CN107760655A - 由枯草芽孢杆菌分泌的黄曲霉毒素降解酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种由枯草芽孢杆菌分泌的黄曲霉毒素降解酶及其应用。本发明首次从枯草芽孢杆菌ANSB060中分离纯化出黄曲霉毒素降解酶BADE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并克隆得到编码该酶的基因。另外，本发明还将所述基因转化到大肠杆菌表达系统中，成功实现了该蛋白在大肠杆菌中的表达。通过活性鉴定，证明重组rBADE具有降解黄曲霉毒素的作用，为开发专一性更强、转化效率更高的黄曲霉毒素降解酶奠定了基础。

Description

由枯草芽孢杆菌分泌的黄曲霉毒素降解酶及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学和基因工程技术领域，具体地说，涉及一种由枯草芽孢杆菌分泌的黄曲霉毒素降解酶及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素(AF)是一类主要由曲霉属的真菌，如黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)产生的有毒次级代谢产物，具有强的毒性、致癌性和诱变性，严重威胁动物生产和人类的健康。AF的靶器官是肝脏，可抑制肝脏脂质代谢和蛋白合成，引起肝脏损伤，导致肝功能下降。肝脏黄曲霉毒素中毒的主要症状包括肝脏坏死、出血、胆管增生和弥漫性肝纤维化等。AF还可导致动物生产性能下降，对动物机体造成氧化损伤，并降低动物免疫力，使其易被传染病原感染，长期接触会引发动物癌变死亡。AF不仅存在于粮食、水果和蔬菜等植物性介质中，还可残留在肉、蛋以及奶制品等动物性介质中，从而进入人类的食物链。AF被人类食用后，经胃肠道的吸收，随后经血液循环送至肝脏和肾脏被代谢激活，对人类健康造成巨大威胁。AF与乙肝病毒共同作用可提高肝癌的发病率。研究表明，在亚洲和非洲的多个地区，AF的暴露水平与肝癌的发病率成正相关。

根据联合国粮农组织(FAO)评估，全世界每年约有25％的农作物受到霉菌毒素的污染，约有2％的粮食因霉变污染而不能使用，每年，由于霉菌毒素污染造成的损失高达数千亿美元。饲料原料非常容易被AF污染，因此自上个世纪AF被发现以来，科学工作者便不断地研究该类毒素的预防和解毒、去毒方法。迄今为止已知的去除饲料原料中AF方法有物理、化学和生物学法。物理、化学脱毒方法,在实际应用中对于目前饲料业、养殖业来说均不适用。因其操作困难,且大批量的饲料及原料用此类方法无法进行,而且经化学脱毒处理后往往会降低饲料的营养品质和适口性，目前还没有切实有效的防止饲料霉菌毒素污染的方法。微生物或生物酶因其反应的准确性、有效性和环保性而成为人们关注的热点。目前未见枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶和该酶全长基因的研究报道。

因此，为了解决饲料及饲料原料中AF污染的问题，有必要对微生物所分泌的AF降解酶进行分离纯化，基因克隆及外源表达，开发专一性更强、转化效率更高的AF降解酶，确保畜牧业的安全生产和经济效益的提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种由枯草芽孢杆菌分泌的黄曲霉毒素降解酶及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)ANSB060分泌的黄曲霉毒素降解酶BADE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供编码所述降解酶BADE的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供含有编码所述降解酶BADE基因的表达盒、载体、转基因细胞系及工程菌。

本发明还提供所述降解酶BADE在降解黄曲霉毒素中的应用。所述应用为降解饲料或食品中的黄曲霉毒素。

其中，所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1，优选黄曲霉毒素B1。

本发明首先从筛选得到的一株枯草芽孢杆菌产酶菌中纯化出能降解AF的纯酶，命名为枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶(Bacillus subtilus aflatoxin-degradingenzyme,BADE)。进一步通过纯化和测序获得用于PCR扩增BADE全长基因的特异性引物(上游引物F：5′-ATGAAACTGGCCTTAGATC-3′和下游引物R：5′-TTATGCCATGCCTAATTC-3′)，以枯草芽孢杆菌ANSB060(Bacillus subtilus)的总DNA为模板，克隆得到了编码BADE的全长基因；并利用基因工程技术，在大肠杆菌表达系统中表达并纯化出重组的BADE蛋白。

