新毒素基因

实施例2、AXMI-002在大肠杆菌(E.coli)中的表达

将截短的axmi002(SEQ ID NO：11)克隆到麦芽糖结合蛋白(MBP)表达载体的NotI和AscI限制性酶切位点，得到pAX6601。在Axmi002的第一个甲硫氨酸和Xa因子切割位点之间加入两个氨基酸(GR)。

这种框内融合的结果是MBP-AXMI融合蛋白在大肠杆菌中表达。以单质粒转化大肠杆菌BL21＊DE3。将单菌落接种到添加有羧苄青霉素和葡萄糖的LB培养基，在37℃培养过夜。第二天，将1％的过夜培养物接种到新鲜培养基中，在37℃培养至对数生长期。随后，以0.3mM IPTG在20℃过夜诱导培养物。将每个细胞沉淀悬浮于20mM Tris-Cl缓冲液(pH7.4+200mM NaCl+1mM DTT+蛋白酶抑制剂)中并进行超声处理。通过SDS-PAGE分析来确认融合蛋白的表达。

将总的无细胞提取物上样到装配有直链淀粉柱的FPLC上，以亲合色谱法纯化MBP-AXMI融合蛋白。以10mM的麦芽糖溶液从树脂上洗脱结合的融合蛋白。然后以Xa因子或胰蛋白酶切割纯化的融合蛋白，以从AXMI002蛋白中除去氨基末端MBP标签。以SDS-PAGE确定蛋白的切割和可溶性。

实施例3、在芽孢杆菌(Bacillus)中表达

以PCR从pAX980中扩增本文所公开的杀虫基因，用本领域中熟知的方法将PCR产物克隆到芽孢杆菌表达载体pAX916中或其它合适的载体中。以常规培养基，例如CYS(10g/l Bacto-casitone；3g/l酵母提取物；6g/lKH2PO4；14g/l K2HPO4；0.5mM MgSO4；0.05mM MnCl2；0.05mMFeSO4)，培养所获得的包含携带axmi基因的载体的芽孢杆菌菌株，直到通过显微镜检测到明显的孢子形成。制备样品并在生物试验中对其活性进行测试。

实施例4、合成序列的构建

在本发明的一个方面，产生了合成的axmi序列。与亲本axmi序列相比，这些合成序列具有改变了的DNA序列，它们编码与其对应的亲本AXMI蛋白共线性的蛋白，但缺乏在许多δ-内毒素蛋白中存在的C末端“晶体结构域”。合成基因显示于表2中。

表2、合成序列

实施例5、杀病虫害活性分析

通常可以以多种方法对杀病虫害蛋白用作病虫害的杀病虫害剂的能力进行评估。一个为本领域技术人员所熟知的方法是进行饲喂试验。在这样的饲喂试验中，使病虫害暴露于包含待测试的化合物的样品或对照样品。通常的做法是，将待测试的材料或该材料的适当的稀释液放在病虫害将会摄食的材料(例如人工食饵)上。待测试的材料可以是液体、固体或浆。可以将待测试的材料放在表面，然后让其干燥。可选择的是，可以将待测试材料与熔化的人工食饵混合，然后将其散布到试验室中。试验室可以是例如杯子、盘子或微量滴定板的孔。

对吸吮式虫害(例如蚜虫)的试验可以涉及通过分隔物(理想地是能够被吸吮式昆虫的吸吮口器穿刺的部分，以允许测试材料可以被摄食)，将测试材料与昆虫分开。通常，将测试材料与取食刺激剂(例如蔗糖)混合，以促进对测试化合物的摄取。

其它类型的试验可以包括将测试材料显微注射到害虫的口腔或肠道中，以及产生转基因植物并随后检测害虫采食转基因植物的能力。植物测试可以涉及分隔正常采食的植物部分，例如，附着叶片的小笼子，或将整个植物分隔在内有昆虫的笼子内。

其它测试病虫害的方法和途径为本领域技术人员所熟知，可以参见，例如Robertson，J.L.& H.K.Preisler.1992.Pesticide bioassays witharthropods.CRC，Boca Raton，FL。可选择的是，《节肢动物管理测试》(“Arthropod Management Tests”)和《经济昆虫学杂志》“Journal ofEconomic Entomology”杂志中通常描述的试验，或与美国昆虫学协会(Entomological Society of America，ESA)成员讨论的试验。

