CN106990083A - 一种基于烟粉虱化学感受蛋白的植物驱避剂筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于烟粉虱化学感受蛋白的植物驱避剂筛选方法，属于生物技术领域。本发明从烟粉虱嗅觉生理的模式出发，通过分子生物学技术克隆了其化学感受蛋白BtabCSP1基因全长，并通过载体构建和原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学配基结合技术探讨了其与气味物质的亲和力。本发明同时证明烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1可以作为上述方法筛选烟粉虱植物源驱避剂，本发明基于烟粉虱植物源的驱避剂的筛选和设计提供了新的策略。

Description

一种基于烟粉虱化学感受蛋白的植物驱避剂筛选方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于烟粉虱化学感受蛋白的植物驱避剂筛选方法。
背景技术
烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)是一种多食性的检疫性害虫，近三十年以来，随着农产品、苗木和花卉等作物国际贸易往来和跨地区传运，烟粉虱不断地向世界各地区扩张，已成为一种著名的外来入侵性害虫。尽管烟粉虱寄主种类非常多，保守估计已超过74科600余种，但其对不同寄主植物存在较大的嗜性差异——这与其对不同植物挥发物气味的反应差异明显有关。如烟粉虱可以对某些植物表现出较强的驱避行为，因此通过这些植物气味挥发物可以设计和开发基于驱避行为的烟粉虱气味驱避剂。然而烟粉虱驱避植物种类众多复杂，如何快速地筛选出合适的驱避剂配方成为制约烟粉虱气味驱避剂开发和设计的瓶颈。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于烟粉虱化学感受蛋白的气味驱避剂筛选方法，本发明基于烟粉虱植物源的驱避剂配方的筛选和设计提供了新的策略。
一种基于烟粉虱化学感受蛋白的植物驱避剂筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1)提供烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1，
2)通过竞争性荧光结合方法获得烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1与气味的结合反应谱，并计算结合常数KA或解离常数KD，
3)如果烟粉虱气味物质将1-NPN与BtabCSP1相对荧光值竞争至50％以下，并且结合常数KA高于1.2×104L/μmol以上或解离常数KD低于60μmol/L以下时，确定为适合烟粉虱的气味驱避剂。
所述的步骤2)中竞争性荧光结合方法获得烟粉虱重组化学感受蛋白与气味的结合反应谱的方法步骤包括：
(1)荧光配基1-NPN与烟粉虱化学感受蛋白的结合，测定荧光值，
(2)选取烟粉虱气味物质和1-NPN进行竞争结合烟粉虱重组化学感受蛋白，测定1-NPN与BtabCSP1相对荧光值，计算结合常数KA。
所述步骤(1)的方法为：在281nm激发波长下，向1μmol/L的烟粉虱化学感受蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀。
所述步骤2)后还有气味驱避剂的验证步骤，所述验证采用Y型嗅觉仪测试。
所述步骤1)中烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1的获取方法为：
A)提取烟粉虱成虫含触角在内的头部总RNA；
B)设计烟粉虱化学感受蛋白基因引物，通过RT-PCR获得烟粉虱化学感受蛋白基因全长；
C)构建烟粉虱化学感受蛋白基因的原核表达载体；
D)通过IPTG诱导烟粉虱重组化学感受蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；
步骤D)中IPTG诱导烟粉虱重组化学感受蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为0.5mmol/L，温度为30℃，诱导转速为200rpm，诱导时间为5h。
