CN108137649A - AXMI554δ-内毒素基因及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。提供了包含毒素多肽的编码序列的组合物。这些编码序列可以用于在植物和细菌中用以转化和表达的DNA构建体或表达盒中。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体而言，提供了分离的毒素核酸分子。此外，涵盖对应于多核苷酸的氨基酸序列，以及与那些氨基酸序列特异性结合的抗体。具体而言，本发明提供了分离的核酸分子，这些核酸分子包含编码SEQ ID NO:4‑11中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或在SEQ ID NO:1‑3中列出的核苷酸序列，及其变体和片段。

Description

AXMI554δ-内毒素基因及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年10月14日提交的美国临时申请序列号62/241/220的权益，将其内容通过引用以其全文结合在此。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列在制备杀有害生物配制品中和在生产转基因抗有害生物植物中是有用的。

背景技术

苏云金芽孢杆菌是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于其产生对某些目和种的昆虫特异地有毒但对植物和其他非靶向生物体无害的结晶内含物的能力。由于这个原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白的组合物可以用作环境上可接受的杀昆虫剂以控制农业昆虫有害生物或者多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目的、半翅目的、双翅目的和鞘翅目的幼虫的有效的杀昆虫活性。这些蛋白质还已经显示针对膜翅目、同翅目、虱目、食毛目和蜱螨亚纲(Acari)有害生物目，连同其他无脊椎动物目(如线形动物门、扁形动物门和肉足鞭毛亚门(Sarcomastigorphora))的活性(Feitelson(1993)TheBacillus Thuringiensis family tree[苏云金芽孢杆菌家族树].在AdvancedEngineered Pesticides[先进的工程化杀有害生物剂],Marcel Dekker,Inc.[马塞尔·德克尔公司],纽约,纽约州)。这些蛋白质最初主要基于它们的杀昆虫活性而分类为CryI至CryV。主要类别是鳞翅目特异性的(I)、鳞翅目和双翅目特异性的(II)、鞘翅目特异性的(III)、双翅目特异性的(IV)以及线虫特异性的(V)和(VI)。这些蛋白质进一步分类为亚家族；在每个家族内更高度相关的蛋白质被指定了分区字母，如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。在每个分区内甚至更密切相关的蛋白质被给予了如Cry1C1、Cry1C2等的名称。

基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性描述了Cry基因的命名法(Crickmore等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学评论]62:807-813)。在此分类中，每种毒素被指定了包括第一级(primary rank)(阿拉伯数字)、第二级(secondary rank)(大写字母)、第三级(tertiary rank)(小写字母)和第四级(quaternaryrank)(另一个阿拉伯数字)的唯一名称。在第一级中，罗马数字已被换成阿拉伯数字。序列一致性小于45％的蛋白质具有不同的第一级，并且第二级和第三级的标准分别为78％和95％。

晶体蛋白不展示杀昆虫活性，直至其被摄取并溶解在昆虫中肠之中。被摄取的原毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成活性毒性分子。(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.[微生物学评论]53:242-255)。此毒素与靶标幼虫的中肠中的顶端刷状缘受体结合并插入顶端膜中，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。

δ-内毒素通常具有五个保守的序列结构域和三个保守的结构性结构域(参见例如，de Maagd等人(2001)Trends Genetics[遗传学趋势]17:193-199)。第一个保守的结构性结构域由七个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的三个β-片层组成，并且结构域III处于“果冻卷”构造的两个反向平行的β-片层组成(deMaagd等人,2001，同上)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。

除了δ-内毒素之外，还有几种其他已知类别的杀有害生物蛋白毒素。这些VIP1/VIP2毒素(参见例如，美国专利5,770,696)是二元杀有害生物毒素，它们通过如下机制对昆虫展示强活性，该机制被认为涉及受体介导的胞吞随后是细胞毒化，类似于其他二元(“A/B”)毒素的作用方式。A/B毒素(如VIP、C2、CDT、CST或炭疽芽孢杆菌水肿和致命毒素)最初通过“B”组分(作为单体)的特异性的受体介导的结合与靶标细胞相互作用。这些单体然后形成同七聚物(homoheptamer)。然后该“B”七聚物-受体复合物充当对接平台，随后该平台约束并允许酶的一种或多种“A”组分通过受体介导的胞吞而易位到细胞溶质中。一旦到细胞的细胞溶质内部，“A”组分通过例如G-肌动蛋白的ADP-核糖基化、或增加环状AMP(cAMP)的胞内水平而抑制正常细胞功能。参见Barth等人(2004)Microbiol Mol Biol Rev[微生物学与分子生物学评论]68:373--402。

大量使用基于苏云金芽孢杆菌的杀昆虫剂已经引起小菜蛾(diamondback moth，Plutella xylostella)的田间种群的抗性(Ferre和Van Rie(2002)Annu.Rev.Entomol.[昆虫学年评]47:501-533)。最常见的抗性机制是该毒素与其一种或多种特异性中肠受体的结合的减少。这还可以赋予针对共享相同受体的其他毒素的交叉抗性(Ferre和Van Rie(2002))。

由于昆虫可能带来的破坏和通过控制昆虫有害生物在产量方面的改进，持续需要发现新形式的杀有害生物毒素。

发明内容

提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包括杀有害生物的和杀昆虫的多肽的核酸分子编码序列、包含那些核酸分子的载体和包含这些载体的宿主细胞。组合物还包括这些杀有害生物多肽序列和那些多肽的抗体。这些核苷酸序列可以用于在生物体(包括微生物和植物)中用以转化和表达的DNA构建体或表达盒中。这些核苷酸或氨基酸序列可以是已设计成在生物体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。组合物还包括包含本发明的核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。

具体而言，提供了编码杀有害生物蛋白的分离的或重组的核酸分子。另外，涵盖与这些杀有害生物蛋白对应的氨基酸序列。具体而言，本发明提供了分离的或重组的核酸分子，该核酸分子包含编码SEQ ID NO:4-11中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或在SEQ IDNO:1-3中列出的核苷酸序列，及其生物活性变体和片段。还涵盖与本发明的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或与本发明的序列或其互补体杂交的核苷酸序列。进一步提供了包含本发明的核苷酸序列、或编码本发明的氨基酸序列的核苷酸序列及其生物活性变体和片段的载体、宿主细胞、植物和种子。

提供了用于产生本发明的多肽的方法，以及用于使用那些多肽来控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目有害生物的方法。还包括用于检测在样品中的本发明的核酸和多肽的方法和试剂盒。

本发明的组合物和方法可用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。这些生物体和包含这些生物体的组合物对于农业目的是所希望的。本发明的组合物还可用于产生具有杀有害生物活性的改变的或改进的蛋白质、或检测在产物或生物体中的杀有害生物蛋白或核酸的存在。

具体实施方式

本发明描绘了用于调节生物体(特别是植物或植物细胞)中的有害生物抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”是指有害生物(例如，昆虫)一旦摄取或以其他方式接触本发明的多肽时就被杀死。“耐受性”是指有害生物的运动、摄食、繁殖或其他功能的损害或降低。这些方法涉及用编码本发明的杀有害生物蛋白的核苷酸序列转化生物体。具体而言，本发明的核苷酸序列可用于制备具有杀有害生物活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是芽孢杆菌属或其他物种的杀有害生物核酸和蛋白。这些序列可用于随后转化到感兴趣的生物体中的表达载体的构建，作为用于其他同源的(或部分同源的)基因的分离的探针，以及用于通过本领域已知的方法(如结构域交换或DNA改组)来产生改变的杀有害生物蛋白，例如内毒素的Cry1、Cry2和Cry9家族的成员。这些蛋白质可用于控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目和线虫有害生物种群，以及用于产生具有杀有害生物活性的组合物。

“杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白”是指具有针对一种或多种有害生物(包括但不限于鳞翅目、双翅目和鞘翅目或线虫动物门的成员)的毒性的毒素，或者与这样的蛋白质具有同源性的蛋白质。已经从生物体中分离出杀有害生物蛋白，这些生物体包括例如杆菌属、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)和日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacilluspopilliae)。杀有害生物蛋白包括从在此披露的全长核苷酸序列推导出的氨基酸序列、和比这些全长序列短的氨基酸序列(由于使用了备用下游起始位点或由于产生较短的具有杀有害生物活性的蛋白质的加工过程)。加工可以在表达该蛋白质的生物体内发生，或在该有害生物摄取该蛋白质之后发生。

杀有害生物蛋白涵盖δ-内毒素。δ-内毒素包括被标识为cry1至cry72、cyt1和cyt2、和Cyt样毒素的蛋白质。目前有超过250种已知种类的δ-内毒素，它们具有宽范围的特异性和毒性。关于扩展性列表，参见Crickmore等人(1998),Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学评论]62:807-813，并且关于定期更新，参见Crickmore等人(2003)“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法],”在www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index处。

因此，在此提供了赋予杀有害生物活性的新颖的分离的或重组的核苷酸序列。这些核苷酸序列编码与已知的δ-内毒素或二元毒素具有同源性的多肽。还提供了这些杀有害生物蛋白的氨基酸序列。由此基因的翻译而产生的蛋白质允许细胞控制或杀死摄取了该蛋白质的有害生物。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明的一个方面涉及分离的或重组的核酸分子，这些核酸分子包含编码杀有害生物蛋白和多肽或其生物活性部分的核酸序列，以及足以用作杂交探针来鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子的核酸分子。在此还涵盖能够在如在此的其他地方所定义的严格条件下与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。如在此所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。该核酸分子可以是单链的或是双链的，但优选地是双链的DNA。术语“重组”涵盖已相对于天然多核苷酸或多肽操纵的多核苷酸或多肽，以使得该多核苷酸或多肽不同于(例如，在化学组成或结构方面)自然界中存在的多核苷酸或多肽。在另一个实施例中，“重组”多核苷酸不含该多核苷酸所来源的生物体基因组DNA中天然存在的内部序列(即内含子)。此多核苷酸的典型实例是所谓的互补DNA(cDNA)。

分离的或重组的核酸(或DNA)在此用于指代不再处于其天然环境中的核酸(或DNA)，例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。在一些实施例中，分离的或重组的核酸是不含天然侧接该核酸所来源的生物体基因组DNA中的核酸(即，位于该核酸5′端和3′端的序列)的序列(优选蛋白质编码序列)。出于本发明的目的，当“分离的”用于指代核酸分子时，不包括分离的染色体。例如，在不同的实施例中，编码核酸分子的分离的δ-内毒素可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列天然侧接该核酸所来源的细胞基因组DNA中的核酸分子。在不同的实施例中，基本上不含细胞材料的δ-内毒素蛋白包括具有小于约30％、20％、10％或5％(干重)的非δ-内毒素蛋白(在此又称之为“污染蛋白”)的蛋白质制剂。在一些实施例中，本发明的重组核酸包含相对于SEQ IDNO:1或其变体或片段的一个或多个核苷酸取代。

编码本发明的蛋白质的核苷酸序列包括在SEQ ID NO:1-3中列出的序列及其变体、片段和互补体。“互补体”是指与给定的核苷酸序列足够地互补使得它可以与该给定的核苷酸序列杂交以便由此形成稳定的双链体的核苷酸序列。由这些核苷酸序列编码的杀有害生物蛋白的相应氨基酸序列在SEQ IDNO:4-11中列出。

本发明还涵盖作为编码杀有害生物蛋白的这些核苷酸序列的片段的核酸分子。“片段”是指编码杀有害生物蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码杀有害生物蛋白的生物活性部分，或者它可以是用作使用以下披露的方法的杂交探针或PCR引物的片段。作为编码杀有害生物蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400个连续核苷酸，或达到存在于在此披露的编码杀有害生物蛋白的全长核苷酸序列中的核苷酸数目，这取决于所期望的用途。“连续的”核苷酸是指彼此紧邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段编码蛋白质片段，这些蛋白质片段保留杀有害生物蛋白的生物活性并且因此保留杀有害生物活性。因此，还涵盖在此披露的多肽的生物活性片段。“保留活性”是指片段将具有杀有害生物蛋白的至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀有害生物活性。在一个实施例中，杀有害生物活性是杀鞘翅目活性。在另一个实施例中，杀有害生物活性是杀鳞翅目活性。在另一个实施例中，杀有害生物活性是杀线虫活性。在另一个实施例中，杀有害生物活性是杀双翅目活性。在另一个实施例中，杀有害生物活性是杀半翅目活性。用于测量杀有害生物活性的方法在本领域是众所周知的。参见例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83:2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人(1985)J.of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]78:290-293；和美国专利号5,743,477，将其全部通过引用以其全文结合在此。

编码杀有害生物蛋白的核苷酸序列的片段编码本发明蛋白质的生物活性部分，该片段将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450个连续氨基酸，或达到存在于本发明的全长杀有害生物蛋白中的氨基酸的总数目。在一些实施例中，片段是蛋白水解切割片段。例如，蛋白水解切割片段可以具有相对于SEQ ID NO:4-11的至少约100个氨基酸、约120、约130、约140、约150或约160个氨基酸的N末端或C末端截短。在一些实施例中，在此涵盖的片段是C末端结晶化区域去除的结果，例如，通过蛋白水解或通过在编码序列中插入终止密码子。

在不同的实施例中，本发明的核酸包含SEQ ID NO:1-3中任一个的简并核酸，其中所述简并核苷酸序列编码与SEQ ID NO:4-11中任一个相同的氨基酸序列。

本发明的优选杀有害生物蛋白由与SEQ ID NO:1-3的核苷酸序列足够一致的核苷酸序列编码，或者杀有害生物蛋白与在SEQ ID NO:4-11中列出的氨基酸序列足够一致。“足够一致”是指氨基酸或核苷酸序列，使用标准参数利用在此描述的比对程序，相比参考序列具有至少约60％或65％序列一致性、约70％或75％序列一致性、约80％或85％序列一致性、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。本领域技术人员将认识到，这些值通过考虑密码子的简并性、氨基酸相似性，阅读框定位等，可以适当调整以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应一致性。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分比一致性，出于最佳比较目的而比对这些序列。两个序列之间的百分比一致性是这些序列共有相同位置的数目的函数(即，百分比一致性＝相同位置的数目/位置总数(例如，重叠位置)x 100)。在一个实施例中，两个序列具有相同长度。在另一个实施例中，百分比一致性跨整个参考序列(即，在此披露为SEQID NO:1-11中任一个的序列)。使用与以下所述那些类似的技术，允许或不允许空位，可以确定两个序列之间的百分比一致性。在计算百分比一致性时，典型地对精确匹配计数。空位(即，在其中残基存在于一个序列中但不存在于另一个序列中的比对中的位置)被认为是具有非一致残基的位置。

两个序列之间的百分比一致性的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:2264的算法，该算法在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5877中进行了修改。这种算法被结合到Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序(得分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的杀有害生物样核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序(得分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明的杀有害生物蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389中所描述的Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。可替代地，可以使用PSI-Blast进行检测分子之间的距离关系的迭代检索。参见Altschul等人(1997)，同上。当利用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对也可以通过检查手动进行。

用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是ClustalW算法(Higgins等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680)。ClustalW比较序列并比对氨基酸或DNA序列的整体，并且因此可以提供关于完整氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法被用于几种可商购的DNA/氨基酸分析软件包中，如Vector NTI Program Suite(英杰公司(Invitrogen Corporation)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的ALIGNX模块。在用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评估百分比氨基酸一致性。可用于分析ClustalW比对的软件程序的非限制性实例是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(Karl Nicholas)允许评估多个蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和一致性。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法。这种算法被结合到ALIGN程序(版本2.0)中，它是GCG威斯康辛遗传学软件包(GCG Wisconsin Genetics Software Package)(版本10)(可购自阿赛乐德公司(Accelrys,Inc.)，9685斯克兰顿路(Scranton Rd.)，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。

除非另有说明，使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48(3):443-453的算法的GAP版本10，将用于使用以下参数确定序列一致性或相似性：使用50的空位权重和3的长度权重及nwsgapdna.cmp评分矩阵确定核苷酸序列的％一致性和％相似性；使用8的空位权重和2的长度权重及BLOSUM62评分程序确定氨基酸序列的％一致性或％相似性。也可以使用等效程序。“等效程序”是指以下任何序列比较程序，该程序针对讨论中的任何两个序列当与GAP版本10产生的相应比对相比时产生具有相同的核苷酸残基匹配和相同的百分比序列一致性的比对。

