CN104845913B - 苏云金芽胞杆菌菌株，组合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“苏云金芽胞杆菌菌株，组合蛋白及其应用”，属于生物防治技术领域。苏云金芽胞杆菌菌株IPPBI0TSUC1O12，其保藏编号为：CGMCC No.10783。其中菌株中提取的蛋白ST1和ST2对稻飞虱害虫具有高毒力，可以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

Description

苏云金芽胞杆菌菌株，组合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，特别是进一步，本发明涉及对稻飞虱农业害虫具有高毒力的Bt菌株、组合蛋白及其应用。

背景技术

稻飞虱属同翅目飞虱科。危害水稻的主要有褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱三种。危害较重的是褐飞虱和白背飞虱，早稻前期以白背飞虱为主，后期以褐飞虱为主；中晚稻以褐飞虱为主。灰飞虱很少直接成灾，但能传播稻、麦、玉米等作物的病毒。

稻飞虱长翅型成虫均能长距离迁飞，成虫和若虫均群集在稻丛下部茎秆上刺吸汁液，遇惊扰即跳落水面或逃离，趋光性强，且喜趋嫩绿；但灰飞虱的趋光性稍弱。

稻飞虱的越冬虫态和越冬区域因种类而异。褐飞虱在广西和广东南部至福建龙溪以南地区，各虫态皆可越冬。冬暖年份，越冬的北限在北纬23°～26°，凡冬季再生稻和落谷苗能存活的地区皆可安全越冬。在长江以南各省每年发生4～11代,部分地区世代重叠。其田间盛发期均值水稻穗期。白背飞虱在广西至福建德化以南地区以卵在自生苗和游草上越冬，越冬北限在北纬26°左右。在中国每年发生3～8代，为害单季中、晚稻和双季早稻较重。灰飞虱在华北以若虫在杂草丛、稻桩或落叶下越冬,在浙江以若虫在麦田杂草上越冬,在福建南部各虫态皆可越冬。华北地区每年发生4～5代，长江中、下游5～6代，福建7～8代。田间为害期虽比白背飞虱迟，但仍以穗期为害最烈。

稻飞虱对水稻的为害，除直接刺吸汁液，使生长受阻，严重时稻丛成团枯萎，甚至全田死秆倒伏外，产卵也会刺伤植株，破坏输导组织，妨碍营养物质运输并传播病毒病。

对于稻飞虱的防治，大多采用传统的化学防治方法，如毒死蜱、吡虫啉、马拉硫磷、吡蚜酮、醚菊酯等，容易造成环境污染，和抗药性的产生。对于飞虱这类植食性刺吸式口器害虫，目前并没有高效的杀虫蛋白用于生物防治以及转基因植物开发。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供筛选到一株苏云金芽胞杆菌菌株，对稻飞虱有较强的毒杀作用。

同时本发明还提供该菌株中分离得到的有毒杀稻飞虱的两个组合蛋白，该组合蛋白一起对稻飞虱起毒杀作用。

苏云金芽胞杆菌菌株IPPBI0TSUC1O12，其保藏编号为：CGMCC No.10783。

上述菌株在毒杀稻飞虱害虫中的应用。

蛋白ST1或蛋白ST2在毒杀稻飞虱害虫中的应用，所述蛋白ST1的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，所述蛋白ST2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种组合蛋白，由蛋白ST1和ST2组成，所述蛋白ST1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述蛋白ST2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

同时表达上述组合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

所述组合蛋白在毒杀稻飞虱害虫中的应用。

所述应用为将组合蛋白作为杀虫活性成分制作杀虫剂对稻飞虱进行动杀灭。

所述应用为将表达组合蛋白的基因转入稻飞虱的寄主植物，使该植物表达对稻飞虱害虫的抗性。

所述基因序列如SEQ ID NO：5所示。

所述害虫为灰飞虱、白背飞虱或褐飞虱。

本实验选用灰飞虱作为杀虫活性菌株筛选对象，选取大量的Bt菌株进行筛选，得出：菌株IPPBI0TSUC1O12对灰飞虱有较强的毒杀作用。

从该菌株中得到一个3个基因的阳性克隆ST1、ST2、ST12，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，但没有得到ST1、ST2的表达蛋白，而得到ST12的表达蛋白，ST12为ST1和ST2的组合蛋白，ST1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，ST2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