本发明从烟粉虱嗅觉生理的模式出发，通过分子生物学技术克隆了其化学感受蛋白基因全长，并通过载体构建和原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学配基结合技术探讨了其与气味物质的亲和力。本发明同时证明烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1可以作为上述方法筛选烟粉虱植物源驱避剂，本发明基于烟粉虱植物源的驱避剂筛选和设计提供了新的策略。
附图说明
图1为重组烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1的分离纯化；
图中：M：蛋白分子量标准；0：未诱导的pET30/BtabCSP1的BL21(DE3)菌体；1：诱导的1～6h优化表达产物，
图2为重组BtabCSP1蛋白与荧光配基1-NPN的荧光结合曲线图；
图3为候选配基与荧光配基1-NPN和重组BtabCSP1蛋白的竞争结合图；
图4为烟粉虱对不同气味驱避物质的嗅觉行为反应对荧光结合验证图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：收集烟粉虱头部(含触角)总RNA以及化学感受蛋白CSP1的基因克隆
1烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1(GenBank登录号GU250808)的克隆
1.1烟粉虱总RNA的提取
利用Ambion-Micro Kit试剂盒提取烟粉虱头部(含触角)的总RNA，具体操作步骤如下：
1)将载玻片滴入RNA缓冲液置于冰上，将活的烟粉虱雌成虫放入RNAlater缓冲液液滴中，在显微镜(Nikon SMZ1500型)下解剖烟粉虱头部，每10头解剖完后，转移到装有200μL的RNAlater的离心管中，累积到800头左右时用于总RNA提取。从-80℃取出保存的烟粉虱样品，放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮快速进行研磨，此步骤在冰上操作，待研成粉末后，称取100mg组织样品装入1.5mL离心管中，然后加入1ml Lysis Solution试剂，漩涡混合器上进行混合；
2)将样品加至Mirco Filter Cattridage Assembly装置中，盖上盖子；
3)4℃，12 000×g，离心1min；
4)弃废液，打开Assembly盖子，将上清转移至Assembly中(切勿吸取沉淀)，然后加入180μL Wash Solution 1，盖上盖子；
5)4℃，12 000×g，离心1min；
6)弃废液，打开Assembly盖子，将上清转移至Assembly中(切勿吸取沉淀)，然后加入180μL Wash Solution 2/3，盖上盖子；
7)4℃，12 000×g，离心1min；
8)重复step 6，7；
9)弃废液，在空气中干燥沉淀5～10min，再加30μL RNase free水到装在新的1.5mL离心管的Assembly中；
10)4℃，12 000×g，离心1min，总RNA在该步骤溶解于离心管中；
11)利用NanoDrop超微量紫外分光光度计测定总RNA浓度，再将提取的总RNA保存于-80℃冰箱中，用于反转录合成第一链。
1.2第一链cDNA的合成
采用InvitrogenTM公司的高通量反转录cDNA试剂盒合成烟粉虱的第一链cDNA。实验方法按照试剂盒说明书进行，具体实验步骤如下：
混匀，进行短暂离心，RT反应程序：25℃10min，37℃120min，85℃5min。实验到此阶段合成了第一链cDNA，将其在-20℃条件下保存备用。
1.3基因克隆
根据GenBank中登录的烟粉虱CSP1基因全长(GenBank登录号：GU250808)，设计引物：
正向引物：5′-GCGGATCCATGCAGGTTTTGACTTTAGTTGTC-3′；
反向引物：5′-CGAAGCTTTTACAGGGTTTGTCCGAAGAGGG-3′。
为了后续实验操作的需要，即将目的基因片段亚克隆至其他载体上，在设计引物时分别在正、反向引物中加入了BamH I，Hind III酶切位点(用下划线表示)。引物由上海生工公司合成。
以烟粉虱cDNA为模板，借助ExTaq酶进行PCR扩增BtabCSP1基因。PCR反应体系如下(20μL)：
PCR的反应条件为：95℃3min预变性，每个循环94℃45s，50℃45s，72℃45s，进行35个循环，然后72℃延伸10min，16℃forever。PCR结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对目的条带进行检测分析。