BADE蛋白的纯化方法如下：首先通过发酵枯草芽孢杆菌ANSB060得到上清液之后，用3倍体积的乙醇进行粗蛋白的沉淀后，用阴离子交换层析和疏水层析得到目的峰。将得到的单一条带的蛋白进行特征氨基酸序列的分析。

本发明对枯草芽孢杆菌ANSB060进行了总DNA的提取，根据获得的特征氨基酸序列(DWINLVYSTAHTFFYDDGK和FDGIATNAVFAWVGER)设计引物进行PCR扩增，得到编码BADE成熟肽的全长基因，包含870个核苷酸碱基(SEQ ID NO:2)，编码289个氨基酸(SEQ ID NO:1)，分子量约为32-34kDa。

本发明通过设计一对引物F和R，以BamH I和Xho I为酶切位点，将枯草芽孢杆菌中编码BADE的基因克隆到原核表达载体pET30a上，成功构建表达载体pET30a-BADE，并将重组表达载体转化到大肠杆菌Rosseta(DE3)中，通过对诱导浓度和时间的摸索，得到了大肠杆菌重组rBADE，以包涵体的形式存在。

本发明还提供一种降解饲料原料中AF的方法，该方法包括如下步骤：取AF重组降解酶rBADE 1mL(酶活约100U)+50mL LB培养基，与受AF污染的饲料5g反应，反应温度为34-38℃，pH值6.8-7.4，转速180-220r/min，反应时间2-72h。

本发明首次分离纯化出枯草芽孢杆菌AF降解酶，并得到了编码该蛋白的基因。另外，本发明还将所述基因转化到大肠杆菌表达系统中，成功实现了该蛋白在大肠杆菌中的表达。通过活性鉴定，证明重组rBADE具有降解AF的作用，为开发专一性更强、转化效率更高的AF降解酶奠定了基础。

本发明具有以下有益效果：

(一)本发明得到的枯草芽孢杆菌AF降解酶，其特异性强、降解效率高，对AF的降解率可达到70％，且本解毒反应为不可逆的生物降解。

(二)本发明的枯草芽孢杆菌对AF的解毒活性高，作用专一，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响。

(三)本发明通过大肠杆菌表达系统，对降解AF酶进行重组表达后，1L重组菌液降解AF的总活性为原枯草芽孢杆菌发酵液的149.5倍，使蛋白表达量大幅提高，是更加高效的AF降解酶。

(四)本发明的重组降解酶rBADE还能降解饲料中的AF，具有实际应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中纯化的BADE蛋白SDS-PAGE电泳结果。其中，1为标准分子量蛋白；2为纯化得到的BADE。

图2为本发明实施例3中枯草芽孢杆菌总DNA电泳结果。其中，M为标准分子量蛋白；1为枯草芽孢杆菌总DNA。

图3为本发明实施例3中BADE全长基因序列PCR扩增产物电泳结果。其中，M为标准分子量蛋白；1为PCR扩增产物。

图4为本发明实施例4中重组表达载体pET30a-BADE的酶切鉴定结果。其中，M为DNAMarker；1、5、10分别为pET30a-BADE经BamH I/Sal I双酶切产物。

图5为本发明实施例5中重组蛋白rBADE在不同浓度IPTG条件下表达的电泳结果。其中，M为蛋白Marker；1为阴性对照菌；2为1mM IPTG诱导表达蛋白；3为0.3mM IPTG诱导表达蛋白。

图6为本发明实施例5中重组蛋白rBADE在不同诱导时间条件下诱导表达的电泳结果。其中，M为蛋白Marker；1为阴性对照菌；2为诱导2h重组蛋白；3为诱导4h的重组蛋白；4为诱导6h的重组蛋白；5为诱导8h的重组蛋白。

图7为本发明实施例6中重组蛋白rBADE分布情况电泳结果。其中M为蛋白Marker；1-2为pET-30a；3为未诱导菌体破碎液；4为0.3mM IPTG诱导2h菌体；5为0.3mM IPTG诱导2h菌体破碎上清；6为0.3mM IPTG诱导2h菌体破碎沉淀；7为纯化蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枯草芽孢杆菌AF降解酶BADE的获得与纯化

1.枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶(BADE)的制备

种子液的活化：将1mL奶粉中保藏的枯草芽孢杆菌ANSB060菌种接种入50mL LB培养基，放入37℃恒温振荡摇床中，180-200r/min，培养24h，活化两次。其中LB培养基为：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，琼脂16g(固体培养基)，1000mL蒸馏水，调节pH值为7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