将克隆得到的基因ST12进行表达，蛋白功能验证死亡率达95％(蛋白浓度为25ppm)，表明该蛋白对稻飞虱有较强的毒杀作用。

菌株保藏信息：

菌种分类命名：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏日期：2015年5月6日

保藏编号：CGMCC No.10783。

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1. 68株Bt菌株对灰飞虱的杀虫活性筛选结果，

图2.不同处理的IPPBI0TSUC1O12蛋白样品对灰飞虱的杀虫活性

图3.LB平板培养的IPPBI0TSUC1O12提取的菌株晶体蛋白，SDS-PAGE检测

图4.提取的IPPBI0TSUC1O12蛋白样品经离子交换色谱图，

其中1为UV280吸光度，2为电导率，灰色块标记的蛋白用于SDS-PAGE分析

图5.经离子交换后浓缩的IPPBI0TSUC1O12蛋白样品(图4中标记的样品顺序检测)

图6.IPPBI0TSUC1O12蛋白凝胶过滤层析色谱图，以及不同时间分离组分的SDS-PAGE检测。横坐标轴的短线代表被检测的组分。

图7.C，D两蛋白条带二级质谱结果同IPPBI0TSUC1O12基因组蛋白编码序列匹配结果

图8.ST-1和ST-2以及其他Cry蛋白序列进化树分析

图9.pHT1A载体示意图

图10.IPPBI0TSUC1O12基因组DNA扩增的ST-12，ST-1，以及ST-2

图11.ST-1，ST-2以及ST-12在HD73-中的表达结果。

其中1：HD73-；2：pHT-1A-ST-1；3：pHT-1A-ST-1；4：pHT-1A-ST-12

图12.纯化后蛋白定量，1,2为纯化的蛋白，M：Marker(70,50,40,30,25kDa)

图13.纯化后ST12蛋白对灰飞虱(◆)，和白背飞虱(▲)的毒力回归曲线

图14.纯化后ST12蛋白对褐飞虱校正死亡率，

其中:X轴是不同浓度样品以及不含有杀虫基因的空宿主菌株；Y轴是不同样品的死亡率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

涉及序列：

1、生测体系的建立与验证

生测方法

参照Fu等报道的生测方法，并加以改进。

新的生测体系的建立在原有的生测体系的基础上，经过多点改进。首先，生测改用透明PET塑料瓶(容积50mL，瓶高69mm，直径42mm)进行，并在其瓶身一侧开6mm直径的孔，并于瓶内贴透气的医用胶带封住开孔，既能防止试虫逃逸又能为试虫的生长提供足量的空气，解决了试虫意外死亡对生测结果的影响。其次，瓶盖与瓶身可分离，可以只用瓶盖完成生测 用饲料的准备。白色瓶盖，用直径30mm开孔器打孔，将双层石蜡封口膜(parafilm M，USA)拉伸4倍后罩住开孔的盖子，添加200μL人工饲料，再用拉伸的石蜡封口膜覆于人工饲料上密封，制作成饲料囊。将需替换的饲料与瓶盖一同取下，更换新的即可。整个过程可以分步骤进行，利于操作，减少试虫逃逸，极大的方便了生测实验的进行。最后，在瓶底加入2％浓度的琼脂糖凝胶，可以维持瓶内对灰飞虱适宜的湿度，只要控温良好的培养箱皆可进行灰飞虱的生测实验。