实施例6、Axmi-002的杀病虫害活性

按实施例2的描述制备的AXMI-002蛋白的生物分析试验得到了以下结果：

表3

昆虫缩写的解释

DBM：Diamond Back Moth小菜蛾

SWCB：Southwestern Corn borer西南玉米杆草螟

VBC：Velvet Bean Caterpillar黎豆夜蛾

ECB：European Corn borer欧洲玉米螟

实施例7、用于植物表达的本发明杀病虫害基因的载体构建

将本发明基因的编码区各分别独立地与合适的启动子和终止子序列相连接用于在植物中进行表达。这些序列为本领域技术人员所熟知，它们可以包括用于在单子叶植物中进行表达的稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子、用于在双子叶植物中进行表达的拟南芥UBQ3启动子或CaMV 35S启动子、以及nos或PinII终止子。产生和验证“启动子-基因-终止子”构建体的技术为本领域技术人员所熟知。

实施例8、利用农杆菌介导的转化将本发明的基因转化到植物细胞中

在授粉后8-12天收集穗。从穗中剥离胚，选择0.8-1.5毫米大小的胚用于转化。将胚以盾片朝上的方式铺于合适的孵育培养基上，在25℃黑暗中孵育过夜。然而，对胚进行过夜孵育本质上并不是必需的。将胚与包含对于Ti质粒介导的转移合适的载体的农杆菌菌株接触5-10分钟，然后铺种到共培养培养基上3天(25℃黑暗中)。在共培养后，将外植体转移到恢复期培养基上5天(25℃黑暗中)。在选择培养基上，根据所采用的具体选择的性质和特征，对外植体进行不超过8周的孵育。在选择期之后，将所获得的愈伤组织转移到胚成熟培养基上，直达观察到成熟的体细胞胚的形成。将所获得的成熟的体细胞胚置于弱光下，如本领域技术人员所熟知的，开始再生过程。在生根培养基上使所获得的芽生根，并将所获得的植株转移到育苗盆中繁殖成转基因植株。

实施例9、用本发明的杀病虫害基因转化玉米细胞

授粉8-12天后收集玉米穗。从穗中剥离胚，选择0.8-1.5毫米大小的胚用于转化。将胚以盾片朝上的方式铺于合适的孵育培养基(例如DN62A5S培养基：3.98g/L N6盐；1mL/L(1000x储备液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(1mg/mL储备液)2，4-D)上，在25℃黑暗中孵育过夜。

将所获得的外植体转移到网格上(每板30-40个)，转移到渗透培养基上30-40分钟，然后转移到束射盘上(见例如，PCT公布号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

使用气溶胶束加速器，采取与如PCT公开WO/0138514中所描述基本一致的条件，将设计用于在植物细胞中表达本发明的基因的DNA构建体加速以进入植物组织中。在束射后，将胚置于渗透培养基上孵育30分钟，随后置于孵育培养基上在25℃黑暗中过夜。为了避免过度损伤束射后的外植体，在转移到恢复培养基前对其孵育至少24小时。随后将胚铺种到恢复期培养基上在25℃黑暗中5天，然后转移到选择培养基上。在选择培养基上，根据所采用的具体选择的性质和特征，对外植体进行不超过8周的孵育。在选择期之后，将所获得的愈伤组织转移到胚成熟培养基上，直达观察到成熟的体细胞胚的形成。将所获得的成熟的体细胞胚置于弱光下，如本领域技术人员所熟知的，开始再生过程。在生根培养基上使所获得的芽生根，并将所获得的植株转移到育苗盆中繁殖成转基因植株。

材料

DN62A5S培养基

以1N KOH/1N KCl将溶液的pH值调到5.8，加Gelrite(Sigma)至3g/L并进行高压蒸气灭菌。在冷却到50℃后，加入2ml/L的5mg/ml硝酸银(Phytotechnology Labs)储备液。该配方产生了大约20个平板。

本说明书中所提及的所有出版物和专利申请对本发明所属领域的技术人员的技术水平具有指示作用。所有出版物和专利申请被并入本文作为参考，其参考程度如同每件出版物或专利申请被详细地分别说明而并入本文作为参考。