种子液的制备：将活化两次后的菌种液(1×10⁹CFU/mL)加入装有80mL发酵培养基的300mL三角瓶中，放入37℃恒温振荡器中，200r/min，培养24h。

发酵上清液的制备：在10L发酵罐中装入LB培养基6L，高压蒸汽灭菌后，按1-2％(v/v)的接种量接入种子液。发酵时，溶氧量为60-65％，磁力搅拌速度为150-200r/min，在37℃下发酵培养20h-22h。发酵结束后，将发酵液在4℃冷冻离心机中3500-5000r/min离心15min，离心得到的发酵上清液用于蛋白沉淀。

2.BADE粗酶的提取

将等体积的上清液分别用95％乙醇(V/V)提取粗蛋白。有机溶剂萃取时，将3倍体积预冷的乙醇缓慢加入到发酵上清液中，边加边搅拌，然后在4℃冰箱中静置不超过30min，将溶液在4℃冷冻离心机中3500-5000r/min离心15min，倒掉上清后，将蛋白沉淀重新溶解在灭菌后的50mM pH7.4PBS液中，得到有机溶剂沉淀粗蛋白，并用20mM PBS透析2h。依据BCA法检测蛋白浓度，得到蛋白浓度为7.2mg/mL，并测定酶活。

3.BADE蛋白的纯化

3.1 DEAE-Sepharose GE阴离子交换层析

样品准备：在做阴离子交换层析之前，将乙醇沉淀粗蛋白调pH至7.4后，用0.45μm膜过滤，测定其电导，若高于5ms/cm应用适量的纯水稀释至5ms/cm以下。

(1)DEAE-Sepharose GE凝胶处理和装柱

取DEAE-Sepharose GE阴离子交换凝胶30mL，用蒸馏水浸泡洗涤数次，使颗粒充分溶胀，去除不溶胀的颗粒，真空抽气去除凝胶中的气泡，用强酸强碱处理12h，用水洗至中性。将处理好的凝胶装入1.6×20cm柱中，胶表面离柱口5～8cm左右为宜。

(2)DEAE-Sepharose GE凝胶层析柱的平衡

装好的层析柱在上样前，用洗脱缓冲液(20mM PB pH7.4)平衡冲洗，当纯化系统分析仪中蛋白吸收值稳定后加入BADE粗酶液(约为柱体积的3倍)。

(3)DEAE-Sepharose GE阴离子交换层析上样和洗脱

平衡结束后，用取液器将柱床表面的缓冲液移出，使溶液与胶面相切，将乙醇沉淀粗酶液加样，使样品尽可能快地覆盖胶面，打开层析柱出水口，使样品缓慢进入凝胶内部，待样品与胶面相切时关闭出水口，用洗脱缓冲液加满层析柱，以0.3mL/min流速冲洗层析柱。用蛋白质纯化系统监测蛋白质，直至监测到无蛋白质流出为止。

第一次阴离子层析时：用100％1mM NaCl离子交换缓冲液在相同条件下对柱子进行洗脱；

第二次阴离子层析时：将第一次收集的100％NaCl洗脱液，用NaCl离子交换缓冲液(浓度依次为0、10％、20％、30％、50％、70％和100％)进行梯度洗脱。两次阴离子层析后，收集穿透峰和洗脱峰，并用50mM PBS缓冲液(pH＝7.4)透析24h，测定各洗脱峰蛋白浓度和酶活。

3.2低苯基琼脂糖疏水作用层析

样品准备：在进行疏水层析之前，取一定体积样品，称取相应量的固体硫酸铵缓慢加入，边加边搅拌，如发现沉淀立即停止，根据实际情况确认加入量，后续的缓冲液浓度需要根据此浓度确定，调节pH至7.0。

(1)低苯基琼脂糖的处理和装柱

将选定的亲水性吸附剂如低苯基琼脂糖悬浮于乙醇溶液中，并且浸泡一段时间，采用离心方法，弃掉上清液，收集沉淀物。以50％(m/v)浓度悬浮于20mM pH7.4PB溶液中，而后真空抽气去旗袍，将填料装入到1.6×20cm柱中。