每瓶放入试虫20头，每个处理重复3次。以黑布覆盖瓶身，将瓶口朝向光源，每隔两天更换饲料。生测持续3-6d。

人工饲料

采用傅强等(2000)报道的，褐飞虱全纯人工饲料配方(表1)。

表中(i)浓度大于0.05mg/mL的组分直接用十万分之一天平称量；(ii)低于0.05mg/mL的组分配制10×母液；(iii)生物素，无机盐配制100×母液使用。用1mol/LNaOH溶液将饲料溶液的pH值调至6.8，容量瓶定容。最后将人工饲料用一次性的Millipore微孔(0.22μm)过滤器过滤除菌，分装在2mL离心管，储存在-20℃备用。饲料配制所有试剂购自Amresco或Sigma-Aldrich。

表1.生测用灰飞虱全纯人工饲料配方

生测方法测试结果

新的生测体系的建立在原有生测体系的基础上，经过多点改进。相关改进使得先前生测对照处理组在20％上下浮动的死亡率，降至10％以下。

2、Bt菌株活性筛选与鉴定

BT菌株蛋白提取

a.准备90mm固体LB平板20板，每个涂布200μL菌液；

b.培养48h，用刮菌器收集菌体于50mL离心管。加入40mL预冷的超纯水洗涤菌体；

c.12000g离心5min弃上清；

d.加入40mL裂解液(50mmol/L Na₂CO₃，NaHCO₃，pH＝10)，超声50％输出功率，超3s停5s，共5min。超声后混合物于摇床上冰盒4h；

e.4℃12000g离心10min取上清；

f.加入H₂CO₃调节pH＝5.0使蛋白等电点沉淀，4℃冰箱静置过夜；

g.离心弃上清，沉淀用5mL裂解液溶解；

h.将沉淀溶解后，加入胰蛋白酶(10mg/ml，以质量比1：10比例加入)消化37℃，2h蛋白；

i.提取蛋白跑10％SDS-PAGE检测。

SDS-PAGE检测蛋白

a.所用到的试剂：

30％-丙稀酰胺

丙稀酰胺 37g

甲叉双丙烯酰胺 1g

加水定容至 100mL

分离胶缓冲液(1.5mol/L Tris-HCl，pH＝8.8)

Tris 9.1g

H₂O 40mL

浓盐酸调pH至8.8，超纯水定容至50mL，4℃保存

浓缩胶缓冲液(1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8)

Tris 6.1g

H₂O 40mL

浓盐酸调pH至6.8，超纯水定容至50mL，4℃保存

10％过硫酸铵

过硫酸铵 1.0g

H₂O 9.0mL

分装为0.5mL每管，-20℃保存

10％(w/v)SDS

SDS 1.0g

H₂O 8mL

68℃加热溶解，浓盐酸调pH至7.2，超纯水定容至10mL

5X电泳缓冲液

Tris 15.0g

甘氨酸 94.0g

SDS 5.0g

超纯水定容至1000mL,用时稀释5倍

染色液配方

溶液1(脱水)1L:500mL乙醇，100mL乙酸，400mL超纯水

溶液2(染色)1L:50mL乙醇，75mL乙酸，875mL超纯水

考马斯亮蓝R250：0.25g考马斯亮蓝R250，溶解于100mL 95％乙醇，滤纸过滤。

b.SDS-PAGE凝胶配方

不同浓度SDS-PAGE分离胶配方：

SDS-PAGE浓缩胶(5％)

c.制胶及电泳

按照上述配方配制分离胶，将其加入制胶器至距离上沿1.5cm，加入超纯水液封，室温下放置20min。配制浓缩胶，灌入制胶器，并插入梳子。待胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用180V电压。根据预染蛋白Marker条带判断适时停止电泳。

d.染色过程：

加入溶液150mL微波炉加热30s，置于摇床10～30min

加入溶液250mL+R250200μL加热30s，置于摇床染色。

Bt菌株活性筛选与鉴定结果

利用筛选结果见图1。以生物测定的校正死亡率作为划分无毒株、低毒株和高毒株的依 据：在75％(含75％)以上者为高毒株、在12％以下者为无毒株、在12％(含12％)到75％之间者为低毒株。生物测定的结果显示：受试的Bt菌株中高毒株有1株(IPPBI0TSUC1O12)、低毒株有30株，其余35株为无毒株。(上述菌株在本申请人的实验室中均有保藏，可以对外公开发放)