1.4 PCR产物的割胶回收
利用Axygen DNA凝胶回收试剂盒对割胶产物进行回收。具体方法如下：
1)在紫外灯下切取目的片段，放入1.5mL的离心管中，先称重量，然后按质量比例换算后，加入600μL Buffer DE-A，在75℃条件下加热融化(加热5-7min，加热过程中注意混匀)；
2)然后向1)中的离心管中加入250μL Buffer DE-B，充分混合后装入制备管中，12000×g离心1min；
3)将柱中离心后的液体，加入500μL Buffer W1，12 000×g离心30s；
4)倒掉滤液，加入700μL Buffer W2，12 000×g常温离心30s；
5)倒掉滤液，加入700μL Buffer W2再洗一遍，12 000×g离心1min；
6)取一新的1.5ml离心管，将柱子放入管中，加入20μL ddH2O，室温放置1min后，12000×g离心1min，弃柱子后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测回收后产物纯度，并且用超微量紫外分光光度计检测浓度后保存在-20℃备用。
1.5连接反应
将目的基因片段的割胶回收产物连接到pGEM-T easy载体上，转化至TG1感受态细胞。连接体系如下：
实施例2：烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1表达载体构建
2.1 PCR扩增BtabCSP1基因
提取烟粉虱的总RNA，反转录得到的cDNA第一链后作为模板，以设计合成的烟粉虱BtabCSP1前后引物进行PCR反应，PCR结果经琼脂糖凝胶电泳，得到了447bp左右的目的片段，与预期片段长度一致。
2.2双酶切鉴定
BtabCSP1基因PCR扩增得到的目的片段凝胶回收纯化后与pGEM-T easy Vector连接转化后，经过蓝白斑鉴定后，在含有氨苄青霉素培养基平板上选取白色克隆菌，接种培养并提取质粒后，利用BamH I和Hind III限制性内切酶双酶切鉴定目的条带大小符合要求。。
2.3转化至感受态细胞TG1
对重组质粒pGEM-T-BtabCSP1利用菌液PCR进行验证，然后送入上海桑尼测序公司测序。测序验证正确后，将pGEM-T-BtabCSP1质粒与表达载体pET30a(+)质粒均经BamH I和Hind III限制性内切酶双酶切，然后目的片段与pET30a(+)载体以摩尔数比3:1，在T4连接酶的作用下4℃连接过夜构建pET30/AcerASP2。连接后的产物先转化进入大肠杆菌TG1，选取阳性克隆菌落之后经PCR鉴定后，选取鉴定的含pET30/BtabCSP1的阳性克隆菌扩大培养，并提取质粒，提取的质粒经过双酶切酶切验证并送上海桑尼测序公司测序进一步确定。连接体系及双酶切体系如下：
1)双酶切体系(20μL)：
2)连接体系(10μL)：
3)连接产物的转化
a.取-70℃冻存的TG1感受态细胞(100μL)，冰上融化；
b.加入5μL连接产物，轻轻吹打均匀，冰浴30min；
c.将菌液放入42℃水浴中热激90s，迅速移置冰上放置5min；
d.加入1000μl的LB培养基(无氨苄)，于37℃恒温摇床上200rpm，复苏1h；
e.将菌液3000rpm/min，离心3min，吸出上清800μL；
f.剩余的200μL吸取100μL涂平板，待菌液被平板吸收后，于37℃倒置培养过夜；
g.挑取平板上的白色单菌落，放入含1mL LB(含氨苄)的1.5mL离心管中，37℃，220rpm，过夜培养10～12h；
h.利用菌落PCR法鉴定其是否为阳性克隆；
i.鉴定为阳性克隆的菌液，可进行扩大培养和测序。
2.4转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)
将构建成功的pET30-BtabCSP1载体转化进入用于原核表达的感受态BL21(DE3)菌中。挑取单菌落经扩大培养后再送入上海桑尼测序公司进行测序，如果测序得到的结果正确，可将此菌液保存于-20℃冰箱中。
实施例3：烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1的诱导表达