(2)低苯基琼脂糖柱的平衡

装好的层析柱在上样前，用10倍与柱床体积的缓冲液(20mM PB，pH7.4)平衡冲洗，当纯化系统分析仪中蛋白吸收值稳定后加入经阴离子层析后的洗脱峰蛋白。

(3)低苯基琼脂糖柱的上样和洗脱

当平衡层析缓冲液流至于床面相切时，关闭出液口，上样。加入3倍体积的层析缓冲液洗柱(20mM PB，20％硫酸铵，pH7.4)洗柱，观察检测仪回到基线后，证明杂蛋白已经完全洗下来。此时，用20％硫酸铵缓冲液(浓度为0、30％、60％、80％和100％)进行梯度洗脱。收集穿透峰和洗脱峰，并用50mM PBS缓冲液(pH7.4)透析24h，测定各洗脱峰蛋白浓度和酶活。

4.用HPLC法测定各活性成分的酶活

酶活单位定义为酶蛋白液与AFB₁在30℃，pH 7.4条件下反应48h，降解1ng AFB₁所需的酶量(单位为U)。

向试管中加入900μL粗酶液(以及各纯化步骤得到的蛋白)+100μL AFB₁(100μg/mL)+3mL LB培养基，37℃避光反应48h，以900μL 20mM PBS缓冲液+100μL AFB₁(100μg/mL)+3mL LB培养基作为对照组。用HPLC检测AFB₁的含量。HPLC法的条件：色谱柱：Agilent C18色谱柱，4.6mm×150mm×5μm；流动相：甲醇-水(45∶55)；流速：1mL/min；泵压：75bar-85bar；检测波长：λex＝360nm，λem＝440nm；分析条件：pH10。

PBS(20mM)的制备过程：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800mL蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1 000mL即可。

检测结果：经过两次阴离子层析和疏水层析后有活性组分的成分酶活单位为3010U。SDS-PAGE电泳得到单一谱带，结果见图1。分子量约为32-33kDa。

实施例2黄曲霉毒素降解酶BADE特征氨基酸序列的获得

将活性蛋白用SDS-PAGE电泳收集目的条带，进行胶内酶解，抽提得到酶解肽段后采用毛细管液相色谱进行分离，经四极杆-轨道阱质谱仪(LC-MS)进行BADE特征氨基酸序列的检测，测得的氨基酸序列如下：

1：DWINLVYSTAHTFFYDDGK

2：FDGIATNAVFAWVGER

本发明的BADE特征氨基酸序列不限于上述序列，它还包含其他短链氨基酸顺序片段，只要该片段用LC-MS或其他方法检测BADE而获得。

实施例3黄曲霉毒素降解酶BADE编码基因的克隆

1.引物设计

根据实施例2获得的BADE特征氨基酸序列，在Uniprot数据库中进行比对。选择在Uniprot数据库中登录的相应蛋白，查询其核酸序列，根据质谱信息与该核酸翻译产物比对，用Primer5.0软件设计筛选出一对目的基因全长序列的PCR引物：

上游引物F：5′-ATGAAACTGGCCTTAGATC-3′

下游引物R：5′-TTATGCCATGCCTAATTC-3′

2.枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取

将奶粉保存中的枯草芽孢杆菌ANSB060接种在液体LB培养基中活化两次，取3mL活化后的菌液13 000r/min离心1min，弃掉上清，加入细胞裂解液500μL，涡旋起沉淀，65℃水浴30min。加入500μL氯仿：异戊醇(24:1)溶液，涡旋混匀，13 000r/min离心10min。取上清，加入1mL异丙醇，混匀，13 000r/min离心10min。弃掉上清，加入70％乙醇混匀，13000r/min离心5min。弃乙醇，倒置离心管晾干。最后加入30μL双蒸水，溶解DNA。DNA样品于-20℃保存备用。测定OD_260nm和OD_280nm，OD_260nm/OD_280nm＝1.87。结果如图2所示，从电泳检测结果中发现DNA条带明显，没有降解。

3.枯草芽孢杆菌目的基因(BADE)的PCR扩增

(1)按照以下PCR反应体系，依次加入双蒸水、KOD-FX Buffer、2mM dNTP、引物和枯草芽孢杆菌ANSB060总DNA等，最后加入KOD-FX DNA聚合酶。

PCR反应体系如下：

(2)PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃变性20s，50℃退火20s；72℃延伸20s，40个循环；72℃延伸7min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图3。