本发明还涵盖变体核酸分子。编码杀有害生物蛋白的核苷酸序列的“变体”包括编码在此披露的杀有害生物蛋白但由于遗传密码的简并性而保守性地不同的那些序列，连同如以上所讨论的足够一致的那些序列。通过使用众所周知的分子生物学技术(如聚合酶链式反应(PCR)和如下文概述的杂交技术)可以鉴定天然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括合成地衍生的核苷酸序列，这些核苷酸序列已经例如通过使用定点诱变而产生但它们仍编码在本发明中披露的杀有害生物蛋白，如以下所讨论的。本发明所涵盖的变体蛋白具有生物活性，即其继续具有天然蛋白的所希望的生物活性，即杀有害生物活性。“保留活性”是指变体将具有天然蛋白的至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约80％的杀有害生物活性。用于测量杀有害生物活性的方法在本领域是众所周知的。参见例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83:2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78:290-293；和美国专利号5,743,477，将其全部通过引用以其全文结合在此。

熟练技术人员将进一步意识到，可以通过突变本发明的核苷酸序列来引入变化，由此导致这些编码的杀有害生物蛋白的氨基酸序列的变化，而不改变这些蛋白质的生物活性。因此，分离的核酸分子的变体可以通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入在此披露的相应核苷酸序列中来产生，使得一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入编码的蛋白质中。通过标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)可以引入突变。本发明还涵盖这样的变体核苷酸序列。

例如，保守的氨基酸取代可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以从杀有害生物蛋白的野生型序列中进行改变而不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性必需的。“保守的氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

δ-内毒素通常具有五个保守的序列结构域和三个保守的结构性结构域(参见例如，de Maagd等人(2001)Trends Genetics[遗传学趋势]17:193-199)。第一个保守的结构性结构域由七个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的三个β-片层组成，并且结构域III处于“果冻卷”构造的两个反向平行的β-片层组成(deMaagd等人,2001，同上)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。

氨基酸取代可以在保留功能的非保守区域中进行。通常，不会对保守的氨基酸残基或驻留在保守基序内的氨基酸残基进行这样的取代，其中这些残基对于蛋白质活性是所必需的。保守的并且可能是蛋白质活性所必需的残基的实例包括例如在对本发明的序列相似或相关的毒素的比对中包含的所有蛋白质之间一致的残基(例如，在同源蛋白质的比对中一致的残基)。保守的但可以允许保守性氨基酸取代并仍然保留活性的残基的实例包括例如在对本发明的序列相似或相关的毒素的比对中包含的所有蛋白质之间仅具有保守性取代的残基(例如，在比对同源性蛋白质中包含的所有蛋白质之间仅具有保守性取代的残基)。然而，本领域技术人员将理解，功能性变体在保守的残基中可以有少量的保守的或非保守的改变。

可替代地，可以通过沿着全部或部分的编码序列随机引入突变(如通过饱和诱变)制备变体核苷酸序列，并且可以筛选得到的突变体赋予杀有害生物活性的能力以鉴定保留活性的突变体。诱变之后，可以重组地表达编码的蛋白质，并且可以使用标准测定技术来测定蛋白质的活性。

使用如PCR、杂交等的方法可以鉴定相应的杀有害生物序列，这样的序列与本发明的序列具有基本一致性(例如，跨整个参考序列至少约70％、至少约75％、80％、85％、90％、95％或更高的序列一致性)并且具有或赋予杀有害生物活性。参见例如，Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.[分子克隆：实验室手册](ColdSpring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约州)和Innis等人(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications[PCR方案：方法和应用指南](Academic Press[学术出版社],纽约州)。

在杂交方法中，可以使用杀有害生物核苷酸序列的全部或部分来筛选cDNA或基因组文库。用于构建这样的cDNA和基因组文库的方法在本领域是普遍已知的，并且披露在Sambrook和Russell,2001，同上中。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以标有可检测基团(如³²P)或其他任何可检测标记(如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。可以基于在此披露的已知的编码杀有害生物蛋白的核苷酸序列通过标记合成寡核苷酸来制备用于杂交的探针。另外，可以使用基于在核苷酸序列或编码的氨基酸序列中保守的核苷酸或氨基酸残基设计的简并引物。探针典型地包含在严格条件下与编码本发明的杀有害生物蛋白的核苷酸序列或其片段或变体的至少约12、至少约25、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。用于制备杂交用探针的方法在本领域是普遍已知的，并且披露在Sambrook和Russell,2001，同上(通过引用结合在此)中。

例如，在此披露的完整杀有害生物序列或其一个或多个部分可以用作能够特异性地与相应杀有害生物蛋白样序列和信使RNA杂交的探针。为了实现在多种条件下的特异性杂交，这样的探针包括唯一的且优选长度至少约10个核苷酸或长度至少约20个核苷酸的序列。这样的探针可以用于通过PCR扩增来自选定生物体或样品的相应杀有害生物序列。此技术可以用于从所希望的生物体分离另外的编码序列，或者用作确定生物体中编码序列的存在的诊断性测定。杂交技术包括杂交筛选铺板的DNA文库(噬斑或菌落；参见例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约))。

因此，本发明涵盖用于杂交的探针，以及能够与本发明的核苷酸序列的全部或一部分(例如，至少约300个核苷酸、至少约400、至少约500、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500，或达到在此披露的核苷酸序列的全长)杂交的核苷酸序列。可以在严格条件下进行这样的序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交条件”是指这样的条件，在这些条件下探针将会与其靶序列杂交，其可检测程度高于与其它序列杂交的可检测程度(例如，超过背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，使得检测出更低的相似度(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是以下那些条件，其中盐浓度在pH 7.0至8.3时低于约1.5MNa离子，通常为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且短探针(例如，10至50个核苷酸)的温度为至少30℃且长探针(例如，大于50个核苷酸)的温度为至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)实现严格条件。示例性低严格条件包括在30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中在37℃下杂交，并且在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50℃至55℃下洗涤。示例性中等严格条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.5X至1X SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性高度严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.1X SSC中在60℃至65℃下洗涤。任选地，冲洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间通常小于约24小时，通常约4至约12小时。

特异性典型地是杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂合体，T_m可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.[分析生物化学]138:267-284的等式估算：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，并且L是杂合体的碱基对长度。T_m是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每错配1％，T_m降低约1℃；因而，可以调整T_m、杂交和/或洗涤条件以与所希望的一致性的序列杂交。例如，如果寻找一致性≥90％的序列，则可以将T_m降低10℃。通常，严紧条件被选择为在确定的离子强度和pH下比特定序列及其互补体的热熔点(T_m)低约5℃。然而，极端严格条件可以利用在比热熔点(T_m)低1℃、2℃、3℃或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比热熔点(T_m)低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比热熔点(T_m)低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下的杂交和/或洗涤。使用等式、杂交和洗涤组成及所希望的T_m，普通技术人员将理解，杂交和/或洗涤溶液严格性的变化属本质性描述。如果所希望的错配度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选的是增加SSC浓度使得可以使用更高温度。核酸杂交的广泛指南可见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术—用核酸探针进行杂交],第I部分,第2章(Elsevier[爱思唯尔出版社],纽约)；和Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验指南],第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience[格林出版社与威立交叉科学出版社],纽约)。参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册](第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约)。

分离的蛋白质及其变体和片段

杀有害生物蛋白也涵盖在本发明内。“杀有害生物蛋白”是指具有在SEQ ID NO:4-11中列出的氨基酸序列的蛋白质。还提供了其片段、生物活性部分和变体，并且它们可以用于实践本发明的方法。“分离的蛋白质”或“重组蛋白”是用于指代不再处于其天然环境中的蛋白质，例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。在一些实施例中，重组蛋白是SEQ IDNO:2-5的变体，其中该变体相对于SEQ ID NO:2-5包含至少一个氨基酸取代、缺失或插入。

“片段”或“生物活性部分”包括包含与在SEQ ID NO:4-11中列出的氨基酸序列足够地一致的氨基酸序列，并且展示杀有害生物活性的多肽片段。杀有害生物蛋白的生物活性部分可以是例如长度为10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350个或更多个氨基酸的多肽。这样的生物活性部分可以通过重组技术制备并用于杀有害生物活性的评估。用于测量杀有害生物活性的方法在本领域是众所周知的。参见例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83:2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78:290-293；和美国专利号5,743,477，将其全部通过引用以其全文结合在此。如此处所用，片段包含SEQ ID NO:4-11的至少8个连续氨基酸。然而，本发明涵盖其他片段，如蛋白质中的长度大于约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350个或更多个氨基酸的任何片段。

“变体”是指具有与SEQ ID NO:4-11中任一个的氨基酸序列至少约60％、65％、约70％、75％、约80％、85％、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体还包括由与SEQ ID NO:1-3的核酸分子或其互补体在严格条件下杂交的核酸分子编码的多肽。变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的多肽。本发明所涵盖的变体蛋白具有生物活性，即其继续具有天然蛋白的所希望的生物活性，即保留杀有害生物活性。在一些实施例中，变体相对于天然蛋白具有改进的活性。用于测量杀有害生物活性的方法在本领域是众所周知的。参见例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]83:2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78:290-293；和美国专利号5,743,477，将其全部通过引用以其全文结合在此。

细菌基因(如本发明的axmi基因)通常在开放阅读框的起始点附近拥有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在一个或多个这些起始密码子处的翻译起始将导致产生功能蛋白。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌(如芽孢杆菌属)也识别密码子GTG作为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一氨基酸处包括甲硫氨酸。在很少的情况下，在细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处起始，尽管在这种情况下TTG编码甲硫氨酸。此外，通常不确定这些密码子中的哪个先天地在细菌中被天然地利用。因此，可以理解使用一个备用甲硫氨酸密码子也可能导致产生杀有害生物蛋白。这些杀有害生物蛋白被涵盖在本发明中，并且可以用于本发明的方法中。应该理解的是，当在植物中表达时，有必要将备用起始密码子改变为ATG以用于正确翻译。

在本发明的不同实施例中，杀有害生物蛋白包括从在此披露全长核苷酸序列推导出的氨基酸序列、和由于使用备用下游起始位点而短于全长序列的氨基酸序列。因此，本发明的核苷酸序列和/或包含本发明的核苷酸序列的载体、宿主细胞和植物(以及制备和使用本发明的核苷酸序列的方法)可以包含编码对应于SEQ ID NO:5-11的氨基酸序列的核苷酸序列。

还涵盖本发明的多肽或其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法在本领域是众所周知的(参见例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约州；美国专利号4,196,265)。

因此，本发明的一个方面涉及与一种或多种本发明的蛋白质或肽分子和它们的同系物、融合物或片段特异性地结合的抗体、单链抗原结合分子或其他蛋白质。在特别优选的实施例中，该抗体与具有在SEQ ID NO:4-11中列出的氨基酸序列的蛋白质或其片段特异性地结合。在另一个实施例中，该抗体与包含选自在SEQ ID NO:4-11中列出的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白或其片段特异性地结合。在不同的实施例中，与本发明的蛋白质或包含本发明蛋白质的融合蛋白特异性地结合的抗体是非天然存在的抗体。

本发明的抗体可以用于定量地或定性地检测本发明的蛋白质或肽分子，或用于检测蛋白质的翻译后修饰。如在此所用，如果这种结合是不被非相关分子的存在竞争性地抑制，则认为抗体或肽与本发明的蛋白质或肽分子“特异性地结合”。

本发明的抗体可以被包含在可用于检测本发明的蛋白质或肽分子的试剂盒中。本发明进一步包括检测本发明的蛋白质或肽分子(特别是由在SEQ IDNO:4-11中列出的氨基酸序列编码的蛋白质，包括其能够与本发明的抗体特异性地结合的变体或片段)的方法，该方法包括使样品与本发明的抗体接触，并且确定该样品是否含有本发明的蛋白质或肽分子。用于利用抗体来检测感兴趣的蛋白质或肽的方法在本领域是已知的。

改变的或改进的变体

应当认识到，杀有害生物蛋白的DNA序列可以通过各种方法来改变，并且这些改变可导致编码具有与由本发明的杀有害生物蛋白编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列的蛋白质的DNA序列。此蛋白质可以按各种方式来改变，包括SEQ ID NO:4-11的一个或多个氨基酸的氨基酸取代、缺失、截短和插入，包括多达约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155个或更多个氨基酸取代、缺失或插入。用于这样的操作的方法在本领域是普遍已知的。例如，杀有害生物蛋白的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变来制备。这也可以通过几种诱变形式之一和/或在定向进化中完成。在一些方面，在氨基酸序列中编码的改变将基本上不影响蛋白质的功能。这样的变体将具有所希望的杀有害生物活性。然而，可以理解杀有害生物蛋白赋予杀有害生物活性的能力可以通过对本发明的组合物使用这样的技术来改进。例如，可以在DNA复制过程中展示高比例的碱基错掺的宿主细胞(如XL-1Red(Stratagene公司，拉霍亚，加利福尼亚州))中表达杀有害生物蛋白。在这样的菌株中繁殖后，可以分离DNA(例如通过制备质粒DNA，或通过经由PCR扩增并将所得PCR片段克隆到载体中)，在非突变菌株中培养杀有害生物蛋白突变体，以及鉴定具有杀有害生物活性的突变基因，例如通过进行用以测试杀有害生物活性的测定。通常，该蛋白质被混合并用于饲喂测定。参见例如，Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫学杂志]78:290-293。这样的测定可以包括使植物与一种或多种有害生物接触并且确定该植物的存活和/或导致有害生物死亡的能力。导致毒性增加的突变的实例可见于Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学评论]62:775-806。

可替代地，可以对许多蛋白质的氨基末端或羧基末端的蛋白质序列进行改变而基本上不影响活性。这可以包括通过现代分子生物学方法引入插入、缺失或改变，这些现代生物学方法是如PCR，包括PCR扩增，其凭借在PCR扩增中利用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列来改变或延伸蛋白质编码序列。可替代地，添加的蛋白质序列可以包括整个蛋白质编码序列，如在本领域中通常用来产生蛋白质融合物的那些。这样的融合蛋白通常用来(1)增加感兴趣的蛋白质的表达；(2)引入结合结构域、酶活性或表位以促进蛋白质纯化、蛋白质检测或其他本领域已知的实验用途；(3)将蛋白质的分泌或翻译靶向至亚细胞器，如革兰氏阴性细菌的细胞周质间隙、或真核生物的内质网，后者通常导致蛋白质的糖基化。

本发明的变体核苷酸和氨基酸序列也涵盖诱变和致重组程序(如DNA改组)所衍生的序列。通过这样的程序，一个或多个不同的杀有害生物蛋白编码区可以用来产生具有所希望的特性的新杀有害生物蛋白。以此方式，从包含具有基本序列一致性且可以在体外或体内同源重组的序列区域的相关序列多核苷酸群产生重组多核苷酸文库。例如，使用此方法，编码感兴趣的结构域的序列基序可以在本发明的杀有害生物基因和其他已知的杀有害生物基因之间改组，以获得编码具有改进的感兴趣特性(如增加的杀昆虫活性)的蛋白质的新基因。用于这样的DNA改组的策略在本领域是已知的。参见例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature[自然]370:389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.[自然生物技术]15:436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]272:336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]94:4504-4509；Crameri等人(1998)Nature[自然]391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是用于产生改变的杀有害生物蛋白的另一种机制。结构域可以在杀有害生物蛋白之间进行交换，导致杂合或嵌合毒素具有改进的杀有害生物活性或目标光谱。用于产生重组蛋白和测试它们的杀有害生物活性的方法在本领域是众所周知的(参见例如，Naimov等人(2001)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]67:5328-5330；de Maagd等人(1996)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]62:1537-1543；Ge等人(1991)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]266:17954-17958；Schnepf等人(1990)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]265:20923-20930；Rang等人91999)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:2918-2925)。