验证后的单菌落在3mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养基中37℃振荡培养过夜，次日以1％(V/V)的接种量接种到20mL LB培养基中扩大培养至OD600在0.4左右，加IPTG至终浓度为1mmol/L进行30℃200rpm开始诱导表达。每隔1h取出1mL菌液，共诱导5h，以未诱导的菌液为阴性对照，诱导结束后，将每小时收集的菌液在8000rpm下离心10min沉淀，并用ddH2O分别重新悬浮后5000rpm离心10min，收集菌体，加入150μl的1×SDS样品缓冲液悬浮菌体沉淀，并在100℃下隔水煮沸10min使菌体充分裂解，之后将各管中样品进行在5％的浓缩胶及12％的分离胶的SDS-PAGE胶中进行电泳中确定菌体是否有表达。
取50mL诱导后的菌液，8000rpm下离心10min收集菌体，弃上清后，用5mL的含溶菌酶的细菌裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％TritonX-100，1mg/mL溶菌酶)重悬液体后置于4℃充分裂解过夜，次日使用细胞超声裂解仪使菌体充分裂解，裂解后的菌体在4℃下12 000rpm离心10min后将上清转移到新的离心管中备用，在沉淀中加入3mL的包涵体裂解液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，8mol/L尿素)进行4℃充分裂解过夜，次日裂解后的溶液经4℃下12000rpm离心上清取出。将细菌裂解液裂解上清和包涵体裂解后上清各取出20μL加入20μL的1×SDS样品缓冲液在沸水中煮3min后，在5％的浓缩胶及12％的分离胶的SDS-PAGE蛋白变性胶中电泳，以观察BtabCSP1重组蛋白的表达形式。
表1 SDS-PAGE电泳浓缩胶与分离胶成分
结果分析：为得到更多的BtabCSP1，我们对表达时间进行优化，经SDS-PAGE，用Bandscan软件对电泳图进行分析，结果显示，当IPTG浓度为1mmol/L，温度30℃，诱导转速为200rpm时，5h的诱导量最大。且特异性蛋白条带在20kD左右，与预期一致。
实施例4：烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1的纯化
4.1蛋白纯化
1)确定了BtabCSP1重组蛋白表达形式后诱导500mL的大肠杆菌，收集含有目的蛋白的细菌上清。在上清溶液中加入5mL蛋白提取液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1mmol/LEDTA，100mmol/L NaCl)，溶解1h，10 000rpm离心后取上清。
2)用含有镍NTA琼脂糖亲和层析柱纯化目的蛋白，用5倍柱体积的缓冲液Ⅰ(0.5mol/L NaH2PO4，0.5mol/L Na2HPO4，0.5mol/L NaCl)平衡镍NTA琼脂糖柱，将4.1中step1)得到的蛋白溶液上柱洗脱，控制流速在2mL/min，
3)然后用5倍柱体积的缓冲液Ⅰ洗涤，
4)分别用不同梯度咪唑(10、20、50、100、200、300、400mol/L)进行洗脱，分别收集不同浓度下的洗脱液，最后用SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度，。各种梯度咪唑洗脱液配方如下：
表2洗脱液的配方比例
如图1为重组烟粉虱气味蛋白BtabCSP1的分离纯化图，M为Marker，1和3为未诱导的诱导的细菌总蛋白，2为诱导后的细菌总蛋白，4为纯化后的BtabCSP1重组蛋白。
4.2透析除盐
1)透析袋的处理
a.将1mL 0.5mol/L EDTA加入到499mL ddH2O配成1mmol/L EDTA溶液；
b.向上述溶液中加入10g NaHCO3，充分搅拌混匀；
c.将透析袋剪成适宜大小，然后放入到配置好的溶液中，煮沸10min；
d.蒸馏水洗干净后再加入透析液透析。
2)透析
配制500mL 0.01mol/L的PBS溶液(pH 7.4)，将3.1.3中确定含有纯BtabCSP1重组蛋白的洗脱液全部转移于透析袋中，放入PBS溶液中于4℃透析3d，期间每天早晚分别更换新鲜的PBS缓冲液一次，最后将透析好的蛋白用Bradford法测定蛋白的浓度，用1.5ml离心管分装，-20℃冰箱保存备用。
实施例5：烟粉虱重组化学感受蛋白与气味挥发物荧光竞争实验
5.1材料与方法
5.1.1试剂与仪器
5.1.1.1实验试剂