4.枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶基因的克隆

(1)PCR产物的回收

PCR产物经过1％琼脂凝胶电泳，在紫外灯下用手术刀割下还有回收DNA的琼脂块，放入1.5mL离心管中，加入4倍体积(800μL)的Buffer CP，混匀后，剧烈震荡，12000rpm室温离心1min，将溶胶逐步移入吸附柱中，每次750μL，一次转不完，12000rpm室温离心1min，倒掉废液，再将剩余混合物转入吸附柱离心。12000rpm离心1min，弃滤液。加入700μL洗脱液，12000rpm离心1min，弃滤液；加入500μL洗脱液，12000rpm离心1min，弃滤液；12000rpm离心2min，甩吸附柱上的乙醇；将吸附柱转到一个新的1.5mL离心管，在吸附柱中心加入30mL双蒸水，室温放置1min；12000rpm离心2min，滤液即为回收的DNA。

(2)PCR产物与T载体连接

连接反应体系如下：

轻轻摇匀，短暂离心。22℃放置10min。

(3)连接产物转化大肠杆菌

采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞Top10放于冰水混合物中解冻。加入1.5μL连接产物，混匀后，冰上放置30min。将离心管放于42℃水浴恰好90s，不可摇动。快速将管移到冰浴上2min，室温放置5min。每管加800μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃振荡45min复苏。8 000rpm离心1min，将上清液去掉800μL，重悬后均匀涂布到抗性(X-gal/IPTG/Amp)LB平板上。平板放置于室温吹干，倒置于37℃培养箱，培养12～16h长出菌落后观察。

(4)阳性克隆菌株的筛选及鉴定

根据α互补现象，在含有X-gal/IPTG/Amp的LB平板上，阳性克隆菌株呈白色。用无菌牙签挑取阳性菌落接种于含Amp的LB液体培养基中。采用碱变性方法抽提阳性克隆质粒，进行测序。结果黄曲霉毒素降解酶BADE的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例4携带有BADE基因的重组表达载体的构建

将实施例3得到的BADE基因克隆到载体pET30a上，构建重组表达载体pET30a-BADE，克隆后的目的基因经双酶切、测序鉴定。

用BamH I和Xho I双酶切含有这两个酶切位点的质粒pET30a和目的片段BADE。利用T4DNA连接酶进行质粒pET30a和目的基因BADE的连接。氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞Top10，转化Top10感受态细胞，筛选转化子，用BamH I+Xho I酶切重组质粒pET30a-BADE并挑选重组质粒进行测序。酶切结果如图4所示，重组载体pET30a-BADE经过BamH I和Xho I双酶切，切下两条特异性条带，一条位于2 000bp左右，另一条是目的基因条带，确定目的基因按照要求定向插入到了pET30a中，载体构建成功。

实施例5重组蛋白rBADE的表达

将实施例4中构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌Rosseta(DE3)中，经过IPTG诱导后出现目的蛋白条带(图5)。经过0.3mM IPTG诱导后目的蛋白表达量最高，而转化不含目的基因的空质粒的阴性对照菌，相同诱导条件下无目的蛋白出现。如图6所示，IPTG诱导表达2h时，诱导表达的目的蛋白量较高。

具体方法如下：

1.IPTG浓度对表达的影响

挑取阳性克隆(pET30a-bade)单菌落接种于3mL含50μg/mL Kan LB的液体培养基中，37℃，200r/min，过夜培养。按照1：100转接于20mL含50μg/mL Kan LB液体培养基中，37℃，200r/min培养4h。当OD值约0.6～0.8时，加入IPTG，使其终浓度分为0.3mM和1mM。加入IPTG之前，取1mL菌液，不含目的基因的含空载体作为负对照。9 500r/min离心，弃去上清培养基，用50μL 2×SDS-PAGE加样缓冲液悬浮起沉淀。沸水煮10min，离心，上样。

2.诱导时间对表达的影响

挑取阳性克隆(pET30a-bade)单菌落接种于3mL含50μg/mL Kan LB的液体培养基中，37℃，200r/min，过夜培养。按照1：100转接于20mL含50μg/mL Kan LB液体培养基中，37℃，200r/min诱导培养，分别于2h、4h、6h和8h。当OD值为约0.6～0.8时，加入终浓度分为0.3mM IPTG，取1mL菌液，含空载体的克隆作为负对照。9 500r/min离心，弃去上清培养基，用50μL 2×SDS-PAGE加样缓冲液悬浮起沉淀。沸水煮10min，离心，上样。