生物学测定表明，IPPBI0TSUC1O12对灰飞虱的初筛生测结果为死亡率为92％。

将该菌株保藏，其保藏编号：CGMCC No.10783。

为了确认从Bt孢晶混合物所提取的样品中，是否是蛋白质成分起活性作用，分别用蛋白酶K对样品进行消化，或者对样品进行高温高压的灭活处理，将处理后的样品，进行生测结果如图2。

蛋白酶K消化：配制20mg/mL蛋白酶K，将200mg的蛋白酶K加入到9.5mL pH＝8.0PBS缓冲液中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加缓冲液定容到10mL，然后分装至1.5mL离心管贮存于-20℃。蛋白样品加入蛋白酶K，1:1000终浓度20μg/mL。37℃，孵育1h。

高温灭活处理：将蛋白样品，放入灭菌锅处理，121℃，15min。

结果表明，样品经过蛋白酶K处理，及高温高压灭活以后，对于飞虱的杀虫活性消失。从而证明，活性物质是某一个或几个蛋白。

3、基因组提取、测序及杀虫基因筛选

基因组提取

基因组提取方法：

a.将IPPBI0TSUC1O12划线接种于LB培养基上，30℃培养过夜；

b.收集菌体于1.5mL离心管中，用150μL S1充分悬浮；

c.加入100mg石英砂，组织破碎仪上破碎1min；

d.加入200μL S2充分混匀；

e.加入400μL S3，充分混匀，12000g离心10min；

f.将上层上清液转移至1.5mL离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，置于-20℃静置20min；

g.12000g离心10min弃上清；

h.70％无水乙醇清洗沉淀，室温晾干；

i.加入100μL超纯水水溶解沉淀。

各溶液配方：

S1：10mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA，1mol/L蔗糖pH＝7.0

S2：4％SDS

S3：5mol/L异硫氰酸胍，1mol/L NaAc

基因组测序

基因组经随机打断，构建文库，采用Illumina测序平台进行。利用SOAPdenovo对reads测序数据组装，得到Scaffold序列。为了避免单个平台的测序偏向性以及短片段造成的基因组组装错误，细菌基因组精细图采用Roche 454长片段双末端测序技术(Paired-End)搭建基因组框架，然后进行Illumina短片段高覆盖测序，将短片段序列mapping到基因组框架中，即可获得高质量的基因组精细图。

基因组测序数据经过拼接后，采用GeneMark.hmm PROKARYOTIC(Version 3.2)以Bacillus thuringiensiskonkukian为参考基因组，启用RBS model。对蛋白质编码基因进行预测。

基因组草图中获取的蛋白质编码基因注释采用Blastx及Uniport数据库进行。

基因组测序、组装、注释结果

经Illumina及454测序平台生成的原始数据经过拼接后，共生成39个Scaffold，基因组草图大小为5.51M。基因组序列经过GeneMark.hmm PROKARYOTIC的预测一共预测到6063个蛋白质编码基因。这些基因经过Uniport数据库的注释以后，产生5846条注释结果，绝大多数(96.4％)预测到的蛋白质编码基因都有注释信息(表2)。

表2.IPPBI0TSUC1O12基因组测序详情

根据注释信息使用关键词“Cry，Cyt，及VIP”进行检索，只有“Cry”返回两条检索数据，两条数据命名分别为Translation5511312..5512181(direct)，290amino acids；Translation5512497..5513384(direct)，290 amino acids。它们对应同一条注释信息，Uniport数据库中，此序列的Primary accession number为D4QGQ7。