在又另一个实施例中，使用以下各项中的一项或多项可以获得变体核苷酸和/或氨基酸序列：易错PCR、寡核苷酸定向诱变、组装PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因重组装、基因位点饱和诱变、置换诱变、合成连接重组装(SLR)、重组、递归序列重组、磷酸酯修饰的DNA诱变、含有尿嘧啶的模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺陷宿主菌株诱变、化学诱变、辐射所致诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体建立等。

载体

本发明的杀有害生物序列可以提供在用于在感兴趣的宿主细胞(例如植物细胞或微生物)中表达的表达盒中。“植物表达盒”是指能够引起来自植物细胞中的开放阅读框的蛋白质表达的DNA构建体。典型地，这些含有启动子和编码序列。通常，这样的构建体还含有3′非翻译区。这样的构建体可以含有“信号序列”或“前导序列”，以促进肽向某些细胞内结构的共翻译或翻译后转运，这些结构是如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。

“信号序列”是指已知或怀疑导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽转运的序列。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，有些会导致糖基化。细菌的杀昆虫毒素通常被合成为原毒素，它们在靶标有害生物的肠中被蛋白水解激活(Chang(1987)MethodsEnzymol.[酶学方法]153:507-516)。在本发明一些实施例中，信号序列位于天然序列中，或者可以从本发明的序列衍生而来。“前导序列”是指在翻译时产生足以触发肽链向亚细胞器的共翻译转运的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内、进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等来对转运和/或糖基化进行靶向的前导序列。因此，在此进一步提供了包含可操作地连接至异源前导序列或信号序列的本发明氨基酸序列的多肽。

“植物转化载体”是指有效转化植物细胞所必需的DNA分子。这样的分子可以由一个或多个植物表达盒组成，并且可以组织成一个以上“载体”DNA分子。例如，二元载体是利用两个非连续DNA载体编码转化植物细胞的所有必需的顺式和反式作用功能的植物转化载体(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science[植物科学趋势]5:446-451)。“载体”是指设计成在不同宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外源细胞中结合、整合和表达异源DNA序列或片段的能力的载体。该盒将包括可操作地连接至本发明的序列的5′和/或3′调节序列。“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列启动并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。通常，可操作地连接意味着连接的核酸序列是连续的，并且在需要接合两个蛋白质编码区时这些连接的核酸序列是连续的并处在同一阅读框中。在一些实施例中，核苷酸序列可操作地连接至能够指导所述核苷酸序列在宿主细胞(如微生物宿主细胞或植物宿主细胞)中的表达的异源启动子。此外，该盒可以含有至少一个有待共转化到生物体中的另外的基因。可替代地，可以在多个表达盒上提供这个或这些另外的基因。

在不同的实施例中，本发明的核苷酸序列可操作地连接至能够指导核苷酸序列在细胞中(例如，在植物细胞或微生物中)的表达的异源启动子。“启动子”是指作用是指导下游编码序列转录的核酸序列。启动子连同其他转录和翻译的调节核酸序列(也称为“控制序列”)是感兴趣的DNA序列的表达所必需的。

这样的表达盒设有多个限制位点，用于插入杀有害生物序列以便处于调节区的转录调控之下。

表达盒将以5′-3′转录方向包括转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明的DNA序列以及在植物中发挥作用的翻译和转录终止区(即，终止区)。启动子对于植物宿主和/或本发明的DNA序列而言可以是天然的或类似的、或外源的或异源的。此外，启动子可以是天然序列或者可替代地合成序列。在启动子对于植物宿主而言是“天然的”或“同源的”时，它是指启动子在被导入启动子的天然植物中发现。在启动子对于本发明的DNA序列而言是“外源的”或“异源的”时，它是指启动子对于可操作地连接的本发明的DNA序列而言不是天然的或天然存在的启动子。启动子可以是诱导型的或组成型的。它可以是天然存在的，可以由不同天然存在的启动子的部分组成，者可以是部分合成的或完全合成的。用于设计启动子的指导通过启动子结构的研究来提供，如Harley和Reynolds(1987)Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:2343-2361的研究。而且，可以优化启动子相对于转录起始的位置。参见例如，Roberts等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],76:760-764。用于在植物中使用的许多适合的启动子在本领域是众所周知的。

例如，用于在于植物中使用的适合的组成型启动子包括：来自植物病毒的启动子，如花生褪绿条纹花椰菜花叶病毒(PClSV)启动子(美国专利号5,850,019)；来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Odell等人(1985)Nature[自然]313:810-812)；小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利号5,563,328)和来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录体启动子(美国专利号5,378,619)；来自这样的基因的启动子，如稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2:163-171和美国专利5,641,876)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12:619-632和Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81:581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.[EMBO杂志]3:2723-2730和美国专利5,510,474)；玉米H3组蛋白(Lepetit等人(1992)Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]231:276-285和Atanassova等人(1992)Plant J.[植物杂志]2(3):291-300)；欧洲油菜ALS3(PCT申请WO 97/41228)；植物核酮糖-二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基基因；圆环病毒(AU 689 311)或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV，US 7,053,205)；以及各种农杆菌属基因的启动子(参见美国专利号4,771,002；5,102,796；5,182,200；和5,428,147)。

用于在植物中使用的适合的诱导型启动子包括：来自响应于铜的ACE1系统的启动子(Mett等人(1993)PNAS 90:4567-4571)；响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米In2基因的启动子(Hershey等人(1991)Mol.Gen.Genetics[分子与普通遗传学]227:229-237和Gatz等人(1994)Mol.Gen.Genetics[分子与普通遗传学]243:32-38)；以及来自Tn10的Tet阻遏子的启动子(Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]227:229-237)。用于在植物中使用的另一种诱导型启动子是响应于植物通常并不响应的诱导剂的启动子。此类型的示例性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的启动子，该基因的转录活性是通过糖皮质甾体激素(Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:10421)或最新应用嵌合转录激活剂XVE来诱导的，用于在通过雌二醇诱导的基于雌激素受体的诱导型植物表达系统中使用(Zuo等人(2000)Plant J.[植物杂志],24:265-273)。用于在植物中使用的其他诱导型启动子描述于EP 332104、PCT WO 93/21334和PCT WO 97/06269中，将其通过引用以其全文结合在此。还可以使用由其他启动子和部分或完全合成的启动子的部分组成的启动子。参见例如，描述用于在植物中使用的此类启动子的Ni等人(1995)Plant J.[植物杂志]7:661-676和PCT WO 95/14098。

在本发明的一个实施例中，对植物的特定区域或组织特异的启动子序列可以用于表达本发明的杀有害生物蛋白，如对种子特异的启动子(Datla,R.等人,1997,Biotechnology Ann.Rev.[生物技术年评]3,269-296)，尤其是napin启动子(EP 255378A1)、菜豆素启动子、麦谷蛋白启动子、向日葵蛋白(helianthinin)启动子(WO 92/17580)、白蛋白启动子(WO 98/45460)、油质蛋白启动子(WO 98/45461)、SAT1启动子或SAT3启动子(PCT/US 98/06978)。

还可以使用有利地选自以下各项的诱导型启动子：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、HMG-CoA还原酶(HMG)、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂(PI)、PR1家族基因、胭脂碱合酶(nos)和vspB启动子(US 5 670 349，表3)、HMG2启动子(US 5 670 349)、苹果β-半乳糖苷酶(ABG1)启动子和苹果氨基环丙烷羧酸合酶(ACC合酶)启动子(WO 98/45445)。多个启动子可以用于本发明的构建体中，包括依次使用。

启动子可以包括或者被修饰成包括一个或多个增强子元件。在一些实施例中，启动子可以包括多个增强子元件。含有增强子元件的启动子提供与不包含它们的启动子相比更高水平的转录。用于在植物中使用的适合的增强子元件包括PClSV增强子元件(美国专利号5,850,019)、CaMV 35S增强子元件(美国专利号5,106,739和5,164,316)和FMV增强子元件(Maiti等人(1997)Transgenic Res.[转基因研究]6:143-156)；在申请WO 87/07644中所述的烟草花叶病毒(TMV)的转录激活剂，或者由Carrington&Freed 1990,J.Virol.[病毒学杂志]64:1590-1597所述的烟草蚀纹病毒(TEV)的转录激活剂，例如，或者内含子，如玉米的adh1内含子或稻肌动蛋白的内含子1。还参见PCT WO 96/23898、WO 2012/021794、WO 2012/021797、WO 2011/084370和WO 2011/028914。

通常，这样的构建体可以含有5′和3′非翻译区。这样的构建体可以含有“信号序列”或“前导序列”，以促进感兴趣的肽向某些细胞内结构的共翻译或翻译后转运，或促使其分泌，这些结构是如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。例如，构建体可以被工程化为含有促进肽向内质网的转移的信号肽。“信号序列”是指已知或怀疑导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽转运的序列。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，有些会导致糖基化。“前导序列”是指在翻译时产生足以触发肽链向亚细胞器的共翻译转运的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内、进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等来对转运和/或糖基化进行靶向的前导序列。还可以优选地将植物表达盒工程化为含有内含子，使得表达需要内含子的mRNA加工。

“3′非翻译区”是指位于编码序列下游的多核苷酸。多腺苷酸化信号序列和编码能够影响将多腺苷酸段添加到mRNA前体的3′端的调控信号的其他序列都是3′非翻译区。“5′非翻译区”是指位于编码序列上游的多核苷酸。

其他上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是起增加启动子区的表达作用的多核苷酸。增强子在本领域是众所周知的，并且包括但不限于SV40增强子区和35S增强子元件。

终止区对于转录起始区而言可以是天然的，对于感兴趣的可操作地连接的DNA序列而言可以是天然的，对于植物宿主而言可以是天然的，或者可以从另一来源衍生而来(即，对于启动子、感兴趣的DNA序列、植物宿主或其任何组合而言是外源的或异源的)。方便的终止区可以从根癌农杆菌的Ti-质粒得到，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]262:141-144；Proudfoot(1991)Cell[细胞]64:671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.[基因与发育]5:141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2:1261-1272；Munroe等人(1990)Gene[基因]91:151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17:7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.[核酸研究]15:9627-9639。

在适当情况下，可以优化这个或这些基因以增加在转化宿主细胞中的表达(合成DNA序列)。也就是说，可以使用宿主细胞偏好的密码子合成基因以改进表达，或者可以根据宿主优选的密码子使用频率用密码子合成基因。合成DNA序列的开放阅读框在细胞中的表达使得产生本发明的多肽。合成DNA序列可以用于简单地去除不需要的限制性内切核酸酶位点、辅助DNA克隆策略、改变或去除任何潜在的密码子偏好、改变或提高GC含量、去除或改变备用阅读框、和/或改变或去除可能存在于天然DNA序列中的内含子/外显子剪接识别位点、多腺苷酸化位点、Shine-Delgarno序列、不需要的启动子元件等。通常，基因的GC含量将增加。关于宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如，Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.[植物生理学]92:1-11。用于合成植物偏好的基因的方法在本领域是可得的。参见例如，美国专利号5,380,831和5,436,391、美国专利公开号20090137409和Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17:477-498(通过引用结合在此)。

还可能的是合成DNA序列可以用于将其他改进引入DNA序列中，如引入内含子序列、产生表达为与细胞器靶向序列的蛋白质融合物的DNA序列，如叶绿体转运肽、质外体/空泡靶向肽或在内质网中引起所得肽截留的肽序列。因此，在一个实施例中，将杀有害生物蛋白靶向叶绿体进行表达。以此方式，在杀有害生物蛋白不是直接插入叶绿体中时，表达盒将另外含有编码转运肽的核酸以引导杀有害生物蛋白到叶绿体。这样的转运肽在本领域是已知的。参见例如，Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学导报]9:104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.[分子生物学杂志]264:17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.[植物生理学]84:965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯]196:1414-1421；和Shah等人(1986)Science[科学]233:478-481。

可以优化靶向至叶绿体的杀有害生物基因，以在叶绿体中表达，以说明在植物核和此细胞器之间的密码子使用差异。以此方式，可以使用叶绿体偏好的密码子合成感兴趣的核酸。参见例如，美国专利号5,380,831(通过引用结合在此)。

植物转化

本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物中。“引入”是指以使得构建体能够到达植物细胞内部的方式将核苷酸构建体提供给植物。本发明的方法不需要使用用于将核苷酸构建体引入植物中的具体方法，只需要该核苷酸构建体能够到达该植物的至少一个细胞的内部。用于将核苷酸构建体引入植物中的方法在本领域是已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬间转化法和病毒介导法。

“植物”是指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“转化植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已经将外源核酸序列或DNA片段结合到或整合到植物细胞中的植物。这些核酸序列包括那些外源的或者未转化的植物细胞中不存在的序列，以及那些可以是内源的或者未转化的植物细胞中存在的序列。“异源”通常是指对于所在细胞或天然基因组的一部分不是内源的，且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微映像(microprojection)等添加到细胞中的核酸序列，

本发明的转基因植物表达在此披露的一个或多个新颖毒素序列。在一些实施例中，本发明的蛋白质或核苷酸序列有利地在植物中与编码赋予这样的植物有用的农艺学特性的蛋白质或RNA的其他基因组合。在编码赋予转化植物有用的农艺学特性的蛋白质或RNA的基因中，可以提及的是编码赋予对一种或多种除草剂的耐受性的蛋白质和赋予对某些昆虫的耐受性的其他蛋白质、赋予对某些疾病的耐受性的那些蛋白质的DNA序列，编码提供线虫或昆虫控制的RNA的DNA等。这样的基因特别描述于公开的PCT专利申请WO 91/02071和WO95/06128以及美国专利7,923,602和美国专利公开号20100166723中，将其各自通过引用以其全文结合在此。

在编码赋予转化植物细胞和植物对某些除草剂的耐受性的蛋白质的DNA序列中，可以提及的是WO 2009/152359中描述的赋予对草丁磷除草剂的耐受性的bar或PAT基因或天蓝色链霉菌基因、编码赋予对以EPSPS为靶标的除草剂(如草甘膦及其盐)的耐受性的适合EPSPS的基因(US 4,535,060、US 4,769,061、US 5,094,945、US 4,940,835、US 5,188,642、US 4,971,908、US 5,145,783、US 5,310,667、US 5,312,910、US 5,627,061、US 5,633,435)、编码草甘膦-n-乙酰转移酶的基因(例如，US 8,222,489、US 8,088,972、US 8,044,261、US 8,021,857、US 8,008,547、US 7,999,152、US 7,998,703、US 7,863,503、US7,714,188、US 7,709,702、US 7,666,644、US 7,666,643、US 7,531,339、US 7,527,955和US 7,405,074)、编码草甘膦氧化还原酶的基因(例如，US 5,463,175)或编码HPPD抑制剂耐受蛋白的基因(例如WO 2004/055191、WO 199638567、US 6791014、WO 2011/068567、WO2011/076345、WO 2011/085221、WO 2011/094205、WO 2011/068567、WO 2011/094199、WO2011/094205、WO 2011/145015、WO 2012/056401和WO 2014/043435中描述的HPPD抑制剂耐受性基因)。

在编码赋予对以EPSPS为靶标的除草剂的耐受性的适合EPSPS的DNA序列中，将更具体地提及的是编码植物EPSPS，具体地是玉米EPSPS，具体地是包含两个突变(具体地是在氨基酸位置102处的突变和在氨基酸位置106处的突变)且描述于专利申请US 6566587中的玉米EPSPS(WO 2004/074443)(在下文称为双突变型玉米EPSPS或2mEPSPS)的基因，或编码从农杆菌属分离的EPSPS并且通过美国专利5,633,435的序列ID No.2和序列ID No.3描述的基因(也称为CP4)。

在编码赋予对以EPSPS为靶标的除草剂的耐受性的适合EPSPS的DNA序列中，将更具体地提及的是编码来自球形节杆菌的EPSPS GRG23而且编码突变体GRG23ACE1,GRG23ACE2或GRG23ACE3，具体地是如WO 2008/100353中所述的GRG23的突变体或变体，如WO2008/100353中的SEQ ID No.29的GRG23(ace3)R173K的基因。

在编码EPSPS并且更具体而言编码以上基因的DNA序列的情况下，编码这些酶的序列有利地在编码转运肽，具体而言在美国专利5,510,471或5,633,448中所述的“优化转运肽”的序列前面。