实施例6重组蛋白rBADE的纯化

取100mL诱导表达菌液，9 500r/min离心2min，弃上清。用10mL Ni-Native0溶液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，在冰浴中超声波破碎细胞20min，超声5s，间隔5s。于4℃，9 500r/min离心30min，转移上清至新离心管中备用。分别取上清和沉淀电泳，发现诱导表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体破碎沉淀中。如图7所示，0.3mM IPTG诱导2h菌体沉淀中存在目的蛋白条带，而菌体破碎上清不存在目的蛋白条带。然后采用镍柱和His-trap柱进行重组蛋白的纯化。具体方法如下：

将100mL诱导表达的菌液9 500r/min离心2min，收集菌体。用10mL Ni-Native 0溶液重悬细胞；超声波破碎细胞，超声5s，间隔5s，20min；9500r/min 4℃离心30min，收集包涵体。加入5mL Ni-Denature-GuHCl(100mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，6mM GuHCl，调pH 8.0)溶液溶解沉淀，离心，转移上清至新的离心管中备用。采用层析法进一步纯化。首先向HisTrap蛋白纯化-Ni亲和层析柱加入10倍柱体积的Ni-Denature-Urea溶液进行平衡，然后向镍柱加入溶解有包涵体蛋白的溶液，流速控制在0.5mL/min，然后加入10倍柱体积的Ni-Denature-Urea溶液清洗柱子，最后加入5倍柱体积的Ni-Denature-250溶液(100mM NaH₂PO₄，300mMNaCl，8mM尿素，250mM咪唑)洗脱蛋白，收集洗脱液，流速控制在1mL/min。将洗脱液在磷酸缓冲液中进行透析复性。

实施例7重组蛋白rBADE浓度和降解活性的鉴定

蛋白活性测定参照BCA法，酶活的鉴定参照实施例1方法进行。

(1)对AFB₁标准品的降解酶活

向试管中加入900μL实施例6中得到的重组酶rBADE+100μL AFB₁(100μg/mL)+3mLLB培养基，37℃避光反应48h，以900μL 20mM PBS缓冲液+100μL AFB₁(100μg/mL)+3mL LB培养基作为对照组。将反应后得到的各样品离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用HPLC检测法检测AF的含量，进行酶活计算。

结果表明，1L重组大肠杆菌工程菌，经发酵表达，可得到1 370mg重组蛋白，降解AFB₁的总活性为450 000U，是原枯草芽孢杆菌分泌的降解酶总活性的149.5倍。

(2)对饲料中的降解酶活

将AF重组降解酶rBADE 1mL+50mL LB培养基与受AF污染的饲料提取液反应，反应温度为34-38℃，pH值6.8-7.4，转速180-220r/min，反应时间48h。以1mL 20mM PBS缓冲液+50mL LB培养基+受AF污染饲料提取液作为对照组。反应后的样品采用免疫亲和住-光化学衍生-HPLC法进行AF含量的检测，具体方法如下：

将饲料样品粉碎，过20目筛。称取50g置于500mL锥形瓶中，加入250mL甲醇水溶液(甲醇：水＝200mL∶50mL)，高速振荡提取20min，收集滤液，调节滤液pH在7.2-7.4范围内。静置，用玻璃纤维滤纸过滤。取100mL滤液用200mL PBS缓冲液稀释滤液，过滤，混合均匀。将滤液分为三份，一份用于测定饲料中原始AF含量；一份选取50mL提取液在旋转蒸干仪中蒸干，加入2mL甲醇重溶解后，加入1mL AF重组降解酶rBADE和50mL LB培养基；最后一份作为对照选取50mL提取液在旋转蒸干仪中蒸干，加入2mL甲醇重溶解后，加入1mL 20mM PBS和50mLLB培养基，反应48h。反应结束后5000r/min离心15min，选取10mL滤液于免疫亲和柱中，调节滤液以3～5s一滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。然后加10mL双蒸水于免疫亲和柱中冲洗两次，调节流速为每秒一滴左右，弃去流出液。最后准确加入0.5mL甲醇，孵育3min，流速为1mL/min左右，收集洗脱液，再重复相同步骤一次，洗脱液用HPLC分析AF含量。

检测结果表明，重组蛋白rBADE对饲料中AF含量具有降解效果，1mg rBADE降解饲料中AFB₁的活性为39U。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)ANSB060分泌的黄曲霉毒素降解酶BADE，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述降解酶BADE的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述表达盒的载体。

6.含有权利要求2或3所述基因、权利要求4所述表达盒或权利要求5所述载体的工程菌。

7.权利要求1所述降解酶BADE在降解黄曲霉毒素中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为降解饲料或食品中的黄曲霉毒素。

9.如权利要求7或8所述的应用，其中所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1。