尽管为了理解清楚，通过举例说明和实施例对上述发明进行了一些详细的描述，但显然可以在所附权利要求范围内进行一定的变更或修改。

Claims (26)

1.一种重组核酸分子，该重组核酸分子包含编码具有杀病虫害活性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)SEQ ID NO：2，1，3，4或5之任一所示的核苷酸序列；

b)编码包含SEQ ID NO：7，6，8，9，10或11之任一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及

c)编码包含与SEQ ID NO：7-11之任一的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

2.权利要求1的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已经被设计用于在植物中表达的合成序列。

3.权利要求2的重组核酸分子，其中所述序列如SEQ ID NO：12-24之任一所示。

4.权利要求1的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列被可操作地连接到能够在植物细胞中指导所述核苷酸序列表达的启动子上。

5.包含权利要求1的核酸分子的载体。

6.权利要求5的载体，该载体还包含编码异源多肽的核酸分子。

7.包含权利要求5的载体的宿主细胞。

8.权利要求7的宿主细胞，该宿主细胞为细菌宿主细胞。

9.权利要求7的宿主细胞，该宿主细胞为植物细胞。

10.包含权利要求9的宿主细胞的转基因植物。

11.权利要求10的转基因植物，其中所述植物选自：玉米、高粱、小麦、甘蓝、向日葵、西红柿、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。

12.包含权利要求1的核酸分子的转基因种子。

13.具有杀病虫害活性的重组多肽，其选自：

a)包含SEQ ID NO：7，6，8，9，10或11之任一的氨基酸序列的多肽；

b)包含与SEQ ID NO：7-11之任一的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列的多肽；以及

c)由SEQ ID NO：2，1，3，4或5之任一编码的多肽。

14.权利要求13的多肽，该多肽还包含异源氨基酸序列。

15.包含权利要求13的重组多肽的组合物。

16.权利要求15的组合物，其中所述组合物选自：粉、粉末、小球、颗粒、喷剂、乳剂、胶体、以及溶液。

17.权利要求15的组合物，其中所述组合物通过对细菌细胞培养物进行脱水、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备。

18.权利要求15的组合物，该组合物包含以重量计约1％至99％的所述多肽。

19.控制鳞翅目、鞘翅目、异翅目、线虫类、或双翅目害虫群体的方法，包括以权利要求13的多肽的有效杀病虫害量接触所述群体。

20.灭杀鳞翅目、鞘翅目、异翅目、线虫类、或双翅目害虫的方法，包括以权利要求13的多肽的有效杀病虫害量接触所述害虫或饲喂所述害虫。

21.生产具杀病虫害活性的多肽的方法，包括在编码多肽的核酸分子表达的条件下，培养权利要求7的宿主细胞。

22.具有稳定整合到其基因组中的DNA构建体的植物，其中的DNA构建体包含编码具有杀病虫害活性的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)SEQ ID NO：2，1，3，4，或5之任一所示的核苷酸序列；

b)编码包含SEQ ID NO：7，6，8，9，10，或11之任一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及

c)编码包含与SEQ ID NO：7-11之任一的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

其中所述核苷酸序列被可操作地连接到在植物细胞中驱动编码序列表达的启动子上。

23.权利要求22的植物，其中所述植物为植物细胞。

24.用于植物防病虫害的方法，包括在植物或其细胞中表达编码杀病虫害多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)SEQ ID NO：2，1，3，4，或5之任一所示的核苷酸序列；

b)编码包含SEQ ID NO：7，6，8，9，10，或11之任一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及

c)编码包含与SEQ ID NO：7-11之任一的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

25.权利要求24的方法，其中所述植物产生对鳞翅目、鞘翅目、异翅目、线虫类、或双翅目害虫具有杀病虫害活性的杀病虫害多肽。

26.提高植物产量的方法，包括在田地中种植具有稳定整合到其基因组的DNA构建体的植物或该植物的种子，其中的DNA构建体包含编码具有杀病虫害活性的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)SEQ ID NO：2，1，3，4，或5之任一所示的核苷酸序列；

b)编码包含SEQ ID NO：7，6，8，9，10，或11之任一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及

c)编码包含与SEQ ID NO：7-11之任一的氨基酸序列具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

其中所述田地被病虫害侵袭，其中所述多肽对该病虫害具有杀病虫害活性。