可以与本发明的核酸序列组合的示例性除草剂耐受性性状进一步包括至少一种ALS(乙酰乳酸合酶)抑制剂(WO 2007/024782)；突变的拟南芥ALS/AHAS基因(美国专利6,855,533)；编码通过代谢赋予对2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)的耐受性的2,4-D-单加氧酶的基因(美国专利6,153,401)；和编码通过代谢赋予对麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)的耐受性的麦草畏单加氧酶的基因(US 2008/0119361和US 2008/0120739)。

在不同的实施例中，本发明的核酸与一个或多个除草剂耐受性基因叠加，这些耐受性基因包括一个或多个HPPD抑制剂除草剂耐受性基因和/或对草甘膦和/或草丁磷耐受的一个或多个基因。

在编码涉及对昆虫的耐受性特性的蛋白质的DNA序列中，将更具体地提及的是在文献中广泛描述的并且本领域技术人员熟知的Bt蛋白。还将提及的是从细菌(如光杆状菌属)中提取的蛋白质(WO 97/17432&WO 98/08932)。

在编码赋予对昆虫的耐受性的新颖特性的感兴趣蛋白质的这样的DNA序列中，将更具体地提及的是在文献中广泛描述的并且本领域技术人员熟知的Bt Cry或VIP蛋白。这些蛋白质包括Cry1F蛋白或源自Cry1F蛋白的杂合体(例如，US 6,326,169；US 6,281,016；US 6,218,188中所述的杂合Cry1A-Cry1F蛋白或其毒性片段)、Cry1A型蛋白或其毒性片段优选地Cry1Ac蛋白或源自Cry1Ac蛋白的杂合体(例如，US 5,880,275中所述的杂合Cry1Ab-Cry1Ac蛋白)或如EP 451878中所述的Cry1Ab或Bt2蛋白或其杀昆虫片段、如WO 2002/057664中所述的Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白或其毒性片段、WO 2007/140256中所述的Cry1A.105蛋白(SEQ ID No.7)或其毒性片段、NCBI登录ABG20428的VIP3Aa19蛋白、NCBI登录ABG20429的VIP3Aa20蛋白(WO 2007/142840中的SEQ ID No.2)、在COT202或COT203棉花事件中产生的VIP3A蛋白(分别为WO 2005/054479和WO 2005/054480)、如WO 2001/47952中所述的Cry蛋白、如Estruch等人(1996),Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]28；93(11):5389-94和US 6,291,156中所述的VIP3Aa蛋白或其毒性片段、来自致病杆菌属(如WO 98/50427中所述的)、沙雷氏菌属(具体地是来自嗜虫沙雷氏菌(S.entomophila))或光杆状菌属菌株的杀昆虫蛋白(如来自光杆状菌属的如WO 98/08932中所述的Tc-蛋白)(例如，Waterfield等人,2001,Appl Environ Microbiol[应用与环境微生物学].67(11):5017-24；Ffrench-Constant和Bowen,2000,Cell Mol Life Sci[细胞与分子生命科学].；57(5):828-33)。在此还包括一些(1-10，优选地1-5个)氨基酸不同于任一以上序列的这些蛋白质中任一个的任何变体或突变体，这些序列具体地是其毒性片段的序列、或与转运肽(如质体转运肽)或另一种蛋白质或肽融合的序列。

在不同的实施例中，本发明的核酸可以在植物中与赋予所希望的性状的一个或多个因组合，这些性状是如除草剂耐受性、昆虫耐受性、耐旱性、线虫控制、水分利用效率、氮利用效率、提高的营养价值、抗病性、提高的光合作用、提高的纤维品质、胁迫耐受性、提高的再生等。

相同种类的植物中可以与本发明的基因组合的特别有用的转基因事件(例如，通过将含有另一个转基因事件的植物与本发明的嵌合基因杂交或通过用本发明的嵌合基因再转化该植物)包括事件531/PV-GHBK04(棉花，昆虫控制，在WO 2002/040677中所述的)、事件1143-14A(棉花，昆虫控制，无保藏，在WO 2006/128569中所述的)；事件1143-51B(棉花，昆虫控制，无保藏，在WO 2006/128570中所述的)；事件1445(棉花，除草剂耐受性，无保藏，在US-A 2002-120964或WO 2002/034946中所述的)、事件17053(稻，除草剂耐受性，保藏为PTA-9843，在WO 2010/117737中所述的)；事件17314(稻，除草剂耐受性，保藏为PTA-9844，在WO 2010/117735中所述的)；事件281-24-236(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-6233，在WO 2005/103266或US-A 2005-216969中所述的)；事件3006-210-23(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-6233，在US-A 2007-143876或WO 2005/103266中所述的)；事件3272(玉米，品质性状，保藏为PTA-9972，在WO 2006/098952或US-A 2006-230473中所述的)；事件33391(小麦，除草剂耐受性，保藏为PTA-2347，在WO 2002/027004中所述的)、事件40416(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-11508，在WO 11/075593中所述的)；事件43A47(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-11509，在WO2011/075595中所述的)；事件5307(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-9561，在WO 2010/077816中所述的)；事件ASR-368(常绿草，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-4816，在US-A2006-162007或WO 2004/053062中所述的)；事件B16(玉米，除草剂耐受性，无保藏，在US-A2003-126634中所述的)；事件BPS-CV127-9(大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB No.41603，在WO 2010/080829中所述的)；事件BLR1(油菜，雄性不育的恢复，保藏为NCIMB 41193，在WO2005/074671中所述的)、事件CE43-67B(棉花，昆虫控制，保藏为DSM ACC2724，在US-A2009-217423或WO 2006/128573中所述的)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，无保藏，在US-A2010-0024077中所述的)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，无保藏，在WO 2006/128571中所述的)；事件CE46-02A(棉花，昆虫控制，无保藏，在WO 2006/128572中所述的)；事件COT102(棉花，昆虫控制，无保藏，在S-A 2006-130175或WO 2004/039986中所述的)；事件COT202(棉花，昆虫控制，无保藏，在US-A 2007-067868或WO 2005/054479中所述的)；事件COT203(棉花，昆虫控制，无保藏，在WO 2005/054480中所述的)；)；事件DAS21606-3/1606(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-11028，在WO 2012/033794中所述的)、事件DAS40278(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-10244，在WO 2011/022469中所述的)；事件DAS-44406-6/pDAB8264.44.06.1(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-11336，在WO 2012/075426中所述的)、事件DAS-14536-7/pDAB8291.45.36.2(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-11335，在WO 2012/075429中所述的)、事件DAS-59122-7(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA11384，在US-A 2006-070139中所述的)；事件DAS-59132(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，无保藏，在WO 2009/100188中所述的)；事件DAS68416(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-10442，在WO 2011/066384或WO 2011/066360中所述的)；事件DP-098140-6(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8296，在US-A 2009-137395或WO 08/112019中所述的)；事件DP-305423-1(大豆，品质性状，无保藏，在US-A 2008-312082或WO 2008/054747中所述的)；事件DP-32138-1(玉米，杂交系统，保藏为ATCC PTA-9158，在US-A 2009-0210970或WO 2009/103049中所述的)；事件DP-356043-5(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8287，在US-A2010-0184079或WO 2008/002872中所述的)；事件EE-1(茄子，昆虫控制，无保藏，在WO 07/091277中所述的)；事件FI117(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC 209031，在US-A 2006-059581或WO 98/044140中所述的)；事件FG72(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-11041，在WO2011/063413中所述的)、事件GA21(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC 209033，在US-A2005-086719或WO 98/044140中所述的)；事件GG25(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC209032，在US-A 2005-188434或WO 98/044140中所述的)；事件GHB119(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8398，在WO 2008/151780中所述的)；事件GHB614(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-6878，在US-A 2010-050282或WO 2007/017186中所述的)；事件GJ11(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC 209030，在US-A 2005-188434或WO 98/044140中所述的)；事件GM RZ13(甜菜，抗病毒性，保藏为NCIMB-41601，在WO 2010/076212中所述的)；事件H7-1(甜菜，除草剂耐受性，保藏为NCIMB 41158或NCIMB 41159，在US-A 2004-172669或WO 2004/074492中所述的)；事件JOPLIN1(小麦，耐病性，无保藏，在US-A 2008-064032中所述的)；事件LL27(大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB41658，在WO 2006/108674或US-A2008-320616中所述的)；事件LL55(大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB 41660，在WO 2006/108675或US-A 2008-196127中所述的)；事件LLcotton25(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCCPTA-3343，在WO 2003/013224或US-A 2003-097687中所述的)；事件LLRICE06(稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC 203353，在US 6,468,747或WO 2000/026345中所述的)；事件LLRice62(稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC 203352，在WO 2000/026345中所述的)、事件LLRICE601(稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-2600，在US-A 2008-2289060或WO 2000/026356中所述的)；事件LY038(玉米，品质性状，保藏为ATCC PTA-5623，在US-A 2007-028322或WO2005/061720中所述的)；事件MIR162(玉米，昆虫控制，保藏为PTA-8166，在US-A 2009-300784或WO 2007/142840中所述的)；件MIR604(玉米，昆虫控制，无保藏，在US-A 2008-167456或WO 2005/103301中所述的)；事件MON15985(棉花，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-2516，在US-A 2004-250317或WO 2002/100163中所述的)；事件MON810(玉米，昆虫控制，无保藏，在US-A 2002-102582中所述的)；事件MON863(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-2605，在WO 2004/011601或US-A 2006-095986中所述的)；事件MON87427(玉米，授粉控制，保藏为ATCC PTA-7899，在WO 2011/062904中所述的)；事件MON87460(玉米，胁迫耐受性，保藏为ATCC PTA-8910，在WO 2009/111263或US-A 2011-0138504中所述的)；事件MON87701(大豆，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-8194，在US-A 2009-130071或WO 2009/064652中所述的)；事件MON87705(大豆，品质性状-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-9241，在US-A 2010-0080887或WO 2010/037016中所述的)；事件MON87708(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCCPTA-9670，在WO 2011/034704中所述的)；事件MON87712(大豆，产率，保藏为PTA-10296，在WO 2012/051199中所述的)、事件MON87754(大豆，品质性状，保藏为ATCC PTA-9385，在WO2010/024976中所述的)；事件MON87769(大豆，品质性状，保藏为ATCC PTA-8911，在US-A2011-0067141或WO 2009/102873中所述的)；事件MON88017(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-5582，在US-A 2008-028482或WO 2005/059103中所述的)；事件MON88913(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-4854，在WO 2004/072235或US-A 2006-059590中所述的)；事件MON88302(油菜，除草剂耐受性，保藏为PTA-10955，在WO 2011/153186中所述的)、事件MON88701(棉花，除草剂耐受性，保藏为PTA-11754，在WO 2012/134808中所述的)、事件MON89034(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-7455，在WO 07/140256或US-A 2008-260932中所述的)；事件MON89788(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-6708，在US-A 2006-282915或WO 2006/130436中所述的)；事件MS11(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-850或PTA-2485，在WO 2001/031042中所述的)；事件MS8(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-730，在WO 2001/041558或US-A 2003-188347中所述的)；事件NK603(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-2478，在US-A 2007-292854中所述的)；事件PE-7(稻，昆虫控制，无保藏，在WO 2008/114282中所述的)；事件RF3(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-730，在WO 2001/041558或US-A 2003-188347中所述的)；事件RT73(油菜，除草剂耐受性，无保藏，在WO 2002/036831或US-A 2008-070260中所述的)；事件SYHT0H2/SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-11226，在WO 2012/082548中所述的)、事件T227-1(甜菜，除草剂耐受性，无保藏，在WO 2002/44407或US-A2009-265817中所述的)；事件T25(玉米，除草剂耐受性，无保藏，在US-A 2001-029014或WO2001/051654中所述的)；事件T304-40(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8171，在US-A 2010-077501或WO 2008/122406中所述的)；事件T342-142(棉花，昆虫控制，无保藏，在WO 2006/128568中所述的)；事件TC1507(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，无保藏，在US-A 2005-039226或WO 2004/099447中所述的)；事件VIP1034(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-3925.，在WO 2003/052073中所述的)、事件32316(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-11507，在WO 2011/084632中所述的)、事件4114(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-11506，在WO 2011/084621中所述的)、事件EE-GM3/FG72(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11041)任选地与事件EE-GM1/LL27或事件EE-GM2/LL55(WO 2011/063413A2)叠加、事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10442，WO 2011/066360A1)、事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10442，WO 2011/066384A1)、事件DP-040416-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11508，WO2011/075593A1)、事件DP-043A47-3(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11509，WO 2011/075595A1)、事件DP-004114-3(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11506，WO 2011/084621A1)、事件DP-032316-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11507，WO 2011/084632A1)、事件MON-88302-9(油菜，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10955，WO 2011/153186A1)、事件DAS-21606-3(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11028，WO 2012/033794A2)、事件MON-87712-4(大豆，品质性状，ATCC登录号PTA-10296，WO 2012/051199A2)、事件DAS-44406-6(大豆，叠加的除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11336，WO2012/075426A1)、事件DAS-14536-7(大豆，叠加的除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11335，WO2012/075429A1)、事件SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11226，WO 2012/082548A2)、事件DP-061061-7(油菜，除草剂耐受性，无保藏号可用，WO 2012071039A1)、事件DP-073496-4(油菜，除草剂耐受性，无保藏号可用，US 2012131692)、事件8264.44.06.1(大豆，叠加的除草剂耐受性，登录号PTA-11336，WO 2012075426A2)、事件8291.45.36.2(大豆，叠加的除草剂耐受性，登录号PTA-11335，WO 2012075429A2)、事件SYHT0H2(大豆，ATCC登录号PTA-11226，WO 2012/082548A2)、事件MON88701(棉花，ATCC登录号PTA-11754，WO2012/134808A1)、事件KK179-2(苜蓿，ATCC登录号PTA-11833，WO 2013/003558A1)、事件pDAB8264.42.32.1(大豆，叠加的除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11993，WO 2013/010094A1)、事件MZDT09Y(玉米，ATCC登录号PTA-13025，WO 2013/012775A1)。

植物细胞的转化可以通过本领域已知的几种技术之一实现。本发明的杀有害生物基因可以被修饰，以获得或增强在植物细胞中的表达。典型地，表达这样的蛋白质的构建体会含有启动子以驱动基因转录，并且含有3′非翻译区以使转录终止和多腺苷酸化。这样的构建体的组织在本领域是众所周知的。在一些情况下，工程化基因可能是有用的，使得分泌由此所得肽，或以其他方式将其靶向在植物细胞内。例如，基因可以被工程化为含有促进肽向内质网的转移的信号肽。还可以优选地将植物表达盒工程化为含有内含子，使得表达需要内含子的mRNA加工。

典型地，此“植物表达盒”将被插入“植物转化载体”中。此植物转化载体可以包含实现植物转化所需要的一种或多种DNA载体。例如，本领域的惯例是使用包含一个以上的连续DNA区段的植物转化载体。这些载体在本领域通常称为“二元载体”。二元载体以及带有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现高效转化所需的DNA区段的大小和复杂度都是非常大的，且将功能分离到分离的DNA分子上是有利的。二元载体典型地含有质粒载体，该质粒载体含有T-DNA转移所需的顺式作用序列(如左边界和右边界)、工程化为能够在植物细胞中表达的选择性标记和“感兴趣基因”(工程化为能够在植物细胞中表达的基因，对它而言转基因植物的产生是所希望的)。此质粒载体上还存在细菌复制所需的序列。这些顺式作用序列以如下方式进行排列以便允许有效转移到植物细胞中并在其中进行表达。例如，选择性标记基因和杀有害生物基因位于左右边界之间。通常，第二质粒载体含有反式作用因子，这些反式作用因子介导从农杆菌到植物细胞的T-DNA转移。此质粒通常含有毒性作用(Vir基因)，这些毒性功能允许植物细胞被农杆菌属感染，并且通过在边界序列上的切割和vir介导的DNA转移来转移DNA，如在本领域所理解的(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science[植物科学趋势]5:446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物转化。第二质粒载体是通过其他方法(如显微映像、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等)转化这些植物并非必要。