4、IPPBI0TSUC1O12蛋白鉴定

蛋白纯化

溶液于4℃，12000g离心10min，取上清作为层析样品。

缓冲液A：20mmol/L Tris-HCl pH＝8.0；缓冲液B：20mmol/L Tris-HCl 1mol/LNaCl pH＝8.0

离子交换：首先对样品进行离子交换浓缩，采用GE Hitrap Q HP 5mL阴离子交换柱。采用AKTA avant 25，所有涉及本仪器的溶液经过滤膜过滤

a.用超纯水清洗A，B泵及整个系统。

b.依次用A，B，A缓冲液，清洗柱子，待UV280线洗平，将其归零。

c.利用Sample Loop上样，上样流速0.5mL/min。

d.上样完毕，用缓冲液A将未结合的蛋白洗脱，流速2mL/min。

e.待uv值降至50mAU以下。启动自动峰值收集功能，采用96孔板收集每孔收集500μL，收峰起点为50mAu。

f.进缓冲液B，洗脱蛋白，目标浓度100％，到达时间10min。

g.洗脱完毕，用20％乙醇清洗系统，保存柱子。

凝胶过滤层析

设置AKTA机器，层析柱为HiPrep 16/60Sephacryl S-100High Resolution，系统流速1mL/min，上样蛋白1mL，自动收集自A280吸光度大于50mAU开始，用96孔-深孔板，每孔收集500μL。流动相为50mmol/L Na₂CO₃，NaHCO₃pH＝10。

蛋白条带二级质谱(MALDI TOF/TOF)鉴定

SDS-PAGE分离检测以后，切胶检测对蛋白进行二级质谱鉴定，

a.用解剖刀将胶带切成1-2mm²大小的胶片放入1.5mL离心管中；

b.凝胶加入乙腈：50mmol/LNH₄HCO₃(1:1)100μL振荡20min,弃上清液，重复1-2次直至蓝色褪尽，加入乙腈100μL，10-15min弃废液；

c.加入50μLDTT还原液体，56℃加热，弃废液，加100μ1乙腈脱水5-10min；

d.加入50μL碘乙酰胺烷基化，于暗处30min，之后冻干；

e.凝胶加入15-20μL酶液(0.01μg/u1)，置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶缓冲液25mmol/L NH₄HCO₃15-20μL，37℃保温15h以上或过夜；

f.加提取液5％TFA 100μL，40℃热水浴1h，每30min，超声一次，每次3min左右；

g.将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入(50％乙睛，2.5％TFA)100μL，30℃保温1小时，每30min，超声一次，每次3min左右；

h.氮气吹干乙腈后，向冻干肽段加入2-10μL的0.1％TFA。所得溶液供质谱分析用。

分析所用的仪器为UltraFlex MALDI TOF/TOF质谱仪，从质谱仪获取的肽段分子量信息经过Flex analysis 2.4分析，数据搜索使用Mascot software v2.3。

IPPBI0TSUC1O12蛋白提取及蛋白分离纯化结果

经过LB平板培养的孢晶混合物收集之后，进行晶体蛋白的提取，提取的蛋白经过胰蛋白酶处理提取的蛋白样品(图3)。

先经过离子交换对样品进行初步纯化及浓缩之后。离子交换洗脱时，出现两个主要的峰(图4)，经过SDS-PAGE分析以后发现绝大多数的蛋白集中出现在第一个峰中(图5，第3，4，5泳道)。

IPPBI0TSUC1O12蛋白杀虫活性鉴定结果

收集离子交换的第一个洗脱峰(即3,4,5泳道的样品)的样品，冻干后加入1mL超纯水。利用高分辨率凝胶过滤层析分离蛋白样品，根据其在96孔板上收集的位置坐标，挑选14个样品，编码为A4、A8、A12、B4、B8、B12、C4、C8、C12、D4、D8、D12、E4、E8。上述蛋白进行SDS-PAGE检测(图6)，同时进行杀虫活性测定，见表3。