实验所用的荧光探针N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)和各种气味挥发性物质的标准样品均购自于百灵威公司，纯度都在97％以上。待测蛋白为上述纯化好的BtabCSP1重组蛋白，蛋白终浓度为0.6μmol/L。
5.1.1.2实验仪器
RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司)
5.1.2实验试剂的准备
将荧光配基1-NPN配成10mmol/L母液并置于4℃避光保存。将各标准样品均溶于HPLC级甲醇，配制成10mmol/L的溶液4℃保存。
5.1.3 BtabCSP1结合能力的测定
首先测定BtabCSP1与1-NPN的结合曲线。移取0.6μmol/L BtabCSP1蛋白溶液于石英比色皿中，然后逐步加入3μL的1mmol/L的1-NPN溶液反应2min后，在281nm波长下激发，记录荧光发射光谱及最大发射波长328nm处时的荧光值，根据Scatchard方程对光谱数据进行线性化(1)：
其中[Dt]表示溶液中总的1-NPN浓度，[D]表示溶液中游离的1-NPN浓度，[Pt]为BtabCSP1融合蛋白的浓度，KA为1-NPN与BtabCSP1的结合常数，n为结合位点数。然后使用1-NPN作为荧光探针，利用竞争结合实验来研究植物挥发性物质与烟粉虱BtabCSP1重组蛋白的解离常数。将供试挥发物质逐次加入到1-NPN与BtabCSP1蛋白混合液中，每次加入后反应时间2min，然后记录荧光值。根据公式(2)计算待测挥发物的解离常数KD：
其中[IC50]为挥发性物质能够将1-NPN与蛋白的结合率降至50％时的浓度，[1-NPN]为溶液中未结合的1-NPN浓度，K1-NPN为蛋白/1-NPN复合物的解离常数。
5.1.4荧光光谱分析
(1)荧光配基1-NPN与重组蛋白的结合。
在281nm激发波长下，向0.6μmol/L的重组BtabCSP1蛋白溶液中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀后进行荧光扫描，荧光光谱的多项式拟合相关系数达到0.9991，拟合较好(图2中a)；用Scatchard方程(公式1)线性化光谱数据后，拟合相关系数为0.9864，拟合较好(图2中b)。根据公式1可求得1-NPN与BtabCSP1蛋白的解离常数K1-NPN为7.38μmol/L。
(2)配基结合实验
选择9种配基(3-蒈烯3-Carene、P-伞花烃4-Cymene、顺-3-己烯-1-醇HL-cis-3-Hexen-1-ol、柠檬烯(+/-)-Limonene、月桂烯Myrcene、α-蒎烯α-Pinene、反-2-己烯醛EHL-tran-2-Hexenal、芳樟醇Linalool和桉树脑1,8-Cinede)分别进行荧光结合实验，这9种配基均能与1-NPN竞争结合BtabCSP1，且结合能力都较好，可将1-NPN与BtabCSP1相对荧光值竞争至50％以下(图3)。将1-NPN与相对荧光BtabCSP1的相对荧光值竞争至50％的最强配基是3-蒈烯和P-伞花烃，解离常数分别达到26.47和39.43μmol/L。
表3候选配基与1-NPN和重组BtabCSP1蛋白的竞争结合
如图3和表3所示，利用本发明发现候选配基中的多种配基能将1-NPN从BtCSP1的相对荧光值竞争至50％以下，其中有些文献报道如3-蒈烯、p-伞花烃、顺-3-己烯-1-醇和α-蒎烯等能使烟粉虱产生驱避行为的植物挥发物质，与这些物质结合说明BtCSP1可能参与了烟粉虱对非寄主植物的趋避行为，并有可能作为烟粉虱高效的驱避剂配方筛选手段。
实施例6：通过本发明筛选得到的驱避剂的有效性试验
6.1材料与方法
6.1.1供试昆虫
供试昆虫：烟粉虱来自北京农林科学院植物保护环境保护研究所养虫室，并在温室内温度25±3℃、RH 60～80％、光照L:D＝16h:8H的条件下，以普通烟草Nicotianatabacum L.(品种为云烟117)为寄主进行连代饲养。
6.1.2实验仪器和试剂
6.1.2.1实验仪器
仪器：Y型嗅觉仪由Y型无色透明玻璃管构成，内径15cm，两臂各长10cm，外加2cm磨口套管，两臂夹角60°，Y型管上方25cm处放有40W日光灯，室内温度保持25±3℃，管中气体流速100mL/min。每个玻璃臂分别与流量计、味源玻璃容器和活性碳管等相连。
6.1.2.2试剂和挥发性气味物质样品制备
各种标准品均购自百灵威。分别将9种植物挥发性物质的标准品以石蜡油稀释至0.01μL/μL浓度的气味试液体，充分混匀后，分别将1μL试液滴加于滤纸上，并以石蜡油为对照，测定烟粉虱的趋性反应。