通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移进入靶植物细胞(例如不成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质等)，接着是应用最大阈值水平的适当选择(取决于选择性标记基因)来从一群未转化细胞团中回收转化植物细胞。典型地，将外植体转移到新供应的相同培养基中，并常规培养。随后，在放置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基上之后，使转化细胞分化成嫩芽。然后将嫩芽转移到选择性生根培养基中，用于回收生根的嫩芽或小植株。然后转基因小植株成长为成熟植物并产生稔性种子(例如Hiei等人(1994)The Plant Journal[植物杂志]6:271-282；Ishida等人(1996)NatureBiotechnology[自然生物技术]14:745-750)。典型地，将外植体转移到新供应的相同培养基中，并常规培养。用于产生转基因植物的技术与方法的一般说明可见于Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science [植物科学关键性评论]13:219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42:107-120。由于转化材料含有许多细胞；在任何一片受试的目标愈伤组织或组织或细胞群中同时存在转化细胞和未转化细胞。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖的能力产生转化植物培养物。通常，去除未转化细胞的能力限制转化植物细胞的快速回收和转基因植物的成功产生。

转化方案以及用于将核苷酸序列引入植物中的方案可依据靶向用于转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而变化。可以通过几种方法之一产生转基因植物，这些方法包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转移、通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌介导的转化)、用粘附于颗粒的异源外源DNA轰击植物细胞、弹道的颗粒加速、气溶胶束转化(美国公开申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公开号WO 91/00915；美国公开申请号2002015066)、Lec1转化以及用于转移DNA的不同的其他非微粒直接介导方法。

用于转化叶绿体的方法在本领域是已知的。参见例如，Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBOJ.[EMBO杂志]12:601-606。该方法依赖于基因枪递送含有选择性标记的DNA，且通过同源重组将DNA靶向至质体基因组中。另外，质体转化可以通过核编码的和质体指导的RNA聚合酶的组织偏好表达，通过沉默的携带质体的转基因的反式激活来完成。这样的系统已经报道于McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91:7301-7305。

将异源外源DNA整合到植物细胞中之后，然后在培养基中应用最大阈值水平的适当选择以杀死未转化细胞,并且通过定期转移到新鲜培养基中来分离和增殖从此选择处理中存活的假定转化细胞。通过连续传代和用适当选择激发，鉴定并增殖用质粒载体转化的细胞。然后，可以使用分子和生物化学的方法来证实整合到转基因植物的基因组中的感兴趣的异源基因的存在。

可以根据常规方法使已经转化的细胞长成植物。参见例如，cCormick等(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5:81-84。然后可以使这些植物生长，并且用相同的转化品系或不同的品系进行授粉，并且鉴定出所得具有所希望的表型特征的组成型表达的杂合体。可以使两代或更多代生长以确保所希望的表型特征的表达被稳定地维持并遗传，然后收获种子以确保已经实现了所希望的表型特征的表达。以此方式，本发明提供了在其基因组中稳定地结合了本发明的核苷酸构建体(例如，本发明的表达盒)的转化种子(也称作“转基因种子”)。

植物转化的评估

将异源外源DNA引入植物细胞中之后，通过不同的方法来证实异源基因在植物基因组中的转化或整合，这些方法是如对与整合基因相关联的核酸、蛋白质和代谢产物进行分析。

PCR分析是在移植到土壤中之前的早期阶段筛选转化的细胞、组织或嫩芽中所结合基因的存在的快速方法(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册].Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约州)。使用对感兴趣基因或农杆菌载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。

可以通过基因组DNA的Southern印迹分析证实植物转化(Sambrook和Russell,2001，同上)。通常，从转化体中提取总DNA，用适当的限制酶消化，在琼脂糖凝胶上分级分离，并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后根据标准技术(Sambrook和Russell,2001，同上)，用例如放射性标记的³²P靶DNA片段探测膜或“印迹”，以证实所引入的基因整合到植物基因组中。

在Northern印迹分析中，按照本领域常规使用的标准程序(Sambrook和Russell,2001，同上)，将RNA从转化体的特定组织中分离，在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，并印迹到尼龙滤膜上。然后通过本领域已知的方法(Sambrook和Russell,2001，同上)，通过使滤膜与源自于杀有害生物基因的放射性探针杂交，测试杀有害生物基因编码的RNA的表达。

使用与存在于杀有害生物蛋白上的一种或多种表位结合的抗体，可以对转基因植物进行Western印迹、生物化学测定等，以便通过标准程序(Sambrook和Russell,2001，同上)证实由杀有害生物基因编码的蛋白质的存在。

植物中的杀有害生物活性

在本发明的另一个方面，可以产生表达具有杀有害生物活性的杀有害生物蛋白的转基因植物。上文通过实例的方式描述的方法可以用来产生转基因植物，但是产生转基因植物细胞的方式对本发明而言不是至关重要的。本领域已知的或描述的方法(如农杆菌介导的转化、基因枪转化和非颗粒介导的方法)可以根据实验者的判断来使用。表达杀有害生物蛋白的植物可以通过本领域中描述的常规方法来分离，例如通过愈伤组织转化、转化愈伤组织的选择和从这样的转基因愈伤组织再生可育植物。在这样的过程中，可以使用任何基因作为选择性标记，只要它在植物中的表达赋予鉴定和选择转化细胞的能力。

已经开发了很多用于与植物细胞一起使用的标记，如对氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等的抗性。编码涉及叶绿体代谢的产物的其他基因也可以用作选择性标记。例如，提供对植物除草剂(如草甘磷、溴苯腈或咪唑琳酮)的抗性的基因可以具有特别的用途。这样的基因已经被报道(Stalker等人(1985)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；和Sathasivan等人(1990)Nucl.Acids Res.[核酸研究]18:2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因))。另外，在此披露的基因可用作评估细菌或植物细胞转化的标记。用于在植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其子代中检测转基因的存在的方法在本领域是众所周知的。在一个实施例中，转基因的存在通过测试杀有害生物活性来检测。

可以测试表达杀有害生物蛋白的可育植物的杀有害生物活性，并且选择显示出最佳活性的植物以用于进一步育种。用于测定有害生物活性的方法在本领域是可用的。通常，该蛋白质被混合并用于饲喂测定。参见例如，Marrone等人(1985)J.of EconomicEntomology[经济昆虫学杂志]78:290-293。

本发明可以用于转化任何植物种类，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于玉米(corn，maize)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸苔属、苜蓿、黑麦、粟类、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶叶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲坚果、杏、燕麦、蔬菜、观赏植物以及针叶树。

蔬菜包括但不限于番茄、莴苣、青豆、菜豆、豌豆以及香瓜属的成员(如黄瓜、哈密瓜和甜瓜)。观赏植物包括但不限于杜鹃花、锈球花、芙蓉、玫瑰、郁金香、黄水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红以及菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等)。

在杀有害生物控制方面的用途

用于采用包含本发明的核苷酸序列或其变体的菌株在有害生物控制或工程化其他生物体作为杀有害生物剂的一般方法在本领域是已知的。参见例如，美国专利号5,039,523和EP 0480762A2。

含有本发明的核苷酸序列或其变体的芽孢杆菌属菌株、或遗传上被改变成含有本发明的杀有害生物基因和蛋白质的微生物可以用于保护农作物和产品防御有害生物。在本发明的一个方面，当细胞施用到一种或多种靶标有害生物的环境时，产生毒素(杀有害生物剂)的生物体的完整的(即，未裂解的)细胞用延长细胞中产生的毒素的活性的试剂处理。

可替代地，杀有害生物剂通过将杀有害生物基因引入细胞宿主中来产生。杀有害生物基因的表达直接地或间接地导致杀有害生物剂在细胞内产生和维持。在本发明的一个方面，当细胞施用到一种或多种靶标有害生物的环境时，然后在延长在细胞中产生的毒素的活性的条件下处理这些细胞。所得产物保留了毒素的毒性。这些天然封装的杀有害生物剂然后可以依照常规技术配制用于施用到寄宿着靶标有害生物的环境(例如，土壤、水和植物的叶)。参见例如EPA 0192319和其中引用的参考文献。可替代地，可以配制表达本发明的基因的细胞以便允许施用所得材料作为杀有害生物剂。

本发明的活性成分通常是以组合物的形式施用，并且可以与其他化合物同时或依次施用到待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀有害生物皂、休眠油、聚合物、和/或定时释放或生物可降解的载体配制品，其允许单次施用该配制品后目标区域的长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化学杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、或几种这些制剂的混合物，如果希望的话，与其他农业上可接受的载体、表面活性剂或在配制品领域中通常采用的促进施用的佐剂一起。适合的载体和佐剂可以是固体或液体，并对应在配制技术中通常所用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，这些配制品可以制备成可食用的“诱饵”或塑造成有害生物“陷阱”，以允许被杀有害生物配制品的靶标有害生物摄食或摄取。

施用本发明的活性成分或本发明的农业化学组合物(该组合物含有由本发明的细菌菌株所产生的杀有害生物蛋白中的至少一种)的方法包括叶施用、种子涂覆和土壤施用。施用次数和施用率取决于被相应有害生物侵染的强度。

可以将该组合物配制成粉末、粉剂、小丸、颗粒、喷雾剂、乳液、胶体、溶液等，并且可以通过常规方法来制备，如干燥、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉降或浓缩包含该多肽的细胞培养物。在含有至少一种这样的杀有害生物多肽的所有这些组合物中，多肽可以按从约1％至约99％的浓度(按重量计)存在。

可以在给定的区域内通过本发明的方法来杀死鳞翅目、半翅目、双翅目或鞘翅目有害生物或减少其数目，或者可以将它们预防性地施用到环境区域内以防止被易感有害生物侵染。优选地，有害生物摄取或接触杀有害生物有效量的多肽。“杀有害生物有效量”是指能够对至少一种有害生物致死，或显著地减少有害生物生长、摄食或正常的生理发育的杀有害生物剂的量。此量将取决于以下因素而变化：例如，待控制的特定的靶标有害生物；待处理的特定的环境、地点、植物、作物、或农业场所；环境条件；以及施用杀有害生物有效的多肽组合物的方法、比率、浓度、稳定性和数量。这些配制品还可以相对于气候条件、环境考虑和/或施用频率和/或有害生物侵染的严重性而变化。

可以通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬浮液、或分离的蛋白质组分与所希望的农业上可接受的载体配制在一起来制备所述杀有害生物剂组合物。这些组合物可以在施用前以适当方法如冻干、冷冻干燥、干燥、或在水性载体、介质或适合的稀释剂如生理盐水或其他缓冲液中来配制。配制的组合物可以处于以下形式：粉剂或颗粒材料、或在油(植物性或矿物性)中的悬浮液、或水或油/水乳液、或作为可湿性粉末、或与适合农业施用的任何其他载体材料相组合。适合的农业载体可以是固体或液体，并且在领域是众所周知的。术语“农业上可接受的载体”覆盖了通常在杀有害生物剂配制技术中所用的所有的佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些是杀有害生物剂配制领域的技术人员所熟知的。这些配制品可以与一种或多种固体或液体佐剂混合并通过多种方法，例如通过使用常规的配制技术将杀有害生物组合物与适合的佐剂进行均匀地混合、掺合和/或研磨。适合的配制品和施用方法描述于美国专利号6,468,523(通过引用结合在此)中。

“有害生物”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨虫、蜱等。昆虫有害生物包括选自以下目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特别是鞘翅目、鳞翅目和双翅目。

鞘翅目包括肉食亚目和多食亚目。肉食亚目包括步甲总科和豉甲总科，而多食亚目包括水龟虫总科、隐翅虫总科、花萤总科、郭公虫总科、叩头虫总科、花甲总科、泥甲总科、丸甲总科、扁甲总科、芫菁总科、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步行虫总科、长蠹总科、金龟总科、天牛总科、叶甲总科和象甲总科。步甲总科包括虎甲科、步行虫科和龙虱科。豉甲总科包括豉甲科。水龟虫总科包括水龟虫科。隐翅虫总科包括埋葬虫科和隐翅虫科。花萤总科包括花萤科和萤科。郭公虫总科包括郭公虫科和皮蠹科。叩头虫总科包括叩头虫科和吉丁虫科。扁甲总科包括瓢虫科。芫菁总科包括芫菁科。拟步行虫总科包括拟步行虫科。金龟总科包括黑蜣科和金龟科。天牛总科包括天牛科。叶甲总科包括叶甲科。象甲总科包括象甲科和小蠹科。

双翅目包括长角亚目、短角亚目和环裂亚目。长角亚目包括大蚊科、毛蠓科、蚊科、蠓科、摇蚊科、蚋科、毛蚊科和瘿蚊科。短角亚目包括水虻科、虻科、剑虻科、食虫虻科、拟食虫虻科、蜂虻科和长足虻科。环裂亚目包括无缝组和无缝组。无缝组包括蚤蝇科、食蚜蝇科和眼蝇科。无缝组包括无瓣类和有瓣类。无瓣类包括斑蝇科、实蝇科、潜蝇科和果蝇科。有瓣类包括虱蝇科、狂蝇科、寄蝇科、花蝇科、蝇科、丽蝇科和麻蝇科。

鳞翅目包括凤蝶科、粉蝶科、灰蝶科、蛱蝶科、斑蝶科、眼蝶科、弄蝶科、天蛾科、天蚕蛾科、尺蛾科、灯蛾科、夜蛾科、毒蛾科、透翅蛾科和谷蛾科。

线虫包括寄生性线虫，如根结线虫、胞囊线虫和根腐线虫，包括异皮线虫属、根结线虫属和球异皮线虫属；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)；甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)(甜菜胞囊线虫)；燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)(燕麦胞囊线虫)；以及马铃薯金线虫和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫)。根腐线虫包括短体线虫属。

半翅目有害生物(其包括指定为半翅目、同翅目或异翅亚目的物种)包括但不限于草盲蝽属，如西方无泽盲蝽(Western tarnished plant bug)(豆荚草盲蝽)、无泽盲蝽(tarnished plant bug)(美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris))和绿盲蝽(green plantbug)(伊利苏斯草盲蝽(Lygus elisus))；蚜虫，如碧桃蚜(green peach aphid)(桃蚜(Myzus persicae))、棉花蚜虫(棉蚜)、樱桃蚜虫或黑樱桃蚜虫(樱桃黑瘤额蚜(Myzuscerasi))、大豆蚜虫(大豆蚜(Aphis glycines Matsumura))；褐飞虱(brown planthopper，Nilaparvata lugens)、和稻青叶蝉(rice green leafhopper)(黑尾叶蝉属)；以及蝽象，如绿色蝽象(喜绿蝽(Acrosternum hilare))、棕色大理石纹蝽象(brown marmoratedstink bug)(茶翅蝽)、南方绿色蝽象(稻绿蝽(Nezara viridula))、稻蝽象(美洲稻蝽)、森林红蝽(forest bug)(红足真蝽(Pentatoma rufipes))、欧洲蝽象(砂枣蝽(Rhaphigasternebulosa))和盾椿象耳蝽(Troilus luridus)。