SDS-PAGE分析蛋白质样品，从上往下将可见蛋白条带，命名为A，B，C，D(图6)。同时利用ImageJ对蛋白进行定量。通过获取蛋白条带的灰度值同蛋白样品的死亡率做相关分析。结果发现生测死亡率同A，B，C+D(两蛋白含量一致，且条带位置接近，灰度值一并计算)之间的相关系数分别为0.65，-0.36，0.83。亦即，A蛋白同杀虫活性之间是中等相关关系，B蛋白同杀虫活性之间是负相关关系，而C和D两蛋白同蛋白样品的杀虫活性之间表现出高度相关关系(表3)。因此，我们从凝胶中切取了A，C，D三条蛋白进行二级质谱鉴定。

表3.凝胶过滤后纯化蛋白的生测结果，蛋白条带A，B，C+D的灰度值及对应的相关系数。

IPPBI0TSUC1O12蛋白二级质谱鉴定结果

蛋白条带酶解后肽段的分子量分布在Nr数据库中检索并未有显著的匹配结果。将基因组中预测的蛋白质编码序列，构建成为Mascot本地数据库，再次进行检索。B蛋白无显著匹配序列。C和D两个蛋白条带分别有高质量的匹配，肽段覆盖度分别达到71％和59％。匹配得分也分别高达15010和9925。C蛋白匹配的序列是Translation5511312..5512181(direct)，290 amino acids；D蛋白匹配的序列是Translation5512497..5513384(direct)，290amino acids。而这两条序列证正是在所有基因组预测蛋白质编码序列中，其注释信息是Cry蛋白的两条序列(图7)。蛋白质鉴定结果与基因组测序注释结果中杀虫基因一致。

C蛋白匹配的序列，见SEQ ID NO：1。

C蛋白匹配的序列编码基因，见SEQ ID NO：2。：

Composition 315 A；138 C；170 G；247 T；0 OTHER

Percentage:36％ A；16％ C；20％ G；28％ T；0％OTHER

D蛋白匹配的序列，见SEQ ID NO：3。

Translation5512497..5513384(direct)

D蛋白匹配的序列编码基因，见SEQ ID NO：4。

Composition 332 A；144 C；154 G；258 T；0 OTHER

Percentage:37％ A；16％ C；17％ G；29％ T；0％OTHER

同时表达蛋白C+蛋白D的ST12基因序列，见SEQ ID NO：5。

蛋白序列分析

蛋白C与蛋白D分别命名为ST-1和ST-2，收集所有与ST-1和ST-2有序列相似性的基因构建进化树。进化树利用MEGA5.0，邻接法，p-distance model，Bootstrap＝1000，进行构建(图8)。经过比对ST-1和ST-2两个氨基酸之间具有51％的序列相似性。以ST-2基因序列为例分别同Cry64Aa1有45％序列相似性，同Cry33Aa1有36％的序列相似性，同Cry15Aa有31％相似性。

IPPBI0TSUC1O12新基因克隆表达

载体

pHT-1A为本实验室在pTH315的基础上构建的为E.coli-Bt穿梭克隆载体。苏云金芽胞杆菌杀虫基因Cry1AC的启动子序列，pDONR221质粒上的attP1-attP2片段(包括attP1,attP2位点以及cddB致死基因)，利用重叠PCR的方法将启动子与attP1-attP2片段相连接，同时为了避免通读现象，在attP1-cddB-attP2片段后面连接一段强终止子序列。利用上述序列替换掉载体上的lacZ基因及其启动子序列，即获得新的E.coli-Bt穿梭表达载。见图9。

引物

依据上述杀虫基因对应序列及其表达载体的要求，设计了基因表达引物。

表4.PCR引物序列

注：下画线标记的是(attp)同源重组片段序列

PCR

采用Takara PrimerStar扩增，反应体系(50μL)