6.1.3烟粉虱对植物挥发物质的行为反应测定。
Y型嗅觉仪测试前，按照试验设置要求，将味源置于味源瓶中，然后通气10min，使气味充满管道，以保证测试结果。实验时每次将1头烟粉虱置于嗅觉仪Y型管基部，观察其3min内(即从释放口开始计时到进入两臂的时间)的行为选择反应，当雌虫越过某臂1/3处则视为选择，3min内不作选择，则记无反应。每头烟粉虱只测试1次，每测试10头后，用75％的乙醇擦洗管的内、外壁，烘干后调换对称的两臂与味源瓶联接的位置，以消除误差。具有行为选择的有效重复为60头。
6.1.4数据统计和分析。
选择率＝选择臂虫口数/总头数×100％，校正反应率＝(处理臂虫口数－对照臂虫口数)/总头数×100％，若值为正，为诱集率，若值为负，则为驱避率。
表4烟粉虱对气味挥发物的行为反应值
从表4可以发现3-蒈烯3-Carene、P-伞花烃4-Cymene、顺-3-己烯-1-醇HL-cis-3-Hexen-1-ol、α-蒎烯α-Pinene、柠檬烯(+/-)-Limonene和月桂烯Myrcene等6种植物挥发物均能使烟粉虱产生驱避作用，而反-2-己烯醛EHL-tran-2-Hexenal、芳樟醇Linalool和桉树脑1,8-Cinede)等3种挥发物能使烟粉虱产生吸引作用。而图4显示，产生较强驱避行为的气味挥发物往往具有有较高的结合常数，如驱避作用最显著的3-蒈烯3-Carene和P-伞花烃4-Cymene，其相应的荧光结合常数也所有测试气味信息中最大(越大表明化学感受蛋白结合气味配基能力越强)。结合上文所述BtCSP1与气味物质的结合反应，确定当二者结合常数KA高于1.2×104L/μmol以上，即相应行为反应高于最弱的月桂烯时，确定为适合烟粉虱的气味驱避剂。

Claims (6)

1.一种基于烟粉虱化学感受蛋白的植物驱避剂筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1)提供烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1；
2)通过竞争性荧光结合方法获得烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1与气味的结合反应谱，并计算结合常数KA或解离常数KD，
3)如果烟粉虱气味物质将1-NPN与BtabCSP1相对荧光值竞争至50％以下，并且结合常数KA高于1.2×104L/μmol以上或解离常数KD低于60μmol/L以下时，确定为适合烟粉虱的气味驱避剂。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤2)中竞争性荧光结合方法获得烟粉虱重组化学感受蛋白与气味的结合反应谱的方法步骤包括：
(1)荧光配基1-NPN与烟粉虱化学感受蛋白的结合，测定荧光值，
(2)选取烟粉虱气味物质和1-NPN进行竞争结合烟粉虱重组化学感受蛋白，测定1-NPN与BtabCSP1相对荧光值，计算结合常数KA。
3.根据权利要求2所述的方法，所述步骤(1)的方法为：在281nm激发波长下，向1μmol/L的烟粉虱化学感受蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀。
4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤2)后还有气味驱避剂的验证步骤，所述验证采用Y型嗅觉仪测试。
5.根据权利要求1所述的方法，所述步骤1)中烟粉虱化学感受蛋白BtabCSP1的获取方法为：
A)提取烟粉虱成虫含触角在内的头部总RNA；
B)设计烟粉虱化学感受蛋白基因引物，通过RT-PCR获得烟粉虱化学感受蛋白基因全长；
C)构建烟粉虱化学感受蛋白基因的原核表达载体；
D)通过IPTG诱导烟粉虱重组化学感受蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化。
6.根据权利要求5所述的方法，步骤D)中IPTG诱导烟粉虱重组化学感受蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为0.5mmol/L，温度为30℃，诱导转速为200rpm，诱导时间为5h。
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