对于主要作物的本发明的昆虫有害生物包括：玉米：玉米螟(Ostrinianubilalis)，欧洲玉米螟(European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon)，黑切根虫(black cutworm)；玉米穗虫(Helicoverpa zea)，玉米穗蛾(corn earworm)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fall armyworm)；西南玉米秆草螟(Diatraeagrandiosella)，西南玉米螟(southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)，小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer)；小蔗秆草螟(Diatraeasaccharalis)，甘蔗螟虫(surgarcane borer)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)，西方玉米根虫(western corn rootworm)；长角叶甲巴氏亚种(Diabrotica longicornisbarberi)，北方玉米根虫(northern corn rootworm)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)，南方玉米根虫(southern corn rootworm)；梳爪叩头虫属(Melanotus spp.)，金针虫(wireworms)；北方圆头犀金龟(Cyclocephalaborealis)，北方蒙面金龟子(northern masked chafer)(蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)，南方蒙面金龟子(southern masked chafer)(蛴螬)；日本弧丽金龟(Popillia japonica)，日本金龟子(Japanese beetle)；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲(corn flea beetle)；玉米谷象(Sphenophorusmaidis，maize billbug)；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)，玉米叶蚜虫；玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis)，玉米根蚜虫；美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterusleucopterus)，高粱长蝽(chinch bug)；红足黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红胫蝗虫(redlegged grasshopper)；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蝗虫；玉米种蝇(Hylemya platura)，种蝇(seedcorn maggot)；玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis，cornblot leafminer)；玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus)，草蓟马；窃蚁(Solenopsismilesta，thief ant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；高粱：斑禾草螟(Chilo partellus)，高粱螟；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fall armyworm)；考斯夜蛾(Spodoptera cosmioides)；南方灰翅夜蛾(Spodopteraeridania)；玉米穗虫(Helicoverpa zea)，玉米穗蛾(corn earworm)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer)；斑点夜蛾(Feltia subterranea)，颗粒地老虎(granulate cutworm)；长毛食叶然金龟(Phyllophagacrinita)，蛴螬；伪金针虫属、宽胸叩头虫属和Aeolus属，金针虫；黑角负泥虫(Oulemamelanopus)，谷类叶甲；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲(corn fleabeetle)；玉米谷象(Sphenophorus maidis，maize billbug)；玉米缢管蚜；玉米叶蚜；美甘蔗伪毛蚜(Sipha flava)，黄甘蔗蚜；美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterusleucopterus)，高粱长蝽(chinch bug)；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola，sorghummidge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus，carmine spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospotted spider mite)；小麦：一点黏虫(Pseudaletiaunipunctata)，粘虫(army worm)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fallarmyworm)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫(lessercornstalk borer)；西方灰地老虎(Agrotis orthogonia)，西方地老虎；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer)；黑角负泥虫(Oulema melanopus)，谷类叶甲；三叶草叶象(Hypera punctata，clover leaf weevil)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)，南方玉米根虫(southern corn rootworm)；俄罗斯小麦蚜虫；麦二叉蚜(Schizaphis graminum，greenbug)；麦长管蚜(Macrosiphum avenae，English grain aphid)；红足黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红胫蝗虫(redlegged grasshopper)；异黑蝗(Melanoplusdifferentialis)，异蝗虫(differential grasshopper)；血黑蝗(Melanoplussanguinipes)，迁徙蝗虫；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊(Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)，小麦吸浆虫(wheat midge)；美洲杆蝇(Meromyzaamericana)，麦秆蝇(wheat stem maggot)；麦种蝇(Hylemya coarctata，wheat bulbfly)；烟褐花蓟马(Frankliniella fusca)，烟草蓟马；麦茎蜂(Cephus cinctus，wheatstem sawfly)；麦瘿螨(Aceria tulipae)，小麦曲叶螨(wheat curl mite)；向日葵：向日葵芽卷叶蛾(Suleima helianthana)，向日葵芽蛾；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)，向日葵蛾；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis)，向日葵甲虫；胡萝卜金龟(Bothyrusgibbosus)，胡萝卜甲虫；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana，sunflower seedmidge)；棉花：烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，棉花蚜虫；玉米穗虫(Helicoverpa zea)，棉铃虫(cotton bollworm)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua，beet armyworm)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)，粉色棉铃虫(pink bollworm)；棉铃象(Anthonomusgrandis)，棉子象鼻虫(boll weevil)；棉蚜(Aphis gossypii)，棉花蚜虫；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)，棉花跳盲蝽(cotton fleahopper)；温室粉虱(Trialeurodes abutilonea)，带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，无泽盲蝽(tarnished plant bug)；红足黑蝗(Melanoplusfemurrubrum)，红胫蝗虫(redlegged grasshopper)；异黑蝗(Melanoplusdifferentialis)，异蝗虫(differential grasshopper)；烟蓟马(Thrips tabaci)，洋葱蓟马；烟褐花蓟马(Franklinkiella fusca)，烟草蓟马；朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus，carmine spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae，twospottedspider mite)；稻：小蔗秆草螟(Diatraea saccharalis)，甘蔗螟虫(sugarcane borer)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fall armyworm)；考斯夜蛾(Spodopteracosmioides)；南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)；玉米穗虫(Helicoverpa zea)，玉米穗蛾(corn earworm)；葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea，grape colaspis)；稻水象(Lissorhoptrus oryzophilus，ricewater weevil)；米象(Sitophilus oryzae，riceweevil)；二条黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)，稻叶蝉；美洲毛谷杆长蝽(Blissusleucopterusleucopterus)，高粱长蝽(chinch bug)；喜绿蝽(Acrosternum hilare)，绿色蝽象；二化螟(Chilu suppressalis)，亚洲稻螟；大豆：大豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens，soybean looper)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis，velvetbeancaterpillar)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra，green cloverworm)；玉米螟(Ostrinianubilalis)，欧洲玉米螟(European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon)，黑切根虫(black cutworm)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua，beet armyworm)；考斯夜蛾(Spodopteracosmioides)；南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)；烟芽夜蛾(Heliothis virescens)，棉花蚜虫；玉米穗虫(Helicoverpa zea)，棉铃虫(cotton bollworm)；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis，Mexican bean beetle)；桃蚜(Myzus persicae)，碧桃蚜；蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae)，马铃薯叶蝉(potato leafhopper)；喜绿蝽(Acrosternumhilare)，绿色蝽象；红足黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红胫蝗虫(redleggedgrasshopper)；异黑蝗(Melanoplus differentialis)，异蝗虫(differentialgrasshopper)；玉米种蝇(Hylemya platura)，种蝇(seedcorn maggot)；大豆蓟马(Sericothrips variabilis，soybean thrips)；烟蓟马(Thrips tabaci)，洋葱蓟马；草莓叶螨(Tetranychus turkestani，strawberry spider mite)；二斑叶螨(Tetranychusurticae，twospotted spider mite)；大麦：玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米螟(European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon)，黑切根虫(black cutworm)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum，greenbug)；美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterusleucopterus)，高粱长蝽(chinch bug)；喜绿蝽(Acrosternum hilare)，绿色蝽象；烟草蝽(Euschistus servus)，褐臭蝽(brown stink bug)；英雄美洲蝽(Euschistus heros)，新热带褐臭蝽(neotropical brown stink bug)；灰地种蝇(Delia platura)，种蝇(seedcornmaggot)；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊(Hessian fly)；麦岩螨(Petrobialatens)，麦长腿蜘蛛(brown wheat mite)；油籽油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，卷心菜蚜；萝卜菜跳甲(Phyllotreta cruciferae)，跳甲；蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata)，披肩粘虫(Bertha armyworm)；小菜蛾(Plutella xylostella，Diamond-back moth)；地种蝇属，根蛆。

用于增加植物产量的方法

提供了增加植物产量的方法。这些方法包括提供表达编码在此披露的杀有害生物多肽序列的多核苷酸的植物或植物细胞并且在被有害生物侵染(或者易受到有害生物侵染)的田地中使该植物或其种子生长，所述多肽具有针对该有害生物的杀有害生物活性。在一些实施例中，该多肽具有针对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫有害生物的杀有害生物活性，并且所述田地被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫有害生物侵染。如在此所定义的，植物的“产量”是指植物产生的生物质的质量和/或数量。“生物质”是指任何测得的植物产品。生物质产量的增加是测得的植物产品的产量的任何提高。增加植物产量有几个商业应用。例如，增加植物叶片的生物质可以增加绿叶蔬菜的产量供人类或动物消费。此外，增加叶生物质可以用于增加植物源性制药或工业产品的生产。产量的增加可以包括任何统计上显著的增加，包括但不限于，相比不表达杀有害生物序列的植物在产量上增加至少1％、至少3％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更多。在具体方法上，植物产量的提高是由于表达在此披露的杀有害生物蛋白的植物的有害生物抗性增加。杀有害生物蛋白的表达导致有害生物感染或摄食能力降低。

植物也可以用一种或多种化学组合物(包括一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂)处理。示例性化学组合物包括：水果/蔬菜类除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵磷、氯吡延命菊、百草枯、戊炔草胺、稀禾定、氟丙嘧草酯、氯吡、茚嗪氟草胺；水果/蔬菜杀昆虫剂：涕灭威、苏云金芽孢杆菌、西维因、呋喃丹、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、氟氯氰菊酯/高效氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、高效氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、氟酰脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、螺螨酯、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、溴氰虫酰肼、杀铃脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氟虫酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、腈吡螨酯(cyenopyrafen)、噻虫胺、噻虫嗪、赐诺特(spinotoram)、硫双威、氟啶虫酰胺、灭虫威、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、茚虫威、苯线磷、吡丙醚、苯丁氧化物；水果/蔬菜杀真菌剂：唑嘧菌胺、嘧菌酯、苯噻菌胺酯、啶酰菌胺、克菌丹、多菌灵、百菌清、铜、氰霜唑、环氟菌胺、霜脲氰、环唑醇、嘧菌环胺、苯醚甲环唑、烯酸吗啉、二氰蒽醌、咪唑菌酮、环酰菌胺、氟啶胺、咯菌腈、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、灭菌丹、三乙膦酸、异菌脲、异丙菌胺、异皮姆、醚菌酯、代森锰锌、双块酉先菌胺、甲霜灵/精甲霜灵、代森联、苯菌酮、腈菌唑、戊菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、霜霉威、丙环唑、丙森锌、碘喹唑酮、丙硫菌唑、唑菌胺酯、嘧霉胺、喹氧、螺环菌胺、硫、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯；谷物除草剂：2,4-D、酰啼磺隆、溴苯腈、氟酮唑草-E、绿麦隆、氯磺隆、块草酸-P、二氯吡啶酸、麦草畏、禾草灵-M、吡氟草胺、精恶唑禾草灵、双氟横草胺、氟卡巴腙-NA、氟噻草胺、氟啶嘧磺隆-M、氟草烟、弗勒泰蒙、草甘膦、碘甲磺隆、碘苯腈、异丙隆、MCPA、甲磺胺磺隆、甲磺隆、二甲戊乐灵、唑啉草酯、丙氧基卡巴腙、苄草丹、甲氧磺草胺、磺酰磺隆、噻吩磺隆、肟草酮、醚苯磺隆、苯磺隆、氟乐灵、三氟甲磺隆；谷物杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、环氟菌胺、环唑醇、嘧菌环胺、醚菌胺、氟环唑、苯锈、丁苯吗啉、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑、氟唑菌酰胺、异皮姆、醚菌酯、叶菌唑、苯菌酮、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙环唑、碘喹唑酮、丙硫菌唑、唑菌胺酯、喹氧、螺环菌胺、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯；谷物杀昆虫剂：乐果、λ-三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、顺式氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、毒死蜱、抗蚜威、灭虫威、氟啶虫胺腈；玉米除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)噻吩草胺、草铵膦、草甘膦、异氟草、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰氨磺隆、苯唑草酮、环磺酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、噻酮磺隆、氟噻草胺、Pyroxasulfon；玉米杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、高效氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、甲螨酯、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、丁基嘧啶磷、乙虫腈、溴氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素；玉米杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、环唑醇、醚菌胺、氟环唑、种衣酯、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、异皮姆、叶菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙环唑、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、肟菌酯；稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑喃磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草、杀草隆、四唑酸草胺、咪唑横隆、苯噻草胺、恶嗪草酮、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、杀草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酸草胺、氯吡嘧磺隆、噁嗪草酮、双环磺草酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔恶草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特糠酯酮、恶草灵、精恶唑禾草灵、吡丙醚(Pyrimisulfan)；稻杀昆虫剂：二嗪磷、仲丁威、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫胺、乙虫腈、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、溴氰虫酰胺、多杀菌素、赐诺特(spinotoram)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、高效氯氰菊酯、毒死蜱、醚菊酯、克百威、丙硫克百威、氟啶虫胺腈；稻杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、环丙酰菌胺、双氯氰菌胺、苯醚甲环唑、克瘟散、嘧菌腙、庆大霉素、己唑醇、恶霉灵、异稻瘟净(IBP)、稻瘟灵、异噻菌胺、春雷霉素、代森锰锌、苯氧菌胺、肟醚菌胺、戊菌隆、噻菌灵、丙环唑、丙森锌、咯喹酮、戊唑醇、甲基托布津甲基、參酰菌胺、三环唑、肟菌酯、井冈霉素；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧草硫醚、三氟啶磺隆、吡喃草酮、草铵膦、丙炔氟草胺、噻苯隆；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死稗、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒、甲维盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、赐诺特(spinotoram)、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、砜虫啶；棉花杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、苯醚甲环唑、醚菌胺、氟环唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、异菌脲、吡唑萘菌胺、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、苯氧菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、甲基代森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、五氯硝基苯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、肟菌酯；大豆除草剂：甲草胺、苯达松、氟乐灵、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精恶唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、吡喃草酮、草铵膦；大豆杀昆虫剂：λ-氯氟氰菊酯、灭多威、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰虫酰胺、多杀菌素、赐诺特(spinotoram)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀铃脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、苯醚甲环、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、粉唑醇、氟唑菌酰胺、异皮姆、扑海因、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、叶菌唑、苯氧菌胺、腈菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙环唑、丙森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、肟菌酯；甜菜除草剂：氯草敏、甜菜安、甜菜呋、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、吡喃草酮、精喹禾灵；甜菜杀昆虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ-/λ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、Cyaxypyr、氟虫腈、克百威；卡诺拉除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐胺苯磺隆、喹草酸、精喹禾灵、烯草酮、吡喃草酮；卡 诺拉杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、环唑醇、苯醚甲环、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑、氟唑菌酰胺、扑海因、异皮姆、甲哌鎓、叶菌唑、苯氧菌胺、多效唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯、乙烯菌核利；卡诺拉杀昆虫剂：克百威、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ和λ-氯氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯(tau-Fluvaleriate)、乙虫腈、多杀菌素、赐诺特(spinotoram)、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

将本发明的基因引入另一种植物中的方法

在此还提供了将本发明的核酸引入另一种植物中的方法。本发明的核酸或其片段可以通过以下方式引入第二植物中：轮回选择、回交、谱系育种、纯系选择、混合选择、突变育种和/或遗传标记增强的选择。

因此，在一个实施例中，本发明的方法包括使包含本发明的核酸的第一植物与第二植物杂交以产生F1子代植物，并且选择包含本发明的核酸的F1子代植物。这些方法可以进一步包括使所选择的子代植物与包含本发明的核酸的第一植物杂交以产生回交子代植物，并且选择包含本发明的核酸的回交的子代植物。在于此的其他地方提供了用于评估杀有害生物活性的方法。这些方法可以进一步包括依次将这些步骤重复一次或多次之后产生所选择的包含本发明的核酸的第二或更高回交的子代植物。

涉及针对所希望的表型选择植物的任何育种方法都可以用在本发明的方法中。在一些实施例中，F1植物可以自花授粉，以产生分离的F2代。然后可以在每代(F3、F4、F5等)中选择代表所希望的表型(例如，杀有害生物活性)的个体植物，直到这些性状纯合或固定在育种种群内。

第二植物可以是具有所希望的性状的植物，该性状是如除草剂耐受性、昆虫耐受性、耐旱性、线虫控制、水分利用效率、氮利用效率、提高的营养价值、抗病性、提高的光合作用、提高的纤维品质、胁迫耐受性、提高的再生等。第二植物可以是如在于此的其他地方描述的原种事件。

在不同的实施例中，可以从所得杂交物收获植物部分(全株植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚等)并且可以增殖或收集以用于下游用途(如食物、饲料、生物燃料、油、面粉、粗粉等)。