反应程序如下：

PCR产物回收

a.PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳，EB紫外显色；

b.切取含有目的DNA片段的胶条，放入干净的离心管称重；

c.加入3倍体积的Gel solubilization Buffer，55℃水浴溶胶6-10min，间断混合，确保较快完全融化；

d.待融化的凝胶溶液降到室温，加入离心柱中静置1min，10000g离心1min，弃流出液；

e.加入650μL Wash Buffer，10000g离心1min，弃流出液，重复一次；

f.10000g离心1min，去除残留的Wash Buffer；

g.将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置1分钟，使残留的乙醇挥发干净，在柱中央加入30-50μL超纯水，室温静置1min；

h.10000g离心1min，洗脱DNA，于-20℃保存。

酶切，连接，转化

酶切

Takara 10*K buffer 2uL

pGEX质粒或纯化后PCR产物5uL

BamH1，EcoR1各1μL

超纯水补足20μL

37℃，保温1-2h，跑胶，切胶回收酶切后产物。

连接，转化

在1.5mL离心管中依次加入如下组分：

2X快速连接缓冲5μL

纯化后或酶切后的PCR产物3μL

载体1μL

25℃，保温1h，即为连接产物

a.取连接产物5μL，加入50μL感受态细胞DH5a中，冰浴半小时；

b.在精确的42℃水浴中热击30-45s(不要振动)；

c.迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却2分钟；

d.每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的1mL LB培养基；

e.在37℃振荡培养(220rpm)2h；

f.每个转化培养基200μL涂到氨苄抗生素平板上；

g.将平板于37℃培养箱过夜培养(16－24小时)。

Gateway BP反应

本实验，通过Gateway BP反应将IPPBI0TSUC1O12基因组上的ST12(ST-1和ST-2连接在一起)片段，重组到穿梭载体pHT-1A。

BP反应体系

PCR切胶回收产物 3μL

pHT-1A载体 1μL

BP Clonase II enzyme mix 1μL

轻弹混匀后，25℃孵育一小时或过夜增加克隆效率。

反应结束后加入1μL蛋白酶K，轻弹混匀，37℃孵育10min。

转化过程同上。转化所用感受态为DH5a。

质粒提取

a.取1-4mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000g离心1min，尽量吸除上清；

b.向留有菌体沉淀的离心管中加入150μL溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；

c.向离心管中加入150μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；

d.向离心管中加入350μL溶液P5，立即快速地上下颠倒混匀12-20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀。12000g离心2min；

e.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000g离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

f.向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT，12000g离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

g.将吸附柱CP3放入收集管中,12000g离心1min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；

h.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL超纯水，12,000g离心30sec将质粒溶液收集到离心管中。

大肠杆菌ET感受态制备

a.挑取E.coli单菌落于5mL液体LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养过夜；

b.按1％(1mL)接种量接种于100mL液体LB培养基中，37℃，220rpm培养2-2.5h(OD₆₀₀＝0.5-0.6)；

c.4℃，8000g，离心10min；(将100mL菌液转移到灭菌的50mL离心管内进行离心)

d.弃上清，加入50mL预冷的0.1mol/L CaCl₂悬浮细胞，置于冰上30min以上；

e.4℃，8000g离心10min，回收细胞；

f.用2mL灭菌预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬细胞，加入2mL50％甘油(终浓度25％)，然后200μL/1.5mL离心管中进行分装，立即放入液氮，-70℃冰箱进行存储。

Bt感受态制备

a.挑取单菌落于5mL的LB液体培养基中振荡培养过夜；

b.按1％接种量接种于100mL的BH液体培养基(3.7g加到100mL超纯水)中，37℃，230rpm培养4h，(OD₆₀₀＝2)；

c.9000g离心10min，收集菌体；

d.弃去上清，加入预冷的灭菌水漂洗一次，注意不要把菌体悬起；

e.加入等量的灭菌超纯水将菌体悬起混匀；

f.8000g离心收集菌体；

g.加入灭菌预冷的2mL的40％的PEG6000(40克溶解在100毫升超纯水)悬起混匀，并分装成100μL的小份，于-70℃保存。(Lereclus等，1989)。