获得植物产品的方法

本发明还涉及用于获得商品产品的方法，该方法包括从包含本发明的核酸的作物中收获和/或研磨籽粒，以获得该商品产品。农艺学上和商业上重要的产品和/或物质组合物旨在处于本发明的范围内，包括但不限于动物饲料、商品和旨在用作人类消耗的食物或用于在旨在用于人类消耗的组合物和商品中使用的植物产品和副产品，具体地是失活的种子/籽粒产品，包括由这样的籽粒/种子产生的(半加工)加工产品，其中所述产品是或包含完整或加工的种子或籽粒、动物饲料、玉米或黄豆粗粉、玉米或黄豆面粉、玉米、玉米淀粉、大豆粗粉、黄豆面粉、麦片、黄豆蛋白浓缩物、黄豆蛋白分离物、增稠的黄豆蛋白浓缩物、化妆品、护发产品、黄豆黄油、纳豆、印尼豆豉(tempeh)、水解的黄豆蛋白、喷射奶油、起酥油、卵磷脂、可食用性完整大豆(生的、烘烤过的或作为日本青豆)、黄豆奶酪、豆腐乳、豆腐、腐竹、以及煮熟、精制、蒸熟、烘焙或煮半熟的籽粒等，如果这些产品和物质组合物含有可检测量的在此所述的核苷酸和/或氨基酸序列(如针对含有这样的核苷酸序列的任何植物所诊断的)的话。

以说明的方式而不是以限制的方式提供以下实例。

实验实例

实例1.从恶臭假单胞菌中发现新颖杀有害生物基因

使用以下步骤从细菌菌株ATX83556中鉴定新颖杀有害生物基因：

·从菌株中制备总DNA。总DNA含有基因组DNA和染色体外DNA两者。染色体外DNA含有以下一些或全部的混合物：各种大小的质粒；噬菌体染色体；其他未表征的染色体外分子。

·对DNA进行测序。通过下一代测序方法对总DNA进行测序。

·通过同源性和/或其他计算分析鉴定推定的毒素基因。

·当需要时，通过几种PCR或克隆策略之一(例如TAIL-PCR)对感兴趣的基因进行序列整理。

表1.从菌株ATX83556中鉴定的新颖基因

*从相对于Axmi554的下游起始位点编码的蛋白质。

在此披露的毒素基因通过PCR从pAX980扩增，并且通过本领域众所周知的方法将PCR产物克隆到芽孢杆菌属表达载体pAX916或另一种合适的载体中。将含有具有axmi基因的载体的所得芽孢杆菌属菌株在常规生长培养基如CYS培养基(10g/l细菌用酪蛋白胨(Bacto-casitone)；3g/l酵母提取物；6g/l KH₂PO₄；14g/l K₂HPO₄；0.5mM MgSO₄；0.05mMMnCl₂；0.05mM FeSO₄)上培养，直到通过显微镜检查证明孢子形成。制备样品并在生物测定中测试其活性。

实例2.杀有害生物活性的测定

可以测试本发明的核苷酸序列产生杀有害生物蛋白的能力。通常以多种方式评估杀有害生物蛋白作为杀有害生物剂对有害生物作用的能力。本领域众所周知的一种方法是进行摄食测定。在这样的摄食测定中，将有害生物暴露于含有待测化合物的样品或对照样品。通常这通过将待测材料或这种材料的适当稀释物放置在有害生物将摄取的材料(如人工饵料)上进行。待测材料可以由液体、固体或浆液组成。待测材料可以放置在表面上，然后使其干燥。可替代地，待测试材料可以与熔化的人工饵料混合，然后分配到测定室中。测定室可以是例如杯子、碟子或微量滴定板的孔。

用于刺吸式有害生物(例如蚜虫)的测定可以涉及通过分隔物(理想的是可以被刺吸式昆虫的刺吸式口器刺穿的部分)将测试材料与昆虫隔开，以允许摄取测试材料。通常将测试材料与摄食刺激剂(如蔗糖)混合以促进测试化合物的摄取。

其他类型的测定可以包括将测试材料显微注射到有害生物的口或肠中，以及开发转基因植物，然后测试有害生物以转基因植物为食的能力。植物测试可以涉及分离正常消耗的植物部分(例如，附着在叶上的小笼)，或者在含有昆虫的笼中分离整个植物。

测定有害生物的其他方法和途径在本领域是已知的，并且可以例如发现于Robertson和Preisler编辑(1992)Pesticide bioassays with arthropods[用节肢动物进行杀有害生物剂生物测定],CRC,Boca波卡拉顿,佛罗里达州。可替代地，测定通常在杂志节肢动物管理测试(Arthropod Management Tests)和经济昆虫学杂志(Journal ofEconomic Entomology)中或通过与美国昆虫学会(ESA)的成员讨论进行描述。

在一些实施例中，编码在此披露的杀有害生物蛋白的毒素区域的DNA区域被克隆到大肠杆菌表达载体pMAL-C4x中，位于编码麦芽糖结合蛋白(MBP)的malE基因之后。这些框内融合导致在大肠杆菌中表达MBP-Axmi融合蛋白。

用于在大肠杆菌中表达，用单个质粒转化BL21*DE3。将单菌落接种于补充有羧苄青霉素和葡萄糖的LB中，并使其在37℃下过夜生长。次日，用1％的过夜培养物接种新鲜培养基，并使其在37℃下生长至对数期。随后，在20℃下用0.3mM IPTG诱导培养物过夜。将各细胞沉淀悬浮于20mM Tris-Cl缓冲液(pH 7.4)+200mM NaCl+1mM DTT+蛋白酶抑制剂中并超声处理。通过SDS-PAGE分析可以用于证实融合蛋白的表达。

然后将总无细胞提取物在连接至快速蛋白质液相色谱(FPLC)的直链淀粉柱上运行，用于亲和纯化MBP-axmi融合蛋白。将结合的融合蛋白用10mM麦芽糖溶液从树脂上洗脱。然后将纯化的融合蛋白用因子Xa或胰蛋白酶切割以从Axmi蛋白上除去氨基末端MBP标签。蛋白质的切割和溶解度可以通过SDS-PAGE确定。

实例3.表达和纯化

表达Axmi554.1和Axmi554.2并测定其生物活性。合成大肠杆菌优化的基因(分别是编码分别在SEQ ID NO:4和5中列出的氨基酸序列的SEQ IDNO:2和3)用于表达并将其克隆到pMalC4X表达载体中。通过测序对克隆进行证实。在Bl21感受态细胞中转化pGen554-1和pGen554-2以表达蛋白质。将来自每个新鲜转化的板的单菌落接种于LB培养基中，并使其在37℃生长直到对数期，并在18℃下用1mM IPTG诱导18小时。按照标准方案，纯化的Axmi554.1和Axmi554.2被提交进行针对选择的有害生物的生物测定。结果示于表1-4中。

表1.Axmi554.1的活性

有害生物群	生长迟缓评分	死亡率百分比
			草地贪夜蛾(FAW)	0.66	0％
烟芽夜蛾(Hv)	4	0％
			玉米穗虫(Hz)	2	0％
黎豆夜蛾(VBC)	4	100％
			小地老虎(BCW)	0.5	0％
小菜蛾(DBM)	4	100％
			西南玉米秆草螟(SWCB)	3	66％
南方玉米螟(SCB)	3.7	75％
			甜菜夜蛾(BAW)	3	58％
大豆尺蠖(SBL)	1.7	0％
			豆荚草盲蝽	4	100％
茶翅蝽(BMSB)	2	100％
			棉铃虫(Ha)	4	100％
桃蚜(GPA)	4	100％
			大豆蚜(SBA)	4	100％
褐飞虱(BPH)	2	50％
			稻绿蝽(SGSB)	4	100％
烟草蝽(BSB)	4	100％
			棉铃象	4	75％

表2.Axmi554.1的活性

有害生物群	叶损伤评分
		马铃薯叶甲(CPB)	3.5

表3.Axmi554.2的活性

有害生物群	生长迟缓评分	死亡率百分比
			草地贪夜蛾(FAW)	1.7	6％
烟芽夜蛾(Hv)	4	16％
			玉米穗虫(Hz)	2.3	0％
黎豆夜蛾(VBC)	4	100％
			小地老虎(BCW)	1	0％
小菜蛾(DBM)	4	100％
			西南玉米秆草螟(SWCB)	2.7	66％
南方玉米螟(SCB)	2	42％
			甜菜夜蛾(BAW)	2.7	66％
大豆尺蠖(SBL)	3	16％
			豆荚草盲蝽	4	100％
茶翅蝽(BMSB)	2	100％
			棉铃虫(Ha)	4	100％
桃蚜(GPA)	4	100％
			大豆蚜(SBA)	4	100％
褐飞虱(BPH)	2	50％
			稻绿蝽(SGSB)	4	100％
烟草蝽(BSB)	4	100％
			棉铃象	4	75％

表4.Axmi554.2的活性

有害生物群	叶损伤评分
		马铃薯叶甲(CPB)	3.3

实例4.运载基因用于植物表达

将本发明的编码区与适当的启动子和终止子序列连接以便在植物中表达。这样的序列在本领域是熟知的，并且可以包括用于在单子叶植物中表达的稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子、用于在双子叶植物中表达的拟南芥UBQ3启动子或CaMV 35S启动子以及nos或PinII终止子。用于产生和证实启动子-基因-终止子构建体的技术在本领域也是熟知的。

在本发明的一个方面，设计和产生合成的DNA序列。这些合成的序列相对于亲本序列具有改变的核苷酸序列，但是编码的蛋白质本质上与亲本序列相同。

在本发明的另一个方面，设计修饰版本的合成基因使得所得肽被靶向至植物细胞器，如内质网或质外体。已知导致融合蛋白靶向至植物细胞器的肽序列在本领域是已知的。例如，在本领域已知来自白羽扇豆(White Lupin Lupinus albus)(ID GI:14276838，Miller等人(2001)Plant Physiology[植物生理学]127:594-606)的酸性磷酸酶基因的N末端区导致异源蛋白质的内质网靶向。如果所得融合蛋白在C末端还含有内质网滞留序列(其包含肽N-末端-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即“KDEL”基序，SEQ ID NO:11))，则该融合蛋白将被靶向至内质网。如果融合蛋白在C末端缺乏内质网靶向序列，则该蛋白质将被靶向至内质网，但最终将被隔离在质外体。

因此，此基因编码如下融合蛋白，该融合蛋白含有酸性磷酸酶基因的N末端31个氨基酸(来自白羽扇豆(White Lupin Lupinus albus)(ID GI:14276838，Miller等人,2001，同上))融合至本发明的氨基酸序列的N末端，并且在C末端含有KDEL(SEQID NO:11)序列。因此，所得蛋白质在植物细胞中表达后被预测为靶向至内质网。

将上文描述的植物表达盒与适当的植物选择性标记组合以帮助转化细胞和和组织的选择，并连接到植物转化载体中。这些可以包括来自农杆菌介导的转化的二元载体或用于喷气溶胶或基因枪转化的简单质粒载体。

实例5.大豆转化

使用本领域众所周知的方法实现大豆转化，这些方法是如基本上使用由Paz等人(2006),Plant cell Rep.[植物细胞报告]25:206所述的方法使用根瘤农杆菌介导的转化大豆半种子外植体的方法。用环磺酮作为选择标记来鉴定转化体。观察绿芽的外观，并且将其记录为对除草剂异噁唑草酮或环磺酮的耐受性的指标。耐受性转基因嫩芽将显示出比得上未用异噁唑草酮或环磺酮处理的野生型大豆嫩芽的正常绿色，而用相同量的异噁唑草酮或环磺酮处理的野生型大豆嫩芽将完全漂白。这表明HPPD蛋白的存在使得具有对HPPD抑制剂除草剂像异噁唑草酮或环磺酮的耐受性。

将耐受性绿芽转移到生根培养基中或接枝。在适应期之后将生根的小植株转移到温室中。然后用补充有硫酸铵甲酯菜籽油的HPPD抑制剂除草剂喷洒含有该转基因的植物，例如用环磺酮以100g AI/ha的比率或用甲基磺草酮以300g AI/ha的比率喷洒。在施用后十天，评估由施用除草剂引起的症状并且将其与在相同条件下在野生型植物上观察到的症状相比较。

实例6：棉花T0植物建立和选择。

使用本领域众所周知的方法实现棉花转化，尤其是在PCT专利公开WO00/71733中所述的方法中的优选方法。将再生的植物转移到温室中。在适应期后，用补充有硫酸铵和甲酯菜籽油的HPPD抑制剂除草剂喷洒足够生长的植物，这些除草剂是例如等同于100或200gAI/ha的环磺酮。在喷洒施用后七天，评估由用除草剂处理引起的症状并且将其与在相同条件下经受相同处理的野生型棉花植物上观察到的症状相比较。

实例7.用在此所述的杀有害生物蛋白基因转化玉米细胞

最好在授粉后8-12天收集玉米穗。从穗中分离胚，并且将大小0.8-1.5mm的那些胚优选用于在转化中使用。将胚以小盾片侧朝上铺板在合适的孵育培养基如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(的1000x储备液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL储备液)2,4-D)上。然而，DN62A5S以外的培养基和盐是合适的并且在本领域是已知的。将胚在黑暗中于25℃下孵育过夜。然而，胚本身不需要孵育过夜。

将所得外植体转移到网格(每个板30-40个)中，转移到渗透培养基中持续约30-45分钟，然后转移到聚束(beaming)板中(参见例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

使用基本上如PCT公开号WO/0138514中所述的条件，使用气溶胶束加速器将植物细胞中设计成本发明基因的DNA构建体加速到植物组织中。聚束后，将胚在渗透培养基上孵育约30分钟，并置于孵育培养基中在黑暗中于25℃下过夜。为避免过度损伤聚束的外植体，将它们在转移到恢复培养基中之前孵育至少24小时。然后将胚铺在恢复期培养基上在黑暗中于25℃下持续约5天，然后转移到选择培养基中。取决于所利用的具体选择的性质和特征，将外植体在选择性培养基中孵育八周。在选择期之后，将所得愈伤组织转移到胚成熟培养基中，直到观察到成熟体细胞胚形成为止。然后将所得成熟体细胞胚置于低照度下，并且通过本领域已知的方法开始再生过程。允许所得嫩芽在生根培养基中生根，并且将所得植物转移到育苗盆中并繁殖为转基因植物。

材料

DN62A5S培养基

用1N KOH/1N KCl将溶液的pH值调节至5.8，加入浓度高达3g/L的Gelrite(西格玛公司)，并对培养基进行高压灭菌。冷却至50℃后，加入2ml/L的5mg/ml硝酸银储备液(植物技术实验室)。

实例8.通过农杆菌介导的转化在植物细胞中转化本发明的基因

最好在授粉后8-12天收集穗。从穗中分离胚，并且将大小0.8-1.5mm的那些胚优选用于在转化中使用。将胚以小盾片侧朝上铺板在适合的孵育培养基上，并且在黑暗中于25℃下孵育过夜。然而，胚本身不需要孵育过夜。使胚与含有适当载体的农杆菌属菌株接触，以进行Ti质粒介导的转移约5-10min，然后将其铺板在共培养培养基上约3天(在黑暗中于22℃下)。在共培养之后，将外植体转移到回收期培养基中约5-10天(在黑暗中于25℃下)。取决于所利用的具体选择的性质和特征，将外植体在选择性培养基中孵育八周。在选择期之后，将所得愈伤组织转移到胚成熟培养基中，直到观察到成熟体细胞胚形成为止。然后将所得成熟体细胞胚置于低照度下，并且如本领域已知的开始再生过程。

实例9.稻的转化

从在温室中在良好控制的条件下生长的供体植物中收集包含处于正确发育阶段的胚的未成熟稻种子。将种子灭菌后，切下未成熟的胚并在固体培养基上预诱导3天。预诱导后，将胚在具有所希望的载体的农杆菌悬浮液中浸泡几分钟。然后将胚在含有乙酰丁香酮的固体培养基上共培养并在黑暗中孵育4天。然后将外植体转移到含有草胺膦(phosphinotricin)作为选择剂的第一选择性培养基中。大约3周后，具有愈伤组织发育的角质鳞片被切割成多个小块，并转移到相同的选择性培养基中。大约每2周进行随后的传代培养。在每次传代培养后，生长活跃的愈伤组织被切成小块并在第二选择性培养基上孵育。几周后，将对草胺膦具有明显抗性的愈伤组织转移到选择性再生培养基中。将产生的小植株在半强度MS下培养以便完全伸长。将植物最终转移到土壤中，并使其在温室中生长。

说明书中提到的所有出版物和专利申请都指示了本发明所属领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请都通过引用结合在此，其程度就像明确且单独指出每个单独出版物或专利申请通过引用结合一样。

尽管出于清楚理解的目的，前述发明通过说明和实例的方式进行了详细描述，但是显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内作出某些改变和修改。

序列表

<110> 拜耳作物科学有限合伙公司

拜耳作物科学股份公司

<120> AXMI554 δ-内毒素基因及其使用方法

<130> APA15-6006WO

<150> 62/241,220

<151> 2015-10-14

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 846

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 1

atgtgttgct acttactaag gaaggtaaaa atgagcacag ttgatttgga tgcaatcttc 60

aagcgctacg gtgattggtg gtgcaagcaa aatggaggga agtgtgatcg catgaatcct 120

gttcagccgg gctatgagca gcataggttg attgtgtcca acgaacatat cgagtactac 180

ggaaacccta acaaggttgt tgtgccacag atcgcgtctc agcaagtttt ggttaactct 240

acttcagtgg agcagtctca gtccgtgagg ttttccaaga ctacgtcgag cacatttacg 300

tggtctctgc aagaaggtat caagcttggg atgtccgtta cctataaggt gggtgtcgcc 360

cctatcatgt cggcggaaac cactattagt ggcgaactga gcttctcgag cacgcaaaca 420

aacacacaga cagagaccaa aacttgggag gttgctcagc ctgtcattgt ccctgctaag 480

actcaagttc aatccgtttt ggtaattgat gaaagtcgcg tcactcaaaa gtttcacaat 540

aagtttacgt tgagtggcag cgtttgtagt aatagcccaa gtaagatcaa tggtcactat 600

ttctggttcc actcggtctc ggatatattt aataagtttc ctcagccggg ctttaccgtg 660

cgcagtgggc aggtttttta cgagggcgat ggtagctttg acggggtcgc ggggattgga 720

acccgactgg aactcaccga aagtccaatt ggtgatccat caaaagtcct gaagacttat 780

agtgtaattc ctgtagtacc aggcgccggg gtagcaaggc tggctgatat ggtcgatgag 840

actgct 846

<210> 2

<211> 846

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 2

atgtgctgct acctgctgcg taaagtcaaa atgtcaacgg tggacctgga tgctatcttc 60

aaacgctatg gtgattggtg gtgtaaacag aacggcggta aatgcgatcg tatgaatccg 120

gtgcagccgg gctatgaaca acatcgcctg attgttagta acgaacacat cgaatattac 180

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aacacccaaa cggaaaccaa aacgtgggaa gtggcccagc cggtgattgt tccggcaaaa 480

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ttctggttcc actctgtgag tgacatcttt aataaattcc cgcagccggg tttcaccgtt 660

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tctgtgattc cggtggttcc gggtgcgggt gttgcccgtc tggcagatat ggtcgacgaa 840

acggca 846

<210> 3

<211> 816

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 3

atgagcacgg tggacctgga cgctatcttc aaacgctacg gcgactggtg gtgtaaacaa 60

aatggtggca aatgtgaccg catgaatccg gtgcagccgg gctatgaaca acatcgtctg 120

attgttagta acgaacacat cgaatattac ggtaacccga ataaagtggt tgtcccgcag 180

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atgtcggtta cctacaaagt tggcgtcgct ccgattatgt ccgcggaaac cacgatctcc 360

ggtgaactgt catttagttc cacccagacg aacacccaaa cggaaaccaa aacgtgggaa 420

gtggcccagc cggtgattgt tccggcaaaa acccaggtcc aatctgtcct ggtgatcgat 480

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aactcgccga gcaaaatcaa cggtcattac ttctggttcc actctgtgag tgacatcttt 600

aataaattcc cgcagccggg tttcaccgtt cgtagcggtc aagtctttta cgaaggcgat 660

ggttctttcg acggcgttgc tggcattggt acccgcctgg aactgacgga atcgccgatc 720

ggtgatccga gcaaagtcct gaaaacctat tctgtgattc cggtggttcc gggtgcgggt 780

gttgcccgcc tggcagatat ggtcgacgaa acggca 816

<210> 4

<211> 282

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 4

Met Cys Cys Tyr Leu Leu Arg Lys Val Lys Met Ser Thr Val Asp Leu

1 5 10 15

Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp Trp Cys Lys Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His

35 40 45

Arg Leu Ile Val Ser Asn Glu His Ile Glu Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn

50 55 60

Lys Val Val Val Pro Gln Ile Ala Ser Gln Gln Val Leu Val Asn Ser

65 70 75 80

Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser

85 90 95

Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser

100 105 110

Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu Thr Thr

115 120 125

Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr Gln Thr

130 135 140

Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro Ala Lys

145 150 155 160

Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp Glu Ser Arg Val Thr Gln

165 170 175

Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly Ser Val Cys Ser Asn Ser

180 185 190

Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp Phe His Ser Val Ser Asp

195 200 205

Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser Gly Gln

210 215 220

Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly Ile Gly

225 230 235 240

Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser Lys Val

245 250 255

Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala

260 265 270

Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala

275 280

<210> 5

<211> 272

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 5

Met Ser Thr Val Asp Leu Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp

1 5 10 15

Trp Cys Lys Gln Asn Gly Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln

20 25 30

Pro Gly Tyr Glu Gln His Arg Leu Ile Val Ser Asn Glu His Ile Glu

35 40 45

Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn Lys Val Val Val Pro Gln Ile Ala Ser Gln

50 55 60

Gln Val Leu Val Asn Ser Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg

65 70 75 80

Phe Ser Lys Thr Thr Ser Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly

85 90 95

Ile Lys Leu Gly Met Ser Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile

100 105 110

Met Ser Ala Glu Thr Thr Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr

115 120 125

Gln Thr Asn Thr Gln Thr Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro

130 135 140

Val Ile Val Pro Ala Lys Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp

145 150 155 160

Glu Ser Arg Val Thr Gln Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly

165 170 175

Ser Val Cys Ser Asn Ser Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp

180 185 190

Phe His Ser Val Ser Asp Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe

195 200 205

Thr Val Arg Ser Gly Gln Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp

210 215 220

Gly Val Ala Gly Ile Gly Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile

225 230 235 240

Gly Asp Pro Ser Lys Val Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val

245 250 255

Pro Gly Ala Gly Val Ala Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala

260 265 270

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 6

Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His Arg Leu Ile Val Ser

1 5 10 15

Asn Glu His Ile Glu Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn Lys Val Val Val Pro

20 25 30

Gln Ile Ala Ser Gln Gln Val Leu Val Asn Ser Thr Ser Val Glu Gln

35 40 45

Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser Ser Thr Phe Thr Trp

50 55 60

Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser Val Thr Tyr Lys Val

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu Thr Thr Ile Ser Gly Glu Leu

85 90 95

Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr Gln Thr Glu Thr Lys Thr Trp

100 105 110

Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro Ala Lys Thr Gln Val Gln Ser

115 120 125

Val Leu Val Ile Asp Glu Ser Arg Val Thr Gln Lys Phe His Asn Lys

130 135 140

Phe Thr Leu Ser Gly Ser Val Cys Ser Asn Ser Pro Ser Lys Ile Asn

145 150 155 160

Gly His Tyr Phe Trp Phe His Ser Val Ser Asp Ile Phe Asn Lys Phe

165 170 175

Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser Gly Gln Val Phe Tyr Glu Gly

180 185 190

Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly Ile Gly Thr Arg Leu Glu Leu

195 200 205

Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser Lys Val Leu Lys Thr Tyr Ser

210 215 220

Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala Arg Leu Ala Asp Met

225 230 235 240

Val Asp Glu Thr Ala

245

<210> 7

<211> 172

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 7

Met Ser Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu

1 5 10 15

Thr Thr Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr

20 25 30

Gln Thr Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro

35 40 45

Ala Lys Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp Glu Ser Arg Val

50 55 60

Thr Gln Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly Ser Val Cys Ser

65 70 75 80

Asn Ser Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp Phe His Ser Val

85 90 95

Ser Asp Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser

100 105 110

Gly Gln Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly

115 120 125

Ile Gly Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser

130 135 140

Lys Val Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly

145 150 155 160

Val Ala Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala

165 170

<210> 8

<211> 160

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 8

Met Ser Ala Glu Thr Thr Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr

1 5 10 15

Gln Thr Asn Thr Gln Thr Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro

20 25 30

Val Ile Val Pro Ala Lys Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp

35 40 45

Glu Ser Arg Val Thr Gln Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly

50 55 60

Ser Val Cys Ser Asn Ser Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp

65 70 75 80

Phe His Ser Val Ser Asp Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe

85 90 95

Thr Val Arg Ser Gly Gln Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp

100 105 110

Gly Val Ala Gly Ile Gly Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile

115 120 125

Gly Asp Pro Ser Lys Val Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val

130 135 140

Pro Gly Ala Gly Val Ala Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala

145 150 155 160

<210> 9

<211> 282

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 9

Met Cys Cys Tyr Leu Leu Arg Lys Val Lys Met Ser Thr Val Asp Leu

1 5 10 15

Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp Trp Cys Lys Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His

35 40 45

Arg Leu Ile Val Ser Asn Glu His Ile Glu Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn

50 55 60

Lys Val Val Val Pro Gln Ile Ala Ser Gln Gln Val Leu Val Asn Ser

65 70 75 80

Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser

85 90 95

Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser

100 105 110

Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu Thr Thr

115 120 125

Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr Gln Thr

130 135 140

Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro Ala Lys

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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225 230 235 240

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245 250 255

Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala

260 265 270

Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala

275 280

<210> 10

<211> 282

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 10

Met Cys Cys Tyr Leu Leu Arg Lys Val Lys Met Ser Thr Val Asp Leu

1 5 10 15

Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp Trp Cys Lys Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His

35 40 45

Arg Leu Ile Val Ser Asn Glu His Ile Glu Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn

50 55 60

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65 70 75 80

Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser

85 90 95

Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser

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165 170 175

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180 185 190

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Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly Ile Gly

225 230 235 240

Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser Lys Val

245 250 255

Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala

260 265 270

Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala

275 280

<210> 11

<211> 282

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 11

Met Cys Cys Tyr Leu Leu Arg Lys Val Lys Met Ser Thr Val Asp Leu

1 5 10 15

Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp Trp Cys Lys Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His

35 40 45

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50 55 60

Lys Val Val Val Pro Gln Ile Ala Ser Gln Gln Val Leu Val Asn Ser

65 70 75 80

Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser

85 90 95

Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser

100 105 110

Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu Thr Thr

115 120 125

Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr Gln Thr

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser Gly Gln

210 215 220

Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly Ile Gly

225 230 235 240

Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser Lys Val

245 250 255

Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala

260 265 270

Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala

275 280

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> endoplasmic reticulum targeting peptide

<400> 12

Lys Asp Glu Leu

1

<210> 13

<211> 819

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> synthetic gene encoding Axmi554

<400> 13

atgagcactg tggatttgga tgccatcttc aagagatatg gagattggtg gtgcaagcag 60

aatggaggaa aatgtgacag gatgaaccct gtgcaacctg gatatgagca gcacaggttg 120

attgtttcca atgagcacat tgaatattat ggaaatccaa acaaggtggt ggttcctcag 180

attgcttctc agcaagtgct ggtcaactca acttctgtgg agcaaagcca aagtgtgagg 240

ttctccaaga caacaagctc aaccttcact tggagcttgc aagaaggaat caagctgggg 300

atgagtgtca cctacaaggt tggagttgct ccaatcatga gtgctgaaac aacaatttct 360

ggagagttga gcttctcttc aacccaaacc aacacccaaa cagaaaccaa gacatgggaa 420

gtggctcaac cagtgattgt tcctgccaag acccaagtgc aaagtgtgct ggtgattgat 480

gaaagcagag tgacccagaa gttccacaac aagttcaccc tctctggaag tgtttgcagc 540

aattctccaa gcaagatcaa tggccattac ttctggttcc attctgtttc agacatcttc 600

aacaagtttc ctcaacctgg cttcactgtg aggagtggcc aagtttttta tgaaggagat 660

ggaagttttg atggagttgc tggaattgga acaaggttgg agctgacaga aagcccaatt 720

ggagatcctt caaaggtgct gaagacatat tctgtgattc cagtggttcc tggtgctgga 780

gtggcaaggc ttgctgacat ggtggatgaa actgcttga 819

Claims (26)

1.一种包含编码具有杀有害生物活性的氨基酸序列的核苷酸序列的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：

a)在SEQ ID NO:1-3的任一个中列出的核苷酸序列；

b)编码包含SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

c)编码包含与SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已设计用于在植物中表达的合成序列。

3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列可操作地连接至能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中的表达的启动子。

4.一种包含如权利要求1所述的重组核酸分子的载体。

5.如权利要求4所述的载体，该载体还包含编码异源多肽的核酸分子。

6.一种含有如权利要求1所述的重组核酸的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞是细菌宿主细胞。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞是植物细胞。

9.一种包含如权利要求8所述的宿主细胞的转基因植物。

10.如权利要求9所述的转基因植物，其中所述植物选自下组，该组由以下各项组成：玉米、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。

11.一种包含如权利要求1所述的核酸分子的转基因种子。

12.一种具有杀有害生物活性的重组多肽，该重组多肽选自下组，该组由以下各项组成：

a)包含SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列的多肽；和

b)包含与SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽。

13.如权利要求12所述的多肽，该多肽还包含异源氨基酸序列。

14.一种包含如权利要求12所述的多肽的组合物。

15.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物选自下组，该组由以下各项组成：粉末、粉剂、小丸、颗粒、喷雾剂、乳液、胶体和溶液。

16.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物通过干燥、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉降或浓缩细菌细胞培养物来制备。

17.如权利要求14所述的组合物，该组合物包含按重量计从约1％至约99％的所述多肽。

18.一种用于控制鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目有害生物种群的方法，该方法包括使所述种群与杀有害生物有效量的如权利要求12所述的多肽接触。

19.一种用于杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目有害生物的方法，该方法包括使所述有害生物与杀有害生物有效量的如权利要求12所述的多肽接触或向所述有害生物饲喂杀有害生物有效量的如权利要求12所述的多肽。

20.一种用于产生具有杀有害生物活性的多肽的方法，该方法包括在表达编码该多肽的核酸分子的条件下培养如权利要求6所述的宿主细胞。

21.一种在其基因组中稳定地整合了DNA构建体的植物或植物细胞，该DNA构建体包含编码具有杀有害生物活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：

a)在SEQ ID NO:1-3的任一个中列出的核苷酸序列；

b)编码包含SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和

c)编码包含与SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

22.一种用于保护植物防御有害生物的方法，该方法包括在植物或其细胞中表达编码杀有害生物多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：

a)在SEQ ID NO:1-3的任一个中列出的核苷酸序列；

b)编码包含SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和

c)编码包含与SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述植物产生具有针对鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目有害生物的杀有害生物活性的杀有害生物多肽。

24.一种用于增加植物产量的方法，该方法包括在田地中种植在其基因组中稳定地整合了DNA构建体的植物或其种子，该DNA构建体包含编码具有杀有害生物活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：

a)在SEQ ID NO:1-3的任一个中列出的核苷酸序列；

b)编码包含SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和

c)编码包含与SEQ ID NO:4-11的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

其中所述田地被所述多肽对其具有杀有害生物活性的有害生物侵染。

25.如权利要求1所述的核酸用于保护植物防御由所述核酸编码的氨基酸对其具有杀有害生物活性的有害生物的用途。

26.一种包含如权利要求1所述的核酸分子或由其编码的蛋白质的商品产品，其中所述产品选自下组，该组由以下各项组成：完整或加工的种子或籽粒、动物饲料、玉米或黄豆粗粉、玉米或黄豆面粉、玉米淀粉、大豆粗粉、黄豆面粉、麦片、黄豆蛋白浓缩物、黄豆蛋白分离物、增稠的黄豆蛋白浓缩物、化妆品、护发产品、黄豆黄油、纳豆、印尼豆豉、水解的黄豆蛋白、喷射奶油、起酥油、卵磷脂、可食用性完整大豆、黄豆奶酪、豆腐乳、豆腐、腐竹和煮熟、精制、蒸熟、烘焙或煮半熟的籽粒。