电击转化

a.电击杯于75％乙醇中浸泡10min；

b.超纯水洗净，晾干；

c.取100μL感受态置于冰上融化，加入ET中提取的去甲基化质粒5μL，轻轻吸打混匀；

d.将上述混合物缓慢加入电击杯中，过程中避免产生气泡；

e.使用Bio-Rad的MicroPluser进行电击，参数如下，2mm电击杯，电压2.2kv；4mm电击杯，电压2.5kv，电阻800Ω；

f.电击完成后，加入1mLLB培养基，30℃220rpm活化2h；

g.取200μL菌液涂布红霉素抗性平板。

IPPBI0TSUC1O12新基因克隆表达结果：

表达杀虫蛋白；

利用引物attB1 ST-12F，attB2 ST-12R，attB2-1R，attB1-2F，从基因组中扩增ST-1，ST-2，ST-12(图10)。

PCR产物经过切胶回收，利用Gateway BP反应连接pHT-1A载体，转化所用感受态为DH5a。经菌液PCR鉴定阳性克隆，并测序。摇菌，提质粒转化ET感受态，对质粒进行去甲基化。再次摇菌，进行质粒提取，质粒提取最后一步用超纯水洗脱，-20℃冻存。

经过电击将重组质粒转化进HD73-感受态。经PCR检测阳性克隆。摇菌提取蛋白SDS-PAGE检测(图11)。检测结果表明蛋白，ST-1和ST-1在HD73^-中单独存在都不表达。而当两个基因同时存在，可以在HD73^-中共表达(图11)。

纯化蛋白：

为了测定蛋白的LC₅₀，首先对HD73^-中表达的蛋白进行纯化。通过G75分子筛凝胶过滤，离子交换，得到纯度较高的蛋白，得到的蛋白经过浓缩(图12)，透析以后进行生测。

杀虫活性测定：

设定6个浓度梯度20，10，5，2.5，1.25，0.625μg/mL。

灰飞虱生测持续6天，将浓度做对数转换，死亡率转化为几率值，拟合线性回归的毒力回归方程。蛋白对灰飞虱的毒力回归方程式为y＝3.67x+3.62，LC₅₀为3.15μg/g，95％置信区间分别为2.12-3.80μg/g(图13)。

白背飞虱生测持续4天。将浓度做对数转换，死亡率转化为几率值，拟合线性回归的毒力回归方程。蛋白对白背飞虱的毒力回归方程为y＝3.95x+2.99，LC₅₀为2.14μg/g，95％置信区间分别为1.18-2.57μg/g(图13)。

纯化后ST12蛋白对褐飞虱校正死亡率曲线见图14。

上述实验结果显示，ST12蛋白混合样品对目前主要灰飞虱、白背飞虱以及褐飞虱等主要飞虱种类都有较好的杀虫活性。

本发明的有益效果：本发明分离克隆的ST1，ST2基因序列及其基因表达产物能够对稻飞虱产生毒力，特别对于灰飞虱、白背飞虱以及褐飞虱，可以通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

Claims (5)

1.一种组合蛋白在毒杀稻飞虱害虫中的应用，所述组合蛋白由蛋白ST1和ST2组成，所述蛋白ST1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述蛋白ST2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.权利要求1所述应用，为将组合蛋白作为杀虫活性成分制作杀虫剂对稻飞虱进行杀灭。

3.权利要求1所述应用，为将表达组合蛋白的基因转入稻飞虱的寄主植物，使该植物表达对稻飞虱害虫的抗性。

4.权利要求3所述的应用，所述基因序列如SEQ ID NO：5所示。

5.权利要求1所述的应用，所述害虫为灰飞虱、白背飞虱或褐飞虱。